CN109734621B - 1-萘酚半抗原及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了1‑萘酚半抗原及其制备方法和应用，一种1‑萘酚的半抗原，具有如下结构式：

，其中，R=H或OH。利用该半抗原进一步制备得到1‑萘酚完全抗原和1‑萘酚抗体，并建立了1‑萘酚的间接竞争酶联免疫检测方法，本检测方法对1‑萘酚的检测范围达到20.8～475.7 ng/mL，检测限为8.3 ng/mL，灵敏度可达99.5 ng/mL。本发明所制备的半抗原以及以此为基础的说建立的免疫分析法线性范围广，灵敏度较高，可满足快速筛查诊断需求。

Description

1-萘酚半抗原及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及免疫检测技术领域，更具体地，涉及一种1-萘酚半抗原及其制备方法和应用。

背景技术

甲萘威是常用的氨基甲酸酯类农药，由于其对多种昆虫的高效性，是农业上应用最广泛的杀虫剂。然而，该农药残留在农产品或环境中可能会造成对人体产生持续的健康危害。甲萘威可通过食物链或环境被摄入人体，但是甲萘威不会在组织中积累或在血液中持续存在，而是经人体代谢后产生稳定的代谢物1-萘酚，随后在尿中排泄。因此，1-萘酚被认为是甲萘威暴露的最重要的生物标志物。为保障人体健康，监控农药暴露水平，建立一种简单、可靠、高灵敏度的检测方法用于检测尿液中1-萘检测方法具有重要意义。

免疫分析法是基于抗原与抗体特异性、可逆性结合反应的分析技术。免疫反应涉及抗原与抗体分子间高度互补的立体结构、静电、氢键和范德华力等的综合作用，具有任何一种单独理化分析技术难以达到的选择性和灵敏度，因此具有灵敏度与常规的仪器分析一致、适合现场筛选、简单、快速、成本低、样品所需量少等优点，被认为是21世纪最具竞争性和挑战性的快速检测技术。世界粮农组织 (FAO)已向许多国家推荐此项技术。美国化学学会(ACS)将免疫分析技术、色谱分析技术共同列为农药、兽药和渔药残留分析的主要技术。本发明对1-萘酚结构制备的半抗原目前尚无报道。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供1-萘酚半抗原及其制备方法和应用。

本发明的第一个目的是提供一种1-萘酚的半抗原。

本发明的第二个目的是提供所述半抗原的制备方法。

本发明的第三个目的是提供一种1-萘酚的完全抗原。

本发明的第四个目的是提供所述完全抗原的制备方法。

本发明的第五个目的是提供一种1-萘酚的抗体。

本发明的第六个目的是提供所述半抗原、所述完全抗原、和/或所述抗体在检测1-萘酚或制备1-萘酚检测试剂盒中的应用

本发明的第七个目的是提供一种1-萘酚的间接竞争酶联免疫检测方法。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

一种1-萘酚的半抗原，结构式如式(I)所示：

其中，R＝H或OH。

所述半抗原的制备方法，R＝OH，包括以下步骤：

S11.4-羟基-1-萘甲醛、羧甲基羟胺半盐酸盐、甲醇、吡啶和水混合，得到混合溶液，其中，羟基-1-萘甲醛和羧甲基羟胺半盐酸盐的摩尔质量比为1～2：2～ 10，甲醇、吡啶和水的体积比为1～4：1～2：1～2；

S12.步骤S11中的混合溶液50～60℃反应4～24h；

S13.步骤S12的反应产物稀盐酸和乙酸乙酯的混合液萃取，弃水层，旋转蒸发即得。

优选地，步骤S11中，羟基-1-萘甲醛和羧甲基羟胺半盐酸盐的摩尔质量比为1:2。

优选地，步骤S11中，甲醇、吡啶和水的体积比为4:1:1

优选地，步骤S12中，50℃反应5h。

优选地，步骤S13中，盐酸的浓度为0.5～1M。

更优选地，步骤S13中，盐酸的浓度为0.5M。

优选地，步骤S13中，盐酸和乙酸乙酯的体积比为1～2：1～2。

更优选地，步骤S13中，盐酸和乙酸乙酯的体积比为1：1。

优选地，步骤S13中，萃取5～10s，共萃取1～3次。

更优选地，步骤S13中，萃取10s，共萃取3次。

所述半抗原的制备方法，其特征在于，R＝H，包括以下步骤：

S21.1-萘甲醛、羧甲基羟胺半盐酸盐、甲醇、吡啶和水混合，得到混合溶液，其中，羟基-1-萘甲醛和羧甲基羟胺半盐酸盐的摩尔质量比为1～2：2～10，甲醇、吡啶和水的体积比为1～4：1～2：1～2；

S22.步骤S21中的混合溶液50～60℃反应4～24h；

S23.步骤S22的反应产物稀盐酸和乙酸乙酯的混合液萃取，弃水层，旋转蒸发即得。

优选地，步骤S21中，羟基-1-萘甲醛和羧甲基羟胺半盐酸盐的摩尔质量比为1:2。

优选地，步骤S21中，甲醇、吡啶和水的体积比为4:1:1。

优选地，步骤S22中，50℃反应5h。

优选地，步骤S23中，盐酸的浓度为0.5～1M。

更优选地，步骤S23中，盐酸的浓度为0.5M。

优选地，步骤S23中，盐酸和乙酸乙酯的体积比为1～2：1～2。

更优选地，步骤S23中，盐酸和乙酸乙酯的体积比为1：1。

优选地，步骤S23中，萃取5～10s，共萃取1～3次。

更优选地，步骤S23中，萃取10s，共萃取3次。

一种1-萘酚的完全抗原，结构式如式(II)所示：

其中，R＝H或OH。

优选地，所述载体蛋白为牛乳铁蛋白、牛血清白蛋白、血蓝蛋白或卵清蛋白中的一种。

所述完全抗原的制备方法，包括以下步骤：

S1.将所述的1-萘酚的半抗原的N，N-二甲基甲酰胺溶液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺混合，避光搅拌，得到A液，其中，所述的1-萘酚的半抗原、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和所述 N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1：1.2～1.5：1.2～1.5；

S2.将载体蛋白溶解在碳酸缓冲液中，得到B液，其中载体蛋白浓度为5～ 10mg/mL；

S3.在冰浴搅拌下，将S1的A液滴加到S2的B液中，用NaOH溶液或9.5～ 9.6的碳酸缓冲液将调节pH至9.5～9.6，避光反应1～4h，透析纯化后即得。

优选地，NaOH水溶液的浓度为1～5M。

优选地，NaOH水溶液的浓度为3M。

优选地，碳酸缓冲液pH9.6。

优选地，所述的1-萘酚的半抗原、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和所述N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1：1.5：1.5。

优选地，避光反应4h。

优选地，A液中的所述1-萘酚半抗原与B液中的所述载体蛋白的摩尔比为 30～40：1。

最优选地，载体蛋白为牛乳铁蛋白，A液中的所述1-萘酚半抗原与B液中的所述载体蛋白的摩尔比为40：1。

最优选地，载体蛋白为牛血清蛋白，A液中的所述1-萘酚半抗原与B液中的所述载体蛋白的摩尔比为30：1。

一种1-萘酚的抗体，是由所述的或所述制备方法制备得到的完全抗原免疫动物得到。

优选地，所述抗体为多克隆抗体、单克隆抗体或基因工程抗体。

所述半抗原、所述完全抗原、和/或所述抗体在检测1-萘酚或制备1-萘酚检测试剂盒中的应用，也属于本发明的保护范围。

进一步，本发明要求保护一种1-萘酚的间接竞争酶联免疫检测方法，以式 (III)所示的1-萘酚完全抗原作为免疫原制备抗体，以式(IV)所示的1-萘酚完全抗原作为包被原，

优选地，所述式(III)所示的1-萘酚完全抗原作为免疫原，载体蛋白为牛乳铁蛋白。

优选地，所述以式(IV)所示的1-萘酚完全抗原作为包被原，载体蛋白为牛血清白蛋白。

优选地，包被原的工作浓度为100～500ng/mL，1-萘酚抗体的工作浓度为 100～500ng/mL。

更优选地，包被原的工作浓度为125ng/mL，1-萘酚抗体的工作浓度为200 ng/mL。

最优选的，所述间接竞争酶联免疫检测方法，以式(III)所示的1-萘酚完全抗原作为免疫原和以式(IV)所示的1-萘酚完全抗原作为包被原，

其中，所述式(III)所示的1-萘酚完全抗原作为免疫原，载体蛋白为牛乳铁蛋白；

所述以式(IV)所示的1-萘酚完全抗原作为包被原，载体蛋白为牛血清白蛋白；

包被原的工作浓度为125ng/mL，1-萘酚抗体的工作浓度为200ng/mL。

进一步，本发明要求保护一种1-萘酚的间接竞争酶联免疫检测的试剂盒，包括(III)所示的1-萘酚完全抗原作为免疫原制备抗体，以式(IV)所示的1-萘酚完全抗原作为包被原的酶标板，

优选地，所述式(III)所示的1-萘酚完全抗原作为免疫原，载体蛋白为牛乳铁蛋白。

优选地，所述以式(IV)所示的1-萘酚完全抗原作为包被原，载体蛋白为牛血清白蛋白。

优选地，包被原的工作浓度为100～500ng/mL，1-萘酚抗体的工作浓度为 100～500ng/mL。

更优选地，包被原的工作浓度为125ng/mL，1-萘酚抗体的工作浓度为200 ng/mL。

最优选的，所述试剂盒，包括(III)所示的1-萘酚完全抗原作为免疫原制备抗体和以式(IV)所示的1-萘酚完全抗原作为包被原的酶标板，

其中，所述式(III)所示的1-萘酚完全抗原作为免疫原，载体蛋白为牛乳铁蛋白；

所述以式(IV)所示的1-萘酚完全抗原作为包被原，载体蛋白为牛血清白蛋白；

包被原的工作浓度为125ng/mL，1-萘酚抗体的工作浓度为200ng/mL。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

通过本发明提供的1-萘酚的半抗原，进一步制备得到1-萘酚完全抗原和1- 萘酚抗体，并建立了1-萘酚的间接竞争酶联免疫检测方法，本检测方法对1-萘酚的检测范围达到20.8～475.7ng/mL，检测限为8.3ng/mL，灵敏度可达99.5 ng/mL。本发明所制备的半抗原以及以此为基础的说建立的免疫分析法线性范围广，灵敏度较高，可满足快速筛查诊断需求。

附图说明

图1为1-萘酚半抗原合成。

图2为式(III-1)所示的1-萘酚完全抗原鉴定图。

图3为式(III-2)所示的1-萘酚完全抗原鉴定图。

图4为式(IV-1)所示的1-萘酚完全抗原鉴定图。

图5为1-萘酚抗体的ELISA竞争标准曲线图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例11-萘酚半抗原合成

一、实验方法

结构式如式(I)所示1-萘酚的半抗原合成路线如图1所示，

其中，R＝H或OH。

具体步骤如下：

(1)如式(I-1)所示的1-萘酚半抗原(R＝OH)

10mmol4-羟基-1-萘甲醛和20mmol羧甲基羟胺半盐酸盐溶解于甲醇：吡啶：水＝4:1:1的混合溶液中，50℃加热反应5h。反应结束后，混合产物用0.5M 稀盐酸和乙酸乙酯的1：1混合液萃取10s，萃取后弃水层，一共萃取3次，每次萃取剧烈震荡10s。旋转蒸发有机层，即得。

(2)如式(I-2)所示的1-萘酚半抗原(R＝H)

10mmol1-萘甲醛和20mmol羧甲基羟胺半盐酸盐溶解于甲醇：吡啶：水＝4:1:1的混合溶液中，50℃加热反应5h。反应结束后，混合产物用0.5M稀盐酸和乙酸乙酯的1：1混合液萃取10s，萃取后弃水层，一共萃取3次，每次萃取剧烈震荡10s。旋转蒸发有机层，即得。

二、实验结果

如式(I-1)所示的1-萘酚半抗原和如式(I-2)所示的1-萘酚半抗原质谱和核磁鉴定如表1所示。

表1：

实施例21-萘酚完全抗原合成

结构式如式(II)所示1-萘酚的完全抗原的合成，

其中，R＝H或OH。

一、实验方法

(1)如式(III-1)或(III-2)所示的1-萘酚完全抗原合成

(i)半抗原与牛乳铁蛋白(LF)的摩尔比为40：1。将6.2mg式(I-1)所示的1-萘酚半抗原与2.7mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1.6mg N-羟基琥珀酰亚胺溶于600μLN，N-二甲基甲酰胺中，室温下避光搅拌4h，获得活化后的半抗原，称为A液。

将50mg牛乳铁蛋白溶解在5mLpH9.6碳酸缓冲液中，称为B液。

在冰浴搅拌下将上述A液体滴加到B液中，滴加后，用3MNaOH将pH调节至9.5～9.6。避光反应过夜，并经过透析纯化后，即得免疫原(III-1)所示的 1-萘酚完全抗原。

(ii)半抗原与牛血清白蛋白(BSA)的摩尔比为30：1。将22.3mg式(I-1) 所示的1-萘酚半抗原与2.7mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1.6 mgN-羟基琥珀酰亚胺溶于600μLN，N-二甲基甲酰胺中，室温下避光搅拌4h，获得活化后的半抗原，称为A液。

将200mg牛血清白蛋白溶解在20mLpH9.6碳酸缓冲液中，称为B液。

在冰浴搅拌下将上述A液体滴加到B液中，滴加后，用3MNaOH将pH调节至9.5～9.6。避光反应过夜，并经过透析纯化后，即得包被原(III-2)所示的 1-萘酚完全抗原。

(2)如式(IV-1)所示的1-萘酚完全抗原合成

半抗原与牛血清白蛋白(BSA)的摩尔比为30：1。将21mg1-萘酚半抗原 (I-2)与27mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和16mgN-羟基琥珀酰亚胺溶于600μLN，N-二甲基甲酰胺中，室温下避光搅拌4h，获得活化后的半抗原，称为A液。

将200mg牛血清白蛋白溶解在20mLpH9.6碳酸缓冲液中，称为B液。

在冰浴搅拌下将上述A液体滴加到B液中，滴加后，用3MNaOH将pH调节至9.5～9.6。避光反应过夜，并经过透析纯化后，即得(IV-1)所示的1-萘酚完全抗原。

二、实验结果

通过分别扫描半抗原、偶联物及载体蛋白溶液在紫外区(200–400nm)的吸收光。如图2～4所示，偶联物均具有半抗原和载体蛋白的紫外吸收特征峰，证明人工抗原制备成功。

实施例31-萘酚多克隆抗体制备

一、实验方法

取10周龄雌性新西兰大白兔(广东省实验动物中心)，将制备的500μL免疫抗原(式(III-1)所示的1-萘酚完全抗原)与弗氏完全佐剂等量混合，完全乳化后，注射兔子背部。第一次免疫采用弗氏完全佐剂，后加强免疫采用弗氏不完全佐剂，每隔3周免疫一次，一共加强免疫4次。第二次加强免疫后一周从耳部静脉取血检效价和抑制。第四次加强免疫后，将兔子麻醉并从颈部动脉取全血，所获得全血在37℃孵育半小时，12000rpm离心，所获得的抗血清即为抗1-萘酚多克隆抗体。

二、实验结果

兔抗血清检血结果表2，包被原包被浓度0.5μg/mL，药物浓度1μg/mL。选择式(III-1)所示化合物作为免疫原，选择式(IV-1)所示化合物作为包被原。

表2：

实施例4抗血清检测1-萘酚标准曲线建立及特异性检测

一、实验方法

用方阵滴定法确定包被原(式(IV-1)所示的1-萘酚完全抗原)和实施例4 利用式(III-1)所示的1-萘酚完全抗原制备得到的1-萘酚抗体的工作浓度，包被原的工作浓度为125ng/mL，1-萘酚抗体的工作浓度为200ng/mL。采用三组平行试验(n＝3)。

抗血清间接竞争ELISA检测步骤如下：

S1.包被

用pH9.6碳酸缓冲液包被原稀释至合适浓度，加入酶标板孔中，100μL/ 孔，37℃水浴箱中过夜。

S2.洗涤

倾去孔内液体，洗板机洗板2次，每孔加洗涤液250μL，甩干孔中液体。

S3.封闭

每孔加入120μL封闭液，37℃封闭3h，甩干孔内液体，倒置于37℃烘箱中1h备用。

S4.加样及孵育

将1-萘酚、1,5-萘二酚、1,6-萘二酚，苯酚，萘分稀释成系列梯度标准液，分别稀释为5000，1000，200，40，8，1.6，0.32ng/mL，每孔加50μL，然后加入合理稀释抗血清的稀释液50μL，37℃水浴箱中反应40min后，洗板机洗板5 次，每孔加入洗涤液250μL，甩干孔中液体。

S5.加二抗

每孔加入100μL稀释5000倍的HRP-羊抗兔，37℃水浴箱中反应30min 后，洗板同S4。

S6.显色

TMB底物液和底物缓冲液等体积混合，每孔加入混合液100μL，置于37℃水浴箱中显色10min后，每孔加入50μL10％H₂SO₄终止液。

S7.测定

用酶联免疫检测仪测定各孔A_450nm的吸光值。

S8.计算

用Origin8.5的四参数拟合模块计算抑制曲线的IC₁₀、IC₂₀、IC₅₀、IC₈₀值。交叉反应率R(％)计算公式如下：

R(％)＝IC₅₀(1-萘酚)/IC₅₀(1-萘酚结构类似物)×100％。

二、实验结果

标准曲线见图5。所得1-萘酚标准曲线IC₅₀值为99.5ng/mL，检测限为(IC₁₀)8.3ng/mL，线性检测范围为20.8～475.7ng/mL。

特异性检测如下表3。

表3：

Claims (9)

1.一种1-萘酚的半抗原，其特征在于，结构式如式(I)所示：

其中，R＝OH。

2.权利要求1所述半抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S11.4-羟基-1-萘甲醛、羧甲基羟胺半盐酸盐、甲醇、吡啶和水混合，得到混合溶液，其中，羟基-1-萘甲醛和羧甲基羟胺半盐酸盐的摩尔质量比为1～2：2～10，甲醇、吡啶和水的体积比为1～4：1～2：1～2；

S12.步骤S11中的混合溶液50～60℃反应4～24h；

S13.步骤S12的反应产物稀盐酸和乙酸乙酯的混合液萃取，弃水层，蒸发溶剂即得。

3.一种1-萘酚的完全抗原，其特征在于，结构式如式(II)所示：

其中，R＝OH。

4.根据权利要求3所述的完全抗原，其特征在于，所述载体蛋白为牛乳铁蛋白、牛血清白蛋白、血蓝蛋白或卵清蛋白。

5.权利要求4所述完全抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.将权利要求1所述的1-萘酚的半抗原的N，N-二甲基甲酰胺溶液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺混合，避光搅拌，得到A液，其中，权利要求1所述的1-萘酚的半抗原、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和所述N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1：1.2～1.5：1.2～1.5；

S2.将载体蛋白溶解在碳酸缓冲液中，得到B液，其中载体蛋白浓度为5～10mg/mL；

S3.在冰浴搅拌下，将S11的A液与S12的B液混合，用NaOH溶液或pH9.6的碳酸缓冲液将调节pH至9.5～9.6，避光反应12～16h，纯化后即得。

6.一种1-萘酚的抗体，其特征在于，是由权利要求4所述的或权利要求5所述制备方法制备得到的完全抗原免疫动物得到。

7.权利要求1所述半抗原、权利要求3所述完全抗原、和/或权利要求6所述抗体在检测1-萘酚或制备1-萘酚检测试剂盒中的应用。

8.一种1-萘酚的间接竞争酶联免疫检测方法，其特征在于，以式(III)所示的1-萘酚完全抗原作为免疫原，以式(IV)所示的1-萘酚完全抗原作为包被原：

9.根据权利要求8所述的间接竞争酶联免疫检测方法，其特征在于，包被原的工作浓度为50～500ng/mL，1-萘酚抗体的工作浓度为100～500ng/mL。

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