CN118033113A - 一种甘胆酸胶乳增强免疫比浊检测试剂及其制备方法 - Google Patents
一种甘胆酸胶乳增强免疫比浊检测试剂及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN118033113A CN118033113A CN202211373983.4A CN202211373983A CN118033113A CN 118033113 A CN118033113 A CN 118033113A CN 202211373983 A CN202211373983 A CN 202211373983A CN 118033113 A CN118033113 A CN 118033113A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- glycocholic acid
- latex
- solution
- formula
- antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- RFDAIACWWDREDC-FRVQLJSFSA-N glycocholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 RFDAIACWWDREDC-FRVQLJSFSA-N 0.000 title claims abstract description 168
- 229940099347 glycocholic acid Drugs 0.000 title claims abstract description 151
- 239000004816 latex Substances 0.000 title claims abstract description 121
- 229920000126 latex Polymers 0.000 title claims abstract description 121
- 108010007979 Glycocholic Acid Proteins 0.000 title claims abstract description 118
- RFDAIACWWDREDC-UHFFFAOYSA-N Na salt-Glycocholic acid Natural products OC1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(=O)NCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 RFDAIACWWDREDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 116
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims abstract description 82
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 38
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title abstract description 32
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 claims abstract description 69
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 52
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 32
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 32
- -1 maleimide-polyethylene Chemical group 0.000 claims abstract description 16
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 15
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims abstract description 15
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims abstract description 14
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims abstract description 14
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims abstract description 14
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims abstract description 12
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims abstract description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims abstract description 6
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 claims abstract description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 107
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 54
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 40
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 31
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 27
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 claims description 26
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 25
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 23
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 23
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 19
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 19
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 16
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 claims description 16
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 16
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 14
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 13
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 12
- 239000008213 purified water Substances 0.000 claims description 11
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims description 10
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 claims description 10
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000010171 animal model Methods 0.000 claims description 10
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 claims description 10
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M Acrylate Chemical compound [O-]C(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 9
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 9
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 8
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 8
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 8
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 8
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 8
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 claims description 8
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 8
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 claims description 8
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- GVJXGCIPWAVXJP-UHFFFAOYSA-N 2,5-dioxo-1-oxoniopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound ON1C(=O)CC(S(O)(=O)=O)C1=O GVJXGCIPWAVXJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 6
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 6
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 claims description 5
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 claims description 4
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 claims description 4
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 4
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 claims description 4
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 claims description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims description 3
- CCMKPCBRNXKTKV-UHFFFAOYSA-N 1-hydroxy-5-sulfanylidenepyrrolidin-2-one Chemical compound ON1C(=O)CCC1=S CCMKPCBRNXKTKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims description 2
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 claims description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 2
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 claims description 2
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 claims description 2
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 claims description 2
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 claims description 2
- 125000004218 chloromethyl group Chemical group [H]C([H])(Cl)* 0.000 claims description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 2
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 claims description 2
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 claims description 2
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 claims description 2
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 2
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 claims description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 7
- 238000009739 binding Methods 0.000 abstract description 3
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 abstract description 2
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 abstract description 2
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 abstract description 2
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 60
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 24
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 14
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 10
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 10
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 10
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 9
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 9
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- BHQCQFFYRZLCQQ-UHFFFAOYSA-N (3alpha,5alpha,7alpha,12alpha)-3,7,12-trihydroxy-cholan-24-oic acid Natural products OC1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 BHQCQFFYRZLCQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000004380 Cholic acid Substances 0.000 description 7
- BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N cholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N 0.000 description 7
- 229960002471 cholic acid Drugs 0.000 description 7
- 235000019416 cholic acid Nutrition 0.000 description 7
- KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N deoxycholic acid Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 7
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940125904 compound 1 Drugs 0.000 description 6
- 229940125782 compound 2 Drugs 0.000 description 6
- 229940126214 compound 3 Drugs 0.000 description 6
- 229940125898 compound 5 Drugs 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 6
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 5
- HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N (2s,4r)-4-[(3r,5s,6r,7r,8s,9s,10s,13r,14s,17r)-6-ethyl-3,7-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-2-methylpentanoic acid Chemical compound C([C@@]12C)C[C@@H](O)C[C@H]1[C@@H](CC)[C@@H](O)[C@@H]1[C@@H]2CC[C@]2(C)[C@@H]([C@H](C)C[C@H](C)C(O)=O)CC[C@H]21 HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N 0.000 description 4
- BWGRDBSNKQABCB-UHFFFAOYSA-N 4,4-difluoro-N-[3-[3-(3-methyl-5-propan-2-yl-1,2,4-triazol-4-yl)-8-azabicyclo[3.2.1]octan-8-yl]-1-thiophen-2-ylpropyl]cyclohexane-1-carboxamide Chemical compound CC(C)C1=NN=C(C)N1C1CC2CCC(C1)N2CCC(NC(=O)C1CCC(F)(F)CC1)C1=CC=CS1 BWGRDBSNKQABCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N Palladium Chemical compound [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003613 bile acid Substances 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 4
- QARBMVPHQWIHKH-UHFFFAOYSA-N methanesulfonyl chloride Chemical compound CS(Cl)(=O)=O QARBMVPHQWIHKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 4
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 3
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 3
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 3
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 3
- RUDATBOHQWOJDD-UHFFFAOYSA-N (3beta,5beta,7alpha)-3,7-Dihydroxycholan-24-oic acid Natural products OC1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)CC2 RUDATBOHQWOJDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WDBQJSCPCGTAFG-QHCPKHFHSA-N 4,4-difluoro-N-[(1S)-3-[4-(3-methyl-5-propan-2-yl-1,2,4-triazol-4-yl)piperidin-1-yl]-1-pyridin-3-ylpropyl]cyclohexane-1-carboxamide Chemical compound FC1(CCC(CC1)C(=O)N[C@@H](CCN1CCC(CC1)N1C(=NN=C1C)C(C)C)C=1C=NC=CC=1)F WDBQJSCPCGTAFG-QHCPKHFHSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N Bilirubin Chemical compound N1C(=O)C(C)=C(C=C)\C1=C\C1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(CC2=C(C(C)=C(\C=C/3C(=C(C=C)C(=O)N\3)C)N2)CCC(O)=O)N1 BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N 0.000 description 2
- 206010008909 Chronic Hepatitis Diseases 0.000 description 2
- OKKJLVBELUTLKV-MZCSYVLQSA-N Deuterated methanol Chemical compound [2H]OC([2H])([2H])[2H] OKKJLVBELUTLKV-MZCSYVLQSA-N 0.000 description 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 2
- LFZAGIJXANFPFN-UHFFFAOYSA-N N-[3-[4-(3-methyl-5-propan-2-yl-1,2,4-triazol-4-yl)piperidin-1-yl]-1-thiophen-2-ylpropyl]acetamide Chemical compound C(C)(C)C1=NN=C(N1C1CCN(CC1)CCC(C=1SC=CC=1)NC(C)=O)C LFZAGIJXANFPFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000008050 Total Bilirubin Reagent Methods 0.000 description 2
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000354 acute hepatitis Toxicity 0.000 description 2
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- HSDAJNMJOMSNEV-UHFFFAOYSA-N benzyl chloroformate Chemical compound ClC(=O)OCC1=CC=CC=C1 HSDAJNMJOMSNEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 2
- 210000000013 bile duct Anatomy 0.000 description 2
- FJDQFPXHSGXQBY-UHFFFAOYSA-L caesium carbonate Chemical compound [Cs+].[Cs+].[O-]C([O-])=O FJDQFPXHSGXQBY-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000024 caesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- RUDATBOHQWOJDD-BSWAIDMHSA-N chenodeoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)CC1 RUDATBOHQWOJDD-BSWAIDMHSA-N 0.000 description 2
- 229960001091 chenodeoxycholic acid Drugs 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 2
- 238000010219 correlation analysis Methods 0.000 description 2
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000012065 filter cake Substances 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 2
- IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N hcl hcl Chemical compound Cl.Cl IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000753 hepatic injury Toxicity 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- DCPMPXBYPZGNDC-UHFFFAOYSA-N hydron;methanediimine;chloride Chemical compound Cl.N=C=N DCPMPXBYPZGNDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000012280 lithium aluminium hydride Substances 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000013062 quality control Sample Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- BNWCETAHAJSBFG-UHFFFAOYSA-N tert-butyl 2-bromoacetate Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)CBr BNWCETAHAJSBFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 206010008635 Cholestasis Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004206 Gamma-glutamyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 206010070538 Gestational hypertension Diseases 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 206010019755 Hepatitis chronic active Diseases 0.000 description 1
- 206010023126 Jaundice Diseases 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012445 acidic reagent Substances 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 201000001883 cholelithiasis Diseases 0.000 description 1
- 231100000359 cholestasis Toxicity 0.000 description 1
- 230000007870 cholestasis Effects 0.000 description 1
- 230000001587 cholestatic effect Effects 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 210000001198 duodenum Anatomy 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 208000002296 eclampsia Diseases 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 102000006640 gamma-Glutamyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000005283 ground state Effects 0.000 description 1
- 210000003405 ileum Anatomy 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000414 obstructive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 210000003240 portal vein Anatomy 0.000 description 1
- 201000011461 pre-eclampsia Diseases 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000012265 solid product Substances 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- PXQLVRUNWNTZOS-UHFFFAOYSA-N sulfanyl Chemical class [SH] PXQLVRUNWNTZOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
- G01N33/537—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody
- G01N33/539—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody involving precipitating reagent, e.g. ammonium sulfate
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明使用表面带有氨基修饰的聚苯乙烯胶乳微球(氨基微球),首先使用马来酰亚胺‑聚乙二醇‑丙烯酸琥珀酰亚胺酯(Mal‑PEG‑NHS ester)与氨基微球进行偶联反应,对胶乳微球进行修饰,再用修饰后得到的胶乳微球‑聚乙二醇‑马来酰亚胺偶联体(Latex microspheres‑(PEG)n‑Mal)中的‑(PEG)n‑Mal作为连接分子,与抗体表面的巯基反应,得到胶乳微球‑连接分子‑抗体蛋白偶连体(即本发明中的抗甘胆酸特异性抗体包被的胶乳微球)。通过这种偶联方法能扩大抗体与胶乳微球表面之间的空间距离,同时增加抗体与抗体之间的间隔距离,避免抗体分子相互挤压,使抗体有足够空间与抗原进行识别结合反应,有效提高了抗体反应效率,减少了抗体使用量,节省了试剂成本,同时显著提高了甘胆酸检测的灵敏度。本发明的检测试剂可实现在全自动生化分析仪上对甘胆酸含量的高通量、快速化检测,且稳定性好、准确度高、特异性强、使用方便,检测效率显著提高,易于广泛推广使用。
Description
技术领域
本发明属于生物检测试剂技术领域,具体涉及一种甘胆酸胶乳增强免疫比浊检测试剂及其制备方法。
背景技术
甘胆酸(Cholylglycine,CG),其结构式如式Ⅶ所示:
式Ⅶ。
甘胆酸是由胆酸和甘氨酸结合而成的结合型胆酸,是胆汁酸的主要成分之一。胆固醇在肝细胞内经过极其复杂的酶促反应,转变成初级胆汁酸,包含胆酸(CA)和鹅去氧胆酸(CDCA),胆酸的类固醇核上有三个羟基(C3、C7、C12),侧链末端的羟基以肽键与甘氨酸结合成为甘胆酸,分子量为 466.3。甘胆酸由肝细胞合成后,经毛细胆管、胆管排入胆囊,随同胆汁进入十二指肠,帮助食物中脂肪的消化吸收。大部分胆汁酸在回肠和结肠被重吸收,经门静脉再回肝脏,由肝细胞摄取再利用,重吸收的甘胆酸又进入肝-肠循环,通过这种机制,机体能充分利用甘胆酸。在正常情况下,外周血中甘胆酸含量甚微,正常人无论空腹或餐后,其甘胆酸浓度都稳定在低水平。当人体肝细胞受损或胆汁淤滞时,就会引起甘胆酸代谢和循环紊乱,使肝细胞摄取甘胆酸的能力下降,导致血液中甘胆酸含量升高,且甘胆酸值高低与肝细胞损害及胆汁酸代谢障碍的严重程度相关。
研究指出:肝细胞一旦病变,血液中的甘胆酸浓度随即升高,肝胆疾病患者甘胆酸水平升高的阳性率很高,在肝病中具有出现早、恢复慢的特点,且较 ALT、AST、总胆红素(TBIL)、碱性磷酸酶(ALP)、谷酰转肽酶(GGT)及血清白蛋白(ALB)等常规肝功能指标更为敏感。各种肝脏疾病如:肝硬化、急性肝炎、慢性肝炎等患者的甘胆酸水平均显著升高,因此甘胆酸可作为诊断这些疾病的良好指标。研究显示,肝硬化、急性肝炎、慢性活动性肝炎和胆石症等肝病患者的甘胆酸含量明显高于正常人,甘胆酸也是检测胆汁郁积和早期酒精肝损伤的重要指标。甘胆酸检测对其它多种疾病的诊断与治疗也具有重要的参考价值。研究发现:酒精性肝损害、黄疸、胆管胆囊排泄功能障碍、梗阻性肝病、肠-肝循环障碍等疾病患者的甘胆酸含量也显著高于正常人,甘胆酸检测对早期诊断这些疾病具有重要意义。此外,对妊娠期高血压及重度子痫的诊断也具有重要价值。
化学发光法是目前常用的体外定量测定甘胆酸含量的方法,该检测方法是利用化学发光物质经催化剂催化和氧化剂氧化,形成一个激发态的中间体,这种激发态的中间体回到稳定基态时,发出光子,利用发光信号测量仪测量光子数,从而间接测定甘胆酸的浓度。该方法灵敏度较高,但测定速度较慢,测试结果的准确度和试剂稳定性较差,而且需要昂贵的专用化学发光检测设备,不利于常规实验室开展,临床应用局限性明显。因此,针对现有技术中存在的缺陷,研发一种性能指标达到临床检测要求,灵敏度高、特异性强、稳定性好、结果准确,可应用于全自动生化分析仪的高通量、快速化检测的甘胆酸检测试剂已成为国内外体外诊断试剂行业的热点。
发明内容
为了克服现有技术的不足,本发明所采用的技术方案是:
本发明一方面提供了一种甘胆酸胶乳增强免疫比浊检测试剂,包括:R1试剂与R2试剂;
所述R1试剂由甘胆酸-共轭蛋白偶联物和R1缓冲液组成,所述R2试剂由抗甘胆酸特异性抗体包被的胶乳微球和R2缓冲液组成;
所述的甘胆酸-共轭蛋白偶联物由甘胆酸衍生物1与共轭蛋白偶联而成,其结构式如式Ⅰ所示:
式Ⅰ;
所述甘胆酸衍生物1,结构式如式Ⅱ所示:
式Ⅱ;
所述共轭蛋白为血清白蛋白;所述R1缓冲液为含有聚乙二醇20000与普瑞克宁300的Tirs缓冲液;
所述的抗甘胆酸特异性抗体为甘胆酸免疫原免疫实验动物后得到的抗体;所述的甘胆酸免疫原由式Ⅱ所示的甘胆酸衍生物2与载体蛋白偶联而成,其结构式如式Ⅲ所示:
式Ⅲ;
所述甘胆酸衍生物2,结构式如式Ⅳ所示:
式Ⅳ;
所述的载体蛋白是具有免疫原性的蛋白质或多肽;所述的实验动物为哺乳动物;
所述抗甘胆酸特异性抗体包被的胶乳微球由抗甘胆酸特异性抗体通过连接分子与胶乳微球偶联而成;
所述连接分子为马来酰亚胺-聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯,其结构式如式Ⅴ所示:
式Ⅴ;
式Ⅴ中n为1-12之间的任意整数;
所述胶乳微球为表面带有氨基、羧基、羟基、巯基、酰肼基或氯甲基中任意一种基团修饰的聚苯乙烯胶乳微球,直径范围为50-450nm;
所述R2缓冲液为含有普瑞克宁300的磷酸钠缓冲液。
优选地,所述血清白蛋白为牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、羊血清白蛋白、马血清白蛋白或人血清白蛋白中的一种。更优选地,所述血清白蛋白为羊血清白蛋白。
优选地,所述具有免疫原性的蛋白质或多肽为血清白蛋白、甲状腺球蛋白、丙种球蛋白、卵清白蛋白、血蓝蛋白或多聚赖氨酸中的一种;所述哺乳动物为家兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马中的一种。更优选地,所述具有免疫原性的蛋白质或多肽为牛丙种球蛋白;所述哺乳动物为家兔。
优选地,所述连接分子为马来酰亚胺-六聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯,其结构式如式Ⅵ所示:
式Ⅵ;
优选地,所述胶乳微球为表面带有氨基修饰的聚苯乙烯胶乳微球,直径为200nm。
本发明另一方面提供了一种上述的甘胆酸胶乳增强免疫比浊检测试剂的制备方法,所述的制备方法包含以下步骤:
(A1)R1试剂的制备:将甘胆酸-共轭蛋白偶联物溶解于纯化水中,然后添加聚乙二醇20000、普瑞克宁300、三羟甲基氨基甲烷,搅拌均匀,将pH值调节至7.0-9.0,制得R1试剂;
(A2)R2试剂的制备:将抗甘胆酸特异性抗体包被的胶乳微球加入纯化水中,然后添加磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、普瑞克宁300,搅拌均匀,将pH值调节至7.0-9.0,制得R2试剂。
具体地,上述的甘胆酸胶乳增强免疫比浊检测试剂的制备方法包含以下步骤:
(A1)R1试剂的制备:将甘胆酸-共轭蛋白偶联物按照终浓度质量分数为0.01%的比例溶解于纯化水中,然后添加终浓度质量分数为0.1%的聚乙二醇20000、0.05%的普瑞克宁300,终浓度摩尔浓度为100.0mmol/L的三羟甲基氨基甲烷,搅拌均匀,将pH值调节至8.0,制得R1试剂;
(A2)R2试剂的制备:将抗甘胆酸特异性抗体包被的胶乳微球按照终浓度质量分数为2.5%的比例加入纯化水中,然后添加终浓度摩尔浓度为8.0 mmol/L的磷酸氢二钠、5.0mmol/L的磷酸二氢钾,终浓度质量分数为0.05%的普瑞克宁300,搅拌均匀,将pH值调节至8.0,制得R2试剂。
优选地,所述甘胆酸-共轭蛋白偶联物的制备方法,包含以下步骤:
(B1)将共轭蛋白溶解于磷酸钾缓冲液中,然后加入1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺,室温下搅拌反应,得到共轭蛋白溶液;
(B2)将上述式Ⅱ所示的甘胆酸衍生物1溶解于二甲基甲酰胺中,然后加入乙醇、磷酸钾缓冲液,搅拌均匀,得到甘胆酸衍生物1溶液;
(B3)将步骤(B2)得到的甘胆酸衍生物1溶液加入到步骤(B1)得到的共轭蛋白溶液中,搅拌反应,经透析纯化,得到甘胆酸-共轭蛋白偶联物。
具体地,所述甘胆酸-共轭蛋白偶联物的制备方法,包含以下步骤:
(B1)将200.0mg羊血清白蛋白溶解于100.0mL(10.0mmol/L、pH=5.0)的磷酸钾缓冲液中,然后加入400.0mg 1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺、50.0mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺,室温下搅拌15分钟进行反应,得到羊血清白蛋白溶液;
(B2)将50.0mg上述式Ⅱ所示的甘胆酸衍生物1溶解于10.0mL二甲基甲酰胺中,然后加入2.5mL乙醇、20.0mL(0.2mol/L、pH=8.5)的磷酸钾缓冲液,搅拌均匀,得到甘胆酸衍生物1溶液;
(B3)将步骤(B2)得到的甘胆酸衍生物1溶液加入到步骤(B1)得到的羊血清白蛋白溶液中,并在4℃下搅拌反应12小时,经透析纯化,得到甘胆酸-共轭蛋白偶联物。
优选地,所述式Ⅱ所示的甘胆酸衍生物1的制备方法,其合成路径如下:
。
具体地,所述甘胆酸衍生物1的制备方法包括以下步骤:
(C1)化合物2的合成
将化合物1 (250 mg,0.48 mmol)溶解于二氯甲烷(25 mL)中,然后在0℃下逐滴加入氯甲酸苄酯(85 mg,0.5 mmol)制成反应溶液。将反应溶液在室温下搅拌12小时,然后将溶剂在真空中挥发去除,再通过硅胶层析柱进行纯化得到化合物2。
(C2)化合物3的合成
将化合物2(160 mg,0.24 mmol)溶解于四氢呋喃(10 mL)中,然后在0℃下加入氢化铝锂(19 mg,0.5 mmol)制成反应溶液。将反应溶液在室温下搅拌0.5小时,然后将甲醇加入溶剂中,并在真空中将溶液浓缩,再通过硅胶层析柱进行纯化得到化合物3。
(C3)化合物6的合成
将化合物4 (500 mg,1.2 mmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺 (10 mL)中,然后在0℃下加入化合物5 (634 mg,1.0 mmol)、三乙醇胺(101 mg,1.0 mmol)及2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯 (380 mg,1.0 mmol)制成反应溶液。将反应溶液在室温下搅拌12小时,然后将纯化水加入到溶剂中,接着进行过滤。将滤饼在真空中进行干燥处理得到化合物6。
(C4)甘胆酸衍生物1的合成
将化合物6(825 mg,0.8 mmol)溶解于甲醇 (25 mL)中,然后在室温下加入钯碳催化剂(0.1 g)制成反应溶液。将反应溶液在充入氢气的条件下于室温下搅拌12小时,然后通过过滤将固体沉淀物去除,再将滤液进行浓缩。最后将浓缩产物通过制备级高效液相色谱进行纯化,得到甘胆酸衍生物1。
优选地,所述抗甘胆酸特异性抗体包被的胶乳微球的制备方法,包含以下步骤:
(D1)将聚苯乙烯胶乳微球加入磷酸钠缓冲液中,轻柔振荡使聚苯乙烯胶乳微球悬浮于上述磷酸钠缓冲液中,离心后去除上清液,然后用磷酸钠缓冲液将沉淀物重悬,制得胶乳微球悬浊液;将马来酰亚胺-聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯溶解于二甲基亚砜中,制成马来酰亚胺-聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯溶液;将马来酰亚胺-聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯溶液加入胶乳微球悬浊液中,充分搅拌溶解,在室温下搅拌反应。反应结束后,将溶液离心,去除上清液,用上述相同的磷酸钠缓冲液快速洗涤沉淀物两次,得到胶乳微球-连接分子偶联物。
(D2)将步骤(D1)制备的胶乳微球-连接分子偶联物重悬于磷酸钠缓冲液中制成胶乳微球-连接分子偶联物悬浊液;将抗甘胆酸特异性抗体用硼酸钠缓冲液稀释得到抗体溶液,将抗体溶液立即加入到上述胶乳微球-连接分子偶联物悬浊液中,然后在室温下搅拌反应;反应完成后,加入半胱氨酸,静置2小时,以阻断过量的马来酰亚胺反应位点;然后离心,去除上清液,再将沉淀物用硼酸钠缓冲液洗涤3次,得到抗甘胆酸特异性抗体包被的胶乳微球;最后将抗甘胆酸特异性抗体包被的胶乳微球重悬于甘氨酸缓冲液中,加入叠氮钠防腐剂于0-4℃下保存。
具体地,所述抗甘胆酸特异性抗体包被的胶乳微球的制备方法,包含以下步骤:
(D1)将10.0mg直径为200nm的聚苯乙烯胶乳微球加入15.0 mL(10.0mmol/L、pH=7.2)的磷酸钠缓冲液中,轻柔振荡使聚苯乙烯胶乳微球悬浮于上述磷酸钠缓冲液中,10000r/min离心10分钟后去除上清液,然后用15.0 mL(10.0mmol/L、pH=7.2)的磷酸钠缓冲液将沉淀物重悬,制得胶乳微球悬浊液;将马来酰亚胺-六聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯溶解于二甲基亚砜(DMSO)中,制成终浓度为20.0mmol/L的马来酰亚胺-六聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯溶液;将马来酰亚胺-六聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯溶液以体积比1∶20的比例加入胶乳微球悬浊液中,充分搅拌溶解,在室温下搅拌反应1小时。反应结束后,将溶液用10000r/min离心5分钟,去除上清液,用上述相同的磷酸钠缓冲液快速洗涤沉淀物两次,得到胶乳微球-连接分子偶联物。
(D2)将步骤(D1)制备的胶乳微球-连接分子偶联物重悬于10.0mL(10.0mmol/L、pH=7.2)的磷酸钠缓冲液中制成胶乳微球-连接分子偶联物悬浊液;将1.0mg抗甘胆酸特异性抗体用5.0mL(50.0mmol/L、pH=8.2)的硼酸钠缓冲液稀释得到抗体溶液,将抗体溶液立即加入到上述胶乳微球-连接分子偶联物悬浊液中,然后在室温下搅拌反应6小时;反应完成后,加入50.0mmol/L的半胱氨酸,静置2小时,以阻断过量的马来酰亚胺反应位点;然后10000r/mim离心8分钟,去除上清液,再将沉淀物用10.0mL(50.0mmol/L、pH=8.0)的硼酸钠缓冲液洗涤3次,得到抗甘胆酸特异性抗体包被的胶乳微球;最后将抗甘胆酸特异性抗体包被的胶乳微球重悬于15.0mL(50.0mmol/L、pH=8.0)的甘氨酸缓冲液中,加入质量分数为0.01%的叠氮钠防腐剂于0-4℃下保存。
优选地,所述抗甘胆酸特异性抗体的制备方法,包含以下步骤:
(E1)将上述结构式Ⅲ所示的甘胆酸免疫原用磷酸钠缓冲液稀释,得到抗原溶液,然后将所述抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合,对实验动物进行注射;
(E2)15-45天后,再用上述的抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合,对上述实验动物注射一次,之后每隔10-20天注射一次,共计注射4-6次;
(E3)对步骤(E2)免疫后的实验动物取血,分离纯化抗血清,得到抗甘胆酸特异性抗体;
具体地,所述抗甘胆酸特异性抗体的制备方法,包含以下步骤:
(E1)将上述结构式Ⅲ所示的甘胆酸免疫原用磷酸钠缓冲液(0.2mol/L、pH=7.5)稀释至终浓度为3.0mg/mL,得到抗原溶液,然后将3.0mL所述抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合,对家兔进行注射;
(E2)30天后,再用3.0mL上述的抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合,对上述家兔注射一次,之后每隔15天注射一次,共计注射5次;
(E3)对步骤(E2)免疫后的家兔取血,分离纯化抗血清,得到抗甘胆酸特异性抗体。
优选地,所述结构式Ⅲ所示的甘胆酸免疫原的制备方法,包含以下步骤:
(F1)将载体蛋白溶解于磷酸钾缓冲液中,得到载体蛋白溶液;
(F2)将上述式Ⅳ所示的甘胆酸衍生物2与二甲基甲酰胺、乙醇、磷酸钾缓冲液、1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺混合,搅拌溶解,得到甘胆酸衍生物2溶液;
(F3)将步骤(F2)得到的甘胆酸衍生物2溶液加入到步骤(F1)得到的载体蛋白溶液中,搅拌反应,经透析纯化,得到甘胆酸免疫原。
具体地,所述的甘胆酸免疫原的制备方法包括以下步骤:
(F1)将800.0mg牛丙种球蛋白溶解于100.0mL(0.3mol/L、pH=8.3)的磷酸钾缓冲液中,得到牛丙种球蛋白溶液;
(F2)将120.0mg上述式Ⅳ所示的甘胆酸衍生物2、6.0mL二甲基甲酰胺、6.0mL乙醇、15.0mL(10.0mmol/L、pH=6.5)的磷酸钾缓冲液、150.0mg1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺、30.0mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺混合,搅拌溶解反应2小时,得到甘胆酸衍生物2溶液;
(F3)将步骤(F2)得到的甘胆酸衍生物2溶液加入到步骤(F1)得到的牛丙种球蛋白溶液中,并在4℃下搅拌反应12小时,经透析纯化,得到甘胆酸免疫原。
优选地,所述式Ⅳ所示的甘胆酸衍生物2的制备方法,其合成路径如下:
。
具体地,所述甘胆酸衍生物2的制备方法包括以下步骤:
(G1)化合物3的合成
称取10.0 g(24.5 mmol)化合物1胆酸,将化合物1溶解于100mL无水二甲基甲酰胺(DMF)中,室温下加入7.04g(36.7 mmol)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、4.96 g(36.7 mmol)羟基苯并三氮唑(HOBT)和10.7 mL(61.2 mmol)二异丙基乙胺(DIEA),再加入3.07 g(24.5mmol)化合物2甘氨酸,搅拌4小时,得到合成溶液;将上述合成溶液用水稀释后再用乙酸乙酯(EtOAc)萃取,使用水和卤水冲洗有机层,加入Na2SO4干燥,通过减压方法使溶剂蒸发,得到化合物3,即甘氨胆酸。
(G2)化合物4的合成
称取8.27 g(17.2 mmol)化合物3溶解于90 mL的吡啶中,0 oC下加入2.37 g(20.7mmol)甲基磺酰氯(MsCl),将此溶液在室温下搅拌1小时,得到合成溶液。将上述合成溶液用水稀释后再用乙酸乙酯(EtOAc)萃取,使用水和卤水冲洗有机层,加入Na2SO4干燥,通过减压方法使溶剂蒸发,得到化合物4。
(G3)化合物5的合成
称取10.0 g(18.0 mmol)化合物4溶解于100 mL的吡啶中,室温下加入20 mL的乙二醇,将此反应混合液加热至110 oC过夜。将上述反应混合液除去溶剂,残留物用水稀释后再用乙酸乙酯(EtOAc)萃取,使用卤水冲洗有机层,加入Na2SO4干燥,过滤,浓缩并通过FCC(DCM/MeOH = 30/1)方法纯化得到化合物5。
(G4)化合物7的合成
称取100 mg(0.191 mmol)化合物5和 64 mg(0.21 mmol)碳酸铯(Cs2CO3),共同悬浮于5 mL的无水二甲基甲酰胺(DMF)中,冰浴条件下加入41 mg(0.21 mmol)化合物6(溴乙酸叔丁酯),室温下搅拌反应过夜。将上述反应液用水稀释后再用乙酸乙酯(EtOAc)萃取,使用水和卤水冲洗有机层,加入Na2SO4干燥,过滤,浓缩并通过FCC(DCM/MeOH = 35/1)方法纯化得到化合物7。
(G5)甘胆酸衍生物2的合成
称取80 mg(0.13 mmol)化合物7 溶解于5 mL的二氯甲烷(DCM)中,冰浴条件下加入1 mL三氟乙酸(CF3COOH),室温下搅拌反应2小时。将上述反应液除去溶剂后用1N的氢氧化钠(NaOH)调节pH值至9.0,再用乙酸乙酯(EtOAc)萃取。将水相用1N 的盐酸(HCl)调节pH值至6.0,再用乙酸乙酯(EtOAc)萃取。使用卤水冲洗有机层,加入Na2SO4干燥,浓缩得到甘胆酸衍生物2。
本发明的有益效果为:现有技术中的胶乳增强免疫比浊试剂常用的胶乳微球为表面带有羧基修饰的胶乳微球(羧基微球),羧基微球能与抗体(IgG)上的氨基直接偶联。这种偶联方法较为简单,但偶联后的结果是偶联体(即抗体包被的胶乳微球)中抗体与胶乳微球表面之间的空间距离很小,同时抗体与抗体之间的间隔距离也很小,大量抗体分子相互挤压在一起,导致抗体没有足够空间与抗原进行识别结合反应,进而导致抗体活性和灵敏度下降,降低了抗体利用效率,造成了抗体浪费。
本发明使用的胶乳微球为表面带有氨基修饰的聚苯乙烯胶乳微球(氨基微球),首先使用马来酰亚胺-聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯(Mal-PEG-NHS ester)与氨基微球进行偶联反应,对胶乳微球进行修饰,再用修饰后得到的胶乳微球-聚乙二醇-马来酰亚胺偶联体(Latex microspheres-(PEG)n-Mal)中的-(PEG)n-Mal作为连接分子,与抗体表面的巯基反应,得到胶乳微球-连接分子-抗体蛋白偶连体(即本发明中的抗甘胆酸特异性抗体包被的胶乳微球)。通过这种偶联方法能扩大抗体与胶乳微球表面之间的空间距离,同时增加抗体与抗体之间的间隔距离,避免抗体分子相互挤压,使抗体有足够空间与抗原进行识别结合反应,有效提高了抗体反应效率,减少了抗体使用量,节省了试剂成本,同时显著提高了甘胆酸检测的灵敏度。本发明的检测试剂可实现在全自动生化分析仪上对甘胆酸含量的高通量、快速化检测,且稳定性好、准确度高、特异性强、使用方便,检测效率显著提高,易于广泛推广使用。
附图说明
图1是甘胆酸胶乳增强免疫比浊检测试剂的校准曲线。
图2是胶乳增强免疫比浊检测试剂与高效液相色谱法检测甘胆酸的相关性分析图。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施方式,对本发明做进一步描述,这些附图均为简化的示意图,仅以示意方式说明本发明的基本结构,因此其仅显示与本发明有关的构成。除非特别指明,以下实施例中所用的试剂、仪器、设备、耗材均可从正规渠道商购买获得。
实施例1:甘胆酸胶乳增强免疫比浊检测试剂的制备
(1)甘胆酸衍生物1的制备
a.化合物2的合成
将化合物1 (250 mg,0.48 mmol)溶解于二氯甲烷(25 mL)中,然后在0℃下逐滴加入氯甲酸苄酯(85 mg,0.5 mmol)制成反应溶液。将反应溶液在室温下搅拌12小时,然后将溶剂在真空中挥发去除,再通过硅胶层析柱进行纯化得到化合物2 (160 mg,产率51%)。
b.化合物3的合成
将化合物2(160 mg,0.24 mmol)溶解于四氢呋喃(10 mL)中,然后在0℃下加入氢化铝锂(19 mg,0.5 mmol)制成反应溶液。将反应溶液在室温下搅拌0.5小时,然后将甲醇加入溶剂中,并在真空中将溶液浓缩,再通过硅胶层析柱进行纯化得到化合物3 (158 mg,产率100%)。
c.化合物6的合成
将化合物4 (500 mg,1.2 mmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺 (10 mL)中,然后在0℃下加入化合物5 (634 mg,1.0 mmol)、三乙醇胺(101 mg,1.0 mmol)及2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯 (380 mg,1.0 mmol)制成反应溶液。将反应溶液在室温下搅拌12小时,然后将纯化水加入到溶剂中,接着进行过滤。将滤饼在真空中进行干燥处理得到化合物6 (410 mg,产率33%)。
d.甘胆酸衍生物1的合成
将化合物6(825 mg,0.8 mmol)溶解于甲醇 (25 mL) 中,然后在室温下加入钯碳催化剂(0.1 g)制成反应溶液。将反应溶液在充入氢气的条件下于室温下搅拌12小时,然后通过过滤将固体沉淀物去除,再将滤液进行浓缩。最后将浓缩产物通过制备级高效液相色谱进行纯化,得到甘胆酸衍生物1 (0.5 g,产率70%)。
(2)甘胆酸衍生物2的制备
a.化合物3的合成
称取10.0 g(24.5 mmol)化合物1胆酸,将化合物1溶解于100mL无水二甲基甲酰胺(DMF)中,室温下加入7.04g(36.7 mmol)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、4.96 g(36.7 mmol)羟基苯并三氮唑(HOBT)和10.7 mL(61.2 mmol)二异丙基乙胺(DIEA),再加入3.07 g(24.5mmol)化合物2甘氨酸,搅拌4小时,得到合成溶液;将上述合成溶液用水稀释后再用乙酸乙酯(EtOAc)萃取,使用水和卤水冲洗有机层,加入Na2SO4干燥,通过减压方法使溶剂蒸发,最后得到9.38 g白色固体化合物3,即甘氨胆酸,产率80%。
b.化合物4的合成
称取8.27 g(17.2 mmol)化合物3溶解于90 mL的吡啶中,0 oC下加入2.37 g(20.7mmol)甲基磺酰氯(MsCl),将此溶液在室温下搅拌1小时,得到合成溶液。将上述合成溶液用水稀释后再用乙酸乙酯(EtOAc)萃取,使用水和卤水冲洗有机层,加入Na2SO4干燥,通过减压方法使溶剂蒸发,最后得到6.67 g白色固体化合物4,产率81%。
c.化合物5的合成
称取10.0 g(18.0 mmol)化合物4溶解于100 mL的吡啶中,室温下加入20 mL的乙二醇,将此反应混合液加热至110 oC过夜。将上述反应混合液除去溶剂,残留物用水稀释后再用乙酸乙酯(EtOAc)萃取,使用卤水冲洗有机层,加入Na2SO4干燥,过滤,浓缩并通过FCC(DCM/MeOH = 30/1)方法纯化得到1.33 g白色固体化合物5粗品,产率11%。
d.化合物7的合成
称取100 mg(0.191 mmol)化合物5和 64 mg(0.21 mmol)碳酸铯(Cs2CO3),共同悬浮于5 mL的无水二甲基甲酰胺(DMF)中,冰浴条件下加入41 mg(0.21 mmol)化合物6(溴乙酸叔丁酯),室温下搅拌反应过夜。将上述反应液用水稀释后再用乙酸乙酯(EtOAc)萃取,使用水和卤水冲洗有机层,加入Na2SO4干燥,过滤,浓缩并通过FCC(DCM/MeOH = 35/1)方法纯化得到15 mg黄色固体化合物7,产率12%。
e.甘胆酸衍生物2的合成
称取80 mg(0.13 mmol)化合物7 溶解于5 mL的二氯甲烷(DCM)中,冰浴条件下加入1 mL三氟乙酸(CF3COOH),室温下搅拌反应2小时。将上述反应液除去溶剂后用1N的氢氧化钠(NaOH)调节pH值至9.0,再用乙酸乙酯(EtOAc)萃取。将水相用1N 的盐酸(HCl)调节pH值至6.0,再用乙酸乙酯(EtOAc)萃取。使用卤水冲洗有机层,加入Na2SO4干燥,浓缩得到65mg无色固体产物,即式Ⅳ所示的甘胆酸衍生物2,产率89%,纯度> 95 %。
f.对上述无色固体纯化产物进行结构鉴定
利用Bruker Avance III plus 400 MHz 和VARIAN MERCURY plus 300M对上述无色固体化合物进行核磁共振光谱扫描,采用TMS作为内标。结果如下:1H NMR (400 MHz,CD3OD): δ 4.61 (s, 2H), 4.27 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 3.95 (s, 1H), 3.90 (s, 2H),3.79 (s, 1H), 3.71 (s, 3H), 3.60-3.61 (m, 3H), 2.14-2.43 (m, 4H), 1.73-1.92(m, 6H), 1.55-1.65 (m, 7H), 1.28-1.45 (m, 7H), 1.03 (d, J = 6.4 Hz, 3H), 0.92(s, 3H), 0.71 (s, 3H)。表征为式Ⅳ所示的甘胆酸衍生物2。
利用色谱/质谱技术(LCMS)对得到的衍生物进行分析鉴定,采用安捷伦公司的串联四级杆质谱仪LC/MSD1200系列,离子源采用正离子或负离子化模式。色谱柱规格为:Symmetry C18 (50×4.6 mm, 5 μm),柱温为30℃,流速为1.5 mL/min,检测波长为214nm,流动相为5-60%乙腈-0.02% NH4OAc。LCMS结果显示:纯度>95%;保留时间3.637min。
综合上述结果,可以确定该无色固体化合物为式Ⅳ所示的甘胆酸衍生物2。
(3)甘胆酸-共轭蛋白偶联物的制备
a.将200.0mg羊血清白蛋白溶解于100.0mL(10.0mmol/L、pH=5.0)的磷酸钾缓冲液中,然后加入400.0mg 1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺、50.0mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺,室温下搅拌15分钟进行反应,得到羊血清白蛋白溶液;
b.将50.0mg上述式Ⅱ所示的甘胆酸衍生物1溶解于10.0mL二甲基甲酰胺中,然后加入2.5mL乙醇、20.0mL(0.2mol/L、pH=8.5)的磷酸钾缓冲液,搅拌均匀,得到甘胆酸衍生物1溶液;
c.将步骤b得到的甘胆酸衍生物1溶液加入到步骤a得到的羊血清白蛋白溶液中,并在4℃下搅拌反应12小时,经透析纯化,得到甘胆酸-共轭蛋白偶联物。
(4)甘胆酸免疫原的制备
a.将800.0mg牛丙种球蛋白溶解于100.0mL(0.3mol/L、pH=8.3)的磷酸钾缓冲液中,得到牛丙种球蛋白溶液;
b.将120.0mg上述式Ⅳ所示的甘胆酸衍生物2、6.0mL二甲基甲酰胺、6.0mL乙醇、15.0mL(10.0mmol/L、pH=6.5)的磷酸钾缓冲液、150.0mg1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺、30.0mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺混合,搅拌溶解反应2小时,得到甘胆酸衍生物2溶液;
c.将步骤b得到的甘胆酸衍生物2溶液加入到步骤a得到的牛丙种球蛋白溶液中,并在4℃下搅拌反应12小时,经透析纯化,得到甘胆酸免疫原。
(5)抗甘胆酸特异性抗体的制备
a.将结构式Ⅲ所示的甘胆酸免疫原用磷酸钠缓冲液(0.2mol/L、pH=7.5)稀释至终浓度为3.0mg/mL,得到抗原溶液,然后将3.0mL所述抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合,对家兔进行注射;
b.30天后,再用3.0mL上述的抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合,对上述家兔注射一次,之后每隔15天注射一次,共计注射5次;
c.对步骤b免疫后的家兔取血,分离纯化抗血清,得到抗甘胆酸特异性抗体。
(6)抗甘胆酸特异性抗体包被的胶乳微球的制备
a.将10.0mg直径为200nm的聚苯乙烯胶乳微球加入15.0 mL(10.0mmol/L、pH=7.2)的磷酸钠缓冲液中,轻柔振荡使聚苯乙烯胶乳微球悬浮于上述磷酸钠缓冲液中,10000r/min离心10分钟后去除上清液,然后用15.0 mL(10.0mmol/L、pH=7.2)的磷酸钠缓冲液将沉淀物重悬,制得胶乳微球悬浊液;将马来酰亚胺-六聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯溶解于二甲基亚砜(DMSO)中,制成终浓度为20.0mmol/L的马来酰亚胺-六聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯溶液;将马来酰亚胺-六聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯溶液以体积比1∶20的比例加入胶乳微球悬浊液中,充分搅拌溶解,在室温下搅拌反应1小时。反应结束后,将溶液用10000r/min离心5分钟,去除上清液,用上述相同的磷酸钠缓冲液快速洗涤沉淀物两次,得到胶乳微球-连接分子偶联物。
b.将步骤a制备的胶乳微球-连接分子偶联物重悬于10.0mL(10.0mmol/L、pH=7.2)的磷酸钠缓冲液中制成胶乳微球-连接分子偶联物悬浊液;将1.0mg抗甘胆酸特异性抗体用5.0mL(50.0mmol/L、pH=8.2)的硼酸钠缓冲液稀释得到抗体溶液,将抗体溶液立即加入到上述胶乳微球-连接分子偶联物悬浊液中,然后在室温下搅拌反应6小时;反应完成后,加入50.0mmol/L的半胱氨酸,静置2小时,以阻断过量的马来酰亚胺反应位点;然后10000r/mim离心8分钟,去除上清液,再将沉淀物用10.0mL(50.0mmol/L、pH=8.0)的硼酸钠缓冲液洗涤3次,得到抗甘胆酸特异性抗体包被的胶乳微球;最后将抗甘胆酸特异性抗体包被的胶乳微球重悬于15.0mL(50.0mmol/L、pH=8.0)的甘氨酸缓冲液中,加入质量分数为0.01%的叠氮钠防腐剂于0-4℃下保存。
(7)甘胆酸胶乳增强免疫比浊检测试剂的制备
a.R1试剂的制备:将甘胆酸-共轭蛋白偶联物按照终浓度质量分数为0.01%的比例溶解于纯化水中,然后添加终浓度质量分数为0.1%的聚乙二醇20000、0.05%的普瑞克宁300,终浓度摩尔浓度为100.0mmol/L的三羟甲基氨基甲烷,搅拌均匀,将pH值调节至8.0,制得R1试剂;
b.R2试剂的制备:将抗甘胆酸特异性抗体包被的胶乳微球按照终浓度质量分数为2.5%的比例加入纯化水中,然后添加终浓度摩尔浓度为8.0 mmol/L的磷酸氢二钠、5.0mmol/L的磷酸二氢钾,终浓度质量分数为0.05%的普瑞克宁300,搅拌均匀,将pH值调节至8.0,制得R2试剂。
实施例2:甘胆酸标准品的制备
将甘胆酸纯品粉末分别加入6份浓度为50mmol/L pH=7.2的Tris-HCl缓冲液中,搅拌溶解,至终浓度分别为0.00μg/mL、2.50μg/mL、5.00μg/mL、10.00μg/mL、20.00μg/mL、40.00μg/mL,然后在每份溶液中分别加入质量分数为0.5%的氯化钠、1.0%的牛血清白蛋白、0.75%的乙二胺四乙酸、0.05%的叠氮钠,搅拌均匀,即为甘胆酸标准品(一组6个不同浓度)。
实施例3:甘胆酸胶乳增强免疫比浊检测试剂校准曲线制作及性能评估实验
(1)制作甘胆酸胶乳增强免疫比浊检测试剂校准曲线:
在奥林巴斯AU480全自动生化分析仪中放入实施例1制备得到的甘胆酸胶乳增强免疫比浊检测试剂,及实施例2制备得到的甘胆酸标准品,然后对生化分析仪进行反应参数设置,具体参数详见表1。实际检测过程中先加入R1试剂,再加入标准品,最后加入R2试剂。加入R2试剂后,测定不同时间点的OD570nm吸光值,计算出不同标准品浓度时的反应速率(详见表2),绘制成反应标准曲线,如图1所示。
表1. 奥林巴斯AU480全自动生化分析仪反应参数
表2. 不同标准品浓度时的反应度数值
(2)质控实验:
将甘胆酸纯品粉末溶解于甲醇中制得1mg/mL的储存液,并将此储存液稀释于不含甘胆酸的健康人血浆中,至终浓度分别为0.00、3.50、15.00、40.00µg/mL,制得空白、低、中、高浓度的质控样本。利用上述的胶乳增强免疫比浊检测方法,对质控样本进行测定,并根据步骤1中制作的胶乳增强免疫比浊检测校准曲线,计算每个质控样本中甘胆酸的含量,每个质控样本重复测定10次,检测结果及数据分析详见表3。
表3. 甘胆酸胶乳增强免疫比浊试剂检测结果及数据分析
实验结果表明:测定不同浓度质控样品中甘胆酸含量的CV值均低于5%,回收率均在95%-105%之间,说明本发明的甘胆酸胶乳增强免疫比浊检测试剂测定生物样本中甘胆酸含量的精密度较高,结果准确。
(3)甘胆酸胶乳增强免疫比浊检测试剂的性能评估实验
根据GB/T 26124-2011《临床化学体外诊断试剂(盒)》、《中华人民共和国卫生行业标准:定量测定方法的线性评价》的有关要求,参考CLSI相关标准,在进行大量实验验证后,确定本发明的试剂可以达到的性能指标如下:
a.试剂空白吸光度:以纯化水为检测样本时,吸光度≥0.8。(光径1 cm,主波长570nm,37℃)。
b.分析灵敏度:测定含量为5.00 µg/mL的甘胆酸样本时,吸光度差值(ΔA)的范围为0.01~0.40。
c.线性范围:[1.00,40.00]µg/mL,r≥0.990;在[1.00,5.00)µg/mL线性范围内,绝对偏差在±0.75 µg/mL以内;在[5.00,40.00] µg/mL线性范围内,相对偏差在±15.0%以内。
d.精密度:重复性CV≤10.0%(n=10);连续三批生产的不同批号的试剂测定同一样本,每个批号测三次,批间差R≤10.0%。
e.准确度:用甘胆酸试剂对质控品进行测定,每个浓度测定3次,取平均值,根据平均值计算相对偏差B在±15.0%以内。
f.分析特异性:进行了血红蛋白≤200mg/dL、胆红素≤20mg/dL、甘油三酯≤2000mg/dL的干扰试验研究。测定已知浓度的样本3次,计算相对偏差,相对偏差在±15.0%以内,说明该浓度范围内的干扰物对本试剂无影响。
g.可报告范围:甘胆酸胶乳增强免疫比浊检测试剂的可报告范围为0.85~400.00µg/mL。
h.稳定性:将试剂密闭贮存于2℃~8℃,有效期为12个月;试剂开封后在2℃~8℃储存环境下,有效期为30天。
性能评估实验结果表明,本发明的甘胆酸胶乳增强免疫比浊检测试剂的试剂空白吸光度、分析灵敏度、线性范围、精密度(重复性、批间差)、准确度、分析特异性、可报告范围、稳定性等性能指标均符合相关标准的技术要求。
实施例4:胶乳增强免疫比浊检测试剂与高效液相色谱法检测甘胆酸的相关性实验
使用实施例1制备得到的甘胆酸胶乳增强免疫比浊检测试剂与高效液相色谱法对100例临床尿液样本分别进行检测,对上述检测得到的数据作散点图,并进行相关性分析(如图2所示),得到的线性方程为:y = 0.9913x + 0.1668,相关系数R2 = 0.9987,表明采用本发明甘胆酸胶乳增强免疫比浊检测试剂检测临床尿液样本的实验数据与高效液相色谱法具有较高的一致性,检测结果准确度高。
实施例5:使用不同连接分子的抗甘胆酸特异性抗体包被的胶乳微球制备的试剂的性能验证
为了说明本发明使用其它不同连接分子的抗甘胆酸特异性抗体包被的胶乳微球都能用于制备甘胆酸胶乳增强免疫比浊检测试剂,并且都具有相同性能,采用各种不同连接分子的抗甘胆酸特异性抗体包被的胶乳微球,按照实施例1的方法制备相应的检验试剂,并对所制备的检验试剂按照实施例3-4所述方法进行各项实验,各实验方案所采用的连接分子及试剂性能验证结果见表4。
表4.使用不同连接分子的试剂性能验证结果
实验结果表明:本发明使用其它不同连接分子的抗甘胆酸特异性抗体包被的胶乳微球都能用于制备甘胆酸胶乳增强免疫比浊检测试剂,并且都具有优越性能。
需要说明的是,以上所述仅为本发明的实施例,并非因此限制本发明的专利范围,凡是利用本发明说明书及其附图内容所做的等效结构或等效流程变换,或直接或间接运用在其他相关技术领域,均同理包括在本发明的权利要求保护范围内。
Claims (10)
1.一种甘胆酸胶乳增强免疫比浊检测试剂,其特征在于,包括:R1试剂与R2试剂;
所述R1试剂由甘胆酸-共轭蛋白偶联物和R1缓冲液组成,所述R2试剂由抗甘胆酸特异性抗体包被的胶乳微球和R2缓冲液组成;
所述的甘胆酸-共轭蛋白偶联物由甘胆酸衍生物1与共轭蛋白偶联而成,其结构式如式Ⅰ所示:
式Ⅰ;
所述甘胆酸衍生物1,结构式如式Ⅱ所示:
式Ⅱ;
所述共轭蛋白为血清白蛋白;所述R1缓冲液为含有聚乙二醇20000与普瑞克宁300的Tirs缓冲液;
所述的抗甘胆酸特异性抗体为甘胆酸免疫原免疫实验动物后得到的抗体;所述的甘胆酸免疫原由式Ⅱ所示的甘胆酸衍生物2与载体蛋白偶联而成,其结构式如式Ⅲ所示:
式Ⅲ;
所述甘胆酸衍生物2,结构式如式Ⅳ所示:
式Ⅳ;
所述的载体蛋白是具有免疫原性的蛋白质或多肽;所述的实验动物为哺乳动物;
所述抗甘胆酸特异性抗体包被的胶乳微球由抗甘胆酸特异性抗体通过连接分子与胶乳微球偶联而成;
所述连接分子为马来酰亚胺-聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯,其结构式如式Ⅴ所示:
式Ⅴ;
式Ⅴ中n为1-12之间的任意整数;
所述胶乳微球为表面带有氨基、羧基、羟基、巯基、酰肼基或氯甲基中任意一种基团修饰的聚苯乙烯胶乳微球,直径范围为50-450nm;
所述R2缓冲液为含有普瑞克宁300的磷酸钠缓冲液。
2.根据权利要求1所述的甘胆酸胶乳增强免疫比浊检测试剂,其特征在于,所述血清白蛋白为牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、羊血清白蛋白、马血清白蛋白或人血清白蛋白中的一种。
3.根据权利要求2所述的甘胆酸胶乳增强免疫比浊检测试剂,其特征在于,所述血清白蛋白为羊血清白蛋白。
4.根据权利要求1所述的甘胆酸胶乳增强免疫比浊检测试剂,其特征在于,所述具有免疫原性的蛋白质或多肽为血清白蛋白、甲状腺球蛋白、丙种球蛋白、卵清白蛋白、血蓝蛋白或多聚赖氨酸中的一种;所述哺乳动物为家兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马中的一种。
5.根据权利要求4所述的甘胆酸胶乳增强免疫比浊检测试剂,其特征在于,所述具有免疫原性的蛋白质或多肽为牛丙种球蛋白;所述哺乳动物为家兔。
6.根据权利要求1所述的甘胆酸胶乳增强免疫比浊检测试剂,其特征在于,所述连接分子为马来酰亚胺-六聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯,其结构式如式Ⅵ所示:
式Ⅵ;
所述胶乳微球为表面带有氨基修饰的聚苯乙烯胶乳微球,直径为200nm。
7.一种如权利要求1所述的甘胆酸胶乳增强免疫比浊检测试剂的制备方法,其特征在于,所述的制备方法包含以下步骤:
(A1)R1试剂的制备:将甘胆酸-共轭蛋白偶联物溶解于纯化水中,然后添加聚乙二醇20000、普瑞克宁300、三羟甲基氨基甲烷,搅拌均匀,将pH值调节至7.0-9.0,制得R1试剂;
(A2)R2试剂的制备:将抗甘胆酸特异性抗体包被的胶乳微球加入纯化水中,然后添加磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、普瑞克宁300,搅拌均匀,将pH值调节至7.0-9.0,制得R2试剂。
8.根据权利要求7所述的甘胆酸胶乳增强免疫比浊检测试剂的制备方法,其特征在于,所述甘胆酸-共轭蛋白偶联物的制备方法,包含以下步骤:
(B1)将共轭蛋白溶解于磷酸钾缓冲液中,然后加入1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺,室温下搅拌反应,得到共轭蛋白溶液;
(B2)将上述式Ⅱ所示的甘胆酸衍生物1溶解于二甲基甲酰胺中,然后加入乙醇、磷酸钾缓冲液,搅拌均匀,得到甘胆酸衍生物1溶液;
(B3)将步骤(B2)得到的甘胆酸衍生物1溶液加入到步骤(B1)得到的共轭蛋白溶液中,搅拌反应,经透析纯化,得到甘胆酸-共轭蛋白偶联物;
所述式Ⅱ所示的甘胆酸衍生物1的制备方法,其合成路径如下:
。
9.根据权利要求7所述的甘胆酸胶乳增强免疫比浊检测试剂的制备方法,其特征在于,所述抗甘胆酸特异性抗体包被的胶乳微球的制备方法,包含以下步骤:
(C1)将聚苯乙烯胶乳微球加入磷酸钠缓冲液中,轻柔振荡使聚苯乙烯胶乳微球悬浮于上述磷酸钠缓冲液中,离心后去除上清液,然后用磷酸钠缓冲液将沉淀物重悬,制得胶乳微球悬浊液;将马来酰亚胺-聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯溶解于二甲基亚砜中,制成马来酰亚胺-聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯溶液;将马来酰亚胺-聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯溶液加入胶乳微球悬浊液中,充分搅拌溶解,在室温下搅拌反应;反应结束后,将溶液离心,去除上清液,用上述相同的磷酸钠缓冲液快速洗涤沉淀物两次,得到胶乳微球-连接分子偶联物;
(C2)将步骤(C1)制备的胶乳微球-连接分子偶联物重悬于磷酸钠缓冲液中制成胶乳微球-连接分子偶联物悬浊液;将抗甘胆酸特异性抗体用硼酸钠缓冲液稀释得到抗体溶液,将抗体溶液立即加入到上述胶乳微球-连接分子偶联物悬浊液中,然后在室温下搅拌反应;反应完成后,加入半胱氨酸,静置2小时,以阻断过量的马来酰亚胺反应位点;然后离心,去除上清液,再将沉淀物用硼酸钠缓冲液洗涤3次,得到抗甘胆酸特异性抗体包被的胶乳微球;最后将抗甘胆酸特异性抗体包被的胶乳微球重悬于甘氨酸缓冲液中,加入叠氮钠防腐剂于0-4℃下保存。
10.根据权利要求9所述的甘胆酸胶乳增强免疫比浊检测试剂的制备方法,其特征在于,所述抗甘胆酸特异性抗体的制备方法,包含以下步骤:
(D1)将权利要求1中结构式Ⅲ所示的甘胆酸免疫原用磷酸钠缓冲液稀释,得到抗原溶液,然后将所述抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合,对实验动物进行注射;
(D2)15-45天后,再用上述的抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合,对上述实验动物注射一次,之后每隔10-20天注射一次,共计注射4-6次;
(D3)对步骤(D2)免疫后的实验动物取血,分离纯化抗血清,得到抗甘胆酸特异性抗体;
所述结构式Ⅲ所示的甘胆酸免疫原的制备方法,包含以下步骤:
(E1)将载体蛋白溶解于磷酸钾缓冲液中,得到载体蛋白溶液;
(E2)将权利要求1中式Ⅳ所示的甘胆酸衍生物2与二甲基甲酰胺、乙醇、磷酸钾缓冲液、1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺混合,搅拌溶解,得到甘胆酸衍生物2溶液;
(E3)将步骤(E2)得到的甘胆酸衍生物2溶液加入到步骤(E1)得到的载体蛋白溶液中,搅拌反应,经透析纯化,得到甘胆酸免疫原;
所述式Ⅳ所示的甘胆酸衍生物2的制备方法,其合成路径如下:
。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211373983.4A CN118033113A (zh) | 2022-11-04 | 2022-11-04 | 一种甘胆酸胶乳增强免疫比浊检测试剂及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211373983.4A CN118033113A (zh) | 2022-11-04 | 2022-11-04 | 一种甘胆酸胶乳增强免疫比浊检测试剂及其制备方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN118033113A true CN118033113A (zh) | 2024-05-14 |
Family
ID=90990127
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202211373983.4A Pending CN118033113A (zh) | 2022-11-04 | 2022-11-04 | 一种甘胆酸胶乳增强免疫比浊检测试剂及其制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN118033113A (zh) |
-
2022
- 2022-11-04 CN CN202211373983.4A patent/CN118033113A/zh active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4510251A (en) | Fluorescent polarization assay for ligands using aminomethylfluorescein derivatives as tracers | |
US5352803A (en) | 5(6)-methyl substituted fluorescein derivatives | |
CN104076155B (zh) | 用于检测25-羟基维生素d的检测剂及制备方法和应用 | |
JP4990785B2 (ja) | トピラメートに関する免疫アッセイ | |
CN107365342B (zh) | 醛固酮衍生物、免疫原、及合成方法、特异性抗体和检测试剂及制备方法、试剂盒 | |
CN108709993B (zh) | 一种胶乳增强免疫比浊检测试剂盒及其制备和检测方法 | |
DE69331721T2 (de) | Neue carbamazepin hapten Analoge | |
CN109917131B (zh) | 一种脂蛋白磷脂酶a2检测试剂及其制备和使用方法 | |
JP4068137B2 (ja) | ビオチニル化した化学発光性標識、結合体、測定法及び測定法キット | |
CN110950820A (zh) | 一种氯丙嗪衍生物及其制备方法与氯丙嗪检测试剂 | |
CN110003300B (zh) | 一种17-羟类固醇的衍生物、检测试剂及制备方法 | |
CN107973836B (zh) | 醛固酮衍生物及其制备方法、醛固酮均相酶免疫检测试剂 | |
CN110082537A (zh) | 血管内皮生长因子化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法 | |
WO2006047204A1 (en) | Topiramate analogs | |
CN109884322B (zh) | 一种髓过氧化物酶检测试剂及其制备和使用方法 | |
JP4699756B2 (ja) | 親水性化学発光アクリジニウムラベル化剤 | |
CN118033113A (zh) | 一种甘胆酸胶乳增强免疫比浊检测试剂及其制备方法 | |
CN102295698B (zh) | 环孢霉素a免疫原、特异性抗体、检测试剂及检测试剂盒 | |
CN111620931B (zh) | 万古霉素衍生物及其制备方法和应用 | |
CN109884318B (zh) | 一种均相酶免疫偶联物及其制备方法和应用 | |
CN114014774A (zh) | 一种氟胺酮人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用 | |
CN118033149A (zh) | 一种皮质醇胶乳增强免疫比浊检测试剂及其制备方法 | |
CN118033115A (zh) | 一种17-羟类固醇胶乳增强免疫比浊检测试剂及其制备方法 | |
Taber et al. | Competitive particle concentration fluorescence immunoassay for measuring 5, 10-dideaza-5, 6, 7, 8-tetrahydrofolic acid (lometrexol) in serum | |
CN113721012B (zh) | 一种组合物及其试剂盒在检测甘胆酸中的用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication |