CN101671345B - 一种莪术醇半抗原和人工抗原及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种莪术醇半抗原和人工抗原及其制备方法，所制备的莪术醇半抗原的结构式为：人工抗原的结构式为：

其制备方法为：本发明以莪术醇为原料，利用丁二酸酐与莪术醇反应生成莪术醇琥珀酸单酯(Cur-HS)，得到人工半抗原，将莪术醇的半抗原制备成吡啶水溶液，然后使之与牛血清蛋白结合，制备出莪术醇的人工抗原。本发明合成了莪术醇的半抗原和人工抗原，所制备的产品可用于含莪术醇成分样品的研究，合成步骤简单，所需的实验条件温和，在常温下就能进行，产物容易得到，且产率较高，有效，完全可用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了方便，可以满足国内外对其研究的需要。

Description

一种莪术醇半抗原和人工抗原及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种莪术醇半抗原、人工抗原及其制备方法，属于免疫学技术领域。

背景技术

免疫分析是一种基于抗原抗体抗原抗体特异性识别和结合反应的分析方法，不仅可用于测定蛋白质、酶等大分子物质，而且还广泛用于测定小分子量的药物，特别适用于那些色谱法难以分析的药物，该法已成为药物分析中一种必不可少的基本检测技术。免疫分析不仅为临床诊断提供了依据，在内分泌学、病毒学、药理学、血液学及肿瘤学等研究方面得以应用，而且在农业科学、食品科学、环境保护、生态学及法医学等领域的应用也有所进展。免疫分析具有检测灵敏度高、特异性强、前处理简单、反应速度快、检测费用低廉，适于现场监控和大批量样品分析的特点。

莪术醇(curcumol)又名姜黄环奥醇，姜黄醇，属萜类化合物，是莪术挥发油中的重要成分。具有抗癌、抗早孕、抗病毒、抗突变、保肝、活血化瘀等药理作用。特别是在免疫分析检测方面具有独特作用，但莪术醇为小分子天然化合物，相对分子质量较小，仅具有反应原性，而不具有免疫原性，因此不能直接采用免疫方法检测，需要与大分子蛋白等偶联形成复合物后才能成为完全抗原。但是小分子化合物必须具有或衍生出能与载体进行交联反应的功能基团(如氨基，羧基，重氮基等)，对于含羟基的半抗原需要将其羟基衍生为羧基再与蛋白质载体交联合成人工抗原。根据莪术醇结构中存在C₆羟基的特点，先将莪术醇的羟基衍生为羧基，然后再与大分子蛋白偶联形成复合物，从而成为完全抗原才行。

发明内容

本发明的目的是提供一种莪术醇半抗原和人工抗原；

本发明的另一个目的是要提供上述莪术醇半抗原和人工抗原的制备方法，所制备出的产品用于含有莪术醇的中草药的免疫方法研究，其制备方法合成步骤简单，实验条件温和，产物容易得到，且产率较高。

实现本发明的技术方案是：一种莪术醇半抗原和人工抗原的制备方法，以莪术醇为原料，利用丁二酸酐与莪术醇反应生成莪术醇琥珀酸单酯(Cur-HS)，得到莪术醇人工半抗原，用MS质谱和¹³C-NMR谱测定半抗原的结构；将莪术醇半抗原制备成吡啶水溶液，然后使之与牛血清蛋白结合，制得莪术醇人工抗原，即Cur-HS-BSA，用MALDI-TOF-MS鉴定莪术醇人工抗原；其反应方程式为：

(1)莪术醇琥珀酸单酯(Cur.-HS)

莪术醇                   丁二酸酐    莪术醇琥珀酸单酯

(2)莪术醇人工抗原Cur.-HS-BSA

莪术醇琥珀酸单酯            牛血清蛋白    莪术醇人工抗原

本发明所述莪术醇半抗原的制备方法步骤如下：

1、取三氯甲烷置于反应瓶，加入少量无水MgSO₄，搅拌过夜，滤去MgSO₄；

2、取上述滤液，加入莪术醇和丁二酸酐，搅拌溶解，加入适量的4-甲基氨基吡啶，于65℃回流，TLC检测反应进度，反应结束，冷却；

3、将反应物倾入冰水中，用乙醚萃取，合并有机相，回收有机溶剂，得莪术醇半抗原粗品；

4、用石油醚-乙酸乙酯进行硅胶柱层析，得到纯度较高的莪术醇丁二酯油状物，此即为莪术醇半抗原莪术醇琥珀酸单酯，置4℃冰箱保存；所述石油醚与乙酸乙酯的体积比为8∶1。

将上述所得产品用MS质谱和¹³C-NMR谱测定其结构，从Cur-HS的MS(APCI)m/z：337.14(M^-)，推出其分子量为336，初步认为Cur-HS为合成的目标产物；再分别测定出原莪术醇、Cur-HS的¹³C-NMR谱，比较两者¹³C-NMR谱的不同，发现产物多出δ172.48，169.15，30.2，29.13，共四条谱线，其中δ169.15为莪术醇成丁二酸单酯后酯羰基碳原子，δ172.48为莪术醇成丁二酸单酯链羧基羰基碳原子，而δ29.13，δ30.2为丁二酸单酯链中2个亚甲基碳原子。结合MS的数据，对原料莪术醇和和合成出的产物碳谱的化学位移数据的差异分析表明，从而确定合成出的产物就是所需要的目标产物Cur-HS。

本发明所述莪术醇人工抗原的制备方法步骤如下：

1、称取莪术醇琥珀酸单酯，加入吡啶和H₂O，搅拌溶解，所加入的吡啶与H₂O的体积比为1∶1；

2、称取BSA，加入PH8.0的碳酸氢钠缓冲液，搅拌溶解，加入1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)，将莪术醇丁二酸单脂的吡啶水溶液加入前反应液中，于室温反应15小时；

3、将其反应物装入透析袋，用纯净水于4℃透析，每5小时换水一次，透析3天，经冷冻干燥，得莪术醇人工抗原Cur-HS-BSA，于-20℃下保存。

将上述所得产品用MALDI-TOF-MS进行鉴定，其鉴定方法是：

(1)先配置基质辅助溶液：将0.15％三氟醋酸(TFA)666ul加入到乙腈(CH₃CN)333ul中，取10mg芥子酸加入到前配的0.15％TFA-CH₃CN混合液1ul，超声波10-15min后溶解，备用；

(2)供试品处理：取Cur-HS-BSA，溶解在8mol/L的尿素溶液中，然后将其稀释成浓度在1-10pmol/L；另称取BSA0.5mg溶于水100ul，配置成5mg/ml的BSA水溶液。

(3)MALDI-TOF-MS测定：各取供试品和基质辅助溶液1ul，充分混匀，吸取混合液1ul滴加在镀金样品板上，室温下晾干后，送入质谱仪分析。

结合比＝(偶联物相对分子质量-蛋白质相对分子质量)/莪术醇相对分子质量

结合比＝(73302.3-66713.4)/336.42＝19.6。

根据MALDI-TOF-MS图谱，可以清晰的判断出Cur-HS与BSA偶联形成了新的复合物，改复合物的相对分子质量约为73302；对比BSA的相对分子质量66731以及Cur-HS的相对分子质量336，可以求出Cur-HS-BSA的结合比19.6，本试验中人工合成的半抗原-蛋白复合物Cur-HS-BSA的结合数值较大，每个载体蛋白分子平均与19.6个半抗原分子结合，说明半抗原与载体的偶联情况良好，这为后续的抗莪术醇抗体的制备提供了可靠的实验基础。

本发明的有益效果：本发明合成了莪术醇的半抗原和人工抗原，所制备的产品可用于含莪术醇成分样品的研究，合成步骤简单，所需的实验条件温和，在常温下就能进行，产物容易得到，且产率较高，有效，完全可用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了方便，可以满足国内外对其研究的需要。

附图说明

图1为莪术醇¹³C-NMR

图2为莪术醇琥珀酸单酯(Cur.-HS)¹³C-NMR

图3为莪术醇琥珀酸单酯(Cur.-HS)MS(APCI)

图4为牛血清蛋白(BSA)的MALDI-TOF-MS谱图

图5为莪术醇人工抗原(Cur-HS-BSA)的MALDI-TOF-MS谱图

具体实施方式

实施例1

一种莪术醇人工半抗原的制备方法按如下步骤进行：

(1)称取莪术醇0.1170g(即0.495mmol)与丁二酸酐0.12g(即1.2mmol)；

(2)取10ml三氯甲烷置于反应瓶，加入少量无水MgSO₄，搅拌过夜，滤去MgSO₄；

(3)取上述滤液，将称好的莪术醇与丁二酸酐加入到滤液中，搅拌溶解，加入适量的4-甲基氨基吡啶，于65℃回流，TLC检测反应进度，反应结束，冷却；

(4)将反应物倾入冰水中，用乙醚萃取，合并有机相，回收有机溶剂，得莪术醇半抗原粗品；

(5)用石油醚-乙酸乙酯进行硅胶柱层析，得到纯度较高的莪术醇丁二酯油状物0.1450g，产率87％，此即为莪术醇半抗原莪术醇琥珀酸单酯0.431mmol，置4℃冰箱保存，石油醚-乙酸乙酯的体积比为8∶1。

实施例2

(1)称取莪术醇0.234g(即0.99mmol)与丁二酸酐0.24g(即2.4mmol)；

(2)取20ml三氯甲烷置于反应瓶，加入少量无水MgSO₄，搅拌过夜，滤去MgSO₄；

(3)取上述滤液，将称好的莪术醇与丁二酸酐加入到滤液中，搅拌溶解，加入适量的4-甲基氨基吡啶，于65℃回流，TLC检测反应进度，反应结束，冷却；

(4)将反应物倾入冰水中，用乙醚萃取，合并有机相，回收有机溶剂，得莪术醇半抗原粗品；

(5)用石油醚-乙酸乙酯进行硅胶柱层析，得到纯度较高的莪术醇丁二酯油状物0.29g，产率87％，此即为莪术醇半抗原莪术醇琥珀酸单酯0.862mmol，置4℃冰箱保存，石油醚-乙酸乙酯的体积比为8∶1。

实施例3

一种莪术醇人工抗原的制备方法按如下步骤进行：

(1)称取4.15mg(12.3×10^-6mol)莪术醇琥珀酸单酯，加吡啶与水的混合液250ul(二者体积比为1∶1)，搅拌溶解；

(2)称取BSA2.8mg(4.2×10^-5mmol)，加入PH8.0的碳酸氢钠缓冲液250ul，搅拌溶解，加入1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)4.7mg(24.6×10-6mol)，将莪术醇丁二酸单脂的吡啶水溶液加入前反应液中，于室温反应15小时；

(3)将其反应物装入透析袋，用纯净水于4℃透析，每5小时换水一次，透析3天，经冷冻干燥，得1.60mg莪术醇人工抗原Cur-HS-BSA，产率52％，于-20℃下保存。

实施例4

(1)称取8.3mg(24.6×10^-6mol)莪术醇琥珀酸单酯，加吡啶与水的混合液250ul(二者体积比为1∶1)，搅拌溶解；

(2)称取BSA5.6mg(8.4×10^-5mmol)，加入PH8.0的碳酸氢钠缓冲液250ul，搅拌溶解，加入1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)9.4mg(49.2×10-6mol)，将莪术醇丁二酸单脂的吡啶水溶液加入前反应液中，于室温反应15小时；

(3)将其反应物装入透析袋，用纯净水于4℃透析，每5小时换水一次，透析3天，经冷冻干燥，得3.2mg莪术醇人工抗原Cur-HS-BSA，产率52％，于-20℃下保存。

Claims (3)

1.一种莪术醇半抗原，其特征在于：它以莪术醇为原料，应用丁二酸酐与莪术醇反应生成莪术醇琥珀酸单酯制得，其分子结构式为：

2.一种莪术醇半抗原的制备方法，其特征在于：该方法步骤如下：

(1)取三氯甲烷置于反应瓶，加入少量无水MgSO₄，搅拌过夜，滤去MgSO₄；

(2)取上述滤液，加入莪术醇和丁二酸酐，搅拌溶解，加入适量的4-甲基氨基吡啶，于65℃回流，TLC检测反应进度，反应结束，冷却；

(3)将反应物倾入冰水中，用乙醚萃取，合并有机相，回收有机溶剂，得莪术醇半抗原粗品；

(4)用石油醚-乙酸乙酯进行硅胶柱层析，得到莪术醇琥珀酸单酯，即莪术醇丁二酸单酯，此即为莪术醇半抗原，置4℃冰箱保存，所述的石油醚与乙酸乙酯的体积比为8∶1。

3.一种莪术醇人工抗原，其特征在于：它以莪术醇为原料，应用丁二酸酐与莪术醇反应生成莪术醇琥珀酸单酯制得莪术醇人工半抗原，用MS质谱和¹³C-NMR谱测定半抗原的结构，再将莪术醇半抗原制备成吡啶水溶液，然后再与牛血清蛋白结合制成，其分子结构式为：

该方法步骤如下：

(1)称取莪术醇琥珀酸单酯，加入吡啶和H₂O，搅拌溶解，所加入的吡啶∶H₂O的体积比为1∶1；

(2)称取BSA，加入碳酸氢钠缓冲液，搅拌溶解，加入1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，将莪术醇丁二酸单脂的吡啶水溶液加入前反应液中，于室温反应15小时；

(3)将其反应物装入透析袋，用纯净水于4℃透析，每5小时换水一次，透析3天，经冷冻干燥，得Cur-HS-BSA，于-20℃下保存。

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