CN114774367B - 一株分泌甲硝唑单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

一株分泌甲硝唑单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株分泌甲硝唑单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，本发明的杂交瘤细胞株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2021年05月13日，保藏编号CGMCCNo.22330。本发明所述免疫抗原制备的单克隆抗体灵敏度高，以MNZ‑GA耦合载体蛋白制备的完全抗原为包被抗原，抗体在ic‑Elisa中的IC50值为0.075ng/mL。本发明所提供的甲硝唑半抗原，以及所述甲硝唑抗原在抗体制备和甲硝唑药物残留分析检测应用方面具有十分重要的意义和重大价值。

Description

一株分泌甲硝唑单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
技术领域
本发明属于免疫化学技术领域，尤其是指一株分泌甲硝唑单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。
背景技术
甲硝唑作为一种抗生素和抗原虫剂，对治疗或预防厌氧菌引起的系统或局部感染效果显著，抗菌谱包括脆弱拟杆菌和其他拟杆菌属，梭形杆菌、产气梭状芽孢杆菌、真杆菌、韦容球菌、消化球菌和消化链球菌等，对组织滴虫、毛滴虫、均有杀灭作用，对球虫也有一定的抑制作用。由于甲硝唑对厌氧菌的临床效果显著，其也被广泛用于畜禽水产养殖中疾病的治疗，但不当的使用以及滥用会导致其在动物体内大量残留，从而危害人体健康。我国对动物性食品中甲硝唑的药物残留做出了不得检出的严格的限定。因此，建立快速、有效、高灵敏的检测甲硝唑含量的方法具有重要意义及市场价值。
目前，对于动物性食品中甲硝唑的残留监测仍以仪器分析为主，包括液相色谱、气相色谱和液质联用技术等。尽管这些方法灵敏度和可靠性较高，但需要较高专业性、复杂的前处理技术，且具有耗时长和成本高的缺陷。近年来，随着免疫分析技术的快速发展，建立一种高效、快速和高灵敏的免疫检测方法对于动物性食品中甲硝唑药物残留的检测具有十分重要的意义。
影响免疫分析检测技术发展的根本要素时高灵敏度和高亲和力抗体的制备，而制备性能优异抗体的关键就是半抗原的设计和合成，以及完全抗原的构建。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明在半抗原的设计过程中，以2-甲基位置为衍生位点，一方面，最大限度地保留了甲硝唑原有官能团结构，不引入其他杂原子，另一方面，通过碳链延长能够使其与载体蛋白耦合后最大限度地暴露自身官能团结构，从而增加免疫的特异性，对制备高灵敏度和高特异性的甲硝唑抗体具有十分重要的意义。
本发明的第一个目的是提供一株分泌甲硝唑单克隆抗体的杂交瘤细胞株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2021年05月13日，保藏编号CGMCC No.22330。
本发明的第二个目的是提供一种甲硝唑单克隆抗体，所述的甲硝唑单克隆抗体由保藏编号为CGMCC No.22330的杂交瘤细胞株分泌得到。
本发明的第三个目的是提供所述的杂交瘤细胞株或所述的甲硝唑单克隆抗体在检测甲硝唑中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种试剂盒，所述试剂盒中含有所述的杂交瘤细胞株或所述的甲硝唑单克隆抗体。
本发明的第五个目的是提供所述试剂盒在检测甲硝唑中的应用。
本发明的第六个目的是提供一种甲硝唑半抗原，其结构式为：
本发明的第七个目的是提供所述的甲硝唑半抗原的制备方法，包括如下步骤：
(1)先称取甲硝唑(MNZ，40g,233.9mmol)溶解到无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF，400mL)中，然后向上述溶液中加入N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛(DMF-DMA，400mL)和三氟乙酸(TFA，2mL)，在100℃和充氮气保护的条件下保持磁力搅拌反应48h，反应完成后，真空旋转蒸发浓缩得到黑色固体化合物1(37g,69.9％)；
(2)先将化合物1(37g,163.7mmol)和三乙胺(TEA,33.1g,322.4mmol)溶解到二氯甲烷(370mL)中，然后在0℃和氮气保护的环境下逐滴向上述溶液中加入乙酰氯(19.3g,245.6mmol)，在室温环境下保持磁力搅拌反应过夜；反应完成后，上述溶液体系分别用纯水和饱和氯化钠清洗，得到的有机相真空旋转蒸发浓缩后用硅胶柱层析色谱(SGC)纯化得到红色固体化合物2(36g,82％)；
(3)先将化合物2(36g,134.3mmol)和高碘酸钠(57.2g,268.6mmol)溶解到四氢呋喃-水溶液中(v/v＝1:1，720mL)，并保持室温环境下磁力搅拌过夜。上述反应完成后，用乙酸乙酯萃取上述反应体系(200mL/次，5次)，萃取后的乙酸乙酯有机相合并后用饱和氯化钠清洗并真空旋转蒸发浓缩；粗产物用SGC纯化后得到黄色油状化合物3(15g,49.2％)；
(4)先将4-羧丁基三苯基溴化膦(9.76g,22mmol)溶解到四氢呋喃(100mL)中，然后在0℃和充氮气保护条件下逐滴向上述溶液中加入双三甲基硅基胺基锂(HMDSLi，48.5mL)，保持上述溶液体系在室温环境下磁力搅拌反应1h；上述反应体系完成后冷却至0℃，并将溶解在四氢呋喃(50mL)中的化合物3(5g,22mmol)逐滴加入到上述反应体系，保持在室温环境下磁力搅拌反应过夜；上述反应完成后，混合物溶液体系用纯水猝灭并浓缩。将得到的粗产物化合物4溶解到甲醇-水溶液中(v/v＝1:1，200mL),并加入氢氧化锂(1.85g,44mmol)，上述溶液体系在室温环境下保持磁力搅拌过夜；反应物真空旋转蒸发浓缩后用乙酸乙酯萃取2次(100mL/次)，用0.5M HCl将萃取后的水相体系pH调节到3-4，并再次用乙酸乙酯萃取3次(100mL/次)。将上述萃取的有机相合并后用饱和氯化钠清洗，并真空旋转蒸发浓缩。所得粗产物用pre-HPLC纯化后得到黄色固体半抗原MNZ-COOH(3g,51.2％)。
本发明的第八个目的是提供一种甲硝唑免疫抗原，由所述的甲硝唑半抗原与载体蛋白偶联所得。
进一步地，所述的载体蛋白为牛血清蛋白、卵清蛋白、匙孔血蓝蛋白或人血清白蛋白。
本发明的第九个目的是提供一种甲硝唑完全抗原的制备方法，包括如下步骤：
(1)将所述甲硝唑半抗原MNZ-COOH(16.2mg，0.06mM)溶解到N,N-二甲基甲酰胺(DMF，1mL)溶液中，然后加入溶解在N,N-二甲基甲酰胺(DMF，0.2mL)里的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，34.3mg)和溶解在MES(0.1M,pH＝4.0,0.2mL)里的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，20.7mg)，保持室温环境下磁力搅拌1h，得到溶液A；
(2)将载体蛋白溶解于的碳酸盐缓冲液(CBS，0.05M，pH＝9.6)中，得到溶液B，本研究优选牛血清蛋白BSA(67mg，0.001mM)；
(3)在室温环境下，向保持磁力搅拌的溶液B中逐滴缓慢滴加溶液A，并用氢氧化钠(0.5M)维持溶液pH在8.5-9之间,保持室温环境下磁力搅拌反应6-8h；
(4)将上述反应完成的溶液体系密封装入透析袋中，并在磷酸盐缓冲液(PBS，0.05M，pH＝7.4)中透析3天，每隔8h换一次透析液，即得到甲硝唑免疫抗原。
本发明的第十个目的是提供一种甲硝唑包被抗原的制备方法，包括如下步骤：
(1)称取甲硝唑(1g)和戊二酸酐(1g)于100mL圆底烧瓶中，加入40mL无水吡啶溶解，置于恒温磁力搅拌器冷凝回流反应过夜；反应完成后，溶剂通过旋转蒸发除去，然后加入40mL纯水，用乙酸乙酯萃取3次(20mL/次)，合并收集的有机相，并通过旋转蒸发干燥得到油状物，最后用乙酸乙酯和石油醚重结晶得到白色固体MNZ-GA。
(2)将上述MNZ-GA(16.2mg，0.06mM)溶解到N,N-二甲基甲酰胺(DMF，1mL)溶液中，然后加入溶解在N,N-二甲基甲酰胺(DMF，0.2mL)里的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，34.3mg)和溶解在MES(0.1M,pH＝4.0,0.2mL)里的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，20.7mg)，保持室温环境下磁力搅拌1h，得到溶液A。
(3)将载体蛋白溶解于的碳酸盐缓冲液(CBS，0.05M，pH＝9.6)中，得到溶液B，本研究优选卵清蛋白OVA(45mg，0.001mM)。
(4)在室温环境下，向保持磁力搅拌的溶液B中逐滴缓慢滴加溶液A，并用氢氧化钠(0.5M)维持溶液pH在8.5-9之间,保持室温环境下磁力搅拌反应6-8h。
(5)将上述反应完成的溶液体系密封装入透析袋中，并在磷酸盐缓冲液(PBS，0.05M，pH＝7.4)中透析3天，每隔8h换一次透析液，即得到甲硝唑包被抗原。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
本发明所述免疫抗原制备的单克隆抗体灵敏度高，以MNZ-GA耦合载体蛋白制备的完全抗原为包被抗原，抗体在ic-Elisa中的IC50值为0.075ng/mL。本发明所提供的甲硝唑半抗原，以及所述甲硝唑抗原在抗体制备和甲硝唑药物残留分析检测应用方面具有十分重要的意义和重大价值。
生物材料样品保藏：一株分泌甲硝唑单克隆抗体的杂交瘤细胞株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2021年05月13日，保藏编号CGMCCNo.22330。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1(a)甲硝唑半抗原的LC-MS鉴定图；
图1(b)甲硝唑半抗原的NMR鉴定图；
图2甲硝唑单克隆抗体灵敏度测试；
图3甲硝唑检测卡检测实际样本与HPLC检测一致性分析结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
溶液的配制：
碳酸盐缓冲液(CBS)：称取Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用。
磷酸盐缓冲液(PBS)：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH2PO4，2.9g Na2HPO4·12H2O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；
PBST：含0.05％吐温20的PBS；
TMB显色液：A液：Na2HPO4·12H2O 18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60mg TMB溶于100mL乙二醇中。A、B液按1:5混合即为TMB显色液，现用现混。
实施例1：甲硝唑半抗原的合成
(1)先称取甲硝唑(MNZ，40g,233.9mmol)溶解到无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF，400mL)中，然后向上述溶液中加入N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛(DMF-DMA，400mL)和三氟乙酸(TFA，2mL)，在100℃和充氮气保护的条件下保持磁力搅拌反应48h，反应完成后，真空旋转蒸发浓缩得到黑色固体化合物1(37g,69.9％)。
(2)先将化合物1(37g,163.7mmol)和三乙胺(TEA,33.1g,322.4mmol)溶解到二氯甲烷(370mL)中，然后在0℃和氮气保护的环境下逐滴向上述溶液中加入乙酰氯(19.3g,245.6mmol)，在室温环境下保持磁力搅拌反应过夜。反应完成后，上述溶液体系分别用水和饱和氯化钠清洗，得到的有机相真空旋转蒸发浓缩后用硅胶柱层析色谱(SGC)纯化得到红色固体化合物2(36g,82％)。
(3)先将化合物2(36g,134.3mmol)和高碘酸钠(57.2g,268.6mmol)溶解到四氢呋喃-水溶液中(v/v＝1:1，720mL)，并保持室温环境下磁力搅拌过夜。上述反应完成后，用乙酸乙酯萃取上述反应体系(200mL/次，5次)，萃取后的乙酸乙酯有机相合并后用饱和氯化钠清洗并真空旋转蒸发浓缩。粗产物用SGC纯化后得到黄色油状化合物3(15g,49.2％).
(4)先将4-羧丁基三苯基溴化膦(9.76g,22mmol)溶解到四氢呋喃(100mL)中，然后在0℃和充氮气保护条件下逐滴向上述溶液中加入双三甲基硅基胺基锂(HMDSLi，48.5mL)，保持上述溶液体系在室温环境下磁力搅拌反应1h。上述反应体系完成后冷却至0℃，并将溶解在四氢呋喃(50mL)中的化合物3(5g,22mmol)逐滴加入到上述反应体系，保持在室温环境下磁力搅拌反应过夜。上述反应完成后，混合物溶液体系用纯水猝灭并浓缩。将得到的粗产物化合物4溶解到甲醇-水溶液中(v/v＝1:1，200mL),并加入氢氧化锂(1.85g,44mmol)，上述溶液体系在室温环境下保持磁力搅拌过夜。反应物真空旋蒸浓缩后用乙酸乙酯萃取2次(100mL/次)，用0.5M HCl将萃取后的水相体系pH调节到3-4，并再次用乙酸乙酯萃取3次(100mL/次)。将上述萃取的有机相合并后用饱和氯化钠清洗，并真空旋转蒸发浓缩。所得粗产物用pre-HPLC纯化后得到黄色固体半抗原MNZ-COOH(3g,51.2％)。
实施例2：甲硝唑完全抗原的合成
甲硝唑免疫抗原的制备方法，包括如下步骤：
(1)将式1所述甲硝唑半抗原MNZ-COOH(16.2mg，0.06mM)溶解到N,N-二甲基甲酰胺(DMF，1mL)溶液中，然后加入溶解在N,N-二甲基甲酰胺(DMF，0.2mL)里的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，34.3mg)和溶解在MES(0.1M,pH＝4.0,0.2mL)里的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，20.7mg)，保持室温环境下磁力搅拌1h，得到溶液A。
(2)将载体蛋白溶解于的碳酸盐缓冲液(CBS，0.05M，pH＝9.6)中，得到溶液B，本研究选用牛血清蛋白BSA(67mg，0.001mM)。
(3)在室温环境下，向保持磁力搅拌的溶液B中逐滴缓慢滴加溶液A，并用氢氧化钠(0.5M)维持溶液pH在8.5-9之间,保持室温环境下磁力搅拌反应6-8h。
(4)将上述反应完成的溶液体系密封装入透析袋中，并在磷酸盐缓冲液(CBS,0.05M,pH＝7.4)中透析3天，每隔8h换一次透析液，即得到甲硝唑完全抗原。
甲硝唑包被抗原的制备方法，包括如下步骤：
(1)称取甲硝唑(1g)和戊二酸酐(1g)于100mL圆底烧瓶中，加入40mL无水吡啶溶解，置于恒温磁力搅拌器冷凝回流反应过夜；反应完成后，溶剂通过旋转蒸发除去，然后加入40mL纯水，用乙酸乙酯萃取3次(20mL/次)，合并收集的有机相，并通过旋转蒸发干燥得到油状物，最后用乙酸乙酯和石油醚重结晶得到白色固体MNZ-GA。
(2)将上述MNZ-GA(16.2mg，0.06mM)溶解到N,N-二甲基甲酰胺(DMF，1mL)溶液中，然后加入溶解在N,N-二甲基甲酰胺(DMF，0.2mL)里的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，34.3mg)和溶解在MES(0.1M,pH＝4.0,0.2mL)里的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，20.7mg)，保持室温环境下磁力搅拌1h，得到溶液A。
(3)将载体蛋白溶解于的碳酸盐缓冲液(CBS，0.05M，pH＝9.6)中，得到溶液B，本研究优选卵清蛋白OVA(45mg，0.001mM)。
(4)在室温环境下，向保持磁力搅拌的溶液B中逐滴缓慢滴加溶液A，并用氢氧化钠(0.5M)维持溶液pH在8.5-9之间,保持室温环境下磁力搅拌反应6-8h。
(5)将上述反应完成的溶液体系密封装入透析袋中，并在磷酸盐缓冲液(PBS，0.05M，pH＝7.4)中透析3天，每隔8h换一次透析液，即得到甲硝唑包被抗原。
实施例3：甲硝唑杂交瘤细胞株1A10的制备
(1)小鼠免疫：选择健康的6～8周龄的Balb/C雌性小鼠进行免疫。取甲硝唑完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后加强免疫都用不完全弗氏佐剂，每次免疫之间间隔21天。第三次免疫后7天采血，使用ic-ELISA测定小鼠血清效价和抑制，选择效价高抑制好的小鼠，在第五次免疫后21天冲击免疫，腹腔注射，要求冲免剂量减半且不含任何佐剂。
(2)细胞融合和亚克隆：通过聚乙二醇(PEG 4000)法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞进行融合，采用选择性培养基(HAT培养基)筛选出杂交瘤细胞，并用HT培养基进行细胞培养。融合一周后利用ic-ELISA法检测阳性细胞孔，并进一步利用ic-ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对抑制较好的阳性细胞孔进行亚克隆，一周后再次检测、挑孔、亚克隆。按上述方法进行三次亚克隆后获得能分泌甲硝唑高特异抗体的单克隆杂交瘤细胞株1A10。
实施例4：甲硝唑单克隆抗体的制备与鉴定
取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化。在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01M PBS溶液(pH7.4)溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。
单克隆抗体的鉴定：上述纯化制备得到的单克隆抗体通过ic-ELISA方法进行鉴定，包含如下步骤：
1.包被：将甲硝唑抗原用0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液从1μg/mL开始3倍比稀释，100μL/孔，37℃反应2h。
2.洗涤：将板内溶液倾去，并用洗涤液洗涤3次，每次3min.
3.封闭：拍干后加入200μL/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用。
4.加样：将抗血清从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μL/孔，37℃反应1h；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃反应1h。
5.显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min.
6.终止和测定：每孔加入50μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD450值。
灵敏度测试：用ic-ELISA测定单克隆抗体甲硝唑的标准曲线如图2所示，其中标准曲线方程为：y＝0.084+1.523(1+(x/0.072)^1.001),半数抑制浓度值(IC50)为：0.072ng/mL，说明对甲硝唑有很好的灵敏度，可用于甲硝唑免疫分析检测。
交叉反应率测试：选取硝基咪唑类药物类似物进行抗体的交叉测试，先分别通过标准曲线测定塞克硝唑、地美硝唑、奥尼达唑、异丙硝唑、洛硝达唑、替硝唑的IC50值，然后计算交叉反应率：交叉反应率(％)＝(IC50(甲硝唑)/IC50(类似物))×100％，结果见表1。
结果表明，本发明制备的单克隆抗体对塞克硝唑、地美硝唑、奥尼达唑、异丙硝唑均有较好的识别性，可用于这些药物残留的检测分析。
表1单克隆抗体对硝基咪唑类药物类似物的交叉反应率
类似物 交叉反应率
甲硝唑 100％
塞克硝唑 63.0％
地美硝唑 58.5％
奥尼达唑 33.1％
异丙硝唑 31.7％
洛硝达唑 ＜1％
替硝唑 ＜1％
实施例5：甲硝唑胶体金免疫层析试纸卡的制备
(1)甲硝唑胶体金免疫层析试纸卡的组成
该检测卡由卡壳和装在里面的试纸条组成。试纸条包含五个部分：PVC底板、吸水垫、反应膜、结合垫和样品垫。
反应膜固定在所述PVC底板中间位置，吸水垫固定在PVC底板一端并叠压搭接在所述反应膜的一端上，结合垫固定在PVC底板另一端并叠压搭接在反应膜的另一端上，样品垫固定在PVC底板上并叠压搭接在结合垫上。
其中，反应膜中间区域划有两条线，分别为：靠近吸水垫一侧为划有羊抗鼠IgG抗体的质控线(C线)，靠近结合垫一侧划有甲硝唑抗原的检测线(T线)，结合垫上喷涂有用胶体金标记的实施例3制备的甲硝唑特异性抗体。
将组装好的试纸板切成试纸条，装入卡壳得到甲硝唑检测卡。
(2)甲硝唑胶体金免疫层析检测卡的制备
a.胶体金纳米粒子的合成：取22.5mL氯金酸溶液(4g/L)加入到装有277.5mL超纯水的锥形瓶中，上述溶液保持磁力搅拌并加热(300℃)，溶液沸腾后，向上述溶液中加入8mL的柠檬酸钠溶液(20mg/mL)，并保持加热和搅拌30min，反映完成后自然冷却至室温即得到胶体金纳米粒子溶液；
b.金标抗体的制备：取上述胶体金纳米粒子溶液5mL到15ml离心管中，并用0.1M碳酸钾溶液将上述胶体金纳米粒子溶液pH值调节至8.2，然后加入50ug甲硝唑特异性抗体，涡旋混匀后静置45min，再加入10％(m/v)牛血清蛋白溶液，涡旋混匀后静置2h，反应完成后在8000rpm和4℃条件下离心40min，底部沉淀物用0.5mL重悬缓冲液复溶，得到胶体金纳米粒子标记的甲硝唑抗体结合物；
c.结合垫的制备：用喷金滑膜一体机将步骤(b)制备的金标抗体均匀地喷涂在1cm宽的玻璃纤维垫上(10uL/cm)，37℃下烘12h制备得到结合垫；
d.反应膜的制备：用磷酸盐缓冲液(0.01M,pH＝7.4)分别将羊抗鼠IgG抗体和甲硝唑完全抗原稀释到0.2mg/mL和0.1mg/mL，通过喷金划膜一体机依次分别划在硝酸纤维膜上，划线流量均为0.9uL/cm，间距为4mm，37℃下烘12h制备得到反应膜；
e.检测卡的组装：反应膜粘贴在在PVC底板中间位置，吸水垫粘贴在PVC底板一端并叠压搭接在反应膜的一端上，结合垫粘贴在PVC底板另一端并叠压搭接在反应膜的另一端上，样品垫挨着结合垫粘贴在PVC底板上并叠压搭接在结合垫上，即得到试纸板，将上述试纸板沿纵向斩切成2～4mm的试纸条，本实施例中选用3mm的试纸条，使得每条均包含PVC底板、吸水垫、反应膜、结合垫和样品垫，最终将上述试纸条封装到卡壳即得到用于甲硝唑快速检测的免疫层析检测卡。
(3)甲硝唑胶体金免疫层析检测卡的使用方法
a.样品前处理：准确称取1g±0.01g均质后的样品(肌肉、肝脏组织)到15mL离心管中，加入8mL乙酸乙酯涡旋2min，4000r/min离心5min。上清转移至50mL鸡心瓶中，用8mL乙酸乙酯重复提取一次，合并两次提取液，40℃空气吹干，残渣用3mL PBS溶解，取100uL待测。
牛奶样本可直接检测；蜂蜜，鸡蛋样本均质称样后，加入等量(m/v)的纯水，然后按上述步骤处理。
b.检测步骤：取出试纸卡水平置于38℃孵育器中，预热3min，吸取100ul待测样本溶液加入到样品孔中，孵育反应6min后，将检测卡插入检测卡读数仪中，5s后基于内置标准曲线自动计算显示测试浓度。
c.内置标准曲线的建立：通过向阴性样本添加标准品的方式制备梯度浓度的加标阳性样本，用甲硝唑胶体金免疫层析试纸卡检测阴性样本和这些加标阳性样本，用检测卡读数仪测定它们的T线和C线颜色的灰度值。以阴性样本和这些加标阳性样本的浓度值为横坐标，以对应T线和C线颜色灰度值的比值(T/C)为纵坐标绘制标准曲线，并用实际阳性样本矫正后输入检测卡读数仪中。
(4)甲硝唑胶体金免疫层析检测卡的检测
a.灵敏度测定：配制梯度浓度的甲硝唑标准品溶液,并用甲硝唑胶体金免疫层析检测卡测定。以标准品浓度为横坐标，以对应T线和C线颜色灰度值的比值(T/C)为纵坐标绘制标准曲线。
甲硝唑检测卡标准曲线方程为：y＝0.085+1.714/(1+(x/0.498)^0.909)，相关系数为0.999，半数抑制浓度值(IC50)为0.498ng/mL。
b.样本标准曲线的建立：向阴性样本中添加不同量标准物质，制备梯度浓度的阳性添加样本，经过3(a)的前处理后用甲硝唑胶体金免疫层析检测卡测定。以标准品浓度为横坐标，以对应T线和C线颜色灰度值的比值(T/C)为纵坐标绘制标准曲线。
牛奶中甲硝唑标准曲线方程为：y＝0.063+1.707/(1+(x/0.559)^0.918)，相关系数为0.998，半数抑制浓度值(IC50)为0.6μg/kg。
鸡肉中甲硝唑标准曲线方程为：y＝0.077+1.799/(1+(x/1.985)^0.973)，相关系数为0.999，半数抑制浓度值(IC50)为1.985μg/kg。
鸡蛋中甲硝唑标准曲线方程为：y＝0.089+1.548/(1+(x/1.719)^0.857)，相关系数为0.997，半数抑制浓度值(IC50)为1.719μg/kg。
蜂蜜中甲硝唑标准曲线方程为：y＝0.08+1.477/(1+(x/1.776)^0.813)，相关系数为0.998，半数抑制浓度值(IC50)为1.776μg/kg。
d.甲硝唑检测卡与仪器分析方法的对比：收集测试了包含鸡蛋、鸡肉、牛奶、蜂蜜在内的200份样本，测试结果表明182份样本为阴性，18份阳性样本的测试结果如图3所示，甲硝唑胶体金免疫层析检测卡测定结果与HPLC方法显著相关，线性拟合的R2＝0.987，斜率为1.04，二者具有较好的一致性。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (6)

1.一株分泌甲硝唑单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2021年05月13日，保藏编号CGMCCNo.22330。
2.权利要求1所述的杂交瘤细胞株在检测甲硝唑中的应用。
3.一种甲硝唑单克隆抗体，其特征在于，所述的甲硝唑单克隆抗体由保藏编号为CGMCCNo.22330的杂交瘤细胞株分泌得到。
4.权利要求3所述的甲硝唑单克隆抗体在检测甲硝唑中的应用。
5.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求1所述的杂交瘤细胞株或权利要求3所述的甲硝唑单克隆抗体。
6.权利要求5所述的试剂盒在检测甲硝唑中的应用。
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