CN106867970B - 一种分泌抗孔雀石绿单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

一种分泌抗孔雀石绿单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种分泌抗孔雀石绿单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于生物技术领域。所述杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞株MG A7，保藏编号为CCTCC NO:C201666。本发明以羧基隐性孔雀石绿与牛血清白蛋白形成的偶联物为抗原，免疫BALB/c小鼠，再将免疫后的小鼠的脾脏细胞与复壮的SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，并采用不添加抗菌素的培养基进行细胞培养，经多次筛选和克隆获得杂交瘤细胞株；该杂交瘤细胞株分泌IgM k链单克隆抗体灵敏度高，特异性强，可用于孔雀石绿的快速、准确免疫检测和免疫分析。

Description

一种分泌抗孔雀石绿单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种分泌抗孔雀石绿单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。
背景技术
孔雀石绿(MalachiteGreen oxalate，MG)是有毒的三苯甲烷类化学物，既是染料，也是杀真菌、细菌及寄生虫的药物。由于这类药物高效、价格低廉，所以多年来被广泛应用于水产养殖领域，用于预防和治疗疾病。
研究发现，孔雀石绿进入水生动物体内后，会快速代谢为脂溶性的隐性孔雀石绿(LMG)，隐形孔雀石绿由于其特性，能长期积蓄在机体组织内，残留毒性强；在哺乳动物体内，孔雀石绿会引起细胞转化和脂质过氧化，进而威胁人体健康，引发肿瘤。鉴于孔雀石绿具有潜在的致癌、致畸、致突变等危害性，《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中明确规定禁止将孔雀石绿应用于所有食品及动物。依据评估结论，MG和LMG的最高残留限量为“不得检出”。但由于没有低廉有效的替代品，孔雀石绿在水产养殖中的使用一直屡禁不止。
目前，对于孔雀石绿残留的检测方法主要以理化检测法和免疫学方法为主。其中理化检测法包括：薄层层析法、高效液相色谱法、拉曼光谱法、液质联用法等。这些方法具有定量精度高的特点，但仪器成本高、操作复杂、检测时间长，且不能用于现场检测，因而不适用于基层单位的应用，无法满足农产品市场准入制度实施对检测方法时效性的需求。利用抗体与抗原的反应为核心发展起来的免疫学检测方法主要有：酶联吸附免疫法(ELISA)和免疫胶体金法(GICT)等，这些方法具有高通量检测和操作简便、快速等优点，因而尤其适合在基层单位的应用和现场快速检测。
开发药物残留检测免疫试剂盒所面临的主要难题除了检测结果假阳性、假阴性率偏高，还有其核心原料(抗体)批量小、批间差异大且价格昂贵。出现假阳性和假阴性分别是由于方法的特异性和灵敏度不够，而免疫学检测方法的特异性和灵敏度又主要由抗体所决定。常用的单克隆抗体生产方法是将杂交瘤细胞输入动物体内，当动物腹部膨大产生腹水时，再抽取腹水获得抗体，但此方法不足之处为小鼠腹水量少而且动物个体差异使每只动物所产抗体的质量和产量均有较大差异，从而造成抗体批量小且批间差异大；而有些国家和地区禁止在动物体内制备抗体。
发明内容
本发明提供了一种分泌抗孔雀石绿单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，该杂交瘤细胞株能够在体外培养条件下大量分泌高灵敏度、高特异性的抗孔雀石绿单克隆抗体。
一种分泌抗孔雀石绿单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为杂交瘤细胞株MG A7，已于2016年4月27日保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type CultureCollection，简称CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:C201666；中国典型培养物保藏中心的地址为：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心。
本发明提供了一种制备所述杂交瘤细胞株的方法，包括：
(1)将牛血清白蛋白和羧基隐性孔雀石绿混合制备偶联物，再用所述偶联物免疫动物，获得脾细胞；
(2)将所述脾细胞与骨髓瘤细胞融合，经筛选、克隆后，获得所述杂交瘤细胞株；
所述羧基隐性孔雀石绿与牛血清白蛋白的投料摩尔比为30～50:1；所述偶联物的偶联比为2～5:1。
作为优选，所述的筛选和克隆在无抗菌素的条件下进行。
具体地，所述的动物为BALB/c小鼠。所述骨髓瘤细胞为复壮的SP2/0细胞。
所述杂交瘤细胞株的抗体基因型：重链(IgG)V基因为Musmus IGHV1-39*01F，J基因为Musmus IGHJ2*01F，D基因为Musmus IGHD1-1*01F；轻链(kappa)V基因为MusmusIGKV4-55*01F，J基因为Musmus IGKJ1*01F。
本发明还提供了一种单克隆抗体，由所述的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生。
具体地，所述单克隆抗体的亚型为IgM k链，与隐性孔雀石绿有特异性反应，对孔雀石绿、结晶紫和隐性结晶紫均有较高的亲和力。
作为优选，所述单克隆抗体由所述杂交瘤细胞株或其传代细胞株经体外培养方式获得。
具体地，本发明采用杂交瘤细胞株或其传代细胞在1640培养基中培养，当细胞进入对数生长期，收集细胞上清液，再利用硫酸铵沉淀法和透析法获得初步纯化的抗体。
本发明还提供了所述的单克隆抗体在检测动物源食用农产品中孔雀石绿及其代谢物中的应用。
本发明还提供了一种检测孔雀石绿及其代谢物的试剂盒，含有所述的单克隆抗体。
具体地，所述的试剂盒中含有所述杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生的单克隆抗体、酶标板、孔雀石绿及其代谢物标准品，酶标记物(酶标二抗)、底物和终止液，其中，酶标板上包被有人工合成的抗原(竞争物)。使用时，待检样品与抗体加入酶标板完成反应后，再加入酶标记物，若样品中含有孔雀石绿及其代谢物，则会与酶标板上的抗原竞争结合抗体，再加入底物反应，终止显色。显色强度与样品中残留的孔雀石绿及其代谢物量成反比。根据孔雀石绿及其代谢物标准品做出的标准曲线，计算出样品中的孔雀石绿及其代谢物的含量。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：
本发明以羧基隐性孔雀石绿与牛血清白蛋白形成的偶联物为抗原，免疫BALB/c小鼠，再将免疫后的小鼠的脾脏细胞与复壮的SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，并采用不添加抗菌素的培养基进行细胞培养，经多次筛选和克隆获得杂交瘤细胞株；该杂交瘤细胞株分泌IgMk链单克隆抗体灵敏度高，特异性强，可用于孔雀石绿的快速、准确免疫检测和免疫分析。
附图说明
图1为羧基隐性孔雀石绿的正离子质谱图；
图2为羧基隐性孔雀石绿、卵清蛋白、抗原羧基隐性孔雀石绿-卵清蛋白偶联物(CLMG-OVA)的光谱叠加图；
图3为杂交瘤细胞株MG A7的染色体标本；
图4为单抗对孔雀石绿(MG)间接竞争ELISA的标准曲线；
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
杂交瘤细胞株MG A7于2016年4月27日送达中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)，该细胞株的存活性于2016年5月8日检测结果为存活，保藏编号CCTCCNo:C201666。
该杂交瘤细胞株通过羧基隐性孔雀石绿(CLMG)与牛血清白蛋白(BSA)的偶联物(CLMG-BSA)为抗原，免疫BALB/c小鼠，将免疫后小鼠的脾脏细胞与经复壮的SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，采用不添加抗菌素的培养基进行细胞培养，经过筛选和3次克隆获得。具体过程如下：
(1)半抗原(羧基隐性孔雀石绿)的合成与纯化
IKA磁力搅拌器的加热板上加装油浴装置和精密反馈式温控器→称取0.9001g对醛基苯甲酸、3.6012g无水氯化锌放进三口烧瓶中，加入3.6mLN,N-二甲基苯胺、90mL无水乙醇→置于油浴装置中，用橡胶塞密住加样口，中口接蛇形冷凝管，另一口通入氮气管→在冷凝管上端放一个加塞脱脂棉的小漏斗，用封口膜蜜封三口烧瓶所有接口处。检查气密性后，接通氮气和冷却水，开始加热→在氮气保护下，100±0.2℃冷凝回流反应24h→停止加热，继续在氮气保护下冷却至室温→取出烧瓶，密封，用12层纱布包裹后，垂直放入小瓦楞纸箱内，用旧报纸固定后，-20℃静置72h→取出烧瓶时，溶液固体明显分层，上层液体为无色透明，烧瓶底部有浅绿色粘固体析出，即羧基隐性孔雀石绿(CLMG)粗产物→取少量粗产物溶解后，用高分辨离子肼质谱用正离子模式测定，测得产物分子量为376.20(见图1)。
将上层液体快速倒入抽滤器中→加压抽滤→加冷水洗涤烧瓶内固体，倒入同一抽滤器中→加压抽滤→弃滤液→收集抽滤所得固体，再水洗1次，并入烧瓶内固体中→将装有CLMG粗产物烧瓶放在水浴锅中加热(温度80℃)，并向烧瓶中滴加二甲基亚砜至产物完全溶解(约3.5mL)，倒入烧杯中→再加少量二甲基亚砜洗涤烧瓶，溶液一并倒入烧杯中→向烧杯中滴加预热好的蒸馏水(温度为45-55℃)，浅灰绿色固体析出→冷却后，4℃4000r/min，10min，弃上清→再纯化1次→产物经冷冻干燥，得浅绿色固体粉末2.2138g，产率为94％→用石墨炉原子吸收法测定产物中锌含量＜0.01％。
(2)全抗原的合成
称取羧基隐性孔雀石绿0.0375g于50mL离心管中，加入2mL DMF使其溶解→加入N,N-0.0309g二环己基碳二亚胺(DCC)、0.0174g N-羧基琥珀酰亚胺(NHS)→将离心管放在振荡器上震荡，并在4℃下振荡反应过夜→称取牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)各0.0675g，用4.5mLpH＝7.38的PBS溶解→分别向BSA和OVA溶液中各加入1mL羧基隐性孔雀石绿DMF溶液→振荡摇床上4℃摇晃反应过夜，分别合成免疫抗原(CLMG-BSA)和包被抗原(CLMG-OVA)→离心4000r/min，10min，弃沉淀→将上清液转入透析袋中，以pH＝7.4的PBS 4℃透析3天，每天换2次透析液→离心4000r/min，10min，取上清液备用，用考马斯亮蓝染色法测定蛋白浓度，其中测得CLMG-BSA浓度为3.51mg/mL→将CLMG-BSA、CLMG-OVA、CLMG、BSA和OVA溶液适当稀释，分别用分光光度计进行紫外-可见光区的扫描，如图2中CLMG、CLMG-OVA和OVA的吸收峰分别为279.50nm、268.50nm和251.00nm，产物(CLMG-OVA)与原料(CLMG和OVA)的吸收峰发生了相对位移，说明偶联成功。根据产物与原料的279.50nm、268.50nm和251.00nm波长下的吸光值和摩尔浓度，通过Lambert-Beer定律和吸收光叠加原则可粗略计算出产物的偶联率，通过以CLMG与蛋白(BSA或OVA)以6：1～150：1不同投料比的多次试验发现：当投料比过高时，DMF使蛋白变性较严重；当投料比过低时，CLMG析出较多；最佳投料比为30～50：1，产物的偶联率为2～5：1。
(3)免疫动物
首次免疫剂量约为120μg/只，例如取3.51mg/mL CLMG-BSA溶液150μL+50μLPBS+200μL弗氏完全佐剂，充分乳化后，每批免疫3只6周龄的Balb/c小鼠，分4～5点皮下注射；第2次～第5次免疫抗原剂量为80μg/只，加弗氏不完全佐剂乳化，每隔2周免疫1次，腹腔免疫与皮下免疫间隔实施；第5次免疫3周后，以120μg/只的剂量从尾静脉加免。
(4)血清抗体的检测
从第3次免疫开始，每次免疫第10天从小鼠尾部或眼框少量采血，用间接ELISA法检测血清抗体效价和对CLMG的抑制率。
ELISA检测方法：以pH＝9.6的碳酸盐缓冲液稀释将CLMG-OVA稀释成200ng/mL的包被液，100μL/孔加入96孔板酶标板，4℃过夜，洗板后每孔加150μL 10％脱脂奶粉，37℃封闭2小时，洗板后阴干备用；将血清用0.02mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)做102～107倍梯度稀释测定抗体效价；用竞争ELISA方法检测抑制率，即在对照孔中加50μL PBS，在竞争孔中加50μL 100ng/mL CLMG标准溶液，将血清稀释至适当浓度，对照孔和竞争孔各加入50μL血清稀释液，后续步骤按间接ELISA方法操作；选对照孔OD值为0.8～1.2稀释度的一组计算抑制率。
抑制率(％)＝[1﹣(OD竞争孔-OD空白)/(OD对照孔-OD空白)]×100。
本发明所涉及的杂交瘤细胞株来源于经六次免疫免疫的Balb/c小鼠，第五次免疫后10天所采的血清，用ELISA方法测得其效价为105，对100ng/mL CLMG标准溶液的抑制率为62～68％。10天后，以120μg/只的剂量从尾静脉进行第六次免疫，3天后取小鼠脾细胞用于细胞融合。
(5)细胞融合
融合前5天复苏SP2/0F3代细胞→融合前2天SP2/0细胞改用含2％8-AG培养基选择培养24小时→融合前1天换成1640培养基+10％胎牛血清培养→取6周龄空白小鼠的腹腔巨噬细胞和脾细胞作为饲养细胞，加1640培养基+15％胎牛血清+2％HAT制成细胞悬液→将六免后的小鼠引椎处死，在无菌条件下取脾脏，制成悬液→刮取107处于对数生长期的SP2/0细胞；2种细胞各用1640培养基离心清洗2次→脾细胞与SP2/0细胞以6：1的比例在50％PEG4000介导下融合→低速离心去除PEG后，向融合细胞中慢慢加入饲养细胞悬液，小心混匀后，以200μL/孔加入96孔细胞培养板中，共铺6块板。
(6)细胞选择性培养
细胞融合后在37℃，5％CO2条件下培养；第1～2周，用1640培养基+15％胎牛血清+2％HAT的选择培养基；第3～4周，改HAT为2％HT过渡培养基；第5周后，停用HAT，并将胎牛血清添加量降为10％。第10天和第20天，各筛选板补分别充一次饲养细胞，为了提高细胞活力和分泌抗体的特异性，在细胞培养过程中不添加任抗菌素。
(7)阳性孔筛选
细胞融合后第5天做第一次半换液，即每孔吸去100μL培养基上清，加入100μL新鲜的HAT选择培养基；融合后第5～30天，每3～4天取细胞上清做ELISA检测，先测效价，再选阳性孔检测CLMG标准溶液对ELISA反应的抑制率。
(8)单克隆细胞株的建立
细胞融合后第12天，选择抗体效价高，且抑制率较好(100ng/mL CLMG抑制率为77％)的阳性孔5B1进行单克隆，再经过2次亚克隆获得本次融合的细胞株MG 5B1E7H2A7(简称MG A7)。
MG A7细胞株扩增后，将其F0代冻存35管，其中10管于2016年4月27日送中国典型培养物保藏中心，该培养物的存活性由保藏中心于2016年5月8日检测完毕，结果为存活，保藏编号为CCTCC No:C201666。
(9)杂交瘤细胞染色体标本的制作
取一瓶处于对数生长期的MG A7细胞，加入100μg/mL的秋水仙素，至终浓度为0.1μg/mL，在37℃，5％CO2条件下培养约30min后，刮下细胞，离心去上清，收集细胞；加入8mL0.075mol/L的氯化钾，低渗处理25min；加入1mL固定液(甲醇和冰醋酸按3:1比例配制)进行预固定，用吸管轻轻吹打混匀细胞，200g离心6min，去上清；再加入8ml固定液，用吸管轻轻吹打混匀细胞，室温下静置30min后，200g离心6min，弃上清液，依法重复固定2次；弃上清液，视细胞数量余留适量固定液，轻轻吹散细胞制备成细胞悬液，于垂直120cm高度滴于冰水浸泡的洁净载玻片上，在酒精灯上过火，室温下阴干。将阴干的玻片标本加入Giemsa染液，并进一步做G显带处理。选50个分裂象做众数分析，染色体数目为99-113条，平均染色体数为108条(图3)。
(10)杂交瘤细胞抗体基因型检测
刮取处于对数生长期的MG A7细胞→离心，去上清→沉淀中加入Trizol裂解细胞→提取RNA→5’RACE反转录cDNA→PCR获得抗体重链/轻链可变区基因→重链及轻链可变区基因克隆测序→分析测序结果(表1)。
表1抗体基因型分析及等位基因一致性的比较
Figure GDA0001251009410000061
实施例2
MG A7细胞株用于生产单克隆抗体。
(1)孔雀石绿单克隆抗体的体外制备过程
将MG A7细胞株用1640培养基(含10％胎牛血清)在37℃，5％CO2条件下培养→当细胞进入对数生长期，收集细胞上清液→加入等体积的饱和硫酸铵，4℃静置16h→10000g离心30min→弃上清，沉淀用0.02mol·L-1PBS溶解→再2：1体积比加入饱和硫酸铵，10000g离心30min，弃沉淀→上清液加饱和硫酸铵至占总体积的42％，4℃静置16h→10000g离心30min，弃上清→沉淀经透析后获得初步纯化抗体。
(2)抗体亚型的测定
通过IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgG3、IgM、IgE、IgA、κchain、λchain分型二抗-HRP检测，本发明细胞株所产抗体亚型为IgMκchain(κ链)。
(3)抗体灵敏度和交叉反应的测定
取MG A7细胞培养基上清液，做梯度稀释后分别用0、0.1、0.2、0.5、1、2、5ng/mL隐性孔雀石绿标准溶液做竞争ELISA，测得细胞培养基上清液中单克隆抗体(单抗)对隐性孔雀石绿的50％抑制浓度(IC50)为0.426ng/mL(见图4)，且该单抗对孔雀石绿、结晶紫和隐形结晶紫均有较高的亲和力；与青霉素、氯霉素、链霉素、四环素和磺胺嘧啶等其它类别的抗菌素交叉反应率＜0.2％。
实施例3
ELISA方法检测水产品中孔雀石绿及其代谢物
(1)包被：以pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释CLMG-OVA至200ng/mL，100μL/孔加入酶标板微孔条中，4℃过夜，洗板后每孔加200μL 10％脱脂奶粉，37℃封闭2小时，洗板后阴干备用。
(2)样品预处理：准备经液相质谱-串联质谱法(LC-MS/MS)检测的阳性淡水鱼和阴性甲鱼样品各一个→每份称取5g样品于50mL离心管内，阳性样品称3份，阴性样品称15份→取12管阴性样品，分别以孔雀石绿和隐性孔雀石绿标准溶液添加0.4、1.0μg/kg水平，每个浓度做3个平行→参照GB/T 19857-2005方法进行提取与净化→残液用0.5mL乙腈溶解，加PBS定溶至5mL。
(3)抗体准备：取经初步纯化的抗体，用PBS稀释500倍。
(4)测定：将样品液和0、0.1、0.2、0.5、1、2、5ng/mL的系列孔雀石绿(MG)标准溶液对应微孔按序编号，每份样品和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样品孔所在的位置；加系列标准溶液和样品液50μL到对应微孔中；每孔加50μL抗体溶液，用盖板膜盖板后，37℃孵育1小时；加250μL洗涤缓冲液洗板3次；加入100μL酶标二抗，37℃孵育1小时；加250μL洗涤缓冲液洗板6次，用吸水纸拍干；加入100μL显色液，室温避光显色20min；加入100μL终止液；用酶标仪于450nm处，测定每孔吸光度值。
(5)计算方法：用标准溶液或样品液的吸光度值(B)比0标准溶液的吸光度值(B0)计算相对吸光度值；用相对吸光度值(％)对应MG标准溶液自然对数做半对数坐标系统曲线图；对应样品液中MG浓度从校正曲线算出；
相对吸光度值＝B/B0×100％；
水产品中MG的残留量(μg/kg)＝(A×n×375)/(m×1000)
式中A为样品液的相对吸光度值对应的MG浓度，n为样品稀释倍数，375为MG的分子量，m为样本质量。
(6)检测结果：阳性淡水鱼样品检出浓度为5.2～6.9μg/kg，与LC-MS/MS检测结果(7.3μg/kg)符合率为71～94％；添加0.4μg/kg，回收率为61％～87％，样本变异系数37％；添加1.0μg/kg，回收率为70％～95％。样本变异系数13％。

Claims (4)

1.一种分泌抗孔雀石绿单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，命名为杂交瘤细胞株MG A7，保藏编号为CCTCC NO:C201666。
2.一种单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生，所述单克隆抗体的亚型为IgM k链。
3.如权利要求2所述的单克隆抗体在检测动物源食用农产品中孔雀石绿及其代谢物隐性孔雀石绿中的应用。
4.一种检测孔雀石绿及其代谢物的试剂盒，其特征在于，含有如权利要求2所述的单克隆抗体。
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