CN102539744A - 一种检测环境水样中邻苯二甲酸二环己酯的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测环境水样中邻苯二甲酸二环己酯的方法，包括以下步骤：a：标准曲线的建立步骤、b：样品的检测步骤。本发明与现有技术相比，不仅具有邻苯二甲酸二环己酯抗原抗体的选择性，而且酶促反应可以放大测定信号，提高灵敏度，同时辣根过氧化物酶在市场中很普遍，价廉适合推广。所以如此简单、快速、成本低、特异性强等优点的分析方法在适合环境中邻苯二甲酸二环己酯污染物的微量监测提供了便利。

Description

一种检测环境水样中邻苯二甲酸二环己酯的方法

技术领域

本发明涉及一种分析方法，特别涉及环境水样中邻苯二甲酸二环己酯的简单、快速、选择性好的检测分析方法。

背景技术

邻苯二甲酸酯(又称酞酸酯)是环境激素类物质中一类化合物。它主要用作增塑剂即作为塑料的一种添加剂以增大塑料的可塑性和强度，还用于涂料、印染、化妆品、香水和食品包装材料等的生产。在塑料中，邻苯二甲酸酯在分子间起“润滑剂”作用，以提高聚合物的柔韧性；在化妆品和香料中，他们能够延长香味的保持时间。近年来随着工业生产和塑料制品的使用，塑料垃圾的大量增加，由于邻苯二甲酸酯与聚烯烃类塑料分子之间非化学反应的结合方式，而是由氢键或范德华力连接，彼此保留各自相对独立的化学性质，因此随时间的推移，可由塑料中迁移到外部环境，对人类和环境造成很大的危害。塑化剂类似于人工荷尔蒙，具有雌性激素的功能，对男性、幼儿的伤害尤为严重。研究表明长期摄取塑化剂会干扰内分泌使女孩性早熟，男性生殖器变短小、性征不明显、精液量和精子数量减少等。塑化剂还会增加肝肾负担，对免疫系统、消化系统在造成慢性伤害，严重的还会导致肝癌。目前已在大气、水体、土壤等，乃至人体中普遍发现了邻苯二甲酸酯类化合物的存在。而且在2011年4月，台湾日前出现在食品添加物起云剂中加入有害健康的塑化剂″邻苯二甲酸(2-乙基己基)酯″(DEHP)事件，在台湾引起轩然大波。也让邻苯二甲酸酯成为全球性的最普遍的一类污染物，引起了各国学者的广泛关注，对邻苯二甲酸酯开展了一系列的研究。

1997年世界野生动物基金会(WWF)将八种邻苯二甲酸酯类化合物：邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二丙酯(DnPP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二戊酯(DAP)、邻苯二甲酸二环己酯(DCHP)、邻苯二甲酸正己酯(DnHP)、邻苯二甲酸丁基苯基酯(BBP)、邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)列为环境激素类物质。

邻苯二甲酸二环己酯(DCHP)是一种白色结晶粉末，具有芳香气味，可溶于丙酮、乙醚、正丁醇、甲苯等有机溶剂以及热的汽油，难溶于水，与聚氯乙烯、聚苯乙烯、硝酸纤维素等树脂相容。邻苯二甲酸二环己酯一种固体增塑剂，应用十分广泛，主要行业有塑料加工，如与硝酸纤维素和一些天然树脂可制造防潮材料。还有印刷油墨、涂料和粘合剂等。

而对于这些邻苯二甲酸酯的分析目前大多用气相色谱(GC)，气相色谱与质谱(MS)联用和高效液相色谱(HPLC)来完成。虽然这些方法均能很好的分离多种邻苯二甲酸酯，但是色谱技术的重点是环境样品的前处理，其过程复杂、操作费时、分析成本昂贵。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种简单、快速、廉价并适用多样品同时检测和现场监控的痕量分析方法。

本发明解决技术问题的技术方案为：一种检测环境水样中邻苯二甲酸二环己酯的方法，包括以下步骤：

a：标准曲线的建立步骤：

在建立邻苯二甲酸二环己酯的标准曲线之前，先配制不同浓度的标准品。DCHP标准液用1-2mL的无水乙醇溶解后，再用比例为1∶6～1∶9的PBS与无水乙醇混合液稀释一系列的浓度，分别为20ng/mL、10ng/mL、8ng/mL、4ng/mL、2ng/mL、1ng/mL、0.8ng/mL、0.4ng/mL、0.2ng/mL、0.1ng/mL、0.025ng/mL、0.0125ng/mL。竞争时加入这一系列浓度的标准液，测定结果的平均值经过数据处理后绘制成标准曲线。

(1)包被步骤：

用浓度为7μg/mL的邻苯二甲酸二环己酯包被抗原包被96孔酶标板，每孔100μL，放置培养箱37℃温育2h后，取出酶标板，将孔内溶液倒掉，每一次加满洗涤液，静置3-5min，再将其甩干，总共三次。

(2)封闭步骤：

在包被好的酶标准版中加入1％卵清蛋白(OVA)溶液，每孔150μL，封闭没有包被抗原的多余的部分，避免抗体的非特异吸附在酶标板上。37℃温育30min后，取出同上洗涤3次；

(3)竞争步骤：

每孔加入50μL邻苯二甲酸二环己酯标准溶液和50μL酶标记的邻苯二甲酸二环己酯抗体使之发生竞争反应。37℃下温育3h后，使待测物质和固相抗原同时竞争酶标抗体上的结合位点。加样使应将所加物加在板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。然后同上洗涤。

(4)检测步骤：

加入底物液，并与酶发生反应显示颜色，每孔100μL，37℃下温育30min后，用2mol/L硫酸溶液的终止液停止反应。用多功能酶标仪测定各孔在490nm时的吸光强度。

b：样品的检测步骤

除(3)竞争步骤：每孔加入50μL不同水样样品和50μL邻苯二甲酸二环己酯的酶标抗体，37℃下温育3h后，使待测物质和固相抗原同时竞争酶标抗体上的结合位点。然后同上洗涤，其余与a：标准曲线的建立步骤相同。

为了建立方法的重复性好，以及检测的准确度，需要在样品中加入标准品，进行加标回收实验。

除(3)竞争步骤：每孔加入25μL水样和25μL邻苯二甲酸二环己酯标准溶液，再加入50μL邻苯二甲酸二环己酯的酶标抗体，37℃下温育3h后，然后同上洗涤。其余与a：标准曲线的建立步骤相同。

所述的包被抗原通过以下方法制备：

称取4-氨基邻苯二甲酸二环己酯0.0138g先与0.1mL浓盐酸(12mol/L)，再加0.75mL蒸馏水混合，溶解后，置冰浴中冷至4℃以下，3-8℃下均匀搅拌，滴入1mL 0.1mol/L NaNO₂溶液，加完后继续搅拌30分钟，加1-3mg尿素除去未反应的NaNO₂，此时即为反应液1；

将含40mg卵清蛋白(OVA)溶于10mL硼酸纳缓冲液(pH9.2)，然后逐滴加入上述的反应液1中，并用1mol/L NaOH调节到pH8-9，溶液颜色变成橙红色即可，再继续搅拌4h，得到抗原粗品；

将反应液装入透析袋(MD36，8,000～14,000)中，置蒸馏水透析5天，每天换水2次，得到邻苯二甲酸二环己酯包被抗原OVA-DCHP。

所述的酶标记的邻苯二甲酸二环己酯抗体，通过以下方法制备：

免疫抗原的制备步骤：

称取4-氨基邻苯二甲酸二环己酯0.0553g先与0.1mL浓盐酸(12mol/L)，再加3mL蒸馏水混合，溶解后，置冰浴中冷至4℃以下，3-8℃下均匀搅拌，滴入4mL 0.1mol/L NaNO₂溶液；滴完后，继续搅拌30分钟，加6-12mg尿素除去未反应的NaNO₂，此时即为反应液1；

将含160mg牛血清蛋白(BSA)溶于40mL硼酸纳缓冲液(pH9.2)，然后逐滴加入上述的反应液1中，并用1mol/L NaOH调节到pH8-9，溶液颜色变成橙红色即可，再继续搅拌4h，得到抗原粗品；

将反应液装入透析袋(MD36：8,000～14,000)中，置蒸馏水透析5天，每天换水2次，得到邻苯二甲酸二环己酯免疫抗原。

抗体的制备步骤

取1mL邻苯二甲酸二环己酯免疫抗原加入3mL0.9％的生理盐水配成浓度为1mg/mL的溶液；

①第一次免疫用等体积的完全弗氏佐剂和1mg/mL的免疫原混匀，当混合后的免疫抗原滴进盛有冷水的烧杯中时，能以油滴状态完整地停留在水面上，而不扩散，说明免疫抗原已经完全乳化，可以进行注射；

②首次注射用含完全弗氏佐剂的免疫抗原进行基础免疫，之后用不完全弗氏佐剂的免疫抗原加强免疫。用剪刀剪去兔背部，酒精消毒，采用背部皮下多点注射的方法，每次背部皮下免疫8～10点，每次注射1mL；

③三周后开始用不完全弗氏佐剂的免疫抗原加强免疫，以后每隔2周再次加强免疫，从第二次加强免疫开始，每次免疫后第7天耳静脉采血，室温放置1h后放入4℃冰箱，1h后离心分离出血清后测血清效价；

④当效价不再变化时，颈动脉采血，血清室温静置0.5-1h，在4℃冰箱静止2h后吸取上层澄清的血清，作为邻苯二甲酸二环己酯抗体；

动物免疫方案

酶标抗体的制备步骤：

辣根过氧化物酶10mg溶于0.4mL 0.05mol/L pH9.6CB缓冲液，待溶解后加入25％戊二醛0.1mL，然后37℃温育2h；

再加入0-4℃的无水乙醇2mL，2500r/min离心15min，倾去上清液；

取沉淀以80％乙醇(v/v)4mL混悬，2500r/min离心15min，倾去乙醇，将管倒置，使乙醇充分流出；沉淀用1mL 0.05mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液(包被缓冲液CB)溶解，加入0.5-1mL邻苯二甲酸二环己酯抗体溶液，放在冰箱内4℃过夜后，加入0.5-2mgNaH₂PO₄，调至溶液pH7-8即可，制备好的酶标抗体放置在4℃保存。

所述的弗氏佐剂通过以下方法制备

佐剂是指与抗原同时注射或预先注射，能非特异性增强或改变机体对抗原免疫应答的物质。

制备过程是将液体石蜡和无水羊毛脂以体积比2∶1混合，用超声波清洗器震荡3h，使之完全混匀，即滴一滴乳化剂到盛进冷水的烧杯中，半分钟之内以油滴状态完整地停留在水面上，而不扩散，表明是稳定的，此即为不完全弗氏佐剂。不完全弗氏佐剂在临用前加入液体卡介苗即成为完全弗氏佐剂。

由于制备抗体的目的都是要求效价高。不同抗原制备的抗体，其效价各异。

本发明采用间接酶联免疫分析方法测定抗血清的效价。实验过程如下：用CB将包被抗原(OVA-DCHP)稀释，每孔100μL包被96孔酶标板，放入4℃冰箱过夜；第二天用PBST洗涤3次，每次3min后，然后甩干孔内溶液，加入150μL/孔1％的OVA溶液，在37℃封闭30min；再用PBST洗涤3次，每孔100μL不同浓度的抗血清(1∶1000-64000)，37℃温育2h；同上洗涤后，加入1000倍稀释的酶标二抗，100μL/孔，37℃温育2h，再洗板(同上)，加入底物溶液，100μL/孔，37℃温育30min；用2mol/LH2SO4终止反应，最后在酶标仪上490nm处测定各孔的吸光值。由效价的判定依据，得出最终抗血清的效价达到了1∶64000。

本发明的酶标抗体采用戊二醛作为交联剂，利用戊二醛分子上对称的两个醛基，分别与酶和抗体中游离的氨基、酚基等以共价键结合而进行标记，制备出了酶标抗体。

本发明与现有技术相比，具有以下的特点：

准确明了地完成对邻苯二甲酸二环己酯的一系列制备和分析，并在0.01-20ng/mL浓度范围内与吸光强度有良好的线性关系。线性回归方程为Y＝1.02076-0.32409lgX，此式中Y为吸光强度，X为DCHP的浓度，R²＝0.9965，LOD＝0.005ng/mL。一发明中选取了四种水样，分别为实验室自来水，长江水，镜湖水以及超市购买的矿泉水，样品进行预处理之后，用建立的dc-ELISA法测定。发现水样中DCHP的含量为0.056-0.29ng/mL，自来水和矿泉水不在方法的测定范围之内。指定的三个标准浓度加标，回收率为93.7-104％。与色谱技术相比，所建立的直接竞争酶联免疫分析方法中，不仅具有邻苯二甲酸二环己酯抗原抗体的选择性，而且酶促反应可以放大测定信号，提高灵敏度，同时辣根过氧化物酶在市场中很普遍，价廉适合推广。所以如此简单、快速、成本低、特异性强等优点的分析方法在适合环境中邻苯二甲酸二环己酯污染物的微量监测提供了便利。

附图说明

图1为实施例1的邻苯二甲酸二环己酯标准曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作详细的说明。

实验药品

溶液的配制

1).饱和硫酸铵溶液：取500mL蒸馏水，加热至70～80℃，将400g硫酸铵粉剂溶于水中，搅拌20min，硫酸铵结晶沉于瓶底，上清即为饱和硫酸铵，室温冷却后用脱脂棉过滤。再取28％氨水将饱和硫酸铵调节至pH7.0。

2).生理盐水：0.85gNaCl加蒸馏水至100mL。

3).0.01mol/L pH7.2磷酸缓冲液(PB)：0.2mol/LNa₂HPO₄36.0mL，0.2mol/LNaH₂PO₄14.0mL混合，蒸馏水定容到1000mL。

4).包被缓冲液(0.05mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液，CB)：称取1.59g Na₂CO₃，2.94g NaHCO₃，蒸馏水定容到1000mL。

5).稀释液(0.01mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液，PBS)：称取8.0gNaCl，2.96gNa₂HPO₄·12H₂O，0.29g NaH₂PO₄·2H₂O，0.1gKCl，蒸馏水定容到1000mL。

6).洗涤液(0.01mol/L pH7.4，PBST)：PBS中加入0.05％吐温-20(v/v)。

7).封闭液：用PBS配制1％(w/v)卵清蛋白(OVA)溶液。

8).底物液：邻苯二胺4mg溶于10mL柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，临用前加入15μL30％过氧化氢。

9)柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液：称取Na₂HPO₄·12H₂O 1.84g，柠檬酸0.51g。然后用蒸馏水溶解至50mL。

10).终止液：2mol/L硫酸溶液。

实施例1：

邻苯二甲酸二环己酯的标准曲线的建立：

(1)包被步骤：

用浓度为7μg/mL的包被抗原OVA-DCHP包被96孔酶标板，每孔100μL，放置培养箱37℃温育2h后，取出酶标板，将孔内溶液倒掉，每一次加满洗涤液，静置3-5min，再将其甩干，总共三次。

(2)封闭步骤：

再加入1％OVA溶液，每孔150μL，37℃温育30min，封闭没有包被抗原的多余的部分，取出同上洗涤3次。

(3)竞争步骤：

再每孔加入50μL邻苯二甲酸二环己酯标准溶液和50μL邻苯二甲酸二环己酯的酶标抗体，37℃下温育3h后，使待测物质和固相抗原同时竞争酶标抗体上的结合位点。然后同上洗涤。

(4)检测步骤：

加入底物液，并与酶发生反应显示颜色，每孔100μL，37℃下温育30min后，用2mol/L硫酸溶液停止反应。最后用多功能酶标仪测定各孔在490nm时的吸光强度。

将实施例1取得的实验结果通过Origin软件进行数据处理，标准曲线如图1所示。

实施例2：

本实施例所用的试剂按下列配方进行配制：

测定用的水样分别采集于芜湖段长江水、芜湖市镜湖水以及本实验室自来水和矿泉水，对于表面水的采集，用玻璃瓶盛装样品，在灌瓶前用需采样的水将瓶冲洗3次。采集水样后先对其过滤萃取处理，再用1mol/mLHCl或1mol/mLNaOH将pH值调至7.0左右，置于4℃保存待用。

(1)包被步骤：

用浓度为7μg/mL的包被抗原OVA-DCHP包被96孔酶标板，每孔100μL，放置培养箱37℃温育2h后，取出酶标板，将孔内溶液倒掉，每一次加满洗涤液，静置3-5min，再将其甩干，总共三次。

(2)封闭步骤：

加入1％OVA溶液，每孔150μL，37℃温育30min，封闭没有包被抗原的多余的部分，取出同上洗涤3次。

(3)竞争步骤：

每孔加入50μL不同水样样品和50μL邻苯二甲酸二环己酯的酶标抗体，37℃下温育3h后，使待测物质和固相抗原同时竞争酶标抗体上的结合位点。然后同上洗涤。

(4)检测步骤：

加入底物液，并与酶发生反应显示颜色，每孔100μL，37℃下温育30min后，用2mol/L硫酸溶液停止反应。最后用多功能酶标仪测定各孔在490nm时的吸光强度。

其结果处理如表1所示。

实施例3：

除竞争步骤为：每孔加入25μL水样和25μLDCHP标准溶液，再加入50μL邻苯二甲酸二环己酯的酶标抗体，37℃下温育3h后，然后同上洗涤。外，其余与实施2相同，

其结果处理也如表1所示：

ND^a：没有检测出DCHP的样品

实施例4：

抗邻苯二甲酸二环己酯抗体特异性考察

除竞争步骤为：每孔50μL加入用PBS稀释之后的一系列浓度(1-10000ng/mL)邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丙酯、邻苯二甲酸二丁酯或邻苯二甲酸二戊酯溶液，再加入50μL邻苯二甲酸二环己酯的酶标抗体，37℃下温育3h后，然后同上洗涤。外，其余与实施2相同，

利用抗体的特异性可以提高实验中的选择性，而考察特异性在于对邻苯二甲酸二环己酯抗体的交叉反应的计算。交叉反应是指抗体与结构不同的抗原决定簇发生结合的能力，不同的抗原有相同表位时，也可以与抗体进行结合，这意味着与半抗原、半抗原衍生物和全抗原有着共同结构的其他物质也可能与抗体发生结合反应，从而干扰结果的判断。

计算类似物的IC₅₀浓度，交叉反应率＝(抗原的IC₅₀浓度/近似抗原的IC₅₀浓度)×100％；

计算的结果如表2所示，从表中看到几种结构相似的邻苯二甲酸酯对DCHP抗体的分析无干扰，因为这些相似物与DCHP抗体的交叉反应率均在10％以下，故邻苯二甲酸二环己酯抗体是高特异性的，可应用于复杂样品中邻苯二甲酸二环己酯的高特异性检测。

表2与DCHP结构相似物与抗体的交叉反应率

Claims (5)

1.一种检测环境水样中邻苯二甲酸二环己酯的方法，包括以下步骤：

a：标准曲线的建立步骤：

在建立邻苯二甲酸二环己酯的标准曲线之前，先配制不同浓度的标准品。邻苯二甲酸二环己酯标准液用1-2mL的无水乙醇溶解后，再用比例为1∶6～9的稀释液与无水乙醇混合液稀释一系列的浓度，分别为20ng/mL、10ng/mL、8ng/mL、4ng/mL、2ng/mL、1ng/mL、0.8ng/mL、0.4ng/mL、0.2ng/mL、0.1ng/mL、0.025ng/mL、0.0125ng/mL；竞争时加入这一系列浓度的标准液，测定结果的平均值经过数据处理后绘制成标准曲线；

(1)包被步骤：

用浓度为7μg/mL的邻苯二甲酸二环己酯包被抗原包被96孔酶标板，每孔100μL，放置培养箱37℃温育2h后，取出酶标板，将孔内溶液倒掉，每一次加满洗涤液，静置3-5min，再将其甩干，总共三次；

(2)封闭步骤：

在包被好的酶标准版中加入1％卵清蛋白溶液，每孔150μL，37℃温育30min后，取出同上洗涤3次；

(3)竞争步骤：

每孔加入50μL邻苯二甲酸二环己酯标准溶液和50μL酶标记的邻苯二甲酸二环己酯抗体，37℃下温育3h后，然后同上洗涤；

(4)检测步骤：

加入底物液，并与酶发生反应显示颜色，每孔100μL，37℃下温育30min后，用2mol/L硫酸溶液的终止液停止反应；用多功能酶标仪测定各孔在490nm时的吸光强度；

b：样品的检测步骤

除(3)竞争步骤：每孔加入50μL不同水样样品和50μL邻苯二甲酸二环己酯的酶标抗体，37℃下温育3h后，然后洗涤，其余与a：标准曲线的建立步骤相同。

2.根据权利要求1所述的一种检测环境水样中邻苯二甲酸二环己酯的方法，其特征在于：

除(3)竞争步骤：每孔加入25μL水样和25μL邻苯二甲酸二环己酯标准溶液，再加入50μL邻苯二甲酸二环己酯的酶标抗体，37℃下温育3h后，然后同上洗涤。其余与a：标准曲线的建立步骤相同。

3.根据权利要求1所述的一种检测环境水样中邻苯二甲酸二环己酯的方法，其特征在于：

所述的邻苯二甲酸二环己酯包被抗原通过以下方法制备：

称取4-氨基邻苯二甲酸二环己酯0.0138g先与0.1mL浓盐酸(12mol/L)，再加0.75mL蒸馏水混合，溶解后，置冰浴中冷至4℃以下，3-8℃下均匀搅拌，滴入1mL 0.1mol/L NaNO₂溶液，加完后继续搅拌30分钟，加1-3mg尿素除去未反应的NaNO₂，此时即为反应液1；

将含40mg卵清蛋白溶于10mL硼酸纳缓冲液，然后逐滴加入上述的反应液1中，并用1mol/L NaOH调节到pH8-9，溶液颜色变成橙红色即可，再继续搅拌4h，得到抗原粗品；

将反应液装入透析袋，置蒸馏水透析5天，每天换水2次，得到邻苯二甲酸二环己酯包被抗原。

4.根据权利要求1所述的一种检测环境水样中邻苯二甲酸二环己酯的方法，其特征在于：

所述的酶标记的邻苯二甲酸二环己酯抗体的制备工序，包括免疫抗原的制备步骤、抗体的制备步骤、酶标抗体的制备步骤：

所述的酶标抗体的制备步骤：

辣根过氧化物酶10mg溶于0.4mL 0.05mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液，待溶解后加入25％戊二醛0.1mL，然后37℃温育2h；

再加入0-4℃的无水乙醇2mL，2500r/min离心15min，倾去上清液；

取沉淀以80％乙醇(v/v)4mL混悬，2500r/min离心15min，倾去乙醇，将管倒置，使乙醇充分流出；沉淀用1mL 0.05mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液溶解，加入0.5-1mL邻苯二甲酸二环己酯抗体溶液，放在冰箱内4℃过夜后，加入0.5-2mgNaH₂PO₄，调至溶液pH7-8即可，制备好的酶标抗体放置在4℃保存。

5.根据权利要求4所述的一种检测环境水样中邻苯二甲酸二环己酯的方法，其特征在于：

所述的免疫抗原的制备步骤：

称取4-氨基邻苯二甲酸二环己酯0.0553g先与0.1mL浓盐酸(12mol/L)，再加3mL蒸馏水混合，溶解后，置冰浴中冷至4℃以下，3-8℃下均匀搅拌，滴入4mL 0.1mol/L NaNO₂溶液；滴完后，继续搅拌30分钟，加6-12mg尿素除去未反应的NaNO₂，此时即为反应液1；

将含160mg牛血清蛋白溶于40mL硼酸纳缓冲液(pH9.2)，然后逐滴加入上述的反应液1中，并用1mol/L NaOH调节到pH8-9，溶液颜色变成橙红色即可，再继续搅拌4h，得到抗原粗品；

将反应液装入透析袋中，置蒸馏水透析5天，每天换水2次，得到邻苯二甲酸二环己酯免疫抗原。

所述的抗体的制备步骤

取1mL邻苯二甲酸二环己酯免疫抗原加入3mL0.9％的生理盐水配成浓度为1mg/mL的溶液；

①第一次免疫用等体积的完全弗氏佐剂和1mg/mL的免疫原混匀，当混合后的免疫抗原滴进盛有冷水的烧杯中时，能以油滴状态完整地停留在水面上，而不扩散，说明免疫抗原已经完全乳化，可以进行注射；

②首次注射用含完全弗氏佐剂的免疫抗原进行基础免疫，之后用不完全弗氏佐剂的免疫抗原加强免疫。用剪刀剪去兔背部，酒精消毒，采用背部皮下多点注射的方法，每次背部皮下免疫8～10点，每次注射1mL；

③三周后开始用不完全弗氏佐剂的免疫抗原加强免疫，以后每隔2周再次加强免疫，从第二次加强免疫开始，每次免疫后第7天耳静脉采血，室温放置1h后放入4℃冰箱，1h后离心分离出血清后测血清效价；

④当效价不再变化时，颈动脉采血，血清室温静置0.5-1h，在4℃冰箱静止2h后吸取上层澄清的血清，作为邻苯二甲酸二环己酯抗体。

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