CN103288661B - 一种孔雀石绿半抗原制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种孔雀石绿半抗原，相应的人工抗原和单克隆抗体，同时本发明也公开了所述孔雀石绿半抗原，相应的人工抗原和单克隆抗体的制备方法及其应用。本发明提供的孔雀石绿半抗原是式(1)所示化合物，用式(1)所示化合物与载体蛋白连接可以得到孔雀石绿抗原。所述孔雀石绿抗原可应用于制备孔雀石绿特异性抗体。本发明制备方法简便可行、成本较低，半抗原产率较高。本发明的孔雀石绿人工抗原，可作为包被抗原用于包被酶标板，也可通过免疫动物产生针对孔雀石绿的特异性多抗或者单抗，所产生抗体可用于制备检测食品中孔雀石绿残留的酶联免疫试剂盒或者胶体金试纸卡，具有简单、快速、处理样品量大、灵敏度高、特异性强等诸多优点。

Description

一种孔雀石绿半抗原制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种孔雀石绿半抗原、抗原、单克隆抗体制备方法及其酶联免疫定量检测方法，属于免疫学范畴。

背景技术

孔雀石绿(Malachite green，MG)分子式为：C₂₃H₂₅N₂Cl，分子量365，电离常数pK值为6.9。pH值为4.0时，全部电离，pH值为6.9时50％电离，pH为7.4时，有25％电离，pH上升为10.1时，则不发生电离。

自1993年证实孔雀石绿具有抗菌杀虫等药效以来，许多国家曾广泛用作驱虫剂和杀菌剂，以杀灭水产动物体外的寄生虫、原生动物和鱼卵中的霉菌等。在鱼类养殖中使用防治鱼类的水霉病等。在治疗鱼体和鱼卵体表传染病的药物中，很少有其它化学药物可与其效果相媲美，特别是治疗那些由水霉和多子小瓜虫引起的疾病。孔雀石绿的抗菌杀虫机理是：孔雀石绿在细胞分裂时阻碍蛋白肽的形成，使细胞内的氨基酸无法转化为蛋白肽，使细胞分裂受到抑制，从而产生抗菌杀虫作用。

孔雀石绿等进入人类或动物机体后，通过生物转化可产生致癌、致畸、致突变等副作用。美国食品药品管理局将孔雀石绿作为致癌敏感化合物。孔雀石绿对呼吸系统酶有毒性影响，可导致虹蹲鱼和罗非鱼的呼吸失调。孔雀石绿可在环境中长期存在并对水生和陆生生物产生毒性。临床报道和试验研究都证明孔雀石绿对多器官有毒性。孔雀石绿影响食物的吸收、动物生长和繁殖能力。造成肝、脾、肾和心的病变，皮肤、眼睛、肺部和骨骼的损害。

鉴于孔雀石绿的危害性，许多国家都将孔雀石绿列为水产养殖禁用药物。我国也于2002年5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中，禁止用于所有食品动物。但由于孔雀石绿的抗菌果较好，价格便宜，不少业户在一段时间内仍可能偷偷使用，在国内市场的检查中也屡屡看到孔雀石绿的残留问题，尤其是河南、湖北等地的水产养殖和水产品运输过程中，孔雀石绿仍在被普遍使用。2002年12月农业部对农牧发【1999】17号文《动物性食品中兽药残留限量》进行了重新修订(235号公告)其中规定孔雀石绿为不得检出。

目前对孔雀石绿的检测方法主要有：薄层色谱法、分光光度法、共振瑞利散射法、气质联用法、高效液相色谱法和酶联免疫法等，目前国内尚无关于孔雀石绿的系统检测方法，该方法的建立为监控动物源性食品中孔雀石绿残留提供了技术支持。

发明内容

本发明的目的是提供一种孔雀石绿半抗原、抗原、单克隆抗体制备方法及其应用。

本发明提供的孔雀石绿半抗原，是式(1)所示化合物：

式1

本发明还保护式(1)所示化合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)于25mL三角瓶中加入1g对羟基苯甲醛，2g氯化锌，溶于20mL无水乙醇中；

(2)加入3mL N，N-二甲基苯胺，90℃回流24h，反应完毕，减压去溶剂，柱层析纯化(乙酸乙酯/石油醚，1/2，v/v)；

(3)将其溶于20mL吡啶中，加入琥珀酸酐0.74g(与底物摩尔比为1∶1.2)。在80℃下反应20h，反应完毕，减压去溶剂。加入稀盐酸调pH值至5左右，加入乙酸乙酯萃取3次。合并有机相，无水硫酸镁干燥，减压去溶剂，柱层析纯化(乙酸乙酯/石油醚，2/1，v/v)。

本发明提供的孔雀石绿抗原，是将式(1)所示化合物和载体蛋白偶联得到的偶联物。

所述孔雀石绿抗原的结构示意图见图3。

本发明还保护所述孔雀石绿抗原的制备方法，包括如下步骤：

(1)取10mg半抗原，溶解于1mL二甲基甲酰胺(DMF)中；

(2)取15mg二氯乙烷(EDC)用0.2mL水充分溶解后于加入半抗原溶解液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A；

(3)称取载体蛋白40mg，使之充分溶解在2.8mL PBS(PH 7.2)中，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h；

(4)用0.01mol/L PBS 4℃透析3d每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；

(5)分装，于-20℃保存备用。

常用载体蛋白均可采用，如牛血清白蛋白(BSA)，卵清蛋白(OVA)，人血清白蛋白(HSA)，鼠血清白蛋白(MSA)，甲状腺蛋白(TG)和血蓝蛋白(KLH)等。

所述孔雀石绿抗原可以作为免疫抗原制备孔雀石绿特异性单克隆抗体，也可以作为包被抗原制备酶标板。

所述抗体具体可为单克隆抗体。

式(1)所示化合物、所述孔雀石绿抗原、所述抗体均可应用于检测孔雀石绿。

应用孔雀石绿抗原和孔雀石绿单克隆抗体制备得到的酶联免疫检测试剂盒也属于本发明的保护范围。

酶联免疫检测试剂盒，是由包被有包被原的酶标板；酶标二抗；孔雀石绿特异性抗体、孔雀石绿系列标准品、底物显色液、终止液、浓缩复溶液、浓缩洗涤液、氧化剂浓缩液、孔雀石绿提取剂、样品净化剂组成。

本发明依靠免疫学、免疫化学基本原理和残留分析技术手段，设计、合成小分子目标分析物半抗原，并与载体蛋白偶联，制备有效人工抗原，免疫动物制备针对小分子分析物的特异性抗体。利用抗原抗体的特异性免疫学反应，定性的检测样本中微量小分子目标分析物，具有特异、灵敏、准确、快速、方便、廉价等特点。本发明制备方法简便可行、成本较低，半抗原产率较高。本发明克服了现有检测技术中对孔雀石绿样品预处理复杂、耗时、且需要大量有机溶剂萃取，以及在检测过程中要用到精密昂贵的检测仪器而不适于推广使用等缺点。本发明的孔雀石绿人工抗原，通过免疫动物可产生了针对孔雀石绿的特异性抗体，用于快速检测食品中的孔雀石绿残留，具有简单、快速、处理样品量大、灵敏度高、特异性强等诸多优点。

附图说明

图1为孔雀石绿酶联免疫试剂盒标准曲线

图2为孔雀石绿人工半抗原的核磁共振氢谱。

图3为孔雀石绿抗原的结构示意图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

产率％＝实际得到的产物的质量/理论上得到产物的质量×100％。

实施例1、孔雀石绿半抗原的制备和鉴定

一、孔雀石绿半抗原的制备

(1)于25mL三角瓶中加入1g对羟基苯甲醛，2g氯化锌，溶于20mL无水乙醇中；

(2)加入3mL N，N-二甲基苯胺，90℃回流24h，反应完毕，减压去溶剂，柱层析纯化(乙酸乙酯/石油醚，1/2，v/v)；

(3)将其溶于20mL吡啶中，加入琥珀酸酐0.74g(与底物摩尔比为1∶1.2)。在80℃下反应20h，反应完毕，减压去溶剂。加入稀盐酸调pH值至5左右，加入乙酸乙酯萃取3次。合并有机相，无水硫酸镁干燥，减压去溶剂，柱层析纯化(乙酸乙酯/石油醚，2/1，v/v)。

二、孔雀石绿半抗原的鉴定

核磁共振氢谱见图2。

分析结果表明：新增加的12.0左右的羧基信号峰以及2.5-3.0之间的两个亚甲基峰说明半抗原合成成功。

实施例2、孔雀石绿人工抗原的制备和鉴定

一、孔雀石绿抗原的合成

(1)取10mg半抗原，溶解于1mL二甲基甲酰胺(DMF)中；

(2)取15mg二氯乙烷(EDC)用0.2mL水充分溶解后于加入半抗原溶解液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A；

(3)称取载体蛋白40mg，使之充分溶解在2.8mLPBS(PH7.2)中，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h；

(4)用0.01mol/L PBS4℃透析3d每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；

(5)分装，于-20℃保存备用。

二、孔雀石绿人工抗原的鉴定

按合成孔雀石绿免疫抗原反应所用的半抗原、载体蛋白与偶联产物的比例，分别进行紫外(200～400nm)扫描鉴定，并通过比较三者在同一波长下的吸光值计算其结合比。产物的紫外光谱图与载体蛋白相比发生了变化，说明半抗原已经与载体蛋白成功偶联制得孔雀石绿人工抗原。经计算，孔雀石绿半抗原分子与BSA分子的结合比为12.8∶1，OVA分子的结合比为16.2∶1。

实施例3、单克隆抗体制备和灵敏度测定

一、孔雀石绿单抗的制备

1、用上述制备出的免疫原(MG-BSA)按100μg/只，以生理盐水溶解免疫原与弗氏完全佐剂等体积混匀，颈背部皮下注射免疫6～8周龄Balb/c雌鼠，初次免疫后第7、14、28天以免疫原与弗氏不完全佐剂等体积混匀，各追加免疫一次，融合前3天以免疫复合物100μg/只，不加弗氏佐剂再追加免疫一次。

2、按常规方法进行，取免疫小鼠的脾细胞与处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)混合，然后在45秒内缓慢加入预热的融合剂(PEG4000)进行融合，用HAT培养基悬浮均匀，再加入适量的饲养细胞，培养于96孔培养板，于37℃，5％CO₂培养箱中培养，5天后用HT培养基半换液，9天时候进行全换液。

3、细胞融合后，待细胞长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞。初选采用间接ELISA方法，以包被抗原(预先用方阵法常规滴定其最佳包被浓度和阳性血清稀释度)包被酶标板，加入被测孔培养上清，孵育，清洗后加入羊抗鼠IgG-HRP和IgM-HRP，OPD进行显色反应。筛选出的阳性孔再用间接竞争ELISA方法筛选，先将细胞上清与100μg/mL的孔雀石绿等体积混合，37℃水浴作用30min，再加入到包被好的酶标板中。同时用PBS取代孔雀石绿作对照，其余步骤同上。若经孔雀石绿阻断后的OD₄₅₀nm值下降到对照孔的50％以下，则判为阳性，经2～3次检测都为阳性的孔，立即用有限稀释法进行亚克隆化。

4、将2～3次亚克隆建株后的杂交瘤细胞扩大培养，收集上清液用间接ELISA测定效价，冻存；并取8～10周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.5mL/只，7～10日后腹腔注射杂交瘤细胞1～2×10⁶/只，7～10日后抽取小鼠腹水，离心取上清，测定效价，并冻存备用。

二、孔雀石绿抗体的半数抑制量(IC₅₀)

孔雀石绿标准品购自Sigma公司。

用方阵滴定法确定孔雀石绿包被抗原(载体蛋白为卵清蛋白，制备方法同实施例2所示)和实施例3步骤一制备的单抗的工作浓度，孔雀石绿包被抗原的工作浓度为5.0μg/mL，抗血清的工作浓度为1∶32000。

用不同浓度的孔雀石绿标准品溶液做实验溶液，其浓度如下：0、0.2、0.6、1.8、5.4ng/mL。采用8组平行试验(n＝8)。

间接竞争性ELISA方法：用上述工作浓度的抗原包被酶标板，将实验溶液与抗体溶液同时加入酶标板小孔中，同时设置空白孔(将添加的抗体溶液换成高纯水，其它一致)和阴性对照孔(将添加的实验溶液用PBS溶液代替，其它一致)，37℃温育0.5h，倒出孔内液体，用洗涤液洗涤3～5次，将酶标板倒置在吸水纸上拍打；加入酶标二抗溶液于酶标板小孔中，37℃温育0.5h，用洗涤液重复洗3～5次，吸干；加入底物显色溶液到酶标板小孔中，室温下反应10～15min，用酶标仪在波长450nm处测定OD值。以OD值为纵坐标，以孔雀石绿实验溶液浓度的log10值为横坐标，绘制半对数标准曲线图。

结果如下：

吸光度值与每孔所加入的标准品溶液中孔雀石绿的浓度成反比；标准曲线具有完整的反S形状，并具有上平台和下平台，标准曲线的平行测定次数8次，实验重复性良好，相对标准偏差(变异系数)均在15％以内。

根据标准曲线得出半数抑制量(IC₅₀)，比较检测灵敏度。

抑制率用以下式计算：

式中：ODmax：为不加标准品时的吸光值，ODx为标准品x时的吸光值，ODmin为空白对照孔的吸光值。

由上述公式计算得孔雀石绿抗体在缓冲液中的半数抑制量(IC₅₀)为0.495ng/mL。

实施例4、检测孔雀石绿的酶联免疫试剂盒及其制备

一、酶联免疫试剂盒由下述物质组成：

1、包被孔雀石绿与包被抗原(MG-OVA)的酶标板；

2、抗体工作液：实施例3中所述单克隆抗体。抗体工作液是用洗涤工作液对实施例3中的纯化单克隆抗体稀释成1∶64000的工作浓度得到的；

3、孔雀石绿标准品：以常规方法将孔雀石绿纯品用含有10％甲醇的0.05m mol/L，pH＝7.4的PBS配制成浓度分别为0、0.2、0.6、1.8、5.4ng/mL的孔雀石绿标准溶液，所述百分比为体积百分比；

4、酶标二抗：酶标羊抗鼠抗体为辣根过氧化酶-羊抗鼠IgG原液，使用时用抗体工作液以1∶10的体积比例进行稀释得到的工作液；

5、底物显色液：由A液和B液组成，A液配方为每1000mL去离子水中加入过氧化脲1g，柠檬酸10.3g，Na₂HPO₄·12H₂O 35.8g，吐温-20 100μL，调至pH＝5；B液配方为每1000mL去离子水中加入四甲基联苯胺700mg，10.3g柠檬酸，调至pH＝2.6；

6、终止液：以常规方法配制浓度为2mol/L的硫酸溶液；

7、洗涤液：每1升所述洗涤液是按照如下方法配制得到的：将10mL吐温20、5g叠氮化钠和990mL磷酸盐缓冲液混合，得到所述洗涤液；所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01M pH值为7.4；

8、浓缩复溶液：pH值为7.4，含有10％卵清蛋白、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为质量百分比；

9、样本净化剂：固体碱性氧化铝可直接使用；

10、样本提取剂：称取5g无水乙酸钠，加入去离子水溶解，最后定容至100mL；

11、氧化剂浓缩液：称取0.5g高锰酸钾，用5％双氧水溶液溶解，最后定容至100mL。

二、试剂盒组分的制备

包被有包被原的酶标板及其制备

包被有包被抗原(MG-OVA)的聚苯乙烯酶标板：用10mM的碳酸盐溶液将抗原作1∶50000倍稀释(5.0μg/mL)，包被96孔聚苯乙烯酶标板，每孔100μL，37℃温育2h，倾去包被液，用洗涤液洗涤3次，每次10s，拍干，然后在每孔中加入150μL封闭液，37℃温育2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。

包被缓冲液：pH值为9.6，0.05mol/L的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液；

封闭液：pH值为9.2，含有5％小牛血清、体积百分比为0.2％吐温-20、0.2mol/L的碳酸盐缓冲液，所述百分比为体积百分比。

三、试剂盒检测方法

(一)罗非鱼样品前处理

用均质器均质组织样本，称取2.0±0.05g均质物至50mL聚苯乙烯离心管中，加入1.9mL4％三氯乙酸溶液，用涡旋仪涡动5min，加入4mL乙腈，再加入100μL孔雀石绿提取剂，涡动振5min，静置10min，3000g以上，室温(20-25℃)离心10min，取出2mL上清液至50mL聚苯乙烯离心管中，加入2mL乙腈，加入100μL孔雀石绿氧化剂，轻轻振荡混匀，室温静置20min，加入3g无水硫酸钠，再加入0.2g样本净化剂，涡动振荡5min，3000g以上，室温(20～25℃)离心10min，取上清液2mL上清液至10mL干净的玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干30min，加入500μL复溶液涡动溶解，取50μL用于分析。

(二)用试剂盒检测

1、标准曲线的制作

加标准品/样本50μL到对应的微孔中，向已加入标准品/样本的微孔板种加入混合好的抗体/酶标记二抗混合液50μL/孔。轻轻振荡酶标板使微孔内液体混合均匀后用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应30min，小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250μL/孔，充分洗涤4～5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干，加入底物液A液50μL/孔，再加底物液B液50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中显色15min，加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处，测定每孔OD值。

用每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准品溶液(0标准)的吸光度值(B0)再乘以100％，得到百分吸光度值。以孔雀石绿标准品浓度(μg/L)的半对数值为x轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。得到的标准曲线如图1所示。

百分吸光度值(％)＝(B/B₀)×100％

2、样品中孔雀石绿浓度的测定

用每个检测样本溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准品溶液(0标准)的吸光度值(B0)再乘以100，得到百分吸光度值。相对应每一个检测样本溶液的百分吸光度值，则可从标准曲线上读出检测样本溶液的吸光度值，再根据标准品溶液的浓度值换算出样本溶液中孔雀石绿的残留量。

四、试剂盒检测效果评价

(一)最低检测限试验

对空白罗非鱼样本各重复测定20次得到样本的测定值结果，根据结果计算最低检测限。结果见下表1。

最低检测限＝x+3s

x为空白样品浓度平均值，s为空白样品浓度标准差。

表1空白鸡肉样本测定结果统计表 μg/kg

由上表检测结果可知，空白罗非鱼样本的最低检测限为0.46μg/kg。

(二)准确度和精密度试验

向不含孔雀石绿的罗非鱼样品中添加孔雀石绿标准品，使孔雀石绿标准品在样品中的终浓度分别为1、2、4μg/kg；将添加后的样品分别按照实验三中所述方法进行前处理，得到检测样本溶液。

从三个不同批次的试剂盒中各抽取3个试剂盒进行检测，检测方法如实验三中所述，每个实验重复5次，分别计算变异系数。结果分别见表2。

表2准确度和精密度试验结果

批内变异系数：同一次测定中各平行样本的变异系数。

批间变异系数：同一样本在不同批次测定结果的变异系数，取其平均值。

结果表明：所有样品的添加回收率在70.3～89.6％，批内变异系数在4.1～11.3％，批间变异系数在6.2～9.7％。

(三)试剂盒保存期

试剂盒保存条件为2～8℃，经过15个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(0标准)，50％抑制浓度、孔雀石绿添加实际测定值均在正常范围之内。考虑到运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存的条件下放置20天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒的各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻15天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2-8℃至少可以保存12个月以上。

(四)交叉反应率试验

选择相应的物质进行交叉反应试验，通过各种标准曲线分别得到其50％抑制浓度(IC₅₀)。用下式计算试剂盒对其它类似物的交叉反应率：

表3试剂盒的特异性

药物名称	交叉反应率(％)
		孔雀石绿	100
结晶紫	120
		隐形孔雀石绿	100
隐形结晶紫	115
		磺胺二甲基嘧啶	＜0.1

氯霉素	＜0.1
		四环素	＜0.1
红霉素	＜0.1
		恩诺沙星	＜0.1

实验表明，本发明试剂盒对孔雀石绿、结晶紫、隐形孔雀石绿、隐形结晶紫均具有较高的交叉反应率，而对磺胺二甲基嘧啶、氯霉素、四环素、红霉素、恩诺沙星等药物的交叉反应率很低，特异性良好，即本发明试剂盒可以用于检测罗非鱼体内2种孔雀石绿和2种结晶紫残留总量。

Claims (3)

1.一种孔雀石绿酶联免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于制备以下物质：孔雀石绿半抗原、孔雀石绿抗原、包被有包被原的酶标板、酶标二抗、孔雀石绿特异性抗体、孔雀石绿系列标准品、底物显色液、终止液、浓缩复溶液、浓缩洗涤液、氧化剂浓缩液、孔雀石绿提取剂、样品净化剂，所述孔雀石绿半抗原，其特征在于制备方法包括如下步骤：

(1)于25mL三角瓶中加入1g对羟基苯甲醛，2g氯化锌，溶于20mL无水乙醇中；

(2)加入3mLN，N-甲基苯胺，90℃回流24h，反应完毕，减压去溶剂，用体积比为1:2的乙酸乙酯和石油醚进行柱层析纯化；

(3)将其溶于20mL吡啶中，加入琥珀酸酐0.74g，与底物摩尔比为1∶1.2，在80℃下反应20h，反应完毕，减压去溶剂，加入稀盐酸调pH值至5左右，加入乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，无水硫酸镁干燥，减压去溶剂，用体积比为2:1的乙酸乙酯和石油醚进行柱层析纯化；

所述孔雀石绿半抗原的结构式如式(1)所示：

2.如权利要求1所述的一种孔雀石绿酶联免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于孔雀石绿半抗原能够与载体蛋白偶联得到孔雀石绿抗原。

3.如权利要求1或2所述的一种孔雀石绿酶联免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于孔雀石绿抗原的制备方法包括如下步骤：

(1)取10mg孔雀石绿半抗原，溶解于1mL二甲基甲酰胺中；

(2)取15mg二氯乙烷用0.2mL水充分溶解后于加入半抗原溶解液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A；

(3)称取载体蛋白40mg，使之充分溶解在2.8mL pH为7.2的PBS中，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h；

(4)用0.01mol/L PBS 4℃透析3d每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；

(5)分装，于-20℃保存备用。