CN103364553B - 检测硝基咪唑类药物的酶联免疫试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测硝基咪唑类药物的酶联免疫试剂盒，它含有：包被有甲硝唑偶联抗原的酶标板，酶标抗抗体工作液，硝基咪唑类药物特异性抗体工作液，甲硝唑标准品溶液，底物显色液，终止液，浓缩洗涤液，复溶液。本发明还公开了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测硝基咪唑类药物的方法，它包括：首先进行样品前处理，然后用试剂盒进行检测，最后分析检测结果。本发明提供的酶联免疫试剂盒可用于检测蜂蜜样品中硝基咪唑类药物的含量，其操作简便、费用低廉能够现场监控且适合大量样本的筛查。

Description

检测硝基咪唑类药物的酶联免疫试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及酶联免疫检测技术，具体涉及一种用于检测硝基咪唑类药物的酶联免疫试剂盒，其适用于蜂蜜中硝基咪唑类药物测定。

技术背景

硝基咪唑类药物是畜禽饲料中常用的抗原虫感染及抗菌药，主要用于防治家禽组织滴虫和寄生虫、牛的滴虫，猪的出血性肠炎、鱼的寄生虫感染、蜂的微孢子虫病等，并具有促生长作用，但是该类药物及其某些代谢物对哺乳动物具有致癌、致畸、致突变作用和遗传毒性，因此硝基咪唑类药物的不合理使用造成可食性动物组织中药物残留问题危害到人类的食品安全，我国已经禁止甲硝唑、地美硝唑、洛硝唑在肉食食品中使用，替硝唑禁止在兽药中使用，因此，需要一种既灵敏又精确的方法同时测定蜂蜜中的硝基咪唑类药物。

目前检测硝基咪唑类药物的方法主要有：高效液相色谱-紫外色谱、高效液相色谱二极管陈列检测器法，气相色谱氮磷检测器法、高效液相色谱-电喷雾质谱法，气相色谱法等，仪器检测方法操作繁琐且费用较高，推广应用受到限制。

发明内容

本发明的目的在于针对上述不足提供一种用于硝基咪唑类药物含量测定的酶联免疫试剂盒，其操作简单适合现场大批量样品的筛选。

本发明试剂盒，它包括：

(1)包被有甲硝唑偶联抗原的酶标板；

(2)酶标记抗抗体；

(3)硝基咪唑类药物特异性抗体；

(4)甲硝唑标准品溶液；

(5)底物显色液；

(6)终止液；

(7)浓缩洗涤液；

(8)复溶液。

所述甲硝唑偶联抗原为甲硝唑半抗原与载体蛋白的偶联物，所述载体蛋白可为卵清蛋白、牛血清白蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、鼠血清蛋白、人血清蛋白。

所述甲硝唑半抗原的结构如下：

所述甲硝唑半抗原制备过程：0.85g甲硝唑和1.0g琥珀酸酐，加入10ml吡啶，室温下搅拌12-20小时，蒸干溶剂，乙酸乙酯溶解，饱和氯化铵溶液洗涤，水洗，干燥，除去溶剂后在环己烷-乙酸乙酯中重结晶得到白色固体，为甲硝唑半抗原。

所述酶标记抗抗体的标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶，其中优选辣根过氧化物酶；酶标记抗抗体是采用戊二醛法或过碘酸钠法将标记酶与羊抗鼠抗抗体进行偶联得到的，优选过碘酸钠法。所述抗抗体为羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体。

所述硝基咪唑类药物特异性抗体可为硝基咪唑类药物单克隆抗体或硝基咪唑类药物多克隆抗体；它们均是用甲硝唑偶联抗原为免疫原得到的；所述硝基咪唑类药物特异性抗体可为鼠源、马源、羊源或兔源抗体，所述硝基咪唑类药物单克隆抗体优选为硝基咪唑类药物鼠单克隆抗体，所述硝基咪唑类药物多克隆抗体优选为硝基咪唑类药物兔多克隆抗体。

为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还包括甲硝唑标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、复溶液。

所述浓缩洗涤液为pH7.2-7.6，含有0.5-1.0％吐温20，0.01-0.04‰叠氮化钠的0.1-0.2mol/L磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量百分比。

所述复溶液为pH6.5-6.8含有5-10％酪蛋白的0.1-0.2mol/L磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量百分比。

当标记酶为辣根过氧化物酶时，显色剂由显色液A液和显色液B液组成，所述显色液A液为过氧化氢或过氧化脲，显色液B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，终止液为1～2mol/L的硫酸或盐酸缓冲液；当标记酶为碱性磷酸酯酶时，显色液为对硝基磷酸盐缓冲液、终止液为1～2mol/L氢氧化钠溶液。

其中酶标板在制备过程中所用的包被缓冲液为pH9.0-9.6，0.1-0.2mol/L碳酸盐缓冲液，所用封闭液为pH7.2-7.6，含有0.5-0.8％脱脂奶粉，0.1mol/L磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量百分比。

本发明中酶标板的制备过程为：用包被缓冲液将包被抗原稀释成0.1～0.2μg/ml，每孔加入100μl，37℃温育2h或4℃过夜，倾去包被液，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入150～200μl封闭液，37℃温育1～2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。

本发明的检测原理为：

当在微孔条上预包被甲硝唑偶联抗原时，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入硝基咪唑类药物特异性抗体溶液，样本中的硝基咪唑类药物与酶标板上包被的甲硝唑偶联抗原竞争硝基咪唑类药物特异性抗体，加入酶标记抗抗体进行放大作用，用显色液显色，样本吸光值与硝基咪唑类药物的含量呈负相关，与标准曲线比较即可得出样本中硝基咪唑类药物的含量。同时根据酶标板上颜色的深浅，与系列浓度的甲硝唑标准品溶液颜色的比较可粗略判断样品中硝基咪唑类药物的浓度范围。

本发明还提供了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测硝基咪唑类药物的方法，它包括步骤：

(1)样品前处理；

(2)用试剂盒进行检测；

(3)分析检测结果。

本发明检测硝基咪唑类药物的酶联免疫试剂盒主要采用间接竞争ELISA方法检测样品中硝基咪唑类药物的含量；对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批量样品；采用高特异性的硝基咪唑类药物单克隆抗体，主要试剂以工作液的形式提供，检验方法方便易行，具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。本发明的酶联免疫试剂盒，结构简单、使用方便、价格便宜、携带便利、检测方法高效、准确、简便、适于大批量样品筛选的定性、定量。

附图说明

图1：甲硝唑偶联抗原为包被原、酶标抗抗体为酶标记物的试剂盒的标准曲线图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。

实施例1试剂盒组分的制备及试剂盒组建

包被抗原制备

甲硝唑半抗原制备

0.85g甲硝唑和1.0g琥珀酸酐，加入10ml吡啶，室温下搅拌12-20小时，蒸干溶剂，乙酸乙酯溶解，饱和氯化铵溶液洗涤，水洗，干燥，除去溶剂后在环己烷-乙酸乙酯中重结晶得到白色固体，为甲硝唑半抗原。

甲硝唑半抗原与卵清蛋白偶联得到包被抗原

1)取15mg甲硝唑半抗原用1.5ml DMF溶解，冷却至10℃；

2)取氯甲酸异丁酯10μl加入1)中，10℃搅拌反应30min；

3)取25mg卵清蛋白用2.2ml 50mmol/L Na₂CO₃溶解10℃反应4h，然后4℃过夜；

4)0.01mol/lPBS 4℃透析3天，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质，分装，于-20℃保存备用。

免疫抗原制备

甲硝唑半抗原与牛血清白蛋白偶联得到免疫抗原。

1)取12mg甲硝唑半抗原，溶解于1mL DMF中；

2)取15mg EDC用0.2ml水充分溶解后于加入1)中，室温下搅拌24h；

3)称取BSA 40mg，使之充分溶解在3ml水中，将步骤2)得到的反应液逐滴缓慢滴加到牛血清白蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h；

4)用0.01mol/lPBS 4℃透析3d每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质，分装，于-20℃保存备用。

硝基咪唑类药物单克隆抗体的制备

a.动物免疫

将上述步骤得到的免疫抗原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生抗血清。

b.细胞融合和克隆化

取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按9∶1(数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选得到稳定硝基咪唑类药物单克隆抗体的硝基咪唑类药物单克隆杂交瘤细胞株。

c.细胞冻存和复苏

将杂交瘤细胞用冻存液制成1×10⁹个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

d.单克隆抗体的制备与纯化

增量培养法：将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，-20℃保存。

硝基咪唑类药物多克隆抗体的制备

采用新西兰大白兔作为免疫动物，以为甲硝唑偶联抗原为免疫原，免疫剂量为1.5mg/kg，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔3～4周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐剂。最后一次免疫10天后采血，测定血清抗体效价，心脏采血，用硫酸铵分级沉淀得到纯化的多克隆抗体。

羊抗鼠抗抗体的制备过程：以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。

羊抗兔抗抗体的制备过程：以羊作为免疫动物，以兔源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗兔抗抗体。

酶标板的制备

用包被缓冲液将包被抗原稀释成0.1-0.2μg/ml，每孔加入100μl，37℃温育2h或4℃过夜，倾去包被液，用稀释20倍的浓缩洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后再每孔中加入200μl封闭液，37℃温育2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。

酶标记羊抗鼠抗抗体的制备

将抗抗体与辣根过氧化物酶(HRP)采用改良后的过碘酸钠法进行偶联。传统的过碘酸钠法要求反映体系中酶与抗抗体的摩尔浓度比为4∶1；由于辣根过氧化物酶在强氧化的作用下产生许多与抗抗体结合的位点，这样活化的辣根过氧化物酶分子充当了连接各分子的桥梁，降低了酶标记物的酶活性，使制备的偶联物中混有许多聚合体，为了解决这个问题，我们将传统的方法进行了改良，即：

1)省去了氨基的封闭过程，因为能产生自身氨基连接的氨基实际很少。

2)降低了辣根过氧化物酶：抗抗体的摩尔浓度比率至2∶1，改良后的方法比传统的方法简便，对酶的活性的损失减少。

检测硝基咪唑类药物的酶联免疫试剂盒的组建

组建检测硝基咪唑类药物的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分：

(1)包被甲硝唑偶联抗原的酶标板；

(2)用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体；

(3)硝基咪唑类药物单克隆抗体工作液；

(4)甲硝唑标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L、0.05μg/L、0.15μg/L、0.6μg/L、2.4μg/L、9.6μg/L；

(5)底物显色液由A液和B液组成，底物显色液A液为过氧化脲，底物显色液B液四甲基联苯胺；

(6)终止液为2mol/L盐酸；

(7)浓缩洗涤液为pH7.2-7.6，含有0.5-1.0％吐温20，0.01-0.04‰叠氮化钠的0.1-0.2mol/L磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量百分比。

(8)复溶液为pH6.5-6.8，含有5-10％酪蛋白的0.1-0.2mol/L磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量百分比。

实施例2样品中硝基咪唑类药物的检测

1.样品前处理

样品的前处理主要是为了从样品中获得硝基咪唑类药物溶液，从而用于后续的检测。下面是样品的前处理方法：

称取3.0±0.05g蜂蜜至50ml聚苯乙烯离心管中；加入3ml 0.1M碳酸盐缓冲液充分溶解蜂蜜；加入9ml乙酸乙酯，振荡5min，3000g以上，室温离心5min；取6ml上层有机相至50ml聚苯乙烯离心管中，分别加入1ml乙酸乙酯，1ml甲醇，1ml正己烷，再加入2ml 2M氢氧化钠溶液，涡动5min；3000g以上，室温离心5min；移取4ml上层有机相至10ml干净玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；加入1ml正己烷，涡动30s，加入0.5ml复溶工作液，涡动1min，3000g以上，室温离心5min；除去上层有机相，取下层水相50μl用于分析。

2.用试剂盒检测

向包被有甲硝唑偶联抗原的酶标板微孔中加入甲硝唑标准品溶液或样品溶液50μl，再加入硝基咪唑类药物单克隆抗体工作液50μl，用盖板模封板，0-4℃避光反应60min，每孔加入250μl洗涤液，30s后倒出孔内液体，如此重复操作共洗板4-5次，用吸水纸拍干，加入辣根过氧化物酶标记羊抗鼠抗抗体工作液100μl，用盖板模封板，25℃恒温箱中反应30min，倒出孔内液体，每孔加入250μl洗涤液，30s后倒出孔内液体，如此重复操作共洗板4-5次，用吸水纸拍干，每孔加入底物显色液A液过氧化脲，底物显色液B液四甲基联苯胺(TMB)，轻轻振荡混匀，25℃恒温箱避光显色30min，每孔加入2mol/L终止液盐酸50μl，轻轻振荡混匀，用酶标仪波长设定在450nm处，测定每孔吸光度值(OD值)。

3.检测结果分析

用所获得的每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准品溶液(0标准)的吸光度值(B₀)再乘以100％，得到百分吸光度值。以甲硝唑标准品浓度(μg/L)的半对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。用同样的办法计算样品溶液的百分吸光度值，相对应每一个样品的浓度，则可从标准曲线上读出硝基咪唑类药物的含量。

实验例1标准品精密度试验：

分别从三个不同的时间段制备的酶标板中各抽出一批酶标板，每批各抽取5个试剂盒，每板各抽出20个微孔，测定0.6μg/L标准溶液的吸光度值，计算变异系数。

表1标准可重复性试验(CV％)

通过上述试验结果可以得出，每批试剂盒各5次标准品变异系数在2.4％-9.2％之间。

实验例2样本精密度和准确度试验

以重复测定某一浓度样品的检测结果变异系数(CV％)作为精密度评价指标。以回收率作为准确度评价指标。变异系数CV％计算公式为：CV(％)＝SD/X×100％；其中SD为标准偏差，X为测定数据的平均值。回收率计算公式为：回收率(％)＝实际测定值/理论值×100％。其中理论值为模拟样品的添加浓度。

按0.2、0.4μg/L两个浓度甲硝唑、洛硝唑、二甲硝咪唑对蜂蜜样品进行添加回收测定，每个样品做4个平行，用三批不同试剂进行测定，计算样品的平均回收率及精密度，见表2。

表2精密度及准确度试验

以0.2、0.4μg/L两个浓度的甲硝唑对蜂蜜样品进行添加，平均回收率为94.6～105.6％，批内变异系数在7.6～8.2％之间，批间变异系数在8.9～10.3％之间；以0.2、0.4μg/L两个浓度的二甲硝咪唑对蜂蜜样品进行添加，平均回收率为106.2～109.0％，批内变异系数在9.6～10.5％之间，批间变异系数在10.5～12.4％之间；以0.2、0.4μg/L两个浓度的洛硝唑对蜂蜜样品进行添加，平均回收率为92.4～95.6％，批内变异系数在9.2～11.7％之间，批间变异系数在9.9～12.5％之间。检测结果的精密度和准确度均符合相关标准要求。

实验例3交叉反应率试验：

选择硝基咪唑类药物测定交叉反应率，通过各种药物的标准曲线分别得到其50％抑制浓度。用下式计算试剂盒对其它药物的交叉反应率。交叉反应率越大，那么此试剂盒对硝基咪唑类药物的检测的特异性就越好。

交叉反应率(％)＝(引起50％抑制甲硝唑的浓度/引起50％抑制的类似物浓度)×100％

表3试剂盒的特异性

竞争物	交叉反应率(％)
		甲硝唑	100
二甲硝咪唑	216
		洛硝唑	82

塞克硝唑	20
		奥硝唑	18
替硝唑	6

实验例4

试剂盒保存条件为2～8℃，经过12个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(零标准)、50％抑制浓度、硝基咪唑类药物添加实际测定值均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存条件下放置9天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻5天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2～8℃可以保存12个月以上。

Claims (2)

1.一种检测样品中硝基咪唑类药物含量的方法，包括步骤：

(1)样品前处理：

称取3.0±0.05g蜂蜜至50ml聚苯乙烯离心管中；加入3ml 0.1M碳酸盐缓冲液充分溶解蜂蜜；加入9ml乙酸乙酯，振荡5min，3000g以上，室温离心5min；取6ml上层有机相至50ml聚苯乙烯离心管中，分别加入1ml乙酸乙酯，1ml甲醇，1ml正己烷，再加入2ml 2M氢氧化钠溶液，涡动5min；3000g以上，室温离心5min；移取4ml上层有机相至10ml干净玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；加入1ml正己烷，涡动30s，加入0.5ml复溶液，涡动1min，3000g以上，室温离心5min；除去上层有机相，取下层水相50μl用于分析；

(2)用试剂盒进行检测；

(3)分析检测结果；

其特征在于所述试剂盒为检测硝基咪唑类药物的酶联免疫试剂盒，它含有：

(1)包被甲硝唑偶联抗原的酶标板；

(2)用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体；

(3)硝基咪唑类药物单克隆抗体工作液；

(4)甲硝唑标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L、0.05μg/L、0.15μg/L、0.6μg/L、2.4μg/L、9.6μg/L；

(5)底物显色液由A液和B液组成，底物显色液A液为过氧化脲，底物显色液B液为四甲基联苯胺；

(6)终止液为2mol/L盐酸；

(7)浓缩洗涤液为pH7.2-7.6，含有0.5％-1.0％吐温20，0.01‰-0.04‰叠氮化钠的0.1-0.2mol/L磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量百分比；

(8)复溶液为pH6.5-6.8，含有5％-10％酪蛋白的0.1-0.2mol/L磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量百分比；

所述甲硝唑偶联抗原是甲硝唑半抗原与载体蛋白偶联得到；所述半抗原的制备步骤为：0.85g甲硝唑和1.0g琥珀酸酐，加入10ml吡啶，室温下搅拌12-20小时，蒸干溶剂，乙酸乙酯溶解，饱和氯化铵溶液洗涤，水洗，干燥，除去溶剂后在环己烷-乙酸乙酯中重结晶得到白色固体，为甲硝唑半抗原，所述甲硝唑半抗原结构如下：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述酶标板在制备过程中所用的包被缓冲液为pH9.0-9.6，0.1-0.2mol/L碳酸盐缓冲液，所用的封闭液为pH7.2-7.6，含有0.5％-0.8％脱脂奶粉的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量百分比。