CN104558184B - 用于检测硝基咪唑类药物的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种能识别硝基咪唑类药物的特异性单克隆抗体,它是由保藏号为CCTCC NO:C201499的杂交瘤细胞株DMZ1D5所分泌的。本发明还公开了一种检测硝基咪唑类药物的酶联免疫方法与试剂盒。与现有技术相比，本发明制备的单克隆抗体可以同时识别二甲基甲硝唑、异丙硝唑、洛硝哒唑、羟基异丙硝唑和羟甲基甲硝咪唑5种硝基咪唑类药物，本发明的酶联免疫方法和试剂盒一次测定即可检出动物饲料或可食性动物组织中的硝基咪唑类药物残留，具有简便、快速、灵敏、准确等优点。

Description

用于检测硝基咪唑类药物的单克隆抗体及酶联免疫方法与试 剂盒

技术领域

本发明属于兽药残留分析和免疫学技术领域，具体涉及一种能识别硝基咪唑类药物的单克隆抗体和一种用于检测硝基咪唑类药物的酶联免疫方法(ELISA)及试剂盒。

背景技术

硝基咪唑类药物属于人工合成的抗原虫、抗厌氧菌药物。基本结构是5-硝基咪唑环。抗原虫作用强大，可防治各个部位的原虫感染；抗菌谱广，可结合各种抗生素应用于兽医临床。由于能够促进动物生长和提高饲料转化率，在畜禽生产中被广泛用作饲料添加剂。

对该类药物的不合理使用，造成了在动物性食品中的残留，进而通过食物链进入人体。有研究表明硝基咪唑杂环有潜在的致畸、致癌、致突变作用，严重威胁人类健康。因此，世界各国和国际组织都对其进行了严格的残留监控，规定只允许作治疗药，但不得在动物可食性组织中检出，尤其是二甲硝咪唑，严禁作为饲料添加剂。现有的检测动物组织或饲料中硝基咪唑类药物残留的方法主要是仪器分析法，该类方法灵敏、准确、分离度高但仪器昂贵、操作复杂、样品处理繁琐，因此主要应用于样品的定性定量研究。免疫化学分析法特别是酶联免疫吸附分析技术(ELISA)具有快速、灵敏度高、操作简单、适应性强等优点，适合高通量样品筛选，因此对于快速检测硝基咪唑类药物在饲料和动物可食性组织中的残留，ELISA方法更具优势。

用ELISA方法检测硝基咪唑类药物残留的文献报道并不多，Stanker(1993)通过对二甲硝咪唑的改造，得到了一种单克隆抗体，可识别二甲硝咪唑、羟甲基甲硝咪唑等，且在火鸡中二甲硝咪唑的检测限为1μg/L。此方法识别能力不够，除了二甲硝咪唑以外，对大多数硝基咪唑类药物的亲和力较差，检测结果并不理想。Fodey(2003)和Huet(2005)则是通过对甲硝唑进行改造合成免疫原、对二甲硝咪唑进行改造合成包被原，通过异源包被的方法，筛选到了一株多克隆抗体，在直接竞争ELISA方法中，对二甲硝咪唑、洛硝达唑、羟甲基甲硝咪唑、异丙硝唑、甲硝唑均有识别，IC₅₀在1.26-73.76μg/L。虽然这种方法对多种药物都有识别，但是多克隆抗体变异性较大，不够稳定，不能大量生产，且除了二甲硝咪唑以外，其他药物的灵敏度较低。

发明内容

本发明的目的是：

(1)提供一种能识别多种硝基咪唑类药物的单克隆抗体；

(2)利用该单克隆抗体，制备一种用于硝基咪唑类药物检测的酶联免疫试剂盒；

(3)利用该试剂盒，建立一种用于硝基咪唑类药物非诊断目的检测的ELISA方法；

上述目的是通过以下技术方案实现的：

一种能识别硝基咪唑类药物的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCC NO:C201499杂交瘤细胞株DMZ1D5所分泌的。

上述的杂交瘤细胞株DMZ1D5，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO:C201499。

制备所述单克隆抗体所用的免疫原是以3-甲硝唑巯基丙酸酯(MNZ-MPA)为半抗原，将其用碳二亚胺法与血蓝蛋白偶联后得到的偶联物(MNZ-MPA-DCC-KLH)。

一种非诊断目的检测硝基咪唑类药物的酶联免疫方法，包括以下步骤：

(1)将洛硝哒唑(RNZ)在戊二醛(GA)作用下与牛血清白蛋白(BSA)偶联得到包被原(RNZ-GA-BSA)；

(2)用保藏号为CCTCC NO:C201499的杂交瘤细胞株DMZ1D5制备单克隆抗体；

(3)用步骤(1)的包被原包被固相载体；

(4)将待测样品提取后进行酶联免疫检测。

本发明以上述单克隆抗体和包被原作为核心试剂与常规的其他试剂组合，制成了能检测硝基咪唑类药物的酶联免疫检测试剂盒，结合上述酶联免疫方法，实现了对硝基咪唑类药物的酶联免疫检测。

所述的硝基咪唑类药物为二甲硝咪唑、异丙硝唑、洛硝哒唑、羟基异丙硝唑和羟甲基甲硝咪唑。

本发明的有益效果是：

1、本发明在抗体制备时，采用3-甲硝唑巯基丙酸酯作为半抗原，该半抗原体现了硝基咪唑类药物所共有的化学结构5-硝基咪唑环，由该半抗原制备的单克隆抗体可同时识别二甲硝咪唑、异丙硝唑、洛硝哒唑、羟基异丙硝唑和羟甲基甲硝咪唑。

2、本发明制备的单克隆抗体对二甲硝咪唑、异丙硝唑、洛硝哒唑、羟基异丙硝唑和羟甲基甲硝咪唑的识别灵敏度高，IC₅₀分别为5μg/L、0.5μg/L、6μg/L、25μg/L、15μg/L；该抗体对其它药物没有识别，显示出良好的特异性。

3、本发明建立的ELISA方法和试剂盒能同时检测二甲硝咪唑、异丙硝唑、洛硝哒唑、羟基异丙硝唑和羟甲基甲硝咪唑5种硝基咪唑类药物，一次测定即可检出上述药物在动物饲料或可食性组织中的残留，本发明的ELISA方法和试剂盒在检测药物的种类上具有明显的优势，可以节省对样品的分析次数，具有更好的经济价值。

4、本发明建立的ELISA方法和试剂盒检测灵敏度、准确度高，精密度好。

附图说明

图1为本发明的单克隆抗体与二甲硝咪唑标准品的间接竞争ELISA反应曲线，X轴为二甲硝咪唑(DMZ)标准溶液浓度对数值，Y轴为二甲硝咪唑标准品溶液的光密度值除以“零”孔光密度值(B/B₀)。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不限制本发明。

实施例1 免疫原和包被原的制备

1.1免疫原3-甲硝唑巯基丙酸酯与血蓝蛋白偶联物(MNZ-MPA-DCC-KLH)的制备

称取MNZ 17g(0.1mol)置于500mL圆底烧瓶中，用丙酮和少量N,N’-二甲基甲酰胺助溶。加入碳酸钾10g、醋酐16g，40℃油浴反应1d。抽滤，减压蒸除溶剂，得到第一步反应产物。将第一步产物10g溶于二氯甲烷，加入等量的N-溴代琥珀酰亚胺，光照3-5d，抽滤，将滤液蒸干。残留物过硅胶柱纯化，洗脱剂为乙酸乙酯∶石油醚＝1∶4，合并有机相，减压蒸除溶剂，得到红棕色固体，即第二步反应产物。称取第二步产物50mg，溶于无水乙醇6mL，加入氢氧化钾48mg，3-巯基丙酸180μL，回流反应24h，即得到第三步反应产物。将第三步反应产物用盐酸水解，室温反应5h后，蒸除乙醇，加入蒸馏水，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，减压蒸除溶剂，用蒸馏水洗涤2次，无水硫酸镁脱水后，得到黄色油状物，即半抗原3-甲硝唑巯基丙酸酯(MNZ-MPA)。反应式如下：

将MNZ-MPA 27mg溶于1mL DMF中，加入碳二亚胺17mg，N-羟基琥珀酰亚胺18mg，室温避光反应6h，离心去沉淀，取上清，为A液。将血蓝蛋白(KLH)8mg溶于10mL CBS中，为B液。将A液逐滴加入到B液中，4℃冰浴过夜。将混合液装入透析袋中，4℃用PBS透析5-7天，用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即完全抗原MNZ-MPA-DCC-KLH。反应式如下：

1.2包被原洛硝哒唑-戊二醛-牛血清白蛋白偶联物(RNZ-GA-BSA)的制备

称取BSA 50mg溶于PBS 10mL中，为A液。称取洛硝哒唑20mg溶于DMF 0.5mL中，为B液。室温条件下，将B液缓慢滴入A液中，然后缓缓加入戊二醛(GA)溶液0.1mL，室温反应6h。将混合液移入透析袋中，在4℃条件下用PBS缓冲液透析5-7天，使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到包被原RNZ-GA-BSA，于-20℃保存备用。反应式如下：

实施例2 单克隆抗体的制备

2.1动物免疫

利用发明人所在的国家兽药残留基准实验室制备的3-甲硝唑巯基丙酸酯与血蓝蛋白偶联物(MNZ-MPA-DCC-KLH)免疫Balb/C雌性小鼠(购自湖北省疾病预防控制中心实验动物中心)。免疫程序是取含MNZ-MPA-DCC-KLH偶联物50～100μg的蛋白溶液与佐剂等量混合后注入小鼠体内，使其产生特异性血清。

2.2细胞融合和克隆化

融合时，取经最后强化免疫的Balb/C鼠一只，眼眶放血处死(收集血清，即为阳性血清)，在75％酒精中浸泡5min消毒。无菌取出小鼠脾脏，分离出脾细胞，与新鲜制备的SP2/0骨髓瘤细胞(SP2/0骨髓瘤细胞来自本实验室)按1～2×10⁷个SP2/0与10⁸个免疫脾细胞(1:10～1:15)的比例于50mL离心管，用15mL RPMI-1640基础液重悬细胞，1500r/min离心5min，洗细胞1次。离心的间隙将温浴的培养基，温浴的水，温浴的聚乙二醇(PEG)等放入超净台。然后取出灭菌的吸水纸，将装有骨髓瘤细胞和免疫脾细胞的离心管上清倒尽后，倒扣在吸水纸上控干水滴，轻敲管底使细胞松动。打开计时器，用1mL吸管吸取0.8mLPEG，手持装有混合细胞的离心管，将其放置在水浴中片刻，将PEG缓慢的滴加到混合细胞上，边加边轻轻搅拌，1min内加完，持续搅拌30s。用吸管取10mL基础液，沿管壁缓慢加到融合细胞上，边加边轻轻摇动(不能吹打)，5min内分别加1mL，2mL，3mL，4mL，最后补加基础液到40mL，加完后，盖上盖子，反复颠倒几次，使细胞混匀。800r/min 5min离心，弃上清。吸取含有饲养细胞的HAT培养基，用吸管将离心管中的融合细胞轻轻搅拌起来，液面附近逐滴滴入到含饲养细胞的血清瓶中，搅拌混匀，动作要轻将细胞轻轻搅拌起来，千万不要吹打。颠倒混匀。然后将细胞接种在细胞培养板上，每孔两滴，置于培养箱中培养。一次融合可接种4～6块96孔板。根据需要也可少种，一般按SP2/0的细胞数计算，每孔接种量约含10⁴左右个SP2/0细胞。于37℃，5％CO₂培养箱中培养。

融合的当天计为0d，前3d尽量不要动细胞板，保持培养箱内环境稳定。第3d每孔补加1滴HAT完全培养基；第5d每孔吸出l/2培养上清(100μL)，再加入1滴HT完全培养基；以后每隔2d同上法吸去l/2～3/4培养上清，在7d后换入HT完全培养基。

待融合细胞集落长至培养孔1/10～1/5，同时用建立的间接ELISA方法进行筛选。与零药物孔相比，药物孔OD值能被抑制的判为阳性。根据抑制率和细胞集落生长状况，选择2～6个强阳性的仅有1-2个单集落的细胞孔，采用有限稀释方法进行克隆化。

经过3～4次克隆，最终筛选出分泌抗硝基咪唑类药物抗体的单克隆杂交瘤细胞株，申请人将其命名为DMZ1D5，并于2014年5月20日送位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO:C201499。对该细胞系进行了染色体计数，结果显示，SP2/0的染色体数为62～68条，脾细胞染色体为40条，而杂交瘤细胞的染色体数目平均值为96.0条，说明融合细胞的确是SP2/0细胞与脾细胞的杂交产物。将该细胞株经腹腔注射Balb/C小鼠，生产单克隆抗体。采用购自Thermo Sxientific公司的鼠单克隆抗体(Monoclonal antibody,Mab)快速ELISA同型试剂盒对本发明所得到的单克隆抗体的亚型和轻链进行鉴定，结果为小鼠IgG_1K亚型。

实施例3 二甲硝咪唑间接竞争ELISA检测方法的建立

3.1试剂的配制(本实施例使用的试剂除另注明外均采用以下方法配制)

磷酸盐缓冲液：NaCl 8.0g，KH₂PO₄ 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，KCl 0.2g，加去离子水至1000mL，调节pH至7.4；

包被液：取Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，加去离子水至1000mL，调节pH值至9.6；

洗涤液：NaCl 8.0g，KH₂PO₄ 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，KCl 0.2g，Tween 200.5mL，加去离子水至1000mL，调节pH至7.4；

封闭液：卵清蛋白1g溶于100mL磷酸盐缓冲液中；

底物液A：3,3',5',5-四甲基联苯二胺(TMB)200mg，无水乙醇100mL，加去离子水至1000mL；

底物液B：Na₂HPO₄ 14.6g，柠檬酸9.3g，0.75％过氧化氢脲6.4mL，加去离子水至1000mL；

底物混合液：将A液和B液按体积比1∶1混合即得，现配现用；

终止液：2mol/L硫酸溶液。

3.2包被原浓度和抗体工作浓度的初步确定

选择上述合成的RNZ-GA-BSA作为包被原，用包被液稀释成16mg/L、8mg/L、4mg/L、2mg/L、1mg/L、0.5mg/L、0.25mg/L、0.125mg/L 8个浓度，在96孔酶标板，从第一至第八列依次加入，4℃过夜；洗涤3次，拍干，加入封闭液200μL，37℃封闭60min；洗涤3次，拍干，在酶标板的第一行至第八行依次加入100μL磷酸盐缓冲液稀释的稀释倍数为1000、2000、4000、8000、16000、32000、64000、128000的单克隆抗体，37℃孵育30min，洗涤3次，拍干；各孔加入1∶5000倍磷酸盐缓冲液稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(简称二抗，以下所指二抗均为HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，购自武汉飞弈生物技术有限公司)100μL，37℃孵育30min，洗涤5次，拍干；各孔加入100μL底物混合液，避光显色15min，加入50μL终止液，用自动酶标仪在450nm波长处测定光密度值(OD值)，结果见表1。

结果表明，初步确定包被原RNZ-GA-BSA的包被浓度为1mg/L或0.5mg/L，抗体工作浓度为1:32000或1:16000。

表1 包被原浓度和抗体工作浓度的初步确定

3.3最佳包被原浓度和抗体工作浓度的确定

以初步确定的包被原包被浓度，设置1mg/L、0.5mg/L2个浓度包被酶标板。将二甲硝咪唑用磷酸盐缓冲液稀释成20μg/L、10μg/L、5μg/L、2.5μg/L、1.25μg/L、0μg/L 6个浓度，分别将1∶32000和1∶16000磷酸盐缓冲液稀释的单克隆抗体(因为作间接竞争ELISA时，单克隆抗体的加样体积减小了一半，相应地单克隆抗体稀释度减小一半)和上述二甲硝咪唑溶液各加50μL进行间接竞争ELISA。以二甲硝咪唑浓度对数值作为横坐标，以二甲硝咪唑标准溶液的OD值与“零”孔OD值的比值(B/B₀)作为纵坐标绘制抑制曲线，选择线性较佳、产生50％抑制时二甲硝咪唑浓度(IC₅₀)较低者作为包被浓度。以最佳包被原浓度包被酶标板，将二甲硝咪唑稀释成20μg/L、10μg/L、5μg/L、2.5μg/L、1.25μg/L、0μg/L6个浓度，将抗体以中心浓度1∶16000等差设置4个稀释度，单克隆抗体和系列浓度二甲硝咪唑标准溶液各加50μL进行间接竞争ELISA，绘制抑制曲线，选择线性较佳、IC₅₀值较低者作为最佳抗体工作浓度。结果见表2、3。

表2 最佳包被原浓度优化

包被原浓度(μg/mL)	抗体稀释倍数(1:X)	0孔OD值	IC50值(μg/L)
				1	32000	2.343	6.5
0.5	16000	1.833	5.8

表3 最佳抗体稀释度优化

抗体稀释倍数(1:X)	0孔OD值	IC50(μg/L)
			12000	2.404	7.3
14000	2.317	5.8
			16000	2.047	5.5
18000	1.626	4.3

结果表明，包被浓度为0.5mg/L，抗体稀释度为1∶16000时，其IC₅₀最低。

3.4标准曲线的建立

将二甲硝咪唑用磷酸盐缓冲液配制成20μg/L、10μg/L、5μg/L、2.5μg/L、1.25μg/L、0μg/L6个系列浓度，每个浓度重复5孔，按照间接竞争ELISA方法测定，重复测定5次。以二甲硝咪唑溶液浓度的对数值为横坐标，B/B0为纵坐标绘制标准曲线，求出IC₅₀。本试剂盒的IC₅₀值为5μg/L。

3.5交叉反应试验

将硝基咪唑类药物用磷酸盐缓冲液配制成适当浓度，用建立的ELISA方法测定各药物的IC₅₀值，每个药物3个复孔，以单克隆抗体对二甲硝咪唑的交叉反应率为100％，利用公式1计算单克隆抗体对各药物的交叉反应率，结果见表4。

公式1：

表4 本发明试剂盒对各种硝基咪唑类药物的交叉反应率

药物	IC50(μg/L)	交叉反应率(％)
			异丙硝唑	0.5	1000
二甲硝咪唑	5	100
			洛硝哒唑	6	83
羟甲基甲硝咪唑	15	33
			羟基异丙硝唑	25	20
甲硝唑	500	1

结果表明，单克隆抗体对二甲硝咪唑、异丙硝唑、洛硝哒唑、羟甲基甲硝咪唑和羟基异丙硝唑有较高的交叉反应率，可用于动物饲料和可食性组织中硝基咪唑类药物残留的ELISA检测。

实施例4 本发明硝基咪唑类药物检测ELISA试剂盒的组装

4.1本发明ELISA试剂盒由下述部分组成：

1)包被有包被原RNZ-GA-BSA的固相载体(酶标板)；

2)二甲硝咪唑标准溶液6瓶，浓度分别为20μg/L、10μg/L、5μg/L、2.5μg/L、1.25μg/L、0μg/L；

3)保藏号为CCTCC NO:C201499的杂交瘤细胞株DMZ1D5分泌的单克隆抗体；

4)辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体工作液；

5)浓缩磷酸盐缓冲液：NaCl 80.0g，KH₂PO₄ 2.0g，Na₂HPO₄·12H₂O 29.0g，KCl2.0g，加去离子水至1000mL；

6)浓缩洗涤液：NaCl 80.0g，KH₂PO₄ 2.0g，Na₂HPO₄·12H₂O 29.0g，KCl 2.0g，Tween20 5mL，加去离子水至1000mL；

7)底物液A：3,3',5',5-四甲基联苯二胺(TMB)200mg，无水乙醇100mL，加去离子水至1000mL；

8)底物液B：Na₂HPO₄ 14.6g，柠檬酸9.3g，0.75％过氧化氢尿素6.4mL，加去离子水至1000mL，调节pH至5.0～5.4；

9)终止液：2mol/L硫酸溶液。

4.2酶标板的制备

用包被液将RNZ-GA-BSA稀释成0.5mg/L，每孔加入100μL，4℃过夜，倾去包被液，每孔加入250μL洗涤液洗涤3次，拍干，然后每孔加入封闭液250μL，37℃孵育60min，倾去孔内液体，洗涤液洗涤3次，拍干，用锡箔纸真空密封保存。

实施例5 本发明的酶联免疫试剂盒的测定程序

5.1试剂的配制

1)样品稀释液：将试剂盒中提供的浓缩磷酸盐缓冲液用去离子水稀释10倍后使用。

2)洗涤液：将试剂盒中提供的洗涤液用去离子水稀释10倍后使用。

3)底物混合液：根据每次所需用量，将配制的底物液A和底物液B按体积1∶1混匀，现配现用。

5.2样品前处理

1、猪、鸡、鱼肌肉和鸡蛋、蜂蜜样品的前处理：

1)称取组织样品均质物2.0g于50mL离心管中，加入0.2M NaOH 2mL，乙酸乙酯8mL，剧烈振荡5min后，室温4000rpm离心5min；

2)取上清液4mL，40℃氮气吹干，加入正己烷2mL和磷酸盐缓冲液1mL充分溶解剧烈振荡5min后，室温4000rpm离心5min，去下层液体供试剂盒测定，本处理对组织样品的稀释系数为1。

2、猪、鸡、鱼饲料样品的前处理：

1)称取粉碎饲料4.0g于50mL离心管中，加入pH8.0的磷酸盐缓冲液10mL，剧烈振荡5min后，室温4000rpm离心5min；

2)取上清液用PBS稀释20倍后用于分析供试剂盒检测，本处理对饲料样品的稀释系数为50；

5.3测定步骤

1)加样：向酶标板微孔中加入二甲硝咪唑系列浓度标准溶液或样品溶液50μL，然后加入单克隆抗体工作液50μL，置于湿盒中，37℃恒温孵育30min；

2)洗涤：倒出孔中的液体，每孔中加入洗涤液250μL洗涤3次并拍干；

3)加辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体工作液：每孔中加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体工作液100μL，置于湿盒中，37℃恒温孵育30min；

4)洗涤：倒出孔中的液体，每孔中加入洗涤液250μL，洗涤3次并拍干；

5)加底物：每孔中加入底物混合液100μL，置于湿盒中，37℃恒温孵育15min；

6)加终止液：每孔中加入终止液50μL；

7)测定：用酶标仪在450nm处测定每孔的光密度值(OD值)。

5.4结果判断

标准曲线：以所测定的标准品OD值除以“零”孔OD值(B/B0)为纵坐标，二甲硝咪唑浓度的对数值为横坐标作标准曲线，并进行线性回归，给出回归方程。

组织中硝基咪唑类药物浓度计算：计算样品的抑制率(所获得的样品的OD值除以“零”孔OD值)，代入标准曲线的回归方程中，计算出肌肉中二甲硝咪唑浓度(μg/kg)，按照公式2折算成其他硝基咪唑类药物浓度。

饲料中硝基咪唑类药物浓度计算：计算样品的抑制率(所获得的样品的OD值除以“零”孔OD值)，代入标准曲线的回归方程中，并乘以稀释系数50，计算出饲料中二甲硝咪唑浓度(μg/kg)，按照公式2折算成其他硝基咪唑类药物浓度。

公式2：

实施例6 本发明试剂盒的灵敏度、精密度、准确度、重复性试验

6.1本发明试剂盒的灵敏度试验

以标准曲线的IC₅₀值和组织最低检测限(LOD)作为本发明检测试剂盒的灵敏度指标。将二甲硝咪唑标准品稀释成为20μg/L、10μg/L、5μg/L、2.5μg/L、1.25μg/L、0μg/L6个浓度，每个浓度5个复孔，按照间接竞争ELISA方法重复测定5次，取5次测定的IC₅₀的平均值。LOD通过以下步骤决定，测定20份空白饲料和组织样品的OD值，根据标准曲线的回归方程计算出相应的二甲硝咪唑浓度，然后计算出二甲硝咪唑浓度的平均值和标准差(SD)，根据公式计算出组织中的最低检测限。本发明的IC₅₀值为5μg/L，二甲硝咪唑和洛硝达唑在动物饲料和可食性组织中的最低检测限详见表5、表6。

表5 饲料中两种硝基咪唑类药物的最低检测限

表6 动物组织中的最低检测限

6.2本发明试剂盒的精密度试验

将二甲硝咪唑标准品稀释成20μg/L、10μg/L、5μg/L、2.5μg/L、1.25μg/L、0μg/L6个浓度，每浓度5个重复，按照间接竞争ELISA方法重复测定5次，应用标准曲线的回归方程计算出各浓度二甲硝咪唑标准溶液的测定值，计算板内和板间变异系数，结果见表7。

表7 标准曲线的板内及板间误差

6.3本发明试剂盒的准确度、重复性试验

本研究将三个浓度的两种硝基咪唑类药物分别添加到饲料样品中，其添加回收率在80.3％～111.9％之间，批内与批间变异系数≤12.7％，测定结果见表8～10；将三个浓度的两种硝基咪唑类药物添加到可食性组织中，其添加回收率在75.5％～108.5％之间，批内与批间变异系数≤14.6％，测定结果见表11～15。

公式3：

表8 猪饲料中添加回收率

表9 鸡饲料中添加回收率

表10 鱼饲料中添加回收率

表11 猪肌肉中添加回收率

表12 鸡肌肉中添加回收率

表13 鱼肌肉中添加回收率

表14 鸡蛋中添加回收率

表15 蜂蜜中添加回收率

Claims (8)

1.一种能识别硝基咪唑类药物的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCC NO:C201499的杂交瘤细胞株DMZ1D5所分泌的，所述硝基咪唑类药物为二甲硝咪唑、异丙硝唑、洛硝哒唑、羟基异丙硝唑和羟甲基甲硝咪唑。

2.一株杂交瘤细胞株DMZ1D5，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:C201499，所述杂交瘤细胞株DMZ1D5分泌的单克隆抗体能识别硝基咪唑类药物，所述硝基咪唑类药物为二甲硝咪唑、异丙硝唑、洛硝哒唑、羟基异丙硝唑和羟甲基甲硝咪唑。

3.权利要求1所述的单克隆抗体在制备检测硝基咪唑类药物的酶联免疫试剂盒中的应用，所述硝基咪唑类药物为二甲硝咪唑、异丙硝唑、洛硝哒唑、羟基异丙硝唑和羟甲基甲硝咪唑。

4.包含权利要求1所述单克隆抗体的试剂盒。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，该试剂盒是检测硝基咪唑类药物的酶联免疫试剂盒。

6.权利要求4或5所述的试剂盒在硝基咪唑类药物非诊断目的检测中的应用，所述硝基咪唑类药物为二甲硝咪唑、异丙硝唑、洛硝哒唑、羟基异丙硝唑和羟甲基甲硝咪唑。

7.一种非诊断目的检测硝基咪唑类药物的酶联免疫方法，所述硝基咪唑类药物为二甲硝咪唑、异丙硝唑、洛硝哒唑、羟基异丙硝唑和羟甲基甲硝咪唑，其特征在于包括以下步骤：

(1)将洛硝哒唑与牛血清白蛋白偶联得到包被原；

(2)用保藏号为CCTCC NO:C201499的杂交瘤细胞株DMZ1D5制备单克隆抗体；

(3)用步骤(1)的包被原包被固相载体；

(4)将待测样品提取后进行酶联免疫检测。

8.权利要求7所述的酶联免疫方法在硝基咪唑类药物非诊断目的检测中的应用，所述硝基咪唑类药物为二甲硝咪唑、异丙硝唑、洛硝哒唑、羟基异丙硝唑和羟甲基甲硝咪唑。