CN109030811A - 一种睾酮酶结合物的制备方法 - Google Patents
一种睾酮酶结合物的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种睾酮酶结合物的制备方法。该方法采用睾酮衍生物（T‑NHS）直接与酶进行交联结合而成，不需要额外添加活化剂和偶联剂。所述睾酮衍生物为N‑羟基琥珀酰亚胺(NHS)和睾酮的化学合成物质，或者所述睾酮衍生物为N‑磺酸化羟基琥珀酰亚胺(Sulfo‑NHS)和睾酮的化学合成物质。该方法操作简单，成本低廉，稳定性好。
Description
技术领域
本发明涉及一种应用于化学发光免疫分析技术中的睾酮酶结合物的制备方法。
技术背景
睾酮（T）是含19个碳原子的类固醇激素，血液循环中的雄性激素主要是睾酮。睾酮的特异性结构是17位的羟基和3位的酮基，这也是其生物活性的基础。在5α-还原酶的作用下，睾酮可在一些组织中进一步转化为活性更强的双氢睾酮，同时，睾酮也可转化为雌二醇，相对于男性而言，此反应在女性体内更常见。
因为睾酮的可溶性较小，在血液中的游离睾酮约占2％。约60％的睾酮与肝脏合成的性激素结合球蛋白（SHBG）结合，由于结合力较强，这种结合态睾酮无生物活性。其余的睾酮与血清白蛋白结合，因其结合较弱，具有一定的生物活性。在下丘脑、垂体、睾丸和沃尔弗管中，睾酮进入靶细胞后，与雄激素受体（AR）结合形成睾酮-AR复合物，该复合物与DNA的特定部位结合，调节信使RNA的形成，可在不同靶器官发挥不同的生理作用。睾酮最主要的生理作用是促进男性性器官的发育和成熟并维持第二性征，在代谢方面，睾酮可促进肌肉的增长和蛋白的合成，同时抑制糖皮质激素引起的蛋白分解。
在男性体内，睾酮主要由睾丸大量合成；而男性和女性的肾上腺都可合成部分睾酮；另外，女性的卵巢也可分泌少量的睾酮。促性腺激素释放激素（GnRH）可促进垂体前叶嗜碱性细胞合成黄体生成素（LH）和卵泡刺激素（FSH），LH可促进睾丸间质细胞合成睾酮。相反有两种反馈机制调节过量性激素的合成，循环中的睾酮到达脑部和垂体可抑制GnRH、LH、FSH的产生；促性腺激素也可直接抑制GnRH的产生。
睾酮分泌具有生理节律性，个体差异较大，每天约8~14个脉冲，早晨最高，每天波动的幅度约25％。儿童期睾酮水平通常很低，青春期一般在14~28nmol/L，30岁以后随年龄增长逐渐下降。
很多情况下都会对男性、女性和儿童进行睾酮检测。男孩出现青春期延迟或发育迟缓，常同时测定睾酮、FSH和LH。判断青少年男性性早熟也需要检测睾酮，睾酮升高引起的男性性早熟原因常包括各种肿瘤和先天性肾上腺肥大。成年男性检测睾酮，常是在怀疑不育症、性功能下降和勃起障碍疾病的情况下。在女性，出现不规则月经或无月经，不孕症或者男性化特征如多毛症、声音低沉等，常要检测睾酮。睾酮升高的肿瘤主要发生在卵巢或肾上腺，其他还有多囊卵巢综合征(POCS)。
用于体内睾酮测定的主要方法有放射免疫分析法、酶联免疫吸附分析法、化学发光免疫分析法等。 目前常用的放射免疫分析法（RIA）是用I125标记睾酮半抗原来实现的，其合成工艺复杂，有效期短，对环境有一定污染，影响检测结果的因素较多。近几年来，化学发光免疫分析技术发展迅速，灵敏度、特异性以及自动化程度均达到或超过了RIA水平，特别是标记物的稳定性和不污染环境是RIA法无法比拟的。
目前各大中型医院均进口了全自动化学发光免疫分析系统，但是仪器和试剂价格昂贵，试剂盒中酶标记物合成工艺是国外厂家高度保密的专利技术。
国内厂家酶联免疫吸附分析法（ELISA）试剂盒以及化学发光免疫分析法（CLIA）试剂盒主要采用的睾酮半抗原酶结合物作为标记物，其中睾酮半抗原为睾酮衍生物（T-3-CMO）与牛血清白蛋白（BSA）的结合物（T-3-CMO-BSA）或鸡卵清白蛋白（OVA）的结合物（T-3-CMO-OVA），此种酶结合物生产工艺复杂，成本较高，容易产生空间位阻影响睾酮特异性抗体的结合。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明公开了一种操作简单、成本低廉、稳定性好的睾酮酶结合物，该酶结合物是化学发光免疫分析法检测睾酮试剂盒的关键组分。
本发明涉及的睾酮酶结合物是由睾酮衍生物（T-NHS）与酶发生偶联反应生成，该反应不需要额外添加活化剂和偶联剂。
本发明涉及的睾酮衍生物为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和睾酮的化学合成物质，其化学结构式如下：
或者所述睾酮衍生物为N-磺酸化羟基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)和睾酮的化学合成物质,其化学结构式如下：
优选地，所述睾酮衍生物是采用以工艺步骤制备的：
S1.睾酮琥珀酸酯的制备：将睾酮加入到二氯甲烷琥珀酸酐中，再加入4-二甲氨基吡啶，在油浴中回流4-6小时，冷却至室温后，冰浴降温至有结晶析出，然后用乙醇重结晶，得到白色片状结晶睾酮琥珀酸酯；
S2.N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与睾酮合成物的制备：取步骤S1制备的睾酮琥珀酸酯溶解于磷酸盐溶液中，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，避光条件下2～8℃进行反应，过色谱柱收集N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与睾酮合成物的洗脱液，浓缩后，用无水乙醇重结晶，得到白色针状结晶的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与睾酮合成物，即得T-NHS。
进一步地，所述睾酮衍生物是采用以工艺步骤制备的：
S1.睾酮琥珀酸酯的制备：取睾酮5.0g于200mL二氯甲烷、50mL琥珀酸酐中，加入4-二甲氨基吡啶500mg，在油浴中回流5小时，冷却至室温后，冰浴降温2小时有结晶析出，用乙醇重结晶，得到白色片状结晶睾酮琥珀酸酯4.2g；
S2.N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与睾酮合成物的制备：取3.5g的睾酮琥珀酸酯溶解于50mM磷酸盐溶液（PH8.0）中，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)100mg和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)200mg，避光条件下2～8℃反应12h，过色谱柱收集N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与睾酮合成物的洗脱液，浓缩后，用无水乙醇重结晶，得到白色针状结晶N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与睾酮合成物890mg，即得T-NHS。
优选地，将睾酮衍生物与酶加入到缓冲液中，然后进行避光反应，除去未反应完全的睾酮衍生物，加入保护剂得到睾酮酶结合物。
进一步地，所述酶包括碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖氧化酶和苹果酸脱氢酶中的一种，优选为碱性磷酸酶。
进一步地，所述睾酮衍生物与酶的比例质量比为1:5～1:200，优选的1:20～1:150，最优选的为1:50～1:100。
进一步地，所述缓冲液包括但不限于EDTA 缓冲液、EGTA 缓冲液、柠檬酸盐缓冲系统、磷酸盐缓冲系统、碳酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲系统、SSC 缓冲系统、SSPE 缓冲系统、2-(N-吗啉代) 乙磺酸(MES) 缓冲系统、哌嗪-N，N’双(2-乙磺酸)(PIPES) 缓冲系统中的一种，优选为碳酸盐缓冲液。
进一步地，所述缓冲液PH值范围为7.0～10.0,优选的为8.0～9.0；所述避光反应的温度为4℃～37℃，避光反应的时间为0.5～24小时，反应温度与反应时间相关，温度越高，反应时间可相应缩短。
进一步地，所述除去未反应的睾酮衍生物的方法有超滤法、透析法、脱盐柱法，优选的为超滤法。除去未反应完全的睾酮衍生物后，加入保护剂，得到睾酮酶结合物，所述保护剂优选为甘油。
本发明采用新的制备方法合成睾酮酶结合物，并应用于化学发光免疫定量检测中，具有灵敏度高、特异性好、自动化程度高、标记物更加稳定、不污染环境的优点。本发明睾酮酶结合物是由睾酮衍生物（T-NHS）与酶发生偶联反应生成，该反应不需要额外添加活化剂和偶联剂。本发明方法合成的睾酮酶结合物与国外同类型产品应用于化学发光免疫分析试剂盒中，信燥比和稳定性测试结果很接近，达到优良结果，本发明的睾酮酶结合物制备方法具有很好的适用性和先进性，具有生产工艺简单、成本较低的优点，不会产生空间位阻影响睾酮特异性抗体的结合。
具体实施方式
下面结合实例进一步说明本发明，本发明的优点和特点将被描述的更清楚。但是，应该可以理解，本实例仅仅是本发明的一种范例，并不会对本发明的范围做任何限制。
实施例1
将100ug碱性磷酸酶加入1mL10mM 碳酸钠缓冲液(pH8.0) 中，加入1ug睾酮衍生物，进行避光反应，避光反应的温度为4℃～37℃，避光反应的时间为0.5～24小时，然后用ProteinG亲和柱(GE公司) 纯化酶标抗体，除去未反应完全的睾酮衍生物，得到睾酮酶结合物。
需要说明的是，所述睾酮衍生物与碱性磷酸酶加入到碳酸钠缓冲液中是不分先后顺序的，也可以先将1ug睾酮衍生物加入1mL10mM 碳酸钠缓冲液(pH8.0) 中，再加入100ug碱性磷酸酶；或者将1ug睾酮衍生物与100ug碱性磷酸酶同时加入到碳酸钠缓冲液(pH8.0)中。所述睾酮衍生物与酶的比例可以根据情况进行调整，所述睾酮衍生物与酶的比例（质量比）为1:5～1:200，优选的1:20～1:150，最优选的为1:50～1:100。
所述碱性磷酸酶也可以用辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖氧化酶和苹果酸脱氢酶中的任一种代替，所述碳酸钠缓冲液可以用EDTA 缓冲液、EGTA 缓冲液、柠檬酸盐缓冲系统、磷酸盐缓冲系统、醋酸盐缓冲系统、SSC 缓冲系统、SSPE 缓冲系统、2-(N-吗啉代) 乙磺酸(MES) 缓冲系统、哌嗪-N，N’双(2-乙磺酸)(PIPES)缓冲系统中的任一种代替。
上述睾酮衍生物为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和睾酮的化学合成物质，其化学结构式如下：
或者所述睾酮衍生物为N-磺酸化羟基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)和睾酮的化学合成物质,其化学结构式如下：
所述睾酮衍生物是采用以工艺步骤制备的：
S1.睾酮琥珀酸酯的制备：取睾酮5.0g于200mL二氯甲烷、50mL琥珀酸酐中，加入4-二甲氨基吡啶500mg，在油浴中回流5小时，冷却至室温后，冰浴降温2小时有结晶析出，用乙醇重结晶，得到白色片状结晶睾酮琥珀酸酯4.2g；
S2.N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与睾酮合成物的制备：取3.5g的睾酮琥珀酸酯溶解于50mM磷酸盐溶液（PH8.0）中，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)100mg和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)200mg，避光条件下2～8℃反应12h，过色谱柱收集N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与睾酮合成物的洗脱液，浓缩后，用无水乙醇重结晶，得到白色针状结晶N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与睾酮合成物890mg，即得T-NHS。
实施例2
将50ug葡萄糖氧化酶加入1mL10mM 碳酸钠缓冲液(pH8.0) 中，加入2ug睾酮衍生物，进行避光反应，所述避光反应的温度4℃，反应24小时后，用15mL 30KD截留分子量的超滤管(Millipore 公司)，超滤纯化酶结合物，得到睾酮酶结合物。
需要说明的是，所述睾酮衍生物与葡萄糖氧化酶加入到碳酸钠缓冲液中是不分先后顺序的，也可以先将1ug睾酮衍生物加入1mL10mM 碳酸钠缓冲液(pH8.0) 中，再加入50ug葡萄糖氧化酶；或者将1ug睾酮衍生物与50ug葡萄糖氧化酶同时加入到碳酸钠缓冲液(pH8.0) 中。所述睾酮衍生物与葡萄糖氧化酶的比例也可以根据情况进行调整，所述睾酮衍生物与葡萄糖氧化酶的比例（质量比）为1:5～1:200，优选的1:20～1:150，最优选的为1:50～1:100。
所述葡萄糖氧化酶也可以用辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、碱性磷酸酶和苹果酸脱氢酶中的任一种代替，所述碳酸钠缓冲液也可以其它的缓冲液，如EDTA 缓冲液、EGTA 缓冲液、柠檬酸盐缓冲系统、磷酸盐缓冲系统、醋酸盐缓冲系统、SSC 缓冲系统、SSPE 缓冲系统、2-(N-吗啉代) 乙磺酸(MES) 缓冲系统、哌嗪-N，N’双(2-乙磺酸)(PIPES) 缓冲系统。
所述睾酮衍生物为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和睾酮的化学合成物质，其化学结构式如下：
或者所述睾酮衍生物为N-磺酸化羟基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)和睾酮的化学合成物质,其化学结构式如下：
所述睾酮衍生物是采用以工艺步骤制备的：
S1.睾酮琥珀酸酯的制备：将睾酮加入到二氯甲烷琥珀酸酐中，再加入4-二甲氨基吡啶，在油浴中回流4-6小时，冷却至室温后，冰浴降温至有结晶析出，然后用乙醇重结晶，得到白色片状结晶睾酮琥珀酸酯；
S2.N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与睾酮合成物的制备：取步骤S1制备的睾酮琥珀酸酯溶解于磷酸盐溶液中，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，避光条件下2～8℃进行反应，过色谱柱收集N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与睾酮合成物的洗脱液，浓缩后，用无水乙醇重结晶，得到白色针状结晶的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与睾酮合成物，即得T-NHS。
实施例3
将200ugβ-半乳糖苷酶加入1mL10mM EGTA 缓冲液(pH9.0) 中，加入1ug睾酮衍生物，进行避光反应，25℃反应5小时后，采用超滤法、或透析法、或脱盐柱法除去未反应的睾酮衍生物，加入保护剂，得到睾酮酶结合物。所述保护剂优选为甘油。
需要说明的是，所述睾酮衍生物与β-半乳糖苷酶加入到碳酸钠缓冲液中是不分先后顺序的。所述睾酮衍生物与β-半乳糖苷酶的比例也可以根据情况进行调整，所述睾酮衍生物与酶的比例（质量比）可以调整为1:5～1:200，优选的1:20～1:150，最优选的为1:50～1:100。
所述β-半乳糖苷酶也可以用辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、脲酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、碱性磷酸酶和苹果酸脱氢酶中的任一种代替，所述碳酸钠缓冲液也可以其它的缓冲液，如EDTA 缓冲液、EGTA 缓冲液、柠檬酸盐缓冲系统、磷酸盐缓冲系统、醋酸盐缓冲系统、SSC 缓冲系统、SSPE 缓冲系统、2-(N-吗啉代) 乙磺酸(MES) 缓冲系统、哌嗪-N，N’双(2-乙磺酸)(PIPES) 缓冲系统。
所述EGTA 缓冲液可以采用EDTA 缓冲液、柠檬酸盐缓冲系统、磷酸盐缓冲系统、醋酸盐缓冲系统、SSC 缓冲系统、SSPE 缓冲系统、2-(N-吗啉代) 乙磺酸(MES) 缓冲系统、哌嗪-N，N’双(2-乙磺酸)(PIPES) 缓冲系统中的任一种替换，所述缓冲液PH值可调整为7.0～10.0,优选的为8.0～9.0。
实施例4
将10ug苹果酸脱氢酶加入1mL10mM SSPE 缓冲液(pH7.0) 中，加入1ug睾酮衍生物（T-NHS），4℃反应3小时后，用15mL 30KD截留分子量的超滤管(Millipore 公司)，超滤纯化酶结合物，得到睾酮酶结合物。
需要说明的是，所述睾酮衍生物与苹果酸脱氢酶加入到碳酸钠缓冲液中是不分先后顺序的，所述睾酮衍生物与苹果酸脱氢酶的比例也可以根据情况进行调整。
所述苹果酸脱氢酶也可以用辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、脲酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶中的任一种代替，所述碳酸钠缓冲液也可以其它的缓冲液，如EDTA 缓冲液、EGTA 缓冲液、柠檬酸盐缓冲系统、磷酸盐缓冲系统、醋酸盐缓冲系统、SSC 缓冲系统、SSPE 缓冲系统、2-(N-吗啉代) 乙磺酸(MES) 缓冲系统、哌嗪-N，N’双(2-乙磺酸)(PIPES) 缓冲系统。
所述SSPE 缓冲液可以采用EDTA 缓冲液、柠檬酸盐缓冲系统、磷酸盐缓冲系统、醋酸盐缓冲系统、SSC 缓冲系统、EGTA 缓冲液、2-(N-吗啉代) 乙磺酸(MES) 缓冲系统、哌嗪-N，N’双(2-乙磺酸)(PIPES) 缓冲系统中的任一种替换，所述缓冲液PH值可调整为7.0～10.0。
睾酮酶结合物应用实验
将实施例1～4生成的睾酮酶结合物与某进口公司生产的睾酮试剂盒中Rb（睾酮酶结合物）组分分别应用于睾酮化学发光免疫分析试剂盒中进行对比实验，结果如下：
由以上的结果可以看出：本工艺合成的睾酮酶结合物与国外同类型产品应用于化学发光免疫分析试剂盒中，信燥比和稳定性测试结果很接近，达到优良结果，本发明的睾酮酶结合物制备方法具有很好的适用性和先进性。
以上所述实施例仅是本发明的优选实施方式。应当指出，本发明所述的稀释比例是指按质量比稀释的比例，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以做出若干改进和修饰，这些改进和修饰也应视为本发明的保护范围，本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
Claims (10)
1.一种睾酮酶结合物的制备方法，其特征在于：所述睾酮酶结合物是由睾酮衍生物（T-NHS）与酶发生偶联反应生成，该反应不需要额外添加活化剂和偶联剂。
2.根据权利要求1所述的一种睾酮酶结合物的制备方法，其特征在于：所述睾酮衍生物为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和睾酮的化学合成物质，其化学结构式如下：
或者所述睾酮衍生物为N-磺酸化羟基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)和睾酮的化学合成物质,其化学结构式如下：
。
3.根据权利要求1或2所述的一种睾酮酶结合物的制备方法，其特征在于：所述睾酮衍生物是采用以工艺步骤制备的：
S1.睾酮琥珀酸酯的制备：将睾酮加入到二氯甲烷琥珀酸酐中，再加入4-二甲氨基吡啶，在油浴中回流4-6小时，冷却至室温后，冰浴降温至有结晶析出，然后用乙醇重结晶，得到白色片状结晶睾酮琥珀酸酯；
S2.N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与睾酮合成物的制备：取步骤S1制备的睾酮琥珀酸酯溶解于磷酸盐溶液中，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，避光条件下2～8℃进行反应，过色谱柱收集N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与睾酮合成物的洗脱液，浓缩后，用无水乙醇重结晶，得到白色针状结晶的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与睾酮合成物，即得睾酮衍生物。
4.根据权利要求3所述的一种睾酮酶结合物的制备方法，其特征在于：所述睾酮衍生物是采用以工艺步骤制备的：
S1.睾酮琥珀酸酯的制备：取睾酮5.0g于200mL二氯甲烷、50mL琥珀酸酐中，加入4-二甲氨基吡啶500mg，在油浴中回流5小时，冷却至室温后，冰浴降温2小时有结晶析出，用乙醇重结晶，得到白色片状结晶睾酮琥珀酸酯4.2g；
S2.N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与睾酮合成物的制备：取3.5g的睾酮琥珀酸酯溶解于50mM磷酸盐溶液（PH8.0）中，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)100mg和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)200mg，避光条件下2～8℃反应12h，过色谱柱收集N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与睾酮合成物的洗脱液，浓缩后，用无水乙醇重结晶，得到白色针状结晶N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与睾酮合成物890mg，即得T-NHS。
5.根据权利要求1所述的一种睾酮酶结合物的制备方法，其特征在于：将睾酮衍生物与酶加入到缓冲液中，然后进行避光反应，除去未反应完全的睾酮衍生物，得到睾酮酶结合物。
6.根据权利要求5所述的一种睾酮酶结合物的制备方法，其特征在于：所述酶包括碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖氧化酶和苹果酸脱氢酶中的一种，优选为碱性磷酸酶。
7.根据权利要求5所述的一种睾酮酶结合物的制备方法，其特征在于：所述睾酮衍生物与酶的比例质量比为1:5～1:200，优选的1:20～1:150，最优选的为1:50～1:100。
8. 根据权利要求5所述的一种睾酮酶结合物的制备方法，其特征在于：所述缓冲液包括EDTA 缓冲液、EGTA 缓冲液、柠檬酸盐缓冲系统、磷酸盐缓冲系统、碳酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲系统、SSC 缓冲系统、SSPE 缓冲系统、2-(N-吗啉代) 乙磺酸(MES) 缓冲系统、哌嗪-N，N’双(2-乙磺酸)(PIPES) 缓冲系统中的一种，优选为碳酸盐缓冲液。
9.根据权利要求8所述的一种睾酮酶结合物的制备方法，其特征在于：所述缓冲液PH值范围为7.0～10.0,优选的为8.0～9.0；所述避光反应的温度为4℃～37℃，避光反应的时间为0.5～24小时。
10.根据权利要求5所述的一种睾酮酶结合物的制备方法，其特征在于：所述除去未反应完全的睾酮衍生物的方法有超滤法、或透析法、或脱盐柱法，除去未反应完全的睾酮衍生物后，加入保护剂，得到睾酮酶结合物，所述保护剂优选为甘油。
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