DE2223385A1 - Ligandenbestimmung mit enzymen durch rezeptorverdraengung - Google Patents

Description

Ligandenbestimmung mit Enzymen durch Rezeptorverdrängung

Es besteht ein fortgesetztes Bedürfnis nach schnellen, genauen qualitativen und quantitativen Bestimmungsmethoden für biologisch aktive Substanzen in äußerst niedrigen Konzentrationen. Der Zweck der Bestimmung kann äußerst vielseitig sein. Es besteht heute ein großes Bedürfnis, die Anwesenheit von Drogen oder Narkotika in Körperflüssigkeiten, wie Speichel, Blut oder Urin zu bestimmen. Weiterhin ist es bei der medizinischen Diagnose häufig wichtig, die Anwesenheit verschiedener Substanzen, die auf natürlichem Wege durch den Körper synthetisiert werden bzw. eingenommen werden, nachzuweisen. Hierbei handelt es sich z.B. um Hormone, und zwar sowohl um Steroidhormone als auch um Polypeptide, weiterhin um Prostaglandine, Toxine und andere Substanzen, die an Körperfunktionen beteiligt sind. Häufig handelt es sich um äußerst kleine Mengen und gelegentlich um sehr geringe Konzentrationsunterschiede.

Um diesen Bedürfnissen zugenügen, wurde eine Anzahl von Methoden zur Analyse von Substanzen in Spurenmengen entwickelt.

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Ein übliches Verfahren ist die Dünnschichtchromatographie. Durch Bestimmung der Strömungsfaktoren und durch Verwendung spezifischer Reagentien kann die Anwesenheit gewisser Substanzen nachgewiesen werdenj in vielen Fällen kann die jeweilige Substanz isoliert und quantitativ bestimmt werden, beispielsweise durch Massenspektroskopie oder durch Gaschromatographie. Die Dünnschichtchromatographie hat jedoch eine Reihe von Nachteilen, d.h. sie ist langsam, erfordert bei ihrer Ausführung sehr viel Übung, wird durch eine Vielzahl von Substanzen gestört und ihre Zuverlässigkeit unterliegt starken Schwankungen. Das Fehlen befriedigender Alternativen führte deshalb zu intensiven Forschungsanstrengungen, um verbesserte Trenn~ und Nachweismethoden zu entwickeln.

Eine Alternative zur Dünnschichtchromatographie ist die Radioimmunanalyse. Hierbei werden Antikörper für spezifische Haptene oder Antigene verwendet. Es wird ein radioaktives Analoges mit einem radioaktiven Atom mit starker Strahlungsintensität verwendet, das mit dem Antigen verbunden wird. Durch Vermischen eines Antikörpers mit Lösungen des Haptens oder Antigens und des radioaktiven Haptens oder Antigen-Analogen wird das radioaktive Analoge daran gehindert, sich mit dem Antikörper zu verbinden, und zwar in einer Menge, die in direkter Beziehung zu der Konzentration des Haptens oder Antigens in der Lösung steht. Wird dann das freie radioaktive Analoge von dem an den Antikörper gebundenen radioaktiven Analogen getrennt, kann die Menge des Haptens oder Antigens in der ursprünglichen Lösung bestimmt werden.

Die Verwendung radioaktiver Substanzen ist aus vielen Gründen unerwünscht. Einmal verursacht die Radioaktivität Schwierigkeiten bei der Handhabung sowie unerwünschte Gefahren.

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Weiterhin ist die Herstellung dieser Verbindung mit ähnlichen Gefahren verbunden, die noch dadurch vergrößert werden, daß wesentlich größere Mengen an radioaktiven Substanzen vorhanden sind. Weiterhin ist für die Verwendung radioaktiver Substanzen eine Erlaubnis der zuständigen Behörden erforderlich, wobei die Erlaubnis jederzeit widerrufen und von Mindestanforderungen abhängig gemacht werden kann. Diese Anforderungen können sich im Laufe der Zeit ändern, so daß der Inhaber der Erlaubnis zusätzliche Kosten und Unbequemlichkeiten hat. Weiterhin ist die Trennung des gebundenen und nichtgebundenen radioaktiven Analogen schwierig und mit Fehlern behaftet (vgl. z.B. Abraham, Prelim. Comm., 2_9_, 866 (1969).

Außer den vorstehend genannten Substanzen sind Bestimmungsmethoden bei äußerst niedrigen Konzentrationen auch bei einer Vielzahl von Schädlingsbekämpfungsmitteln, wie Insecticiden, Baktericiden, .Fungiciden usw. sowie bei anderen organischen Substanzen, die die Luft und das Wasser verunreinigen, erwünscht. Organische Verunreinigungen können analysiert werden, wenn es gelingt, einen geeigneten Rezeptor zu finden und die verunreinigende Substanz gegenüber den verwendeten Reagentien inert ist.

Die Anwendung der Radioimmunanalyse ist in zwei Aufsätzen von Murphy, J. Clin. Endocr., 27, 973 (1967); ibid 28, 343 (1968) beschrieben. Die Verwendung von Peroxydase als Markierungssubstanz bei der immunochemischen Bestimmung von Antigenen und Antikörpern ist von Stanislawski et al, CR. Acad Sei. Ser. Do 1970, 271 (16)_r 1442-5 (CA. 74 1144B) beschrieben. Weiterhin wird auf die Arbeit von Nakane et al., J«, of Histochem. and Cytochem_o, 14» 929 (1967) und Avrameas, Int. Rev» of Cytology 27, 349 (1970) verwiesen. Eine allge-

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meine Beschreibung der Dünnschichtchromatographie für analytische Zwecke findet sich bei Stahl, Thin Layer Chromatography, Springer-Yerlag, New York, 1969. Schließlich wird auf Peron et al, Immunologie Methods in Steroid Determination, Appleton-Century-Crofts, New York, 1970, hingewiesen.

Erfindungsgemäß wird eine Bestimmung von Liganden in äußerst niedrigen Konzentrationen durch Anwendung spezifischer Rezeptorstellen für den Liganden und durch Enzymverstärkung (enzyme amplification) der Ligandenverdrängung (ligand displacement) erzielt. Indem man einen Liganden oder einen "nachgemachten¹¹ Liganden (counterfeit) dieser Ausdruck ist dem Geldwesen entnommen und bedeutet "Fälschung" oder "Blüte") mit einem Enzym verbindet, während man die enzymatische Aktivität aufrechterhält, worauf man den an das Enzym gebundenen Liganden mit einem Rezeptor für den Liganden kombiniert, kann man die Anwesenheit und die Menge des Liganden in einer unbekannten Lösung leicht bestimmen. Infolge des Wettbewerbes zwischen dem an das Enzym gebundenen Liganden und dem freien Liganden um die Rezeptorstellen können die beiden Ligandenformen, die gleichzeitig oder nacheinander dem Rezeptor zugesetzt werden, aufgrund der unterschiedlichen enzymatischen Aktivität bei vorhandenem oder fehlendem Liganden nach einer speziellen Analysenmethode bestimmt werden. Diese Differenz steht in Beziehung mit der in der unbekannten Lösung vorhandenen Menge an Ligand. Die enzymatische Aktivität kann leicht in an sich bekannter Weise bestimmt werden, indem man die Koreentrationsänderungen eines Enzymsubstrates oder -Produktes des Substrats nach Standardmethodeibestimmt.

Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis bzw. zur Bestimmung äußerst kleiner Konzentrationen von verschiedenartigen Substanzen, wobei die Anwesenheit

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einer bestimmten unbekannten Substanz mit der enzymatischen Aktivität in Beziehung gesetzt wird. Eine Verstärkung wird dadurch erzielt, daß aufgrund der Anwesenheit eines Moleküls eine große Anzahl von Molekülen gebildet oder umgewandelt wird. Diese Verstärkung wird dadurch erzielt, daß die zu analysierende Verbindung bzw. die "nachgemachte" Verbindung mit einem Enzym verbunden wird. Diese Anordnung wird als ^wan das Enzym gebundener Ligand" bezeichnet. Das jeweils zu analysierende Molekül wird als Ligand bezeichnet« Das Ligand~Analoge ist entweder ein Ligand, der durch Ersatz eines Protons durch eine verbindende Gruppe zum Enzym modifiziert ist, oder ein "nachgemachter" Ligand, bei dem es sich um einen Liganden handelt, der auf andere Weise als durch einfachen Ersatz eines Protons zwecks Erzeugung einer verbindenden Stelle zum Enzym modifiziert ist. Der Ligand und der an das Enzym gebundene Ligand sind in der Lage, um spezifische Rezeptorstellen in Wettbewerb zu treten. Es können auch andere Verbindungen mit sehr ähnlicher Struktur als Liganden dienen, die um diese Stellen in Wettbewerb treten können; z.B. treten Morphin-Glucuronid und Codein mit an Enzym gebundenem Morphin in Wettbewerb, um sich mit gewissen Arten von Morphin-Antikörpern zu verbinden. In den meisten Fällen ist dies von Vorteil, da auf diese Weise eine ganze Klasse von physiologisch eng verwandten Verbindungen analysiert werden kann.

Es können sowohl homogene, als auch heterogene Systeme für die Analysen verwendet werden. In einem homogenen System ist eine Trennung der Reagentien nicht ganz einfach, weshalb derartige Systeme auf diejenigen Fälle beschränkt sind, in denen eine Signifikante Inhibition der enzymatischen Aktivität auftritt, wenn der an das Enzym gebundene

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Ligand an den Rezeptor gebunden ist. Obgleich homogene Systeme einfacher sind, eind heterogene Systeme, bei denen der Rezeptor an einen Träger gebunden werden muß, vielseitiger, da für die Analyse unterschiedliche Analysenmethoden angewendet werden können.

Bei dem Verfahren im homogenen System wird der an das Enzym gebundene Ligand mit einem hochmolekularen Rezeptor kombiniert, wobei eine Inhibition der enzymatischen Aktivität eintritt. Werden der Ligand und der an das Enzym gebundene Ligand in eine Lösung eingebracht, die den Ligand-Rezeptor enthält, so wird die enzymatische Aktivität der Lösung nach der Kombination der drei Substanzen durch die Konzentration des in der Lösung vorhandenen Liganden beeinflußt, d.h» der an das Enzym gebundene Ligand und der freie Ligand treten um die Rezeptorstellen in Wettbewerb. Liegt eine unzureichende Anzahl von Rezeptorstellen am Gleichgewicht vor, so steht die Anzahl der an das Enzym gebundenen Ligand-Moleküle, die durch den Rezeptor nicht inhibiert sind, in direkter Beziehung mit der Anzahl der in der Lösung vorhandenen Ligand-Moleküle. Man kann diesen Zustand auf zwei Wegen erreichen? (1) Entweder durch Wettbewerb, wobei der an das Enzym gebundene Ligand und der freie Ligand praktisch gleichzeitig mit dem Rezeptor zusammengebracht werden, oder (2) der an das Enzym gebundene Ligand oder der freie Ligand können dem Rezeptor zuerst zugesetzt werden, worauf man das System ins Gleichgewicht kommen läßt und anschließend den Liganden bzw. den an das Enzym gebundenen Liganden zusetzt, um das ursprünglich zugesetzte Material zu verdrängen,. Da die enzymatische Aktivität sich vermindert oder inhibiert wird, wenn der an das Enzym gebundene Ligand am Rezeptor gebunden wird, steht die enzymatische Aktivität der Lösung direkt mit der Menge des in der Lösung vorhandenen Liganden in Beziehung.

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Die Konzentrationen der Reagentien, nämlich des an das Enzym gebundenen Liganden und des Rezeptors, können in weiten Grenzen variiert werden. Normalerweise liegt die Konzentration des Rezeptors und des an das Enzym gebundenen Liganden zwischen etwa 10 bis 10" Mol, gewöhnlich von

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etwa 10 bis 10 Mol. Die untere Grenze für die Konzentration des an das Enzym gebundenen Liganden ist durch die Nachweisgrenze bestimmt. Diese ändert sich mit den jeweiligen Enzymen und den jeweiligen Nachweissystemen.

Die Menge des Rezeptors wird normalerweise nach den Rezeptorstellen berechnet und ändert sich mit der Konzentration an enzymgebundenem Liganden, dem Verhältnis zwischen Liganden und Enzym im enzymgebundenen Liganden und der Affinität des Rezeptors gegenüber dem Liganden. Gewöhnlich ist mindestens 1,0-aktive Rezeptorstelle je Molekül enzymgebundener Ligand und weniger als etwa 20 aktive Stellen je Molekül Ligand als enzymgebundener Ligand vorhanden, doch kann das Verhältnis zwischen den Rezeptorstellen und den Molekülen auch bis zu 1000:1 gehen, was von der Art der·Analyse und der Affinität des Rezeptors abhängt. Vorzugsweise beträgt das Verhältnis der aktiven Stellen am Rezeptor zu den Molekülen des mit dem Enzym gebundenen Liganden mindestens 2:1, während das Verhältnis zwischen den aktiven Stellen des Rezeptors zum Ligänden als e'nzymgebundenem Liganden weniger als etwa 5:1 beträgt. Das Verhältnis hängt in starkem Ausmaß von den Bindekonstanten und der vermuteten Menge Ligand ab. Das Verfahren zur Bestimmung der Bindestellen für den Rezeptor ist nachstehend im experimentellen Teil angegeben.

Bei dem an das Enzym gebundenen Liganden liegt das Verhältnis zwischen den Enzym-Untereinheiten und dem Liganden im Bereich von etwa 0,01· bis 100:1, häufig zwischen etwa 0,02 bis 50:1 und noch häufiger zwischen etwa 0,04 bis 25:1

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(bei Proteinen sollen die Protein-Untereinheiten als Liganden gelten). Die Höchstzahl der Enzymeinheiten je ligand wird durch die Art dee Liganden und sein Molekulargewicht bestimmt. Bei niedrigmolekularen Enzymen mit einem Molekulargewicht von etwa 12.000 bis 80.000 sind etwa 1 bis 40, gewöhnlich 2 bis 35 Liganden je Enzym-Untereinheit vorhanden. Im allgemeinen liegt nur eine Enzym-Einheit auf ein Molekulargewicht des Liganden von 2000, gewöhnlich nur eine Enzym-Einheit auf ein Molekulargewicht von 4000 des Liganden und normalerweise eine Enzym-Einheit auf ein Molekulargewicht von 6000 des Liganden vor. Diese Werte sind Durchschnittswerte für die Zusammensetzung des an das Enzym gebundenen Liganden.

In einigen Fällen verbinden sich mehrere Enzyme in einer stabilen Anordnung zu einem Multienzymkomplex. Wegen der gleichzeitigen Anwesenheit der Enzyme kann eine Anzahl von Reaktionen nacheinander in wirksamer' Weise durchgeführt werden, wobei hohe lokalisierte Konzentrationen an Reaktionsteilnehmern vorliegen. Deshalb kann der Ligand mit einer Kombination von Enzymen verbunden werden, wodurch mehrere Enzyme je Ligand vorhanden sind. Wenn mehrere Liganden mit dem Multienzymkomplex verbunden sind, kann das Molverhältnis zwischen Enzymen und Ligand 1:1 betragen, obgleich tatsächlich mehrere Enzyme und Liganden in einer einzigen Aggregation vorliegen. Die Anzahl der verbundenen Enzyme (entweder als Multienzymkomplex oder nach einem anderen Mechanismus) liegt selten über 20, gewöhnlich nicht über 10 und üblicherweise im Bereich von 2 bis 5 Enzymen.

Wenn alle anderen Parameter gleich sind, so ist die Empfindlichkeit der Analyse umso größer, je größer die Zahl der Enzyme je großen Ligand ist. Die Enzyme können aber die

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Rezeptorerkennuns stören, die Löslichkeit beeinflussen und auch auf andere Weise nachteilig sein« Deshalb ist die Anzahl der mit einem Liganden verbundenen Enzyme derart., daß nicht mehr als eine Enzym-Polypeptidkette auf ein Molekulargewicht von 2000 des Liganden vorhanden ist.

Wenn der Ligand ein großer organischer Komplex, z«B_o eine Zelle oder ein Virus ist, so geht die Zahl der an die Zelle, oder das Virus gebundenen Enzymeinheiten in die lausende, damit die gewünschte Empfindlichkeit erreicht wird. Die Anzahl der gebundenen Enzymeinheiten soll ausreichen, um nachweisbare Veränderungen des Substrates zu verursachen, soll jedoch nicht so groß sein, daß die Erkennung durch den Rezeptor verhindert wird»

Die Anzahl der mit einem Enzym verbundenen Liganden hängt von folgenden Faktoren ab·:

Den für die Bindung mit dem Liganden verfügbaren Stellen, der Anzahl der zur Erzielung des gewünschten Effektes notwendigen Liganden (z«B_o zur Erzielung des Inhibitionseffektes, wenn der Ligand mit dem Antikörper verbunden wird), dem Einfluß der Anzahl der an das Enzym gebundenen Liganden auf die Löslichkeit und die Aktivität, sowie von allosterischen Effekten usw«

In einem gewissen Grad können die Wirkungen der Ligandensubstitution auf das Enzym modifiziert werden«, Beispielsweise kann bei der Bindung des Liganden an Lysin mittels einer Carboxylgruppe und bei einem neutralen Ligandenmolekül eine verbindende Gruppe mit einer positiven Ladung, z.B. Ammonium, verwendet werden; man kann auch eine verbindende Gruppe verwenden, die auf den pH-Wert ähnlich wie das Lysin anspricht, ζ·Β. ein Amin. Ist der Ligand stark lipophil, ζ·Β. Testosteron, so ist es gewöhnlich erwünscht, die Anzahl der am Enzym gebundenen Liganden möglichst niedrig

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zu halten. Gehört der Ligand demselben Ladungstyp wie die verdrängte Gruppe an, so wird gewöhnlich eine ungeladene verbindende Gruppe Verwendete Auoh durch Änderung der Funktionalität der verbindenden Gruppe kann die Anzahl der am Enzym gebundenen Liganden und der Stellen, an denen der Ligand gebunden ist, variiert werden_e

Die Konzentrationen an Rezeptor und Enzym stehen mit dem Konzentrationsbereich des zu analysierenden Liganden in Beziehung. Die zu analysierende Lösung wird unmittelbar verwendet, es sei denn, daß der Ligand in einer verhältnismäßig hohen Konzentration vorhanden ist. Bei einer hohen Kozentration wird die unbekannte Lösung bis auf eine geeignete Konzentration verdünnt» In vielen interessierenden biologischen Systemen ist die zu analysierende Substanzmenge jedoch verhältnismäßig gering, weshalb gewöhnlich eine Verdünnung des unbekannten Substrats nicht notwendig ist.

Bei dem Verfahren im homogenen System wird ein löslicher Rezeptor für den jeweiligen Liganden verwendete Z»B. sei als Ligand das Hapten, d_oh. das Morphin, angenommen, wobei dann der Rezeptor ein für Morphin spezifischer Antikörper ist« Nur am Rand sei erwähnt, daß Antikörper im allgemeinen die Molekülform und die Verteilung der polaren Gruppen in einem Liganden "erkennen", wobei ein anderer Teil des Moleküls stark modifiziert sein kann, ohne daß das "Erkennen" verlorengeht. Zum Beispiel können sowohl Morphin, als auch sein Glucuronid mit gewissen Morphin-Antikörpern verbunden werden.

Ein Enzym wird zuerst dadurch modifiziert, daß man ein oder mehrere Morphinmoleküle mit dem Enzym verbindet. Es kann jedes beliebige Enzym verwendet werden, das mit einem leicht nachweisbaren Substrat reagierte

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Es wird eine Lösung des Antikörpers in der erforderlichen Konzentration hergestellt, wobei nur einige Mikroliter der Lösung erforderlich sind. Der Antikörper, der auf einem pH-Wert gehalten wird, bei dem er das Morphin wirksam bindet, wird in eine Lösung des an das Enzym gebundenen Morphins bei der gewünschten Konzentration eingebracht. Das Reaktionsvermögen der vereinigten Lösung von Antikörper und enzymgebundenem Morphin kann dadurch bestimmt werden, daß man einen gemessenen Anteil herausnimmt, diesen unter den Bedingungen, bei denen das Enzym aktiv ist, zum Substrat gibt und die spektroskopische Veränderung als Funktion der Zeit bei einer konstanten Temperatur bestimmt«) Die Geschwindigkeit dieser Änderung ist das Ergebnis, das erhalten werden sollte, wenn in der unbekannten Lösung kein Morphin vorhanden ist.

Dann wird ein zweiter gemessener Anteil entnommen und der unbekannten Lösung zugesetzt. Die unbekannte Lösung kann das Substrat und beliebige andere Zusätze enthalten, die zur Erzielung einer enzymatischen Aktivität notwendig sind. Man kann aber auch zuerst die unbekannte Lösung mit dem Komplex aus Antikörper und enzymgebundenem Morphin kombinieren, und ins Gleichgewicht bringen und anschließend mit dem Substrat vermischen· In jedem Fall wird die Inderungsgeschwindigkeit im Spektrum bestimmte Eine Variante des vorstehend beschriebenen Verfahrens besteht darin, daß man ein Gemisch aus enzymgebundenem Morphin und unbekannter Lösung dem Antikörper zusetzt, worauf man diese Lösung dem Substrat zusetzt. Es sind auch andere Varianten leicht vorstellbarο -

Wenn alle Konzentrationen an Reagentien, ausgenommen Morphin, konstant gehalten und mehrere Morphin-Standard-Lösungen verwendet werden, kann die Veränderung des Spektrums über bestimmte Zeiträume mit den Morphinkonzentrationen in Beziehung gesetzt werden= Das standardisierte System kann also dann zur schnellen, genauen und wirksamen Bestimmung

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der Menge des Morphins oder eines anderen Liganden in der unbekannten Lösung verwendet werden.

In einigen Fällen.werden heterogene Systeme bevorzugt. Dies gilt insbesondere dann, wenn der Rezeptor das am Liganden gebundene Enzym beim Binden des enzymgebundenen Liganden am Rezeptor nicht ausreichend inhibiert. Heterogene Systeme werden auch dann bevorzugt, wenn die Bedingungen, unter denen der enzymgebundene Ligand enzymatisch aktiv ist, deutlich verschieden von den Bedingungen sind, unter denen der Rezeptor bezüglich der Bindung des Liganden aktiv ist· Beispielsweise kann ein Rezeptor bei einem pH-Wert um 7 sehr aktiv, dagegen bei einem basischen pH-Wert verhältnismäßig inaktiv sein, während die Enzymaktivität bei einem höheren pH-Wert zunehmen kann. Das heterogene System ist auch in anderen Fällen günstiger. Beispielsweise kann bei einem großen Volumen einer unbekannten Lösung mit einer sehr geringen Konzentration eine Kolonne des enzymgebundenen Liganden, der an einen Träger gebunden und mit einem Rezeptor zu einem Komplex vereinigt ist, verwendet werden,. Dann kann die gesamte unbekannte Substanz in der Probe zur Aktivierung des Enzyms verwendet werden, ohne daß das Enzym verdünnt wird, indem die unbekannte Lösung durch die Kolonne, geleitet wirdo Das so aktivierte Enzym in der Kolonne kann dann durch Zugabe des Enzymsubstrates zu der Kolonne und spektroskopische Untersuchung des Ausflusses analysiert werden.

In heterogenen Systemen können entweder der enzymgebundene Ligand, der Rezeptor oder der Ligand an einen Träger gebunden werden. Die Verwendung des Trägers ermöglicht eine leichte Trennung des daran gebundenen Reagens von der überstehenden Lösung. Die Trennung kann auf folgende Weise erfolgen: (1) Zentrifugieren einer Suspension des Trägers, (2) Verwendung dös Trägers in einer Kolonne, durch die die Lösungen filtriert werden oder (3) durch Verwendung eines

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zweidimensionalen Trägers, wie Papier, über den die Löaungen geleitet werden. Wenn der enzymgebundene Ligand an einen Träger gebunden wird, so wird der Träger gleichzeitig oder anschließend mit dem Rezeptor und der unbekannten Lösung, die den Liganden enthält, in Berührung gebracht. Nach dem Erreichen des Gleichgewichts wird der Träger mechanisch von der Lösung getrennt und unter Bedingungen, die eine maximale Enzymaktivität begünstigen und die Bindung des Rezeptors aufrechterhalten, mit dem Substrat behandelt. Die Größe der enzymatischen Aktivität hängt von der Menge des in der unbekannten Lösung vorhandenen Liganeten ab«

Wenn der Rezeptor an einen Träger gebunden ist, so ist das Enzym über den Liganden,an den es gebunden ist, mit dem Rezeptor verbunden. Bei gleichzeitiger oder anschließender Zugabe einer einen Liganden enthaltenden Lösung und des enzymgebundenen Liganden zu dem an den Träger gebundenen Rezeptor steht die Menge des nicht am Träger gebundenen enzymgebundenen Liganden mit der Konzentration des Liganden in Beziehung. Die Lösung kann dann vom Träger getrennt werden, doho das freie Enzym wird von dem am Träger gebundenen Enzym getrennt, worauf das Substrat zum freien Enzym gegeben und die enzymatische Aktivität bestimmt wird.

Die enzymatische Aktivität steht natürlich mit der Menge des zusammen mit dem enzymgebundenen Liganden in der Lösung, in der der am Träger gebundene Rezeptor dispergiert ist, vorhandenen Liganden in Beziehung. Dieses Verfahren hat den großen Vorteil, daß der Rezeptor die. Enzymaktivität nicht inhibiert, da das infolge der Anwesenheit des Liganden nicht gebundene Enzym von dem am Träger gebundenen Enzym getrennt wird« Deshalb kommt das Substrat nur mit dem aufgrund der Anwesenheit des Liganden freien Enzym in Berührung, und jede Änderung der Substratkonzentration ist direkt proportional der Menge des Liganden in Berührung mit dem Träger.

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Bei einem anderen heterogenen System, bei dem der Rezeptor ebenfalls nicht die Enzymaktivität inhibiert, ist der ligand an einen !Präger gebunden. Ein mehrwertiger Rezeptor, d.h. ein Rezeptor mit mehr als einer Bindestelle, z.B. ein Antikörper, wird gleichzeitig oder anschließend mit der den Liganden enthaltenden Lösung zu dem Träger gegeben. Die Menge des Rezeptors, die den an den Träger gebundenen Liganden bindet, und die Anzahl der freien Bindestellen an den Rezeptoren hängen von der Menge des freien Liganden in der ursprünglichen Lösung ab; die Menge des enzymgebundenen Liganden, die sich nicht mit dem Träger verbindet, steht dann wie bei dem vorstehend beschriebenen Verfahren mit der Konzentration des Liganden in Beziehung.

Die Analysen werden gewöhnlich bei mäßigen Temperaturen, im allgemeinen im Bereich von etwa 10 bis 50⁰G, gewöhnlich im Bereich von etwa 15 bis 40⁰C, durchgeführt» Der pH-Wert der zu analysierenden Lösung liegt im allgemeinen im Bereich von etwa 5 bis 10, gewöhnlich im Bereich von etwa 6 bis 9.

Ob in Anwesenheit von Sauerstoff oder in einer inerten Atmosphäre gearbeitet wird, hängt von der jeweiligen Analyse ab. Wenn Sauerstoff stört, so wird normalerweise eine inerte Atmosphäre verwendete Normalerweise werden hydroxylgruppenhaltige Medien verwendet, insbesondere wäßrige Medien, da in diesen Medien das Enzym aktiv ist. Es können aber auch 0 bis 40 YoI.-# anderer Flüssigkeiten als Hilfslösungsmittel vorhanden sein, z.B. Alkohole, Ester, Ketone, Amide usw. Die Auswahl des jeweiligen Hilfslösungsmittels hängt von den anderen, im Medium vorhandenen Reagentien, dem Einfluß auf die Enzymaktivität und anderen erwünschten oder unerwünschten Wechselwirkungen mit dem Substrat oder den Produkten ab.

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Falls es zweckmäßig erscheint, können die Reagentien in trockener Form auf einem Grundmaterial niedergeschlagen werden, so daß sie "beim Einbringen in ein flüssiges Medium,, insbesondere eine Körperflüssigkeit, wie Speichel, Urin oder Serum, aktiviert werden und auf die Anwesenheit eines Liganden ansprechen«, Wenn das Enzymsubstrat ein leicht nachweisbares (zoBo durch Farbänderung) Produkt bildet, so kann die Anwesenheit oder Abwesenheit des jeweiligen Liganden bestimmt werden«.

Wie schon gesagt, können Antikörper häufig eine ganze Verbindungsgruppe "erkennen", wenn die Geometrie und die räumliche Verteilung der polaren Gruppen ähnlich ist. Häufig kann die Spezifizität des Antikörpers dadurch variiert werden, daß man die Haptenstruktur und die Art der Bindung mit dem Antigen bei der Erzeugung der Antikörper variiert. In einigen Fällen kann es erwünscht sein, zwei oder mehrere Antikörper, gewöhnlich nicht mehr als 6 Antikörper, zu verwenden, so daß die Antikörper-Reagenslösung in der Lage ist, eine ganze Verbindungsgruppe, z„B. Barbiturate, oder mehr als eine Verbindungsgruppe, z_oB_e Morphin und Barbiturate, nachzuweisenο Dies kann besonders dann wertvoll sein, wenn man eine Probe daraufhin untersucht, ob ein Vertreter einer Verbindungsgruppe vorhanden ist oder ob eine spezielle Klasse von Verbindungen vorhanden ist, z«,B₀ mißbräuchlich verwendete Drogen oder Gesehlechtshormone. Wenn Kombina-* tionen von Antikörpern verwendet werden, so ist es gewöhnlich nötig, entsprechende Kombinationen von enzymgebundenen Liganden zu verwenden_o

Liganden

Bei einer allgemeinen Betrachtung der Reagentien ist zuerst der Ligand zu berücksichtigen« Es können alle Liganden verwendet werden, die von biologischem Interesse sind und für

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die ein geeigneter Rezeptor mit einer ausreichenden Spezifizität für den Liganden gefunden werden kann. In der neueren Literatur sind viele Arbeiten über Rezeptoren für eine zunehmende Zahl von biologisch aktiven Substanzen zu finden. Verbindungen, für die Rezeptoren zur Verfügung stehen, umfassen einfache Phenylalkylämine, ζ.,B. Amphetamln bis hochmolekulare Polymere, z.B. Proteine und Polysaccharide« Neben Verbindungen oder Gemischen von verwandten Verbindungen können gewisse Systeme von organischen Verbindungen, z.B. Zellen und Viren, nach immunanalytischen Methoden nachgewiesen werden. Deshalb sind Beschränkungen hinsichtlich des Molekulargewichtes oder der Zusammensetzung der Verbindungen oder Systeme, die analysiert werden können, nicht gerechtfertigt.

Die Liganden umfassen solche Verbindungen, die Narkotika, Hypnotika, Sedativa, Analgetika, Antipyretika, Anästhetika, psychogene Drogen, Muskelrelaxantien, Stimulantien für das Nervensystem, Anticholinesterase-Mittel, parasympathomimetische Mittel, sympathomimetische Mittel, i^C-adrenergische Blockiermittel, antiandrenergische Mittel, ganglienstimulierende- und -blockierende Mittel, neuromu&ulärblockierende Mittel, Histamine, Antihistamine, 5-Hydroxytryptamin und Ant.agonisten, cardiovaskuläre Drogen, antiarrhythmische Drogen, Antihypertensiv-Mittel, vasodila- -torische Drogen, Diuretika, Pesticide (Fungicide, Antihelminthica, Insecticide, Ektoparasiticide usw.), Antimalariadrogen, Antibiotika, Antimetaboliten, Hormone, Vitamine, Zucker, Thyroid- und Antithyroid-Drogen, Corticosteroide, Insulin und orale hypoglämische Drogen und Stoffwechselprodukte darstellen.

Diese Drogen und Mittel umfassen beispielsweise Alkaloide, Steroide, Polypeptide, Prostaglandine, Catecholamine, Xanthine, Arylalkylamine, heterocyclische Verbindungen, ζ.Ββ Thiazine, Piperazine, Indole und Thiazole} Aminosäuren usw.

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Im allgemeinen sind die Liganden organische Verbindungen mit einem Molekulargewicht von etwa 100 bis 10 , gewöhnlich von etwa 125 bis 40.000, insbesondere von etwa 125 bis 20.000. Die liganden haben gewöhnlich etwa 8 bis 50.000 Kohlenstoffatome und etwa 1 bis 35oOOO Heteroatome.

Ein großer Teil der Liganden sind Monomere oder niedrigmolekulare Polymere mit Molekulargewichten im Bereich von etwa 100 bis 2000, gewöhnlich von etwa 125 bis 1000. Ein weiterer großer Teil der Liganden sind Polymere (Verbindungen mit wiederkehrenden Einheiten) mit Molekulargewichten im Bereich von etwa 750 bis 1_e000.000, häufig von 2000 bis 100ο000 und gewöhnlich von 2000 bis 50.000. Handelt es sich um Polymere mit wechselndem Molekulargewicht, so soll sich das angegebene Molekulargewicht auf das durchschnittliche Molekulargewicht beziehen.

Die Liganden sind normalerweise aus Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel, Phosphor, Halogen und Metallen, hauptsächlich in Form der Kationen, z.B. von Alkali- und Erdalkalimetallen und den Metallen der Gruppen IB, HB, VIIB und VIIIB, insbesondere der dritten Reihe des Periodensystems, zusammengesetzt_β Insbesondere sind die Liganden hauptsächlich aus Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel zusammengesetzt.

Strukturell können die Liganden Monomere oder Polymere darstellen, wobei es sich um acyclische, mono- oder pölycyclische Verbindungen mit carbocyclischen oder heterocyclischen Hingen handeln kann. Die Liganden können eine Vielzahl von funktioneilen Gruppen, z.Bo Halogen, Oxocarbonyl, Nicht-Oxocarbonyl, Amino-ßxy (Hydroxy', Aryloxy, Alyloxy und Cycloalyloxy £"*"alyl" bedeutet einen einwertigen aliphatischen Rest__7), Thiooxy-, Dithio», Hydrazo-und Kombinationen dieser Gruppen darstellen.

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Die Iiiganden können in drei verschiedene Kategorien eingeteilt werden, die sich durch ihre biologische Wechselwirkung mit dem Rezeptor "bestimmen. Die erste Kategorie umfaßt die Antigene, die beim Einführen in den Blutkreislauf eines Vertebraten zur Bildung von Antikörpern führen. Die zweite Kategorie umfaßt die Haptene, die in Bindung mit einem Protein bei der Einführung in den Blutkreislauf eines Vertebraten die Bildung von Antikörpern verursachen, welche spezifisch für das Hapten sindo Die dritte Kategorie von Liganden umfaßt solche mit natürlich vorkommenden Rezeptoren in lebenden Organismen, wobei die Rezeptoren in einer für den Liganden spezifischen Form isoliert werden können·

Biologische Substanzen, die für eine Art von Lebewesen spezifisch sind und in dieser Art natürlich vorkommende Rezeptoren besitzen, können natürlich auch Haptene sein, wenn sie an ein Protein gebunden sind und einem Lebewesen der gleichen oder einer anderen Art verabreicht werden. Deshalb ist die Klassifizierung etwas willkürlich, da der Ligand gegenüber einer Art ein Antigen, gegenüber einer anÄeren Art ein Hapten sein kann und bei einer dritten Art natürlich vorkommende Rezeptoren besitzen kann.

Die Antigene fallen zum größten Teil in die Gruppe der Proteine oder Polysaccharide und sind gegenüber dem Lebewesen, dem sie injiziert werden, Fremdsubstanzen.

Die wichtigsten Vertreter von Liganden für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sind die Haptene. Unter Haptenen versteht man Substanzen, die bei der Injizierung keine Antikörperbildung verursachen, die aber in der Lage sind, spezifisch mit Antikörpern zu reagieren, um entweder eine Fällung zu erzeugen oder zu verhindern. Diese Definition umfaßt nicht nur die einfachen chemischen Substanzen, die die Determinanten der Spezifiziiät sind, wenn sie mit Proteinen verbunden werden und die eine Fällung verhindern,

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sondern auch Substanzen aus natürlichen Quellen, z.B« die für Pneumoooccen spezifischen Polysaccharide und Dextrane, die beim Kaninchen bei der Erstinjektion keine Antigenbildung verursachen (Definition nach Kabat et al₀, Experimental Immunoehemistry, Charles C. Thomas, Springfield, Illinois (1967))ο In der nachstehenden Diskussion ist der Begriff "Hapten" beschränkt auf nicht-antigene Gruppen, die künstlich in Proteine eingeführt werden, die die Spezifizität beeinflussen und die für diese Gruppen gelten, ganz gleich,ob die Gruppe mit dem Protein verbunden ist oder nicht.

Die dritte Gruppe von Liganden umfaßt diejenigen mit natürlich vorkommenden Rezeptoren. Diese Rezeptoren können Proteine, Nucleinsäuren, wie Ribonucleinsäure (RNS) oder Desoxyribonucleinsäure (DNS) oder Membranen, die mit Zellen assoziiert sind, sein_o Beispiele für solche Liganden mit natürlich vorkommenden Rezeptoren sind Thyroxin, viele Steroide, wie die östrogene, Cortison, Corticosteron und Östradiolj Polypeptide, wie Insulin und Angiotensin II, sowie andere, natürlich vorkommende biologisch aktive Verbindungen,, Vergleiche z.B. Murphy et al., Jo Clin. Endocr_o, 24, 187 (1964); Murphy, ibid 27, 973 (1967)·, ibid 28, 343 (1968)} BBA, 176, 626 (1969)J McEwen et al, Nature, 226, 263 (197P); und Morgan et al, Diabetes (1966); Page et al, ibid, 28, 200 (1969)«

Die Liganden können auch aufgrund der chemischen Familien, die in der Literatur akzeptiert wurden, eingruppiert werden. In einigen Fällen sind für die Zwecke der Erfindung in eine Familie phyeiomimetische Substanzen eingeordnet, die hinsichtlich ihrer Struktur einem Teil der natürlich vorkommenden Struktur ähnlich sind und die physiologischen Eigenschaften der Natursubstanz entweder nachahmen oder hemmen. Auch Gruppen von synthetischen Substanzen, z.B. die Barbiturate und Amphetamine, sind in diesen Familien eingeschlossen,. Weiterhin können alle diese Verbindungen

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zur Bindung an das Enzym an einer Stelle, an der die biologische Aktivität zerstört werden kann, modifiziert sein. Diese modifizierten Verbindungen werden als "nachgemachte" liganden (ligand counterfeits) bezeichnete

Alkaloide

Die erste Kategorie umfaßt die Alkaloide„ In dieser Kategorie sind erfindungsgemäß auch solche Verbindungen eingeschlossen, die synthetisch hergestellt werden und als physiologische Ersatzstoffe für die natürlich vorkommenden Alkaloide in Frage kommen· Alle natürlich vorkommenden Alkaloide haben ein Aminstickstoffatom als heterocyolisches Glied· Die synthetischen Alkaloide enthalten normalerweise ein tertiäres Amin-Stickstoffatom, das gegebenenfalls auch ein heterocyclisches Glied darstellen kann. Die Alkaloide enthalten im Molekül eine Vielzahl von Funktionalitäten, z.B. Äther, Hydroxylgruppen, Ester, Acetale, Amine, Isoxazole, Olefine, von denen alle, in Abhängigkeit von ihrer bestimmten Stellung im Molekül, als Stellen zur Verbindung mit der Funktionalität des Enzyms verwendet werden können«.

Eine besonders bevorzugte Gruppe von Alkaloiden sind die Morphin-Alkaloide und ihre physiologisch nachgeahmten synthetischen Analogen₀ Alle diese Moleküle haben die nachstehend angegebene Funktionalität und Grundstruktur:

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worin die freien Valenzen durch sehr unterschiedliche Gruppen, hauptsächlich Kohlenstoff und Wasserstoff, abgesättigt sind.

Das an das Enzym gebundene Analoge zu diesen Verbindungen hat in den meisten Fällen die nachstehend angegebene Grundstruktur:

worin X eine Bindung oder eine Funktionalität, z„B. Imino, Azo, Oxy, Thio, Sulfonyl, Oxocarbonyl, Nicht-Oxocarbonyl oder Kombinationen dieser Funktionalitäten darstellt« Der Sauerstoff steht in der Ortho-, Meta- oder ß-Stellung. ¹A ist ein Enzym, das mit X an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle verbunden ist und bei dem ein großer Teil der natürlichen enzymatischen Aktivität erhaltengeblieben ist. Es ist nur ein X-A je Ligand-Molekül vorhanden, obgleich mehrere liganden über X mit dem Enzym A verbunden sein können. Wenn auf ein Molekül im Zusammenhang mit einem -X⁺-A⁺ Bezug genommen wird, so ist das Ligandenmolekül gemeint. Deshalb sollten die vorstehend und die nachsiöiend angegebenen Formeln nicht dahingehend ausgelegt werden, daß die Moleküle auf einen liganden je Enzym beschränkt werden. Dies ist nachstehend noch näher erläutert.

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Das an das Enzym gebundene Morphin und seine nahe verwandten Analogen haben die nachstehend angegebene Formel

worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:

Jede der Gruppen W kann -X⁺-A⁺ sein oder ein H jeder der Gruppen W kann durch -X -A ersetzt sein, worin X eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A , geteilt durch 2000, trägt, bedeuten;

Wasserstoff.oder ein Kohlenwasserstoff mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, insbesondere Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen und Aralkyl, Z₀B₀ Methyl und ß-Phenäthyl;

Wasserstoff;
Wasserstoff;

Wasserstoff oder zusammen mit W ein zweiwertiger Rest mit 3-6 Kohlenstoffatomen und 0-2 Sauerstoffatomen, der einen sechsgliedrigen carbocyclischen Ring mit der Kohlenstoffkette bildet, an die er gebunden ist, z_oB_o Propylen-1,3, 1-Hydroxyprop-2-enylen-1,3* 1-Hydroxy-

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propylen-1,3, 1-Acetoxypropylen-1,3, 1-Acetoxyprop-2-enylen-1,3, 1-Oxopropylen-1,3, 1-Oxoprop-2-enylenvi,3;

Wasserstoff oder Hydroxyl;

Wasserstoff, Hydroxyl oder zusammen mit W Oxy (-0-);

Wasserstoff oder Methyl;

Wasserstoff oder Hydroxyl;

Wasserstoff, Hydrqxy, Acyloxy mit 1-3 Kohlenstoffatomen, ZoBo Acetoxy (Acyloxy umfaßt nur Carboxy, falls nichts anderes gesagt ist), Hydrocarbyloxy mit 1-3 Kohlenstoffatomen, ζ.B₀ Methoxy, Äthoxy, 2-(N-morpholino)· äthoxy und Glucuronyl; und

β Wasserstoff (In allen Formeln sind die ungesättigten Valenzen durch Wasserstoff abgesättigt, ausgenommen wenn eine Grundstruktur angegeben ist).

Unter Hydrocarbyl versteht man einen organischen Rest, der nur aus Wasserstoff und Kohlenstoff zusammengesetzt ist und der gesättigt oder ungesättigt, aliphatisch, alicyclisch oder aromatisch sein kann bzw_o die entsprechenden Kombinationen enthalten kann.

Die eng verwandten Morphin-Analogen haben die nachstehend angegebene Formel

0-1 äthyleaisch ungesättigte Stellen

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worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben: Jede Gruppe W kann -X⁺-A"*" sein, oder ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt, bedeuten;

W¹ = Alkyl mit 1 - 3 Kohlenstoffatomen, ζ.B₀ Methyl;

4'
W = Wasserstoff, Hydroxy, Oxo oder Acetoxy;

W = Wasserstoff oder Hydroxyl;

W = Wasserstoff, Hydroxyl oder zusammen mit W Oxy (-0-);

und

q ι
W = Hydroxy oder Alkoxy mit 1 - 3 Kohlenstoffatomen.

Beispiele für Verbindungen, die an ein Enzym gebunden werden können, sind Morphin, Heroin, Hydromorphon, Oxymorphon, Metopon, Codein, Hydrocodon, Dihydrocodein, Dihydrohydroxycodeinon, Phplcodin, Dextromethorphan, Phenazocin und Dionin bzw» ihre Stoffwechselprodukte.

1 9 In den bevorzugten Verbindungen ist W oder W gleich -X -A , bzwo es bilden W und W zusammen die Gruppierung A⁺-X⁺-CHOH₂ - oder A⁺-X⁺-CH-CH=CH-.

Beispiele für Verbindungen, die mit einem Enzym verbunden werden können, sind 0 -Carboxymethylmorphin, ΪΤ-( 2'-carboxy propyl), O^-Methylmorphin, 0 -Methyl-, 0 -Morphinylsuccinat, 2-Aza-2-(2"-phenyläthyl)-5,9-dimethyl-6,7-(5'-carboxymethoxybenzol)-bicyclo/"~3,3,1 'Voct-6-en, 0 -Äthyl-0 -(3'-

7 ^>

aza-5-chlorpentyl)-morphin, 0 -Acetyl·, O -Carboxymethylmorphin , 7,8-Dihydro-14-hydroxymorphinon-O-carboxymethyloxim und 0^-(2'-Aminoäthyl)-morphin_o

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Die einzelnen Gruppen werden ao ausgewählt, daß sie mit bekannten Verbindungen mit physiologischem Interesse in Beziehung gesetzt werden können. Der Hauptunterschied zwischen den bekannten Verbindungen und den vorliegenden Verbindungen ist die verbindende Gruppe und die Anwesenheit des Enzymsο

Eine weitere Gruppe von Verbindungen mit narkotischer Wirksamkeit umfaßt Methadon und seine Analogen, die größtenteils die nachstehend angegebene Struktur haben:

11

,12

14

In dieser Formel bedeuten:

Die Gruppen W können -X⁺-A⁺ sein, bzw. ein H jeder der

20 9 8 81 /0752

Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000,- trägt, bedeuten;

η » 0 oder 1 (gewöhnlich dieselbe Zahl in beiden Fällen); m = 2 oder 3;

W¹⁰ ist Wasserstoff;

W¹¹ und W¹² sind Wasserstoff, Alkylgruppen mit 1-3 Kohlenstoffatomen, ZoBo eine Methylgruppe; sie können aber zusammen auch einen sechsgliedrigen Ring mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, bilden, z_oB_o in Form der Gruppen Pentylen-1,5 und 3-Oxa- oder 3-Azapentylen-1,5;

W¹-⁵ ist Wasserstoff oder Methyl, wobei nur ein W¹^ Methyl ist; W¹⁴" ist Wasserstoff;

W ist Wasserstoff oder Hydroxyl;

W ist Wasserstoff, eine Acyloxygruppe mit 1-3 Kohlenstoffatomen, ZoBe eine Propionoxygruppe, oder eine Hydroxylgruppe (wenn sowohl W als auch W Hydroxylgruppen sind, so liegt die Oxogruppe vor); und

W ist Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1-3 Kohlenstoffatomen, ZoBe die Äthylgruppe_o

Als Beispiele für Verbindungen, die mit einem Enzym verbunden werden können, seien Methadon, Dextromoramid, Mpipanon, Phenadoxon, Propoxyphen (Darvon) und Acetylmethadon genannte

Metaboliten von Methadon oder Methadon-Analogen kommen ebenfalls in Betracht. Von den Methadon-Metaboliten ist N-Methal-2-äthyl-3,3-diphenyl-5-methylpyrrolin zu nenneno

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-- 27 -

11 17 Bevorzugte Verbindungen liegen vor, wenn W oder W-

die Gruppe -X-A⁺ bedeuten·

Eine engere Klasse von Methadon- und Methadon-Analogen umfaßt Verbindungen mit der Formel

worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:

Jede der Gruppen W kann -X -A bedeuten, oder ein H jeder
der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin X eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von
1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000,
trägt, bedeutenj

10' 14'
W und W ^ bedeuten Wasserstoff;

11' 12'
W und W bedeuten Methyl oder bilden zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, .einen Morpholin- oder Piperidinringj

209881 /0752

-28- 222338B

15' 16'
W und W bedeuten Wasserstoff, Hydroxy- oder Acetoxy,

wobei mindestens eine Gruppe eine Hydroxy- oder Acetoxygruppe darstellt} und

17'
W ist eine Alkylgruppe mit 1-3 Kohlenstoffatomen,, .

Die Methadon-Metaboliten und nahe verwandten Analogen haben größtenteils die nachstehend angegebene IOrmel

worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:

Jede der Gruppen W kann -X -A sein oder ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A ein Enzym, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A , geteilt durch 2000, trägt, bedeuten:

ja = Phenyl;

10"
W = Wasserstoff;

11"
W = Wasserstoff, Methyl oder eine freie Valenz, die mit

1 5"
W verbunden ist;

W ^J = Wasserstoff oder Methyl;

leu
W^ = Wasserstoff oder eine Hydroxygruppe oder bildet zu-

11"
3ammeη mit W eine Doppelbindung zwischen dem Stick-

209881 /0752

stoffatom und dem Kohlenstoffatom, an das W und W¹^

jeweils gebunden sind}

und

W ist eine Alkylgruppe mit 1-3 Kohlenstoffatomen, gewöhnlich mit 2 Kohlenstoffatomenο

Beispiele für Verbindungen, die mit einem Enzym verbunden werden können, sind Phenylbenzyl-(i-dimethylamino-2-propyl)· methylsuccinat, Phenylbenzyl-(1-dimethylamino-2-propyl)-methyloxalat, Diphenyl-(2-dimethylamino-1-propyl)-methylmaleat, O-Oarboxymethyl-4,4-diphenyl-7-dimethylamino-2-heptanonoxim, 4,4-Diphenyl-7-dimethylamino~3-octylsucpinat, H-(2,2-diphenyl-3-me thyl-4-morpholino-butyryl)-glycin und 3-1thyl-4,4-diphenyl-6-dimethylaminohept-2-ensäure .

Die dritte G-ruppe von Verbindungen, die eine narkotische Wirkung haben, sind Meperidin- oder Meperidin-Analoge, die sich in den meisten Fällen durch die nachstehende lormel kennzeichnen lassen: .

2098817 0752

In dieser Formel haben die Substituenten folgende Bedeutungen:

Die Gruppen W können -X⁺-A⁺ bedeuten bzw₀ ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A ein Enzym, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A , geteilt durch 2000, trägt, bedeuten;

W²⁰ 3 Wasserstoffj

W = Wasserstoff, eine Alkylgruppe mit 1 - 3 Kohlenstoffatomen, ZoBo eine Methylgruppe, eine Aminophenylalkylgruppe, z.Bο die ß-(Aminophenyl)-äthylgruppe, eine Phenylaminoalkylgruppe, z,B_o die Phenylaminopropylgruppe (die Alkylgruppe enthält hier 2-3 Kohlenstoffatome)j

22
W ist eine Hydroxygruppe oder eine Alkoxygruppe mit 1-3

Kohlenstoffatomen, z.Bc die Ä'thoxy gruppe j W ist Wasserstoff oder die Methylgruppe.

Als Beispiele für diese Verbindungen seien Meperidin, alpha-Prodin, Alvodin und Anileridin genannt»

21 Bevorzugte Verbindungen sind solche, die denen W oder

pp .ι. 4.

W »χ _A bedeutet bzw« in denen ein Wasserstoff von W durch -X⁺-A"*" ersetzt ist,

Beispiele für Verbindungen, die mit einem Enzym gebunden werden können,, sind 1 _sj^D±niethyl-4-pbe2ijl-pIperidinylcarbonsäura _s 1-0arboxymethyl-4-plisnyl-4~carboxylpiperidin und 2J-{ 1-M3thyl-4-pßenyl-piperidylca.rboayl)-gly-3in_e

2~> Ί i> ο ι / Π 7 κ ?

Eine zweite Gruppe von interessierenden Liganden leiten sich vom Tryptamin ab und fallen in die Klasse der Indolalkaloide, insbesondere in die Klasse der Ergotalkaloide. Diese Verbindungen haben die nachstehende Grundstruktur: '

worin die freien Valenzen durch eine Vielzahl von Gruppen abgesättigt sind, insbesondere Kohlenstoff und Wasserstoff, obgleich auch andere Substituenten vorhanden sein können, z.Bο Carboxylgruppen, Hydroxylgruppen, Ket©gruppen usw. Der häufigste Vertreter dieser Klasse, der erfindungsgemäß in Betracht gezogen wird, ist die Lysergsäure, hauptsächlich ihr Diäthylamido Andere Vertreter dieser Klasse umfassen Ergotamin, Ergotaminih, Isolysergsäure und Ergosinο Andere Vertreter der Indolalkaloid-Pamilie, die ebenfalls analysiert werden können, sind die Strychningruppe und die Indolopyridocolingruppe; in diese Klasse fallen Yohimbin und Reserpine

Die mit dem Enzym substituierten Indolalkaloide haben die nachstehende Formel!

? f) 9 8 0 1 / (J 7 5 /

X - Λ

worin X und A die vorstehend angegebene Bedeutung haben»

Andere Gruppen von Alkaloiden umfassen die Steroidalkaloide, die Iminazolylalkaloide, die Chinazolinalkaloide, die Isochinolinalkaloide, die Chinolinalkaloide (am bedeutendsten ist hier das Chinin) und die Diterpenalkaloide_o

Zum größten Teil haben die Alkaloide, die mit einer Enzym-Funktionalität verbunden sind, ein Molekulargewicht von etwa 300 - 1500, gewöhnlich von etwa 400 - 100O₀ Sie sind normalerweise nur aus Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff und Stickstoff zusamraengesetzte Der Sauerstoff ist in Form von Oxy- und Oxogruppen vorhanden, und der Stickstoff liegt in Form von Amino- oder Amidogruppen vor₀

Von großer Bedeutung sind auch Drogen, die zwar, medizinisch richtig angewendet, einen guten Zweck erfüllen, die aber auch außerhalb des medizinischen Gebietes mißbräuchlich verwendet wurden_o Beispiele innerhalb dieser Kategorie sind Amphetamine, Barbiturate und andere Drogen, die gefühlsanregend wirken«,

209881/075 2

Gate cholamine

Unter die erste Gruppe fallen Catecholamine mit der Formel:

,39

_W33- ν?³³

In dieser IOrmel haben die Substituenten folgende Bedeutungen:

Die Gruppen W können -X⁺-A⁺ bedeuten bzw_o ein H von jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A ein Enzym, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A , geteilt durch 2000, trägt, bedeuten;

W ist Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 4 -' 3 Kohlenstoffatomen, ZoBo die Methylgruppe;

W ist Wasserstoff, eine Alkylgruppe mit 1 - 3 Kohlenstoffatomen, z.Bo die Methylgruppe;

W⁵² und W⁵-⁵ sind Wasserstoff;

W ist Wasserstoff, die Hydroxy-, Dimethoxycarboxyphenacyl- und Dirnethoxy-t?(.-phthalidylgruppe;

20988 1/0752

W⁵⁵ und W⁵ sind Wasserstoff, wobei eine Gruppe mit

miteinander

31
eine Bindung bilden kann; wenn W und verbunden sind, können W und W bzw_o W und W zusammen eine Doppelbindung bilden;

W ist Wasserstoff oder eine Alkoxygruppe mit 1-3 Kohlenstoffatomen, z.Bo die Methoxygruppe;

38 39

W und W sind Hydroxy- oder Alkoxygruppen mit 1-3 Kohlenstoffatomen, ZoBo die Methoxygruppeο

Als Beispiele für diese Verbindungen seien Gotarnin, Narcein, Noscapin und Papaverin genannt.

In den bevorzugten Verbindungen bedeuten W , W oder

die Gruppe -X⁺-A⁺, bzwo ein Wasserstoff ist durch

-X⁺-A⁺ ersetzt.

Beispiele für derartige Verbindungen, die mit einem Enzym verbunden werden können, sind Narcein, i-Carboxymethyl-2-methyl-6,7-methylendioxy-8-methoxy,1,2,3,4-tetrahydroisochinolin und 1—(2*,3',4'-Trimethoxy-2-carboxybenzyl)-2-methyl-6,7-methylendioxy-8-methoxy-1,2,3 ^-tetrahydrochinoline

Eine weitere Gruppe von Gatecholaminen sind Epinephrin oder die Amphetamine und verwandte Verbindungen» Diese Verbindungen haben die Formel

42

_W4O

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Die Substituenten in dieser Formel haben folgende Bedeutungen! ' ,

Die Gruppen W können -X -A sein "bzwo ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin 'X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A ein Enzym, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle

gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Mo!
trägt, bedeutenj

von 1 bis zum Molekulargewicht von A , geteilt durch 2000,

W⁴⁰ und W⁴"¹ sind Wasserstoff, die 2-Phenyl-2-Butylgruppe oder Alkylgruppen mit 1-3 Kohlenstoffatomen, z.B. die Methyl- und Isopropylgruppe, wobei vorzugsweise einSubstituent Wasserstoff ist; . .

W (die jeweils gleich oder verschieden sind) sind Wasserstoff, eine Alkylgruppe mit 1 - 3 Kohlenstoffatomen, Z₀B. die Methyl- und Äthylgruppe, sowie die Carboxygruppe, wobei nur eine Carboxygruppe vorhanden ist; eine Gruppe W kann aber auch zusammen mit W einen Piperidinring bilden; gewöhnlich ist W Wasserstoff oder eine Methylgruppe;

W ist Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe; und

W und W sind Wasserstoff, Hydroxyl- oder Alkoxylgruppen mit 1-3 Kohlenstoffatomen«,

Beispiele für Verbindungen, die mit einem Enzym verbunden werden können, sind Ephedrin, Epinephrin, L-dopa, Oohefrin, Benzidrin (Amphetamin), Paredrin, Methamphetamin, Phentermin, Methylphenidat und Norephedrin«, . .

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Beispiele für Verbindungen, die mit einem Enzym verbunden werden können, sind 3-(3' ,4'-I>ihydroxyphenyl)-*3-hydroxypropionsäure, N-(ß-(ß,3,4-Trihydroxyphen)-äthyl)-N-methylglycin, N-(1-Phenyl-2-propyl)-N-methylglycin, N-(1-Phenyl-2-propyl)-oxalamsäure, 0-(1-Phenyl-2-methylamino-1-propyl)-glykolsäure, p-(2-Dimethylaminopropyl-1^phenoxyessigsäure, N-(1 '-Phenyl-2^f-propyl)-glycin, 4-Methylamino-4-phenylvaleriansäure, para-(2-Aminopropyl-1^phenoxyessigsäure und 2-Amino-4-phenylbuttersäure_o

Wenn W und W Wasserstoff bedeuten, haben bevorzugte Verbindungen die nachstehend angegebene Formel:

_T42 ·

worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:

Jede der Gruppen W kann -X -A sein, bzw₀ ein H jeder der Gruppen W kann durch -X -A ersetzt sein, woiin X eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt, bedeuten;

40' 41 '
W und W sind Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit

1 - 3 Kohlenstoffatomen, wobei vorzugsweise ein Wasserstoff vorhanden ist;

2098»1/0752

ist Wasserstoff oder eine Methylgruppe j ist Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe;

W⁴⁶' ist Wasserstoff.

Wenn W und W Oxy gruppen bedeuten,, haben die bevorzugten Verbindungen die nachstehend angegebene Formel

,44"

41"

worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:

Jede der Gruppen W kann -X -A bedeuten, bzw· ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A , geteilt durch 2000, trägt, bedeuten;

41" 42" Γ und W sind Wasserstoff oder eine Methylgruppe;

ist Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe; und

44" 45" W und W sind Hydroxyl- oder Methoxylgruppen.

Mit Amphetaminen nahe verwandte Verbindungen sind solche, in denen ein gesättigter fünf- oder sechsgliedriger Ring

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222338S

anstelle des Phenylringes steht. Diese Verbindungen haben die nachsäend angegebene formel:

worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:

Jede der Gruppen W kann -X⁺-A⁺ bedeuten, bzw_e ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A ein Enzym, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺i geteilt durch 2000, trägt, bedeuten;

4-0' -4.^ ·
W ^J haben die vorstehend angegebene Bedeutung; W⁴"⁶' ist Wasserstoff; und

η = eine ganze Zahl von 4 bis 5·

Barbiturate

Eine breite Klasse von synthetischen Drogen, die einem ausgedehnten und häufigen Mißbrauch ausgesetzt sind, sind die Barbiturate» Diese Verbindungen sind synthetisch leicht zugänglich, und ihr Gebrauch kann nur schwierig überwacht werden» Die in Betracht kommenden Verbindungen lassen sich

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durch die nachstehende Formel kennzeichnen:

In der Formel haben die Substituenten folgende Bedeutungen:

Die Gruppen W können -X⁺-A⁺ sein, bzw. ein H jeder- der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A ein Enzym, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Ligandän im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A , geteilt durch 2000,.. trägt, bedeuten; .

W ist Wasserstoff, eine Alkylgruppe mit 1-3 Kohlenstoffatomen, z.B. die Methylgruppe oder ein Alkalimetallkation, z.B. Natrium;

W^¹ und W^² sind Wasserstoff, eine Alkyl-, Alkenyl-, Cycloalkyl-, Cycloalkenyl- oder Ary!kohlenwasserstoffgruppe mit 1-8, insbesondere 1-6 Kohlenstoffatomen, z.B. die Äthyl-, η-Butyl-, oC-Methylbuty1-, Isoamyl-, Allyl-j _: L-\ -Cyclohexenyl- und Phenylgruppe; gewöhnlich ist W eine Kohlenwasserstoff gruppe mit 2-8 Kohlenstoffatomen.;

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5^
W^ ist Wasserstoff oder ein Alkalimetallkation, z.B. Natriumι

W⁵⁴" ist Sauerstoff oder Schwefel.

Beispiele für Verbindungen, die mit einem Enzym verbunden werden können, sind Veronal, Medinal, Luminal, Prominal, Soneryl, Nembutal, Amytal, Dial, Phenadorn, Seconal, Evipan, Phenobarbital und Pentothai.

50 51 In den bevorzugten Verbindungen sind W oder W bzw.

ein Wasserstoff von W⁵⁰ oder W⁵¹ gleich -X⁺-A⁺.

51 Bevorzugte Verbindungen liegen auch dann vor, wenn ein W

52
bzw» W eine Alkylgruppe mit 1 - 4 Kohlenstoff bedeutet.

Beispiele für Verbindungen, die mit einem Enzym verbunden werden können, sind 5,5-Diäthyl-1-carboxymethylbarbitursäure, 5-Äthyl-5-n-buty1-1-succinoylbarbitursäure, 5-Ä'thyl-5-phenyl-1-(U-(2'"-chloräthyl)-2"-aminoäthyl)-barbitursäure, 5-(2'-Carboxy- Δ^{1 2}'-cyclohexenyl)-1,5-dimethylbarbitursäure und 1-Methyl-5-äthyl-5-(p-carboxyphenyl)-barbitursäure.

Cocain

Eine Droge von großer Bedeutung hinsichtlich der verbrauchten Menge ist das Cocain«, Das mit dem Enzym markierte Cocain bzw. Cocain-StoffWechselprodukt oder -Analoge, wie Ecgonin, haben im wesentlichen die nachstehend angegebene Formel

CH₀ CH CHCOW^{5 5}

\ I

/N—W⁵⁷ ■ CH-OW⁵⁶

/ I

CH CH₂

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In dieser Formel haben die Stubstituenten folgende Bedeutungen:

Die Gruppen W können*-X -A sein bzw. ein H von jeder Gruppe W kann durch -X -A⁺ ersetzt sein, worin X _Λ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A ein Enzym, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A , geteilt durch 2000, trägt, bedeuten;

W ist eine Hydroxy-, Methoxy- oder Aminogruppe;

W ist Wasserstoff oder eine Benzoylgruppej und

W ist Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1-3 Kohlenstoffatomen, ζ.Bο die Methylgruppe.

Beispiele für Verbindungen, die mit einem Enzym verbunden werden können, sind Norecgoninyl-8-essigsäure und N-Carboxymethylnorcocain.

Diphenylhydantoin

Eine weitere Verbindung von Interesse ist die antiepileptische Droge Diphenylhydantoinο Diese Verbindung und ihre Analogen haben die nachstehend angegebene Formel

_wa60

worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:

20 9 88 1/07 5-2

Jede der Gruppen W kann -X -A sein bzw. ein H jeder der Gruppen W kann durch -X -A ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A , geteilt durch 2000, trägt, bedeuten;

= Phenyl; und
W^a6°, W^a61 und W^a62 sind Wasserstoff.

Aminosäuren, Polypeptide und Proteine

Die nächste Verbindungsgruppe umfaßt die Aminosäuren, Polypeptide und Proteine_o In den meisten Fällen enthalten die Aminosäuren 2-14 Kohlenstoffatome und umfassen eine Vielzahl von fuktionellen Gruppen, wie die Mercapto-, Dithio-, Hydroxyl-, Amino-, Guanidyl-, Pyrrolidinyl-, Indolyl-, Imidazolyl-, Methylthio-, Jod-, Diphenyläther-, Hydroxyphenyl- und andere Gruppen. Hierbei handelt es sich in erster Linie um die menschlichen Aminosäuren, wobei es auch andere Aminosäuren gibt, die in Pflanzen und Tieren vorkommenο

Die Polypeptide haben normalerweise etwa 2 bis 100 wiederkehrende Aminosäureeinheiten₀ Ihr Molekulargewicht ist gewöhnlich niedriger als etwa 12_o000. Größere Polypeptide werden willkürlich Proteine genannte Proteine sind gewöhnlich aus 1-20 Polypeptidketten (Untereinheiten) zusammengesetzt, die durch kovalente oder nicht-kovalente Bindungen assoziiert sind. Die Untereinheiten enthalten normalerweise etwa 100 - 300 Aminosäuregruppen und haben ein Molekulargewicht von etwa 10_o000 bis 35.000. Die individuellen Polypeptide und Protein-Untereinheiten haben normalerweise

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etwa 2 "bis 300,. gewöhnlich etwa 2 Ms 1-50 wiederkehrende Aminosäuregruppen. Gewöhnlich haben die Polypeptide und Proteinuntereinheiten, die hier interessieren, ein Molekulargewicht von nicht mehr, als etwa 40«000, gewöhnlich nicht mehr als etwa 20.000 und mehr als etwa 750_o Alle Aminosäuren können zur Herstellung des Polypeptids verwendet werden_e Wegen der großen Vielzahl der funktioneilen Gruppen in den Aminosäuren und in den verschiedenen natürlich vorkommenden Polypeptiden kann das Enzym mit jeder "beliebigen Funktionalität verbunden werden, indem für die freie Radikalverbindung die geeignete Funktionalität gewählt wird«, Gewöhnlich kann das Enzym mit einer Cystein·; Lysin— oder Arginingruppe verbunden werden, obgleich auch Serin, Threonin oder eine andere Aminosäure mit einer passenden Funktionalität verwendet werden kann, Z₀B₀ mit der Carboxy- und Hydroxy-Funktionalität»

In den meisten Fällen haben die mit dem Enzym verbundenen Polypeptide die folgende Formel

-CHCO₂H

worin X und A die vorstehend angegebene Bedeutung haben, R einen Aminosäurerest und η eine ganze Zahl von 1 bis 2000, gewöhnlich von 1 - 500, üblicherweise von 2 - 200' bedeuten«, n' ist eine ganze Zahl von mindestens 1 und nicht größer als das Molekulargewicht des Polypeptids, geteilt durch 2O₀OOO₀ Bei kleinen Liganden ist nur ein Enzym mit einem Liganden verbunden, während bei hochmolekularen Liganden, z.Bo Polypeptiden, mit einem Molekulargewicht von 4000 oder darüber, mehrere Enzyme mit dem Liganden verbunden sein können_o

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Beispiele für Aminosäuren sind Glycin, Alanin, Serin, Histidin, Methionin, Hydroxyprolin, Tryptophan, Tyrosin, Thyroxin, Ornithin, Phenylalanin, Arginin und Lysin,, Interessierende Polypeptide sind ACTH, Oxytocin, Gelbkörperhormon, Insulin, Bence-Jones-Protein, Choriongonadotropin, Hypophysen-Gonadotropin, Wuchshormon, Renin, thyroxidbindendes Globulin, Bradykinin, Angiotensin, follikelanregendes Hormon.

In vielen Fällen ist es erwünscht, ein Protein abzubauen und die kleineren Polypeptidfragmente zu analysieren« Die Konzentration des Fragments kann dann mit der Menge des ursprünglichen Proteins in Beziehung gesetzt werden.

Steroide

Eine weitere wichtige Gruppe von Verbindungen, die erfindungsgemäß verwendet werden können, sind die Steroide, die einen weiten Bereich von Funktionalitäten haben, was von ihrer Körperfunktion abhängt. Neben den Steroiden gibt es die steroidähnlichen Substanzen, die zwar nicht die polycyclische Grundstruktur der Steroide haben, jedoch einige der physiologischen Wirkungen der Steroide.

Die Steroide wurden sehr intensiv untersucht, und es wurden Derivate hergestellt, die zur Gewinnung von Steroid-Antikörpern mit antigenen Proteinen verbunden wurden. Als Beispiele seien folgende Verbindungen genannt:

lYß-Östradiol-e-CO-carboxymethyl-oximJ-RSA (Rinderserumalbumin) (Exley et al, Steroids t8, 593» (1971)); Testosteron-3-oxim-Derivat von RSA (Midgley, et al, Acta Endocr. 64, Supplement 147, 320 (197O)) und Progesteron-3-oxim-Derivat von RSA (Midgley et al, ibid).

209 881/0752

In den meisten Fällen haben die verwendeten Steroide die folgende Grundstruktur:

X-A

worin X und A wie vorstehend definiert sind. Gewöhnlich wird das Enzym mit den Ringen A, B oder C an den Stellungen 2, 3, 4, 6 oder 11 bzw. an der Stellung 16 oder 17 des Ringes D bzw. an den Seitenketten der Stellung 17 verbunden. Die Ringe können verschiedene Substituenten tragen, insbesondere Methylgruppen, Hydroxylgruppen, Oxocarbony!gruppen, Äthergruppen und Aminogruppen. Alle diese Gruppen können dazu verwendet werden, um das Enzym mit der Ringgrundstruktur zu verbinden. Zum-größten Teil haben die interessierenden Steroide mindestens eine, gewöhnlich 1-6, insbesondere 1-4 Sauerstoff-Funktionalitäten, z.B. Alkohol-, Ä'ther-, Ester- oder Ketofunktionen. Weiterhin können Halogensubstituenten vorhanden sein. Die Steroide haben gewöhnlich 18 bis 27 Kohlenstoff atome.

Die Ringe können eine oder mehrere ungesättigte Stellen (äthylenisch oder aromatisch ungesättigte Stellen) aufweisen; sie können weiterhin in gewissen Stellungen mit sauerstoffhalt igen Substituenten substituiert sein, z.B. in den Stellungen 6, 7 und 11. Weiterhin können Methylgruppen in den

20988 1/07 52

Stellungen 10 und 13 vorhanden sein_o Die mit Z bezeichnete Stellung, nämlich die Stellung 17» kann sehr unterschiedlich substituiert sein, was von dem jeweiligen Steroid abhängt. Z steht für zwei einwertige Gruppen oder eine zweiwertige Gruppe und kann ein Carbonylsauerstoff, eine aliphatische Gruppe mit 1 - 8 Kohlenstoffatomen, einschließlich einer Acetylgruppe, einer Hydroxyacetylgruppe, einer Hydroxy-Carboxygruppe.oder eine Oarboxyalkylgruppe mit 2-6 Kohlenstoffatomen, eine acetylenische Gruppe mit 2-6 Kohlenstoffatomen oder eine halogensubstituierte Alkyl- oder eine- sauerstoffhaltige Alkylgruppe, oder eine Gruppe mit mehr als einer Funktionalität, gewöhnlich mit 1-3 Funktionalitäten, sein·

Die Gruppe Z kann Wasserstoff oder eine zweite Gruppe bedeuten, insbesondere eine Hydroxylgruppe, eine Alkylgruppe, ZoB. die Methylgruppe, eine Hydroxyalkylgruppe, Z₀B₀ die Hydroxymethylgruppe, Halogen, z_oB. Fluor oder Ghlor, eine Oxyäthergruppe und dergleichen.

Diese Steroide stellen Hormone dar, z_oBo männliche und weibliche Geschlechtshormone, die in Östrogene, Gestogene und Androgene unterteilt werden können; weiterhin können sie adrenocorticoide Hormone (Glucocorticoide), Gallensäuren, cardiotonische Glycoside und Aglycone sowie Saponine und Sapogenine darstellen«

Als Beispiel für steroidähnliche Substanzen, inabesondere Geschlechtshormone, sei Diäthylstilbestrol angegebene

Die interessierenden Geschlechtshormone können in zwei Gruppen unterteilt werden: Die männlichen Hormone (Androgene) und die weiblichen Hormone (Östrogene)_o

209881 /0752

2223335

Brauchbare Androgene haben die nachstehend angegebene Formel

• _W65

0-1 äthylenisch ungesättigte Stellen

In dieser Formel können die Substituenten folgende Bedeutungen haben:

Die Gruppen W können -X -A sein bzw_o ein H jeder der Gruppen W kann durch -X -A ersetzt sein, worin X eine Bindung oder eine verbildende Gruppe und A ein Enzym, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von^1 bis zum Molekulargewicht von A , geteilt durch 2000, trägt, bedeuten;

W ist Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe;

W ist Wasserstoff, eine Methyl- oder Hydroxylgruppe (wenn zwei Hydroxylgruppen mit demselben Kohlenstoffatom verbunden sind, handelt es sich um eine Oxogruppe);

W und W sind Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe, wobei mindestens eine der Gruppen W ~ ' eine Hydroxylgruppe (eine eigentliche Hydroxylgruppe oder eine Oxogruppe) darstellt) O

209 88 1/07 52

222338b

W ist Wasserstoff bzw. zwei W können zusammen eine Doppelbindung bilden;

W⁶⁵ ist Methyl;

und

ist Wasserstoff.

Beispiele für Verbindungen, die mit einem Enzym verbunden werden können, sind Testosteron, Androsteron, Isoandrosteron, Äthiocholanon, Methyltestosteron und Dehydroisoandrosteron< >

Beispiele für Verbindungen, die mit einem Enzym verbunden werden können, sind N-Carboxymethoxytestosteronimin, 17-Monotestosteronylcarbonat, Androsteronylsuccinat,

3 17

Testosteronylmaleat, 0 -Carboxymethyl-0 -methyl-androst-5-en-3ß, 17ß-diol, Testosteron-O-carboxymethyloxim und Androsteronylcarbonat ₀

Die Östrogene haben einen/aromatischen Ring A und zum größten Teil die nachstehend angegebene Formel:

0-1 äthylenisch ungestüttigte Stellen

worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:

209881 /0752

Jede der Gruppen W kann -X⁺-A⁺ bedeuten bzw. ein H jeder

der Gruppen W kann durch -X -A ersetzt sein, worin X

eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt,

bedeuten;

70 71 ··

W oder W sind Wasserstoff, eine Athinylgruppe oder

Hydroxylgruppe (wenn zwei Hydroxylgruppen am selben Kohlenstoffatom stehen, handelt es sich um eine Oxogruppe);

72
W ist Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe;

W ist eine Hydroxyl- oder Alkoxylgruppe mit 1-3 Kohlenstoffatomen;

W ist Wasserstoff bzw_e es können zwei W zusammen eine Doppelbindung bilden; und

W'^ ist Wasserstoff.

Beispiele für Verbindungen, die mit einem Enzym verbunden werden können, sind Equilenin, ß-östradiol, Östron, Östriol und 17-cd -Ä'thinyl-Östradiolo

Beispiele für Verbindungen, die mit einem Enzym verbunden werden können, sind 3-Carboxymethylästradiol, 2-Chlormethylöstron, Östronglutarat, Equileninylasp.artat, östron-O-carboxymethyloxim und Equileninyl-N-carboxymethylthiocarbamate

Eine weitere Klasse von Hormonen sind die Gestogene mit der nachstehend angegebenen Formel:

209881 /0752

worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:

ein H jeder

Jede der Gruppen W kann -X⁺-A⁺ darstellen, bzw, der Gruppen W kann durch -X -A ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt, bedeuten;

W und W sind Wasserstoff oder Hydroxylgruppen, wobei mindestens eine Hydroxylgruppe vorhanden ist (wenn zwei Hydroxylgruppen an demselben Kohlenstoffatom stehen, so handelt es sich um die Oxogruppe);

W ist Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe;

W und -W sind Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe, wobei mindestens eine Hydroxylgruppe vorhanden ist; und

W ist Wasserstoff bzw. zwei W Doppelbindung bilden.

können zusammen eine

209881/0752

Beispiele für Verbindungen, die mit einem Enzym verbunden werden können, sind Progesteron, Pregnenolon, Allopregnan-3a:20a-diol und Allopregnan-3a-ol-20-on.

Beispiele für Verbindungen, die mit Enzymen verbunden werden können, sind 20-Progesteron-O-carboxymethyloxim, Pregn-4-en-20~on-3-ylidinylmethylencarbonsäure, O-Carboxymethylprogesteron_T3-oxim, Pregnenolonyltartrat, O-Pregnenolonyl-Milchsäure und Allopregnan-3-carboxymethyl-20-olo

Die nächste wichtige Gruppe von Steroiden sind die Cortico- ■

steroide, die sowohl die Mineralocorticoide und die Gluco-

corticoide umfassen«. Diese Verbindungen haben die nachstehend angegebene Formel:

>τ9 2
^3

0-1 äthylenisch ungesättigte Stellen i

worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:

Jede der Gruppen W kann -X⁺-A bedeuten, bzw. ein H jeder der Gruppen W kann durch -X -A ersetzt sein, worin X 6ine

2 0 9 8 8 1 /075?

Bindung oder eine verbindende Gruppe und A ein Enzym, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A , geteilt durch 2000, trägt, bedeuten;

90
W ist Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe;

91 92
W und W sind Wasserstoff oder Hydroxylgruppen, wobei mindestens eine Hydroxylgruppe vorhanden ist (stehen zwei Hydroxylgruppen an demselben Kohlenstoffatom, so handelt es sich um eine Oxogruppe);

9*5
W ist Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe;

W , W , W und W sind Wasserstoff oder Hydroxylgruppen,

94- 95 wobei mindestens eine Gruppe W und W eine Hydroxylgruppe darstellt; und

98
W ist eine Methyl- oder Formylgruppe;

99 99

W ist Wasserstoff oder zwei W können zusammen eine Doppelbindung bilden.

Beispiele für Verbindungen, die mit einem Enzym verbunden

yerwerden können, sind 17-Hydroxydioxyoorticosteron (bindung S), Desoxycorticosteron, Cortison, Corticosteron, 11-Dihydrocortison (Verbindung P), Cortisol, Prednisolon und Aldosteron„

Beispiele für Verbindungen, die mit einem Enzym verbunden

21
sein können, sind 0 -Carboxymethylcorticosteron, F-Carboxymethyl-21-carbamat-cortisol, 21-Cortisonsuccinat, 21-Desoxo-

17 21 corticosteronsuccinat und 0 -Methyl-0 -carboxymethylcorti-

209881/075 2

Eine weitere Steroidfamilie umfaßt die Sapogenine, von denen Digitalis ein wichtiges Glied ist. Die■Grundverbindung ist das Gitoxigenin, das auch als Glycosid vorkommt. Die interessierenden Verbindungen haben die nachstehend angegebene Formel:

0-1 äthylenisch ungesättigte Stellen -GO

In der Formel haben die Substituenten folgende Bedeutungen:

Die Gruppen W können -X⁺-A⁺ sein bzw. ein H Jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A ersetzt sein, worin X eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym,, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 20Ö0_f 'trägt, bedeuten;

W und W sind Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe,

gewöhnlich eine Hydroxylgruppe.

2 0 9 8 B 1 / ü 7 5 2

Marihuana

Wegen seiner leichten Zugänglichkeit und wegen seines häufigen Gebrauches ist Tetrahydrocannabinol (der wirksame Bestandteil von Marihuana) zusammen mit den verwandten Verbindungen Cannabidiol und Cännabinol und deren Stoffwechselprodukten eine Verbindung von großem Interesse, weshalb eine einfache Analysenmethode wichtig wäre. Die Verbindungen, die als Analoge in Präge kommen, haben die nachstehend angegebene Formel:

_ra10

a 14

_wa12

0-3 äthylenisch ungesättigte Stellen

&15

worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:

Jede der Gruppen W kann -X -A bedeuten b'.w. ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A ein Enzym, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt, bedeuten;

al 0
ff ist Wasserstoff oder eine Carboxylgruppe;

a I 1
',/ ist eine Hydroxylgruppe;

H Int eine Pentylgruppe;

209881 /0752

a 14
W ist Wasserstoff oder eine Methylgruppe, bzw. die beiden

a14 ^%

Gruppen W können miteinander einen carbocyclischen Ring

mit 4-6 Ringgliedern bilden; und

ist eine Methyl- oder Carboxylgruppe.

Vitamine

Die nächste Gruppe von Verbindungen umfaßt die Vitamine. Chemisch sind die Vitamine keine einfache chemische Klasse, da sie sieh in ihrer Struktur stark unterscheiden; sie werden jedoch hinsichtlich ihrer Wirkungsweise als eine Gruppe zusammengefaßt, Die Vitamine umfassen Vitamin A, das ein Carotin darstellt, die Vitamin-B-Gruppe die Riboflavin, Thiamin, Niacin, Pyridoxin, Pantothensäure, Biotin» !"ölsäure und Cyanocobalamin (Vitamin B^p) einschließt, Ascorbinsäure (Vitamin C), die Vitamine D, die sieh von den Steroiden ableiten, Tocopherol (Vitamin E), und Phytyl-1,4-naphthochinon (Vitamin K).

Zucker ·

Die nächste Gruppe von Verbindungen umfaßt die Zucker und Saccharide. Die Saccharide sind Kombinationen verschiedener Zucker, die Dimere, Trimere und hochmolekulare Polymere bilden, die man als Polysaccharide bezeichnet.

Prostaglandin

Eine weitere Gruppe von Verbindungen von biologischer BeEnzym deutung sind die Prostaglandine. Diese Verbindungen haben an em\

gebunden zum größten Teil die nachstehend angegebene Formel _ta20

0-1 äthylenisch ungesättigte Stellen

^G6^H10-12 - C0W^a24

17

In dieser Formel haben die Substituenten die nachstehend angegebenen Bedeutungen:

Die Gruppen W können -X -A sein bzw_o ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A ein Enzym, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt, bedeuten;

W ist Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe; W^a und W^a sind Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe (wenn zwei Hydroxylgruppen mit demselben Kohlenstoffatom verbunden sind, handelt es sich um eine Oxogruppe);

W ist Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe; und

W ist eine Hydroxyl-, Amino- oder Carboxygruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen, z_oBo eine Alkoxygruppe.

Tranquilizer (Beruhigungsmittel)

Eine Reihe von Verbindungen hat Tranquilizer-Wirkung, und infolge ihrer mißbräuchlichen Verwendung kann es Fälle geben, in denen ihre Bestimmung wichtig ist₀

Der erste interessierende Tranquilizer ist Meprobamat, das auch als Miltown oder Equanil bekannt ist„ Diese Verbindung und ihre Analogen haben die nachslöiend angegebene Formel

0 C₃H₇

W^a ° COCH₂-— C GH—r 0 CW^a^

CH,

209 881/0752

In dieser Formel haben die Substituenten folgende Bedeutungen:

Die Gruppen W können -X^f-A⁺ sein bzw. ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A ein Enzym, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich, von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt, bedeuten;

und W

a26

sind Aminogruppen.

Die nächste Gruppe von Tranquilizern sind Benzdiazocyclo heptane, die als Librium, Valium, Diazepam oder Oxazepam bekannt sind. Diese Verbindungen und ihre Analogen haben die nachstehend angegebene Formel

In der Formel haben die Substituenten folgende Bedeutungen:

Die Gruppen W können -X⁺-A⁺ sein bzw. ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A ersetzt sein, worin X eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A ein Enzym, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A^f, gebeilt durch 2000, trägt, bedeuten;

70 9 3 81/0762

und W^a55 sind Wasserstoff; W^a31 ist Wasserstoff, eine

niedere Alkylgruppe mit 1-3 Kohlenstoffatomen, z.B. die

a32 Methylaminogruppe,bzw. kann in Verbindung mit W eine

Doppelbindung zwischen dem Kohlenstoff- und Stickstoffatom bilden;

a33
W ist eine Amino- oder niedere Alkylaminogruppe mit

1 - 3 Kohlenstoffatomen, z.B. eine Methylaminogruppe, bzw.

a32
kann zusammen mit W eine Carbonylgruppe bilden;

W ist Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe; und

W ist eine Oxygruppe oder zwei ungepaarte Elektronen.

Die nächste Gruppe von Verbindungen umfaßt die Phenothiazine, zu denen das Chlorpromazin gehört. Diese Verbindungen haben zum größten Teil die nachstehend angegebene Formel

In der Formel haben die Substituenten folgende Bedeutungen:

W^a ist Wasserstoff, eine Alkylgruppe mit 1 - 6 Kohlenstoffatomen, eine Dialkylaminoalkylgruppe mit 4-8 Kohlenstoffatomen, z.B. 3-Dimethylamino)-propyl; eir» N-Hydroxyalkylgruppe (Alkylrest mit 2-3 Kohlenstoffatomen), eine N'-Piperazinoalkylgruppe (Alkylrest mit 2-3 Kohlenstoffatomen), z.B. N-Hydroxyäthyl-N'-piperazinopropyl; eine N-Alkylgruppe (Alkylrest mit 1 - 3 Kohlenatoffatomen), eine N'-Piperazinoalkylgruppe (Alkylrest mit 2-3 Kohlenstoffatomen), z.B. N-Mebhyl-N'-piperazinopropyl; und eine 2-(N-Alk/L)-piperidinyiaLky!gruppe, worin -lie N-Alkylgruppe 1 - 3 Kohiens tof f-i tome un 1 die andere Alkylgruppe 2-3 Kohlenatuffatome enthäLt, z.B. r?-(N-Mothyl)-pip«ri-lin/Läfchyl ,

2 Ü 9 8 s 1 / 0 7 5 I

wobei mindestens zwei Kohlenstoffatome zwischen den Heteroatomen stehen?

W ist Wasserstoff, Chlor, eine Trifluormethyl- oder Alkylmercaptogruppe mit 1-3 Kohlenstoffatomen, z„B. eine Methylmercaptogruppe, oder eine Acylgruppe mit 1-3 Kohlenstoffatomen, ZoBo die Ace-tylgruppef und

W^a42 und W^a43 sind Wasserstoffe

Beispiele für Verbindungen, die mit einem Enzym verbunden werden können, sind Chlorpromazin, Promazin, Trifluorpromazin, fluphenazin, Thioridazin, Perphenazin und Prochlorperazin₀

Andere Verbindungen

Die letzte Gruppe umfaßt andere Verbindungen, die eine Vielzahl von Drogen oder anderen Chemikalien einschließen^ die in der Medizin, in der Tiermedizin und auf anderen Gebieten Anwendung finden.

In diese Gruppe fallen die Antibiotika, s.B. Penicillin, Ghloromyeetin, Actinomyeetin und Nucleinsäuren oder,deren Derivate, wie nucleoside und Nucleotidee.

Von Interesse ist weiterhin das Serotonin, bei dem es sich um 3-(2ⁱ-Aminoäthyl)-5-hydroxyindol handelt» -X⁺-A⁺ kann mit jedem der beiden Stickstoffatome oder mit der Hydroxylgruppe verbunden sein*,

Natürlich erleiden viele der interessierenden Verbindungen im Stoffwechsel von Vertebraten Veränderungen» Die jeweilige physiologische Flüssigkeit, die getestet wird, kann nur einen kleinen Teil bzw₀ nichts mehr von der ursprünglichen Verbindung enthalten» Deshalb kann die ursprünglich vorhandene Verbindung nur als Metabolit (Stoffwechselprodukt).

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nachweisbar sein₀ In vielen Fällen kann der Metabolit das Gluouronid (Oxy- oder Oxoderivat) der ursprünglichen Verbindung sein. In anderen Fällen kann die ursprüngliche Verbindung oxydiert (hydroxyliert), reduziert, desaminiert_f aminiert, methyliert oder stark abgebaut worden sein. Hat der Metabolit immer noch einen wesentlichen Anteil der räumlichen und polaren Geometrie der ursprünglichen Verbindung, so ist es häufig möglich, das Ligand-Analoge entweder auf die ursprüngliche Verbindung oder den Metaboliten zu beziehen« Unterscheidet sich der Metabolit deutlich von der ursprünglichen Verbindung, so wird das Ligand-Analoge auf den Metaboliten bezogene

Neben den Metaboliten der verschiedenen Arzneimittel, Hormone und anderen Verbindungen, die vorstehend beschrieben wurden, sind auch Metaboliten von großem Interesse, die sich auf Krankheitszustände beziehen.

Beispiele für diese Verbindungen sind Spermin, Galactose, Phenylpyruvsäure und Porphyrin-Typ 1, die als diagnostisch für gewisse Tumoren, für Galactosämie, Phenylketonurie bzw, kongenitale Porphyrie gelten.

Zwei interessierende Verbindungen, die Metaboliten von Epinephrin darstellen, sind Vanillylmandelsäure und Homovanillinsäure ο Bei diesen Verbindungen kann entweder die Hydroxylgruppe oder die Carboxylgruppe als die Stelle für -X⁺-A⁺ verwendet werden«

Eine weitere interessierende Verbindung ist Gluthethimid, worin das an das Enzym gebundene Analoge die nachstehend angegebene Formel hat»

<ra 51

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In der Formel haben die Substituenten folgende Bedeutungen:

Die Gruppen W können -X⁺-A⁺ sein bzw«, ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ eineEnzym, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt, bedeuten;

W^a5° und W^a51 sind Wasserstoffj und

W- ist eine niedere Alkylgruppe mit 1 - 3 Kohlenstoffatomen, ZoBe die Äthylgruppe ο

Eine weitere interessierende allgemeine Gruppe umfaßt die Pesticide, z_oB. die Insecticide, Fungicide, Bactericide und Nematooideo Beispiele für diese Verbindungen sind Phosphate, wie Malathion, DDVP, Dibromj Carbamate, wie Sevin usw.

Weiterhin können auch große organische Strukturen oder Systeme, wie Viren und Zellen, Liganden darstellen«. Es ist bekannt, daß diese Systeme Rezeptoren und eine Vielzahl von Stellen für die Bindung mit einer großen Anzahl von Enzymen aufweisen. Bei Viren dient die äußere Proteinhülle als Ligand, an den die Enzyme gebunden werden. Bei Zellen kann die äußere Membrane die Bindungsstellen für die Enzyme liefern«, Beispielsweise kann ein System mit der Formel

(CV)-X⁺-A⁺)

vorliegen, worin CV eine Zelle oder ein Virus darstellt, X⁺-A⁺ die nachstehend angegebene Bedeutung hat und m eine Zahl von sehr viel mehr als 1, d.h. von mindestens 100 bis einige Tausend, gemittelt über das gesamte System, bedeuten.

2098Ö1/0752

Da viele der biologisch aktiven Substanzen nur in einer steroiaomeren Form aktiv sind, so soll die aktive Form oder das Racemat in Betracht kommen, wenn das Racemat befriedigend und leicht zugänglich ist. Die Antikörper sind für die jeweils verwendete Form des Haptens spezifisch.

Enzyme (A)

Obwohl im Prinzip erfindungsgemäß beliebige Enzyme verwendet und mit einem Liganden verbunden werden können, gibt ea in der Praxis gewisse Beschränkungen. Bei der Beschränkung hinsichtlich der Enzyme handelt es sich aber nicht um eine Frage der Durchführbarkeit, sondern lediglich um eine Frage der. Verminderung der Schritte zur Durchführung der Analyse, um eine Frage der Erhöhung der Zuverlässigkeit, z„B_o durch Verwendung von stabileren Enzymen» die in trockenem Zustand oder in Lösung lange Zeit haltbar sind, und um eine Frage der Verwendung von Enzymen, ate im allgemeinen nicht Störrungen unterworfen sind _t entweder durch andere, natürlich vorkommende Enzyme, die mit dem Substrat odei^ait anderen natürlicherweise vorhandenen Substraten in Wettbewerb treten oder die mit dem zum Nachweis des Liganden zugesetzten Substrat in Wettbewerb treten» Diese Beschränkungen können aber zum größten Teil überwunden werden, so daß gegen die Verwendung eines bestimmten Enzyms kein prinzipieller Hinderungsgrund besteht. Weiterhin hängt die Art der jeweils verwendeten Enzyme von der Analyse und der jeweils zu untersuchenden Flüssigkeit./Hydrolytische Enzyme, die im Speichel vorhanden sind, brauchen im Urin weniger berücksichtigt zu werden,, Katalase, die mit Wasserstoffperoxyd reagiert, ist verhältnismäßig häufig, und wenn man eine Peroxydase verwenden will, so sollte alle vorhandene Katalase entweder denaturiert, entfernt oder unter Verwendung einer Kontrollprobe berücksichtigt werden, damit die Analyse möglichst genau wird.

0 9 8 8 1/075?

In fast jedem Pall können störende Substanzen, wie Enzyme oder Inhibitoren beseitigt werden, entweder durch Desaktivierung oder Entfernung der Substanzen oder, im Falle des Substrates, durch Zerstörung oder Entfernung des Substrates bzwo durch Berücksichtigung des Substrates unter Verwendung einer Kontrollprobe. Labile Enzyme sind zwar nicht leicht als Handeisprodukte zu erhalten* jedoch können sie durch ein unabhängiges laboratorium als frische Substanzen hergestellt werden^ indem der Ligand vor Gebrauch mit dem Enzym verbunden wird. Da dieses Verfahren unbequem ist, . ist die allgemeine Verwendung derartiger Enzyme natürlich etwas eingeschränkt.

Bei einigen Enzymen mit kleinen Substraten, wie Peroxydase und Katalyse können Schwierigkeiten dadurch auftreten, daß das Enzym blockiert wird, wenn der Rezeptor mit dem durch das Enzym gebundenen Liganden verbunden wird. Diese Schwierigkeit kann auf verschiedene Weise umgangen werden. Einmal kann ein künstliches Substrat mit höheren sterischen Anforderungen hergestellt werden. Zweitens kann die Methode der Affinitätsmarkierung angewendet werden, wobei der Ligand der reaktiven Enzymstelle benachbart ist. Soweit diese Modifikationen unbequem oder unerwünscht sind, können andere Enzyme mit den gewünschten Eigenschaften verwendet werden«

Mit vielen Enzymen und Liganden-Kombinationen wird die katalytische Wirksamkeit der Enzyme stark vermindert, indem mindestens ein Substrat (einschließlich des Coenzyme) der Enzymreaktion mit einem Molekulargewicht von mindestens ' 150, vorzugsweise von mindestens 500 und besonders bevorzugt von mindestens 1000 verwendet wird. In einigen Fällen liegt das Molekulargewicht weit über 5000, beipielsweise bei Lysozym oder Cellulase«,

209881/0752

Eine liste der üblichen Enzyme findet sich in Hawk et al., Practical Physiological Chemistry, McGraw-Hill Book Ooiapany, New York (1954) Seiten 306 - 307« Diese Liste ist nachstehend angegeben, einschließlich der Herkunft des Enzyms, des Substrate und der Endprodukte, Weitere brauchbare Enzyme sind bei Barman, Enzyme Handbook, Springer-Verlag, New York (1969) angegeben.

209881/0752

Name und Klasee	Vorkommen	Substrat	Endprodukte
Hydrolaten, Oarbohjjrdrasen 1 ο Amylaae	Pankreas, Speichel, . Malz usw.	Kohlehydrate, Stärke ,· Dextrin usw.	Maltose und Dextrine
2ο Laotase	Parmflüaaig- keit und Schleim	Lactose	Glucose und Galactose
3ο Maltaae	Darmflüssig keit, Hefe usw.	Maltose	Glucose
4-· Sao charaae	Darmflüasig- keit, Hefe usw.	Saccharose	Glucose und Fructose
5« Emulsin	Pflanzen	ß-ölucoside	Glucose usw.
Nucltasen		Nuöle^naäure und Derivate
1. Polynucleoti- daae	Panoreasflüs- sigkeit, Darm- flüssigkeit usw.	Nucleimaäure	Nucleotide
2. Nuoleotidase	Darmflüssig keit und andere Gewebsflüssig- keiten	Nucleotide	Nucleotide und Phos phorsäure
3 ο Nuoleotidase	tierisches Gewebe	Nucleotide	Kohlehy drate und Basen

Amidaaen 1 ο Arginase 2. Urease

3ο Glutaminase 4. Transaminase

Leber

Aminoverbindungen und Amide

Arginin

Ornithin

und Harnstoff

Kohlendioxyd und Ammoniak

Glutaminsäure und Ammoniak

tierisches Gewebe Glutaminsäure /χ -Ketoglu-

UoOxalessigsäu- tarsäure,

re usw. Asparginsäure

209881/0752 ^usw·

Bakterien, Sojabohnen, andere-Bohnen usw.

Leber usw.

Harnstoff

Glutamin

	- 66	Vorkommen	"Substrat	2223385
Name und Klasse		Purinbasen	Endprodukte
Purin-Desaminäs en		und Derivate
	Tierisches Gewebe	Adenin
1Q Adenase	Tierisches Gewebe	Guanin	Hypoxanthin und Ammoniak
2. Guanase		Peptide	Xanthin und Ammonika
	Hefe ι Einge weidt usw.	Polypeptide
1 · Aminopoly- ptptidast	Panorta·	Polyptptidt	Einfachere Peptide und Aminosäuren
2. Oarboxy- ptptidase	Pflanzliches und tierisches Gewebt und Bakterien	Dipeptide	Einfaohert Peptide und Aminosäuren
3* Dipeptidaee	Tierisches Gewebe u.Hefe	Prolin, Peptide	Aminosäuren
4· Prolinase		Proteine	Prolin und einfachere Peptide
Proteinasen	Magensaft	Proteine
1. Pepsin	Pancreas- flüssigkeit	Proteine, Proteasen und Peptone	Proteosen, Peptone usw.
2. Trypsin	Tierisches Gewebe	Proteint	Polypeptide und Amino säuren
3· Cathepsin	Kälbermagen	Casein	Prottosen und Peptone
4. Rennin	Panoreassaft	Proteine, Proteosen und Peptone	Paracasein
5· Chymotryρsin	Papaya, andere Pflanzen Feigensaft	Proteine, Proteosen und Peptone Proteine	Polypeptide und Amino säuren
6. Papain 7. Piein		Proteosen usw.

209881 /0752

Name und
Klasse

Esterasen

- 67 Vorkommen . Substrat

Ester

222338B

Endprodukte

Alkohole und Säuren

1. Lipase

2. Esterasen

Pancreas, Castor-Bonne

USWo

leber usw.

3» Phosphatesen Pflanzlische

und tierische Gewebe

4* Sulfatasen

Tierische und

pflanzliche

Gewebe

Fette

Äthylbutyrat usw.

Ester der
Phosphorsäure

Schwefelsäureester

5· Cholinesterase Blut,Gewebe Glycerin und Fettsäuren

Alkohole und Säuren

Phosphate und Alkohol

Schwefelsäure und Alkohol

Aoetylcholin Gholin und Essigsäure

Katalase

2· Gytochromoxidase

3. Peroxidaee

Alle lebenden Wasserstoff-Organiemen mit peroxyd Ausnahme einiger Mikroorganismen-Arten

Alle lebenden Organismen mit Ausnahme einiger Mikroorganismen-Arten

Past alle

pflanzlichen

Zellen

Heduzisrtss
Cytochrom Ö
in Anwesenheit von
Sauerstoff

Wasser und Sauerstoff

Oxydiertes OytoohroiE Ö und Wasser

eine große Öxydationss^ro-Anzahl von dükt des SubPhenolen,
aromatischen

Aminen usw.
in Anwesenheit
von H₂O₂

strats und Wasser

1. TyrosinaS« Pflanzliches (Polyphenol- und tierioxidase, Mono- βehea Gewebe phenoloxidase)

2. Ascorbinsäure- Pflanzliches oxldase Gewebe

Verschiedene

phenolische

Verbindungen

Ascorbinsäure
in Anwesenheit
von Sauerstoff

Oxydationeprodukt des Substrats

Dehydro-

ascörbin*·

säure

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•	Name und Klasse	■ - 68 -	Tierisches und pflanz liches Gewebe	Tierisches Gewebe	■	2223385	Acetaldehyd und andere Aldehyde
Enzyme, enthal tend Ooenzym I und^oder II	Vorkommen	Tierisches und pflanz liches Gewebe	9ο Aldehyd-Dehydro- Leber genäse	Substrat Endprodukte	Oxalessig- säure
	Tierisches Gewebe und Hefe	Cytochrom-reduzie-		Oxalobern- steinsäure
1o Alkoholdehydro- Tierisches genäse und pflanzli ches Gewebe	Leber, Nieren und Herz	Äthylalkohol und andere Alkohole	Pyruvsäure
2 ο Ä'pfelsäure- Dehydrogenase	6β Glucosedehydro- Tierisches genäse Gewebe	L(-)Äpfel- säure	Acetaessig- säure
3 ο Isozitronen- säure-Dehydro- genase	7. Robinson-Ester- Erythrocyten Dehydrogenase und Hefe	L-Isozitronen- säure	D-Glucon- säure
4. Milchsäure- dehydrogenase	8ο Glycerophos- phat-Dehydro- genase	Milchsäure	Phosphohexon säure
5 ο .■··· 31 ß-oxy- buttersäure- Dehydrogenase	L-ß-Oxybutter- säure	Phosphogly- cerinsäure
D-Glucose	Säuren
Robinson- Ester (Hexo- se-6-phosphat)
Glycero- phosphat
Aldehyde

1· Bernsteinsäure- Pflanzen,

dehydrogenase Tiere und

(gewöhnlich her- Mikroorga-

gesteilt) . nismen

Bernsteinsäure Fumarsäure

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Name und
Klasse

Vorkommen Substrat

Endprodukte

1 ο Altes gelbes
Enzym nach
Warburg

2, Diaphorase

Hefe

3· Haas-Enaym

♦«!Xanthin*.
oxidaae

Bakterien, Hefen, höhere Pflanzen und Tiere

Hefe

Tierisches Gewebe

5· D-Aminosäure- Tierisches oxidase Gewebe Reduziertes
Ooenzym II

Reduziertes
Cοenzym I

Reduziertes
Cοenzym II

Hypoxanthin,
Xanthin,
Aldehyde
reduziertes
Coenzym I,usw

D-Amino säuren
*°2

Oxydiertes Coenzym II und reduziertes gelbes Enzym

Oxydiertes Coenzym I und reduzierte gelbe Diaphorase

Oxydiertes Ooensya II und reduziertes gelbes Enzym

Xanthin, Harnsäure, Säuren, oxydiertes Coenzym I usw. in Gegenwart von Luft,HgO₂

cC -K e t ο säure η + H_nO_n

6. L-Aminosäure- Tieren, oxidasen Schlangengifte

7. TPN-Cytochrom- Hefe, Leber C-reduktase

8. DPNJ-Cytochrom- Leber,Hefe C-reduktase

L-Amino säuren

Reduziertes

Coenzym II

und Cytochrom C

Reduziertes
Coenzym I und
Cytochrom C

Ketosäuren und Ammoniak

Oxydiertes Coenzym II und reduziertes Cytochrom C

Oxydiertes Coenzym I und reduziertes Cytochrom C

'/ f) 9 ü J 1 ! 0 / S 2

Name und Klasse	Vorkommen	Brythrocyten	Substrat	Endprodukte
Hjjrdrasen
1 ο Pumarase	Lebende Organismen im allgemei nen	Fumarsäure + H2O	L-Äpfelsäure
2. Aoonitase 3· Enolase	Tiere und Pflanzen isches Tier- . Grtwebe und Hefe	Zitronensäure 2-PhOBpho- glyoerinsäure	cis-Aconit- säure und L-Isozitronen- säure Phoaphopyruv- säure + HgO
Ifutftitn
1. ölyoxalase	Lebende Orga nismen im allgemeinen	Methylglyoxal vopA andere substituierte Grlyoxale	D (-)-Miloh- säure
Stsmolasen
1· Zymohexase (aldolase)	alle Zellen	Pructose- 1,6-diphosphat	Dlhydroxy- aceton, . Phosphorsäure und Phospho- glycerinsäure
2, Carboxylase	Pflanzliches Gewebe	Pyruvsäure	Acetaldehyd und CO2
3. ß-Ketooarboxy- Tiere, lasen Bakterien, Pflanzen	ß-Ketosäuren	oC-Zetosäuren
4· Aminosäure- Pflanzen, Deoarboxylasen Tier·, Bakterien	L-Amino säuren	imine und CO2
5. Kohleneäure- anhydrase	Kohlensäure	COg + H2O

;·■:■ J

— 71 — Vorkommen ' * Substrat

Name und Klasse

Andere_Enz^me

ο Phosphorylase Tierisches

und pflanzliches Gewebe

ο Phosphohexo- Tierisches

isomerase und pflanzliches Gewebe "

3ο Hexokinase

ο Phosphoglucomutase

Hefe, tierisches Gewebe

Pflanzen und Tiere

Stärke oder
Glycogen und
Phosphat

Glucose-6-phoaphat

Adenosintriphosphat

Glucose-1-phosphat

Endprodukte

Glueöse-1-Phosphat

fruotose-6-Phosphat

Adenosindi" phosphat + Glucose-6-phosphat

Glucose-6-phosphat

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Wie schon angedeutet, sollte das ideale Enzym in der zu untersuchenden Körperflüssigkeit, wie Urin, Speichel und Blut, fehlen. Auch störende Substrate sollten in diesen Körperflüssigkeiten fehlen; andere Enzyme, die um dasselbe Substrat in Wettbewerb treten, sollten ebenfalls in diesen Körperflüssigkeiten fehlen. Das Enzym soll längere Zeit unter normalen Lagerbedingungen, entweder trocken oder in Lösung, stabil sein. Mit dem Enzym soll ein Substrat verwendet werden bzw₀ es soll ein Produkt des Substrates liefern, das leicht nachweisbar ist, wobei der Nachweis nicht durch andere Chemikalien, die in den genannten Körperflüssigkeiten vorhanden sind, gestört werden sollte. Das ideale Enzym soll weiterhin eine sehr hohe Aktivität und eine maximale Aktivität unter den gleichen Bedingungen haben, bei denen eine maximale Bindung mit dem Rezeptor erfolgt. Schließlich soll es inhibiert sein, wenn es mit dem Rezeptor verbunden ist_o Die beiden letztgenannten Erfordernisse sind nicht wesentlich und können durch Verwendung eines heterogenen Systems umgangen werden.

Weitere Gesichtspunkte, die zwar nichts mit der Durchführbarkeit zu tun haben, aber die technische Durchführung erleichtern, sind die Verfügbarkeit eines bestimmten Enzyms und seine Kostens

Enzyme mit einigen der genannten Eigenschaften sind Lysozym, Merrettich-Peroxidase, ß-G-lucuronidase, Äpfelsäuredehydrogenase, Amylase, Cellulase, Mannit-1-phosphat-dehydrogenase, Phospholipase, insbesondere Phospholipase C und Peroxidase« Diese Enzyme haben einen oder mehrere Nachteile, doch konen diese Nachteile verhältnismäßig leicht vermieden werden, und die Enzyme zeigen eine große Anzahl der vorstehend genannten erwünschten Eigenschaften.

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Verbindende Gruppe (X)

Der Ligand oder das Ligand-Analoge sind normalerweise direkt mit dem Enzym verbunden, entweder durch eine Einfach- oder Doppelbindung oder vorzugsweise mi't einer verbindenden Gruppe Bei Liganden, bei denen es sich um Haptene handelt, und bei denen die Rezeptoren Antikörper sind, ist der Ligand zuvor an ein Protein gebunden, damit die Antikörper hergestellt werden können« Da die Antikörper denjenigen Teil des Ligandenmoleküls "erkennen", der aus dem Protein herausragt, wird gewöhnlich die gleiche verbindende Gruppe zum Verbinden des Liganden mit dem Enzym wie zur Verbindung des Liganden mit dem Protein verwendet, um die antigene Substanz herzustellen.

Die funktioneilen Gruppen im Enzym, die zum Verbinden dienen, sind Amino-, (einschließlich Guanidino-), Hydroxy-, Carboxy- und Mercaptogruppen· Weiterhin können auch aktivierte aromatische Gruppen als Bindungsstellen dienen₀

Aminosäuren mit Gruppen, die sich zum Verbinden eignen, sind Lysin, Arginin und Histidin«, Aminosäuren mit freien Hydroxylgruppen sind Serin, Hydroxyprolin und Threonin. Aminosäuren mit freien Carboxylgruppen sind Aspartinsäure und Glutaminsäure β Eine Aminosäure mit einer freien Mercaptogruppe ist Cystein. Aminosäuren mit aktivierten aromatischen Ringen sind Tyrosin und Tryptophane ₍

In den meisten Fällen ist die bevorzugte verbindende Gruppe die Aminogruppe. Es gibt jedoch auch Fälle bei gewissen Enzymen, in denen eine der anderen verbindenden Gruppen bevorzugt wird.

Der Ligand hat natürlich eine große Vielfalt von Funktionalitäten, die verfügbar sein können. Weiterhin können die verfügbaren Funktionalitäten modifiziert werden, so daß eine andere Funktionalität erhalten wird} beispielsweise kann eine Ketogruppe in eine Oxygruppe oder ein Olefin in einen Aldehyd oder eine Carbonsäure umgewandelt werden,. In dieser Hinsicht ist die Auswahl von verbindenden Gruppen zum Liganden größer als zum Enzym. In beiden Fällen wurde jedoch eine Vielzahl von unterschiedlichen Funktionalitäten erprobt, insbesondere zur Bindung verschiedener Verbindungen an Proteine und insbesondere Enzyme β

Wird eine verbindende Gruppe zum Binden des Liganden an das Enzym verwendet, so geht mam meisJ; so vor, daß man die verbindende Grappe an den Liganden anhängt, wodurch man eine aktive Stelle für die Bindung an das Enüym erhält. Dies kann in einer einzigen oder in mehraren Synthesestufen geschehen, wobei andere aktive Gruppen em Liganden als die verbindende Gruppe blockiert unc?. freigelegt werden können. Die nachstehend angegebenen verbindenden Gruppen beziehen sich lediglieh auf die Verbindung des Enzyms mit dem Liganden.

Als verbindende Gruppe wird normalerweise eine solche mit 1-14, gewöhnlich eine solche mit 2-8 Atomen in der Kette, die den Liganden mit dem Enzym verbindet, verwendet. Verwendet man cyclische Strukturen, wählt man die Atomzahl so, daß man eine ähnliche Kettenlänge erhält.

Wenn man keine direkte Bindung verwendet, so enthält die verbindende Gruppe etwa 1-30 Atome (Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff, Sauerstoff, Phosphor und Schwefel; mit Ausnahme der Atome am Liganden und am Enzym), gewöhnlich etwa 4-^0 Atome.

2 ü ^c) B ^r. 1 / 0 7 5 2

Vorzugsweise enthält die verbindende Gruppe im allgemeinen 0 - Η Kohlenstoffatome, gewöhnlich 1-8 Kohlenstoffatome, sowie 1-8, gewöhnlich 1-6 Heteroatome, bei denen es sich im allgemeinen um Sauerstoff, Schwefel und Stickstoff, gewöhnlich nur um Sauerstoff und Stickstoff, handelt. Die bevorzugten Funktionalitäten in der verbindenden Gruppe sind die Nicht-Oxocarbonyl-, Thiοcarbonyl-, Amino- oder Hydroxygruppe. .

Besonders brauchbare verbindende Gruppen für eine Vielzahl von Liganden enthalten 2-4 Kohlenstoffatome und besitzen 1-2 Nicht-Oxocarbonyl-Funktionalitäten. Diese Grippen leiten sich von cyclischen Anhydriden und alpha-Halogencarbonsäuren ab. Eine weitere verbindende Gruppe enthält 2-4 Kohlenstoff atome und 1-2 Heteroatome in der Kette, wobei insgesamt 1-4 Heteroatome vorliegen können. Eine solche verbindende Gruppe leitet sich beispielsweise vom O-Carboxymethylhydroxylamin abo '

Die nachstehende tabellarische Aufstellung zeigt verschiedene verbindende Gruppen, die den Funktionalitäten am Liganden und am Enzym angepaßt sind_o Falls nichts anderes gesagt ist, sättigt die verbindende Gruppe eine oder zwei Valenzen eier funktionellen (gruppen am Liganden und am Enzym ab, an die sie gebunden ist»_s

2 09881/0752

Ligand
Amino (-HTH-) oder Hydroxyl (-0H)

-L

J-

ο ο

-C-Z-O 0

(nur primäre Aminogruppe)

Enzym

Amino (-JSfHp) Hydroxyl (-0H) ode? Mercapto(-SH)

Ϊ

-C-NH-CH₂C -P(O)(OR⁸)-

-P(O)(OR⁸ί-

(R⁹)₂-

-C(R⁹)₂- -C(R⁹)₂C(R⁹)₂-

■J-

-Z-SO₂-

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In den vorstehend angegebenen Formeln haben die Substituenten folgende Bedeutungen:

Z ist eine Bindung; ein HydrocarbyIenrest mit 1- 10 Kohlenstoffatomen, insbesondere eine Alkylengruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen, eine Alkenylengruppe mit 2-6 Kohlenstoffatomen, eine Alkinylengruppe mit 2-6 Kohlenstoffatomen, eine Cyoloalkylengruppe mit 4-10 Kohlenstoffatomen oder eine Arylengruppe mit 6-10 Kohlenstoffatomen} eine Oxaalkylengruppe mit 4-8 Kohlenstoffatomen; oder eine Azaalkylengruppe mit 4 ·- 8 Kohlenstoffatomen;

8
R ist eine Alkylgruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen}

R^ ist Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1-3 Kohlenstoffatomen«,

Die Gruppe Z oder eine Nicht-Oxocarbonylgruppe werden zur Bindung an Hydroxyl bevorzugt; zur Bindung mit Aminogruppen werden Nicht-Oxocarbonylgruppen, Nicht-Oxothioearbonylgruppen und die Gruppe Z bevorzugt·

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Ligand	=NOZ-
Oxocarbonyl (:>C=0)	*=NOZ-CO-
	-NO2CZCO-
	=CHCO-
	=NNHZ-CO«
	-NNHZ-CS-
-

Ni cht«-0xo carbonyl (*-u-)

Enzym

Amino(-NH₂), Hydroxyl (-0H) oder Mercapto (-SH)

Amino(-NH₂), Hydroxyl(-0H) oder Mercapto(-SH)

-0-Z-CO- -N(R⁹)-Z-CO-

-N(R⁹)-Z- -0-Z-

Arylamino (-Z¹¹NH₂)

Hetliin(=CH) Amino (-NH₂)

Amino(-NH₂; Hydroxyl(-0H)
Nioht-Oxocarbonyl (^:C=O)

Methin (SCH) Amino (-NH₉)

-0-Z"-N₂- -N(R⁹)-Z"-N-

Hierbei bedeutet Z" ein· Arylengruppe Mit 6-10 Kohlenetoff« atomen.

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Soll das Enzym über eine Carboxylgruppe des Ligahden oder über eine an den Liganden gebundene verbindende Gruppe gebunden werden, so können entweder Ester oder Mide verwendet werden«, Der Ligand kann an ;jede beliebige verbindende Gruppe gebunden sein, die in der Lage ist> eine Verbindung zwischen dem Liganden und der Alkohol- öder Äminogruppe dös Enzyms unter Ausbildung der Ester- bzw«, Amidgruppe zu bilden. Enthält das Enzym einen aktivierten aromatischen Ring* so kann der Ligand mit einem arpmätisehen Diäzoriiümealz verbünden werden, damit die gewünschte Brücke entsteht.

Die verbindende Gruppe wird aufgrund der nachstehenden Über- · legungen ausgewählt. Die gebildeten Bindungen müssen unter den Bedingungen·der Analyse stabil sein. Wird derLlgänd über die verbindende Gruppe mit dein Enzym verbüriäen; so muß das Enzym nach der Isolierung mindestens einen !feil seine* Aktivität behalten* Das Enzym darf die Bindung deö Liganden an den Rezeptor nicht verhindern^ Die Punktionalitaten sollen eine gewisse Selektivität ermöglichen, ,so daß die Bindung an speziellen Gruppen oder Typen von Gruppen in den Liganden und den Enzymen erfolgen kann;

Nachstehend sind einige erläuternd« Beispiel! WbUi diS Einführung von verbindenden Gruppen angegeben. Trägt äer Ligätit beispielsweise eine Äminogruppe _f so kann diese mit CIiI ofessigsäureäthylester verbunden werden, uitt das U-Sübsträt . von Äthyiglycinat zu bilden« Der Ester kann hydroiysisit und das gemischte Anhydrid der Carbonsäure gebildet iwriehi Das gemischte Anhydrid kann dann zur Bildung einer- Carböx&midgruppe mit einer Aminosäure eines Enzyms ^ die eine fiele Aminogruppe enthält, (z.B. Lysin) verwendet werden.'

81/07

Wenn der Ligand eine Ketogruppe enthält, so kann die Carbonyl« gruppe direkt mit einer Aminogruppe des Enzyms kondensiert werden; es kann aber auch das O-Carboxymethyloxim mit O-Carboxymethylhyroxylamin hergestellt v/erden» In der gleichen Weise kann der Ester hydrolysiert und ein gemischtes Anhydrid gebildet werden, das dann zur Bildung des Carboxamids mit Lysin verwendet werden kann.

.Enthält der Ligand eine Carboxylgruppe, so kann es zweckmäßig sein, die Carboxylgruppe unter Bildung des Monoamids von phenylendiamin umzusetzen* Die erhaltene Verbindung kann dann zum Diazosalz diazotiert werden, das dann mit dem im Enzym vorhandenen Tyrosin gekuppelt werden kann_e

Eine weitere Möglichkeit, die verbindende Gruppe zu bilden, besteht darin, einen Alkohol eines Liganden mit Bernsteinsäureanhydrid unter Bildung des Monoesters umzusetzen. Die freie Carboxylgruppe kann dann durch Herstellung des gemischten Anhydrids aktiviert und für die Umsetzung mit einer Aminogruppe im Enzym verwendet werden_β

Enthält der Ligand eine Aminogruppe, so kann diese unter schärferen Bedingungen mit Maleinsäureanhydrid zum Maleinsäureimid umgesetzt werden. Das Maleinsäureimid kann dann mit Cystein im Enzym kombiniert werden, wobei durch Michael-Addition das 3-Thiosuccinimid erhalten wird.

Bei polyfunktionellen Liganden, wie Proteinen, können bifunktionelle Reagentien mit Gemischen des Liganden und des Enzyms verwendet werden. Beispielsweise verbindet sich bis-(4-Fluor-3-nitro)-sulfon mit dem Aminogruppen des Ljysins, wodurch der Ligand und das Enzym durch eine bis-(4-Amino-3-nitro)-sulfongruppe tiberbrückt wird.

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Obgleich das Enzym in den meisten Fällen mit jeder geeigneten Stelle des Liganden verbtmden werden kann, was entweder über eine bereits im Liganden vorliegende oder synthetisch eingeführte Funktionalität geschehen kann, gibt es bevorzugte Verfahren zur Verbindung des Enzyms mit dem Liganden. Es sei vorausgeschickt, daß der Ligand des mit dem Enzym gebundenen Liganden keine biologische Aktivität zu haben braucht. Hauptsächlich kommt es darauf an, daß die Geometrie und die Beziehungen zwischen den polaren Stellen eines größeren Teils des Ligandenmoleküls nicht gestört werden. 1st der Ligand ein Hapten, so wird das Enzym normalerweise an der gleichen Stelle gebunden, an der das Protein bei der Herstellung des Antigens angelagert wird. Ist der Ligand ein intaktes Antigen, so können verschiedene Stellen zur Bindung eines oder mehrerer Enzymmoleküle verwendet werden, wobei jedoch die offensichtliche Einschränkung gilt, daß die Anzahl der Enzymmoleküle nicht so groß sein darf, daß eine Bindung mit dem Antikörper verhindert wird» Hat der Ligand einen anderen natürlichen Rezeptor als einen Antikörper, so bestimmt sich die Bindestelle (oder die Bindestellen) in erster Linie dadurch, daß eine starke Bindung mit dem Rezeptor aufrechterhalten wird.

Bei der Analyse eines Moleküls aus einer Vielzahl von ziemlich ähnlichen Molekülen, Z₀B. Steroiden, die sich hinsichtlich ihrer Substituenten in der Stellung 17 unterscheiden, zieht man es vor, das Molekül an einer Stelle, die von der unterscheidenden Funktionalität weiter abliegt, mit dem Enzym zu verbinden. Bei den- Steroiden ist es häufig vorzuziehen, die Bindung an der Stellung 5 und nicht an der Stellung 17 durchzuführen, da der unterscheidende Teil des Moleküls gewöhnlich in der Stellung 17 angeordnet ist« In den meisten Fällen ist

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die Stellung 3 entweder ein Alkohol oder ein Keton, wobei das Keton normalerweise einer aliphatisch ungesättigten Stelle benachbart ist.

Die gleichen oder ähnliche Überlegungen gelten für andere Liganden· Z.B. wird man bei einem Polypeptid, das eine natürliche Rezeptorstelle besitzt, die Bindung vorzugsweise in einer gewissen Entfernung von der Rezeptorstelle durchführen.

Wie- schon gesagt, ist in den vorstehend angegebenen Formeln nur ein mit einem Enzym A verbundener Ligand angegeben. Wie bereits angedeutet, kann die Anzahl der an das Enzym gebundenen Liganden auch größer als 1 sein, ausgenommen wenn man eine Affinitätsmarkierung vornimmt oder wenn das Enzym nur geringfügig substituiert zu sein braucht, damit eine Verminderung der katalytischen Wirksamkeit erzielt wird.

Die Formeln sollten deshalb richtiger wie folgt lauten:

-W*¹ -W*²

x1

x3

x1 jc2 x3 worin eine der Gruppen W , Wn und W eine verbindende

Gruppe, die andere Gruppe, nämlich X , Wasserstoff oder eine geeignete Funktionalität, L den Liganden und a eine Zahl von 1 oder größer ist und der Anzahl der am Enzym A gebundenen Liganden L entspricht. Deshalb können die vorstehend angegebenen Formeln entsprechend modifiziert werden, so daß sie auch mehrere, an ein Enzym gebundene Liganden umfassen. Der

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Bereich, der Verhältnisse zwischen Liganden und Enzym wurde bereits angegeben. Bei den meisten, durch die Formeln angedeuteten Liganden (ausgenommen bei den Polypeptiden und den Proteinen) liegt a im allgemeinen zwischen 1 und 40» gewöhnlich zwischen 1 und 35; ist das Enzym in statistischer Verteilung substituiert, so liegt der Durchschnittswert von a zwischen etwa 2 und 35.

Die Bindung von Liganden an Träger

Zur Bindung von Liganden an Träger können ähnliche Arbeitsweisen wie für die Bindung von Liganden an Enzyme angewendet werden· Die Träger können die gleichen Funktionalitäten wie die Enzyme haben, ZoBo Carboxyl-, Amino- oder Hydroxylgruppen, die als Bindungsstellen verwendet werden können. Es können die gleichen verbindenden Gruppen bzw. direkten Bindungen wie bei der Bindung an Enzyme verwendet werden. Die Enzyme können in an sich bekannter Weise an Träger gebunden werden_e

Enzymanalys e

Zur Bestimmung der Menge des aktiven Enzyms wird die Analyse der enzymatischen Aktivität angewendet, die für eine große Vielzahl von Enzymen bekannt ist«, Zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität wurde bereits eine Vielzahl von Medien, Bedingungen und Substraten entwickelt (vgl. ζ·Β_β Bergmeyer, Methods for Enzymatic Analysis, Academic Press, New York, 1965)· Da es hier Unterschiede gibt, nicht nur zwischen den Analysenmethoden für verschiedene Enzyme, sondern auch für ein bestimmtes Enzym, kann eine allgemeine Beschreibung der Analysenmethode nicht angegeben werden.

Der Rezeptor

Erfindungsgemäß handelt es sich bei den Rezeptoren um Makromoleküle mit Stellen, die spezifische Strukturen erkennen·

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Die Erkennung der spezifischen Strukturen beruht auf van der Waals-Kräften, die eine besondere räumliche Umgebung liefern, wodurch die van der Waals-Kräfte verstärkt werden; weiterhin beruht sie auf Dipol-Wechselwirkungen, entweder durch permanente oder induzierte Dipole; auf Wasserstoff- und Ionen-Bindung, auf koordinatiy-kovalenter Bindung und auf hydrophober Bindung» Eine ausführliche Erörterung der Mechanismen, nach denen die Rezeptoren Liganden binden, findet sich bei Goldstein et al, principles of Drug Action, Harper and Howe, New York, 1968.

Makromoleküle mit dem größten Interesse sind Proteine und Nucleinsäuren, die in Zellmembranen, Blut und anderen biologischen Flüssigkeiten vorkommen· Unter diese Verbindungen fallen Enzyme, Antikörper, Ribonucleinsäure (RNS), Desoxyribonucleinsäure (DNS) und andere natürliche Rezeptoren.

Die bequemste Gruppe von Proteinen, die erfindungsgemäß verwendet werden, sind Antikörper, Diese Substanzen werden zweckmäßig bei der Analyse der Liganden-Kategorie verwendet, die als Haptene bezeichnet wirde Antikörper werden durch Einführung einer immunogenen Substanz in den Blutkreislauf eines Lebewesens erzeugt. Die Reaktion auf die Einführung der immunogenen Substanz oder des Antigens besteht in der Bildung von Antikörpern, die das Antigen überziehen und ungiftig machen bzw· es aus der Lösung ausfällen· Die Antikörper bilden einen Überzug, der geometrisch so angeordnet ist, daß er sich der räumlichen Anordnung des Antigens anpaßt· Dies kann mit einem Schloß und einem Schlüssel verglichen werden· Die Wechselwirkung ist normalerweise reversibel, derart, daß das Antigen auf verschiedene Weise verdrängt oder entfernt werden kann, ohne daß die Rezeptorstelle zerstört wird.

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Es gibt viele Substanzen, die Antigene darstellen und die bei der Einführung in den Blutkreislauf eines Wirbeltiers eine Immunreaktion erzeugen. Eine Anzahl von interessierenden Substanzen sind jedoch keine Antigene, sondern Haptene, und in diesem Fall ist ein weiterer Schritt zur Herstellung des Antikörpers erforderliche Dieses Verfahren zur Herstellung von Antikörpern mit Substanzen, die keine Antigene sind, ist bekannt und ist z_eBo in Microbiology, Hoeber Medical Division, Harper and Rowe, 1969» beschrieben« Es sei auch auf Landsteiner, Specificity of Serological Reactions, Dover Publications, Ν·Υ. 1962j Rabat et al, Experimental Immunochemistry, Charles C. Thomas, Springfield, Illinois, 1967 und Williams et al, Methods in Immunology and Immunochemistry, VoIo I, Academic Press, New York, 1967 verwiesene

Das zu untersuchende Material wird in beliebiger Weise mit einem Protein verbunden, und das modifizierte Protein wird in den Blutkreislauf eingeführt· Es können verbindende Gruppen vom gleichen Typ wie zur Verbindung des Enzyms mit dem Liganden verwendet werden. Die sich bildenden Antikörper schließen Gruppen von Antikörpern ein, die so geformt sind, daß sie mit der Fremdsubstanz, die an das Protein gebunden ist, zusammenpassen. Auf diese Weise erhält man Antikörper, die für die Verbindung oder die Substanz, die mit dem Protein gebunden ist, spezifisch sindo Durch sorgfältige Trennverfahren können die in erster Linie mit der fraglichen Substanz zusammenhängenden Antikörper konzentriert werden, so daß eine Antikörper-Zusammensetzung erhalten wird, die in erster Linie mit der spezifischen Substanz, die mit dem Protein gebunden war, zu tun hat.

Zur Erläuterung dieses Verfahrens wird para-Aminobenzo1-Arsonat zum Diazosalz diazotiert. Durch Vereinigung des Diazosalzes mit Kaninchen-Globulin wird das Kaninchen« Globulin mit para-Azobenzol-Arsonat markiert« Durch Ein·» führung dieser Zusammensetzung in den Blutkreislauf eines

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anderen Tieres ale eines Kaninchens, z_oBo eines Schafes, können Antikörper gebildet werden, deren räumliche Anordnung nur das Azobenzol-Arsonat aufnimmt₀

Neben den Antikörpern gibt es eine Anzahl von natürlich vorkommenden Rezeptoren, die für Verbindungen mit biologischem Interesse spezifisch sind. Verbindungen, für die natürliche Rezeptoren existieren, sind Thyroxin, Corticosteron, Cortison, 11-Desoxycortisol, 11-Hydroxyprogesteron, östrogen, Insulin und Angiotensin (vgl. beispielsweise Vonderhaar et al, Biocheme Biophysic Acta, 176, 626 (1969))» Alle diese Liganden wurden untersucht und sind in der Literatur in Verbindung mit Untersuchungen über ihre Verbindung mit spezifischen Rezeptoren erwähnt.

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Tabelle

Ni O CO CO CO

Ligand Thyroxin

Corticosteron

Rezeptor für Liganden mit Literaturhinweis

Thyroxinbindendes Globulin (TBG) Thyroxinbindendes Prealbumin (TBA) B.E.P. Murphy, C.J.J. Pattee, J. Clin Endocr., 24, 187 (1964) gandenstruktur

Protein von Gehirnkernzellen, B. McEwen, L. Plapinger Nat. 226, 263 (1970)

COOH

Corticosteron

Cortisol (Β=ΟΗ·,Η) Cortison (H=O) 11-Desoxycörtisol (R=H,H).

B.W. Murphy, J.Clin.Endocr.. 28, 343; (1968), 27, 973 (1967) Corticosteroid-bxndendes Globulin (Transcortin)

CH2	OH	C=O T ι	2338
3 ^-- -oh

Gortison

Tabelle 1 - Fortsetzung

Ligand Östradiol

Insulin

Rezeptor für Liganden mit Literaturhinweis

Rezeptorstelle für Östrogen aus dem Uterus, BBA, 176, 626 (1969)

Ligandenstruktur

CR. Morgan, W.M. Holland, III Diabetes, 1966

Östradiol

) siehe unten

S S NH₀

I * [ j [

⁺) H-Gly-Ile-Val-Glu-Glu-Cys-Cys-Ala-Ser-Tal-Cys-Ser-Leu-Tyr-Glu-Leu-Glu-Asp-Tyr-Cys-Asp-OH

I

S . S

I

s s

t i

H-Phe-Val-Asp-Glu-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu—Tyrr-rLeu—YaI—Cys-Gly-Glu-Arg-Gi;

NH₂ NH₂

Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-AIa-OH

K) CO OO OO

Tabelle 1 - Portsetzung

Ligand
Angiotensin II

Rezeptor für Liganden mit Literaturhinweis Ligandenstruktur

L.B. P.age, E. Haber, A.Y.Kimura A. Pernode, J.Clin.End. 28, 200 Asp-Arg-Val-Tyr-Ileu-His-Pro-Phe

ro co co

Falls gewünscht, können die Antikörper mit einer Reihe von Trägern verbunden werden. Die Verbindung kann in ähnlicher Weise wie die Verbindung eines Proteins mit einem Liganden durchgeführt werden. Die Träger umfassen beispielsweise Polyacrylamide, Copolymere von Vinylacetat und Acrylsäure, Polyvinylester, modifizierte Zellulose, Z₀Be Agarose und Sepharose usw. Der Rezeptor kann aber auch, wie schon gesagt, indirekt an einen Träger gebunden sein. Bei Antikörpern mit zwei Rezeptorstellen kann der Ligand für den Antikörper an einen Träger mit großen Poren gebunden sein. Auf diese Weise ist eine der Stellen des Antikörpers mit dem liganden verbunden, der wiederum an den Träger gebunden ist, wobei die andere Stelle für die Analyse frei ist. Dieses Verfahren hat den Vorteil, daß die für den Liganden spezifischen Antikörper konzentriert und von den im Antiserum vorhandenen anderen Proteinen getrennt werden,»

Experimentelles

Die nachstehenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung, sollen diese aber nicht hierauf beschränken,, Alle Temperaturen sind in ⁰C angegeben»

Beispiel A
Herstellung von Morphin«-Antikörpern und Bindung

1· 900 mg Morphin wurden 4 Stunden bei 50⁰C und 0,01 mmHg getrocknete Das getrocknete Morphin wurde in 18 ml absolutem Äthanol gelöst, worauf 125 mg Natriumhydroxyd und anschließend 350 mg trockenes Natriumchloracetat zugesetzt wurde. Nach dem Spülen mit Stickstoff wurde die lösung 4 Stunden unter Rückfluß gerührt« Die heiße Lösung wurde mit 3,8 ml äthanolischer Salzsäure (0,85 molar)

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behandelt und anschließend noch warm filtriert. Beim Stehen über Nacht bildete sich ein Niederschlag, der gesammelt und aus Äthanol/Wasser umkristallisiert wurde. Bei Zusatz von Äther zum ursprünglichen Piltrat wurde ein weiterer Niederschlag erhalten, der ebenfalls aus Äthanol/ Wasser umkristallisiert wurde. Gesamtausbeute 600 mg (55 $) Beim Erhitzen dieses Produktes in Vakuum bei 75°C wurde ein Gewichtsverlust, entsprechend 0,48 Mol Äthanol oder 1,15 Mol Wasser festgestellt. Die getrocknete Verbindung zersetzt sich bei 190"- 220⁰C (in Abhängigkeit von der Erhitzungsgeschwindigkeit).

Analyse: C^oH₂₁NO₅J $ theor.: C,66/5j H, 6,16} N, 4,08

$ getinden:C,65,87;H, 6,98; N, 4,09, 4,07

(C₅D₅N) 2,44 ppm (-CH₃), 5,08 ppm (-CH₂COO)

2. 24O mg Carboxymethylmorphin, suspendiert in 8 ml trockenem DMP, wurden auf -15⁰C gekühlt und mit 84/Ul Chlorameisensäureisobutylester behandelt. Die feste Substanz löste sich nach dem Rühren bei -15⁰C über einen Zeitraum von 30 Minuten. Dieser Lösung wurden 4OO mg Rinderserumalbumin (RSA), gelöst in 56 ml Wasser, das 2,6 g Natriumbicarbonat enthielt, zugesetzt, und das Gemisch wurde über Nacht bei 0 C gehalten© Das Gemisch wurde dann gegen destilliertes Wasser dialysiert, wobei das Wasser viermal ausgetauscht wurde (Dialyseverhältnis 1:80), und gefriergetrocknet, wobei 350 mg Konjugat erhalten wurde»

Haptenkonzentration im protein

^ ⁶CMM = ¹⁰⁷°

= 64 c 400 £

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Das Ultraviolettspektrum wurde bei 280 nm in einer 1 cm-Zelle gemessen: d=O,59 bei einer Konzentration von 0,287 g/Liter in Wasser. Der Konjugationsgrad kann aus den obigen Werten und der Formel

d «

^MGRSA

bestimmt werden, worin X die Anzahl der Haptene je Molekül, Gr das Gewicht des Proteinkonjugats je Liter und MGr das Molekulargewicht bedeuten, wobei sich GMM auf das Hapten Oarboxymethylmorphin und RSA auf das Protein beziehen.

X = 46,6 Haptene/Molekül

Antiseren können wie folgt erhalten werden: Das Antigen (Hapten, gekoppelt mit einem geeigneten Protein) wird in einer Kochsalzlösung (9 g/Liter) mit einer Konzentration von 2 mg/ml zubereitete Je Anteil von 1,0 ml dieser Lösung werden gleichzeitig 3 ml vollständiges Freund'sches Adjuvans in homogenisierter Form mit Hilfe einer Zweiwegenadel eingeführte Für subukante Injektionen werden an jede Stelle etwa 0,3 ml (Antigen + Freund¹sehe Lösung) injiziert, bei intraperitonealen Injektionen etwa 0,4 ml. Die gesamte Dosis beträgt etwa 4,0 ml je Kaninchen.

Nach 3-4 Wochen wird eine starke intramuskuläre Injektion aus 0,5 ml der vorstehend angegebenen Kochsalzlösung und 0,5 ml vollständigem Freund'schein Adjuvans injiziert.

Nach 5-7 Tagen wird das Kaninchen geblutet, indem eine Injektionsnadel in den Brustkorb eingeführt und langsam in die Mitte gepreßt wird, während an die Spritze ein

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Vakuum angelegt wird,

Ist die gewünschte Blutmenge gesammelt, so läßt man das Blut koagulieren und entfernt das Koagulato Die hinterbleibende,.Lösung wird dann 10 Minuten bei 2000 u/min zentrifugiert. Das gesammelte Serum ist frei von losen roten Blutkörperchen.

Ein gleiches Volumen gesättigter Ammoniumsulfatlösung wird dem Serum unter Rühren bei 4°C zugetropft. Nachdem die Lösung 1 Stunde bei dieser,Temperatur gestanden ist, wird sie 15 Minuten bei 10·000 ü/min zentrifugiert,und die überstehende Flüssigkeit wird entfernte Der Rückstand wird in einem möglichst kleinen Volumen von 1 X BP (Boratpuffer, nachstehend noch näher erläutert) suspendiert, in einen Dialysebeutel gebracht und über Nacht gegen den Boratpuffer (pH = 8,0) dialysiert· Der Rückstand im Dialysebeutel wird dann isoliert und eingefroren.

Zur Herstellung des Boratpuffers werden 24,6 g Borsäure in Wasser gelöst, worauf der pH-Wert mit Natriumhydroxyd auf 7,9 bis 8,0 eingestellt, 0,1 g Natriumazid und 0,01 g Äthylmercurithiosalicylat zugesetzt werden und das Gesamtvolumen auf 1 Liter aufgefüllt wird.

4. In 20 ml Dimethylformamid werden 400 mg Aminoäthyl-Bio-G-el-P-300 und 300 mg Carboxymethylmorphin (vgl. Beispiel A-1) eingebracht, worauf 1 g Natriumbicarbonat zugesetzt wird. Die Suspension wird 2 Tage bei 4°C gerührt und anschließend filtriert, worauf der Rückstand mit Wasser gewaschen wird bis die Waschwässer neutral sind} der Rückstand wird dann unter Vakuum getrocknet.

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Das erhaltene Produkt wird dann in 20 ml Kaninchenserum, das Morphin-Antikörper enthält, suspendiert und 4 Stunden bei 4 C gerührt» Nach dem Filtrieren erhält man einen Rückstand, der wieder in 5 ml Phthalatpuffer mit einem pH-Wert von 3,8 (0,1 molar) und 2 Stunden gerührt wirdo Das Gel wird abzentrifugiert, und die überstehende Flüssigkeit wird gegen Phosphatpuffer (pH = 7,4t 0,1 molar) dialysiert, wobei eine gepufferte lösung von praktisch reinen Antikörpern erhalten wird·

5· In einen Kolben wurden 5 ml einer Sepharose~4B-Suspension„ 5 ml Wasser und 5 ml einer CNBR-Lösung (100 mg/ml) eingebracht, und der pH-Wert mit 4n-NaOH auf 11,5 eingestellte Das Gemisch wurde gerührt, wobei der pH-Wert überwacht und durch Zusatz von 4n-NaOH auf 11 - 11,5 gehalten wurde, bis keine Änderung des pH-Wertes mehr festgestellt werden konnte. Das Gemisch wurde filtriert und mit 100 ml 0,1-molarem Carbonatpuffer mit einem pH-Wert von 9,0 gewaschen.

Die Maphin-Antikörper wurden dadurch vorbehandelt, daß 3 ml der Antikörperlösung durch eine Sephadex-G-25-Kolonne (10 χ 0,9 cm) geleitet wurden, die mit 0,1-molarer Carbonatlösung (pH = 9,0) ins Gleichgewicht gesetzt worden war. Es wurden 4 ml Eluat erhalten₀

Die wie oben hergestellte Sepharose wurde in 5 ml kalter Carbonat-Pufferlösung suspendiert und der Morphin-Antikörperlösung zugesetzt· Das Gemisch wurde 36 Stunden bei 4⁰C gerührt, filtriert und mit 100 ml 0,1-molarer Carbonat-Pufferlösung (pH = 9) gewaschen» Die Ultraviolettanalyse ergab, daß 65 i» des Proteins an Sepharose gebunden waren.

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6. Die Rezeptorstellen können wie folgt bestimmt werden:

Die Enzymaktivität einer lösung, die den an das Enzym gebundenen Liganden enthält, wird nach an sich bekannten Verfahren bestimmt. Der Antikörper für den Liganden wird so lange zugesetzt, bis nach weiterer Zugabe des Antikörpers keine weitere Änderung der Enzymaktivität feststellbar ist« Hierdurch kann die Restaktivität für praktisch den gesamten, an das Enzym gebundenen Liganden_t der wiederum an den Antikörper gebunden ist, festgestellt werden«,

Es wird eine zweite Antikörper-Lösung hergestellt, welcher der an das Enzym gebundene Ligand in Anteilen zugesetzt wird, wobei die Enzymaktivität nach jeder Zugabe festgestellt wird· Die Enzymaktivität wird gegen die Menge des zugesetzten, an das Enzym gebundenen Liganden aufgetragen· Im Ergebnis wird also der Antikörper mit dem an das Enzym gebundenen Liganden titriert. Zu einem gewissen Zeitpunkt sind praktisch alle Rezeptorstellen aufgefüllt, und man erhält eine geradlinige Beziehung zwischen der Zunahme der Enzymaktivität und der Menge des zugesetzten, an das Enzym gebundenen Liganden. Extrapoliert man den geradlinigen Teil der Kurve auf die Abszisse, so erhält man die tatsächliche Anzahl der Antikörperstellen, die den an das Enzym gebundenen Liganden inhibieren«. Erhöht man die effektive Zahl durch die Prozentzahl der Restaktivität, so erhält man eine gute Annäherung an die Absolutzahl der Antikörpers telleno

Das vorstehend angegebene Verfahren kann mit jedem beliebigen Rezeptor verwendet werden^ wenn das Enzym in ausreichendem Maße dadurch inhibiert wird, daß der an das Enzym gebundene Ligand an den Rezeptor gebunden wird« Ist das Enzym nicht inhibiert« so können Alternativverfahren

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angewendet werden, die in der Literatur beschrieben sind (vgl. auch Patentanmeldung P 22 01 165·0)_ο

Beispiel 1 Konjugation von Morphin mit Amylaee

A« Einer Lösung von 100 mg Amylase in 15 ml Wasser mit

«2 600 mg Natriumbicarbonat wurden 4»6 χ 10 Mol des Morphin-Mischanhydrids (hergestellt nach Beispiel A-2) in 1 ml DMF bei 0«5°C zugesetzt. Die Lösung wurde 18 Stunden bei O⁰C gerührt, in einen Dialysebeutel gebracht und 2 Tage bei 0° gegen Wasser dialysierto Der Rückstand wurde gefriergetrocknet, wobei ein weißer fester Stoff erhalten wurde.

Die Aktivität der mit Morphin modifizierten Amylase wurde wir folgt bestimmt:

Die mit Morphin modifizierte Amylase wurde mit einer Suspension von gefärbter Amylose bei 37 gemischt. Nach einer willkürlich gewählten Zeit wurde die Reaktion abgebrochen, zentrifugiert, und die überstehende Flüssigkeit in eine Küvette gebracht und die optische Dichte gemessen. Dies wurde mehrmals wiederholt, so daß die optische Dichte gegen die Zeit aufgetragen werden konnte, wobei eine Gerade erhalten wurde» Die Steigung der Geraden war ein Maß für die Enzymaktivität* Es wurde gefunden, daß die Modifizierung der Amylase mit Morphin - nur einen geringen bis gar keinen Einfluß auf die enzymatische Aktivität der Ausgangs-Amylase hatte.

Be Eine abgemessene Menge Morphin-Antiserum (Konzentration an aktiven Stellen 2 χ 10 Mol je Liter) wurde zu einer mit Oarboxymethylmorphin modifizierten Amylaselösung (6,4 x 10" Mol/Liter) gegeben« Dann wurde der Amylase-Aktivitätstest bei 37° über einen Gesamtzeitraum von

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20 Minuten durcageführt. Die Ergebnis·· sind in der nachstehenden Tabelle angegeben.

Beetiaaung	Voluaen der ait Carboxyaethyl- aorphin modifi- »ierten Aaylaae, /ul	Voluaen der Antikörper- Ιο eung, al	Optische Dichte
1	100	0,0	0,910
2	100	0,020	0,720 .
3	100	0,050	0,560
4	100	0,100	0,450
5	100	0,150	0,390

Die !Tabelle zeigt, daß mit zunehmender Antikörperkonzentration die Aktivität der mit Carboxymethalmorphin modi« fixierten Amyläse abnimmt·

C· Der Einfluß eines Codeinzueatzes wurde dadurch bestimmt, daß eine Probe mit Antikörper und Carboxymethylmorphin in Abwesenheit von Codein und eine entsprechende Probe in Anwesenheit von Codein getestet wurden.

Mit 0,2 ml einer lösung, die den mit Antikörper und Carboxymethylmorphin modifizierten Enzymkomplex enthielt, wie er bei der Amylasebestimmung verwendet wird, betrug die optische Dichte 0,450. Wurden jedoch 0,030 ml einer

10 -molaren Codeinlösung zu der gleichen Menge des Antikörper-Enzym-Komplexes gegeben, so betrug die optische Dichte bei der Amylaee-Analyse 0,580, Auf diese Weise

<-7
kann eine 10 -molare Codeinlösung, von der nur 30yul zur Verfügung stehen, analysiert werden. Dies soll jedoch nicht bedeuten, daß es sich hierbei um die erforderliche Mindestkonzentration handelt; vielmehr handelt es sich hierbei um eine Konzentration, die für eine erfolgreiche Analyse angewendet werden kann. Das beschriebene Verfahren kann auch mit Morphin, Morphin-Glucuronid und anderen eng verwandten Strukturellen Analogen des Morphins

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und Codein· angewendet werden.

Beispiel 2 Konjugation τοη Morphin ait Peroxyda«· oder Lyaoiya

A* (1) Zu 10 β* (2,5 χ 1O^-7 Mol) Heerretttehperoxydaee (3400 1,1./mg) und 20 ag HaHCO₃ in 1 al Wasser wurden 0«09 al (9 x 10"⁶ NoI) einer Lösung τοη 10Q,uM©i/al dee gemischten Anhydrid» τοη Carboxymethylaorphin (siehe weiter unten) in Diaethylforaamid (DM7) gegeben} das Gemisch wurde über Macht bei 4°C stehengelassen« Die Lösung wurde dann durch eine mit Sephadex G-25 gefüllte Kolonne (1 χ 10cm) geleitet, und der Abfluß wurde als an Peroxydasθ gebundenes Morphin für die Bestimmung von Morphin verwendet.

A· (2) Das gemischte Anhydrid aus Chlorameisensäureisobutyl-

•3
ester und 0 -Carboxymethylmorphin wurde in Form einer DMF-Löeung (100 /uMol) hergestellt· Dann wurden 5 mg Meerrettichperoxydase (MRP) (1,5 x 10 Mol Lysinreste) in 0,5 ml Wasser gelöst. Die Lösung wurde auf 4-⁰C abgekühlt und der pH«-Wert mit verdünnter NaOH-lösung auf 9»5 eingestellt, 90/Ul (9 x 10 Mol) des gemischten Anhydrids wurden in Anteilen von 10 All zugesetzt, wobei der pH-Wert durch gelegentliche Zugabe von NaOH auf 9-10 gehalten wurde. Das Gemisch wurde 1 Stunde gerührt und erschöpfend gegen Wasser dialysiert.

B« Eine erste Lösung (Lösung A) wurde durch Auflösen von 100 mg Lysozym (6,9 * 10*" . Mol) in 10 ml Wasser und Zusatz von Natriumbicarbonat, bis ein pH-Wert von 8,0 erreicht wurde, hergestellt. Eine zweite Lösung wurde dadurch hergestellt, daß 34,3 mg (1 χ 10""* Mol) Carboxymethylmorphin in 2 ml wasserfreiem DMF gelöst wurden· Nach dem Abkühlen auf -15⁰C wurden 13,1/ul Chlorameisensäureisobutylester

(1 χ 10*"* Mol) zugesetzt, wobei sich ein gemischtes Anhydrid bildete» Die Lösung wurde bei -15°C etwa 30 Minui gerührt, wonach die Feststoffe gelöst waren»

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Die Lösung A wurde in einem Eisbad gekühlt und mit dem Morphin-Mischanhydrid versetzt. Die Lösung wurde 14 Stunden bei 4°C stehengelassen und dann 4 Tage gegen destilliertes Wasser dialysiert (2000 ml Wasser zweimal täglich ausgetauscht) O . , -..

Das Protein wurde gefriergetrocknet;und der Rückstand in 10'ml 0,128-molarer Natriumphosphatlösung (pH = 7,15) gelöstο Das Produkt wurde dann in einer Säule mit einem schwachen Kationenaust-auscherharz (Biorex' 70) fraktioniert, wobei mit 400 ml einer Natriumphosphatlösung (pH = 7,15) mit einem linearen Gradienten von 0,128 bis 0*400 Mol bei · einer Geschwindigkeit von 1 ml je Minute elüiert wurde. Das Eluat ; wurde in Fraktionen von jeweils- 2 ml aufgefangen. Die chromatographische Trennung wurde durch Messen der Ultraviolettabsorption bei 280 nm kontinuierlich überwachte Es wurden 5 Fraktionen erhaltene Die Lysozymaktivität wurde in der nachstehend, angegebenen Weise gemessene

Es wurde eine Suspension von getrockneten Bakterien, Micrococcus|lysodeikticus (0,35 mg/ml) in einer 0,05Hmolaren Natriumphosphatlösung (pH = 7,0) hergestellt. Zu 2,85 ml der in einer Küvette von 3 ml enthaltenen Suspension wurden 0,10 ml einer 8,76^-igen (Gewicht/Volumen) Nätriumchlorillösung und 0,025 ml Enzymlösung (7$ 5 x 10"* ' g Protein) gegebene Der Inhalt wurde durchgemischt und in ein auf 436 nm eingestelltes Spektrophotometer eingebrachte Die Abnahmegeschwindigkeit der optischen Dichte als Punktion der Zeit wurde aufgezeichnet und als optische Dichteeinheiten je Minute und 7,5 x 10** g Protein ausgedrückt. In der nachstehenden Tabelle sind die Fraktionen, das Gewicht des Proteins in mg/ml und die Reaktionsgeschwindigkeit angegeben.

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Fraktionen = mg Protein Reaktionsgeschwindigkeit OeD./min./

7,5 x 10"⁶g Protein

a ' 0,15 0,027

b 0,18 0,033

c 0,26 0,040

d 0,28 0,047

e 0,31 0,043

Lysozym 0,30 0,070

Beispiel 3 Konjugation von Meperidin mit Lysozym

Ao 2,23 g 4-Cyano-4-phenylpiperidin-hydrochlorid wurden in 15 ml Wasser gelöst, dem 4 ml 50 56-iges wäßriges Kaliumhydroxyd zugesetzt war. Das Öl wurde dreimal mit 15 ml Äther extrahiert, und die organischen Schichten wurden über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Nach dem Filtrieren und Eindampfen der Lösung wurde ein Rückstand erhalten, der zusammen mit 3 ml Methanol und 1,23 ml einer 50 ^-igen wäßrigen Kaliumhydroxydlösung in eine Glasampulle gebracht wurde«, Die abgeschmolzene Ampulle wurde 3,5 Stunden auf 165 - 170° erhitzt und mit 50 ml Wasser verdünnt. Nach der Extraktion mit Chloroform wurde die wäßrige Phase mit einem Austauscherharz in der H⁺-Form (DOWEX 50-X8) bis auf einen pH-Wert von 6 neutralisierte Nach dem Filtrieren und Eindampfen wurden 0,82 g eines Rückstandes erhalten, der oberhalb 300⁰C schmölze Nach dem Umkristallisieren aus Wasser

und dem Trocknen über Phosphorpentoxyd wurde eine Verbindung
halten.

bindung mit einem Schmelzpunkt von 285 - 286 C er-

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Bc 1,8 g 4~Carboxy-4-phenylpiperidin wurden 4 Stunden in 50 ml einer 5 $-igen äthanolischen HCl-Lösung unter Rückfluß erhitzt. Der nach dem Eindampfen des Lösungsmittels erhaltene Rückstand wurde in Aceton gelöst und vom unlöslichen Teil abfiltriert_o Beim Eindampfen der Acetonlösung hinterblieb ein viskoses Öl, das beim Stehen kristallisierte.

F₀ 197 - 11O⁰G (1,068 g) Das Produkt wurde ohne weitere Reinigung verwendet*,

BO (Alternative) Eine Lösung von 4-Cyano-4-piperidinhydrochlqrid in 6 ml 66 5^-iger Schwefelsäure wurde auf 145 erhitzt und 45 Minuten gerührt. Beim Abkühlen auf 125, wurde die Lösung etwas viskosere Durch Zusatz von Alkohol (Rohr des Zugabetrichters unterhalb der Oberfläche des Reaktionsgemisches) wurde die Temperatur auf 105⁰O erniedrigte Das Gemisch wurde 4 Stunden auf dieser Temperatur gehalten. Während der ersten Stunde wurden 20 ml Alkohol zugegeben, in den nächsten Stunden jeweils 6 ml. Die Alkoholdämpfe wurden durch kontinuierliche Destillation entfernte Am Ende der Zugabe wurde die Temperatur auf 125 erhöht, bis sich kein Kondensat mehr bildete_o Die heiße Lösung wurde in ein Gemisch aus 6 ml Wasser und 40 g Eis, das 8 g Natriumhydroxyd enthielt, gegossen. Nach der Extraktion mit 3 x 70 ml Äther, Trocknen über wasserfreiem Magnesiumsulfat und Entfernung des Lösungsmittels hinterblieb ein öl, das . bei 112 - 115°O/O,2 mm Hg abdestillierte. Ausbeute 4,01 g (54 $).

Ce 4»01 g 4~Carbäthoxy~4-phenylpiperidin wurden in 13 ml absolutem Äthanol gelöst und zusammen mit 2,01 g Natriumchloracetat unter Rückfluß erhitzt. Nach 7 Stunden konnte durch Dünnschiehtchromatographle kein Ausgangsmaterial mehr nachgewiesen werden. Dann wurde das

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ausgeschiedene Natriumchlorid abfiltriert und mit 3 ml Äthanol gewaschene Beim Abkühlen des Filtrats schieden sich weiße Kristalle aus« Nach dem Abfiltrieren und Trocknen wurden 2,9 g (58 %) Produkt erhalten. F₀ 148 - HO⁰G. Beim Eindampfen der Mutterlauge wurde eine glasige Substanz erhalten, die aus Aceton/Hexan nicht kristallisierte,,

Do Zu einer Lösung von 29,7 mg (0,1 mMol) 4-Carbäthoxy-1-carboxymethyl-4-phenylpiperidin in I₉O ml trockenem Dimethylformamid von O⁰C wurden 13,1 /Ul Chlorameisensäureisobutylester (0,1 mMol) gegeben. Das Gemisch wurde 1 Stunde bei O⁰C gerührt»

E₀ Die kalte Lösung des gemischten Anhydrids (wie oben hergestellt) wurde einer Lösung von 100 mg Lysozym (6,9yuMol) und 100 mg Natriumbicarbonat in 10 ml Wasser von O⁰G zugetropft. Das Reaktionsgemisch wurde 24 Stunden bei 4° gerührt und dann 48 Stunden gegen Wasser dialysierto Das Wasser wurde täglich dreimal ausgewechselt. Das unvollständig gereinigte Enzymkonjugat wurde dann auf Bio-Rex-70 mit einem Phosphatpuffergradienten von 0,05 - 0,20 Mol (pH = 7,15) chromatographiert. Die Lysozymaktivität im Eluat wurde nach der üblichen Lysozymanalyse mit MicrococcusiLeisodeikticus (20 mg/50 ml Pufferlösung) bestimmt₀ Durch Zugabe von gamma-Globulin aus Kaninchen oder Schafen, die mit dem RSA-Konjugat der Meperidinsäure immunisiert worden waren, wurde das Lysozym-Meperidin-Konjugat fast vollständig inhibierte Durch Zusatz von freiem Meperidin zu dem inhibierten Enzym-Antikörper-Komplex wurde die Lysozym-Aktivitat wieder hergestellt»

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Beispiel 4 Konjugation von Amphetamin mit Lysozym

A₀ 3»68 g Amphetaminsulfat (20 mMol Amin) wurden in 80 ml 0,5-normaler Natriumhydr,oxydlösung gelöste Die alkalische Lösung wurde mit Äther extrahiert, der Äther getrocknet und eingedampfte Der Rückstand wurde in 50 ml Benzol gelöst, worauf 3 ml Diisopropyläthylamin und dann 2,2 ml (20 mMol) Bromessigsäureäthylester zugegeben wurden_o Das Reaktionsgemisch.wurde 1 Stunde unter Rückfluß gehalten, abgekühlt, filtriert, und das Filtrat eingedampft. Der Rückstand wurde in Äther aufgenommen, einige Male mit Wasser gewaschen, der Äther getrocknet und eingedampft. Der reine Aminoester wurde durch Säulenchromatographie auf Kieselgel (Hexan/Äther = 7:3) erhalten« Ausbeute 3»1 (70 <fi) c Die NMR- und IR-Analyse stimmt mit der Struktur überein«

B. 2,5 g (11,5 mMol) des Aminoesters wurden in einem 1:1-Gemisch von Methanol und■1-normaler Natriumhydroxydlösung (50 ml) gelöst und über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelasseno Das Gemisch wurde auf ein kleines Volumen eingedampft, 2 χ mit je 25 ml Äther gewaschen und mit konzentrierter HCT-bis auf einen pH-Wert von 6 angesäuerte Die sich abscheidenden Kristalle wurden aus Äther/Aceton umkristallisiert, wobei zwei Fraktionen erhalten wurden: 900 mg mit einem Schmelzpunkt von 222 - 225°0 (Schmelzpunkt nach der Literatur 220 - 225⁰O, Tetra_eLetters* 1966, 4603 - 7) und 450 mg mit einem Schmelzpunkt von 210 - 218⁰Oo Nur die erste Fraktion wurde für die weite- ' ren Umsetzungen verwendet« γΗ-Ο 257, 6= 159.

max

Go 700 mg (3»8 mMol) Amphetaminearbonsäure wurden bei 40° in 50 ml trockenem Dioxan suspendiert, worauf 20 ml einer 12,5 Gewo-'^igen Phosgenlösung in Benzol auf einmal zugesetzt wurdeno Das Reaktionsgemisch wurde 3 1/2 Stunden bei

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40 ~ 5O⁰G gerührt, zur Trockne eingedampft und in 20 ml trockenem Dioxan gelöste, Diese Lösung wurde für die nächste Reaktionsstufe in Eis gehaltene

Do 25 mg N-Carboxymethylamphetamin (0,133 mMol) wurden bei 40⁰C in 1,8 ml trockenem Dioxan suspendiert. Dann wurden 0,715 ml einer 12,5 Volo-^igen Lösung von Phosgen in Benzol auf einmal zugesetzt» Das Reaktionsgemisch wurde 3 1/2 Stunden bei 4O⁰C gerührt, worauf nochmals 0,2 ml Phosgenlösung (12_p5 VoI₀-^Ig in Benzol) zugesetzt wurden.

Nach weiterem Rühren über 30 Minuten wurde die Lösung homogen. Das Lösungsmittel wurde bei 25 C unter Vakuum im Abzug entfernte Für die nächste Stufe wurden nochmals 0j,70 ml trockenes Dioxan zugesetzt.

Eo Die kalte Dioxanlösung des Produktes wurde über einen Zeitraum von 5 Minuten zu einer gerührten kalten (O C) Lösung von 200 mg Natriumbicarbonat und 100 mg Lysozym in 10 ml Wasser gegebene Das milchige Reaktionsgemische wurde 48 Stunden bei 4⁰C gerührt und dann 48 Stunden gegen Wasser dialysiert (1 Liter, 3 x täglich ausgetauscht)„ Der Rückstand wurde gefriergetrocknet und für Aktivitätsund Inhibitionsuntersuchungen verwendete

Beispiel 5 Konjugation von Ecgonin mit Lysozym

Ae 5 g Cocain wurden 6,5 Stunden in 25 ml Wasser unter Rückfluß erhitzte Das nach dem Eindampfen der Lösung hinterbleibende Öl wurde in 5 ml heißem Wasser gelöst. Beim Abkühlen schieden sich lange, weiße Kristalle ab (2,87 g)o Aus der Mutterlauge wurden weitere 543 mg erhalten.

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B* 1 g Benzoylecgonin wurde 1 Stunde in 25 ml 2~normaler Chlorwasserstoff säure unter Rückfluß erhitzt«, Nach dem Abkühlen wurde^ die Lösung filtriert und mit Äther extrahierte Die wäßrige Phase wurde mit Natriumbiearbonat bis auf einen pH-Wert von 5»8 neutralisierte Beim Eindampfen hinterblieb ein weißer Rückstand, der mit 40 ml 95 fähige Äthanol unter Rückfluß erhitzt wurde,, Es wurde abfiltriert und das Lösungsmittel· eingedampft« Der ölige Rück stand (580 mg) kristallisierte bei Zusatz von 0,5 ml Äthanol aus (130 mg) F_e 135 - 196⁰C (zers„)°

Einer Suspension von 22,7 mg (0,1 mMol) Ecgonin-Hydrochlorid in 1,0 ml trockenem Dimethylformamid von O⁰C

wurden 13»7/Ul Chlorameisensäureisobutylester (0_s1 mMol)

zugesetzte Das G-emisch wurde 2 Stunden bei 0 C gerührt

und anschließend für die Konjugation verwendete

Do Einer kalten, (4-°) Lösung von 100 mg Lysozym (6₉9 /uMol) und 100 mg Natriumbicarbonat in 10 ml Wasser wurde die Dimethylformamid-Suspension des gemischten Anhydrids zugesetzt. Die homogene Lösung xtfurde 40 Stunden bei 4° gerührt und dann 4 Tage gegen Wasser dialysiert (1 Liter, 3 χ täglich ausgetauscht)_β Das dialysierte Material wurde dann gefriergetrocknet. Mit diesem Material wurden Aktivitäts- und Inhibitionsuntersuchungen durchgeführte

Beispiel 6 Konjugation von Phenobarbital mit Lyeozym

A« 5,08 g (0,02 Mol) Natriumphenobarbital, 2,16 g (0,02 Mol) Chloressigsäuremethylester, 14 ml Methanol und eine katalytische Menge DMF (1 ml) wurden 2 Stunden unter Rückfluß gehalten« Während dieser Zeit schied sich ein weißer niederschlag aus ο Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und abfiltriert· Das methanolische filtrat

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wurde zur Trockne eingedampft, wobei etwa 5 g eines gummiartigen Materials erhalten wurden, das beim Stehen erstarrte,) (Der- Niederschlag aus der obigen Filtration löste sich teilweise auf₉ wenn er nochmals mit destilliertem Wasser gewaschen wurde<, Das wasserunlösliche Material (etwa 50 mg) erwies sich als das dialkylierte Produkte

Das erstarrte Material wurde mit 20 ml 1-normaler NaOH-Lösung 15 Minuten gerührt und dann filtriert» Hierdurch wurden die alkaliunlöslichen Derivate von dem monoalkylierten Produkt und nichtumgesetzten Phenobarbital abgetrennt» Das alkalische Filtrat wurde mit konzentrierter HCl bis zu einem pH-Wert von 2 angesäuert, und der weiße, gummiartige Niederschlag wurde in Methylenchlorid aufgenommene

Nach dem Trocknen (über MgSO-) und Eindampfen des organischen Lösungsmittels wurden 4 g eines gummiartigen Materials erhaltene Dieses Material wurde in Benzol gelöst und über einer Kieselgelsäule (40 g) chromatographiert» Es wurde mit Chloroform eluiert, wobei Fraktionen von jeweils 100 ml gesammelt wurden (Der Verlauf der Chromatographie wurde durch Dünnschichtchromatographie verfolgt, da das dialkylierte Produkt einen R~ von 0,9» das monoalkylierte Material einen R~ von 0,6 und Phenobarbital einen R» von 0,1 mit Chloroform/Methanol im Verhältnis 95:5 hat)_o

Die vereinigten Fraktionen 2-5 ergaben nach dem Eindampfen 1,6 g einer gummiartigen Masse, die beim Stehen erstarrte. Nach dem Verreiben mit Petroläther und Abfiltrieren wurden 1,5 g eines weißen Pulvers erhalten, das durch NMR als das erforderliche monoalkylierte Derivat, nämlich N-Methoxycarbonylmethylphenobarbital nachgewiesen werden konnte»

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Eine weitere Eluierung mit Chloroform (50Ö ml) ergab 1,5 g eines weißen festen Stoffes, der als nichtumgesetztes Phenobarbital nachgewiesen werden konnte,,

B« 1 g des wie vorstehend hergestellten Monoesters wurde mit 10 ml 20 ^-iger HCl-Lösung 3,5 Stunden unter Rückfluß gehalten» Das abgekühlte Heaktionsgemisch wurde mit 20 ml Wasser verdünnt und mit- Äther extrahiert₀ Die Eindampfung des Ätherextraktes ergab 0,98 g einer farblosen gummiartigen Substanz, die beim Stehen sehr langsam erstarrte. Durch NMR- und Dünnschichtchromatographie-Analyse konnte nachgewiesen werden, daß der Ester vollständig zur Säure hydrolysiert war«.

Eine reine Probe der Säure wurde durch präparative DünnscriichtChromatographie für die UV-Analyse mit Chloroform/ Methanol im Verhältnis 5:1 als Eluierungsmittel hergestellt.

Co Zu einer kalten (0°) Lösung von 29,6 mg ΪΓ-Carboxymethylphenobarbital (0,1 mMol) und 14,3 /Ul Triäthylamin (0,1 mMol) in 1,0 ml trockenem Dimethylformamid wurden 13,1/Ul Chlorameisensäureisobutylester (0,1. mMol) gegeben. Die Lösung wurde 1 Stunde vor dem Gebrauch bei 4 gerührt«.

D« Die kalte Lösung des gemischten Anhydrids wurde unter Rühren einer kalten (4 ) Lösung von 0,100 g Lysozym (6,9 mMol) und 0,100 Natriumbicarbonat in 10 ml Wasser zugetropft. Die erhaltene heterogene Lösung wurde 48 Stunden bei 4° aufbewahrt und anschließend 48 Stunden gegen Wasser dialysiert (das Wasser wurde 3 x täglich ausgetauscht) α Das Dialysat wurde dann auf Bio-Rex 70 chromatographiert, wobei zum Eluieren ein Phpsphatpuffergradient von 0,05 - 0,20 Mol (pH = 7,15) verwendet wurde» Die Lysozymaktivität im Eluat wurde· nach der üblichen Lysozymanalyse mit Micrococcusjlysodeikticus (20 mg/50 ml pufferlösung) bestimmt. Durch Zusatz von Y-Glöbulin von Schafen,

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die mit dem RSA-Konjugat von N-Carboxymethylphenobarbital immunisiert worden waren, wurde das Lysozym-phenobarbital-Konjugat fast vollständig inhibiert. Durch Zusatz von freiem Phenobarbital au dem inhibierten Enzym-Antikörper-Komplex wurde die Lysozym-Aktivität wieder hergestellte

Beispiel .7 Secobarbital~RSA- und Lysozym-Konjugat

A« Ozon wurde durch eine gekühlte(Trockeneis/Aceton) Lösung von Natrium-Secobarbital (2,6 g, 0,01 Mol) in 250 ml Methanol geleitete Nach Beendigung der Ozonolyse (KJ-Test positiv) wurde Stickstoff durch das Reaktionsgemisch geleitet, um alle Spuren von Ozon zu entfernen, worauf 7 ml Dimethylsulfid mittels einer Spritze der kalten Lösung zugesetzt wurden, die über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen wurde. Nach dem Eindampfen des Lösungsmittels wurde der Rückstand mit 20 ml Wasser verdünnt, mit konzentrierter HOl angesäuert und 3 x mit je 20 ml Chloroform extrahiert. Der Ohloroformextrakt wurde über MgSO. getrocknet und eingedampft, wobei 2,4 g eines gummiartigen farblosen Materials erhalten wurden. Durch NMR-Analyse konnte die Anwesenheit einer Aldehydgruppe bei 89,7 ppm nachgewiesen werden₀ Das Produkt wurde ohne weitere Reinigung für die Umsetzung mit Malonsäure verwendet₀

Be Eine Probe des reinen Aldehyds (0_P24 g, 1 mMol), 0,21 g (2 mMol) Malonsäure, 20 ml Pyridin und 1 ml Piperidin wurden miteinander 6 Stunden unter Rückfluß gehalten» Das Lösungsmittel wurde im Schnellverdampfer entfernt, und der Rückstand wurde in einer 10 /ό-igen Natriumbicarbonatlösung gelöste Die Bicarbonatlösung wurde 3 x mit je 20 ml Äther gewaschen und dann mit kozentrierter HCl angesäuerte Dann wurde die Lösung 2 χ mit je 20 ml Äther

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- ¹⁰⁹Λ . 222338Β

und anschließend mit 2 χ 25 ml Chloroform extrahiert und anschließend über MgSO. getrocknet, worauf die vereinigten organischen Schichten eingedampft wurden. Es wurden 0,23 g (Ausbeute 80 /&) eines weißen, festen Stoffes erhalten, der mit Hilfe der NMR-Analyse als die gewünschte 5-(<?f - Crotonsäure)^^ 1 '-methylbutyl)-barbitursäure nachgewiesen werden konnte,, Nach dem Umkristallisieren aus CHCl^/CCl, wurden 0,16 g reines Material erhalten.

Co Zu einer Lösung von 5-W-Crotonsäure)-5-(1 'methylbutyl)-barbitursäure (0,282 g, 1 mMol) in DMT (3 ml), die auf -15°C (Eis-Salzbad) abgekühlt war, wurden 0,28 ml (2 mMol) Triäthylamin und 0,13 ml (1 mMol) Chlorameisensäureisobutylester gegeben« Das Rühren wurde noch 15 Minuten bei -15⁰O und dann 30 Minuten bei O⁰C fortgesetzt» Das Reaktionsgemisch wurde dann mit Hilfe einer Spritze zu einer gekühlten Lösung von 400 mg RSA in 56 ml Wasser, das 2,6 g NaHCO₇, enthielt _t zugetropft_o Das Reaktionsgemisch

wurde in einem kalten Raum 5 Tage bei 0 C gerührt_p wonach die anfängliche Trübung fast vollständig verschwunden war. Die Lösung wurde dann gegen 4 Liter Phosphatpuffer (pH = 8), dann gegen destilliertes Wasser-dialysiert, wobei das gewünschte Konjugat erhalten wurde·

Do 240 mg Lysozym (100 /uMol Lysin) wurden in 20 ml Wasser gelöst und die Lösung auf O⁰C abgekühlt. Der pH-Wert der Lösung wurde mit 0_s05«normalem Natriumhydroxyd auf 10,2 eingestellt, worauf das gemischte Anhydrid (100yuMol) in 1,5 ml trockenem Dimethylformamid zugetropft wurde, während die Lösung durch Zugabe der erforderlichen Menge Base auf einen pH-Wert von 9»6 - 9»9 gehalten wurde₀ Der pH-Wert wurde noch 30 Minuten auf 9»6 gehalten, worauf das Gemisch zentrifugiert wurde.

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-¹¹⁰- 222338B

Die überstehende Flüssigkeit wurde gegen eine 0,5-molare Tris-Maleat-Lösung (pH = 8,0) dialysiert. Die beim Zentrifugieren erhaltene Pille löste sich in 20 ml einer 8~molaren Harnstofflösung und wurde in der vorstehend beschriebenen Weise dialysiert, wobei weiteres Enzym erhalten wurde. Die Dialysebehandlung mit Harnstoff wurde wiederholt, bis nur 10 mg unlösliches Material hinterblieben,,

Beispiel 8 Methadon-Analog-Konjugat mit Lysozyim

Ao Eine Lösung von 32,4 g (150 mMol) Tetramethylendibromid in 150 ml trockenem Äther wurde zu 10,9 g (450 mMol) Magnesium in 80 ml Äther mit einer solchen Geschwindigkeit gegeben, daß der Äther unter Rückfluß siedete» Die Umsetzung wurde unter Argon durchgeführt» Nach Beendigung der Zugabe wurde das Reaktionsgemisch 1 Stunde gekocht» Eine Lösung von 2,2-Diphenyl-4~dimethylaminovaleronitril (I), (hergestellt nach J₀W₀ CUSIC, J₀Am. Chem_e Soco, T±, 3546 (1949), (8,4 g, 30 mMol) in trockenem Xylol (100 ml) wurde über einen Zeitraum von 30 Minuten bei Raumtemperatur zugesetzt, und das Gemisch wurde 1 Stunde bei 55 C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in einem Eis-Wasser-Bad gekühlt und COo wurde unter kräftigem Rühren 4 Stunden lang hindurchgeleitet α Dann wurden 200 ml Wasser und 100 ml konzentrierte HCl zugesetzt, das Magnesium abfiltriert, und das Piltrat 2 Stunden unter Rückfluß erhitzte Die abgekühlte, klare Lösung wurde 3 x mit 150 ml Äther gewaschen und mit 3 x 150 ml Dichlormethan extrahiert. Der Extrakt wurde zur Trockne eingedampft, und der Rückstand wurde in 0,5 Liter 0,5-normaler Natriumhydroxydlösung gelöste

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Die Lösung wurde 3 x mit 100 ml Äther gewaschen, mit 150 ml konzentrierter HCl angesäuert, mit Natriumchlorid gesättigt und mit 3 x 200 ml Dichlormethan extrahierte Beim Eindampfen des Lösungsmittels hinterblieben 7»55 g (60 io) eines Öls, nämlich 6-Keto-7,7-diphenyl-9-(dimethylamino)-decansäure-hydrochlorid, das bei der Dünnschichtchromatographie (HCCl,!Methanol =8:2 und 7s3) als einzelner Fleck wanderte

	,02 ?	6 CF5COOH	UV-Spektrum	293	(■€	= 54O)1
O	max		264	( e	= 50O)5
X			259	(ε	= 535);

21,0 mg (50/uMol) der Säure wurden in 1 ml trockenem Dimethylformamid unter Zusatz von 2 Tropfen Triäthylamin gelöst, und die abgekühlte Lösung wurde wie in der vorstehend beschriebenen Weise mit 6,5/Ul Chlorameisensäureisobutylester behandelte

120 mg Lysozym (50/uMol Lysin) wurden in 12 ml Wasser gelöste Der pH-Wert wurde mit 0., 05-normaler Hydroxydlösung auf 10 eingestellt und während des Zutropfens der Mischanhydridlösung auf diesem Wert gehaltene Es wurde noch 30 Minuten weitergerührt, worauf das Gemisch zentrifugiert wurde« Die überstehende Fraktion blieb bei der Dialyse gegen Wasser homogen und enthielt das Lysozymkonjugat des Methadon-Analogeno

20988 1 /07 52.

Beispiel 9

Konjugation von Carboxymethy!morphin (CMM) mit Äpfelsäuredehydrogenase (MDH)

Schweineherζ-MDH wurde in Form einer Suspension (8 mg/ml) in einer 2,8-molaren Ammoniumsulfatlösung erhalten. Ein Milliliter dieser Lösung (2 χ 10 Mol MDH) wurde zentrifugiert, und die Pille in 1 ml Wasser von 4 C gelöst. Der pH-Wert wurde mit verdünnter NaOH auf 9,0 eingestellt, worauf 0,30 ml der Lösung des gemischten Anhydrids in Anteilen von 10/ul zugesetzt wurden. Während der Zugabe- wurde der pH zwischen und 9 eingestellt. Nach Beendigung der Zugabe wurde das Gemisch 1 Stunde bei 4 C gerührt. Dann wurde eine ausreichende Menge eines 0,05-molaren Phosphatpuffers (pH =7,5) zugesetzt, um das Gesamtvolumen auf 5 ml zu erhöhen, worauf die Lösung gegen diesen Puffer dialysiert wurde.

Beispiel 10

Konjugation von Testosteron-3-carboxymethaloxim mit Äpfelsäuredehydrogenase (MDH)

36,1 mg (100/uMol) Testosteron-3-carboxymethyloxim wurden in 1 ml Dimethylformamid, das 3 Tropfen Triäthylamin enthielt, gelöst» Die Lösung wurde auf -15 C abgekühlt, worauf 13,1 /Ul (100/uMol) Chlorameisensäureisobutylester zugesetzt wurden. Die Lösung wurde 1 Stunde bei -15 bis -5 C gerührt, wobei sie sich nach hellorange verfärbten

0,5 ml einer Suspension von Äpfelsäuredehydrogenase in 2,8-

—ft
molarer Ammoniumsulfatlösung (5 mg MDH, 6,8 χ 10" Mol MDH,

4,4 x 10 Mol Lysinrückstände) wurden 20 Minuten bei 15.000 U/min_o zentrifugiert. Die Pille wurde in 1 ml Wasser gelöst, und die Lösung wurde 5 Stunden gegen Wasser von 4 C dialysiert (3 x ausgetauscht)ο Die Lösung wurde mit verdünnter NaOH von 4⁰O auf einen pH-Wert von 8,5 gebracht und 44/ul der Lösung des gemischten Anhydrids (4,4 mMol gemischtes Anhydrid; entspricht 1 Hapten je Lysin) wurden der geührten Enzymlösung

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in 3 Anteilen über einen Zeitraum von 5 Minuten zugesetzte Natriumhydroxydlösung wurde nach Bedarf zugesetzt, um den pH-Wert auf 8,5 zu halten«, Die Lösung war zunächst trüb, klärte sich aber nach einstündigem Rühren bei 4 Co

Die Lösung wurde erschöpfend gegen 0,05-molare Phosphatpufferlösung (pH = 7ji5) dialysierto Eine, kleine Menge eines Niederschlages wurde abzentrifugiert. Es waren etwa 27 Gruppen je MDH vorhanden,

Analyse: Wegen der Instabilität von stark verdünnten Enzymlösungen wurde die Stammlösung (5 mg/ml; 3p4 x 10 Mol) unmittelbar vor jeder Analyse im Verhältnis 1:500 verdünnt. Die Reihenfolge der Zugabe der Reagentien zum Analysengemisch war wie folgt:

1o Antikörper (falls verwendet), 2ο verdünntes Enzym, 3 β Oxalessigsäure, 4o NADH

Die Endkonzentration an Enzym betrug 2,7 x 10 ^ Mole Die Antikörperkonzentration war nicht bekannte Es wurde ausreichend Antikörper verwendet, um eine mehr als 40 °/>-±ge Inhibition der Enzymaktivität zu erzielen. Diese Menge entspricht einem Äquivalent von 10yul Antikörper enthaltendem Serum,,

(1) Enzym allein: 0,073'0D/min_o (2) Enzym und Antikörper: 0,042 0D/min, (3) Enzym + Antikörper + 50yul χ 10"⁵ Mol Testosteron (zuerst zugegeben): 0,073 0D/min.

Oodeinanalyse

Die nachstehenden Versuche wurden ausgeführt, um die Inhibition der Aktivität des mit Morphin modlfozierten Lysozyms durch Antikörper und die Wiederkehr der Aktivität durch Zusatz

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von Codein zu zeigen. Zu abgemessenen Anteilen der einzelnen Fraktionen des mit Morphin modifizierten Lysozyms wurde Antikörper gegeben und die Reaktionsgeschwindigkeit bestimmt.
Auf diese Weise konnte der Einfluß . des Antikörpers auf die enzymatische Aktivität und des Codeins auf die Regeneration
der enzymatischen Aktivität bestimmt werden» In der nachstehenden Tabelle sind die erhaltenen Ergebnisse angegeben.

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Fraktion	mit Morphin	Antikörper	Codein	OoDo/min
	modifiziertes Enzym, Mol	Mol* χ 1O*"7	Mol χ 1O"7	χ 103
a	3,3 x 1O"7			33
Il	It	4,2		17
Il	Il	Il	6,7	27
It	ti	13	-	8
Il	tt	It	30	15'
It	Il	Il	67	25
b	It	-	-	65
It	ti	13	-	10
ti	tt	tt	30	20
It	ti	It	67	37
C	1,2x1O~7	—	-	' 43
tt	ti	6,7	-	7
Il	It	tt	33	13
It	Il	It	67	23
d	tt	. -	-	47
It	11	6,7	-	10
It	It	It	33	20
ti	Il	It	67	25
e	ti	—	-	43
Il	It	6,7	-	8
Il	Il	ti	33	12
Il	It	It	67	20
Il	It	3,3		17
It	ti	3,3	33	25

Mole, bezogen auf die Bindestellen

2 0 9 8 8:1/0752

Die vorstehenden Ergebnisse zeigen klar die große Empfindlichkeit des Systems. Durch Verwendung äquimolarer Mengen (bezogen auf die Bindungsstellen) oder eines geringen Überschusses an Antikörper gegenüber dem Enzym kann eine Verminderung der Aktivität bis zu 85 $> erreicht werden. Ein wesentlicher Teil der Aktivität kann mit nur 10" Mol Codein zurückerhalten werden. Im übrigen wird Lysozym durch den Antikörper oder das Codein überhaupt nicht beeinflußt.

Eine weitere Einzeluntersuchung wurde wie folgt durchgeführt: Die Enzymkonzentration wurde auf 1,7 x 10 Mol konstant gehalten, während wechselnde Mengen an Morphin-Antikörper zugesetzt wurden,. Die Geschwindigkeit wurde anhand der wechselnden Konzentrationen des Morphin-Antikörpers bestimmte Die Fraktion c wurde als Enzymquelle verwendet» Die Ergebnisse Bind in der nachstehenden Tabelle angegeben.

Antikörper, Mol* x 10	Geschwindigkeit (OoD./min)	45,7
	χ 105	45,7
0	46,0
1,7	38,6
3,3	33,6
6,7	28,3
12	21,4
17	16,1
25	8,3
33	7,1
50	7,2
67
130

Konzentration der Bindungsstellen_t

209881 /0752

-¹¹⁷" 2.223386

Im nächsten Versuch wurde die Enzymkonzentration bei 1,7 χ Mol und die Antikörper-Bindungsstellen-Konzentration auf

—7
5,0 κ 10 Mol konstant gehalten. Es wurden wechselnde Mengen an Codein zugesetzt und die Geschwindigkeiten bestimmte Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle angegeben.

8
Codein, Mol χ 10 Geschwindigkeit

(0.Do/min«, χ 1(r

530 45,0

270 31,3

130 28,0

67 26,0

33 · ' 22,1

17 16,7

6,7 12,9

1,3 10,0

Die vorstehend angegebenen Tabellen beweisen schlüssig die

—R große Empfindlichkeit des Systems» Mit nur 1,3 x 10 Mol Codein ist ein erkennbarer Unterschied in der Geschwindigkeit erreichbar.

Es wurden auch Versuche mit dem mit phenobarbital konjugierten Lysozym nach Beispiel 6 und dem mit Secobarbital konjugierten Lysozym nach Beispiel 7 durchgeführt. Sowohl das PhenobarbitalfAnaloge, als auch das Secobarbital-Analoge wurden mit Rinderserumalbumin konjugiert, und die Antikörper wurden in an sich bekannter Weise durch injizieren der RSA-Konjugate in Tiere und Sammlung der Antikörper erhalten.

Hierbei wurden zunächst einige Reagenslösungen hergestellte Die Pufferlösung war eine 0,05-molare Tris-Maleat-Lösung mit einem pH-Wert von 6„ Die Rinderserumalbumin-Iiösung enthielt 0,1 Gew.-^ RSA in Tris-Maleat-Pufferlösung. Die Bakterienlösung enthielt 30 mg Micrococcuslysodeikticus in 50 ml

209 881/07 52

Pufferlösung. Die Suspension wurde erst 12 Stunden vor Gebrauch hergestellt und bei 4°C aufbewahrt. Die mit dem Barbiturat konjugierte Lysozymlösung wird mit der RSA-Lösung verdünnt. Der Verdünnungsgrad wird so eingestellt, daß eine Geschwindigkeit von etwa 0,21 O.D./min. mit einer Lösung erhalten wird, die 0,2 ml Bakterienlösung, 0,02 ml RSA-Albumin-Lösung, 0,08 ml synthetischen Urin und 0,5 ml Lysozymlösung enthalte Die Anti-Secobarbital- und Anti-Phenobarbital-Y-Globulin-Lösungen (0,025 Tris-Maleat, pH = 7,4) liegen in solchen Konzentrationen vor, daß 20 X ausreichen, um die Aktivität des mit dem speziellen Barbiturat konjugierten Lysozyms der Enzymstammlösung zu 92 - 96 ^ zu inhibieren. Der synthetische Urin wird erhalten, indem man in einem Liter destilliertem Wasser 5,2 g Kaliumchlorid, 8,2 g Natriumchlorid, 1,4 g Natriumdihydrogenphosphat, 1,4 g Dinatriumonohydrogenphosphat und 11 g Harnstoff lösto Barbiturat-(Phenobarbital- oder Secobarbital-)-Standardlösungen werden dadurch hergestellt, daß man die gewünschte Menge des jeweiligen Barbiturate in synthetischem Urin löst.

Die Analyse wird dadurch ausgeführt, daß man 0,2 ml der Bakteriensuspension in einen Probekolben bringt, 20 K des jeweiligen Anti-Barbiturat-)f-Globulins zusetzt, dann 80 X der Urinprobe zusetzt und das Gemisch mit 0,5 ml Enzymlösung verdünnt. Das Reaktionsgemisch wird dann in das Spektrometer gesaugt, und die Abnahme der optischen Dichte bei 436 nm über einen Zeitraum von 40 Sekunden wird bei 30° bestimmt. Es kann jede beliebige Zeitspanne zwischen 10 und 60 Sekunden verwendet werden. Die Konzentration des jeweiligen Barbiturate in der Urinprobe wird anhand einer Kurve bestimmt, die unter Verwendung von Standardlösungen erhalten wurde. Eine Leerwert-Korrektur wird dadurch vorgenommen, daß man 0,52 ml einer 0,1 $-igen RSA-Lösung in

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0,025 Tris-Maleatlösung (pH = 6,0) anstelle der Lösungen des Antibarbiturat-"^-Globulins und des mit Barbiturat konjugierten Lysozyms verwendet. Dieser Leerwert wird von dem mit den Urinproben erhaltenen Ergebnis abgezogen.

Unter Anwendung dieser Arbeitsweise wurde eine Anzahl von bekannten und unbekannten Urinproben auf die Anwesenheit von Secobarbital und phenobarbital getestet. Die Ergebnisse stimmten fast identisch mit der Dünnschichtchromatographie und einer weiteren Immunanalysenmethode auf der Grundlage eines stabilen freien Radikals als Detektor überein.

Weiterhin wurd,e eine zusätzliche .Reaktivität mit anderen Barbituraten festgestellt, die mit nicht-Barbituraten, einschließlich Verbindungen mit ähnlicher Struktur, wie Glutethimid fehlte.

Unter Anwendung dieser Arbeitsweise wurde, auch eine Reihe von Methadonanalysen durchgeführt. Die Urinproben wurden von klinisch mit Methadon behandelten Patienten genommen und auf Methadon getestet. Von 65 Proben ergab die Dünnschichtchromatographie 62 positive Proben, während die vorliegende Analyse 63 positive proben ergab.

Weitere Versuche wurden mit anderen Enzymen durchgeführt.

3 Es wurden andere Enzyme verwendet, die mit 0 -Carboxymethy,!- morphin konjugiert waren. Diese Versuche sind nachstehend beschrieben.

(1) Pur die Meerrettich-Enzym-Analyse wurde ein spezielles Substrat hergestellt. Der monomere Donor, ein Analoges von malachitgrün, wurde durch Umsetzung von Toluesäure und p,p¹-Dimethylaminobenzophenon in Gegenwart von Schwefelsäure hergestellt, wobei sich der Leukofarbstoff bildete. Der Leukofarbstoff wurde nach der gleichen Methode, die für das Garboxymethylmorphin angewendet wurde, in das gemischte Anhydrid umgewandelt. Die Konzentration

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betrug 0,15 mMol je ml DMP. 44 mg Polyvinylalkohol (entsprechend 1 mMol monomerer Vinylalkohol)(Viskosität einer 4 ^-igen wäßrigen Lösung bei 20° =4-6 cp) wurden in 5 ml DMF aufgeschlämmt. Beim Erhitzen auf 100⁰C löste sich der PVAo Der Lösung wurden 2,5 ml des gemischten Anhydrids und 0,5 ml Pyridin zugesetzt; die Lösung wurde 14 Stunden bei 10O⁰C unter N„ stehengelassen. Während der Reaktion fand eine beträchliche Oxydation des Farbstoffes statt.

Das Gemisch wurde zur Trockne eingedampft und der Rückstand gründlich mit Aceton gewaschen, um nichtumgesetztes Anhydrid zu entfernen. Das Gemisch wurde in 20 ml Wasser gelöst und gegen Wasser dialysiert. Das erhaltene Polymer war als Substrat gegenüber Meerrettichperoxydase aktiv und ergab eine blaue Farbe« Für die Analyse wurde die obige Lösung im Verhältnis 3:10 mit 0,05-molarem Tris-Maleatpuffer (pH = 6,0) verdünnte Zu 10 ml der Lösung wurden 0,100 ml 0,39-molares Wasserstoffperoxyd gegeben. Zu iiml dieses Gemisches wurden Enzym, Antikörper und Hqpten gegeben, worauf die Entwicklungsgeschwindigkeit der OD (optische Dichte) bei 620 nm gemessen wurde.

Enzym, Mol (AB), Mol

1,25 x 10~^y

1,25 x 10~⁹ Ix 10~⁸ 1,25 x 10*"⁹ 1 χ 10"*⁸

Codein, Mol

5 x 10*

Geschwindigkeit, OD/min,

0,070 0,050 0,068

Der nächste Versuch wurde mitcd-Amylase durchgeführt.

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(2) 0,100 g (2,0 χ 10"⁶ Mol) c£-Amylase aus Bacillus|subtilis und 0,600 g Bicarbonat wurden in 15 ml kaltem Wasser gelöst. Der gerührten, gekühlten Lösung wurde 1 ml der vorstehend genannten Mischanhydrid-Lösung zugetropfte Bs wurde 18 Stunden weitergerührt, worauf gegen Wasser erschöpfend dialysiert wurde. Die Lösung wurde schließlich gefriergetrocknet.

Die Analysen wurden mit dem Roche-Amylochrom-System durchgeführt. Die markierte Amylase wurde in Wassör gelöst, (3,2 mg/Liter) und für die Analyse im Verhältnis 1:10 verdünnt.

Codein, Geschwindig-_M, keit ^Mox OD/10min

0,490 0,210

Der letzte Versuch wurde mit Äpfelsäuredehydrogenase durchgeführt.

(3) Für die Analyse wurde ein 0,05-molarer Phosphatpuffer (pH = 7,5) verwendet. Zu 0,900 ml Pufferlösung wurden in der angegebenen Reihenfolge gegeben:

—3 0,50 ml 7 x 10 -molare Oxalessigsäure in Puffer

Versuch	Antikörper bindungsstelle , Mol	Enzym	4 x	, Mol
1	mm	6,	4 x	ΙΟ""9
2	4,18 χ 10"8	6,	4 x	10-9
3	4,18 χ 10"8	6,	ΙΟ"9

lösung (pH = 7,5)

0,005 ml 3,67 x 1 (Bindungsstellenkonzentration)

0,020 ml 8 (pH « 7,5)

0,020 ml 1,4 x 10*"²-molar*s NADH in Wasser.

0,005 ml 3,67 x 10"⁷-nolaree Antiopiat-Tf-Globulin

0,020 ml 8,03 x lO'^-molares Enzym in Pufferlösung

209881/075 2

Die Abnahme der optischen Dichte bei 340 nm wird als Funktion der Zeit bei 3O⁰C abgelesen. Das Hapten, das Codein (falls verwendet), wurde vor allen anderen Reagentien der Pufferlösung zugesetzt«

Versuche:

(1) Ohne Antikörper. Geschwindigkeit 0,0136 OD/min.

(2) Mit Antikörperβ Geschwindigkeit 0,0073 0D/min.

(3) Antikörper und 5/Ul 1 χ 10" -molare Codein Geschwindigkeit 0,0107 0D/min.

(4) Antikörper und 2 λχΙ 1 χ 10™ -molares Codein„ Geschwindigkeit 0,0099 0D/min.

—7

(5) Antikörper und 2 ,ul 1 χ 10"* -molares Codein.

Geschwindigkeit 0,0079 0D/min.

Erfindungsgemäß liegen die für die Analyse einer großen Vielzahl von Liganden erforderlichen Konzentrationen in

—7
der Größenordnung von 10 Mol oder darunter, wobei weniger als 5/ul Lösung verwendet werden können₀ Somit wird mit äußerst kleinen Mengen an Reagentien ein sehr hoher Empfindlichkeitsgrad erreioht. Weiterhin ermöglicht die äußerst hohe Spezifizität der Rezeptorstellen gegenüber einer bestimmten Verbindung oder ihrer nahe verwandten Inalogen viele Analyeenvarianten mit einem hohen Empfindlichkeitsgrad und einer hohen Spezifizität gegenüber bestimmten Verbindungen. Deshalb können äußerst geringe Mengen an biologisch aktivem Material in verschiedenen Körperflüesigkeiten, wie Blut, Speichel oder Urin, untersucht werden.

Die Erfindung liefert also ein äußerst empfindliches Verfahren zur Analyse von äußerst geringen Mengen spezifischer Stoffe mit einem hohen Grad an Spezifizität und Genauigkeit,

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Andererseits kann das Verfahren qualitativ zur Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit bestimmter Substanzen mit einem höhen Grad an Spezifizitat angewendet werden. Die Enzymanalyse ist technisch schon ziemlich ausgereift« Enzymbestimmungen, die optimalen Bedingungen für die Bestimmung, die Substrate und die Methoden zum nachweis der enzyma- . tischen Aktivität sind aus der Literatur weitgehend bekannt. Weiterhin ist ein großer Teil der auf dem Gebiet der Radioimmunanalyse geleisteten Arbeit unmittelbar auf die vorliegende Erfindung anwendbar. Die für die Radioimmunanalyse zur Verfügung stehenden Antiseren sind im allgemeinen für die erfindungsgemaß verwendeten Liganden anwendbar.

Die Verfahren zur Bindung von Verbindungen an Enzyme an anderen Stellen als an der aktiven Stelle sind ebenfalls ausgereift. Es gibt sehr viel Literatur über die Punktionalitäten, die zur Bindung einer" bestimmten Verbindung an eine bestimmte Stelle, z.Bo an eine Aminosäure in einem Enzym, verwendet werden können, ohne daß die Aktivität des Enzyms nennenswert beeinträchtigt wird. Die obigen Beispiele zeigen, daß die Gegenwart eines Antikörpers die Aktivität des Enzyms deutlich vermindern kann, wenn dieser an einen Liganden gebunden ist, der seinerseits wieder an ein Enzym gebunden ist. Dies geschieht entweder als physikalische Barriere oder alosterisch. Weiterhin wird die enzymatisch^ Aktivität weitgehend regeneriert, wenn ein Ligand in das Medium eingeführt wird, der den an das Enzym gebundenen Liganden wirksam verdrängen und das Enzym vom Antikörper befreien kann_e .-.,..

Indem ein Enzym an einen Liganden gebunden wird, reagiert für jeden Liganden, der einen enzynpbundenen Liganden von seinem Rezeptor befreit, eine große Anzahl von Substrat-

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molekülen, und die Konzentration dee hinterbleibenden Substrates oder Produktes kann gemessen werden. Auf diese Weise kommt es zu einer deutlichen Verstärkung (durch Kupplung des Enzyms an einen Liganden), da viele Moleküle durch die Anwesenheit eines einzigen Moleküls modifiziert werden.

Die Erfindung ermöglicht die Bestimmung von Verbindungen, die in äußerst geringen Konzentrationen oder Absolutmengen vorhanden sind. Dies in erster linie deshalb, weil Rezeptoren mit einer hohen Spezifizität zur Verfügung stehen, wodurch eine Verbindung oder eine Gruppe von Verbindungen bestimmt werden können, ohne daß Störungen durch andere Verbindungen auftreten. Dadurch, daß ein oder mehrere Enzyme in Beziehung zu einem spezifischen Liganden vorhanden sind, kann man eine starke Konzentrationsänderung des Enzymsubstrates, bezogen auf einen einzigen Liganden, erhalten. Weiterhin bietet die Verwendung von Enzymen viele Alternativen hinsichtlich des verwendeten Nachweissystems.

- Patentansprüche -

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Claims (1)

1. Patentansprüche

   Verfahren zum Nachweis eines Liganden in einem Medium, in welchem man diesen Liganden vermutet, dadurch gekennzeichnet, daß man in einer flüssigen Zone (1) das Medium mit (2) einem enzymgebundenen Liganden und (3) einem Rezeptor, der dem Liganden und dem enzymgebundenen Liganden gemeinsam ist, in Berührung bringt und den Einfluß des vorhandenen Liganden bei der Bestimmung der enzymatischen Aktivität analysiert.

   Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die flüssige Zone hinsichtlich (1), (2) und (3) im wesentlichen homogen ist, daß der Ligand eine biologisch wirksame Verbindung darstellt und daß die enzymatische Aktivität des enzymgebundenen Liganden weitgehend inhibiert wird, wenn der enzymgebundene Ligand an den Rezeptor gebunden wird»

   Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert der flüssigen Zone im Bereich von 5-10 und die Konzentration des Rezeptors im Bereich von 10 bis 10"* , bezogen auf die Bindungsstellen, liegt, daß das Verhältnis zwischen den verfügbaren Bindungssteilen des Rezeptors und den Molekülen des enzymgebundenen Liganden größer als etwa 1 ist und daß das Verhältnis zwischen den verfügbaren Bindungssteilen des Rezeptors zu den Molekülen des üganden als enzymgebundenem Liganden weniger als etwa 20 ist»

   Verfahren nach Anspruch, 3, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert im Bereich von 6-9 liegt und daß das Verhältnis zwischen den verfügbaren Bindungsstellen des Rezeptors und den Molekülen des enzymgebundenen Liganden größer als etwa 2 ist und daß das Verhältnis zwischen den verfügbaren Bindungsstellen des Rezeptors und den Molekülen des Liganden als enzymgebundenem Liganden weniger als etwa 5 ist.

   209 88 1/07 52

   5_β Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein lösliches oder unlösliches Substrat für das Enzym des enzymgebundenen liganden in der flüssigen Zone vor-. handen ist und daß die Anwesenheit dieses liganden durch die Änderung der Menge des Substrates oder des Produktes dieses Substrates gemessen wird«

   6β Verfahren" nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Enzym Lysozym und als Substrat Micrococcuslysodeikticus verwendete

   7ο Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß

   man als Enzym Apfelsäuredehydrogenase (malatfcdehydrogenase) verwendete

   8ο Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die flüssige Zone innerhalb eines pH-Bereiches von 7,2 - 8,5 mit (Trishydroxymethyl)-methylamin, Oarbonat, Borat oder Phosphat puffert.

   9ο Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ligand ein Alkaloid, Steroid, Amphetamin, Prostaglandin, einen Tranquilizer, ein HaHtacinogen, Vitamin, Barbiturat, Glutethimid, Serotonin, Methadon, Meperidin, Catecholamin, Cannabinol^erivat, Polypeptid, Protein, Diphenylhydantoin, ein physiomimetisches Analoges oder deren Metaboliten verwendet»

   Oo Verfahren zum Nächweis eines Liganden, der eine organische, biologisch aktive Verbindung mit einem Molekulargewicht von etwa 100 - 2000 darstellt, und der mindestens eine polare Funktionalität enthält, in einem Medium, in welchem dieser Ligand vermutet wird, dadurch gekennzeichnet, daß man in einer flüssigen Zone (1) das Medium mit (2) einem enzymgebundenen Liganden und (3) einem Rezeptor, der dem Liganden und dem enzymgebundenen Liganden gemeinsam

   209881/07 5 2

   ist, in Berührung bringt, wobei die enzymatische Aktivität des enzymgebundenen Liganden im wesentlichen inhibiert wird, wenn der enzymgebundene Ligand an den Rezeptor gebunden wird, und daß man den Einfluß des vorhandenen Liganden durch Bestimmung der enzymatischen Aktivität analysiert·

   ο Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die flüssige Zone hinsichtlich (1), (2) und (3) im wesentlichen homogen ist, daß der Ligand eine biologisch aktive Verbindung darstellt und daß die enzymatische Aktivität des enzymgebundenen Liganden im wesentlichen inhibiert wird, wenn der enzymgebundene Ligand an den Rezeptor gebunden ist.

   12o Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als Enzym Lysozym und als Substrat für das Enzym Micrococcus[Lysodeikticus verwendet „

   13. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als Enzym Apfelsäuredehydrogenase verwendete

   14«. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als Enzym Meerrettichperoxydase verwendet.

   15o Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als Enzym Amylase verwendet.

   16e Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ligand ein Alkaloid oder ein physiomimetisehes Analoges eines Alkaloids verwendet.

   209 881/07 52

   17o Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man als Alkaloid Morphin verwendet.

   18o Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man als ligand ein Steroid verwendet„

   19° Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet,

   daß man als Ligand Amphetamin oder ein physiomimetisches Analoges verwendete

   20» Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ligand ein Barbiturat verwendet»

   © Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ligand ein OannabJnDlderivat verwendet.

   22o Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ligand ein Polypeptid und als enzymgebundenen Liganden einen solchen verwendet, bei dem mindöstens ein Enzymmolekül je enzymgebundenes Ligandenmolekül vorhanden ist.

   23e Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die flüssige Zone heterogen ist, der Ligand eine biologisch aktive Verbindung darstellt und der Rezeptor an einen unlöslichen Träger gebunden ist„

   24-0 Verfahren nach Anspruch 23» dadurch gekennzeichnet, daß man vor der Analyse, jedoch nach dem Inberührungbringen, den an einen Träger gebundenen Rezeptor und die flüssige Zone voneinander trennt»

   209881/0752

   25β Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß man die flüssige Zone nach der Abtrennung mit einem Substrat für das Enzym des enzymgebundenen Liganden kombiniert und die Menge des Liganden durch Bestimmung der Änderung der Menge des Substrats bestimmte

   26. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym des enzymgebundenen Liganden nicht wesentlich inhibiert ist, wenn es durch den Liganden an den Rezeptor gebunden ist und daß der an einen Träger gebundene Rezeptor in einer zweiten flüssigen Zone mit Substrat für das Enzym kombiniert wird und daß die Menge des Liganden durch Bestimmung der Änderung der Menge des Substrates bestimmt wird.

   27ο Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß man für den an einen Träger gebundenen Rezeptor eine Kolonne vorsieht und in dieser Kolonne die flüssige Zone bildet, indem man in die Kolonne eine Lösung des Mediums und des enzymgebundenen Liganden einführt, und daß man den Ausfluß aus der Kolonne mit dem Substrat für das Enzym kombiniert und die Menge des Liganden durch Bestimmung der Änderung der Menge des Substrats bestimmte

   28. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß der an einen Träger gebundene Rezeptor, das Medium und der enzymgebundene Ligand zu einem Gemisch kombiniert werden, so daß der Ligand im Medium und. der
   enzymgebundene Ligand um den Rezeptor in Wettbewerb treten, daß das Gemisch filtriert und das Piltrat auf enzymatische Aktivität analysiert wird,,

   2 0 9 8 81/0752

   Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß man als Liganden ein Alkaloid, Steroid, Cocain, Amphetamin, Prostaglandin, einen Tranquilizer, ein Halocinogen, ein Vitamin, Barbiturat, Glutethimid, Serotonin, Methadon, Meperidin, Oatecholamin, Oannabinolderivate, Polypeptide, Proteine, Diphenylhydantoin, physiomimetiache Analoge oder deren Metaboliten verwendet.

   Enzymgebundender Ligand für Immunanalysen, auf der Grundlage eines Alkaloids oder eines physiomimetischen Analogen eines Alkaloids, dadurch gekennzeichnet, daß das Alkaloid oder Analoge an einer anderen Stelle als dei^ceaktiven Stelle des Enzyms an das Enzym gebunden ist, wobei der Ligand die Grundstruktur

   aufweist, worin X eine verbindende Gruppe und A ein Enzym darstellt, worin der Sauerstoff in einer oder mehreren Stellungen (ortho, meta oder beta) gebunden ist, um eine oder mehrere Oxy-Funktionalitäten zu liefern, worin die restlichen Valenzen durch Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff und/oder Sauerstoff abgesättigt sind und worin A^- eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A, geteilt durch 2000, trägt»

   209881/0752

   31o Enzymgebundender Ligand nach Anspruch-30, gekennzeichnet durch die Formel

   worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:

   Jede der Gruppen W kann -X⁺-A⁺ sein oder ein H ;jeder der Gruppen W kann durch X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A ein Enzym darstellt, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt;

   W ist Wasserstoff oder eine Kohlenwasserstoffgruppe mit 1.-8 Kohlenstoffatomen;

   W ist Wasserstoff;
   W ist Wasserstoff;

   A. %

   W ist Wasserstoff oder bildet zusammen mit W einen zweiwertigen Rest mit 3-6 Kohlenstoffatomen und 0-2 Sauerstoffatomen, die mit der Kohlenstoffkette, an die sie gebunden sind, einen sechsgliedrigen carbocyclischen Ring bilden; *,

   W ist Wasserstoff oder Hydroxyl;

   W ist Wasserstoff, Hydroxyl oder zusammen mit W # Oxy;

   7
   W ist Wasserstoff oder eine Methylgruppe;

   209881/0752

   W ist Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe;

   q
   W ist Wasserstoff, eine Hydroxylgruppe, eine Acyloxygruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen, eine Hydrocarbyloxygruppe mit 1 - 3 Kohlenstoffatomen, eine 2-(N-Morpholino)-äthoxygruppe oder eine Glucuronyl-Gruppe; und 9a

   ist Wasserstoff,

   32o Enzymgebundener ligand nach Anspruch 30, gekennzeichnet durch die Formel

   9'

   W W

   0-1 äthylenisch ungesättigte

   Stellen

   worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:

   Jede der Gruppen W kann -X⁺-A⁺ sein bzw. ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A ein Enzym darstellt, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt;

   1 ♦
   W ist eine Alkylgruppe mit 1-3 Kohlenstoffatomen;

   4.1
   W ist Wasserstoff, eine Hydroxy-, Oxo- oder Acetoxygruppe j

   W ist Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe;

   W ist Wasserstoff, eine Hydroxylgruppe oder zusammen mit W eine Oxy (-0-)-Gruppe; und Ql

   W ist eine Hydroxygruppe oder eine Alkoxygruppe mit 1-3 Kohlenstoffatomen.

   209881 /0752

   2223383

   33· Enzymgebundener Mgand auf der Grundlage von Methadon oder eines physiomimetischen Analogen, dadurch gekennzeichnet, daß das Methadon oder das Analoge über eine verbindende Gruppe an einer anderen Stelle als der reaktiven Stelle des Enzyms an das Enzym gebunden ist, wobei der Ligand die nachstehende Formel

   aufweist» worin die Substituenten folgende Bedeutungen habenι

   Jede der Gruppen W kann -I⁺-A⁺ sein, bzw. ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein En*ym darstellt, das in einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden iat und das ej,ne Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis sun Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 200Q₉ trägtf

   209881/07 5 2

   η *> O oder 1 ; m = 2 oder 3 j

   W ist Wasserstoff!

   11 W und W sind Wasserstoff, Alkylgruppen mit 1-3 Kohlenstoffatomen oder bilden zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen sechsgliedrigen Ring, wobei außer dem Stickstoffatom 0-1 andere Ringheteroatome vorhanden sein können;

   13 W ist Wasserstoff oder eine Methylgruppe, wobei nur

   ein W^ eine Methylgruppe ist;

   W ist Wasserstoffj

   15 W ist Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe;

   W ist Wasserstoff, eine Acyloxygruppe mit 1-3 Kohlenstoffatomen oder eine Hydroxylgruppe; und 17

   W ist Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1-3 Kohlenstoffatomen«

   34· Enzymgebundener Ligand nach Anspruch 331 gekennzeichnet durch die Formel

   209881/0752

   worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:-

   Jede der Gruppen W oder ein H jeder der Gruppen W kann durch -X -A ersetzt sein, worin X eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym darstellt, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A , geteilt durch 2000, trägt;

   1Ω' 1A'

   W . und W ⁴ sind Wasserstoff;

   11' 12' '

   W und W sind Methylgruppen oder bilden zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen Morpholin- oder Piperidinring;

   1 c ι 16 '
   W und W sind Wasserstoff, Hydroxyl- oder Acetoxygruppen, wobei mindestens eine Hydroxyl- oder Acetoxygruppe vorliegt; und

   17'
   W ist eine Alkylgruppe mit 1-3 Kohlenstoffatomen,

   ο Enzymgebundener Ligand auf der Grundlage von Meperidin oder eines physiomimetischen Analogen, dadurch gekennzeichnet, daß das Meperidin oder das Analoge an einer

   re,
   anderen Stelle als der/aktiven Stelle des Enzyms an das

   Enzym gebunden ist, wobei der Ligand die Formel

   20988170752

   aufweist, worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:

   Jede der Gruppen W kann -X⁺-A⁺ darstellen, "bzw» ein H jeder der Gruppen W kann durch -X -A ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A ein Enzym darstellt, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von - A⁺, geteilt durch 2000, trägt5

   W²⁰ ist Wasserstoff j

   W ist Wasserstoff, eine Alkylgruppe mit 1-3 Kohlenstoffatomen, eine Phenylaminoalkyl- oder Aminophenylalkylgruppe;

   22
   W ist eine Alkoxygruppe mit 1-3 Kohlenstoffatomen; und

   W^ ist Wasserstoff oder eine Methylgruppe_o

   36. Enzymgebundener Ligand auf der Grundlage eines Methadon-Metaboliten oder eines physiomimetischen Analogen, dadurch gekennzeichnet, daß der Methadon-Metabolit oder

   sein Analoges über eine verbindende Gruppe an einer andere
   ren Stelle als der/aktiven Stelle des Enzyms an das Enzym gebunden ist, wobei der Ligand die nachstehende Formel

   __Μ17"

   ill"

   aufweist, worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:

   209881 /0752

   Jede der Gruppen W kann -X⁺-A⁺ darstellen, bzw<> ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin X eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym darstellt, daa an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt; ■

   ψ ist eine Phenylgruppe;

   W ist Wasserstoff;

   W ist Wasserstoff, eine Methylgruppe oder eine freie

   15"
   Valenz, die mit W verbunden ist;

   W ist Wasserstoff oder eine Methylgruppe;

   15"
   W ist Wasserstoff, eine Hydroxylgruppe oder bildet zu-

   11"
   sammen mit W eine Doppelbindung; und

   17"
   W ist eine Alkylgruppe mit 1-3 Kohlenstoffatomen.

   37ο Enzymgebundener Ligand auf der Grundlage von Diphenylhydantoin, dadurch gekennzeichnet, daß das Diphenyl-

   hydantoin über eine verbindende Gruppe an einer anderen

   re
   Stelle als der/aktiven Stelle des Enzyms an das Enzym gebunden ist, wobei der Ligand die nachstehende Formel

   W*⁶²—N

   φ-W*⁶⁰

   aufweist, worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:

   209881/0 7 52

   Jede der Gruppen W kann -X⁺-A⁺ bedeuten bzw· ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym bedeutet, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Iiiganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt;

   W^a6°, W^a61 und W^a62 sind Wasserstoffe

   38. Enzymgebundener Ligand auf der Grundlage von Catecholamin, dadurch gekennzeichnet, daß das Catecholamin über eine verbindende Gruppe an einer anderen Stelle als der reaktiven Stelle des Enzyms an das Enzym gebunden ist, wobei der Ligand die nachstehende Formel

   aufweist, worin die Subetituenten folgende Bedeutungen haben:

   Jede der Gruppen W kann -X⁺-A⁺ bedeuten, bzw. ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A ein Enzym bedeutet, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden iat und das eine Anzahl von Iiiganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägtj

   209881/0752

   - 139 - . '

   •zn ' ""■'■' --

   W^ ist Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit .1-3 Kohlenstoff at omen;

   W^y ist Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 - 3 Kohlenstoffatomen; - .

   W⁵² und W⁵⁵ sind Wasserstoff;

   Ίτ ist Wasserstoff, eine Hydroxylgruppe, eine Dimethoxycarboxyphenacylgruppe oder eine Dirnethoxy- oL -phthalidylgruppe;. -

   W^ und W sind Wasserstoff, bzw. eines kann zusammen mit

   •z-i ■ - 3 T

   W eine Bindung bilden, mit der Maßgabe, daß, wenn W und W zusammen eine Bindung bilden, jedes Paar von

   W und W bzw. W und W zusammengenommen werden kann,

   um eine Doppelbindung zu bilden;

   ■27
   W ist Wasserstoff oder eine Alkoxygruppe mit 1-3 Kohlenstoffatomen; und

   W und W sind Hydroxylgruppen oder Alkbxygruppen mit 1-3 Kohlenstoffatomen.

   39 ο Enzymgebuiidener Ligand auf der Grundlage eines Epinephrine oder eines physiomimetisehen Analogen, dadurch gekennzeichnet, daß das Epinephrin oder Analoge über eine ver-

   re bindende Gruppe an einer anderen Stelle als der/aktiven Stelle des Enzyms an das Enzym gebunden ist, wobei der Ligand die nachstehende Formel . ,

   aufweist, worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:

   2 0 9 8 8 1/0752

   Jede der Gruppen W kann -X⁺-A⁺ darstellen bzw_e ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin. X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A ein Enzym bedeutet, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt;

   W und W sind Wasserstoff oder Alkylgruppen mit 1-3 Kohlenstoffatomen;

   W sind gleich oder verschieden und bedeuten Wasserstoff, Alkylgruppen mit 1-3 Kohlenstoffatomen oder Carboxygruppen, bzw_o ein W kann zusammen mit W einen Piperidinring bilden;

   W ist Wasserstoff, eine Hydroxyl- oder Carboxyraethylgruppe; und

   4-4. 4- ^S
   W und W sind Wasserstoff, Hydroxylgruppen oder Alkoxyl-

   gruppen mit 1-3 Kohlenstoffatomen«,

   40. Enzymgebundener Ligand auf der Grundlage eines Barbiturate,

   dadurch gekennzeichnet, daß das Barbiturat über eine ver-

   re bindende Gruppe an einer anderen Stelle als der/aktiven Stelle des Enzyms an das Enzym gebunden ist, wobei der Ligand die Formel

   aufweist, worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:

   209881 /0752

   Jede der Gruppen W kann -X⁺-A⁺ bedeuten bzw. ein Ii jeder

   -4-4- 4-

   der Gruppen W kann durch -X -A ersetzt sein, worin X eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A ein Enzym bedeutet, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A , geteilt durch 2000, trägt;

   W ist Wasserstoff, eine Alkylgruppe mit.1 - 3 Kohlenstoffatomen oder ein Alkalimetallkation; W⁵¹ und W⁵² sind Wasserstoff, Alkyl-Alkenyl-Pycloalkyl-, Cycloalkenyl- oder Arylkohlenwasserstoffgruppen mit nicht mehr als 8 Kohlenstoffatomen;

   55
   W ist Wasserstoff oder ein Alkalimetallkation; und

   54.
   W ist Sauerstoff oder Schwefel.

   4-1 ο Enzymgebundener Ligand auf der Grundlage von Cocain oder einer verwandten Verbindung, dadurch gekennzeichnet, daß das Cocain oder die verwandte Verbindung über eine ver-

   rebindende Gruppe an einer anderen Stelle als der aktiven Stelle des Enzyms an das Enzym gebunden ist, wobei der Ligand die Formel .

   CH₀- CH- : CHCOW⁵⁶

   TT-W⁵⁷ CH-OW⁵⁶

   ^l2

   CH₂ -OH' _: — CH₂

   aufweist, worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:

   Jede der Gruppen W kann -X⁺-A⁺ sein bzw. ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym bedeutet, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und da3 eine Anzahl von Liganden im Boreich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺

   2 0 9 8 8 1/0752

   geteilt durch 2000, trägt;

   55
   W ist eine Hydroxyl-, Methoxy- oder Aminogruppe;

   W ist Wasserstoff oder eine Benzoylgruppe; und

   57
   W ist Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 - 3 Kohlenstoffatomen.

   42. Enzymgebundener Ligand auf der Grundlage eines Steroids mit 18-27 Kohlenstoffatomen und 1 - 6 sauerstoffhaltigen Funktionalitäten, dadurch gekennzeichnet, daß das Steroid über eine verbindende Gruppe an einer anderen Stelle als der aktiven Stelle des Enzyms an das Enzym gebunden ist, wobei der Ligand die nachstehende Grundstruktur

   X-A

   aufweist, worin X eine Bindung oder eine stabile verbindende Gruppe und Z 1 - 2 Gruppen darstellt, von denen eine eine Hydroxyl-oxo-aliphatische Kohlenwasserstoff gruppe mit 1-8 Kohlenstoffatomen oder eine sauerstoffhaltige aliphatische Gruppe mit 1-8 Kohlenstoffatomen und 1-3 Sauerstoffatomen darstellt, und worin A ein Enzym, das an einer anderen Stelle als an der reaktiven Stelle des Enzyms an X gebunden ist, wobei A eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bia zum Molekulargewicht von A, geteilt durch 2000, trägt» darstellt.

   2 Ü 9 FUi 1 / 0 7 \> :

   43o Enzymgebundener Ligand nach Anspruch 42 auf der Grundlage eines Androgens, gekennzeichnet durch die lormel

   W⁶⁰ W⁶¹

   V7

   64

   4 W

   64

   0-1 äthylenisch ungesättigte Stellen

   worin die Substituenten folgende Bedeutungen habeni Jede der Gruppen W kann -X⁺-A⁺ sein bzw. ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym bedeutet, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Ligahden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt?

   W ist Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe;

   W ist Wasserstoff, eine Methyl- oder Hydroxylgruppe;

   6? g>z

   W und W ^? sind Wasserstoff oder Hydroxylgruppen, wobei mindestens eine der Gruppen W ~" ^ eine Hydroxylgruppe darstellt;

   W ist Wasserstoff bzw< Doppelbindung bilden;

   65
   W ist eine Methylgruppe;

   zwei W können zusammen eine und

   ist Wasserstoff,

   209881/07 5 2

   44o Enzymgebundener ligand nach Anspruch 42 auf der Grundlage eines Östrogene, gekennzeichnet durch die Formel

   w⁷? „n

   w.

   75

   72

   73

   0-1 äthylenisch ungesättigte Stellen >_W74

   (W⁷⁴)

   worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:

   Jede der Gruppen W kann -X⁺-A⁺ sein bzw» ein H jeder der Gruppen W kann durch -X -A ersetzt sein, worin W⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym bedeutet, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt;

   70 W ist Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe;

   W ist Wasserstoff, eine A'thinylgruppe oder eine Hydroxylgruppe j

   72 73

   ist Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe;

   ist eine Hydroxylgruppe oder eine Alkoxylgruppe mit

   1 - 3 Kohlenstoffatomen;

   W ist Wasserstoff bzw. zwei W können zusammen eine

   Doppelbindung bilden; 75

   und

   ist Wasserstoff.

   209881 /0752

   45. Enzymgebundener Ligand nach Anspruch 42, auf der Grundlage eines Gestogens, gekennzeichnet durch die Formel

   ,85

   5 (W⁸⁵V

   worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:

   Jede der Gruppen W kann -X -A sein bzw. ein H j'eder der Gruppen kann durch -X -A ersetzt sein, worin X eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym bedeutet, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A , geteilt durch 2000, trägt;

   W sind Wasserstoff oder Hydroxylgruppen, wobei mindestens zwei Hydroxylgruppen vorhanden sind;

   W sind Wasserstoff bzw. zwei W können zusammen eine Doppelbindung bilden.

   2098S 1/0752

   46o Enzymgebundener Ligand nach Anspruch 42, auf der Grundlage eines Cortocosteroids, gekennzeichnet durch die Formel

   90 _W91

   "■■")

   0-1 äthylenisch ungesättigte

   Stellen

   worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:

   Jede der Gruppen W kann -X⁺-A⁺ sein bzw₀ ein H jeder der Gruppen W kann durch -X -A ersetzt sein, worin X eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym darstellt, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt;

   QO-Q7

   W sind Wasserstoff oder Hydroxylgruppen, wobei mindestens zwei Hydroxylgruppen vorhanden sind;

   W ist eine Methyl- oder Formylgruppe; und

   QQ QQ

   W ist Wasserstoff bzw» zwei W können zusammen eine Doppelbindung bilden„

   ? 0 9 B 8 1 / 0 7 S 2

   47o Enzymgebundener Ligand nach Anspruch 42, auf der Grundlage eines Sapogenine, gekennzeichnet durch die Formel

   0-1 äthylenisch ungesättigte Stellen O

   worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:

   Jede.der Gruppen W kann -X⁺-A⁺ sein bzw. ein H jeder der Gruppen W kann durch -X -A ersetzt sein, worin X eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A ein Enzym bedeuten, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt; und

   a2

   a2

   W""" und W sind Wasserstoff oder Hydroxylgruppen, wobei mindestens eine Hydroxylgruppe vorhanden ist«

   209881 /0752

   48o Enzymgebundener Ligand, auf der Grundlage eines Oannabinols oder einer verwandten Verbindung, dadurch gekennzeichnet, daß das Oannabinol bzw. die verwandte Verbindung über eine verbindende Gruppe

   re an einer anderen Stelle als der /aktiven Stelle des Enzyms an das Enzym gebunden ist, wobei der Ligand die nachstehende Formel

   W*¹²

   0-3 äthylenisch ungesättigte

   Stellen

   aufweist, worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben können:

   Jede der Gruppen W kann -X⁺-A⁺ sein bzw. ein H jeder der Gruppen W kann durch -X -A ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A ein Enzym bedeutet, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A , geteilt durch 2000, trägt;

   al 0
   W ist Wasserstoff oder eine Carboxylgruppe; W^a ist eine Hydroxylgruppe;

   W^a12 ist Wasserstoff;

   al "*>
   W ist eine Pentylgruppe;

   ο 14.
   W ist eine Methylgruppe; und

   al S-W ist eine Methyl- oder Garboxygruppe.

   209881/075 2

   49· Enzymgebundener ligand, auf der Grundlage eines Prostaglandins, dadurch gekennzeichnet, daß das

   Prostaglandin über eine verbindende Gruppe an einer

   re
   anderen Stelle als der/aktiven Stelle des Enzyms an das Enzym gebunden ist, wobei der Ligand die nachstehende Formel

   W*20

   0-1 äthylenisch ungesättigte Stellen

   ^C5^H9-11

   W*²³

   ^C6«10-12-^COWa24

   aufweist, worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben;

   Jede der Gruppen W kann -X —A sein bzw_o ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym bedeutet, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von

   geteilt durch 2000, trägt;

   a20—&2.^

   sind Wasserstoff oder Hydroxylgruppen, wobei

   mindestens eine Hydroxylgruppe vorhanden istf und

   a24
   W ist eine Hydroxyl-, Amino- oder eine Oxygruppe

   mit 1-6 Kohlenstoffatomen.,

   209881/0752

   50. Enzymgebundener Iigand auf der Grundlage von Meprobamat oder verwandten Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, daß das Meprobamat bzw. die verwandten Verbindungen über eine verbindende Gruppe an einer anderen Stelle

   re
   als der/aktiven Stelle des Enzyms an das Enzym gebunden

   sind, wobei der Iigand die nachstehende Formel

   Il

   W^a25 000H₂ 0 CH₂ 0 CW

   a26

   CH-

   aufweist, worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:

   Jede der Gruppen W kann -X⁺-A⁺ bedeuten bzw, ein H jeder der Gruppen W kann durch -X -A⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym darstellt, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt; und

   _ap «26
   W und W sind Aminogruppen.

   209881/075 2

   51o Enzymgebundener Ligand auf der Grundlage eines Tranquilizers mit einer Benziazoeycloheptan-Funktionalitat oder einer verwandten Verbindung, dadurch gekennzeichnet, daß der Tranquilizer oder die verwandte Verbindung über eine verbindende Gruppe an einer anderen Stelle als der reaktiven Stelle des Enzyms an das Enzym gebunden ist, wobei der Ligand die nachstehende formel

   _wa35

   aufweist, worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben«

   Jede der Gruppen W kann -X⁺-A⁺ sein bzw. ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein,, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym bedeutet, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt;

   W^a3° und W^a35 sind Wasserstoff?

   ist Wasserstoff, eine niedere Alkylgruppe mit 1-3 Kohlenstoffatomen bzw_o kann zusammen mit W^ eine Doppelbindung zwischen dem Kohlenstoff- und dem Stickstoffatom bilden;

   W ^JJ ist eine Aminogruppe oder eine niedere Alkylaminogruppe mit 1-3 Kohlenstoffatomen oder kann zusammen mit W eine Carbonylgruppe bilden;

   W ist Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe; und

   a^6
   W ■*■ iat eine Oxygruppe oder ein ungepaartes Elektronenpaar,

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   52β EnzymgelDundener Ligand, auf der Grundlage eines Tranquilizers mit einer Phenothiazin-Funktionalität oder von verwandten Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, daß der Tranquilizer oder die verwandte Verbindung über eine verbindende Gruppe an einer anderen Stelle als der reaktiven Stelle des Enzyms an das Enzym gebunden ist, wobei der Ligand die nachstehende Formel

   _Wa43

   aufweist, worin die Substituenten folgende Bedeutungen haben:

   Jede der Gruppen W kann -X -A sein bzw. ein H jeder der Gruppen W kann durch-X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A ein Enzym bedeutet, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt;

   ^_asserstoff, eine Alkylgruppe mit 1 - 6 Kohlenstoffatomen, eine Dialkylaminoalkylgruppe mit 4-8 Kohlenstoffatomen, eine N-Hydroxyalkylgruppe, eine N'-Piperazinoalkylgruppe, worin die Alkylgruppe 2-3 Kohlenstoffatome enthält, eine N'-Alkylgruppe, eine N¹-Piperazinoalkylgruppe, worin die Alkylgruppe 1-3 Kohlenstoffatome enthält, oder eine 2-(N-Alkyl)-piperidinylalkylgruppe, worin die Alkylgruppe 1-3 Kohlenstoffatome enthält, wobei zwischen den Heteroatomen mindestens 2 Kohlenstoffatome angeordnet sind;

   a4-1
   W ist Wasserstoff, Chlor, eine Trifluormethylgruppe, eine Alkylmercaptogruppe mit 1-3 Kohlenstoffatomen oder eine Acylgruppe mit 1-3 Kohlenstoffatomen; und W^a42 und W^a45 sind Wasserstoff,

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   53· Enzymgebundener Ligand auf der Grundlage von Serotonin oder einer verwandten Verbindung, wie 3-(2^fAminqäthyl)-5-hydroxyindol, dadurch gekennzeichnet, daß eines der Wasserstoffatome der Aminogruppe oder die Hydroxylgruppe der Carboxylgruppe durch -X⁺-A⁺ ersetzt ist, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym darstellt, das an einer anderen als an seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt*

   54· Enzymgebundener Ligand auf der Grundlage von Glutethimid oder einer verwandten Verbindung, dadurch gekennzeichnet, daß das Glutethimid oder die verwandte Verbindung über eine verbindende Gruppe an einer anderen Stelle als der reaktiven Stelle des Enzyms an das Enzym gebunden ist, wobei der Ligand die lormel

   '■■·■ ' aufweist» worin die Substituenten die nachstehende Bedeutung haben:

   Jede der Gruppen W kann -X -A sein bzw, ein H jeder der Gruppen W kann durch -X⁺-A⁺ ersetzt sein, worin X⁺ eine Bindung oder eine verbindende Gruppe und A⁺ ein Enzym bedeutet, das an einer anderen Stelle als seiner reaktiven Stelle gebunden ist und das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A⁺, geteilt durch 2000, trägt;

   W^a5° und W^a51 sind Wasserstoff; und

   W ist eine niedere Alkylgruppe mit 1 - 3 Kohlenstoffatomen ο

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   55. Enzymgebundener Iigand auf der Grundlage eines Polypeptide, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid über eine verbindende Gruppe an einer anderen Stelle als der reaktiven Stelle des Enzyms an das Enzym gebunden ist, wobei der Iigand die Formel

   (-CHOONH-)_n OHCO₂H) (X-A)_n,

   R E

   aufweist, worin die Substituenten folgende Bedeutungen habent

   X ist eine Bindung oder eine verbindende Gruppe\ A ist ein Enzym, das an einer anderen Stelle als der reaktiven Stelle gebunden ist u?id das eine Anzahl von Liganden im Bereich von 1 bis zum Molekulargewicht von A, geteilt durch 2000, trägtj

   η = eine ganze Zahl von l - 500 j

   n¹ » eine ganze Zahl von mindestens 1 und nicht größer als das Molekulargewicht des Liganden, geteilt durch 2000.

   56. Ligand nach einem der Ansprüche 30, 31» 33» 39, 40, 41 oder 42, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym Lysozym, Amylase, Peroxydase, Mannit-1-phosphat-dehydrοgenäse, Jtpfelsäuredehydrogenase, ß-Gluooronidase, Oellulase oder Phospholipase darstellt«

   57· Ligand nach einem der Ansprüche 30, 31, 33i 39, 40, oder 41, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym Lysozym, Amylase, Peroxydaae oder Äpfelsäuredehydrogenase darstellte

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   . - 155 - .

   •7.

   58β O -Carboxymethylmorphin, gebunden an Lysozym, Amylase, Äpfelsäuredehydrogenase oder Peroxydase_o

   59e !T-Caxboxymethyl^-phenyl^-earbäthoxypiperidin, gebunden an Lysozym, Amylase, Xpfelsäuredehydrogenaae oder Peroxydase»

   6Oo IT-Carboxymethy 1-1-phenyl-12-propylamin, gebtinden an

   Lysozym, Amylase, Ipfelsäuredehydrogenase oder Peroxydase.

   61 ο Ecgonin, an der 2-Oarboxystellting an Iiysozym, Amylase, Ä'pfelsäuredehydrogenase oder P,eroxydase gebunden·

   62o 5-(o6-Grotonyl)-5-(1'-methylbutyl)-barbitursäure, gebunden an Lysozym, Amylase, Ipfelsäuredehydrogenase oder Peroxydase» .

   63ο Testosteron-3-oarboxymethyloxim, gebunden an Lysozym, Amylase, A'pfelsäuredehydrogenase oder Peroxydase.

   64· 6-Keto-7,7-diphenyl-9-dimethylaminodecansäure, gebunden an Lysozym, Amylase, Äpfelsäuredehydrogenase oder Peroxydase.

   65 ο N-Carboxymethylphenobarbital, gebunden an Lysozym, Amylaae, Äpfelsäuredehydrogenase oder Peroxydase·

   R/hi

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