CN108169481B - 一种检测芍药苷的试纸条及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种检测芍药苷的试纸条及其制备方法和应用，该试纸条包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和基板；其中，所述反应膜上具有包被有芍药苷半抗原‑载体蛋白偶联物的检测区和包被有羊抗鼠抗抗体的质控区，所述结合物释放垫上喷涂有芍药苷单克隆抗体‑胶体金复合物，本发明还提供一种应用上述试纸条检测样品中芍药苷的方法，本发明提供的试纸条和检测方法具有特异性强、灵敏度高、操作简便、可快速读取结果、成本低等特点，适合大量样品的筛查及中药现场质量监控。

Description

一种检测芍药苷的试纸条及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种检测试纸条，具体是一种用于检测芍药苷的免疫胶体金试纸条，其特别适用于中药材、饮片、中成药、保健品、食品、化妆品等中芍药苷含量的检测。
背景技术
芍药苷(Paeoniflorin，PF)是一种单萜类糖苷化合物。研究表明，芍药苷具有抗自由基损伤、抑制细胞内钙超载和抗神经毒性等活性，同时具有降低血液黏度、抗血小板聚集、扩张血管、改善微循环、抗氧化、抗惊厥等多种生物学效应，并且毒副作用较小。中药白芍、中医良方四物汤、中药胶囊剂等含芍药制剂的质量控制、药代动力学、配伍机理等过程研究皆以该成分为研究对象，药典中规定芍药苷为评价白芍、赤芍质量的首选指标。
目前，对于中药材芍药苷的含量测定主要采用高效液相色谱法、薄层扫描法、毛细管电泳法等，尤以高效液相色谱法最为常用。但是上述方法样品前处理过程复杂、仪器昂贵、检测成本高，不利于方法的普及和大量样本的检测。以简单快速为特点的免疫检测技术是近年来中药有效成分分析技术的新热点。
对小分子中药活性成分采用单抗建立的免疫检测方法已经有报道，如现有技术中如(《芍药苷的单克隆抗体制备及其中药材的免疫法测定》邵幼岩，2008年)公开了芍药苷的单克隆抗体，从而建立以此为基础的酶联免疫测定方法，首先采用高碘酸钠法将芍药苷分别与人血清白蛋白或鸡卵清白蛋白结合形成偶联物芍药苷-人血清白蛋白，芍药苷-鸡卵清白蛋白。该现在技术中公开的单克隆抗体是由芍药苷直接与载体蛋白偶联后免疫动物得到的，其检测的灵敏度和便利性取决于单抗的特异性和检测方法的操作性。但芍药苷的特征结构容易受载体蛋白的局部微化学环境或空间位阻的干扰，影响机体免疫系统的识别，难以产生特异性抗体或产生的抗体效价较低。
发明内容
现有技术的灵敏度尚存在问题，而且检测方法的便利性需要解决。
采用试纸检测的便利性显而易见，但需要灵敏度高的单抗，而现有单抗的特异性无法满足试纸检测的要求。
为此，本发明对单抗的种类进行了筛选，找到一种经过改进的灵敏度和特异性极高的单抗，满足了制备试纸的条件。
本发明对芍药苷小分子结构进行改造，然后再与载体蛋白偶联后免疫动物产生单克隆抗体，这样可以保证芍药苷的原有分子特征结构充分暴露在人工抗原的表面，使其能最大限度地被动物的免疫活性细胞所识别，从而刺激机体产生特异性免疫应答，产生对芍药苷具有高亲和力和高特异性的抗体。
本发明还提供了一种检测芍药苷的免疫胶体金试纸条。
本发明另一个发明目的是提供该试纸条的制备方法。
本发明的另一个发明目的是提供该试纸条的应用。
本发明是通过下述技术方案实现的：
一种芍药苷半抗原，其分子结构式：
Figure GDA0004162650440000021
所述芍药苷半抗原是由氧化芍药苷与(4-氨基-苯基)-乙醛反应得到。具体如下：取(4-氨基-苯基)-乙醛，加稀盐酸溶解，低温下搅拌，加亚硝酸钠，继续搅拌，滴加含有氧化芍药苷的乙醇溶液，低温搅拌；停止反应，旋蒸，除去乙醇，加水，氢氧化钠溶液调节pH值到7，加乙酸乙酯萃取，旋蒸蒸干，二氯甲烷/石油醚混合液重结晶，得到乙醛氧化芍药苷半抗原产物。
本发明的一种检测芍药苷的试纸条，该试纸条包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和基板；其中，所述反应膜上具有包被有芍药苷半抗原-载体蛋白偶联物的检测区和包被有羊抗鼠抗抗体的质控区，所述结合物释放垫上喷涂有芍药苷单克隆抗体-胶体金复合物。
所述芍药苷半抗原如上述分子结构式为：
Figure GDA0004162650440000031
所述芍药苷半抗原-载体蛋白偶联物由芍药苷半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白或甲胎蛋白。
所述羊抗鼠抗抗体是以鼠源抗体为免疫原对山羊进行免疫制备获得。
所述芍药苷单克隆抗体是以芍药苷半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原对小鼠进行免疫所得杂交瘤细胞株分离得到，该杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC14281。(该细胞株已经保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为CGMCC14281，保藏日期2017年06月06日，分类命名：芍药苷半抗原-载体蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号)。
本发明所述反应膜、吸水垫、结合物释放垫、样品吸收垫依次粘贴在基板上，其中吸水垫覆盖反应膜顶端1-2mm处，结合物释放垫覆盖反应膜底端1-2mm处，样品吸收垫覆盖结合物释放垫底部1/3-1/2部分，检测区和质控区间隔0.5-1cm。
本发明所述检测区的检测限浓度100μg/L)
所述基板为PVC基板或其他硬质不吸水的材料；所述结合物释放垫及样品吸收垫为玻璃纤维素膜或聚酯材料；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。
本发明还提供了一种制备上述试纸条的方法，包括以下步骤：
1)制备喷涂有芍药苷单克隆抗体-胶体金复合物的结合物释放垫；
2)制备具有包被有芍药苷半抗原-载体蛋白偶联物的检测区和包被有羊抗鼠抗抗体的质控区的反应膜；
3)将1)和2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和基板组装成试纸条。
具体地说，步骤包括：
1)将氧化芍药苷与(4-氨基-苯基)-乙醛反应，制备芍药苷半抗原；
2)将芍药苷半抗原与载体蛋白偶联，制备芍药苷半抗原-载体蛋白偶联物；
3)用芍药苷半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌芍药苷单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
4)提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；
5)分别将芍药苷半抗原-载体蛋白偶联物和羊抗鼠抗抗体包被于反应膜的检测区(T线)和质控区(C线)，检测区和质控区间隔0.5-1cm；
6)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；将制备的芍药苷单克隆抗体加入到制备的胶体金中，得到芍药苷单克隆抗体-胶体金复合物；
7)将芍药苷单克隆抗体-胶体金复合物喷涂在结合物释放垫上，37℃烘1h后取出，置于干燥环境中保存备用；
8)将样品吸收垫用含牛血清白蛋白、磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃下烘干2h；
9)在基板上按顺序粘贴上反应膜、吸水垫、结合物释放垫、样品吸收垫，吸水垫覆盖反应膜顶端1-2mm处，结合物释放垫覆盖反应膜底端1-2mm处，样品吸收垫覆盖结合物释放垫底部1/3-1/2部分，最后切成4mm宽的小条。
更具体地，包括如下步骤：
1、芍药苷半抗原的合成
取(4-氨基-苯基)-乙醛，加稀盐酸溶解，低温下搅拌，加亚硝酸钠，继续搅拌，滴加含有氧化芍药苷的乙醇溶液，低温搅拌；停止反应，旋蒸，除去乙醇，加水，氢氧化钠溶液调节pH值，加乙酸乙酯萃取，旋蒸蒸干，二氯甲烷/石油醚重结晶，得到乙醛氧化芍药苷半抗原产物；
2、免疫原制备——芍药苷半抗原与牛血清白蛋白(BSA)偶联得到免疫原
取乙醛氧化芍药苷半抗原，加乙醇溶解，得到A液；取BSA，加的碳酸盐缓冲液溶解，得到B液；将A液逐滴加到B液中，室温，避光搅拌过夜；停止反应，透析纯化，得到免疫原；
包被原制备——芍药苷半抗原与卵清蛋白(OVA)偶联得到包被原
取乙醛氧化芍药苷半抗原，加乙醇溶解，得到A液；取OVA，加碳酸盐缓冲液溶解，得到B液；将A液逐滴加到B液中，室温，避光搅拌过夜；停止反应，透析纯化，得到包被原；
3、芍药苷单克隆抗体的制备
(1)杂交瘤细胞的获得
1)首次免疫：将芍药苷半抗原-BSA偶联物(免疫原)与等量的弗氏完全佐剂充分乳化，皮下注射6周龄的Balb/c小鼠，；
2)加强免疫两次：从首次免疫开始，每两周加强免疫一次，用弗式不完全佐剂代替弗氏完全佐剂，方法和剂量同首次免疫；
3)最后一次加强免疫一周后眼底静脉采血测效价和抑制，处死小鼠，取其脾脏与骨髓瘤细胞融合；
4)采用间接竞争酶联免疫分析方法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，得到并建立稳定分泌芍药苷单克隆抗体的杂交瘤细胞株，取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存；
(2)单克隆抗体的制备
1)细胞复苏：取出芍药苷单克隆抗体杂交瘤细胞株冻存管，立即放入水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养；
2)制备腹水与抗体纯化：采用体内诱生法，将Balb/c小鼠(8周龄)腹腔注入灭菌石蜡油，采集腹水，用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，得到芍药苷单克隆抗体溶液；
4、羊抗鼠抗抗体的制备
以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。
5、反应膜的制备
将芍药苷半抗原-卵清蛋白偶联物包被到反应膜上构成检测区，将羊抗鼠抗抗体包被在反应膜上构成质控区，检测区和质控区间隔0.5-1cm。
包被过程：用磷酸缓冲液将芍药苷半抗原-卵清蛋白偶联物稀释，将其包被于硝酸纤维素膜上的检测区(T线)，包被量为1.0μL/cm；用磷酸盐缓冲液将羊抗鼠抗抗体稀释，将其包被于硝酸纤维素膜上的质控区(C线)，包被量为1.0μL/cm。将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥2h，备用。
6、芍药苷单克隆抗体-胶体金复合物的制备
(1)胶体金的制备
取氯金酸溶液置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入柠檬酸三钠溶液，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的酒红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，4℃保存。制备好的胶体金用肉眼观察是清亮透明的，没有混浊，液体表面无漂浮物，在日光下观察胶体金的颜色为酒红色；
(2)芍药苷单克隆抗体-胶体金复合物的制备
在磁力搅拌下，用碳酸钾溶液调胶体金的pH至7～8之间，按每毫升胶体金溶液中加入20～50μg抗体的标准向胶体金溶液中加入上述芍药苷单克隆抗体，搅拌混匀，室温静置，加入BSA使其在胶体金溶液中的终质量分数为1％，静置离心，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4℃备用；
复溶缓冲液：含BSA的质量分数为0.1％～0.3％、吐温-80的质量分数为0.05％～0.2％、pH7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液。
7、结合物释放垫的制备
将结合物释放垫浸泡于BSA、磷酸盐缓冲液中，均匀浸湿烘干备用，用将制备好的芍药苷单克隆抗体-胶体金复合物均匀喷涂在结合物释放垫上，每1cm结合物释放垫喷涂0.01mL芍药苷单克隆抗体-胶体金复合物；
8、样品吸收垫的制备
将样品吸收垫用含BSA磷酸盐缓冲液浸泡烘干备用；
9、试纸条的组装
将反应膜、吸水垫、结合物释放垫、样品吸收垫依次按顺序粘贴在PVC基板上；吸水垫的顶端与PVC基板的顶端对齐，吸水垫末端覆盖反应膜顶端1-2mm处，结合物释放垫起始端覆盖反应膜的底端1-2mm处，底端有1/3-1/2区域被样品吸收垫覆盖，样品吸收垫的底端与PVC基板的底端对齐；所述反应膜上有检测区和质控区，检测区(T线)和质控区(C线)均呈与所述试纸条的长相垂直的条状带，检测区位于靠近结合物释放垫的一侧，质控区位于靠近吸水垫的一侧；将试纸条用机器切成4mm宽的小条，装在特制的塑料制卡中，4～30℃条件下可保存12个月。
本发明还提供了一种应用上述试纸条检测样品中芍药苷的方法，包括如下步骤：
(1)对样品进行前处理；
(2)用试纸条进行检测；
(3)分析检测结果。
上述步骤(1)中样品处理方法包括：
取样品，加入含水乙醇或甲醇浸泡，滤过，将滤液用PBS样品稀释液即可。
所述含水乙醇为50-95％乙醇，优选70％乙醇。
所述PBS浓度为0.005-0.03mol/L,优选0.013mol/L。
所述样品包括芍药、赤芍药材、饮片、含芍药制剂等。
上述步骤(2)具体检测方法包括：取出试纸条，置于水平桌面，用加样器吸取80μL待测样本滴加至加样孔，5-10min观察结果，超时结果判定无效。
上述步骤(3)中分析检测结果包括：
样本中的芍药苷与反应膜检测区的芍药苷半抗原-载体蛋白偶联物竞争结合芍药苷单克隆抗体-胶体金复合物，根据检测区红色条带有无来判断待测样品液中芍药苷含量多少；
检测时，样品经处理后滴入样品吸收垫，当芍药苷在样品中的浓度低于检测限时，单克隆抗体-胶体金复合物在层析过程中会与固定在反应膜上的芍药苷半抗原-载体蛋白偶联物结合，在检测区(T线)和质控区(C线)各出现一条红色条带；如果芍药苷在样品中的浓度等于或高于检测限，单克隆抗体-胶体金复合物会与芍药苷全部结合，从而在检测区(T线)因为竞争反应不会与芍药苷半抗原-载体蛋白偶联物结合而不出现红色条带。
阴性：C线、T线显色均匀，且呈淡红色或红色，表示样本中芍药苷浓度低于检测限。
阳性：C线显色均匀，T线位置无明显条带，表示样本中芍药苷浓度等于或高于检测限。
无效：当C线不显示出红色条带，则无论T线显示出红色条带与否，该试纸条均判为无效。
有益效果
1、本发明的检测芍药苷的试纸条采用高度特异性的抗原抗体反应及免疫层析分析技术，将芍药苷单克隆抗体-胶体金复合物固定于结合物释放垫上，样品中的芍药苷在流动过程中，与结合物释放垫上的芍药苷单克隆抗体-胶体金复合物结合，形成芍药苷-抗体-胶体金复合物，样本中的芍药苷与反应膜检测区的芍药苷半抗原-载体蛋白偶联物竞争结合芍药苷单克隆抗体-胶体金复合物，根据检测区红色条带有无来判断待测样品液中芍药苷含量多少。
2、本发明试纸条有益的技术效果在于为中药材芍药及其制剂提供了灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、结果可靠的新型技术方法，为传统检测技术方法提供了有效补充。具体是一种用胶体金免疫层析技术检测中药白芍、赤芍及其制剂中芍药苷的含量，该方法特异性好、灵敏度高、操作简便、检测成本低、适合于批量样品的筛选检测，是理想的快速筛选手段。
3、基于芍药苷单克隆抗体免疫反应原理建立的胶体金法与酶联免疫法相比，具有灵敏度高、特异性强，不需复杂的样品前处理、快速，5分钟即可读出结果，成本低廉、无需任何仪器设备，适合于野外及现场检测，可定性、定量等优点；该技术对于中药活性成分的分析将是一个重要的补充技术和有力手段，适用于中药材及其制剂中关键成分大量样本检测及现场监控。
4、本发明是先对芍药苷小分子结构进行改造，然后再与载体蛋白偶联后免疫动物产生单克隆抗体，这样可以保证芍药苷的原有分子特征结构充分暴露在人工抗原的表面，使其能最大限度地被动物的免疫活性细胞所识别，从而刺激机体产生特异性免疫应答，产生对芍药苷具有高亲和力和高特异性的抗体，从而可以满足试纸检测的要求。
附图说明
图1为试纸条剖面结构示意图，图中：1、样品吸收垫；2、结合物释放垫；3、反应膜；4、吸水垫；5、检测区；6、质控区；7、基板；
图2为试纸条检测结果判定图；
图3为芍药苷半抗原合成图；
图4为芍药苷半抗原核磁共振氢谱图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内可能会对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰同样应落入发明的保护范围。
实施例1检测芍药苷的试纸条的制备
该试纸条的制备方法主要包括以下步骤：
1)制备喷涂有芍药苷单克隆抗体-胶体金复合物的结合物释放垫；
2)制备具有包被有芍药苷半抗原-载体蛋白偶联物的检测区和包被有羊抗鼠抗抗体的质控区的反应膜；
3)将1)和2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和PVC基板组装成试纸条。
下面分步详细叙述：
1、芍药苷半抗原的合成(合成路线见附图3)及鉴定
取(4-氨基-苯基)-乙醛0.5g，加11mL 1mol/L稀盐酸溶解，低温下搅拌，加亚硝酸钠0.3g，继续搅拌1h，滴加含有1.67g氧化芍药苷的乙醇溶液20mL，低温搅拌2h；停止反应，旋蒸，除去乙醇，加水，氢氧化钠溶液调节pH值到7，加乙酸乙酯萃取，旋蒸蒸干，二氯甲烷/石油醚(V/V，2/1)重结晶，得到乙醛氧化芍药苷半抗原产物2g，收率92.59％。
取上述半抗原经核磁共振氢谱鉴定，结果见附图4。1H NMR(CDCl3,300MHz)δ：9.72(1H,s,-CHO)，7.33(1H,s,ArH)，7.14(3H,s,ArH)，6.98(1H,s,ArH)，6.71(2H,s,ArH)，5.35(1H,s,-OH)，5.08(2H,s,CH)，3.66(2H,m,CH2)，4.29(4H,m,CH)，4.00(2H,s,NH)，1.62(4H,s,CH)，1.29(6H,s,CH3)。图谱中，化学位移δ＝9.72的为间隔臂上醛基氢吸收峰，7.14、6.71的是间隔臂苯环上氢吸收峰，3.66是间隔臂亚甲基氢吸收峰，这些吸收峰的存在证明间隔臂偶联成功，芍药苷半抗原结构正确。
2、芍药苷偶联抗原的合成及鉴定
免疫原制备——芍药苷半抗原与牛血清白蛋白(BSA)偶联得到免疫原。
取乙醛氧化芍药苷半抗原24mg，加乙醇溶解，得到A液；取50mg BSA，加pH 9.5的碳酸盐缓冲液溶解，得到B液；将A液逐滴加到B液中，室温，避光搅拌过夜；停止反应，0.02mol/L PBS透析纯化3d，每天换液3次，分装，-20℃保存，得到免疫原。
包被原制备——芍药苷半抗原与卵清蛋白(OVA)偶联得到包被原。
取乙醛氧化芍药苷半抗原13mg，加乙醇溶解，得到A液；取50mg OVA，加pH 9.5的碳酸盐缓冲液溶解，得到B液；将A液逐滴加到B液中，室温，避光搅拌过夜；停止反应，0.02mol/L PBS透析纯化3d，每天换液3次，分装，-20℃保存，得到包被原
按合成芍药苷偶联抗原反应所用半抗原、载体蛋白与偶联产物的比例，进行紫外(200～400nm)扫描测定，通过比较三者分别在260nm和280nm的吸光度值计算其结合比。偶联物芍药苷半抗原-载体蛋白的最大吸收峰与芍药苷半抗原、载体蛋白的最大吸收峰相比发生了明显的变化，表明芍药苷半抗原-载体蛋白偶联物的合成是成功的。
3、芍药苷单克隆抗体的制备
(1)杂交瘤细胞的获得
1)首次免疫：将芍药苷半抗原-BSA偶联物(免疫原)与等量的弗氏完全佐剂充分乳化，皮下注射6周龄的Balb/c小鼠，每只0.2mL；
2)加强免疫两次：从首次免疫开始，每两周加强免疫一次，用弗式不完全佐剂代替弗氏完全佐剂，方法和剂量同首次免疫；
3)最后一次加强免疫一周后眼底静脉采血测效价和抑制，有抑制且效价达到1:10000以上时进行如下末次免疫：腹腔注射不加任何佐剂的免疫原溶液0.1mL，三天后处死小鼠，取其脾脏与骨髓瘤细胞融合；
4)采用间接竞争酶联免疫分析方法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，得到并建立稳定分泌芍药苷单克隆抗体的杂交瘤细胞株，取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。
(2)单克隆抗体的制备
1)细胞复苏：取出芍药苷单克隆抗体杂交瘤细胞株冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养；
2)制备腹水与抗体纯化：采用体内诱生法，将Balb/c小鼠(8周龄)腹腔注入灭菌石蜡油0.5mL/只，7天后腹腔注射杂交瘤细胞5×105个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，得到芍药苷单克隆抗体溶液(-20℃保存)。
4、羊抗鼠抗抗体的制备
以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。
5、芍药苷单克隆抗体-胶体金复合物的制备
(1)胶体金的制备
用双蒸去离子水将质量分数为1％的氯金酸溶液稀释成0.01％，取100mL置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入1.5mL质量分数为1％的柠檬酸三钠溶液，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的酒红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，4℃保存。制备好的胶体金用肉眼观察是清亮透明的，没有混浊，液体表面无漂浮物，在日光下观察胶体金的颜色为酒红色。
(2)芍药苷单克隆抗体-胶体金复合物的制备
在磁力搅拌下，用0.2mol/L碳酸钾溶液调胶体金的pH至7.2(不同抗体的pH标记范围在7～8之间，可以变化)，按每毫升胶体金溶液中加入20～50μg抗体的标准向胶体金溶液中加入上述芍药苷单克隆抗体，搅拌混匀，室温静置10min，加入10％ BSA使其在胶体金溶液中的终质量分数为1％，静置10min。12000r/min，4℃离心40min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4℃备用。
复溶缓冲液：含BSA的质量分数为0.1％～0.3％、吐温-80的质量分数为0.05％～0.2％、pH7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液。
6、结合物释放垫的制备
将结合物释放垫浸泡于含0.5％ BSA(质量分数)、pH 7.2的0.5mol/L磷酸盐缓冲液中，均匀浸湿1h，37℃烘3h备用。用Isoflow喷膜仪将制备好的芍药苷单克隆抗体-胶体金复合物均匀喷涂在结合物释放垫上，每1cm结合物释放垫喷涂0.01mL芍药苷单克隆抗体-胶体金复合物，置于37℃环境中(湿度＜20％)60min后取出，置于干燥环境(湿度＜20％)中保存备用。
7、反应膜的制备
将芍药苷半抗原-卵清蛋白偶联物包被到反应膜上构成检测区，将羊抗鼠抗抗体包被在反应膜上构成质控区，检测区和质控区间隔0.5-1cm。
包被过程：用磷酸缓冲液将芍药苷半抗原-卵清蛋白偶联物稀释到1mg/mL，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测区(T线)，包被量为1.0μL/cm；用0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液将羊抗鼠抗抗体稀释到200μg/mL，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控区(C线)，包被量为1.0μL/cm。将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥2h，备用。
8、样品吸收垫的制备
将样品吸收垫用含0.5％ BSA(质量分数)、pH 7.2的0.1mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃下烘干2h备用。
9、试纸条的组装
将反应膜、吸水垫、结合物释放垫、样品吸收垫依次按顺序粘贴在PVC基板上；吸水垫的顶端与PVC基板的顶端对齐，吸水垫末端覆盖反应膜顶端1-2mm处，结合物释放垫起始端覆盖反应膜的底端1-2mm处，底端有1/3-1/2区域被样品吸收垫覆盖，样品吸收垫的底端与PVC基板的底端对齐；所述反应膜上有检测区和质控区，检测区(T线)和质控区(C线)均呈与所述试纸条的长相垂直的条状带，检测区位于靠近结合物释放垫的一侧，质控区位于靠近吸水垫的一侧；将试纸条用机器切成4mm宽的小条，装在特制的塑料制卡中，4～30℃条件下可保存12个月。
实施例2检测芍药苷的试纸条的应用
1、样品的前处理
取中药材白芍或其饮片粉末0.1g，加入70％乙醇50mL，浸泡30min，滤过，将10μL滤液加入2mL 0.01mol/L PBS样品稀释液中，混匀，即得样品待测液。
取中药材赤芍或其饮片粉末0.1g，加入甲醇50mL，浸泡30min，滤过，将10μL滤液加入2mL 0.01mol/L PBS样品稀释液中，混匀，即得样品待测液。
2、用试纸条进行检测
取出试纸条，置于水平桌面，用加样器吸取80μL待测样本滴加至加样孔，5-10min观察结果，超时结果判定无效。
3、分析检测结果
阴性(-)：C线、T线显色均匀，呈淡红色或红色，均表示样本中芍药苷浓度低于检测限，如图2a、2b、2c。
阳性(+)：C线显色均匀，T线位置无明显条带，表示样本中芍药苷浓度等于或高于检测限，如图2d。
无效：未出现C线，表明不正确的操作过程或试纸条已失效，如图2e、2f。在此情况下，应再次仔细阅读说明书，并用新的试纸条重新测试。
实施例3检测芍药苷的试纸条性能的检测
1、检测限试验
将芍药苷对照品用0.2mol/L PB缓冲液进行倍比稀释，分别稀释至12.5μg/L、25μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、400μg/L、800μg/L，进行点样，每个样本重复测定两次。
用试纸条检测芍药苷对照品系列浓度时，当其中芍药苷浓度为100μg/L时，试纸条呈阳性；当其中芍药苷浓度为50μg/L时，试纸条呈阴性，表明本试纸条对芍药苷对照品的检测限为100μg/L。
2、假阳性率、假阴性率试验
取已知中药白芍饮片中芍药苷含量大于100μg/L的阳性样本50份和含量小于100μg/L的阴性样本20份；取已知中药赤芍饮片中芍药苷含量大于100μg/L的阳性样本50份和含量小于100μg/L的阴性样本20份；用三批试纸条进行检测，计算其阴性率与阳性率，结果见表1。
表1中药材芍药饮片样本符合率检测结果
Figure GDA0004162650440000131
结果表明：用3个批次生产的试纸条检测阳性样本时，结果全为阳性，可知阳性样本符合率为100％，假阴性率为0％；检测阴性样本时，结果全为阴性，可知阴性样本符合率为100％，假阳性率为0％。说明本发明的检测芍药苷的试纸条可以对中药白芍、赤芍饮片中芍药苷含量进行快速检测。
3、特异性试验
用芍药苷试纸条检测5mg/L芍药苷和7种结构及配伍易交叉物甘草酸、紫杉醇、胆酸、橙皮苷、甘草次酸、甘草素、黄芩苷，结果显示，7种结构及配伍易交叉物的C线和T线均显色，结果呈阴性，芍药苷样品的检测区无T线，呈阳性。说明本试纸条对5mg/L的7种结构及配伍交叉物甘草酸、紫杉醇、胆酸、橙皮苷、甘草次酸、甘草素、黄芩苷无交叉反应，特异性较好。
4、重复性实验
制备3个不同批次的芍药苷检测试纸条，然后每个批次选取10条试纸条，用于检测阴性标准品及阳性标准品各5条，结果表明，3个批次阴性标准品检测结果均为阴性，没有明显差异；3个批次阳性标准品检测结果均为阳性，没有明显差异。说明3个批次试纸条的重复性良好。
5、稳定性实验
将铝箔袋包装好的芍药苷检测试纸条分别在-20℃、4℃、室温、37℃、45℃温度环境条件下保存7天，每隔一天取出后，用含有0μg/L、100μg/L的芍药苷标准品溶液进行测试，结果表明：在不同温度下保存3天、5天、7天后试纸条检测结果与第1天(在各温度条件下保存前)的检测结果无明显差异，阴性对照溶液点样T线显色，100μg/L芍药苷标准品溶液点样T线消线，且C线均显色。
6、芍药样本的检测结果
随机抽取29批中药材白芍或其饮片粉末和12批中药材赤芍或其饮片粉末，分别用试纸条和HPLC进行检测，比较检测结果，结果见表2、表3。
表2白芍随机样本HPLC与试纸条检测结果符合率
Figure GDA0004162650440000141
Figure GDA0004162650440000151
表3赤芍随机样本HPLC与试纸条检测结果符合率
Figure GDA0004162650440000152
根据上表可知，本发明试纸条随机样品检测结果与HPLC结果完全一致，确定该试纸条准确性良好，样本灵敏度判定准确。

Claims (10)

1.一种检测芍药苷的试纸条，其特征在于，所述试纸条包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和基板；其中，所述反应膜上具有包被有芍药苷半抗原-载体蛋白偶联物的检测区和包被有羊抗鼠抗抗体的质控区，所述结合物释放垫上喷涂有芍药苷单克隆抗体-胶体金复合物，其中所述芍药苷单克隆抗体是以芍药苷半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原对小鼠进行免疫所得杂交瘤细胞株分离得到，该杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC14281。
2.根据权利要求1所述的检测芍药苷的试纸条，其特征在于，其中，所述芍药苷半抗原-载体蛋白偶联物由芍药苷半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为人血清白蛋白、卵清蛋白或甲胎蛋白，所述芍药苷半抗原，分子结构式为：
Figure FDA0004182662290000011
3.根据权利要求1所述的检测芍药苷的试纸条，其特征在于，其中，所述羊抗鼠抗抗体是以鼠源抗体为免疫原对山羊进行免疫制备获得。
4.根据权利要求1所述的检测芍药苷的试纸条，其特征在于，其中，所述反应膜、吸水垫、结合物释放垫、样品吸收垫依次粘贴在基板上，其中吸水垫覆盖反应膜顶端1-2mm处，结合物释放垫覆盖反应膜底端1-2mm处，样品吸收垫覆盖结合物释放垫底部1/3-1/2部分，检测区和质控区间隔0.5-1cm。
5.根据权利要求1所述的检测芍药苷的试纸条，其特征在于，其中，所述检测区的检测限浓度100μg/L。
6.根据权利要求1所述的检测芍药苷的试纸条，其特征在于，其中，所述基板为PVC基板或其他硬质不吸水的材料；所述结合物释放垫及样品吸收垫为玻璃纤维素膜或聚酯材料；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。
7.权利要求1所述的检测芍药苷的试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将氧化芍药苷与(4-氨基-苯基)-乙醛反应，制备芍药苷半抗原；
2)将芍药苷半抗原与载体蛋白偶联，制备芍药苷半抗原-载体蛋白偶联物；
3)用芍药苷半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌芍药苷单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
4)提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；
5)分别将芍药苷半抗原-载体蛋白偶联物和羊抗鼠抗抗体包被于反应膜的检测区T线和质控区C线，检测区和质控区间隔0.5-1cm；
6)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；将制备的芍药苷单克隆抗体加入到制备的胶体金中，得到芍药苷单克隆抗体-胶体金复合物；
7)将芍药苷单克隆抗体-胶体金复合物喷涂在结合物释放垫上，37℃烘1h后取出，置于干燥环境中保存备用；
8)将样品吸收垫用含牛血清白蛋白、磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃下烘干2h；
9)在基板上按顺序粘贴上反应膜、吸水垫、结合物释放垫、样品吸收垫，吸水垫覆盖反应膜顶端1-2mm处，结合物释放垫覆盖反应膜底端1-2mm处，样品吸收垫覆盖结合物释放垫底部1/3-1/2部分，最后切成4mm宽的小条。
8.权利要求7所述的检测芍药苷的试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、芍药苷半抗原的合成
取(4-氨基-苯基)-乙醛，加稀盐酸溶解，低温下搅拌，加亚硝酸钠，继续搅拌，滴加含有氧化芍药苷的乙醇溶液，低温搅拌；停止反应，旋蒸，除去乙醇，加水，氢氧化钠溶液调节pH值，加乙酸乙酯萃取，旋蒸蒸干，二氯甲烷/石油醚重结晶，得到乙醛氧化芍药苷半抗原产物；
B、免疫原制备——芍药苷半抗原与牛血清白蛋白(BSA)偶联得到免疫原
取乙醛氧化芍药苷半抗原，加乙醇溶解，得到A液；取BSA，加的碳酸盐缓冲液溶解，得到B液；将A液逐滴加到B液中，室温，避光搅拌过夜；停止反应，透析纯化，得到免疫原；
包被原制备——芍药苷半抗原与卵清蛋白(OVA)偶联得到包被原
取乙醛氧化芍药苷半抗原，加乙醇溶解，得到A液；取OVA，加碳酸盐缓冲液溶解，得到B液；将A液逐滴加到B液中，室温，避光搅拌过夜；停止反应，透析纯化，得到包被原；
C、芍药苷单克隆抗体的制备
(1)杂交瘤细胞的获得
1)首次免疫：将芍药苷半抗原-BSA偶联物与等量的弗氏完全佐剂充分乳化，皮下注射6周龄的Balb/c小鼠；
2)加强免疫两次：从首次免疫开始，每两周加强免疫一次，用弗式不完全佐剂代替弗氏完全佐剂，方法和剂量同首次免疫；
3)最后一次加强免疫一周后眼底静脉采血测效价和抑制，处死小鼠，取其脾脏与骨髓瘤细胞融合；
4)采用间接竞争酶联免疫分析方法测定细胞上清液，筛选阳性孔，利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，得到并建立稳定分泌芍药苷单克隆抗体的杂交瘤细胞株，取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存；
(2)单克隆抗体的制备
1)细胞复苏：取出芍药苷单克隆抗体杂交瘤细胞株冻存管，立即放入水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养；
2)制备腹水与抗体纯化：采用体内诱生法，将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油，采集腹水，用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，得到芍药苷单克隆抗体溶液；
D、羊抗鼠抗抗体的制备
以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体；
E、反应膜的制备
将芍药苷半抗原-卵清蛋白偶联物包被到反应膜上构成检测区，将羊抗鼠抗抗体包被在反应膜上构成质控区，检测区和质控区间隔0.5-1cm，
包被过程：用磷酸缓冲液将芍药苷半抗原-卵清蛋白偶联物稀释，将其包被于硝酸纤维素膜上的检测区T线，包被量为1.0μL/cm；用磷酸盐缓冲液将羊抗鼠抗抗体稀释，将其包被于硝酸纤维素膜上的质控区C线，包被量为1.0μL/cm，将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥2h，备用；
F、芍药苷单克隆抗体-胶体金复合物的制备
(1)胶体金的制备
取氯金酸溶液置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入柠檬酸三钠溶液，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的酒红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，4℃保存，制备好的胶体金用肉眼观察是清亮透明的，没有混浊，液体表面无漂浮物，在日光下观察胶体金的颜色为酒红色；
(2)芍药苷单克隆抗体-胶体金复合物的制备
在磁力搅拌下，用碳酸钾溶液调胶体金的pH至7～8之间，按每毫升胶体金溶液中加入20～50μg抗体的标准向胶体金溶液中加入上述芍药苷单克隆抗体，搅拌混匀，室温静置，加入BSA使其在胶体金溶液中的终质量分数为1％，静置离心，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4℃备用；
复溶缓冲液：含BSA的质量分数为0.1％～0.3％、吐温-80的质量分数为0.05％～0.2％、pH7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液；
G、结合物释放垫的制备
将结合物释放垫浸泡于BSA、磷酸盐缓冲液中，均匀浸湿烘干备用，用将制备好的芍药苷单克隆抗体-胶体金复合物均匀喷涂在结合物释放垫上，每1cm结合物释放垫喷涂0.01mL芍药苷单克隆抗体-胶体金复合物；
H、样品吸收垫的制备
将样品吸收垫用含BSA磷酸盐缓冲液浸泡烘干备用；
I、试纸条的组装
将反应膜、吸水垫、结合物释放垫、样品吸收垫依次按顺序粘贴在PVC基板上；吸水垫的顶端与PVC基板的顶端对齐，吸水垫末端覆盖反应膜顶端1-2mm处，结合物释放垫起始端覆盖反应膜的底端1-2mm处，底端有1/3-1/2区域被样品吸收垫覆盖，样品吸收垫的底端与PVC基板的底端对齐；所述反应膜上有检测区和质控区，检测区T线和质控区C线均呈与所述试纸条的长相垂直的条状带，检测区位于靠近结合物释放垫的一侧，质控区位于靠近吸水垫的一侧；将试纸条用机器切成4mm宽的小条，装在特制的塑料制卡中，4～30℃条件下可保存12个月。
9.权利要求1所述的检测芍药苷的试纸条的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)对样品进行前处理；
(2)用试纸条进行检测；
(3)分析检测结果，
上述步骤(1)中样品处理方法包括：
取样品，加入含水乙醇或甲醇浸泡，滤过，将滤液用PBS样品稀释液即可，
所述含水乙醇为50-95％乙醇，
所述PBS浓度为0.005-0.03mol/L，
上述步骤(2)具体检测方法包括：取出试纸条，置于水平桌面，用加样器吸取80μL待测样本滴加至加样孔，5-10min观察结果，超时结果判定无效，
上述步骤(3)中分析检测结果包括：
样本中的芍药苷与反应膜检测区的芍药苷半抗原-载体蛋白偶联物竞争结合芍药苷单克隆抗体-胶体金复合物，根据检测区红色条带有无来判断待测样品液中芍药苷含量多少。
10.权利要求9所述的检测芍药苷的试纸条的使用方法，其特征在于，检测时，样品经处理后滴入样品吸收垫，当芍药苷在样品中的浓度低于检测限时，单克隆抗体-胶体金复合物在层析过程中会与固定在反应膜上的芍药苷半抗原-载体蛋白偶联物结合，在检测区T线和质控区C线各出现一条红色条带；如果芍药苷在样品中的浓度等于或高于检测限，单克隆抗体-胶体金复合物会与芍药苷全部结合，从而在检测区T线因为竞争反应不会与芍药苷半抗原-载体蛋白偶联物结合而不出现红色条带。
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