CN1948964B - 一种溴氰菊酯人工抗原的合成方法及测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种溴氰菊酯人工抗原的合成方法，它包括(1R，3R)-3-(2，2-二溴乙烯基)-2，2-二甲基环丙基甲酰氯的合成、3-(4-硝基苯氧基)苯甲醛的合成、[3-(4-硝基苯氧基)苯基]氰基甲醇的合成、(1R，3R)-3-(2，2-二溴乙烯基)-2，2-二甲基环丙基甲酸[3-(4-硝基苯氧基)苯基]氰基甲酯的合成、人工半抗原(1R，3R)-3-(2，2-二溴乙烯基)-2，2-二甲基环丙基甲酸[3-(4-氨基苯氧基)苯基]氰基甲酯(称为DM)的合成和人工抗原的合成步骤，人工抗原的测定。
Description
技术领域
本发明涉及一种溴氰菊酯人工抗原的合成方法及测定方法。
背景技术
拟除虫菊酯是一类重要的杀虫剂，因其具有高效、低毒、击倒快、残留少等特点，被广泛用于茶园、果园、农田等害虫的防治。目前人们发现它们污染表面水源，影响环境，导致生态破坏。
入世以来，绿色壁垒森严，菊酯类农药残留问题已经成为阻碍我国农副产品特别是茶叶、水果出口贸易的主要障碍，要求开发应用快速残留检测技术来加强产地农副产品中农药残留的监控。为此建立一种敏感的、具有选择性的、快速的免疫分析方法检测菊酯类农药残留是非常必要的。
为了建立免疫分析方法，首先必须制备出效价高、特异性强的抗体。而大多数农药是小分子化合物(分子量<1000)，本身不具有诱导产生抗体的能力。为此，必须设法先将农药小分子与载体蛋白质偶联制备出农药人工完全抗原。如果农药分子不能直接通过双功能交联剂与蛋白质共价偶联，则需先通过衍生过程在农药分子上产生活性功能团，以此作半抗原，再使之与蛋白质偶联。为此，半抗原的设计和人工抗原的合成是小分子免疫分析技术的关键。
多数拟除虫菊酯类农药缺乏可直接与蛋白质相偶联的功能团，这就必须先合成半抗原。拟除虫菊酯类农药半抗原的合成最初采用在其芳香环或环丙烷部位接上一个连接臂，后来发展到以拟除虫菊酯代谢物的衍生物作为半抗原，最近几年有人将拟除虫菊酯的氰基水解成羧基或水解后再接上比较长的连接臂与蛋白质偶联。
溴氰菊酯(deltamethrin)是我国用量最大的拟除虫菊酯类农药，国内研究溴氰菊酯的免疫分析处于初步阶段，尚无建立其的快速检测手段。溴氰菊酯是一种小分子物质，本身只有免疫反应性而没有免疫原性，必须与蛋白等大分子物质偶联得到人工抗原后，才可以用于动物免疫。
本发明根据溴氰菊酯本身的化学结构合成结构类似的半抗原(以DM表示)与牛血清蛋白进行偶联，制得免疫抗原。
发明内容
本发明需要解决的技术问题就在于提供一种溴氰菊酯人工抗原的合成方法及测定方法。
为解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
本发明一种溴氰菊酯人工抗原的合成方法，所述合成方法包括下列步骤：
1)、(1R，3R)-3-(2，2-二溴乙烯基)-2，2-二甲基环丙基甲酰氯的合成：向反应器中加入含30g(1R，3R)-3-(2，2-二溴乙烯基)-2，2-二甲基环丙基甲酸(0.1mol)的三氯甲烷溶液30ml和0.4mol的氯化亚砜28ml，油浴条件下控温60-65℃反应2h，除去溶剂和氯化亚砜，得到黄色油状产品(1R，3R)-3-(2，2-二溴乙烯基)-2，2-二甲基环丙基甲酰氯；
2)、3-(4-硝基苯氧基)苯甲醛的合成：在50ml的反应瓶中加入2.68g3-羟基苯甲醛(0.022mol)、3.78g对硝基氯苯(0.024mol)和10ml二甲基甲酰胺(DMF)，搅拌溶解，加入3.30g(0.024mol)无水碳酸钾，油浴控温120℃，反应2小时至化合物三羟基苯甲醛反应完全(薄层色谱跟踪)；趁热滤出固体并用少量DMF洗涤，滤液浓缩后得黑色固体；所得粗产品用硅胶柱(CH2Cl2)脱色得黄色粉末，甲醇重结晶；
3)、[3-(4-硝基苯氧基)苯基]氰基甲醇的合成：在50ml的反应瓶中，加入4.90g(0.020mol)3-(4-硝基苯氧基)-苯甲醛、氯仿(12ml)溶液和0.64g(0.002mol)碘化锌，氮气保护；混合物冰浴冷却后，加入2.2g(0.022mol)的三甲基氰基硅烷，反应半个小时，撤去冰浴，室温搅拌2小时至化合物3-(4-硝基苯氧基)苯甲醛反应完全(薄层色谱跟踪)后，将反应液转入250ml锥形瓶中；向反应混合物中加入甘醇二甲醚(60ml)的盐酸溶液(15ml，3mol/l)，剧烈搅拌5min，加60ml水稀释，氯丁烷萃取两次；有机相有无水硫酸镁干燥，蒸馏得到黑色油状物氰基醇；产品溶解(CH2Cl2)后，硅胶柱(30g)淋洗(正己烷/二氯甲烷，4：1)，脱色纯化得浅黄色油状物[3-(4-硝基苯氧基)苯基]氰基甲醇；
4)、(1R，3R)-3-(2，2-二溴乙烯基)-2，2-二甲基环丙基甲酸[3-(4-硝基苯氧基)苯基]氰基甲酯的合成：步骤3得到的氰基醇(2.7g)在氯仿(10ml)溶液冰浴搅拌下，加入步骤1得到的酰氯(3.5g)的氯仿溶液(6ml)，完毕后滴加1ml吡啶(1.25mmol)的氯仿溶液(3ml)；室温搅拌30min后，混合物依次用水、1mol/L HCl、饱和的NaHCO3洗涤，所得料液用无水硫酸镁干燥，蒸馏得粘稠油状物，产品用硅胶(60g)(10-100％石油醚/乙酸乙酯)柱层析，得产品(1R，3R)-3-(2，2-二溴乙烯基)-2，2-二甲基环丙基甲酸[3-(4-硝基苯氧基)苯基]氰基甲酯，为白色固体；
5)、人工半抗原(1R，3R)-3-(2，2-二溴乙烯基)-2，2-二甲基环丙基甲酸[3-(4-氨基苯氧基)苯基]氰基甲酯的合成：反应器中，将SnCl2(4.3g，19.06mmol)加入到(1R，3R)-3-(2，2-二溴乙烯基)-2，2-二甲基环丙基甲酸[3-(4-硝基苯氧基)苯基]氰基甲酯(2.10g，3.81mmol)的乙醇(20mL)溶液中；氮气保护下，控温70-75℃搅拌反应8.0h，冷却后用水稀释，加入乙醚和C盐(3.2g)溶液，然后分开15次加入固体NaHCO38.0g，过滤料液，所得固体用乙酸乙酯洗涤，有机相水洗，无水硫酸钠干燥后蒸馏得到红色油状物，产品用硅胶(40g)(25-100％石油醚/乙酸乙酯，)柱层析，得到浅黄色固体，为半抗原，称为DM。
6)、人工抗原的合成：称取半抗原DM0.0261g(0.05mmol)放入50ml小烧杯中，冰浴条件下加入300μL无水乙醇，搅拌溶解；然后向溶液中加入1M盐酸0.5ml和0.2M的亚硝酸钠0.4ml，搅拌均匀，最后逐滴滴加0.4ml N，N-二甲基酰胺到上述反应液中；
称量45mg的牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，以下称BSA)放入50ml小烧杯中，加入5ml硼酸(0.2M)缓冲溶液(ph＝8.7)和1.2mlN，N-二甲基酰胺的混合液溶解。冰浴条件下，将具有活性的半抗原溶液逐滴的加入到搅拌中的蛋白质中，50min滴加完毕；反应混和液在冰浴下搅拌继续反应60min，反应完全后装入透析袋中，4℃下，磷酸缓冲盐溶液(ph＝7.4)透析72h；离心，取上清液得人工抗原，称为DM-BSA。
本发明同时公开了一种所述方法制备的溴氰菊酯人工抗原的测定方法，所述测定方法包括下列步骤：
1)、称取合成的溴氰菊酯半抗原(DM)21.7mg，无水乙醇倍比稀释，配制成0.0283、0.0567、0.1131、0.2263、0.4525mg/ml系列浓度，分别进行紫外图谱扫描；从DM的紫外谱图上读出半抗原最大吸收峰处的吸光度Amax，作DM浓度(CDM)对吸光度的标准吸收曲线；
2)、称取1.28mgBSA，磷酸盐缓冲溶液(PH＝7.4)倍比稀释，配制成0.015、0.027、0.053、0.107、0.214mg/ml系列浓度，分别进行紫外图谱扫描；从BSA的紫外谱图上读出牛血清白蛋白最大吸收峰处的吸光度Amax，作BSA浓度(CBSA)对吸光度的标准吸收曲线。
3)、透析后的半抗原与牛血清蛋白偶联物(DM-BSA)经Lowry法测定得DM-BSA原液中蛋白浓度为1.69mg/ml，磷酸盐缓冲溶液(PH＝7.4)稀释至不同浓度，进行紫外图谱扫描。
本发明方法制备的溴氰菊酯半抗原保留了溴氰菊酯本身所有的化学结构，为免疫分析的特异性提供了一定的前提保障，半抗原的合成过程中，处理方法方便快捷，适合商品化。
本发明制备的人工抗原符合免疫要求，操作条件易于实现，适于抗体商品化目标。
本发明对促进农业生产、降低农业成本、减轻污染、改善环境、提高企业的经济效益都具有重要意义。
附图说明
图1为半抗原标准曲线。
图2为牛血清白蛋白标准曲线。
图3为UV光谱图。
具体实施方式
实施例1 溴氰菊酯人工半抗原的全合成
按下述化学反应式进行溴氰菊酯人工半抗原的全合成：
1.溴氰菊酯人工半抗原的全合成
式中：
1：三羟基苯甲醛
2：对硝基氯苯
3：3-(4-硝基苯氧基)苯甲醛
4：[3-(4-硝基苯氧基)苯基]氰基甲醇
5：(1R，3R)-3-(2，2-二溴乙烯基)-2，2-二甲基环丙基甲酸[3-(4-硝基苯氧基)苯基]氰基甲酯
6：(1R，3R)-3-(2，2-二溴乙烯基)-2，2-二甲基环丙基甲酸[3-(4-氨基苯氧基)苯基]氰基甲酯。6为人工半抗原，和蛋白相连，从而获得抗原。
具体步骤为：
1)、(1R，3R)-3-(2，2-二溴乙烯基)-2，2-二甲基环丙基甲酰氯的合成：向反应器中加入含30g(1R，3R)-3-(2，2-二溴乙烯基)-2，2-二甲基环丙基甲酸(0.1mol)的三氯甲烷溶液30ml和0.4mol的氯化亚砜28ml，油浴条件下控温60-65℃反应2h，除去溶剂和氯化亚砜，得到黄色油状产品(1R，3R)-3-(2，2-二溴乙烯基)-2，2-二甲基环丙基甲酰氯；
2)、3-(4-硝基苯氧基)苯甲醛的合成：在50ml的反应瓶中加入2.68g3-羟基苯甲醛(0.022mol)、3.78g对硝基氯苯(0.024mol)和10ml二甲基甲酰胺(DMF)，搅拌溶解，加入3.30g(0.024mol)无水碳酸钾，油浴控温120℃，反应2小时至化合物三羟基苯甲醛反应完全(薄层色谱跟踪)；趁热滤出固体并用少量DMF洗涤，滤液浓缩后得黑色固体；所得粗产品用硅胶柱(CH2Cl2)脱色得黄色粉末，甲醇重结晶；
3)、[3-(4-硝基苯氧基)苯基]氰基甲醇的合成：在50ml的反应瓶中，加入4.90g(0.020mol)3-(4-硝基苯氧基)-苯甲醛、氯仿(12ml)溶液和0.64g(0.002mol)碘化锌，氮气保护；混合物冰浴冷却后，加入2.2g(0.022mol)的三甲基氰基硅烷，反应半个小时，撤去冰浴，室温搅拌2小时至化合物3-(4-硝基苯氧基)苯甲醛反应完全(薄层色谱跟踪)后，将反应液转入250ml锥形瓶中；向反应混合物中加入甘醇二甲醚(60ml)的盐酸溶液(15ml，3mol/l)，剧烈搅拌5min，加60ml水稀释，氯丁烷萃取两次；有机相有无水硫酸镁干燥，蒸馏得到黑色油状物氰基醇；产品溶解(CH2Cl2)后，硅胶柱(30g)淋洗(正己烷/二氯甲烷，4：1)，脱色纯化得浅黄色油状物[3-(4-硝基苯氧基)苯基]氰基甲醇；
4)、(1R，3R)-3-(2，2-二溴乙烯基)-2，2-二甲基环丙基甲酸[3-(4-硝基苯氧基)苯基]氰基甲酯的合成：步骤3得到的氰基醇(2.7g)在氯仿(10ml)溶液冰浴搅拌下，加入步骤1得到的酰氯(3.5g)的氯仿溶液(6ml)，完毕后滴加1ml吡啶(1.25mmol)的氯仿溶液(3ml)；室温搅拌30min后，混合物依次用水、1mol/L HCl、饱和的NaHCO3洗涤，所得料液用无水硫酸镁干燥，蒸馏得粘稠油状物，产品用硅胶(60g)(10-100％石油醚/乙酸乙酯)柱层析，得产品(1R，3R)-3-(2，2-二溴乙烯基)-2，2-二甲基环丙基甲酸[3-(4-硝基苯氧基)苯基]氰基甲酯，为白色固体；
5)、人工半抗原(1R，3R)-3-(2，2-二溴乙烯基)-2，2-二甲基环丙基甲酸[3-(4-氨基苯氧基)苯基]氰基甲酯的合成：反应器中，将SnCl2(4.3g，19.06mmol)加入到(1R，3R)-3-(2，2-二溴乙烯基)-2，2-二甲基环丙基甲酸[3-(4-硝基苯氧基)苯基]氰基甲酯(2.10g，3.81mmol)的乙醇(20mL)溶液中；氮气保护下，控温70-75℃搅拌反应8.0h，冷却后用水稀释，加入乙醚和C盐(3.2g)溶液，然后分开15次加入固体NaHCO38.0g，过滤料液，所得固体用乙酸乙酯洗涤，有机相水洗，无水硫酸钠干燥后蒸馏得到红色油状物，产品用硅胶(40g)(25-100％石油醚/乙酸乙酯，)柱层析，得到浅黄色固体，为半抗原，称为DM。
实施例2 溴氰菊酯人工抗原的合成
按下列化学反应式进行：
具体步骤为：
称取半抗原0.0261g(DM，0.05mmol)放入50ml小烧杯中，冰浴条件下加入四滴无水乙醇，搅拌溶解。然后向溶液中加入1M盐酸0.6ml和0.2M的亚硝酸钠0.4ml，搅拌均匀。最后逐滴滴加0.4ml DMF到上述均一的反应液中。
称量45mg的牛血清白蛋白(BSA)或鸡卵血清蛋白(OVA)放入50ml小烧杯中，加入5ml硼酸(0.2M)缓冲溶液(ph＝8.7)和1.2ml DMF的混合液溶解。冰浴条件下，将具有活性的半抗原溶液逐滴的加入到搅拌中的蛋白质中，50min滴加完毕。反应混和液在冰浴下搅拌继续反应45min，反应完全后装入透析袋中。4℃下，磷酸缓冲盐溶液(ph＝7.4)透析72h。离心，取上清液，分装成小等分，于-20℃保存。
实施例3 抗原的测定
称取合成的溴氰菊酯半抗原(DM)21.7mg，无水乙醇倍比稀释，配制成0.0283、0.0567、0.1131、0.2263、0.4525mg/ml系列浓度，分别进行紫外图谱扫描；从DM的紫外谱图上读出半抗原最大吸收峰处的吸光度Amax，作DM浓度(CDM)对吸光度的标准吸收曲线。
称取1.28mgBSA，磷酸盐缓冲溶液(PH＝7.4)倍比稀释，配制成0.015、0.027、0.053、0.107、0.214mg/ml系列浓度，分别进行紫外图谱扫描；从BSA的紫外谱图上读出牛血清白蛋白最大吸收峰处的吸光度Amax，作BSA浓度(CBSA)对吸光度的标准吸收曲线。
透析后的半抗原与牛血清蛋白偶联物(DM-BSA)经Lowry法[10]测定得DM-BSA原液中蛋白浓度为1.69mg/ml，磷酸盐缓冲溶液(PH＝7.4)稀释至不同浓度，进行紫外图谱扫描。
实施例4 偶联物的测定(DM-BSA)
偶联后结合物往往有色，可根据颜色的变化判断半抗原是否已经连接到载体蛋白上。溴氰菊酯半抗原DM溶解后为浅黄色的溶液，与BSA偶联反应过程中，溶液的颜色逐渐变黄，最后变成橙黄色。由此可以判断已经发生偶联作用。
实施例5 溴氰菊酯半抗原(DM)标准曲线的绘制
紫外扫描测得DM的最大吸收波长为212nm，根据最大吸收波长对应的吸光度(表1)，绘制溴氰菊酯半抗原(DM)标准曲线的，见图1。根据图1进行线性回归，得线性方程：Y＝6.357X+0.1557R＝0.9896
表1DM最大吸收波长处的吸光度
实施例6 牛血清白蛋白(BSA)标准曲线的绘制
紫外扫描测得的BSA最大吸收波长为276nm，根据最大吸收波长对应的吸光度(表2)，绘制牛血清白蛋白标准曲线，见图2。根据图2进行线性回归，得线性方程：Y＝11.29X-0.025，R＝0.9929
表2BSA最大吸收波长处的吸光度
实施例7 UV光谱图
将半抗原DM、载体蛋白BSA、偶联物DM-BSA对应的不同浓度的紫外光谱图做对照(图3)，偶联后的紫外光谱曲线有所变化；从光谱数据分析，蛋白的吸收峰由276nm移动至282nm，可以证明半抗原DM已经和载体蛋白发生偶联。
图中：①BSA-DM，②BSA，③DM
实施例8 偶联比计算
选用半抗原DM(A)、载体蛋白BSA(B)、偶联物DM-BSA(C)(浓度分别为：0.0283、0.0354、0.0107mg/ml)这三种溶液，从紫外扫描图谱上读出或由2.1.1，2.1.2计算出它们在DM和BSA最大吸收峰波长处的吸光值，即AAam、AAbm、ABam、ABbm、ACam、ACbm(见表3)；并且分别计算DM和BSA在DM和BSA吸收峰波长处的摩尔吸光系数KAam、KAbm、KBam、KBbm(见表3)。代入公式(1)可计算出偶联比。
偶联比率(n)＝(ACam*KBbm-ACbm*KBam)/(ACbm*KAam-ACam*KAbm
表3
依据表3数据，得：
偶联比率(n)＝(ACam*KBbm-ACbm*KBam)/(ACbm*KAam-ACam*KAbm)
＝(1.24*10.58-0.15*16.38)/(0.15*32.61-1.24*2.51)
＝6：1
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下得出的其他任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种溴氰菊酯人工抗原的合成方法，其特征在于所述合成方法包括下列步骤：
1)、(1R，3R)-3-(2，2-二溴乙烯基)-2，2-二甲基环丙基甲酰氯的合成：向反应器中加入含30g，0.1mol(1R，3R)-3-(2，2-二溴乙烯基)-2，2-二甲基环丙基甲酸的三氯甲烷溶液30ml和0.4mol的氯化亚砜28ml，油浴条件下控温60-65℃反应2h，除去溶剂和氯化亚砜，得到黄色油状产品(1R，3R)-3-(2，2-二溴乙烯基)-2，2-二甲基环丙基甲酰氯；
2)、3-(4-硝基苯氧基)苯甲醛的合成：在50ml的反应瓶中加入2.68g，0.022mol 3-羟基苯甲醛、3.78g，0.024mol对硝基氯苯和10ml二甲基甲酰胺，以下称DMF，搅拌溶解，加入3.30g，0.024mol无水碳酸钾，油浴控温120℃，反应2小时至化合物三羟基苯甲醛反应完全，薄层色谱跟踪；趁热滤出固体并用少量DMF洗涤，滤液浓缩后得黑色固体；所得粗产品用CH2C12，硅胶柱脱色得黄色粉末3-(4-硝基苯氧基)苯甲醛，甲醇重结晶；
3)、[3-(4-硝基苯氧基)苯基]氰基甲醇的合成：在50ml的反应瓶中，加入4.90g，0.020mo13-(4-硝基苯氧基)-苯甲醛、12ml氯仿溶液和0.64g，0.002mol碘化锌，氮气保护；混合物冰浴冷却后，加入2.2g，0.022mol的三甲基氰基硅烷，反应半个小时，撤去冰浴，室温搅拌2小时至薄层色谱跟踪化合物3-(4-硝基苯氧基)苯甲醛反应完全后，将反应液转入250ml锥形瓶中；向反应混合物中加入60ml甘醇二甲醚和15ml，3mol/1盐酸溶液，剧烈搅拌5min，加60ml水稀释，氯丁烷萃取两次；有机相由无水硫酸镁干燥，蒸馏得到黑色油状物氰基醇；产品用CH2C12溶解后，30g硅胶柱，4∶1正已烷/二氯甲烷淋洗，脱色纯化得浅黄色油状物[3-(4-硝基苯氧基)苯基]氰基甲醇；
4)、(1R，3R)-3-(2，2-二溴乙烯基)-2，2-二甲基环丙基甲酸[3-(4-硝基苯氧基)苯基]氰基甲酯的合成：步骤3得到的氰基醇2.7g在10ml氯仿溶液中冰浴搅拌，加入6ml含有3.5g步骤1得到的酰氯的氯仿溶液，完毕后滴加3ml含有1ml，1.25mmol吡啶的氯仿溶液；室温搅拌30min后，混合物依次用水、1mol/L HCl、饱和的NaHCO3洗涤，所得料液用无水硫酸镁干燥，蒸馏得粘稠油状物，产品用60g硅胶，10-100％石油醚/乙酸乙酯柱层析，得产品(1R，3R)-3-(2，2-二溴乙烯基)-2，2-二甲基环丙基甲酸[3-(4-硝基苯氧基)苯基]氰基甲酯，为白色固体；
5)、人工半抗原(1R，3R)-3-(2，2-二溴乙烯基)-2，2-二甲基环丙基甲酸[3-(4-氨基苯氧基)苯基]氰基甲酯的合成：反应器中，将4.3g，19.06mmol的SnCl2加入到含有2.10g，3.81mmol(1R，3R)-3-(2，2-二溴乙烯基)-2，2-二甲基环丙基甲酸[3-(4-硝基苯氧基)苯基]氰基甲酯的20ml乙醇溶液中；氮气保护下，控温70-75℃搅拌反应8.0h，冷却后用水稀释，加入乙醚和3.2g C盐溶液，然后分开15次加入固体NaHCO38.0g，过滤料液，所得固体用乙酸乙酯洗涤，有机相水洗，无水硫酸钠干燥后蒸馏得到红色油状物，产品用40g硅胶，25-100％石油醚/乙酸乙酯柱层析，得到浅黄色固体，为半抗原，称为DM；
6)、人工抗原的合成：称取半抗原DM 0.0261g，0.05mmol放入50ml小烧杯中，冰浴条件下加入300μL无水乙醇，搅拌溶解；然后向溶液中加入1M盐酸0.5ml和0.2M的亚硝酸钠0.4ml，搅拌均匀，最后逐滴滴加0.4ml N，N-二甲基酰胺到上述反应液中；
称量45mg的牛血清白蛋白，以下称BSA，放入50ml小烧杯中，加入5ml，0.2M，pH＝8.7的硼酸缓冲溶液和1.2ml N，N-二甲基酰胺的混合液溶解；冰浴条件下，将具有活性的半抗原溶液逐滴的加入到搅拌中的蛋白质中，50min滴加完毕；反应混和液在冰浴下搅拌继续反应60min，反应完全后装入透析袋中，4℃下，pH＝7.4磷酸缓冲盐溶液中透析72h；离心，取上清液得人工抗原，称为DM-BSA。
2.一种如权利要求1所述方法制备的溴氰菊酯人工抗原DM-BSA的测定方法，其特征在于：所述测定方法包括下列步骤：
1)、称取合成的溴氰菊酯半抗原DM21.7mg，无水乙醇倍比稀释，配制成0.0283、0.0567、0.1131、0.2263、0.4525mg/ml系列浓度，分别进行紫外图谱扫描；从DM的紫外谱图上读出半抗原最大吸收峰处的吸光度Amax，作DM浓度对吸光度的标准吸收曲线；
2)、称取1.28mg BSA，pH＝7.4磷酸盐缓冲溶液倍比稀释，配制成0.015、0.027、0.053、0.107、0.214mg/ml系列浓度，分别进行紫外图谱扫描；从BSA的紫外谱图上读出牛血清白蛋白最大吸收峰处的吸光度Amax，作BSA浓度对吸光度的标准吸收曲线；
3)、透析后的半抗原与牛血清蛋白偶联物DM-BSA经Lowry法测定得DM-BSA原液中蛋白浓度为1.69mg/ml，pH＝7.4磷酸盐缓冲溶液稀释至不同浓度，进行紫外图谱扫描。
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| CN2006101449668A CN1948964B (zh) | 2006-11-27 | 2006-11-27 | 一种溴氰菊酯人工抗原的合成方法及测定方法 |
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