JPS60133367A - リドカインおよびその類縁体のための免疫原 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 本発明は、液体媒質、例えば生物学的液体中での免疫試
験に関与するリドカインおよび関連化合物（分析対象物
）の新規な誘導体に関する。このような誘導体には、従
来の技術により、宿主動物において、問題とする分析対
象物に対する抗体の産生を促進するために使用される免
疫原が包含される。また、特に好ましい免疫試験におい
て、抗体と一緒に試薬として使用される標識化された複
合体（以下、標識複合体という。）が提供される。

前記免疫原および標識複合体合成の中間体も提供され石
。

リドカイン〔メルク・インデックス（Ｔｈ＠Ｍ＠ｒｃｋ
　Ｘｎｄｅｘ　）、第９版、第５３３１頁（１９７６年
刀は１式 （式中、Ｑは水素であシ、Ｗｌおよび？はいずれもエチ
ル基である） で示される局所麻酔薬であるが、このものはまた、特に
心室の不整脈に対して抗不整脈特性を有する。

該麻酔薬は心筋梗塞後の患者の処置に広く使用され、体
重１−当たり１〜２ミリグラムのポーラス注射により投
与された後、続いて、１分間に体重１Ｋｆ当たシ２０〜
５０ミクログラムの投与量レベルで点滴によシ投与され
る。有毒な副作用〔低血圧、中枢神経系（ＣＮＳ）の抑
制および痙撃〕は、その血中濃度が１ミリリツトル（−
）当たシラマイクログラムを超えない場合は避けられる
ように見える。長期間の点滴で、安定した状態に達する
には、２４〜３０時間が必要といえる。該治療を受けて
いる患者については、リドカイン毒性の徴候を注意深く
かつ絶えず観察する必要がある。特定の患者の不整脈を
効果的に処理し、薬物毒性を十分に理解するために、リ
ドカインおよび、できれば、リドカイン代謝物の血中濃
度を定量しなければならないといえる。〔ジャネリー（
Ｇｉａｎ＠１ｌｙ）等、ニューイングル、ジエイ、メト
（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ。

ＪｌＭａｄ、）第２７７巻、第１２１５頁（１９６７年
〕；年回；クル（Ｗｉｎｋｌａ）等、アメル、ジエイ、
カルジオロジー（Ａｍ５ｒ、Ｊ、　Ｃａｒｄｉｏｌｏｇ
ｙ　）第３６巻、第６２９頁（１９７５年）〕 リドカインは肝臓内でＮ−説エチル化により代謝すれて
、モノエチルグリシン・キシリジド〔（ＭＫＧＸ）、式
（ト）において、Ｑは水素であり、ｗ”杜エチル基であ
り、Ｗ２は水素である〕およびグリシン・キシリジド（
（ＧＸ）、式（Ｎにおいて、Ｑ、Ｗ”及びＷ２は、いず
れも、水嵩である〕が産生される。

ある研究によると、前者の代謝物（ＭＥＧＸ）は血液中
に１−当たｊｊＪｏ、３１〜２．６マイクログラムの濃
度範囲で産生ずることが見出され九が、このものの抗不
整脈剤としての活性はリドカインの８０−であった。完
全に脱エチル化された誘導体（ＧＸ）は、母剤の１０分
の１の活性しかなかった。

〔バーニイ（Ｂｕｒｎｅｙ）等、アメルウハート、ジエ
イ、（Ａｍｅｒ、　［ａａｒｔ　Ｊ、）第８８巻、第７
６５頁（１９７４年）〕。人間の場合、ＭＥＧＸの高血
中濃度は、リドカイン療法に伴う中枢神経系の副作用に
結びつく。ラットの場合は、ＭＥＧＸの中度の痙筆誘発
投与量は体重１胸当たり６７ミリグラムと測定されたが
、これに対してリドカイン自体は、体重１Ｋｆにつき５
２ミリグラムである。このことは、リドカインで処置さ
れた人間に発作が起とるのは、一部分は、代謝物ＭＥＧ
Ｘによるものといえ名ということを示唆している〔プル
マー（Ｂｌｕｍａｒ）　等、ジエイ、ファーム、イクス
プ、セラプ（Ｊ、ｐｈａｒｍ。

Ｅｘｐ、　Ｔｈ＠ｒ＋ａｐ、）第１８６巻、第３１頁（
１９７３年）；ストロング（ＳＬｒｏｎｇ）等、クリニ
、ファーム、セラプ（Ｃｌ１ｎ、ｐｈａｒｍ、　Ｔｈ＠
ｒａｐ、）第１４巻、第６７頁（１９７３年）〕。

トカイニド、即ちリドカインの第一級アミン類縁体〔成
体）において、Ｑはメチル基であり、Ｗｌ及びＷ！はと
もに水素である〕　本また、リドカインと同様の抗不整
脈特性および毒性を有する。リドカインと異な抄、トカ
イニドは、肝臓を最初に通過する際に急速に代謝されて
除去されることが々いので、経口投与することができる
。トカイニドは１０時間の半減期を有し、６ｎシー！の
血清濃度で治療効果を有し、そして、　キニジンもしく
はシソピラミドと併用されている〔ジブス（Ｚｉｐｅａ
）およびドループ（’ｉ’ｒｏｕｐ　）等、アメル、ジ
エイ。

カルジオ＃　（Ａｍ＠ｒ、Ｊ、Ｃａｒｄｉｏｌ、　）第
４１巻：第１００５〜第１０２４頁（１９７８年）〕。

上記の薬物および代諭物で治療される患者の最適な治療
を管理するために１これらの薬物の崩漿濃度を測定する
のに十分感度のよい迅速かつ特異的な分析法がめられて
いる。このよう表必要性から、特にリドカインおよびＭ
ＥＧＸについての血中濃度を測定する様々な分析手法が
開発されている。例えば、マスフラグメントグラフィー
〔ス）　１：＋　７　り（Ｓｔｒｏｎｇ）およびアトキ
ンソン（ＡＬｋｉｎｓｏｎ）、アナル、ケム（Ａｎａｌ
、Ｃｈｅｍ、）第４４巻、第２２８７頁（１９７２年）
〕；気液クロマトグラフィー〔卜°ウ一シ（Ｄｕｓｃｉ
）およびノ・ケラト（［ａｅｈ＠ｔ）、り１７７゜トキ
シ：ｌ−７１７（Ｃｌ１ｎ、Ｔｏｘｉｃｏｌ、）第１４
巻、第５８７頁（１９７９年）〕；高性能薄層クロマト
グラフィー〔リー（Ｌｅｅ）等、ジエイ、クロマト（Ｊ
、ＣｈｒｏｍａＬ、）第１５８番、第４０３頁（１９７
９年）〕；　および酵素媒介免疫試験法〔レバン（Ｌａ
ｂａ−ｎｅ）等、クリーン、ケＡ　（Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈ
ａｍ、）第２５巻、＄　６１４頁（１９７９年）〕など
が挙げられる。

免疫試験法において使用するためのリドカインおよびそ
の類縁体に対する抗体の調製は、これら薬物と従来の免
疫原性担体物質との特定の免疫原性複合体を形成し、そ
してこの免疫原を抗体の産生を促進するために適当な宿
主動物の血流中に注射することによシ、先行技術によっ
て達成されている。米国特許第４，０６９，１０６号に
、薬剤が、リドカインのフェニル基上の３つの非置換位
の一つに結合したイミン結合によ）担体にカップリング
されている、かかる免疫原複合体が記載されている。具
体的に例示されているのは、薬物の元のア之ド側鎖に対
してパラ位の非置換位での結合である。ある種の阻害剤
標識免ｉ試験法において有用な標識複合体を形成する目
的で、異なった結合により、かかるパラ位でリドカイン
を誘導することは、米国特許第４，２７３．８６６号に
提案されている。

薬物のようなハプテンに対する抗体を製造する技術水準
は、ワインリブ（Ｗｅｉｎｒｙｂ　）　等、）”ラッグ
・メタボリズム・レビューズ（Ｄｒａｇ　Ｍ＠ｔａｂｏ
ｌｉｓｍＲｅｖｉａｗｓ　）第１０巻、第２７１頁（１
９７５年）；プレイフェア（Ｐｌａｙｆａｉｒ）等、プ
ロ、メト、プル（ＢｒｏＭａｄ、Ｂｕｌｌ、）第３０巻
、第２４頁（１９７４年）；ブロートン（Ｂｒｏｕｇｈ
ｔｏｎ）等、クリニ、ケム（ＣＩｉｎ、　Ｃｈｅｍ、）
第２２巻、第７２６頁（１９７６年）：およびパトラ−
（Ｂｕｔｌｅｒ）、ジエイ、イ４ノル、メト。

（Ｊ、　Ｔｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｏｔｈ、）第７巻、第１
頁およびファーマコル、レビ（ｐｈａｒｍａｃｏｌ、Ｒ
ｅｖ、）第２９巻（２）、第１０３頁（１９７８年）に
示されている。

標識物質にカップリングされた分析対象物または誘導体
もしくはそれらの他の類縁体から成る標ｌｌ複合体は、
例えば、′米国特許第４，２７９，９９２号：第４，１
８２，８５６号；第４．２ｊ９，２３３号および第４．
２９２，４２５号（標識は、螢光団酵紫基質β−ガラク
トシルウンベリフェロン）および米国特許第４．２１３
，８９３号（標識は、フラビンアデニンジヌクレオチド
）等の文献において、様々に記載されている。

〔発明の概要〕

本発明は、本明細書で一括して分析対象物と称されるリ
ドカイｙおよびその特定の類縁体（例えばＭＥＧＸ、Ｇ
Ｘおよびトカイニド）を測定するために免疫試験におい
て用いられる試薬を提供せんとする特異なもので、この
試薬の調製には、そのフェニル環上の元のメチル置換基
の一つにおける分析対象物へのカップリングもしくは分
析対象物の誘導体化を伴う。

従来の免疫原性担体物質に、芳香環に付いたメチル置換
基を介して化学結合したハプテン様分析対象物から成る
本発明の免疫原は、分析対象物に対する抗体の産生を促
進する。物質代謝が全く起こらず、有意の免疫原の顕著
な置換基が全く現われない位置で分析対象物をカップリ
ングさせることによシ、免疫原複合体は、分析対象物を
ほとんど修正することなく製造される。

本発明はまた、メチル基置換分析対象物試薬の合成にお
ける新規な中間体を提供するものである。

更に、本発明の新規な抗体を使用することにより、分析
対称物を測定するための改善された免疫試験法および試
薬系も提供される。更Ｋまた、本発明によれば、該免疫
試験法および系の特に好ましい態様のための標識分析対
象物複金体も提供される。

〔好ましい実施態様の説明〕

本発明は、芳香環メチル置換基の−において変性された
リドカインおよびそのメチルアミン類縁体の誘導体の製
造に焦点を合わしているものである。かかる誘導体は、
次に、通常の担体物質とカップリングさせることによシ
免疫原を形成するために使用され、また次いで抗分析対
象物抗体を得るために使用され、または選択された種々
の免疫試験法における検出試薬として作用する標識複合
体を形成するために使用される。

芳香環メチル誘導体 本発明の分析対象物誘導体は、一般式 （式中、Ｑは水素もしくは低級アルキル基でお択されＲ
１は化学結合もしくは適当な連結基であシ、モして２は
選択された免疫原性担体物質もしくは標識試薬に対して
カップリングさせることのできる反応性官能基であり、
以下で更に詳細に説明されている） を有する。

本発明で使用される低級アルキル基は、式％式％ するもので、式中、ｍは１〜６の整数であシ、従って直
鎖状および分枝状のもの（例えば、メチル基、エチル基
、ｎ−プロピル基、イソブチル基、］−ブチル基、イソ
ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−へキシル等とを含
み、直鎖状のものが好ましく、ｍが４以下のものも好ま
しい。かかる誘導体は、出発物質である３−ヒドロキシ
メチル−２−二トロトルエン（１）のアルキル化に゛よ
ジ形成される。

化合物（１）のヒドロキシル基のアルキル化は、従来の
いかなる方法によっても、例えば、試薬Ｘ　−Ｒ’−ｚ
’との反応にょシ達成できる。式中、Ｘは適当な脱離基
、例えば、塩素、臭素、ヨウ素、パラトルエンスルホニ
ル−・メタンスルボニル等テあシ、そして、２′は２も
１くは２に変換することのできる基、例えば、ヒドラジ
ンによる処理によってアミノ基に変換することができる
フタルイミド及びカルボキシル基に変換できるカルボキ
シエステルを挙げることができる。官能基２′は、通常
、アミン、カルボキシル、チオール、ヒドロキシルもし
もしくは前駆体である。試薬Ｘ−Ｒ’−Ｚ’　の唯一の
要件は、出発物質（１）のヒドロキシル基と反応して、
脱離基Ｘが典型的な核的置換を受けるように、脱離基Ｘ
がＲ′に結合しているという点である。

アルキル化試薬Ｘ　−Ｒ’　−Ｚ’の例として、次の任
意の組み合わせから選択される要素から成るものが挙げ
られる。

ＣＨ，８０，○　−（ＣＨ今ＣＦ３Ｃ０Ｎ’Ｈ−当業者
が、本発明の誘導体に導入することができる広範囲の連
結基Ｒ′を有していることは明らかである。かかる選択
の例としては、直鎖状および分枝状アルキレンであり、
１から最大１５個、より普通には１０個以下、および通
常６個未満の炭素原子からなる（例えば、メチレン、エ
チレン、ｎ−７’ロビレン、インプロピレン、ｎ−ブチ
レン等）。更に、かがるアルキレンは、その他の置換基
、例えば、シアノ基、アミノ基（置換アミノを含ム）、
アシルアミノ基、ハロゲン、チオール、ヒドロキシル、
カルボニル基、カルボキシル基（置換されたカルボキシ
ル基、例えば、エステル、アミドおよび置換アミドを含
む）を含んでいてもよい。勿論これは、いがなるこれら
の官能基も以後の合成操作、特に担体物質または標識試
薬に対するカップリングに干渉しないという条件下にお
いてである。連結基Ｒ′はまた、置換もしくは非置換の
アリール、アラルキルもしくはヘテロアリール基（例ｔ
ｉｊＪ７二二レン基、７エネテレン等）を含むか、ある
ｂ＃′ｉそれらから成っていてもよい。

更Ｋまた、かかる連結基は窒素、硫黄および散票から選
択された１以上のへテロ原子を、エーテル、エステル、
アミド、チオエーテル、アミジノ、スルホンもしくはス
ルホキシドの形態で含有していてもよい。また、かかる
連結基は、オレフィンもしくはアセチレン結合のような
不飽和基、イミノ基またはオキシイミノ基を含んでいて
もよい。Ｒ′は、水素を除外して１〜２０個の原子、さ
らに普通には１〜１０個の原子から成る鎖、通常は脂肪
族基であることが好ましいが、この場合、０〜５個は窒
素、散票および硫黄から選択されたヘテロ原子である。

特に好ましいのは、Ｒ′が、ｎが１〜１０の整数である
場合の基（ＣＵｔ）であり、そして２がアミン基もしく
はカルボキシル基、またはその保護された形態である誘
導体である。したがって、連結基Ｒ′の種類は本発明に
とって制限のあるものではなく、安定な化合物の産生を
保証するために通常の予備措置を講じる当業者によって
選択されうるものである。

かかる連結基Ｒ′および末端官能基２′を有する分析対
象物誘導体（Ｂ）を得るために利用することができる合
成経路を以下に例示した。

上記において概説した操作法に従って、ベンジルアルコ
ール系出発物質（１）をオメガ（ホ）ブロモアルキルフ
タルイミドでアルキル化すると、誘導体中）が得られる
。この際、Ｒ′が＋ＣＨ，）−であｌ：、、ｚｌが７タ
ルイミド、即ちＮＨ，の防護された形態であって、ヒド
ラジンと反応させることにょシ冊。

に転換することができる、誘導体ＣＢ）を得ることがで
きる。ｎ　＝＝　５〜９のかかるブロモフタルイミド類
は既知の化合物である〔ディルシェル（Ｄｉｒ　−ａａ
ｂｓｒ　）およびワインガルテｙ　（Ｗｅｊｎｇａｒｔ
ｅｎ）、アナ（Ａｎｎ　）、第５７４巻、１３１頁（１
９５１年）；ミュラー（Ｍｕｌｌｅｒ）およびクララｘ
　（Ｋｒａｕａｓ）、モンタシュ（Ｍｏｎもａｓｈ）、
第６１巻、２１９頁（１９３２年）；エルダーフィール
ド（］ｉ：１ｄｅｒｆｉｅｌｄ　）等、ジエイ、アム、
ケム、ソス（Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　８００．）、
第６８巻、１５６８頁（１９４６年）；ドナヒユー（Ｄ
ｏｎａｈｕａ　）等、ジェイ、オルグ、ケム（Ｊ、Ｏｒ
ｇ。

Ｃｈｅｒｎ、　）　第２２巻、第６８頁（１９５７年）
参照〕。

出発物質（１）を、オメガブロモアルカン酸二２・チル
でアルキル化して、Ｒ′が（ｃＨｔ　）であり、ｚ′が
−ＣＯＯＣ，Ｈ，、即ち−ＣＯＯＴ（の前駆体である、
誘導体０）を生成することもできる。式中、ｎ　＝　１
〜４のエチル・オメガブロモエステルは市販されている
；ｎ＝５〜９のものは既知の化合物である〔ノクーガー
（Ｂａｒｇｅｒ）等、ジエイ、ケム、ソサ（Ｊ、（：ｈ
ｅｍ。

Ｓｏｏ、（１９３７年）、第７１４頁；　サルモンーレ
ガグチー（Ｓａｌｍｏｎ−Ｌｅｇａｇｎａｕｒ　）、プ
ル、ンサ、ケム。

フランス（Ｂｕｌｌ’Ｓｏｃ、ｃｂｅｍ、　Ｆｒａｎｃ
ｅ）　、（１９５６年）、第４１１頁；リネル（Ｌｉｎ
ｎａｌｌ）およびボラ（Ｍａｒｓ）。

シエイ、ファーム、ファーマ：Ｉ　Ａ／　（Ｊ、　Ｐｈ
ａｒｍ。

ｐｈａｒｍａｃｏｌ　）、第４巻、第５５頁、（１９５
２年）参照〕。

更ニ、ベンジルアルコール（１）　ハ、オメガヒドロキ
シアルデヒド類から入手できるオメガノ・ロアルカナー
ル〔フルト（）（ｕｒｄ）等、ジエイ、アム、ケム、ソ
ス（Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｅ、）第７４巻、
第５３２４頁（１９５２年）〕でアルキル化して、Ｒ’
　＝　−（ＣＨｔ）　およびＺ’＝ＣＨ０を有する誘導
体（ロ）を得ることができる。

２がチオールである誘導体中）の例は、Ｚ：ＮＨ。

である誘導体の）をＮ−スクシンイミジル−３−（２−
ピリジルジチオ）プロピオネートと反応させ、そして該
生成物をその場で遊離チオール化合物に還元することに
より得ることができる。

マレイミド基で官能化した誘導体（Ｂ）は、Ｚ＝ＮＨオ
である誘導体中）をマレイン酸無水物と反応させ、生成
物を環化してマレイミド基を形成することにより製造す
ることができる。あるいは、アミノ銹導体をマレイミド
で置換されたカルボン酸と反応させてマレイミド置換誘
導体を得ることができる。

この誘導体において、アミン中に存在する元の連結基Ｒ
′は延長されて、マレイミドカルボン酸によるアミド官
能基を包含するようになっている。マレイミド置換誘導
体の例は既知のものである〔キタガワおよびアイカワ、
ジエイ、バイオケム（Ｊ。

Ｂｉｏｅｂｅｍ、）第７９巻、第２３３頁（１９７６年
）；ケラ−（Ｋｅｌｌｅｒ）およびリープインジャー（
ｌｉｅｄｉｎ−ｇｓｒ　）、ヘルプ、チム、アクタ（Ｈ
ｅ１ｖ、　Ｃｈｌｍ。

Ａｅｔａ　）第５８巻、第５３１頁（１９７５年）〕。

同様に、連結基Ｒ′は広く変更し得る。例えば、非置換
結合は、ベンジルアルコール出発物質（１）　ヲＮ−（
４−ブロモブテニル）フタルイミドと反応させることに
よシ導入することができる〔バークオフエＡ／　（Ｂｉ
ｒｋｏｆｓｒ）およびヘンベル（Ｈｅｍｐｅｌ）、ケム
、べ／Ｌ／　（Ｃｂｅｍ、　Ｂａｒ）第９３巻、第２２
８２頁（１９６０年）〕。

フェニレン連結基は、出発物質（１）を２−（３−クロ
ロプロピル）ベンジルクロリドでアルキル化することに
より導入でき、これにより次式で示される誘導体の）が
得られる。このものは、更にシアニドイオンと反応させ
、しかる後酸で処理することによシ、カルボキシル誘導
体（ｚ　＝　Ｃｏｏ）Ｉ）に変換することができる〔パ
ラフラー（Ｂｕｏｋｌａｒ）等、ヨーロッパ、ジエイ、
メト、ケム（ＥｕｒｏＢＪ、　Ｍｅｄ、　ｃｈｓｍ−）
第１２巻、第４６３頁（１９７７年）参照〕。

上記の合成経路から、一般構造式（Ｂ）　（式中、２は
免疫原性担体物質もしくは適当な標識残基に対してカッ
プリングさせるための反応基である）で示される分析対
象物誘導体は、連結基Ｒ′の特質により広範囲で合成し
得ることは明らかである。

特に好ましいのは、式 （式中、ｎは１〜１０の整数、通常は１〜６、および好
ましくは３の整数である） で示される分析対象物誘導体である。誘導体（Ｃ）　（
式中、Ｑは水素もしくは低級アルキルであり、ｎ冨３、
そして２＝アミノである）は、図示され、かつ実施例の
中で更に詳細に示された合成例により製造することがで
きる。図において、ベンジルアルコール（１）をアクリ
ロニトリルと反応させるとシアノエチルエーテル（２）
が得られる。化合物（２）の触媒による水素添加により
、シアン及びニトロ基が同時に第一級アミンに還元され
、ジアミン（３）を生成する。ジアミン（３）と１当量
の炭酸ジーＬｏｒＬ−ブチルの反応により、−保護化中
間体（４）が生成される。−保護化中間体（４）の未保
護芳香環アミノ基を、次に、所望の塩化α−ブロモアル
カン酸でアシル化し、その生成物（５）をアンモニアま
たは所望のモノアルキル−もしくはジアルキルアミンと
反応させると、（６）が生成される。Ｗｌ及びＷ２が水
素である場合は、（６）の第一級アミン基は次に、例え
ばＯ−ニトロフェニルクロリドとの反応により適切に保
護される。ｔｅｒＬ−ブチルオキシカルボニル保護基を
酸処理によシ除去すると（７）が残る力（、これは以後
のカップリング反応に適切な第一級アミノ基を有してい
る。第一級アミノ基が（６）牛に存在し、それが（７）
の保護形態とされる場合は、該保護基は、（７）を免疫
原性担体、標識試薬等とカップ１ノングさせた形で塩基
で処理することにより除去される・ 免疫原 前記分析対象物誘導体中）は、数多くの慣用技術により
免疫原性担体物質に共有結合せしめられ、式 （式中、Ｑ　、　ＷｌおよびＷ２は前記のように定義さ
れる） で示される１個以上の残基から成る免疫原を生成するこ
とができる。更に具体的には、かかる免疫原は、式 （式中、Ｃａｒｒｉｅｒは免疫原性担体物質であり、Ｒ
は誘導体の）を担体にカップリングさせている適切な連
結基であり、そしてｐは担体にカップリングしたハプテ
ン部分の数である） を有する。数ｐは、免疫原のエピトープ密度とも称され
るととがあシ、担体分子上の利用可能なカップリング部
位の数によってのみ制限される。しかし、担体が天然由
来蛋白質、例えばアルブミンである普通の場合では、Ｒ
は平均して１と約５０の間、更に通常には１〜約２５と
なる。このよう表普通の場合の最適エピトープ密度は、
免疫原の合成および抗体反応の容易性および再現性を考
慮して、２と約２０の間、更に普通には５〜１５になる
。

免疫原性担体物質は、従来公知のいかなるものから選択
してもよい。たいていの場合、担体は蛋白質またはポリ
ペプチドであるが、その他の物質（例えば、炭水化物、
多糖類、リボ多糖類、核酸お・よび十分なサイズと免疫
原性を有する類似物）も同様に使用し得る。たいていの
場合、免疫原性蛋白質およびポリペプチドはｓ、ｏｏｏ
〜１０　、０００．０００゜好ましくは１５，０００以
上、更に普通にはｓｏ　、　ｏｏ。

以上の分子量を有している。一般に、ある動物種から取
った蛋白質は、他の種の血流に導入した場合、免疫原と
なる。特に有用カ蛋白質社アルブミン、顕著な非蛋白質
成分を有する蛋白質、例えば糖蛋白質等である。３ｏ、
ｏｏｏ〜２００，０００の分子量を有するアルブミンお
よびグロブリンが特に好適である。従来の免疫原性担体
物質および−・ブテンとのカップリング技術に関する技
術水準については、更に次のものを参照されたい。バー
カー（ｐａｒｋｅｒ）　、ｒ生物学的活性化合物の放射
性免疫試験Ｊ　（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　
ｏｆ　Ｂ’（ｏｌｏｇｉｅａｌ　ＡｏＬｉｖｅＣｏｍｐ
ｏｕｎｄｓ　）、プレンティス−ホール（Ｐｒｅｎｔｉ
ｏｅ　−Ｈａｌｌ　）　（エングルウッドｅクリフス（
ＫｎｇｌｅｗｏｏｄＣｌｉｆｆｓ　）、ニューシャーシ
ー（Ｎｅｗ　Ｊ＠ｒｌ＠ｙ）、米国、１９７６年〕；パ
トラー（Ｂｕｔｌｅｒ）　、ジエイ。

イムツル、メト（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｍｏｔｈ、）
第７巻、第１〜２４頁（１９７５年）：ウニインリプ師
１ｎｒｙｂ）およびシュロフ（Ｓｈｒ−ｏＨ）、ドラグ
、メタプ、レブ（］）ｒａｇ　Ｍｅｔａｂ、　Ｒｅｖ、
　）第１０巻、第１−２４頁（１９７５年）；ブラウト
７　（ＢｒｏｕｇｈＬｏｎ）およびストロング（ＳＬｒ
ｏｎｇ）、クリン、ケム（Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｅｍ、）第２
２巻、第７２６〜７３２頁（１９７６年）：ペレイ“７
〒テ／　ＤＩａｗｒａ＋ｐ”ｌ航　イｖｑ４Ｖ　ゴｎｔ
（ＴｉｐＭｅｄ、　Ｂｕｌｌ　）第３０巻、＄２４〜３
１頁（１９７４年）；およびパトラ−（Ｂｕｔｌｅｒ）
ジエイ、イミュノル、メト（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍ
ｏｔｈ、）第７巻、第１頁および７アーマコル、レビ（
ｐｈａｒｍａｏｏｌ　Ｒａｙ、）第２９巻（２）、第１
０３頁（１９７８年）。

適切な分析対象物誘導体ＣＢ）は周知の技術に従って免
疫原性担体物質とカップリングし得る。例えば、アミノ
誘導体線、活性化エステル、アシルアジド構造物、カル
ボジイミド等を用いた通常のペプチド結合形成反応によ
シ、カルボキシル基を有する担体（例えば、蛋白質もし
くはポリペプチド担体）にカップリングさせることがで
きる。「ペプチドＪ　（Ｐａｐｔｉｄｅｓ）グツドマフ
　（Ｇｏｏｄｍａｎ　）およびマイエンホーファ（Ｍｅ
ｉｎｈｏｆｅｒ　）、ジョン・ライレイ・アンド・サン
ズ（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｌａｙ　＆　５ｏｎｓ）〔ニュー
ヨーク、・１９７７年〕６頁以下、および「ペプチド、
分析、合成、生物Ｊ　（’Ｉ’ｈｅ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ
。

Ａｎａｌｙｓｉａ、　５ｙｎｔｈａｓ、ｉｉ、　Ｂｉｃ
＋ｌｏｇｙ）、第１巻、アカデミツク・プレス（Ａｏａ
ｄｅｍｉｅ　ｐｒ＋ｅｓｓ）　にニューヨーク、１９７
９年〕参照。同方法は、アミノ基を有する担体にカルボ
キシル化鰐導体を結合させることにも同様に適用される
。

チオール化誘導体は、ジスルフィド交換法〔マーチｙ　
（Ｍａｒｇｉｎ）等、バイオヶム（Ｂｊｏａｂｅｍ、）
　ｍ　２２０巻、第４２２９頁（１９８１年）〕により
、チオール基含有ポリマー（Ｔ、Ｇｔたはチオール化蛋
白質）に結合させることができる。また、アミノ基含有
ポリマーは、キタガワおよびアイカワ、ジェイ、ハイオ
ケム（Ｊ、　Ｂｉｏｃｈａｍ、）第７９巻、第２３３頁
（１９７６年）に記載された方法により、試薬ＭＢ８と
反応させ、続いて生成物をチオール含有誘導体とカップ
リングさせることができる。マレイミド誘導体も、同様
にチオール基含有担体〔同上〕とカップリングさせ得る
。ヒドロキシル基誇導体は、トリクロロトリアジンを用
いて担体に結合させ得る〔ケイ（Ｋａｙ）およびクリー
ク（Ｃｒｏｏｋ）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第２１
６巻、第５１４頁（１９７６年）〕。

多くのその他のカップリング技術が、本発明の種々の誘
導体を通常の免疫原性物質と結合させる上で、当業者に
と如利用可能でおる。例えば、当業者であれば、その一
端が誘導体と共有結合し、他端が上述の担体（例えば、
アミン、カルボキシヘチオール、ヒドロキシルおよびマ
レイミド）とカップリングする官能基を有するような二
官能性試薬を適切な誘導体と反応させることができる。

例えば、二官能性カップリング試薬は、トルエン−２，
４−ジイソシアネート〔ヒールズ（Ｈｉｒａ）　ｂよび
テマシエ７　（Ｔｉｍａｓｈｅｆｆ　）、メンラド拳イ
ン・エンザイモル（Ｍｓｔｈｏｄ＠ａ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ
ｍｏｌ　）第２５巻（Ｂ部）、第６２５頁（１９７２年
）　）　：　４１４’−ジフルオロ−３，３−ジニトロ
フェニルスルホン〔カトレカサス（Ｃｕａｔｒｅｅａｓ
ａａ　）等、ジエイ、バイオルケム、（Ｊ、　Ｂｉｏｌ
、　Ｃｈｅｍ、）第２４４巻、第４０６頁（１９６９年
））ニゲルタルアルデヒド〔フローマフ　（Ｆｒｏｂｍ
ａｎ）等、エンド−クリノル（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ）
第８７巻、第１０５５頁（１９７０年）〕；ビスイミデ
ート〔ダットン（Ｄｕ　Ｌ　ｔ　ｏ　ｎ　）　等、バイ
オケム、バイオフイ、ＶＸ、：Ｉム（Ｂｉｏａｈｅｍ、
　Ｂｉｏｐｈｙ、　Ｒ６１１゜Ｃｏｗｎ、　）第２３巻
、第７３０頁（１９６６年）〕；およびクロロトリアジ
ン〔（ケイ（Ｋａｙ）およびクリーク（Ｃｒｏｏｋ）、
ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第２１６巻、第５１４頁（
１９６７年）〕により、アミン誘導体をアミノ基含有担
体とカップリングさせることについて周知である。その
他の有用なカップリング試薬は文献にくまなく記載され
ている（コブル（Ｋｏｐｐｌｅ）、ペプチドとアミノ酸
（ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ａｎｄＡｍｉｎｏ　Ａａｉｄａ　
）、Ｗ、Ａ、ベンジャミン社（Ｗ、Ａ。

Ｂ＠ｎｊａｍｉｎ、　Ｉｎ６．）　［二ｘ　−５−り、
１９６６年］：年中：　ｌｏｗ・）およびディーン（］
）ｅａｎ）、アフィニティークロ“マ１トゲラフイー（
Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｃｈｒｏｍａｔｏ　−ｇｒａｐｈｙ
）、ジョン・ウイリイ・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ　Ｗ
ｉｌｅｙ　＆　３ｏｎａ　）　（ニューヨーク、１９７
４年〕；ミーンズ（Ｍｅａｎａ）およびフリーニイ（Ｆ
ｒｅａ−ｎｙ）、蛋白質の化学的修飾（Ｃｈｅｍｉａａ
ｌ　Ｍｏｄｌｆｌｏａ−Ｌｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉ
ｎｓ）、ホールデンーデイ（１（ｏｌｄｅｎ−Ｄａｙ）
Ｃサンフランシスコ、１９７１年〕；年上；グレイザー
（Ｑｌａｇｅｔ）等、蛋白質の化学的修飾、エルスエビ
了−（１ｉｊｌａｅｖｉｅｒ）　（＝　：ｘ−−ヨー　
ｐ、１９７５年〕参照）。

本免疫原を表わす（６）式中、連結基Ｒは上記のＲ′連
結基およびカップリング反応後に残存する官能基２の残
基から成る。前述したように、官能基２の残基は担体上
の適当な官能基との結合により直接結合してもよく、あ
るいは二官能性カップリング試薬の残基により結合して
いてもよい。したがって　Ｒ／の場合と同様、連結基Ｒ
は広範囲に変更することができ、その正確な化学構造は
、得られる免疫原の免疫原性にかかわシなく、ノ・ブテ
ン残基を結合する目的に沿う限シ限定されない。特に、
連結基Ｒは、Ｒ′に関して上述したものと同様の多様な
構造を有することに特徴がある。分析対象物誘導体（６
）の官能基２の残基は、イミノ、カルボキシル、スルホ
（Ｓ）またはオキシｔｏ）であることが好ましいＯ 特に好ましいのは、式 （式中、Ｒ″は前に詳細に記載したＲ′と同様の多様性
を有する適切な連結基であり、普通には同じ＜　Ｒ’に
関して上述したように１水素を除外した１〜２０個の原
子を有する鎖である）で示される免疫原である。好都合
なことに、Ｒ〃はアミド基、即ち−ＮＨＣＯ−であって
、との基は、担体のアミノ基からのアミン基窒素原子お
よび適切な誘導体（例えば、カルボン酸）からの炭素原
子によシ（このとき、ｐは担体中の結合アミノ基の平均
数、好ましくは前記で牽義した平均数を表わす）、ある
いは適切な誘導体（例えば、アミノ誘導体）からの窒素
原子および担体のカルボキシル基からの炭素原子によシ
（このとき、ｐは担体中の結合カルボキシル基の平均数
、好ましくは前記で定義した平均数を表わす）形成され
る如く、二つの可能な態様のうちのいずれにも適してい
る。

抗体 本免疫原複合体を用いた特異的な抗体の産生け、いかな
る従来技術によってもよい。抗体形成を誘発するための
基本的な方法を記述し友数多くの文献が利用可能である
が、例えば、パーカー（ｐｉｒｋａｒ）、生物学的活性
化合物の放射性免疫試験（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａａ
ｓａｙ　ｏｆ　ｌｌｉｏｌｏｇｉａａｌｌｙ　Ａｃｔｉ
ｖｅＣｏｍｐｏｕｎｄｓ　）、プレンチスーホール（ｐ
ｒｅｎｔｉａｅ　−）１ａｌｌ　）　（イングルウッド
書クリフス（ＥｎｇｌｅｗｏｏｄＣｌｉｆｆｓ　）、ニ
ューシャーシー（Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ　）、米国、１
９７６年、等が参考とされる。通常の場合、宿主動物（
例えば、ウサギ、ヤギ、マウス、モルモットまたはウマ
）に、免疫原複合体を通常補助剤と混合して、１個所以
上の様々な部位から注射する。定期的または不定期的間
隔で同一もしくは異なった部位に更に注射した後、最適
な力価に達したことが判明するまで、抗体力価を評価す
るために採血する。宿主動物から採電去れて、適量の特
異的抗血清が得られる。望ましくは、抗血清が実際の分
析に使用するのに適当であると考えられるようになる前
に、望ましくない物質、例えば非特異性抗体を除去する
精製操作を行う。

抗体はまた、体細胞ハイブリッド化法により得−ン抗体
と称されている。該モノクローン抗体の概要は、リンパ
球ハイブリドーマ（ＬｙｍｐｈｏｅｙｔｅＨｙｂｒｉｄ
ｏｍａｓ）メリテエルズ（Ｍｅｌｅｈｅｒｓ）等、スブ
リンガーーベルラーグ（Ｓｐｒｉｎｇ＠ｒ−Ｖｅｒｌｍ
ｇ　）、〔ニューヨーク、１９７８年〕；年回；ャー（
Ｎａｖｕｒｅ）第２６６巻、第４９５頁（１９７７年）
；サイエンス（５ｏｉｅｎｅａ）第２０８巻、第６９２
頁（１９８０年）；および酵素学的方法（Ｍｓｔｈｏｄ
ａｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）第６３巻（Ｂ部）
、第３〜４６頁（１９８１年）に記載されている。

免疫試験の技術 本発明の免疫原から調製された抗体は、リドカインおよ
びその類縁体を測定する上で、あらゆる免疫試験および
それに対応する試薬系で使用され得る。該免疫試験法に
は、凝集反応法、放射性免疫試験法、不均一酵素免疫試
験法〔米国特許第３゜６５４．０９０号参照〕、不均一
螢光免疫試験法〔米国特許第４，２０１，７６３号４第
４，１７１，３１１号：第４．１３３，６３９号；第３
，９９２ｊ３１号参照〕、およｒト泊−ｒ鼻斡■鮨１必
佛針齢と病を会咄あア　Ｄ住の免疫試験法は特に好まし
く、それには例えば螢光消失法もしくは増加法〔米国特
許第４，１６０，０１６号参照〕、螢光分極法〔ジエイ
、エクスプ、メト（Ｊ、　ＥＸＰ、　Ｍｓｄ、）第１２
２巻、１０２９頁（１９６５年）参照〕、酵素基質標識
化免疫試験法〔米国特許第４，２７９，９９２号および
英国特許明細書第１゜５５２．６０７号参照〕、補欠分
子族基標識化免疫試験法（米国特許第４，２３８，５６
５号参照）、例えば阻害剤標識物を使用する酵素モジュ
レータ−標識化免疫試験法〔米国特許第４，１３４．７
９２号および第４，２７３，８６６号参照〕、酵素標識
化免疫試験法〔米国特許第３．８１７，８３７号参照〕
、エネルギー伝達免疫試験法〔米国特許第ａ、９ｃ＋ｅ
、３４５号参照〕、および二重抗体立体障害免疫試験法
〔米国特許第３，９３５，０７４号および第３，９９８
，９４３号参照〕等の技術が含まれる。従来公知の均一
免疫試験法は、一般に分析対象物と抗体に結合させるた
めの薬物の標識複合体との間に競合を生ぜしめることに
よシ行われ、標識複合体が抗体に結合すると、検出可能
な標識特性が変化するということにＩｖｆ徴がある。

更に、本発明の分析対象物誘導体（ｑは、上記の種々の
免疫試験法を行うのに必要外標識複合体を製造する丸め
に使用することができる。適切な誘導体は、標準的な方
法に従って、放射線Ｓ識するか、あるいは螢光体で標識
することができる。同様に、好ましい均一技術のための
適切なＳ識部分〔例えば、酵素基質、補欠分子族、酵素
モジュレータ−または酵素（蛋白質であって、上述のよ
うな免疫原性担体に同様にカップリングすること力監で
きる）〕は誘導体とカップリングすること力（でき、標
識複合体を生成する。

特に好ましい標識複合体は、式 で示されるβ−ガラクトシルウンベリフェロン標識複合
体である。上記式中、Ｑ、Ｗ”、Ｗ”およびｎは前記の
とおシであシ、そして（Ｃｏ）βＧＵは、式で示される
。この複合体は、分析対象物の適切々アミン誘導体とβ
−ガラクトシルウンベリフェロンカルボン酸〔米国特許
第４，２２６，９７８号〕との標準的なペプチド縮合に
よシ合成される＠もう一つの好ましい標識複合体は、フ
ラピンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）でＳ識したも
のであシ、このＦＡＤは、二官能性試薬を用い九アミノ
ＦＡＤ　！！誘導体米国特許第４，２１３，８９３号参
照〕またはカルボキシル誘導体と適切なアミノ誘導体中
）（式中、ｚ＝ＮＨりとのペプチド縮合によシ合成する
ことができる。得られたＦＡＤ複合体は、アポ酵素活性
化免疫試験法（ＡｌＩ３−米国特許第用である。

本発明の試薬系または手゛段は、本発明が包含する所望
の免疫試験を実施する上で必要なすべての本質的な化学
的要素を包含する。この試薬系は、試験装置の中で試薬
を奸存させることが許容される組成物もしくは混合物と
して、わるいは試験キット、即ち必要な試薬が収容され
た１個以上の容器が−まとめにされた組み合わせとして
、市販の包装形態で提供される。試薬系には、所望の結
合反応系（例えば、抗体および本発明の標識複合体）に
適した試薬が含まれる。勿論、試薬系には、従来公知の
他の物質が含まれていてもよく、この物質としては、商
業的および利用者の立場から、例えば緩衝液、希釈剤、
標準物質等であることが望ましい。特に好ましくは、本
発明の均一競合結合免疫試験用の試験キットであるが、
これは（ａ）本発明の抗分析対象物抗体および（ｂ）抗
体と結合すると検出可能な特性が変化する標識分析対象
物複合体から成る。好ましくは、また、本発明の抗分析
対象物抗体を含む試薬組成物、抗体と結合する２検出可
能な特性が変化する標識分析対象物複合法および試薬組
成物を包含した固形担体から成る試験装置である。かか
る試験装置の様々な形態は、１９８０年１０月３０日に
提出され、通常のとおりに譲渡された米国特許出願筒２
”０２，３７８号に記載されておシ、これは本明細書中
に参考事項として掲げられているが、欧州特許出願筒５
１，２１３号として公開された。好ましい試験キットお
よび試験装置に用いられる特異的な標識物は、前記のよ
うな試験法に応じて定められる。

本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例
によシ限定されるものではない。

〔発明の実施例〕

試薬 化学名の後に記載した数字は、前記本文および／または
図に示した構造式に関するものである。

Ａ、薬物誘導体　Ｎ−（２−（３−アミノプロポキシメ
チル）−６−メチルフェニル）　−２１−ジエチルアミ
ノアセトアミド（７）　（Ｗ”＝Ｗ”＝エチル。

Ｑ−水素）の合成 ３−ヒドロキシメチル−２−二トロトルエン（１）〔ア
ルドリツヒ・ケミカル社（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅ−ｍ
ｉｅａｌ　Ｃｏ、、　）、ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａ
ｕｋｅｅ　）、ウイス＝ｒ７シｙ　（Ｗｌ　）　：ｌ　
１０　ｔ　（６０ｍＭｇ）とアクリロニトリル７、９　
ｍｌの混合液をアルゴンガス中、室温で攪拌した。カリ
ウムｔａｒｔ−ブトキシド（１０ｖ）を加え、９０分後
に更に１０′ＩＩｆ加えた。

合計３時間経過後、酢酸０．２−を添加するととＫよシ
反応を抑制した。揮発性物質を減圧下で除去し、残渣を
クロマトグラフィーに付して塩化メチレン（ＣＨ，Ｃｔ
、）で溶出した。約１７−の両分を集めた。分画１５５
〜２００を合わせ、溶剤を留去して、３−（２−シアノ
エトキシメチル）−２−二トロトルエン（２）　１２．
５　ｆ　（収率９０％）を透明な油状物として得た。

”）！ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣ１，）　：δ７．３８
（ｍ、３Ｈ，芳香ＩＩ　）　：　４．６０（ｓ　＋　２
Ｈ，ＯＣ馬）　：　３．６６（ｔｒＪ＝６　ＨＭ　Ｈ２
ＨＨＣ％　）　：　２−’６０　（’　ｒ　Ｊ”　６　
Ｈｇ　Ｔ２Ｈ，ＣＨｌ）：　２．３０（ｓ、３Ｈ，Ｃ％
　う。

赤外線スペクトル（ｎｅａｔ）　：　２３６０５＋　（
ＣＮ）。

ニトロ化合物（２）　１２　ｔ　（５５ｄ　）の氷酢酸
１４０−の溶液を二酸化白金（ｐｔｏ、）　ｓ　ｓ　ｏ
岬と混合し５　Ｑ　ｐａｌ　（３，４ａｉｍ　）の水素
雰囲気中室温で６時間振盪した。次に、それをろ過して
触媒を除去し更に溶媒を減圧下で留去した。残渣をｎ−
ブタノール１００ｓｄに溶解させて、溶液を５０−の飽
和ＮａＨＣＯｍ水溶液で２回洗浄した。洗浄水を合わせ
、７５ｇＩｔのｎ−ブタノールで２回抽出した。合わせ
たブタノール抽出液を一つにし、無本硫酸ナトリウム（
Ｎ〜８０４）上で乾燥して、留去した。油状物残渣を、
吸着剤としてシリカゲルを用い４：１０：１（ｖ／ｖ／
Ｙ）のクロロホルム（ＣＨｃｌｍ　）、メタノール、濃
水酸化アンモニウムで溶出させて、液体クロマトグラフ
ィーにより精製した。これにより、２−（３−アミノプ
ロポキシメチル）−ａ−メチル−アニリン（３）　３．
１５　ｆ　（収率３０チ）が油状物として得られた。

’ＨＮＭＲ，ｙ、ベクトル（ｄ、ＤＭＳＯ）：δ７．０
−６−４　（ｍ、　３Ｈ。

芳香ｉ）　：　４．４０（ｓ、２Ｈ，０ＣＨＩ）：　３
．４５（ｔ、２Ｈ，Ｊ＝６ＨＥ、　ＯＣＨ，）：　２．
６２（Ｌ　。

２１Ｌ　Ｊｘ７Ｈｚ、　Ｃ％　）　：　Ｌｌ　（ｓ、　
３Ｈ，ＣＨ，）：　１．６０　（ｔ　ｗ　２Ｈｗ　Ｊ＝
６Ｈｚ、　ＣＥｉｌｌ　）。

質量スペクトル（Ｆ！　ｌ　）　：　ｍ／＊　１９４　
（Ｍ”　’］ジクロロルム（ＣＨＣ／、、）　１２５　
ｄ中のジアミン（３）　７．３　ｆ　（３８ｍｂｏｔ）
の溶液に、り’ｏｎホＪ／Ａ２５ｗｊ中の炭酸ジｔｅｒ
ｔ−ブチル＆　２８　ｆ　（０，３８ｍ　Ｎｏｔ　）の
溶液を加えた。アルゴンガス中室温で４５分間攪拌して
反応を続け、次に減圧下で濃縮させて、２−（３−４ａ
ｒｔ−プチルオキシカルボニルアミノプロボキシメチル
）−６−メチルアニリン（４）　１１．８　ｆ　（収率
１００チ）をオレンジ色の油状物として得た。

’ＨＮＭＬＸペクトｋ　（ＣＤＣＬｓ　）　：δ７．２
−６．８（ｔｎ、　３Ｈ。

芳香環）　：　４．５３　（ｓ、　２　Ｉ（、ＯＣＨ，
）；３．４８（ｔ、　２Ｈ，、ｙ＝ａｕｇ、　ＣＨ，）
　：　３．１７（ｔ、　２Ｈ。

Ｊ＝７Ｈ１，ＣＭ、　）：１．１７（８，３Ｈ，ＣＨ３
）：１７５（Ｌ、２にＣＨ，）　：　１．５０（Ｍ、　
９Ｈ。

Ｃ，Ｈ，）。

質量スペクトル（Ｅｌ）：　ｍ／ｓ　２９４（Ｂ／）こ
の油状物はそれ身重精製しなかった。それを１、７５　
Ｍ酢酸す）　＋７ウム水溶液６ｏ−および酢酸４６−と
混合した。混合液を１０℃に冷却し、ブｔｆｆ％アセチ
ルクロリド６．２２９　（４４ｍＭｏＡ、）を２分間に
わたり滴下混合した。更に５分後、酸クロリド３．１　
ｆ　（２２ｍ　Ｍｏｔ）を添加し、３０分間継続して攪
拌した。反応混合物をクロロホルム３５０−で希釈し、
これを１５０−の水で１回、更に２００−の飽和ＮａＨ
ＣＯ３溶液で２回洗浄した。

有機相を分離し、無水硫酸す）　ＩＪウム上で乾燥させ
、ろ過し、濃縮して、ブロモ化合物（５）　ｌ　３．２
．　ｆ（収率８４チ）を粘稠性のオレンジ色油状物とし
て得た。それを９５−のトルエンに溶解し、ジエチルア
ミン７．０　ｆ　（９６ｍｏｏｔ）を加えた。室温で１
８時間攪拌した後、混合液をろ過し、５０５７の水で洗
浄した。有機相を無水硫酸す）　ＩＪウム上で乾燥し、
ろ過して留去した。残渣を、吸着剤としてシリカゲルを
用い、９　：　１　（ｖ／ｖ）のＣＨＣ４：アセトンで
溶出させて、液体クロマトグラフィーにより精製した。

これＫより、Ｎ−（２−（３−ｔｅｒｔ−プチルオキシ
カルボニルアミノプロボキシメテル）−６−メチルフェ
ニルシー２／−ジエチルアミノアセトアミド（ｓ）　（
ｖｔ’＝　ｗ”−エテル、Ｑ＝：Ｈ）　６　ｆ　（（３
）以後の全収率３９チ〕を黄色油状物として得た。

”ＨＮＭＲｘペクト＃　（ｃｏｃｔ３）　：δ７．２０
　（ｓ、　３Ｋ　芳香環）　：４．４７（ａ、　２Ｈ，
ＣＨ，）：ａ、５ｏ（ｓ。

２Ｈ，ＣＨ，）：３．２３（８，２Ｈ，ＣＨ，）：３．
２０（ｔ、　２Ｈ，ＣＨ，）：２．７０（Ｑ、　ｔｙ＝
ｓａｘ、　４Ｈ。

２ＣＨ，）：２．２６（ａ、　３Ｈ，ＣＨ，）：１．４
０（ｇ。

９Ｈ，Ｃ，Ｈ，）　：１．１７（ｔ、　Ｊ＝８Ｈ露、　
６Ｈ，２ＣＨ，）。

質量スペクトル（Ｃｔ）：　ｍ／ｅ　４０８［ＭＨ”：
１カルバメート（６）を１１５−の１Ｎ塩酸１１５−と
室温で２．５時間攪拌した。反応混合物を次に減圧下で
濃縮し、残渣をシリカゲル３２５ｔのクロマトグラフィ
ーに付し、ｓｏ、：　１０　：　１　（ｖ／マ／ｖ）の
クロロホルム：メタノール濃水酸化アンモニウムで溶出
させた。２ｏ−の両分を集めた。　分画７３〜１４５を
一つにして溶媒を除去した。残渣を塩酸・２−プロパツ
ール（３，９Ｍ　）に溶解し、蒸発乾固することにより
、塩酸塩とした。これに・よシ、高真空中で５８℃にて
乾燥後、薬物誘導体（７）（ｗｌ＝Ｗ２＝エチル基、Ｑ
＝Ｈ）　３．３　ｆ　（収＄５９チ）をハイドロスコピ
ック粉（ｈｙｄｒｏｓｅｏｐｉｅ　ｐｏｗ−ａｅｒ　）
として得た。

計算値：　Ｃ，？Ｈ，，Ｃ４Ｎ、Ｏ，：　Ｃ，５３，６
８：Ｈ，８，２２；Ｎ、１１．０５実測値：　Ｃ，５３
，８５：Ｈ，８，３５：Ｎ、　１０．８３質量スペクト
ル（Ｃ２）：　ｍ／ｅ　３０Ｂ（Ｍ＋１）Ｂ、免疫原お
よび抗体の調製 ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）２３０Ｗを蒸留水３６−
に溶解させて溶液を調製した。これに前記Ａで得たアミ
ノ官能基化リドカイン誘導体３７９岬を加え、−を０．
１Ｎ塩酸で４．８まで下げた。この溶液を冷却し、固体
状の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミド塩酸塩を加えながら攪拌した。−を０．
１　Ｎ塩酸で４．８に調整し、反応混合物を０℃で１時
間攪拌した。

−をまず０．１Ｎ水酸化ナトリウムで、次いで０．０２
Ｎ水酸化す）　ＩＪウムで注意深（６，Ｏ４で高めてお
いてから、溶液を３時間０℃に保ち、次に冷蔵庫（４℃
）内で二晩放置した。体積が約４０−の溶液を室温に戻
し％０−２Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣ２）で平衡化させ
た０、０５ｚＸ２６３のセファデックス（３ａｐｈａｄ
ｓｚ）　Ｇ　−２５（：ファルマシア（Ｐｈ　ａ　ｒｍ
ａ　ｃ　ｉ　ａ　）。

ビスキャットアウェイ（ｐｉｓｏａｔａｗａｙ）、ニュ
ーシャーシー（ＮＪ）Ｅカラムに加えた。このカラムを
０．２Ｍ塩化す）　ＩＪウムｌｔｄ／ｍの流量で溶出さ
せ、１５−容量の両分を集めた。分画１６〜２２を一つ
にして、ローリ−（Ｌｏｗｒｙ　）法〔ローリ−（Ｌｏ
ｗｒｙ）等、ジエイ、パイオル、ケム（ＪＪｌｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、）第１９３巻、第２６５頁（１９５１年）〕
の測定によると２６２岬の回収された蛋白質を得た。

各蛋白質分子に結合したりドヵインハプテンの平均数（
エピトープ密度）を、蛋白質上の未反応カルボキシル基
の滴定にょ請求めると、１８であることが判明した。

リドカイン免疫原を０．８ミクロンの膜フィルターによ
すろ過し、０．２Ｍ塩化ナトリウムで１．０　Ｗ／−ま
で希釈した。６−の免疫源（ｌダ／−）を７０インド（
Ｆｒｕａｎｄａ　）の完全アジュバント１２−および食
塩水６−と混合した。２−のこの混合液で各々同時にウ
サギを免疫し喪。３週間後、それらを不完全フロインド
アジュバントで調製した同様の混合液によシ再免疫した
。ブースター（ｂｏｏ−ｓｔｅｒ　）免疫を４週間毎に
繰り返した。試験採血をブースター免疫から一週間後に
行った。適当な力価を有する抗血清を最初の免疫から３
か刃稜に得た〇 Ｃ１標Ｉｉｉ＆複合体の調製 ７−β−ガラクトシルクマリン−３−カルボン酸〔ブル
ト（Ｂｕｒｄ）等、クリニ、ケム（Ｃｌ１ｎ。

Ｃｈｅｍ、）第２３巻、第１４０２頁（１９７７年）〕
１７６４（０，４４ｍＭｏｔ）およびトリエチルアミン
４４４（０，４４ｍＭｏｔ）を含む０℃の乾燥ジメチル
ホルムアミド５−溶液に、インブチルクロロホルメート
６０■を加えた。この温度で１５分間攪拌した後、反応
混合物を、本実施例Ａの薬物誘導体の二塩酸塩１４０ｗ
ｙ（０，３７ｍＭｏＡ）およびトリエチルアミン５−を
含む乾燥ジメチルホルムアミド５−の溶液と混合した。

更に４５分間攪拌した後、溶媒を真空ポンプに取付けら
れた回転式蒸発装曾て除去した。残渣をシリカゲル７５
ｆのクロマトクラフィーに付し、無水エタノールテ溶出
して、約１７−の両分を集めた。分画１５〜３゜を一つ
にし、溶媒を除去した。この残渣をセファデックス（５
ｅｐｈａｄｅｘ）　ＬＨ−２０（７アルマシア（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ）　）　（２，５Ｘ　５４　ｃｍ　）のク
ロマトグラフィーに再度付し、メタノールで溶出した。

これにより、１０８■（収率４４チ）の複合体がクリー
ム色のガラス状固体物として得られた。

計算値　Ｃ３１１Ｈ４３Ｎ３０＋１　：Ｃ，６０，２７
：　Ｈ，６，５４；　Ｎ、　６．３９実測値：　Ｃ，６
０，０７：Ｈ，６，７０：Ｎ、　６．１５質量スペクト
ル（ＦＡＢ）：　ｍ／ｅ　６５８（Ｍ＋１：］免疫試験
法 リドカイン用の均一基質標識螢光免疫試験法〔５ＬＦＬ
Ａ−米国特許第４，２７９，９９２号〕を以下のとおり
確立した。

Ａ、試薬 １、　抗体／酵素試薬−５０ｍＭのバイシン（Ｂｌｅｉ
ｎａ）緩衝液ＣＮ、Ｎ−ビス（２−ヒドロキシルエチル
）グリシン、カルビオケム、ベーリング社（Ｃａｌｂｉ
ｏ−ｏｈｅｍ　−Ｂａｈｒｉｎｇ　（：ｏｒｐ、）、ラ
ジョラ（ＬａＪｏｌｌｍ）、カリフォルニア（ＣＡ）〕
、−８３、β−ガラクトシダーゼ０．１０単位／−含有
、抗血清が存在しない場合に螢光を２０チにまで減少さ
せる本実施例Ｂの十分量の抗血清、および１５．４ｍＭ
のアジ化ナトリウム ２、複合体試薬−３０ｍＭのギ酸エステル緩衝液、ｆ＃
＋３．５、オヨび本実施例ｃ　ｔｖｓ臓複合体０．０１
０Ａ１．ｌ　（３４３ｎ　ｍでの吸光度単位）単位３　
リドカイン標準物質−通常の人間の症清に加えられたＵ
ＳＰ参照基準のりドナイン：５０ｍＭバイシン緩衝液で
５１倍希釈、１５．４ｍＭのアジ化ナトリウム含有 Ｂ、リドカイン抗血清によるβ−ＧＵ−リドカインの加
水分解の抑制 抗血清を徐々に、β−ガラクトシダーゼ０．１０単位／
−を含むバイシン緩衝液１．５−に加えた。

各キュベツトに、混合しながら、複合体試薬５Ｏμｔを
加えて反応を開始しえ。　２０分後、螢光強度を各キュ
ベツト毎に測定した（励起４００ｎｍ。

放出４５０ｎｍ）。結果を以下に示した。

抗血清（μｔ）　螢光 ０　８．５９ １　４．８４ ２　２．０２ ４　１．０９ ７　０．９３ １０　０．９５ Ｃ６リドカイン分析法および結果 キュベツト中の抗体／酵素試薬１．５−に希釈されたり
ドカイン標準物質５０１ｔｔを加えた。次に反応を開始
させるために、複合体試薬を各キュベツトに混合しなが
ら加えた。２０分後、螢光強度を各キュベツト毎に測定
した（励起４００ｎｍ、放出４５０ｎｍ）。

分析の実行により以下の結果が得られた。

リドカイン（μｆ／ｍ　）　螢　光 ０　２．４９ １　２．９６ ４　４．７４ ８　７．１１ １２　８．４７ かくして、免疫試験法は、血清試料中のりドカイン濃度
を測定するのに使用することができる。

勿論、本発明の性質およびその範囲から逸脱することな
く、上述した本発明に多くの他の修正および変更を加え
ることができる。

【図面の簡単な説明】

図は本発明で用いられるリドカインおよびその類縁体の
芳香環メチル銹導体を合成するための特定の合成経路を
表わす。 第１頁の続き ＠Ｉｎｔ、ＣＩ、’　識別記号　庁内整理−百０発　明
　者　ジョン・エフ・バード　アメリカ合算ビュー、サ
イ ８ ０発　明　者　ステファン・ジー・ト　アメリカ合捺ン
プソン　マンチェスタ ：国、カリフォルニア　９４０４３％マウンテン・プラ
ス・ポイント・ドライブ５０５　ナンバー国、インヂア
ナ　４６６１５．プラス・ベンド、一番ドライブ　５２
２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）式 （式中、Ｑは水素もしくは低級アルキル基であシ；−お
   よびＷ２は、同一であっても異なっていてもよく、水素
   もしくは低級アルキル基から選択される） で示され、免疫原性担体物質に化学結合した１個以上の
   残基から成ることを特徴とする免疫原性化合物。 （２）担体物質が蛋白質もしくはポリペプチドである特
   許請求の範囲第１項記載の免疫原。 （３）前記の１個以上の残基が、水素を除外して１〜２
   ０個の原子から成る鎖により前記担体物質に共有結合し
   ている特許請求の範囲第１項記載の免疫原。 （４）Ｑが水素であシ、ＷｌおよびＷ！がともにエチル
   基である特許請求の範囲第１項記載の免疫原。 （５）平均して約５０個未満の、前記担体物質に結合し
   た残基がある特許請求の範囲第１項記載の免疫原。 （６）式 （式中、Ｑは水素もしくは低級アルキル基であｆｉ、ｗ
   ”およびｗ２は同一であっても異なっていてもよく、水
   素および低級アルキル基から選択され、ｎは１〜１ｏの
   整数であり、Ｒ″は連結基であり、ｐは平均して１乃至
   担体（Ｃａｒｒｉｅｒ）上のカップリング可能な部位の
   数であり、そしてＣａｒｒｉｅｒは免疫原性担体物質で
   ある）で示される免疫原性化合物。 （７）　Ｒ”が、水素を除外して１〜２０個の原子を有
   する鎖から成る連結基である特許請求の範囲第６項記載
   の免疫原。 （８）前記担体物質が蛋白質もしくはポリペプチドであ
   る特許請求の範囲第６項記載の免疫原。 （９）　Ｒ’が、前記担体物質上のアミノもしくはカル
   ボキシル基によりカップリングしているアミド基である
   特許請求の範囲第８項記載の免疫原。 （１０）　Ｑが水素であり、ＷｌおよびＷ８がともにエ
   チル基である特許請求の範囲第６項記載の免疫原。 （ｎ）　ｖｒが３である特許請求の範囲第６項記載の免
   疫原。 （１２）　ｐが５０未満である特許請求の範囲第６項記
   載の免疫原。 （１３）％許請求の範囲第１項記載の免疫原に対して調
   製された抗体。 （１４）％許請求の範囲第６項記載の免疫原に対して調
   整された抗体。 （１５）　％許請求の範囲第９項記載の免疫ｆｆ１Ｋ対
   して調整された抗体。 （１６）免疫試験法によりリドカインを測定する試薬系
   において、Ｑが水素であって、ＷｌおよびＷ！がともに
   エテル基である特許請求の範囲第１３項記載の抗体をリ
   ドカインの抗体として使用することを特徴とする試薬系
   。