CN103713123A - 一种硝基咪唑类药物快速检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种硝基咪唑类药物快速检测试剂盒，它含有：(1)包被硝基咪唑抗原的酶联板或包被硝基咪唑特异性抗体的酶联板；(2)酶标记硝基咪唑特异性抗体或酶标记硝基咪唑抗原；(3)硝基咪唑标准品溶液；(4)底物显色液；(5)终止液；(6)浓缩洗涤液；(7)浓缩复溶液。本发明样品前处理过程简单，检测时间短、费用低廉，灵敏度和检测限都大幅度提高且能同时检测大批样品，可以使试剂盒的检测限达到0.05μg/g，比仪器方法的检测限1μg/g要提高20倍。

Description

一种硝基咪唑类药物快速检测试剂盒
 
【技术领域】
本发明涉及一种硝基咪唑类药物快速检测试剂盒,为一种检测动物源性食品中硝基咪唑的酶联免疫试剂盒。
 
【背景技术】
甲硝唑、二甲硝唑和洛硝哒唑是属于常用硝基咪唑类药物，用于预防和治疗特定病菌和原生动物疾病。由于硝基咪唑类化合物具有潜在的致癌性、诱导有机突变性，故欧盟和我国已禁止在任何动物源性食品中使用该类药物。目前测定硝基咪唑类的方法主要有气相色谱法和气相色谱质谱联用法、高效液相色谱法和高效液相色谱质谱联用法。但因这些检测方法投入成本高，检测时间长，方法复杂，现阶段不适宜在我国广泛推广使用。我公司研制出硝基咪唑类ELISA快速检测试剂盒，其方法简单，时间短，检测成本低，相比市面上的同类国产和进口产品，不仅价格低廉，质量还具有绝对优势，具有稳定性强，检测结果重复率高的特点。农业部发布的193号公告的《食品动物禁用的兽药及其他化合物清单》中,硝基咪唑在所有食品动物肌肉中禁止使用。因此,为确保动物源性食品的安全和对外出口贸易的发展,建立准确可靠,灵敏度高的定性定量方法是十分必要的。本发明由此产生。
 
【发明内容】
为解决现有技术的上述技术问题，本发明的目的是提供一种硝基咪唑类药物快速检测试剂盒，样品前处理过程简单，检测时间短、费用低廉，灵敏度和检测限都大幅度提高且能同时检测大批样品。
为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明为一种硝基咪唑类药物快速检测试剂盒，它含有：
(1)包被硝基咪唑抗原的酶联板或包被硝基咪唑特异性抗体的酶联板；(2) 酶标记硝基咪唑特异性抗体或酶标记硝基咪唑抗原；(3)硝基咪唑标准品溶液；(4)底物显色液；(5)终止液；(6)浓缩洗涤液；(7)浓缩复溶液。
包被硝基咪唑抗原的酶联板或包被硝基咪唑特异性抗体的酶联板的制备步骤为：
(1)用包被缓冲液将硝基咪唑半抗原与载体蛋白偶联物或抗抗体以0.02~0.08μg/ml浓度稀释成抗原稀释液或抗体稀释液；
(2)向酶联板的每孔中加入100μl已经稀释好的抗原稀释液或抗抗体稀释液，37℃温育2h，倾去包被液，用洗涤液洗涤4次，每次15~30s，拍干；
 (3)向酶联板的每孔中加入150~200μl封闭液，37℃温育1~2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。
所述缓冲液为pH值9.6、0.05mol/L、含有0.5%甲醇的碳酸盐缓冲液；所述的洗涤液为含有8%~15%吐温-20的去离子水或超纯水；所述的封闭液是含有8%~15%的脱脂奶和1%惰性蛋白的溶液；该载体蛋白可为牛血清白蛋白、鸡卵清蛋白、兔血清蛋白、人血清白蛋白、人血纤维蛋白、血蓝蛋白等大分子载体。
所述的硝基咪唑酶标记抗原为采用戊二醛法将标记酶与硝基咪唑半抗原进行偶联得到。
所述的硝基咪唑特异性抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
所述单克隆抗体制备的步骤为：
（1）、动物免疫程序：采用Balb/c小鼠作为免疫动物，免疫原(硝基咪唑半抗原与钥孔槭血蓝蛋白的偶联物)免疫剂量为80~100μg/只，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔2~3周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，四免后腹腔加强免疫一次，3天后取脾细胞；（2）、细胞融合与克隆化：取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按5~10：1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔，利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；（3）、细胞冻存和复苏：取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成l~5×106个/ml的细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存，复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养；（4）、单克隆抗体的制备与纯化：采用体内诱生法，将Balb/c小鼠(8周龄)腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7~14天后腹腔注射杂交瘤细胞5×l05~106个/只，7~10天后采集腹水，用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，小瓶分装，-20℃保存；（5）、抗体冻干粉可将腹水在37℃环境下烘干，放入-20℃保存；（6）、抗体工作液是用抗体稀释液将抗体以0.02~0.08μg/ml浓度进行稀释。
所述多克隆抗体制备的步骤为：采用新西兰大白兔作为免疫动物，免疫原(硝基咪唑半抗原与钥孔槭血蓝蛋白的偶联物)免疫剂量为1mg/kg，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔3~4周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐剂。最后一次免疫7~l0天后采血，测定血清抗体效价，心脏采血，经硫酸铵分级沉淀得到纯化的多克隆抗体。
当标记酶为过氧化物酶时底物显色液为过氧化氢或过氧化脲与四甲基联苯胺硫酸盐混合溶液、终止液为0.1~0.5mol/L的硫酸或盐酸缓冲液；当标记酶为半乳糖甘酶时，底物显色液为0.5mol/L磷酸钾缓冲液，终止液为2mol/L的柠檬酸缓冲液。
所述的浓缩洗涤液为去离子水或超纯水。
所述的浓缩复溶液为含1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。
本发明的有益效果如下：
本发明提供的检测动物源性食品中硝基咪唑残留的酶联免疫试剂盒及方法，样品前处理过程简单，检测时间短、费用低廉，灵敏度和检测限都大幅度提高且能同时检测大批样品。当标记酶为过氧化物酶时底物显色液为过氧化氢或过氧化脲与四甲基联苯胺硫酸盐混合溶液时，可将灵敏度提高到0.05μg/L，使试剂盒的检测限达到0.05μg/g，比仪器方法的检测限1μg/g要提高20倍。
 
【具体实施方式】
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
本发明的硝基咪唑类药物快速检测试剂盒包含有：它含有：(1)包被硝基咪唑抗原的酶联板或包被硝基咪唑特异性抗体的酶联板；(2) 酶标记硝基咪唑特异性抗体或酶标记硝基咪唑抗原；(3)硝基咪唑标准品溶液；(4)底物显色液；(5)终止液；(6)浓缩洗涤液；(7)浓缩复溶液。
包被硝基咪唑抗原的酶联板或包被硝基咪唑特异性抗体的酶联板的制备步骤为：
(1)用包被缓冲液将硝基咪唑半抗原与载体蛋白偶联物或抗抗体以0.02~0.08μg/ml浓度稀释成抗原稀释液或抗体稀释液；
(2)向酶联板的每孔中加入100μl已经稀释好的抗原稀释液或抗抗体稀释液，37℃温育2h，倾去包被液，用洗涤液洗涤4次，每次15~30s，拍干；
 (3)向酶联板的每孔中加入150~200μl封闭液，37℃温育1~2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。
在本发明中缓冲液为pH值9.6、0.05mol/L、含有0.5%甲醇的碳酸盐缓冲液；所述的洗涤液为含有8%~15%吐温-20的去离子水或超纯水；所述的封闭液是含有8%~15%的脱脂奶和1%惰性蛋白的溶液；本发明试剂盒中硝基咪唑包被抗原是采用混合酸酐法将硝基咪唑半抗原与载体蛋白进行偶联得到的，该载体蛋白可为牛血清白蛋白、鸡卵清蛋白、兔血清蛋白、人血清白蛋白、人血纤维蛋白、血蓝蛋白等大分子载体。
当标记酶为过氧化物酶时底物显色液为过氧化氢或过氧化脲与四甲基联苯胺硫酸盐混合溶液、终止液为0.1~0.5mol/L的硫酸或盐酸缓冲液；当标记酶为半乳糖甘酶时，底物显色液为0.5mol/L磷酸钾缓冲液，终止液为2mol/L的柠檬酸缓冲液。
包被硝基咪唑抗原或抗体的载体物质可为聚苯乙烯、纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交联葡聚糖、玻璃、硅橡胶、琼脂糖凝胶等；载体的形式可以是试管、微量反应板凹孔、小珠、小圆片等；浓缩洗涤液为去离子水或超纯水；浓缩复溶液为含1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。
以上方法制备的酶联板具有很好的稳定性，经过冷热稳定性试验，酶联板的相关技术参数均在正常范围，且包被原有良好的特异性。
本发明所述试剂盒中酶标记物为酶标记硝基咪唑特异性抗体或酶标记硝基咪唑抗原，所用酶可为过氧化物酶或半乳糖甘酶，本发明优选过氧化物酶；酶标记物形式可为冻干粉、浓缩液和工作液；酶标记物工作液所用的稀释液为含有50%甘油(可防止放入-20℃环境的酶标记物冻结，亦可长时间保持酶标记物的生物活性)、1%的叠氮化钠防腐剂(便于保存)的溶液。
本发明试剂盒中酶标记硝基咪唑特异性抗体为过氧化物酶标记硝基咪唑特异性抗体，其制备步骤为：将抗体与过氧化物酶(HRP)进行偶联，采用的方法是戊二醛法，采用戊二醛法使得抗体与辣根过氧化物酶的结合率升高，传统GA一步法偶联反应不易控制，反应速度快的分子易发生自生聚合，且偶联效率不高。为了解决这些问题，我们将一步法进行了改进，克服了一步法的缺点。首先在被偶联的两种分子中，与偶联剂反映较弱的分子先用过量的偶连剂活化，然后去处多余的偶连剂；第二步将一端与某种分子连接的偶连剂，通过改变反应条件而与另一种分子连接起来。二步法虽然操作较繁，但偶连效率提高，而且形成的同分子聚合物减少。
硝基咪唑酶标记抗原为采用戊二醛法将标记酶与硝基咪唑半抗原进行偶联得到。
本发明所述试剂盒中硝基咪唑特异性抗体为鼠源单克隆抗体或兔源多克隆抗体，免疫原是采用混合酸酐法将硝基咪唑半抗原与鸡卵清蛋白（OVA)行偶联得到的；抗体形式可为冻干粉、浓缩液、工作液；抗体稀释液为pH值7.4、0.08mol/L、含有0.3%明胶、5‰土温-80和5‰甲醇的磷酸盐缓冲液。
所述的硝基咪唑特异性抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
单克隆抗体制备的步骤为：
（1）、动物免疫程序：采用Balb/c小鼠作为免疫动物，免疫原(硝基咪唑半抗原与钥孔槭血蓝蛋白的偶联物)免疫剂量为80~100μg/只，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔2~3周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，四免后腹腔加强免疫一次，3天后取脾细胞；（2）、细胞融合与克隆化：取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按5~10：1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔，利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；（3）、细胞冻存和复苏：取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成l~5×106个/ml的细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存，复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养；（4）、单克隆抗体的制备与纯化：采用体内诱生法，将Balb/c小鼠(8周龄)腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7~14天后腹腔注射杂交瘤细胞5×l05~106个/只，7~10天后采集腹水，用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，小瓶分装，-20℃保存；（5）、抗体冻干粉可将腹水在37℃环境下烘干，放入-20℃保存；（6）、抗体工作液是用抗体稀释液将抗体以0.02~0.08μg/ml浓度进行稀释。
所述多克隆抗体制备的步骤为：采用新西兰大白兔作为免疫动物，免疫原(硝基咪唑半抗原与钥孔槭血蓝蛋白的偶联物)免疫剂量为1mg/kg，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔3~4周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐剂。最后一次免疫7~l0天后采血，测定血清抗体效价，心脏采血，经硫酸铵分级沉淀得到纯化的多克隆抗体。
本发明所述试剂盒中硝基咪唑标准品溶液为六个浓度梯度的硝基咪唑溶液，硝基咪唑稀释液为0.02M的磷酸盐缓冲液。
本发明所述试剂盒中试剂的配制具体为：
a．硝基咪唑标准溶液：硝基咪唑系列标准溶液6瓶，浓度为0μg/L、0.05μg/L、0.15μg/L、0.45μg/L、1.35μg/L、4.05μg/L，1~3ml/瓶；
b．包被缓冲液：pH值9.6、0.05mol/L、含有0.5%甲醇的碳酸盐缓冲液；
c．封闭液：含有8%~15%的脱脂奶和1%惰性蛋白的溶液；
d．洗涤液：含有8%~15%吐温-20的去离子水或超纯水，30~50ml/瓶，1瓶；
e．酶标记物：酶标记抗抗体工作液或酶标记硝基咪唑抗原工作液，7~12ml/瓶，l瓶；
f．底物显色液过氧化氢或过氧化脲与四甲基联苯胺硫酸盐混合溶液，10~15ml/瓶，l瓶；
g．底物显色液对硝基磷酸盐缓冲液：pH8.1、含有MgCl2 0.01%的 100mmolTris-HCl；
h．终止液：1~2mol/L硫酸、盐酸或2mol/L氢氧化钠缓冲液，5~8ml/瓶，1瓶；
i．抗体稀释液：pH值7.4、0.08mol/L、含有0.3%明胶、5‰土温-80和5‰甲醇的磷酸盐缓冲液；
j．浓缩复溶液：含有5%甲醇、1%小牛血清(BSA)的磷酸盐缓冲液，为正常使用浓度的5~10倍，30~50ml/瓶，1瓶。
本发明所述检测动物源性食品中硝基咪唑的方法，包括了以下步骤：
(1)样品前处理；
(2)用本发明所述的试剂盒进行检测；
(3)分析检测结果。
1、本发明中样品前处理方法为：
样本前处理需配制：
配液1：pH 10.6   0.1M   碳酸盐缓冲液    
称取4.66g无水碳酸钠，0.5g碳酸氢钠
去离子水500ml溶解。
配液2：2M 氢氧化钠溶液
称取40g氢氧化钠，加入去离子水500ml溶解。
（A）组 织、蜂蜜（鸡、鸭肉/肝脏、鱼、虾、等）
（样本稀释倍数0.5）
（1）取3g样本，加3ml 0.1M 碳酸盐缓冲溶液振荡至蜂蜜全部溶解；
（2）加入9ml 乙酸乙酯，振荡5分钟，室温4000转/分，离心5分钟；
（3）取上层有机相6ml至另一离心管中，加入2ml乙酸乙酯，2ml 2M氢氧化钠溶液，振荡5分钟，室温4000转/分，离心5分钟；
（4）取4ml清澈上层有机相至干净玻璃试管中，56℃水浴氮气/空气吹干；
（5）加入正己烷1ml，涡动30s，再加入0.5ml复溶液混合30秒，室温4000转/分以上，离心5分钟；
（6）去除上层有机相，取下层50μl液体用于分析。
 
2、用本发明所述的试剂盒进行检测的步骤：
将所需试剂从冷藏环境中取出，在室温下平衡30分钟，每种液体使用前均须摇匀。注意标准液均需做2个平行试验。
抗体工作液和酶标浓缩液混合：将抗体工作液和酶标浓缩液按10:1体积比混合均匀（即 1000l 抗体工作液+100l酶标浓缩液，此混合液现配现用，不能保存）
加50l标准品或样品，于对应微孔中，再加50μl抗体工作液和酶标浓缩液混合液，用膜盖好，25℃下避光反应30分钟。
洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加洗涤液 250l/孔，每次浸泡15~30秒，充分洗涤4－5次，用吸水纸拍干
显色：每孔先各加入底物液A 50μl，再各加入底物液B 50μl，轻轻晃荡混匀，并在25℃下避光反应15分钟。
读数：每孔各加50μl终止液，在酶标仪于450nm处测定OD值（建议用450/630nm双波长检测，在5分钟内读完数据）。
 
(3)分析检测结果：
      所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以第一个标准（0标准）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。
B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
B0—0ng/ml标准溶液的平均吸光度值
以标准品百分吸光率为纵坐标，以DSMS标准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中DSMS实际浓度。
本发明提供的检测动物源性食品中硝基咪唑残留的酶联免疫试剂盒及方法，样品前处理过程简单，检测时间短、费用低廉，灵敏度和检测限都大幅度提高且能同时检测大批样品。
当标记酶为过氧化物酶时底物显色液为过氧化氢或过氧化脲与四甲基联苯胺硫酸盐混合溶液时，可将灵敏度提高到0.05μg/L，使试剂盒的检测限达到0.05μg/g，比仪器方法的检测限1μg/g要提高20倍，
浓缩复溶液：含有5%甲醇、1%小牛血清(BSA)的磷酸盐缓冲液，加入了甲醇，小牛血清，使抗体的抗干扰能力更强，从而减少了假阳性的出现。
分别采用混合酸酐法将半抗原与血清蛋白反应生成包被抗原,用EDC法将半抗原与血蓝蛋白反应生成免疫抗原。可同时检测甲硝唑(MNZ) 、二甲硝咪唑DMZ、洛硝唑(RNZ)三种药物的含量，用间接显色酶联免疫法检测硝基咪唑抗体,结果：IC50=0.2 ng/mL,在食品中检测线为0.1 ng/mL,得到的抗体与其他结构或功能相似的药物交叉率很小,检测食品中硝基咪唑类药物的回收率84-110%,变异系数12%。
上述实施例仅用于解释说明本发明的发明构思，而非对本发明权利保护的限定，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种硝基咪唑类药物快速检测试剂盒，其特征在于，它含有：
(1)包被硝基咪唑抗原的酶联板或包被硝基咪唑特异性抗体的酶联板；
(2)酶标记硝基咪唑特异性抗体或酶标记硝基咪唑抗原；
(3)硝基咪唑标准品溶液；
(4)底物显色液；
(5)终止液；
(6)浓缩洗涤液；
(7)浓缩复溶液。
2.根据权利要求1所述的一种硝基咪唑类药物快速检测试剂盒，其特征在于，包被硝基咪唑抗原的酶联板或包被硝基咪唑特异性抗体的酶联板的制备步骤为：
(1)用包被缓冲液将硝基咪唑半抗原与载体蛋白偶联物或抗抗体以0.02~0.08μg/ml浓度稀释成抗原稀释液或抗体稀释液；
(2)向酶联板的每孔中加入100μl已经稀释好的抗原稀释液或抗抗体稀释液，37℃温育2h，倾去包被液，用洗涤液洗涤4次，每次15~30s，拍干；
 (3)向酶联板的每孔中加入150~200μl封闭液，37℃温育1~2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。
3.根据权利要求2所述的一种硝基咪唑类药物快速检测试剂盒，其特征在于，所述缓冲液为pH值9.6、浓度为0.05mol/L、含有0.5%甲醇的碳酸盐缓冲液；所述的洗涤液为含有8%~15%吐温-20的去离子水或超纯水；所述的封闭液是含有8%~15%的脱脂奶和1%惰性蛋白的溶液；该载体蛋白可为牛血清白蛋白、鸡卵清蛋白、兔血清蛋白、人血清白蛋白、人血纤维蛋白、血蓝蛋白等大分子载体。
4.根据权利要求1所述的一种硝基咪唑类药物快速检测试剂盒，其特征在于，所述的硝基咪唑酶标记抗原为采用戊二醛法将标记酶与硝基咪唑半抗原进行偶联得到。
5.根据权利要求1所述的一种硝基咪唑类药物快速检测试剂盒，其特征在于，所述的硝基咪唑特异性抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
6.根据权利要求5所述的一种硝基咪唑类药物快速检测试剂盒，其特征在于，所述单克隆抗体制备的步骤为：
（1）动物免疫程序：采用Balb/c小鼠作为免疫动物，免疫原(硝基咪唑半抗原与钥孔槭血蓝蛋白的偶联物)免疫剂量为80~100μg/只，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔2~3周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，四免后腹腔加强免疫一次，3天后取脾细胞；
（2）细胞融合与克隆化：取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按5~10：1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔，利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
（3）细胞冻存和复苏：取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成l~5×106个/ml的细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存，复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养；
（4）单克隆抗体的制备与纯化：采用体内诱生法，将Balb/c小鼠(8周龄)腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7~14天后腹腔注射杂交瘤细胞5×l05~106个/只，7~10天后采集腹水，用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，小瓶分装，-20℃保存；
（5）抗体冻干粉可将腹水在37℃环境下烘干，放入-20℃保存；
（6）抗体工作液是用抗体稀释液将抗体以0.02~0.08μg/ml浓度进行稀释。
7.根据权利要求5所述的一种硝基咪唑类药物快速检测试剂盒，其特征在于，所述多克隆抗体制备的步骤为：采用新西兰大白兔作为免疫动物，免疫原(硝基咪唑半抗原与钥孔槭血蓝蛋白的偶联物)免疫剂量为1mg/kg，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔3~4周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐剂；最后一次免疫7~l0天后采血，测定血清抗体效价，心脏采血，经硫酸铵分级沉淀得到纯化的多克隆抗体。
8.根据权利要求1所述的一种硝基咪唑类药物快速检测试剂盒，其特征在于，当标记酶为过氧化物酶时底物显色液为过氧化氢或过氧化脲与四甲基联苯胺硫酸盐混合溶液、终止液为0.1~0.5mol/L的硫酸或盐酸缓冲液；当标记酶为半乳糖甘酶时，底物显色液为0.5mol/L磷酸钾缓冲液，终止液为2mol/L的柠檬酸缓冲液。
9.根据权利要求1所述的一种硝基咪唑类药物快速检测试剂盒，其特征在于，硝基咪唑标准品溶液为六个浓度梯度的硝基咪唑溶液，硝基咪唑稀释液为磷酸盐缓冲液，硝基咪唑标准溶液浓度为：0μg/L、0.05μg/L、0.15μg/L、0.45μg/L、1.35μg/L、4.05μg/L，1~3ml/瓶。
10.根据权利要求1所述的一种硝基咪唑类药物快速检测试剂盒，其特征在于，所述的浓缩复溶液为含1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。
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