CN112540095B - 酶促低场核磁共振免疫传感器检测食源性致病菌的方法 - Google Patents

酶促低场核磁共振免疫传感器检测食源性致病菌的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112540095B
CN112540095B CN201910893003.5A CN201910893003A CN112540095B CN 112540095 B CN112540095 B CN 112540095B CN 201910893003 A CN201910893003 A CN 201910893003A CN 112540095 B CN112540095 B CN 112540095B
Authority
CN
China
Prior art keywords
pathogenic bacteria
ascorbic acid
magnetic
magnetic resonance
nuclear magnetic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910893003.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112540095A (zh
Inventor
陈翊平
王知龙
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Huazhong Agricultural University
Original Assignee
Huazhong Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Huazhong Agricultural University filed Critical Huazhong Agricultural University
Priority to CN201910893003.5A priority Critical patent/CN112540095B/zh
Publication of CN112540095A publication Critical patent/CN112540095A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112540095B publication Critical patent/CN112540095B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N24/00—Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects
    • G01N24/08—Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects by using nuclear magnetic resonance
    • G01N24/087—Structure determination of a chemical compound, e.g. of a biomolecule such as a protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54346—Nanoparticles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • High Energy & Nuclear Physics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种酶促低场核磁共振免疫传感器检测食源性致病菌的方法，主要内容是将Mn(VII)/Mn(II)作为信号读出系统，结合免疫分析技术，构建了基于抗体‑抗原识别的磁免疫传感器，在该方法中，将碱性磷酸酶(ALP)作为免疫标记酶应用到该传感器中，将抗坏血酸磷酸酯作为ALP的底物，ALP可以将抗坏血酸磷酸酯去磷酸化，进而转化为具有还原性的抗坏血酸，而抗坏血酸可以将Mn(VII)转变为Mn(II)，进而引起磁信号(横向弛豫时间，T2)从无到有的改变，T2的改变量和待测样品中食源性致病菌呈正相关。本发明拓宽了基于超顺纳米磁颗粒磁弛豫时间传感器检测范围的限制，极大地提高了分析性能，进而为食品安全的前期防控提供一种有力的工具。

Description

酶促低场核磁共振免疫传感器检测食源性致病菌的方法
技术领域
本发明属于分析化学和食品安全领域，具体而言，本发明涉及一种碱性磷酸酶催化的低场核磁共振免疫传感器检测致病菌的方法。
背景技术
食源性致病菌是导致食品安全问题的一个重要的因素，快速、高灵敏检测食源性致病菌对保障食品安全具有重要意义。目前主要的检测方法有微生物培养法、免疫检测方法和PCR分子诊断方法。微生物培养法需要较长的培养时间，操作步骤繁琐，不适合现场、快速检测。免疫检测方法，主要包括酶联免疫吸附法(ELISA)和胶体金免疫层析试纸条法。酶联免疫吸附法需要多步操作，检测时间较长，同时灵敏度也不能满足样品中痕量的食源性致病菌检测的需要，而胶体金免疫层析试纸条的方法，具有检测速度快，一步操作即可完成的优势，但其灵敏度比酶联免疫吸附法还低，无法实现低浓度的食源性致病菌的检测。PCR分子诊断方法是检测致病菌的金标准，但其需要昂贵的设备和洁净的环境，并且需要多轮的扩增，不适合现场分析。
低场共振免疫传感器是一种将纳米磁颗粒优异的磁学性质和免疫分析高特异性相结合的一种生物传感器。相比其他免疫传感器，低场核磁共振免疫传感器具有两个独特的优势：(1)其是一种均相反应体系，可以避免ELISA方法中多步操作，多步洗涤的步骤；(2)因为食品样品中磁信号背景低，因此将纳米磁颗粒作为磁信号探针，可以避免复杂样品基质的背景信号干扰，具有很高的信噪比，适合浑浊样品的分析，有利于提高方法的准确性。因此低场核磁共振免疫传感器在食品安全、环境监测、体外诊断等领域得到了广泛的应用。但传统的低场核磁共振免疫传感器也存在如下问题：(1)缺乏有效的信号放大系统，灵敏度偏低，特别是检测痕量食源性致病菌，其灵敏度和准确性很难胜任；(2)稳定性比较差: 某些因素会导致磁颗粒的聚集，产生假阳性结果，进而影响了结果的可靠性；(3)制备稳定性好的超顺纳米小磁颗粒的工艺比较复杂，成本也比较高，重复性和稳定性都有待进一步提高，因此需要开发稳定性更好，成本更低，可操作性更好的磁信号探针显得尤为重要。
在免疫分析或者免疫传感分析中，免疫标记酶是最重要的元素之一，是保证方法具有高灵敏度的关键因素。目前，辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(ALP)是应用最为广泛的免疫标记酶，具有催化效率高、稳定性好等优势。因此，如果可以将酶的高效催化性能和磁传感信号转换有机结合，将大大提高低场核磁共振免疫传感器的灵敏度和稳定性。要实现上述目标，需要找到相应的底物，并且这个底物被该酶催化之后的产物可以实现磁信号的转化。
相比于超顺纳米磁颗粒，将顺磁离子作为磁信号探针有着独特的优势：(a)稳定性好、成本低，相比传统的纳米磁颗粒，顺磁离子水溶液稳定性更好，成本更低；(b)纳米磁颗粒在复杂基质中容易发生聚集，造成分析结果不稳定，而顺磁离子则可以很好地避免这个问题，因此抗干扰能力更强；(c)很多类型的氧化还原反应可以实现顺磁离子价态的转换，导致磁信号的变化，进而可以检测一系列的目标物。可见，基于顺磁离子的低场核磁共振免疫传感器将在众多领域发挥越来越重要的作用。Fe(III)/Fe(II)、Cu(II)/Cu(I)都是常见的顺磁离子，其不同价态的转变都可以导致横向弛豫时间(T2)或者纵向弛豫时间(T1)的改变，但Fe(III)/Fe(II)、Cu(II)/Cu(I)这两组顺磁离子价态的改变导致的T1或者 T2信号变化有限，因为这两组不同价态的顺磁离子本身都有磁信号，只是磁信号由弱变强，因此该磁信号的改变不显著，很难用于复杂食品样品中痕量食源性致病菌的分析。
因此，寻找一组稳定性好、磁信号零背景的顺磁离子对作为磁信号转化探针，结合免疫标记酶作为酶促信号放大系统，进而构建一种灵敏度高的低场核磁共振免疫传感器检测致病菌显得尤为重要。在实验中，我们发现Mn(VII)的T2或者T1信号接近于水，而 Mn(II)的T2或者T1信号很强，因此通过将Mn(VII)还原成Mn(II)离子，即可以实现磁信号从无到有，是一种信号打开的模式，更有利于提高方法的灵敏度。因此，本发明的主要内容是将Mn(VII)/Mn(II)作为信号读出系统，结合免疫分析技术，构建了基于抗体-抗原识别的磁免疫传感器，应用于致病菌的检测。在该方法中，将碱性磷酸酶(ALP)作为一种免疫标记酶应用到该传感器中，具体原理如下：将ALP标记上识别相应致病菌的抗体，将抗坏血酸酯作为ALP的底物，该ALP可以将抗坏血酸酯去磷酸化，进而转化为具有还原性的抗坏血酸，而抗坏血酸可以将Mn(VII)转变为Mn(II)，进而引起磁信号(T2) 从无到有的改变，T2的改变量和待测样品中食源性致病菌呈正相关，这也是低场核磁共振免疫传感器检测食源性致病菌的基础(图1)。
相比于基于纳米磁颗粒的传统低场核磁共振免疫传感器，该免疫传感器具有两个独特的优势：(1)稳定性好：相比于纳米磁颗粒探针，Mn离子探针的稳定性更好；(2) 灵敏度更高：在该系统里面，有ALP对底物的酶促信号放大的作用，并且其产生的酶促产物(抗坏血酸)可以进一步使Mn(VII)转变为Mn(II)，实现信号的读出和放大，整个反应是一个级联信号放大的过程，从而使整个方法具有很高的灵敏度。
发明内容
为了弥补传统低场核磁共振免疫传感器的不足，拓宽低场核磁共振免疫传感器的应用范围，增加其应用的普适性。本发明旨在提供一种成本低廉、样品前处理简便、稳定性更好的低场核磁共振免疫传感器检测食源性致病菌的高效方法，为食品安全检测提供一种高效、准确、可行的解决方案。
具体地，为达到此目的，本发明提供以下技术方案：
一种酶促低场核磁共振免疫传感器检测食源性致病菌的方法，包括以下步骤：
1)将捕获抗体偶联到磁纳米颗粒表面并配制成磁纳米颗粒-捕获抗体偶联物，然后将该偶联物加入到待测样品中，使捕获抗体与待测样品中的致病菌发生特异性免疫反应，磁分离后得到磁纳米颗粒-捕获抗体-致病菌复合物；
2)将生物素标记的检测抗体加入到步骤1)的复合物中，使检测抗体与待测致病菌发生特异性免疫反应，磁分离后得到磁纳米颗粒-捕获抗体-致病菌-检测抗体复合物；
3)向步骤2)的复合物中加入链霉亲和素标记的碱性磷酸酶，利用生物素与链霉亲和素的特异亲和能力，将碱性磷酸酶复合到检测抗体，磁分离后得到磁纳米颗粒-捕获抗体- 致病菌-检测抗体-碱性磷酸酶复合物；
4)将抗坏血酸磷酸酯加入到步骤3)磁分离得到的复合物中，使碱性磷酸酶在纯水体系下催化抗坏血酸磷酸酯生成抗坏血酸，磁分离后向反应液中加入KMnO4溶液，抗坏血酸将Mn(VII)还原成Mn(II)，低场核磁共振仪(LF-NMR)测定T2值并计算待测样品中的致病菌含量。
优选地，所述磁纳米颗粒是粒径为1000nm的COOH-MNPs。
优选地，所述生物素为EZ-LinkTMSulfo-NHS-LC-LC-Biotin。
优选地，所述特异性免疫反应是在37℃条件下进行。
优选地，所述反应液中抗坏血酸的浓度为200-500μM，所述KMnO4溶液的浓度为0.5mM，所述反应液与KMnO4溶液的体积比为1：1。
优选地，所述的生物素标记的检测抗体与链霉亲和素标记的碱性磷酸酶的质量比为 4:1。
优选地，步骤1)中所述的磁纳米颗粒-捕获抗体溶液的浓度是0.5mg/mL。
优选地，步骤4)所述的所述抗坏血酸磷酸酯溶液的浓度为25mM，所述抗坏血酸磷酸酯溶液与复合物的体积比为1：1。
优选地，所述碱性磷酸酶催化抗坏血酸磷酸酯生成抗坏血酸是在pH 7.0的纯水体系进行。
现结合本发明的构思，对本发明具体技术方案进一步阐述如下：
本发明将横向弛豫时间(T2)作为一种信号读出信号，引入到传统的低场核磁共振免疫传感器中，通过特定的氧化还原反应，实现MnO4 -向Mn2+的转变。由于MnO4 -对水分子氢质子T2的影响极其微弱，而Mn2+对水分子氢质子T2有超强的改变能力，基于这一显著差异，从而实现目标物和T2之间的转换。由于氧化还原反应的多样性，并且很多生化分析指标本身具有氧化/还原的性质，因此本发明可以直接通过氧化还原反应，实现对生化指标的高灵敏度响应。同时，可以通过抗原-抗体识别构建磁传感器，催化碱性磷酸酶的底物产生具有还原性的物质，进而可以诱导MnO4 -向Mn2+转化实现对食源性致病菌的高灵敏检测。
本发明的技术方案具有但不限于以下有益效果：
本发明将Mn(Ⅱ)T2信号作为信号读出方式引入到免疫分析系统中，通过氧化还原反应，可以调节水溶液中MnO4 -和Mn2+浓度，由于MnO4 -和Mn2+引起水分子氢质子T2改变的能力存在显著的差异，因此可以通过抗原-抗体反应构建磁传感器，并通过碱性磷酸酶催化实现对食源性致病菌的定量分析，大大拓宽了基于超顺纳米磁颗粒磁弛豫时间传感器检测范围的限制，极大地提高了分析效率，进而为食品安全的前期防控提供一种有力的工具。
更为重要的是，基于T2的磁传感器是采用锰离子的信号，克服了传统磁传感器都需要纳米磁颗粒的这个缺点，而且本方法只需要配制一定浓度的高锰酸钾溶液，比合成粒径均匀、悬浮稳定性好的纳米磁颗粒更加简单，成本更低，稳定性更好。因此，本发明方法可以克服传统磁传感器大部分依赖于纳米磁颗粒的这个缺点，进而大大简化了整个磁信号分析过程，提高了整个方法的稳定性。而且该方法只要更换检测过程中涉及的抗体就可以检测不同的致病菌，在食品安全快速检测、环境病原菌监测等领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是本发明工艺路线和检测原理示意图。
图2是T2值的改变量与抗坏血酸浓度之间的响应关系曲线图。
图3是不同KMnO4溶液与抗坏血酸溶液之间的响应关系曲线图。
图4是加入抗坏血酸前后溶液中锰元素的光电子能谱(XPS)谱图。
图5是T2值的改变量与碱性磷酸酶浓度之间的响应关系曲线图。
图6是不同缓冲体系下T2值的改变量与碱性磷酸酶浓度之间的响应关系曲线图。
图7是不同浓度抗坏血酸磷酸酯作为底物时T2值的改变量与碱性磷酸酶浓度之间的响应关系曲线图。
图8是三种T2磁传感器分别对抗坏血酸和碱性磷酸酶的响应灵敏度，图中，A为锰离子、铜离子、铁离子三种顺次离子介导的T2磁传感器分别对抗坏血酸的响应灵敏度， B为锰离子、铜离子、铁离子三种顺次离子介导的T2磁传感器分别对碱性磷酸酶的响应灵敏度。
图9是不同浓度磁纳米颗粒-捕获抗体偶联物下，T2值的改变量和沙门氏菌浓度的相关曲线。
图10是在生物素化抗体与ALP标记的链霉亲和素不同质量比例下，T2值的改变量和沙门氏菌浓度的相关曲线。
图11是本发明磁免疫传感器检测沙门氏菌的标准曲线。
图12是本发明磁免疫传感器检测沙门氏菌的特异性。
图13是磁免疫传感器和ELISA方法检测沙门氏菌灵敏度和线性范围的比较结果。图中，A为T2值的改变量及吸光值的改变量随着沙门氏菌浓度变化曲线，B为T2值的改变量及吸光值的改变量随着沙门氏菌浓度变化的线性范围。
图14是本发明磁传感器检测大肠杆菌的标准曲线。
具体实施方式
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本实施例中使用的主要试剂和仪器如下：
高锰酸钾(KMnO4)、抗坏血酸均来自国药集团化学试剂有限公司，碱性磷酸酶(ALP) 和抗坏血酸磷酸酯钠来自Sigma-Aldrich公司，牛血清白蛋白(Amresco,USA)、1000nm COOH-MNPs(Ocean NanoTech,USA)、EZ-LinkTMSulfo-NHS-LC-LC-Biotin来自赛默飞公司，链霉亲和素标记的碱性磷酸酶来自碧云天生物技术有限公司，沙门氏菌捕获抗体及检测抗体、大肠杆菌捕获抗体及检测抗体来自abcam公司。
磷酸盐缓冲液(PBS)：取8.00g NaCl,0.20g KCl,0.20g KH2PO4和2.90g Na2HPO4·12H2O溶于1000mL水中，摇匀。
封闭液：称取1.2g BSA于40mL PBS中，摇匀，配成3％BSA封闭液。
洗涤液：在配制好的1000mL磷酸盐缓冲液中加入0.5mL吐温-20，摇匀，配成PBST洗涤液。
Tris-HCl缓冲液：50mL 0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液与29.2mL0.1mol/L 盐酸混匀后，加水稀释至100mL得到pH 8.0的Tris-HCl缓冲液。
仪器：0.5T小型核磁共振仪购自上海纽迈电子科技有限公司。
实施例1
碱性磷酸酶(ALP)是免疫分析中应用极为广泛的一种标记酶，同时ALP可以催化其底物(抗坏血酸磷酸酯)产生具有还原性的抗坏血酸(AA)，该AA介导的氧化还原反应可以实现MnO4 -向Mn2+的转化，从而导致T2信号的改变。鉴于MnO4 -的强氧化性和AA的强还原性，ALP催化的氧化还原反应可以实现对AA的超灵敏响应。基于这一原理，可以构建磁免疫传感器实现对不同目标物的检测。
1)T2磁传感器对抗坏血酸(AA)的响应
将100μL不同浓度(1,2,5,10,20,50,100,200,300,400,500,600,700,800,900和1000μM)的抗坏血酸溶液分别加入到100μL的0.5mM KMnO4溶液中，反应5分钟，将 200μL混合液用低场核磁共振仪(LF-NMR)测T2信号，其结果如图2所示，T2值的改变量随着抗坏血酸浓度的升高而变大，说明两者之间具有极好的响应关系。其中，当抗坏血酸浓度为200-500μM时，响应关系最佳。
将100μL不同浓度(10,50,100,200,300,400和500μM)的抗坏血酸溶液分别加入到100μL的不同浓度的KMnO4溶液中，反应5分钟，将200μL混合液用LF-NMR测T2信号，其结果如图3所示，各浓度KMnO4溶液均对抗坏血酸有一定响应，其中，当KMnO4溶液浓度为0.5mM时，响应效果最佳。
将加入抗坏血酸前后的KMnO4溶液固定干燥后进行光电子能谱(XPS)进行元素价态的测试，其结果如图4所示，说明抗坏血酸与KMnO4溶液反应后生成了Mn2+，从而产生了磁信号的变化。
2)T2磁传感器对碱性磷酸酶(ALP)的响应
将碱性磷酸酶(ALP)用纯水分别稀释至0.01,0.05,0.5,1,5,10,100,500,1000,2000, 4000U/L，加入60μL纯水和20μL抗坏血酸磷酸酯(25mM)于37℃孵化0.5小时。然后将100μL上述混合液加入到100μL的0.5mM KMnO4中，混合液于37℃孵化5分钟。最后将200μL反应液用LF-NMR测定T2值。实验结果如图5所示，表明T2值的变化量与ALP浓度之间存在良好的响应关系。其中，当碱性磷酸酶≥1000U/L，具有最佳的响应关系。
将碱性磷酸酶(ALP)用MES缓冲液(pH＝6.0)、纯水(pH＝7.0)和Tris-HCl缓冲液分别稀释至100,500,1000,2000,3000,4000,5000U/L，加入60μL对应的缓冲液和20μL 抗坏血酸磷酸酯(25mM)于37℃孵化0.5小时。然后将100μL上述混合液加入到100μL 的0.5mMKMnO4中，混合液于37℃孵化5分钟。最后将200μL反应液用LF-NMR测定T2值。实验结果如图6所示，表明在纯水(pH＝7.0)体系中T2值的变化量与ALP浓度之间存在更好的响应关系。
将碱性磷酸酶(ALP)用纯水分别稀释至100,500,1000,2000,3000,4000,5000U/L，加入60μL纯水和20μL不同浓度抗坏血酸磷酸酯(15,20,25,30mM)于37℃孵化0.5小时。然后将100μL上述混合液加入到100μL的0.5mM KMnO4中，混合液于37℃孵化5 分钟。最后将200μL反应液用LF-NMR测定T2值。实验结果如图7所示，表明使用25mM 抗坏血酸磷酸酯作为ALP底物时，ALP浓度与T2值的变化量之间具有更好的响应关系。
3)三种T2磁传感器对AA和ALP响应灵敏度比较
将100μL不同浓度(1,2,5,10,20,50,100,200,300,400,500,600,700,800,900和1000μM)的抗坏血酸溶液分别加入到100μL的2.5mM CuCl2或4mM FeCl3溶液中，反应5分钟；
将碱性磷酸酶(ALP)用纯水分别稀释至0.01,0.05,0.5,1,5,10,100,500,1000,2000, 4000U/L，加入60μL纯水和20μL抗坏血酸磷酸酯(25mM)于37℃孵化0.5小时，然后将100μL上述混合液加入到100μL的2.5mM CuCl2或4mM FeCl3溶液中，混合液于37℃孵化5分钟。
最后将200μL反应液分别用LF-NMR测定T2值。实验结果如图8所示，表明锰离子与铜离子和铁离子相比，对AA和ALP具有更灵敏的响应信号，因此Mn(VII)/Mn(II)是一个更加有效的T2信号读出系统。
实施例2沙门氏菌的检测
(1)MNPs-捕获抗体偶联物的制备：取500μL 1000nm COOH-MNPs，用纯水洗涤两次，再用2mL纯水重悬；加入100μL EDC(10mg/mL)和50μL NHS(10mg/mL)活化30 分钟；磁分离后用2mL PBS(pH＝7.4)重悬；再加入0.2mg沙门氏菌捕获抗体(Ab1)，温和振荡反应3小时后，加入500μL 3％BSA反应30分钟，封闭未结合的位点；用PBST 洗涤4～5次，最后用2mL PBS重悬保存于4℃备用。
(2)沙门氏菌检测抗体生物素化：首先将EZ-LinkTMSulfo-NHS-LC-LC-Biotin用二甲基甲酰胺稀释至1mg/mL，同样将沙门氏菌检测抗体(Ab2)用PBS稀释至1mg/mL；再将两者以摩尔比30:1(生物素/检测抗体)的比例混匀，在室温下震荡反应4小时实现检测抗体的生物素化；反应结束后将混合液转移至干净的透析袋中，置于4℃冰箱中透析4 小时除去剩余的生物素和离子；最后经生物素标记的检测抗体保存在﹣20℃备用。
(3)将培养好的沙门氏菌菌液用生理盐水分别稀释至107,106,105,104,103,102,50, 20,10,0CFU/mL，各取400μL至1.5mL离心管中，再加入100μL MNPs-Ab1溶液，充分混匀后在37℃下温和反应30分钟，得到磁纳米颗粒-Ab1-沙门氏菌复合物。其中， MNPs-Ab1浓度为0.5mg/mL时，效果最佳，优化结果见图9所示。
(4)将磁纳米颗粒-Ab1-沙门氏菌复合物磁分离，用PBST洗涤3次，再加入生物素化的检测抗体于各个离心管中，在37℃下温和反应30分钟。
(5)过量的生物素化抗体通过磁分离去除，所得磁纳米颗粒-Ab1-沙门氏菌-Ab2复合物用PBST洗涤3次。
(6)在(5)中所得复合物中加入一定量链霉亲和素标记的碱性磷酸酶，在37℃下温和反应30分钟，磁分离，复合物用PBST洗涤4次，最后用100μL纯水重悬，得到纳米颗粒-Ab1-沙门氏菌-Ab2-碱性磷酸酶复合物。其中，生物素标记的检测抗体与链霉亲和素标记的碱性磷酸酶的质量比例为4:1时，效果最佳，优化结果见图10所示。
(7)配制抗坏血酸磷酸酯溶液(25mM)，取20μL加入到1.5mL离心管中，再加入 60μL纯水和20μL(6)中所得重悬液，在37℃下反应30分钟。
(8)磁分离，取所得混合液80μL，加入80μL浓度为0.5mM的KMnO4，置于37℃孵化5分钟。
(9)最后，将160μL反应液用LF-NMR测定T2值，实验结果如图11示出了T2值的改变量随着沙门氏菌浓度变化的示意图，并且该方法对沙门氏菌的检测具有很好的灵敏度和线性范围。
实施例3检测沙门氏菌的特异性考察
(1)将培养好的沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌和副溶血弧菌菌液用生理盐水分别稀释至105CFU/mL，各取400μL至1.5mL离心管中，再加入100μL MNPs-沙门氏菌捕获抗体溶液，充分混匀后在37℃下温和反应30分钟。
(2)磁分离，用PBST洗涤3次，再加入生物素化的沙门氏菌检测抗体于各个离心管中，在37℃下温和反应30分钟。
(3)过量的生物素化抗体通过磁分离去除，所得复合物用PBST洗涤3次。
(4)在(3)中所得复合物中加入一定量的链霉亲和素标记的碱性磷酸酶，在37℃下温和反应30分钟，磁分离，复合物用PBST洗涤4次，最后用100μL纯水重悬复合物。
(5)配制抗坏血酸磷酸酯溶液(25mM)，取20μL加入到1.5mL离心管中，再加入 60μL纯水和20μL(4)中所得重悬液，在37℃下反应30分钟。
(6)磁分离，取各所得混合液80μL，加入80μL浓度为0.5mM的KMnO4，置于37℃孵化5分钟。
(7)最后，将160μL反应液用LF-NMR测定T2值，实验结果如图12示出了检测不同致病菌所对应的T2值的改变量，表明该方法对沙门氏菌检测具有良好的特异性。
实施例4沙门氏菌测定的加标回收率
(1)在牛奶样品中加入一定浓度的沙门氏菌菌液至沙门氏菌浓度分别为107，105，103CFU/mL，各取400μL至1.5mL离心管中，再加入100μL MNPs-Ab1溶液，充分混匀后在37℃下温和反应30分钟。
(2)磁分离，复合物用PBST洗涤3次，再加入生物素化的抗体于各个离心管中，在37℃下温和反应30分钟。
(3)过量的生物素化抗体通过磁分离去除，所得复合物用PBST洗涤3次。
(4)在(3)中所得复合物中分别加入相同量的链霉亲和素标记的碱性磷酸酶，在37℃下温和反应30分钟，磁分离，复合物用PBST洗涤4次，最后用100μL纯水重悬复合物。
(5)配制抗坏血酸磷酸酯溶液(25mM)，取20μL加入到1.5mL离心管中，再加入 60μL纯水和20μL(4)中所得重悬液，在37℃下反应30分钟。
(6)磁分离，取各所得混合液80μL，加入80μL浓度为0.5mM的KMnO4，置于37℃孵化5分钟。
(7)最后，将160μL反应液用LF-NMR测定T2值，实验结果如表1示出了牛奶中不同沙门氏菌加标水平的加标回收率，表明该方法对沙门氏菌的检测具有良好的准确性和精密度。
表1牛奶中不同沙门氏菌加标水平的加标回收率
Figure BDA0002209355610000101
实施例5T2传感器与传统ELISA检测沙门氏菌方法比较
(1)将培养好的沙门氏菌菌液用生理盐水分别稀释至107,106,105,104,103,102,50, 20,10,0CFU/mL，各取400μL至1.5mL离心管中，再加入100μL MNPs-Ab1溶液，充分混匀后在37℃下温和反应30分钟。
(2)磁分离，用PBST洗涤3次，再加入生物素化的抗体于各个离心管中，在37℃下温和反应30分钟。
(3)过量的生物素化抗体通过磁分离去除，所得复合物用PBST洗涤3次。
(4)在(3)中所得复合物中加入一定量的链霉亲和素标记的碱性磷酸酶，在37℃下温和反应30分钟，磁分离，复合物用PBST洗涤4次，最后用100μL纯水重悬复合物。
(5)配制抗坏血酸磷酸酯溶液(25mM)，取20μL加入到1.5mL离心管中，再加入 60μL纯水和20μL(4)中所得重悬液，在37℃下反应30分钟；
(6)配制对硝基苯磷酸二钠盐(5mg/mL)，取20μL加入到酶标板中，再加入60μL 纯水和20μL(4)中所得重悬液，在37℃下避光反应30分钟，用酶标仪在405nm处读取OD值。
(7)将(5)中反应液磁分离，取所得混合液80μL，加入80μL浓度为0.5mM的KMnO4，置于37℃孵化5分钟。
(8)将(7)中160μL反应液用LF-NMR测定T2值，实验结果如图13示出了T2值的改变量及吸光值的改变量随着沙门氏菌浓度变化的示意图，表明磁免疫传感器对沙门氏菌的检测具有更好的灵敏度和线性范围。
实施例6市售饮用水中大肠杆菌的检测
(1)MNPs-捕获抗体偶联物的制备：取500μL 1000nm COOH-MNPs，用纯水洗涤两次，再用2mL纯水重悬；加入100μL EDC(10mg/mL)和50μL NHS(10mg/mL)活化30 分钟；磁分离后用2mL PBS(pH＝7.4)重悬；再加入0.2mg大肠杆菌捕获抗体(Ab1)，温和振荡反应3小时后，加入500μL 3％BSA反应30分钟，封闭未结合的位点；用PBST 洗涤4～5次，最后用2mL PBS重悬保存于4℃备用。
(2)大肠杆菌检测抗体生物素化：首先将EZ-LinkTMSulfo-NHS-LC-LC-Biotin用二甲基甲酰胺稀释至1mg/mL，同样将大肠杆菌检测抗体(Ab2)用PBS稀释至1mg/mL；再将两者以摩尔比30:1(生物素/检测抗体)的比例混匀，在室温下震荡反应4小时实现检测抗体的生物素化；反应结束后将混合液转移至干净的透析袋中，置于4℃冰箱中透析4 小时除去剩余的生物素和离子；最后经生物素标记的检测抗体保存在﹣20℃备用。
(3)将培养好的大肠杆菌菌液用市售饮用水分别稀释至107,106,105,104,103,102,50,20,10,5,0CFU/mL，各取400μL至1.5mL离心管中，再加入100μL MNPs-Ab1溶液，充分混匀后在37℃下温和反应30分钟，得到磁纳米颗粒-Ab1-大肠杆菌复合物。
(4)将磁纳米颗粒-Ab1-大肠杆菌复合物磁分离，用PBST洗涤3次，再加入生物素化的检测抗体于各个离心管中，在37℃下温和反应30分钟。
(5)过量的生物素化抗体通过磁分离去除，所得磁纳米颗粒-Ab1-大肠杆菌-Ab2复合物用PBST洗涤3次。
(6)在(5)中所得复合物中加入一定量链霉亲和素标记的碱性磷酸酶，在37℃下温和反应30分钟，磁分离，复合物用PBST洗涤4次，最后用100μL纯水重悬，得到纳米磁颗粒-Ab1-大肠杆菌-Ab2-碱性磷酸酶复合物。
(7)配制抗坏血酸磷酸酯溶液(25mM)，取20μL加入到1.5mL离心管中，再加入 60μL纯水和20μL(6)中所得重悬液，在37℃下反应30分钟。
(8)磁分离，取所得混合液80μL，加入80μL浓度为0.5mM的KMnO4，置于37℃孵化5分钟。
(9)最后，将160μL反应液用LF-NMR测定T2值，实验结果如图14示出了T2值的改变量随着大肠杆菌浓度变化的示意图，表明该方法对大肠杆菌的检测具有很好的灵敏度和线性范围。

Claims (9)

1.一种酶促低场核磁共振免疫传感器检测食源性致病菌的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)将捕获抗体偶联到磁纳米颗粒表面并制备成磁纳米颗粒-捕获抗体偶联物，然后将磁纳米颗粒-捕获抗体偶联物加入到待测样品中，使捕获抗体与待测样品中的致病菌发生特异性免疫反应，磁分离后得到磁纳米颗粒-捕获抗体-致病菌复合物；
2)将生物素标记的检测抗体加入到步骤1)的复合物中，使检测抗体与待测致病菌发生特异性免疫反应，磁分离后得到磁纳米颗粒-捕获抗体-致病菌-检测抗体-生物素复合物；
3)向步骤2)的复合物中加入链霉亲和素标记的碱性磷酸酶，利用生物素与链霉亲和素的特异亲和能力，将碱性磷酸酶复合到检测抗体表面，磁分离后得到磁纳米颗粒-捕获抗体-致病菌-检测抗体-碱性磷酸酶复合物；
4)将抗坏血酸磷酸酯加入到步骤3)磁分离得到的复合物中，使碱性磷酸酶催化抗坏血酸磷酸酯生成抗坏血酸，磁分离后向反应液中加入KMnO4溶液，抗坏血酸将Mn(VII)还原成Mn(II)，低场核磁共振仪测定T2值并计算待测样品中的致病菌含量。
2.如权利要求1所述酶促低场核磁共振免疫传感器检测食源性致病菌的方法，其特征在于：所述磁纳米颗粒是粒径为1000nm的COOH-MNPs。
3.如权利要求1所述酶促低场核磁共振免疫传感器检测食源性致病菌的方法，其特征在于：所述生物素为EZ-LinkTMSulfo-NHS-LC-LC-Biotin。
4.如权利要求1所述酶促低场核磁共振免疫传感器检测食源性致病菌的方法，其特征在于：所述特异性免疫反应是在37℃条件下进行。
5.如权利要求1所述酶促低场核磁共振免疫传感器检测食源性致病菌的方法，其特征在于：所述反应液中抗坏血酸的浓度为200-500μM，所述KMnO4溶液的浓度为0.5mM，所述反应液与KMnO4溶液的体积比为1：1。
6.如权利要求1所述酶促低场核磁共振免疫传感器检测食源性致病菌的方法，其特征在于：所述的生物素标记的检测抗体与链霉亲和素标记的碱性磷酸酶的质量比为4:1。
7.如权利要求1所述酶促低场核磁共振免疫传感器检测食源性致病菌的方法，其特征在于：步骤1)中所述的磁纳米颗粒-捕获抗体偶联物的浓度是0.5mg/mL。
8.如权利要求5所述酶促低场核磁共振免疫传感器检测食源性致病菌的方法，其特征在于：步骤4)所述抗坏血酸磷酸酯溶液的浓度为25mM，所述抗坏血酸磷酸酯溶液与复合物的体积比为1：1。
9.如权利要求1所述酶促低场核磁共振免疫传感器检测食源性致病菌的方法，其特征在于：所述碱性磷酸酶催化抗坏血酸磷酸酯生成抗坏血酸是在pH 7.0的纯水体系进行。
CN201910893003.5A 2019-09-20 2019-09-20 酶促低场核磁共振免疫传感器检测食源性致病菌的方法 Active CN112540095B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910893003.5A CN112540095B (zh) 2019-09-20 2019-09-20 酶促低场核磁共振免疫传感器检测食源性致病菌的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910893003.5A CN112540095B (zh) 2019-09-20 2019-09-20 酶促低场核磁共振免疫传感器检测食源性致病菌的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112540095A CN112540095A (zh) 2021-03-23
CN112540095B true CN112540095B (zh) 2022-03-22

Family

ID=75012272

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910893003.5A Active CN112540095B (zh) 2019-09-20 2019-09-20 酶促低场核磁共振免疫传感器检测食源性致病菌的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112540095B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113514488A (zh) * 2021-04-30 2021-10-19 扬州大学 一种基于酶调控纳米颗粒自组装的微流控磁弛豫传感检测方法
CN113376371B (zh) * 2021-05-10 2024-01-30 华中农业大学 一种铂壳金核纳米酶介导的磁弛豫传感信号放大系统的构建方法及其应用
CN114966012B (zh) * 2022-04-07 2024-01-19 深圳万知达科技有限公司 基于超顺磁性二维材料的低场核磁共振均相免疫检测食源性致病菌的方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5164297A (en) * 1990-05-03 1992-11-17 Advanced Magnetics Inc. Solvent mediated relaxation assay system
CN102464355A (zh) * 2010-11-05 2012-05-23 中国石油化工股份有限公司 一种超细锰氧化物的制备方法
CN103926239A (zh) * 2013-01-11 2014-07-16 丹纳赫（上海）工业仪器技术研发有限公司 水性样品中的可氧化污染物的检测方法
CN104558184A (zh) * 2014-12-26 2015-04-29 华中农业大学 用于检测硝基咪唑类药物的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒
CN104914100A (zh) * 2015-06-04 2015-09-16 苏州大学张家港工业技术研究院 一种细菌的现场快速可视化检测方法及其试剂盒
CN105352987A (zh) * 2015-11-16 2016-02-24 南昌大学 一种基于KMnF4纳米探针的NMR食源性过敏原快速检测方法
CN108136053A (zh) * 2015-08-13 2018-06-08 通用医疗公司 用于mr分子成像的基于锰的螯合缀合物

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7534560B2 (en) * 2002-05-10 2009-05-19 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Simple catalytic DNA biosensors for ions based on color changes

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5164297A (en) * 1990-05-03 1992-11-17 Advanced Magnetics Inc. Solvent mediated relaxation assay system
CN102464355A (zh) * 2010-11-05 2012-05-23 中国石油化工股份有限公司 一种超细锰氧化物的制备方法
CN103926239A (zh) * 2013-01-11 2014-07-16 丹纳赫（上海）工业仪器技术研发有限公司 水性样品中的可氧化污染物的检测方法
CN104558184A (zh) * 2014-12-26 2015-04-29 华中农业大学 用于检测硝基咪唑类药物的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒
CN104914100A (zh) * 2015-06-04 2015-09-16 苏州大学张家港工业技术研究院 一种细菌的现场快速可视化检测方法及其试剂盒
CN108136053A (zh) * 2015-08-13 2018-06-08 通用医疗公司 用于mr分子成像的基于锰的螯合缀合物
CN105352987A (zh) * 2015-11-16 2016-02-24 南昌大学 一种基于KMnF4纳米探针的NMR食源性过敏原快速检测方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
《XPS determination of Mn oxidation states in Mn（Hydr）oxides》;Eugene S.Ilton等;《Applied Surface Science》;20160111;第475-485页 *
《基于磁分离的磁弛豫时间免疫传感器检测致病菌的研究》;陈翊平等;《中国化学会第30届学术年会摘要集-第三分会：纳米传感新原理新方法》;20160731;第57页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112540095A (zh) 2021-03-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112540095B (zh) 酶促低场核磁共振免疫传感器检测食源性致病菌的方法
US9448236B2 (en) Biologically enhanced electrically-active magnetic nanoparticles for concentration, separation, and detection applications
Fei et al. A sandwich electrochemical immunoassay for Salmonella pullorum and Salmonella gallinarum based on a AuNPs/SiO 2/Fe 3 O 4 adsorbing antibody and 4 channel screen printed carbon electrode electrodeposited gold nanoparticles
CN110927372B (zh) 基于双纳米复合物的比色免疫传感器及其制备方法和应用
Chen et al. A novel chemiluminescence immunoassay of staphylococcal enterotoxin B using HRP-functionalised mesoporous silica nanoparticle as label
Qiao et al. Rapid and sensitive detection of E. coli O157: H7 based on antimicrobial peptide functionalized magnetic nanoparticles and urease-catalyzed signal amplification
CN110455848B (zh) 基于络合反应放大信号的铁离子纵向弛豫时间传感器及其构建方法、用途
CN109444240B (zh) 一种基于普鲁士蓝的电化学免疫传感器及基于该传感器所建立的电化学免疫传感方法和应用
CN108333536B (zh) 基于纵向弛豫时间信号读出的磁传感器及其构建方法、用途
Luo et al. Rapid electrochemical quantification of Salmonella Pullorum and Salmonella Gallinarum based on glucose oxidase and antibody-modified silica nanoparticles
Zhang et al. A novel colorimetric immunoassay strategy using iron (iii) oxide magnetic nanoparticles as a label for signal generation and amplification
Liu et al. Catalase-linked immunosorbent pressure assay for portable quantitative analysis
CN111796092B (zh) 基于pH响应的异色纳米颗粒、含有该纳米颗粒的致病菌检测试剂盒及检测方法
Cao et al. An ultrasensitive smartphone-assisted bicolor-ratiometric fluorescence sensing platform based on a “noise purifier” for point-of-care testing of pathogenic bacteria in food
Zhao et al. Magnetic nanoprobe-enabled lateral flow assays: recent advances
Huang Simultaneous quantitative analysis of Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus based on antibiotic-introduced lateral flow immunoassay
CN112538519B (zh) 一种酶促低场核磁共振dna传感器检测食源性致病菌的方法
Ye et al. An ultrasensitive sandwich immunoassay with a glucometer readout for portable and quantitative detection of Cronobacter sakazakii
CN113376378A (zh) 一种d-二聚体检测试剂盒、制备方法及用途
Zhou et al. Polystyrene microsphere-mediated optical sensing strategy for ultrasensitive determination of aflatoxin M1 in milk
CN116338171A (zh) 一种免洗均相检测方法
CN113376371B (zh) 一种铂壳金核纳米酶介导的磁弛豫传感信号放大系统的构建方法及其应用
Xi et al. Bioinspired fabrication of bifunctional antibody–enzyme co-assembled nanocomposites for chemiluminescence immunoassays of E. coli O157: H7
Cai et al. Biomimetic-mineralized multifunctional nanoflowers for anodic-stripping voltammetric immunoassay of rehabilitation-related proteins
CN104237501A (zh) 一种抗体修饰的纳米银及其试剂盒与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant