CN109030814A - 一种雌二醇酶结合物的制备方法 - Google Patents

一种雌二醇酶结合物的制备方法 Download PDF

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张玲
胡洁
黄伟
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Abstract

本发明涉及一种雌二醇酶结合物的制备方法。该方法采用雌二醇衍生物（E2‑NHS）直接与酶进行交联结合而成，不需要额外添加活化剂和偶联剂。所述雌二醇衍生物为N‑羟基琥珀酰亚胺(NHS)和雌二醇的化学合成物质，或N‑磺酸化羟基琥珀酰亚胺(Sulfo‑NHS)和雌二醇的化学合成物质。该方法操作简单，成本低廉，稳定性好。

Description

一种雌二醇酶结合物的制备方法
技术领域
本发明涉及一种应用于化学发光免疫分析技术中的雌二醇酶结合物的制备方法。
技术背景
雌二醇（E2）是育龄妇女体内卵巢或者黄体分泌的雌激素，由卵巢或前列腺分泌后，经血流和组织液转运到靶组织（子宫、输卵管、阴道、垂体等），能与血浆蛋白高度结合，在雌激素反应组织内能与特异性受体蛋白结合形成有活性的复合物，维持第二性征和调控副性器官的功能。
雌二醇（E2）在血液中的浓度主要受下丘脑-垂体-性腺轴调节控制，呈周期性波动规律。雌二醇浓度过高或过低都会导致生殖及内分泌系统紊乱，从而引发多种疾病，例如幼女性早熟、月经紊乱、不孕不育、异位妊娠等，因此准确地测定血液中雌二醇浓度对于疾病的诊断和治疗具有十分重要的临床意义。
用于体内雌二醇测定的主要方法有放射免疫分析法、酶联免疫吸附分析法、化学发光免疫分析法等。 目前常用的放射免疫分析法（RIA）是用I125标记雌二醇半抗原来实现的，其合成工艺复杂，有效期短，对环境有一定污染，影响检测结果的因素较多。近几年来，化学发光免疫分析技术发展迅速，灵敏度、特异性以及自动化程度均达到或超过了RIA水平，特别是标记物的稳定性和不污染环境是RIA法无法比拟的。
目前各大中型医院均进口了全自动化学发光免疫分析系统，但是仪器和试剂价格昂贵，试剂盒中酶标记物合成工艺是国外厂家高度保密的专利技术。
国内厂家酶联免疫吸附分析法（ELISA）试剂盒以及化学发光免疫分析法（CLIA）试剂盒主要采用的雌二醇半抗原酶结合物作为标记物，其中雌二醇半抗原为雌二醇衍生物（E2-6-CMO）与牛血清白蛋白（BSA）的结合物（E2-6-CMO-BSA）或鸡卵清白蛋白（OVA）的结合物（E2-6-CMO-OVA），此种酶结合物生产工艺复杂，成本较高，容易产生空间位阻影响雌二醇特异性抗体的结合。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明公开了一种操作简单、成本低廉、稳定性好的雌二醇酶结合物，该酶结合物是化学发光免疫分析法检测雌二醇试剂盒的关键组分。
一种雌二醇酶结合物的制备方法，其特征在于，所述雌二醇酶结合物是由雌二醇衍生物（E2-NHS）与酶发生偶联反应生成，该反应不需要额外添加活化剂和偶联剂。
优选地，所述雌二醇衍生物为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 和雌二醇的化学合成物质，化学结构式为：
优选地，所述雌二醇衍生物为或N-磺酸化羟基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)和雌二醇的化学合成物质，化学结构式为：
优选地，所述雌二醇衍生物的合成方法如下：
S1、雌二醇二醋酸酯的制备：取雌二醇于无水吡啶、乙酸酐中，在油浴中回流2小时，冷却至室温后，冰浴降温2小时有结晶析出，用乙醇重结晶，得到白色片状结晶的雌二醇二醋酸酯。
S2、雌二醇二醋酸酯-6-酮的制备：取步骤S1得到的雌二醇二醋酸酯于冰醋酸中，加入CrO3，于37℃水浴反应4小时，加入蒸馏水，用乙醚萃取，醚相用饱和碳酸氢钠溶液洗涤至红色出现后，用蒸馏水洗涤至中性，加入硫酸镁干燥，得到黄色油状物，用乙酸乙酯：正已烷（1:4）溶解黄色油状物后,过色谱柱收集雌二醇二醋酸酯-6-酮的洗脱液，浓缩后，用无水乙醇重结晶，得到白色针状结晶的雌二醇二醋酸酯-6-酮。
S3、6-酮-雌二醇的制备：取雌二醇二醋酸酯-6-酮溶解于氢氧化钠-甲醇溶液中，室温静置，加入蒸馏水，用稀盐酸调节PH至3.0左右,用无水乙醇重结晶得6-酮-雌二醇。
S4、雌二醇-6-肟的制备：取6-酮-雌二醇溶解于甲醇溶液中，加入羧甲基羟胺半盐酸盐和醋酸钠溶液，37℃水浴反应8小时，冰浴降温4小时，析出针状结晶过滤，滤液用氢氧化钠溶液调整PH至8.5左右，用乙酸乙酯萃取；剩余滤液盐酸溶液调整PH至3.0左右用乙酸乙酯萃取；合并乙酸乙酯并减压蒸干，用丙酮-正已烷重结晶，得到雌二醇-6-肟。
S5、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与雌二醇合成物的制备：取雌二醇-6-肟溶解于2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液中，加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，避光条件下2～8℃反应12h，过色谱柱收集N-羟基琥珀酰亚胺与雌二醇合成物的洗脱液，浓缩后，用无水乙醇重结晶，得到白色针状结晶N-羟基琥珀酰亚胺与雌二醇合成物。
优选地，所述酶包括碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖氧化酶和苹果酸脱氢酶中的一种，优选为碱性磷酸酶。
优选地，将雌二醇衍生物与酶加入到缓冲液中，然后进行避光反应，再除去未反应完全的雌二醇衍生物，即得到雌二醇酶结合物。
优选地，将雌二醇衍生物与酶按一定比例加入到缓冲液中，所述雌二醇衍生物与酶的质量比为1:5～1:200，优选为1:20～1:150，最优选为1:50～1:100。
优选地，所述缓冲液为EDTA 缓冲液、EGTA 缓冲液、碳酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲系统、磷酸盐缓冲系统、醋酸盐缓冲系统、SSC 缓冲系统、SSPE 缓冲系统、2-(N-吗啉代) 乙磺酸(MES) 缓冲系统、哌嗪-N，N’双(2-乙磺酸)(PIPES) 缓冲系统中的一种或多种，优选为碳酸盐缓冲液；所述缓冲液PH值范围为7.0～10.0,优选的为8.0～9.0。
优选地，所述避光反应温度为4℃～37℃，避光反应时间为0.5～24小时。
优选地，所述除去未反应完全的雌二醇衍生物的方法有超滤法、透析法、脱盐柱法，加入保护剂，得到睾酮酶结合物，所述保护剂优选为甘油。
本发明采用新的制备方法合成雌二醇酶结合物，并应用于化学发光免疫定量检测中，具有灵敏度高、特异性好、自动化程度高、标记物更加稳定、不污染环境的优点。本发明雌二醇酶结合物是由雌二醇衍生物（E2-NHS）与酶发生偶联反应生成，该反应不需要额外添加活化剂和偶联剂。本发明方法合成的雌二醇酶结合物与国外同类型产品应用于化学发光免疫分析试剂盒中，信燥比和稳定性测试结果很接近，达到优良结果，本发明的雌二醇酶结合物制备方法具有很好的适用性和先进性，具有生产工艺简单、成本较低的优点，不会产生空间位阻影响雌二醇特异性抗体的结合。
附图说明
图1为一种雌二醇衍生物的合成方法的结构示意图。
具体实施方式
下面结合实例进一步说明本发明，本发明的优点和特点将被描述的更清楚。但是，应该可以理解，本实例仅仅是本发明的一种范例，并不会对本发明的范围做任何限制。
实施例1
将100ug碱性磷酸酶加入1mL10mM 碳酸钠缓冲液(pH8.0) 中，加入1ug雌二醇衍生物（E2-NHS），进行避光反应，避光反应的温度为37℃，避光反应的时间4小时，然后用用ProteinG亲和柱(GE公司) 纯化酶标抗体，得到雌二醇酶结合物。
需要说明的是，所述雌二醇衍生物与碱性磷酸酶加入到碳酸钠缓冲液中是不分先后顺序的，也可以先将1ug雌二醇衍生物加入1mL10mM 碳酸钠缓冲液(pH8.0) 中，再加入100ug碱性磷酸酶；或者将1ug雌二醇衍生物与100ug碱性磷酸酶同时加入到碳酸钠缓冲液(pH8.0) 中。所述雌二醇衍生物与碱性磷酸酶的比例可以根据情况进行调整，所述雌二醇衍生物与碱性磷酸酶的比例（质量比）为1:5～1:200，优选的1:20～1:150，最优选的为1:50～1:100。
所述碱性磷酸酶也可以用辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖氧化酶和苹果酸脱氢酶中的任一种代替，所述碳酸钠缓冲液可以用EDTA 缓冲液、EGTA 缓冲液、柠檬酸盐缓冲系统、磷酸盐缓冲系统、醋酸盐缓冲系统、SSC 缓冲系统、SSPE 缓冲系统、2-(N-吗啉代) 乙磺酸(MES) 缓冲系统、哌嗪-N，N’双(2-乙磺酸)(PIPES)缓冲系统中的任一种代替。所述缓冲液PH值范围为7.0～10.0,优选的为8.0～9.0。
所述雌二醇衍生物为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 和雌二醇的化学合成物质，化学结构式为：
或者所述雌二醇衍生物为或N-磺酸化羟基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)和雌二醇的化学合成物质，化学结构式为：
作为优选方案，所述雌二醇衍生物的合成方法如下（如图1所示）：
S1、雌二醇二醋酸酯的制备：取雌二醇加入到无水吡啶、乙酸酐中，在油浴中回流2小时，冷却至室温后，冰浴降温2小时有结晶析出，用乙醇重结晶，得到白色片状结晶的雌二醇二醋酸酯。
S2、雌二醇二醋酸酯-6-酮的制备：取步骤S1得到的雌二醇二醋酸酯于冰醋酸中，加入CrO3，于37℃水浴反应4小时，加入蒸馏水，用乙醚萃取，醚相用饱和碳酸氢钠溶液洗涤至红色出现后，用蒸馏水洗涤至中性，加入硫酸镁干燥，得到黄色油状物，用乙酸乙酯：正已烷（1:4）溶解黄色油状物后,过色谱柱收集雌二醇二醋酸酯-6-酮的洗脱液，浓缩后，用无水乙醇重结晶，得到白色针状结晶的雌二醇二醋酸酯-6-酮。
S3、6-酮-雌二醇的制备：取雌二醇二醋酸酯-6-酮溶解于氢氧化钠-甲醇溶液中，室温静置，加入蒸馏水，用稀盐酸调节PH至3.0左右,用无水乙醇重结晶得6-酮-雌二醇。
S4、雌二醇-6-肟的制备：取6-酮-雌二醇溶解于甲醇溶液中，加入羧甲基羟胺半盐酸盐和醋酸钠溶液，37℃水浴反应8小时，冰浴降温4小时，析出针状结晶过滤，滤液用氢氧化钠溶液调整PH至8.5左右，用乙酸乙酯萃取；剩余滤液盐酸溶液调整PH至3.0左右用乙酸乙酯萃取；合并乙酸乙酯并减压蒸干，用丙酮-正已烷重结晶，得到雌二醇-6-肟。
S5、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与雌二醇合成物的制备：取雌二醇-6-肟溶解于2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液中，加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，避光条件下2～8℃反应12h，过色谱柱收集N-羟基琥珀酰亚胺与雌二醇合成物的洗脱液，浓缩后，用无水乙醇重结晶，得到白色针状结晶N-羟基琥珀酰亚胺与雌二醇合成物。
实施例2
将50ug辣根过氧化物酶加入1mL10mM 碳酸钠缓冲液中，加入1ug雌二醇衍生物（E2-NHS），进行避光反应，避光反应的温度4℃，反应24小时后，用15mL 30KD截留分子量的超滤管(Millipore 公司)，超滤纯化酶结合物，得到雌二醇酶结合物。
需要说明的是，所述雌二醇衍生物与辣根过氧化物酶加入到碳酸钠缓冲液中是不分先后顺序的，也可以先将1ug雌二醇衍生物加入1mL10mM 碳酸钠缓冲液中，再加入100ug辣根过氧化物酶；或者将1ug雌二醇衍生物与100ug辣根过氧化物酶同时加入到碳酸钠缓冲液中。所述雌二醇衍生物与辣根过氧化物酶的比例可以根据情况进行调整，所述雌二醇衍生物与辣根过氧化物酶的比例（质量比）为1:5～1:200，优选的1:20～1:150，最优选的为1:50～1:100。
所述辣根过氧化物酶也可以用碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖氧化酶和苹果酸脱氢酶中的任一种代替。所述缓冲液可以采用其它缓冲液，如EDTA 缓冲液、EGTA 缓冲液、柠檬酸盐缓冲系统、磷酸盐缓冲系统、醋酸盐缓冲系统、SSC缓冲系统、SSPE 缓冲系统、2-(N-吗啉代) 乙磺酸(MES) 缓冲系统、哌嗪-N，N’双(2-乙磺酸)(PIPES) 缓冲系统。所述缓冲液PH值范围为7.0～10.0,优选的为8.0～9.0。
所述雌二醇衍生物为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 和雌二醇的化学合成物质，化学结构式为：
或者所述雌二醇衍生物为或N-磺酸化羟基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)和雌二醇的化学合成物质，化学结构式为：
作为优选方案，所述雌二醇衍生物的合成方法如下：
S1、雌二醇二醋酸酯的制备：取雌二醇（采购自Sigma公司）7.5g于200mL无水吡啶、50mL乙酸酐中，在油浴中回流2小时，冷却至室温后，冰浴降温2小时有结晶析出，用乙醇重结晶，得到白色片状结晶雌二醇二醋酸酯9.0g。
S2、雌二醇二醋酸酯-6-酮的制备：取8g雌二醇二醋酸酯于30mL冰醋酸中，加入CrO33.5g，于37℃水浴反应4小时，加入200mL蒸馏水，用乙醚萃取（300mL×4），醚相用饱和碳酸氢钠溶液洗涤至红色出现后，用蒸馏水洗涤至中性，加入硫酸镁3.0g干燥，得到黄色油状物5.6g，用乙酸乙酯：正已烷（1:4）溶解黄色油状物后,过色谱柱收集雌二醇二醋酸酯-6-酮的洗脱液，浓缩后，用无水乙醇重结晶，得到白色针状结晶1.5g。
S3、6-酮-雌二醇的制备：取0.9g雌二醇二醋酸酯-6-酮溶解于30mL20%（W/V）氢氧化钠-甲醇溶液中，室温静置12小时，加入蒸馏水50mL，用稀盐酸调节PH至3.0左右,用无水乙醇重结晶得6-酮-雌二醇0.5g。
S4、雌二醇-6-肟的制备：取0.4g 6-酮-雌二醇溶解于20mL甲醇溶液中，加入0.25g羧甲基羟胺半盐酸盐和1mol/L的醋酸钠溶液10mL，37℃水浴反应8小时，冰浴降温4小时，析出针状结晶过滤，滤液用1mol/L氢氧化钠溶液调整PH至8.5左右，用乙酸乙酯萃取（100mL×3）；剩余滤液盐酸溶液调整PH至3.0左右用乙酸乙酯萃取（100mL×3）；合并乙酸乙酯并减压蒸干，用丙酮-正已烷重结晶，得到200mg的雌二醇-6-肟。
S5、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与雌二醇合成物的制备：取100mg的雌二醇-6-肟溶解于50mM 2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液（PH4.0）中，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)50mg和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)50mg，避光条件下2～8℃反应12h，过色谱柱收集N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与雌二醇合成物的洗脱液，浓缩后，用无水乙醇重结晶，得到白色针状结晶N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与雌二醇合成物56mg。
实施例3
将100ug葡萄糖-6-磷酸脱氢酶加入1mL10mM 柠檬酸盐缓冲液(pH8.0) 中，加入1ug雌二醇衍生物（E2-NHS），进行避光反应，避光反应的温度为25℃，反应8小时后，用用ProteinG亲和柱(GE公司) 纯化酶标抗体，得到雌二醇酶结合物。
需要说明的是，所述雌二醇衍生物与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶加入到碳酸钠缓冲液中是不分先后顺序的。所述雌二醇衍生物与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的比例可以根据情况进行调整，所述雌二醇衍生物与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的比例（质量比）为1:5～1:200，优选的1:20～1:150，最优选的为1:50～1:100。
所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶可以用碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶和苹果酸脱氢酶中的任一种代替。所述缓冲液可以采用其它缓冲液，如EDTA 缓冲液、EGTA 缓冲液、碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲系统、醋酸盐缓冲系统、SSC 缓冲系统、SSPE 缓冲系统、2-(N-吗啉代) 乙磺酸(MES) 缓冲系统、哌嗪-N，N’双(2-乙磺酸)(PIPES) 缓冲系统。所述缓冲液PH值范围为7.0～10.0,优选的为8.0～9.0。
所述雌二醇衍生物为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 和雌二醇的化学合成物质，或者所述雌二醇衍生物为或N-磺酸化羟基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)和雌二醇的化学合成物质。
实施例4
将200ug脲酶加入1mL10mM 磷酸盐缓冲液(pH7.0) 中，加入1ug雌二醇衍生物（E2-NHS），进行避光反应，避光反应的温度为4℃～37℃，反应0.5～24小时后，采用超滤法、或透析法、或脱盐柱法除去未反应完全的雌二醇衍生物，加入保护剂，得到雌二醇酶结合物。所述保护剂优选为甘油。
需要说明的是，所述雌二醇衍生物与脲酶加入到碳酸钠缓冲液中是不分先后顺序的，也可以先将1ug雌二醇衍生物加入1mL10mM 碳酸钠缓冲液中，再加入200ug脲酶；或者将1ug雌二醇衍生物与200ug脲酶同时加入到碳酸钠缓冲液中。所述雌二醇衍生物与脲酶的比例可以根据情况进行调整。
所述缓冲液也可以采用EDTA 缓冲液、EGTA 缓冲液、碳酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲系统、醋酸盐缓冲系统、SSC 缓冲系统、SSPE 缓冲系统、2-(N-吗啉代) 乙磺酸(MES) 缓冲系统、哌嗪-N，N’双(2-乙磺酸)(PIPES) 缓冲系统中的一种或多种；所述缓冲液PH值范围为7.0～10.0,优选的为8.0～9.0。
应用测试
将实施例1～4生成的雌二醇酶结合物与某进口公司生产的雌二醇试剂盒中Rb（雌二醇酶结合物）组分分别应用于雌二醇化学发光免疫分析试剂盒中进行对比实验，结果如下：
由以上的结果可以看出：本工艺合成的雌二醇酶结合物与国外同类型产品应用于化学发光免疫分析试剂盒中，信燥比和稳定性测试结果很接近，达到优良结果，本发明的雌二醇酶结合物制备方法具有很好的适用性和先进性。
以上所述实施例仅是本发明的优选实施方式。应当指出，本发明所述的稀释比例是指按质量比稀释的比例，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以做出若干改进和修饰，这些改进和修饰也应视为本发明的保护范围，本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims (10)

1.一种雌二醇酶结合物的制备方法，其特征在于：所述雌二醇酶结合物是由雌二醇衍生物（E2-NHS）与酶发生偶联反应生成，该反应不需要额外添加活化剂和偶联剂。
2.根据权利要求1所述的一种雌二醇酶结合物的制备方法，其特征在于：所述雌二醇衍生物为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 和雌二醇的化学合成物质，化学结构式为：
。
3.根据权利要求1所述的一种雌二醇酶结合物的制备方法，其特征在于：所述雌二醇衍生物为或N-磺酸化羟基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)和雌二醇的化学合成物质，化学结构式为：
。
4.根据权利要求1或2所述的一种雌二醇酶结合物的制备方法，其特征在于，所述雌二醇衍生物的合成方法如下：
S1、雌二醇二醋酸酯的制备：取雌二醇加入到无水吡啶、乙酸酐中，在油浴中回流2小时，冷却至室温后，冰浴降温2小时有结晶析出，用乙醇重结晶，得到白色片状结晶的雌二醇二醋酸酯；
S2、雌二醇二醋酸酯-6-酮的制备：取步骤S1得到的雌二醇二醋酸酯于冰醋酸中，加入CrO3，于37℃水浴反应4小时，加入蒸馏水，用乙醚萃取，醚相用饱和碳酸氢钠溶液洗涤至红色出现后，用蒸馏水洗涤至中性，加入硫酸镁干燥，得到黄色油状物，用乙酸乙酯：正已烷（1:4）溶解黄色油状物后,过色谱柱收集雌二醇二醋酸酯-6-酮的洗脱液，浓缩后，用无水乙醇重结晶，得到白色针状结晶的雌二醇二醋酸酯-6-酮；
S3、6-酮-雌二醇的制备：取雌二醇二醋酸酯-6-酮溶解于氢氧化钠-甲醇溶液中，室温静置，加入蒸馏水，用稀盐酸调节PH至3.0左右,用无水乙醇重结晶得6-酮-雌二醇；
S4、雌二醇-6-肟的制备：取6-酮-雌二醇溶解于甲醇溶液中，加入羧甲基羟胺半盐酸盐和醋酸钠溶液，37℃水浴反应8小时，冰浴降温4小时，析出针状结晶过滤，滤液用氢氧化钠溶液调整PH至8.5左右，用乙酸乙酯萃取；剩余滤液盐酸溶液调整PH至3.0左右用乙酸乙酯萃取；合并乙酸乙酯并减压蒸干，用丙酮-正已烷重结晶，得到雌二醇-6-肟；
S5、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与雌二醇合成物的制备：取雌二醇-6-肟溶解于2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液中，加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，避光条件下2～8℃反应12h，过色谱柱收集N-羟基琥珀酰亚胺与雌二醇合成物的洗脱液，浓缩后，用无水乙醇重结晶，得到白色针状结晶N-羟基琥珀酰亚胺与雌二醇合成物。
5.根据权利要求1所述的一种雌二醇酶结合物的制备方法，其特征在于：所述酶包括碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖氧化酶和苹果酸脱氢酶中的一种，优选为碱性磷酸酶。
6.根据权利要求1所述的一种雌二醇酶结合物的制备方法，其特征在于：将雌二醇衍生物与酶加入到缓冲液中，然后避光反应，再除去未反应完全的雌二醇衍生物，即得到雌二醇酶结合物。
7.根据权利要求6所述的一种雌二醇酶结合物的制备方法，其特征在于：将雌二醇衍生物与酶按一定比例加入到缓冲液中，所述雌二醇衍生物与酶的质量比为1:5～1:200，优选为1:20～1:150，最优选为1:50～1:100。
8.根据权利要求6所述的一种雌二醇酶结合物的制备方法，其特征在于：所述缓冲液为EDTA 缓冲液、EGTA 缓冲液、碳酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲系统、磷酸盐缓冲系统、醋酸盐缓冲系统、SSC 缓冲系统、SSPE 缓冲系统、2-(N-吗啉代) 乙磺酸(MES) 缓冲系统、哌嗪-N，N’双(2-乙磺酸)(PIPES) 缓冲系统中的一种或多种，优选为碳酸盐缓冲液；所述缓冲液PH值范围为7.0～10.0,优选的为8.0～9.0。
9.根据权利要求6所述的一种雌二醇酶结合物的制备方法，其特征在于：所述避光反应温度为4℃～37℃，反应时间为0.5～24小时。
10.根据权利要求6所述的一种雌二醇酶结合物的制备方法，其特征在于：所述除去未反应完全的雌二醇衍生物的方法有超滤法、透析法、脱盐柱法，加入保护剂，得到睾酮酶结合物，所述保护剂优选为甘油。
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