CN106800560B

CN106800560B - 莪术醇衍生物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN106800560B
Application number: CN201611207773.2A
Authority: CN
Inventors: 田瑜; 王�义; 尙海; 许旭东
Original assignee: Institute of Medicinal Plant Development of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Medicinal Plant Development of CAMS and PUMC
Priority date: 2016-12-23
Filing date: 2016-12-23
Publication date: 2018-11-02
Anticipated expiration: 2036-12-23
Also published as: CN106800560A

Abstract

本发明公开了一种莪术醇衍生物及其制备方法和应用，结构式如下：本发明以莪术醇与甘油为原料，保留莪术醇的结构骨架，对莪术醇8位上的羟基基团进行修饰，合成了新型的具有抗癌、抗菌、抗病毒等作用的莪术醇衍生物，合成方法简便，产物纯度高。与莪术醇比较而言，本发明提供的莪术醇衍生物具有以下优点：1、较好的水溶性与脂溶性；2、高效低毒；3、稳定性高。与本发明合成的莪术醇衍生物相比较而言，本发明提供的莪术醇衍生物纳米粒子具有以下优点：1、持续释放的特性；2、生物利用度高。

Description

莪术醇衍生物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及药物化学和治疗学领域，特别是涉及一种莪术醇衍生物及其制备方法和应用。

背景技术

莪术是姜科植物蓬莪术Curcuma phaeocaulisVal.、温郁金C.wenyujinY.H.Chenet C.Ling、广西莪术C.kwangsiensisS.lee et C.F.Liang的干燥根茎，是一味重要的中药材，别名为黑心姜、蓝心姜、姜七，主要产于四川、福建、浙江、广西等地，首载于《药性论》。中医理论认为，其味辛、苦，性温，归肝、脾经，具有行气破血、消积止痛的功效。其临床用于癥瘕积聚、经闭及心腹瘀痛、食积脘腹胀痛等症状。其主要成分莪术挥发油具有较好的抗肿瘤作用、抗早孕作用、抗菌作用、保肝作用以及抗炎作用等。莪术挥发油主要为倍半萜和倍半萜烯类化合物，包括莪术醇、莪术二酮、吉马酮、β-榄香烯、呋喃二烯、莪术烯、新莪术二酮等。而莪术醇是主要的抗癌成分。

莪术醇(Curcmol)，又名莪黄醇、姜黄环氧醇，为具有半缩酮的氢化奥类化合物，由五元环和七元环并合而成，其中的七元环通过半缩酮的氧桥又形成了一个五元环和六元环，因而使得三个环的张力变小，形成了具有刚性结构的较稳定的化合物，属于倍半萜类化合物，莪术醇的化学结构式如下：

已有研究表明：50μg/mL、100μg/mL的莪术醇作用于宫颈癌CASKI细胞24h，可阻滞细胞周期于G2/M期，并诱导部分细胞凋亡。电镜下可见凋亡细胞及凋亡小体，且100μg/mL组细胞凋亡改变较50μg/mL组更明显。莪术醇能明显抑制CASKI细胞的体外增殖，且可阻滞CASKI细胞周期于G2/M期并诱导细胞凋亡。另外，莪术醇还具有抗菌、抗病毒、抗血栓、抗溃疡、抗着床、抗早孕、抗银屑、保肝及升白等作用。

可见，莪术醇是一种很好的天然产物，但其也存在着一些缺点：

1、莪术醇的水溶性极差，其在水中的溶解度仅为0.3％，极大地限制了实验研究和临床使用；

2、莪术醇的抗肿瘤效果与传统抗肿瘤化疗药物比还是有一定差距；

3、局部注射，疼痛感较重；

4、抗肿瘤的种类存在局限性。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提出一种莪术醇衍生物及其制备方法和应用，以提高莪术醇衍生物的水溶性、脂溶性和稳定性。

基于上述目的，本发明提供的莪术醇衍生物的结构式如下：

本发明还提供一种上述莪术醇衍生物的制备方法，包括以下步骤：

以莪术醇与甘油为原料，先利用莪术醇与琥珀酸酐反应生成第一中间体，甘油与叔丁基二甲基硅氯烷反应生成第二中间体，再将第一中间体和第二中间体反应生成第三中间体，最后第三中间体脱保护反应得到目标化合物莪术醇衍生物。

在本发明的一些实施例中，所述莪术醇衍生物的制备方法包括以下步骤：

将琥珀酸酐和4-二甲氨基吡啶加入到莪术醇中，于50～80℃条件下回流反应，得到第一中间体

以甘油原料，以叔丁基二甲基硅氯烷作为保护基团，反应得到第二中间体

将第一中间体溶解于三氯甲烷中，然后加入第二中间体、二甲氨基吡啶和碳化二亚胺，反应后得到第三中间体

在氮气保护下，将四氢呋喃溶解到第三中间体中，然后滴加四丁基氟化铵，反应后得到莪术醇衍生物。

在本发明的一些实施例中，所述第二中间体的制备过程包括以下步骤：

将甘油和咪唑混合，在氮气保护下加入四氢呋喃和叔丁基二甲基硅氯烷，-5～5℃条件下反应，得到第二中间体

本发明还提供一种莪术醇衍生物纳米粒子，包括上述莪术醇衍生物。

本发明还提供一种药物组合物，包括上述莪术醇衍生物和药用载体。

本发明还提供一种上述莪术醇衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明还提供一种上述莪术醇衍生物在制备抗菌、抗病毒、抗血栓、抗溃疡、抗着床、抗早孕、抗银屑、保肝或者升白药物中的应用。

从上面所述可以看出，本发明以莪术醇与甘油为原料，保留莪术醇的结构骨架，对莪术醇8位上的羟基基团进行修饰，合成了新型的具有抗癌、抗菌、抗病毒等作用的莪术醇衍生物，合成方法简便，产物纯度高。与莪术醇比较而言，本发明提供的莪术醇衍生物具有以下优点：1、较好的水溶性与脂溶性；2、稳定性高。3、高效低毒。进一步地，与本发明合成的莪术醇衍生物相比较而言，本发明提供的莪术醇衍生物纳米粒子具有以下优点：1、持续释放的特性；2、生物利用度高。

附图说明

图1为本发明实施例的莪术醇衍生物纳米粒子的体外释放曲线图；

图2为本发明实施例的莪术醇衍生物纳米粒子透射电子显微镜；

图3为本发明实施例的莪术醇衍生物纳米粒子的粒径分布图；

图4为本发明实施例的各样品的UPLC色谱图；

图5为本发明实施例的Cur-NS与Cur在大鼠体内的药-时曲线图；

图6为莪术醇及本发明的莪术醇衍生物的体外抗肿瘤活性测试结果。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。

本发明提供的莪术醇衍生物的结构式如下：

本发明还提供一种制备上述莪术醇衍生物的方法，包括：以莪术醇与甘油为原料，先利用莪术醇与琥珀酸酐反应生成第一中间体A1，甘油与叔丁基二甲基硅氯烷(TBSCl)反应生成第二中间体A2，再将第一中间体A1和第二中间体A2反应生成第三中间体A3，最后第三中间体A3脱保护反应得到目标化合物莪术醇衍生物。

具体地，所述莪术醇衍生物的合成路线如下：

1、第一中间体A1的合成反应

2、第二中间体A2的合成反应

3、第三中间体A3的合成反应

4、目标化合物莪术醇衍生物的合成反应

可见，本发明根据莪术醇结构特性，选择叔丁基二甲基硅氯烷作为保护基团得到第二中间体，合成第三中间体时选用二甲氨基吡啶和碳化二亚胺，本发明提供的莪术醇的制备方法具有合成方法简便，产物纯度高的优点。

实施例1

1、制备第一中间体A1

取22.5mg莪术醇(1N)于圆底烧瓶中，加入3ml过夜干燥氯仿搅拌溶解，分别加入27.3mg琥珀酸酐(3N)，2.2mg 4-二甲氨基吡啶(即DMAP，0.2N)，于65℃下回流，每间隔1.5h加入1.1mg 4-二甲氨基吡啶，TLC检测至原料反应完全，冷却至室温，浓缩溶液，用石油醚-乙酸乙酯体积比15:1进行硅胶柱层析分离产物，得到淡黄色油状物9.76mg，其为第一中间体A1，收率为19.6％。

分子式为C₁₉H₂₈O₅，HR-ESI-MS m/z:359.7500[M+Na]⁺。

¹H-NMR(600MHz,CDCl₃)δ:4.86(2H,s,H-14),2.66～2.62(4H,m,H-1′,2′),2.52(1H,d,J＝15.0Hz,H-9b),2.34(1H,m,H-9a),2.18(1H,t,J＝9.0,10.8Hz,H-1),2.14(1H,t,J＝12.6,12.6Hz,H-6b),1.94(1H,m,H-3b),1.88(1H,m,H-4),1.78(1H,m,H-11),1.67(2H,m,H-2),1.63(1H,m,H-7),1.49(1H,m,H-3a),1.28(1H,dd,J＝6.6,12.6Hz,H-6a),1.00(3H,d,J＝6.6Hz,H-12),0.94(3H,d,J＝6.6Hz,H-15),0.86(3H,d,J＝6.6Hz,H-13)；¹³C-NMR(150MHz,CDCl₃)δ:176.7,169.5,144.5,113.3,109.4,89.8,54.6,51.6,39.5,36.9,33.5,30.9,30.4,29.4,28.6,28.4,22.9,21.4,12.3。

2、制备第二中间体A2

取200mg甘油(1N)、290mg咪唑(2N)于50ml圆底烧瓶中，氮气保护，加入10ml四氢呋喃(THF)搅拌溶解，将633ml叔丁基二甲基硅氯烷(即TBSCl，2N)溶于3ml四氢呋喃中，0℃下缓慢滴加至反应TLC检测原料反应完全，用1ml蒸馏水焠灭，乙酸乙酯萃取，将有机相用无水Na₂SO₄干燥，过滤，浓缩，用石油醚-乙酸乙酯体积比50:1进行硅胶柱层析分离产物得到无色油状物518.12mg，其为第二中间体化合物A2，收率为60.2％。

分子式为C₁₅H₃₆O₃Si₂，HR-ESI-MS m/z:343.3333[M+Na]⁺。

¹H-NMR(600MHz,CDCl₃)δ:3.63～3.65(5H,m),2.46(1H,d,J＝5.4Hz),0.89(18H,s),0.06(12H,s),¹³C-NMR(150MHz,CDCl₃)δ:71.96,63.55(C×2),25.99(C×6),18.49(C×2),-5.30(C×4)。

3、制备第三中间体A3

取7.886mg第一中间体A1(1N)于10ml圆底烧瓶中，加入3ml无水二氯甲烷(DCM)搅拌溶解，分别加入12.7mg第二中间体A2(1.2N)、0.57mg 4-二甲氨基吡啶(即DMAP，0.2N)和5.39mg碳化二亚胺(即EDCI，1.2N)，室温下反应，TLC检测反应进度，至反应结束，浓缩溶液，用石油醚-乙酸乙酯体积比100:1进行硅胶柱层析分离产物，淡黄色油状物9.92mg，其为第三中间体A3，收率为48.2％。

分子式为C₃₄H₆₂O₇Si₂，HR-ESI-MS m/z：661.5833[M+Na]⁺。

¹H-NMR(600MHz,CDCl₃)δ:4.86(2H,s,H-14),3.69～3.76(5H,m,H-3′,H-4′,4″),2.66～2.61(4H,m,H-1′,2′),2.51(1H,d,J＝14.4Hz,H-9b),2.30(1H,m,H-9a),2.18(1H,t,J＝9.0,10.8Hz,H-1),2.12(1H,t,J＝12.6,12.6Hz,H-6b),1.93(1H,m,H-3b),1.89(1H,m,H-4),1.78(1H,m,H-11),1.71(2H,m,H-2),1.65(1H,m,H-7),1.49(1H,m,H-3a),1.28(1H,dd,J＝6.6,12.6Hz,H-6a),1.00(3H,d,J＝6.6Hz,H-12),0.94(3H,d,J＝6.6Hz,H-15),0.87(18H,m,H-6,7′,8′,6″,7″,8″),0.85(3H,d,J＝6.6Hz,H-13),0.04(12H,m,H-5′,9′,5″,9″)；¹³C-NMR(150MHz,CDCl₃)δ:171.9,169.5,144.6,113.2,109.3,89.8,75.2,61.2(C×2),54.6,51.8,39.5,36.8,33.5,30.9,30.7,29.2,28.4,28.4,25.9(C×6),22.9,21.5,18.3(C×2),12.3,-5.2(C×4)。

4、目标化合物A4

取22mg第三中间体A3(1N)于10ml圆底烧瓶中，氮气保护，加入4ml四氢呋喃(THF)搅拌溶解，缓慢滴加29μL四丁基氟化铵(TBAF)，室温下反应，TLC检测反应进度，至反应结束，用5ml蒸馏水焠灭，饱和NaCl洗脱，乙酸乙酯萃取，将有机相用无水Na₂SO₄干燥，过滤，浓缩，用石油醚-乙酸乙酯体积比1.5:1进行硅胶柱层析分离产物，得到淡黄色油状物7.23mg，其为目标化合物A4，即莪术醇衍生物，收率为32.8％。

分子式为C₂₂H₃₄O₇，HR-ESI-MS m/z：433.5833[M+Na]⁺。

¹H-NMR(600MHz,CDCl₃)δ:4.87(2H,s,H-14),4.09～4.24(5H,m,H-3′,4′4″),2.65～2.61(4H,m,H-1′,2′),2.52(1H,d,J＝15Hz,H-9b),2.33(1H,m,H-9a),2.18(1H,t,J＝9.0,10.8Hz,H-1),2.15(1H,t,J＝12.6,12.6Hz,H-6b),1.93(1H,m,H-3b),1.91(1H,m,H-4),1.78(1H,m,H-11),1.69(2H,m,H-2),1.65(1H,m,H-7),1.49(1H,m,H-3a),1.15(1H,dd,J＝6.6,12.6Hz,H-6a),0.99(3H,d,J＝6.6Hz,H-12),0.93(3H,d,J＝6.6Hz,H-15),0.85(3H,d,J＝6.6Hz,H-13)；¹³C-NMR(150MHz,CDCl₃)δ:172.4,169.9,144.1,113.4,109.5,90.0,75.6,65.7,63.2,54.5,51.6,39.3,36.8,33.4,30.8,30.6,29.1,28.3,28.3,22.8,21.4,12.1。

实施例2

1、制备第一中间体A1

取22.5mg莪术醇(1N)于圆底烧瓶中，加入3ml过夜干燥氯仿搅拌溶解，分别加入27.3mg琥珀酸酐(3N)，2.2mg 4-二甲氨基吡啶(即DMAP，0.2N)，于70℃下回流，每间隔1.0h加入1.1mg 4-二甲氨基吡啶，TLC检测至原料反应完全，冷却至室温，浓缩溶液，用石油醚-乙酸乙酯体积比10:1进行硅胶柱层析分离产物，得到淡黄色油状物9.76mg，其为第一中间体A1，收率为19.6％。

2、制备第二中间体A2

取200mg甘油(1N)、290mg咪唑(2N)于50ml圆底烧瓶中，氮气保护，加入10ml四氢呋喃(THF)搅拌溶解，将633ml叔丁基二甲基硅氯烷(即TBSCl，2N)溶于3ml四氢呋喃中，0℃下缓慢滴加至反应TLC检测原料反应完全，用1.5ml蒸馏水焠灭，乙酸乙酯萃取，将有机相用无水Na₂SO₄干燥，过滤，浓缩，用石油醚-乙酸乙酯体积比40:1进行硅胶柱层析分离产物得到无色油状物518.12mg，其为第二中间体化合物A2，收率为60.2％。

3、制备第三中间体A3

取7.886mg第一中间体A1(1N)于10ml圆底烧瓶中，加入3ml无水二氯甲烷(DCM)搅拌溶解，分别加入12.7mg第二中间体A2(1.2N)、0.57mg 4-二甲氨基吡啶(即DMAP，0.2N)和5.39mg碳化二亚胺(即EDCI，1.2N)，室温下反应，TLC检测反应进度，至反应结束，浓缩溶液，用石油醚-乙酸乙酯体积比70:1进行硅胶柱层析分离产物，淡黄色油状物9.92mg，其为第三中间体A3，收率为48.2％。

4、目标化合物A4

取22mg第三中间体A3(1N)于10ml圆底烧瓶中，氮气保护，加入4ml四氢呋喃(THF)搅拌溶解，缓慢滴加29μL四丁基氟化铵(TBAF)，室温下反应，TLC检测反应进度，至反应结束，用5ml蒸馏水焠灭，饱和NaCl洗脱，乙酸乙酯萃取，将有机相用无水Na₂SO₄干燥，过滤，浓缩，用石油醚-乙酸乙酯体积比1:1进行硅胶柱层析分离产物，得到淡黄色油状物7.23mg，其为目标化合物A4，即莪术醇衍生物，收率为32.8％。

实施例3

1、制备第一中间体A1

取1.550g莪术醇(1N)于圆底烧瓶中，加入10ml过夜干燥氯仿搅拌溶解，分别加入1.881g琥珀酸酐(3N)，151.56mg 4-二甲氨基吡啶(即DMAP，0.2N)，于65℃下回流，每间隔1.5h加入75.78mg 4-二甲氨基吡啶，TLC检测至原料反应完全，冷却至室温，浓缩溶液，用石油醚-乙酸乙酯体积比15:1进行硅胶柱层析分离产物，得到淡黄色油状物655.32mg，其为第一中间体A1，收率为19.1％。

2、制备第二中间体A2

取500mg甘油(1N)、725mg咪唑(2N)于100ml圆底烧瓶中，氮气保护，加入15ml四氢呋喃(THF)搅拌溶解，将1.583L叔丁基二甲基硅氯烷(即TBSCl，2N)溶于8ml四氢呋喃中，0℃下缓慢滴加至反应TLC检测原料反应完全，用5ml蒸馏水焠灭，乙酸乙酯萃取，将有机相用无水Na₂SO₄干燥，过滤，浓缩，用石油醚-乙酸乙酯体积比50:1进行硅胶柱层析分离产物得到无色油状物1.295g，其为第二中间体化合物A2，收率为60.2％。

3、制备第三中间体A3

取640mg第一中间体A1(1N)于50ml圆底烧瓶中，加入20ml无水二氯甲烷(DCM)搅拌溶解，分别加入1.031g第二中间体A2(1.2N)、46.26mg 4-二甲氨基吡啶(即DMAP，0.2N)和437.43mg碳化二亚胺(即EDCI，1.2N)，室温下反应，TLC检测反应进度，至反应结束，浓缩溶液，用石油醚-乙酸乙酯体积比100:1进行硅胶柱层析分离产物，淡黄色油状物788.71mg，其为第三中间体A3，收率为47.2％。

4、目标化合物A4

取780mg第三中间体A3(1N)于50ml圆底烧瓶中，氮气保护，加入10ml四氢呋喃(THF)搅拌溶解，缓慢滴加1.028ml四丁基氟化铵(TBAF)，室温下反应，TLC检测反应进度，至反应结束，用10ml蒸馏水焠灭，饱和NaCl洗脱，乙酸乙酯萃取，将有机相用无水Na₂SO₄干燥，过滤，浓缩，用石油醚-乙酸乙酯体积比1.5:1进行硅胶柱层析分离产物，得到淡黄色油状物241.02mg，其为目标化合物A4，即莪术醇衍生物，收率为30.9％。

试验一：质量浓度线性关系

1、色谱条件

ACQUITY UPLC:emoji:BEH C18色谱柱(2.1×100mm，1.7μm)；流动相：甲醇-水＝70％-30％；流速：0.2mL·min^-1；PDA(光电二极管矩阵)检测器，Empower 3工作站，自动进样；柱温：30℃；样品温度：10℃；检测波长：210nm；进样量10μL。

2、标准曲线的制备

称取莪术醇衍生物10.37mg置于50mL容量瓶中，加甲醇适量，超声使溶解，冷却到室温，加甲醇定容至刻度，摇匀，得到质量浓度为0.2074mg·mL^-1的贮备液。量取0.05，0.5，1，2，3，4，5mL母液，置于10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，得到质量浓度分别为0.001037，0.01037，0.02074，0.04148，0.06222，0.08296，0.1037mg·mL^-1的标准系列溶液，分别吸取各标准系列溶液10μL注入UPLC，记录峰面积。以对照品溶液的峰面积(Y)对质量浓度(X，mg·mL^-1)进行线性回归，回归方程为：Y＝7803261.0272X+3322.3851，R＝0.9996，表明莪术醇衍生物在0.001037～0.1037mg·mL^-1范围内峰面积与质量浓度线性关系良好。

试验二：溶解度的测定

量取蒸馏水2mL加入具塞离心管中，加入过量的莪术醇衍生物，置于恒温水浴摇床中，37℃下振摇72h，达到萃取平衡，10000r·min^-1离心10min，静止后，精密吸取上清液100μL用甲醇稀释至2mL上清液，采用UPLC法测定莪术醇衍生物在蒸馏水中的浓度，进样，记录峰面积。按照外标法以峰面积计算莪术醇衍生物在蒸馏水中的浓度。据报道，莪术醇在蒸馏水中的溶解度仅为0.3％，由结果可知，本发明提供的莪术醇衍生物在37℃下，水中的溶解度为0.04360mg·mL^-1，明显提高了莪术醇的水溶性。

试验三：表观油水分配系数的测定

称取1.5mg莪术醇衍生物置于5mL量瓶中，用经水饱和的正辛醇溶解并定容，制成约0.3mg·mL^-1的溶液。精密量取该溶液200μL置于具塞离心管中，加入经正辛醇饱和的水1.8mL，于37℃下振摇72h，是萃取达到平衡，10000r·min^-1离心10min，静置后，精密吸取油相100μL用甲醇稀释至2mL，采用UPLC法测定萃取前后油相中的莪术醇衍生物的浓度，并计算表观油水分配系数。药物能穿过脂质膜的条件是：-1<log P_app<2，由结果可知，本发明提供的莪术醇衍生物在37℃下，纯水中的表观油水分配系数log P_app为1.250，具有很好的脂溶性。

试验四：稳定性考察

测定莪术醇衍生物分别在温度40℃、相对湿度75％及光照4000±500LX条件下的含量变化，结果表明莪术醇衍生物在5天内稳定性良好。

试验五：莪术醇衍生物纳米粒子的性能研究

1、莪术醇衍生物纳米粒子的制备

称量莪术醇衍生物5mg，并溶解于0.2mL甲醇中，待完全溶解后，在超声的条件下，将莪术醇衍生物的甲醇溶液用注射器缓慢注入5mL的去离子水中，通过超声波的作用乳化，形成水包油乳液，于通风橱内常压下搅拌至完全除去有机溶剂，冷冻干燥，4℃保存。

2、莪术醇衍生物纳米粒子的体外释放特性研究

在透析袋中加入1mL莪术醇衍生物纳米乳，扎紧，分为两组，一组投入50mL PBS释放介质，另一组投入50mL纯水释放介质，37℃体外培养，定时取样1mL，并补充等体积释放介质。UPLC分别检测各时间点的峰面积，在由上述“标准曲线”公式计算药物质量浓度，计算累计释放率。体外释放累积释放率计算公式如下：

式中：CRP(Cumulative Release Percentage)—莪术醇衍生物纳米粒子的累计释放率；V_e—释放介质(PBS，pH＝7.4)的置换体积，V_e＝1mL；V₀—释放介质的体积，V₀＝50mL；C_i—第i次置换取样时释放液中莪术醇衍生物纳米粒子的浓度(mg·mL^-1)；M_PTX—纳米粒子中莪术醇衍生物的质量(mg)；n：取样次数。

得到莪术醇衍生物纳米粒子的体外释放曲线图，如图1所示，莪术醇衍生物纳米粒子PBS中明显高于水中的累积释放率。这一试验结果证明莪术醇衍生物纳米粒子具有持续释放的特性。

3、透射电子显微镜观察莪术醇衍生物纳米粒子

如图2所示，通过透射电子显微镜观察，莪术醇衍生物的纳米粒子呈圆球状结构，粒径在200nm左右。并在不同时间点测室温与4℃下其粒径，结果表明，其形态稳定，无明显变化。

4、莪术醇衍生物纳米粒子粒度的测定

如图3所示，通过Zetasizer Nano ZS型粒度仪测定莪术醇衍生物纳米粒子粒径为162.6±2.12多分散系数PDI为:0.182，Zeta电位为：-24.6mv。

试验六：莪术醇衍生物及其纳米粒子的药代动力学研究

1、莪术醇衍生物标准溶液的制备

称取2.5mg莪术醇衍生物，置于100mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，其质量浓度为25mg·L^-1的储备液。量取1mL其储备液用甲醇定容至25mL容量瓶，摇匀，得质量浓度为1mg·L^-1，将该对照品溶液用甲醇进行一系列稀释得到质量浓度分别为0.5，1，2，4，8，16，32，64，128μg·L^-1；称取2mg五味子甲素，置于100mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，得质量浓度为20mg·L^-1的储备液。量取1mL置于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得质量浓度为2mg·L^-1的五味子甲素溶液。再将其溶液稀释得质量浓度为200μg·L^-1的内标溶液。将所配置溶液置于4℃冰箱保存。

2、莪术醇衍生物纳米粒子药液的给药方法

Wistar雄性大鼠6只，禁食不禁水12h，按照10mg·kg^-1的剂量，灌胃给予莪术醇衍生物纳米粒子药液，为实验组。于灌胃后15min，30min，1h，2h，3h，6h，9h，12h，24h眼眶后静脉丛取血0.5mL，置预先肝素化的1.5mL离心管中，3000r·min^-1，离心10min，吸取上层血浆，置于-20℃冰箱保存，测定前37℃水浴解冻。

3、莪术醇衍生物药液的给药方法

Wistar雄性大鼠6只，禁食不禁水12h，按照10mg·kg^-1的剂量，灌胃给予莪术醇衍生物药液，为对照组。于灌胃后15min，30min，1h，2h，3h，6h，9h，12h，24h眼眶后静脉丛取血0.5mL，置预先肝素化的1.5mL离心管中，3000r·min^-1，离心10min，吸取上层血浆，置于-20℃冰箱保存，测定前37℃水浴解冻。

4、血浆样品处理

量取大鼠血浆样品100μL置于2.5mL具塞离心管中，加100μL内标溶液(200μg·L^-1的五味子甲素溶液)及300μL甲醇，涡旋混合2min沉淀蛋白，8000r·min^-1离心10min。取上清液于另一具塞离心管中，35℃氮气吹干，残渣用100μL甲醇复溶，过0.22μm的微孔滤膜过滤，进UPLC分析。

5、色谱条件

ACQUITY UPLC:emoji:BEH C18色谱柱(2.1×50mm，1.7μm)；流动相：乙腈-水＝55％-45％；流速：0.2mL·min^-1；PDA(光电二极管矩阵)检测器，Empower 3工作站，自动进样；柱温：30℃；样品温度：10℃；检测波长：210nm；进样量10μL。

6、工作曲线制备

取大鼠空白血浆200μL，加入100μL内标溶液，分别加入100μL不同质量浓度的对照品溶液(0.5，1，2，4，8，16，32，64，128μg·L^-1)振摇混合，按上述“血浆样品处理”操作，建立标准曲线，以待测物质量浓度为横坐标，待测物与内标物的色谱峰面积比值为纵坐标，线性回归方程为Y＝0.0078X-0.0002，R＝0.9979，在0.5～128μg·L^-1线性关系良好，最低检测线为0.5μg·L^-1。

7、方法专属性考察

取空白大鼠血浆100μL，不加入内标溶液，按上述“血浆样品处理”操作，获得空白血浆样品色谱图；加入100μL内标溶液(200μg·L^-1的五味子甲素溶液)于100μL空白大鼠血浆中，按上述“血浆样品处理”操作，获得含内标的色谱图；加入100μL莪术醇衍生物对照品溶液(质量浓度为1mg·L^-1)于100μL空白大鼠血浆中，按上述“血浆样品处理”操作，获得含样品的色谱图；分别加入100μL内标溶液与100μL莪术醇衍生物对照品溶液于100μL空白大鼠血浆中，按上述“血浆样品处理”操作，获得相应的色谱图，见图4。

其中，图4a为空白血浆的UPLC色谱图，图4b为空白血浆+莪术醇衍生物的UPLC色谱图，图4c为空白血浆+内标的UPLC色谱图，图4d为空白血浆+莪术醇衍生物+内标的UPLC色谱图，图4e为大鼠灌胃以10mg·kg^-1的Cur-NS药液后2h的血浆样品的UPLC色谱图。结果表明内标与检测样品不受血浆中的内源性物质的影响。

8、精密度和准确度试验

取100μL空白大鼠血浆，加入高、中、低质量浓度(40，20，10μg·L^-1)的对照品溶液按上述“血浆样品处理“操作，每个质量浓度的样品分别进样6次分析，连续测定3天，采用UPLC进行测定莪术醇衍生物的准确度与精密度。结果表明莪术醇衍生物的准确度与精密度良好。见表1。

表1莪术醇衍生物血药浓度测定的准确度与精密度(n＝6)

9、回收率试验

取100μL空白大鼠血浆，加入高、中、低质量浓度(40，20，10μg·L^-1)的对照品溶液按上述“血浆样品处理”操作，同时另取100μL空白大鼠血浆，按照“血浆样品处理”操作，再加入高、中、低质量浓度(40，20，10μg·L^-1)的对照品溶液，对每个质量浓度样品进行3样本分析，获得相应色谱峰面积，计算其回收率。结果表明莪术醇衍生物的血浆药物浓度在40，20，10μg·L^-1时的回收率分别为95.73，92.87，96.51，回收率良好。见表2

表2莪术醇衍生物血药浓度测定的回收率

质量浓度/μg·L^-1	回收率％	RSD％
			40	95.73±2.65	2.77
20	92.87±1.22	1.31
			10	96.51±3.00	3.11

10、稳定性考察

取100μL空白大鼠血浆，加入高、中、低质量浓度(40，20，10μg·L^-1)的对照品溶液按上述“血浆样品处理”操作，每个质量浓度的样品分别进样3次分析，分别将血浆样品放置室温3h，-20℃放置30d，将反复冻融3次的血浆样品放置2h进UPLC分析其稳定性。

结果表明，莪术醇衍生物的血浆样品，在室温下放置5h，-20℃放置30d，经历3次反复冻融的血浆样品放置2h后稳定性，结果表明莪术醇衍生物的血浆样品分别在放置室温3h，-20℃放置30d，将反复冻融3次的血浆样品放置2h后稳定。见表3。

表3大鼠血浆中莪术醇衍生物在不同贮存条件下的稳定性

11、药动学参数的测定

测得大鼠灌胃以10mg·kg^-1的剂量给药量绘制平均血药浓度-时间曲线(图5)。利用Winonlin 6.3药动学程序对实验所得血药浓度-时间数据进行处理，即得Cur-NS(莪术醇衍生物纳米粒子)与Cur(莪术醇衍生物)药动学参数(表4)。

表4 Cur-NS与Cur在大鼠体内的药动学参数

大鼠体内药代动力学实验结果表明：口服给药Cur-NS后，药-时曲线下的AUC_(0-t)的面积为273.9621μg·h·L^-1，是Cur原料药的4.67倍，且Cmax也明显增高，说明口服给药Cur-NS与Cur原料药相比，Cur-NS明显提高了药物的口服生物利用度，促进了药物的吸收。

试验七：莪术醇及其衍生物的生物学活性研究

体外抗肿瘤活性测试

活性测试MTT法对数生长期细胞培养于96孔培养板内，每孔100μL(含5000～6000个肿瘤细胞：Hela cell和HepG2cell)，置37℃，5％CO₂温箱中培养。次日，给药组加入含有不同浓度的化合物，每种细胞设4～5个剂量组，每组至少设三个平行孔。对照组加入与给药组等体积的溶剂。置37℃，5％CO₂温箱中培养。48h后弃培养液，每孔加20μL 5mg/mL MTT溶液(培养基配制)。37℃孵育4h，弃上清液，每孔加入DMSO 150μL溶解甲簪颗粒，轻度振荡溶解。用酶标仪，在参考波长450nm，检测波长570nm条件下测定光密度值(OD)，以溶剂对照处理的细胞为对照组，用下面公式计算药物对细胞的抑制率，并计算抑制率，根据计算得到的各浓度的抑制率通过Logit方法计算得到半数抑制浓度(IC50)，重复测试3次，取平均值为最终结果。如图6所示，结果显示在HepG2cell(A)和Hela cell(B)上，莪术醇衍生物均表现出优于莪术醇的抗肿瘤活性。

由此可见，本发明以莪术醇与甘油为原料，保留莪术醇的结构骨架，对莪术醇8位上的羟基基团进行修饰，合成了新型的具有抗癌、抗菌、抗病毒等作用的莪术醇衍生物，合成方法简便，产物纯度高。与莪术醇比较而言，本发明提供的莪术醇衍生物具有以下优点：1、较好的水溶性与脂溶性；2、稳定性高；3、优于莪术醇的抗肿瘤活性。进一步地，与本发明合成的莪术醇衍生物相比较而言，本发明提供的莪术醇衍生物纳米粒子具有以下优点：1、持续释放的特性；2、生物利用度高。

所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种莪术醇衍生物，其特征在于，结构式如下：

2.一种如权利要求1所述的莪术醇衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的莪术醇衍生物的的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的莪术醇衍生物的的制备方法，其特征在于，所述第二中间体的制备过程包括以下步骤：

5.一种药物组合物，其特征在于，包括根据权利要求1所述的莪术醇衍生物和药用载体。

6.一种根据权利要求1所述的莪术醇衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。

7.一种根据权利要求1所述的莪术醇衍生物在制备抗菌、抗病毒、抗血栓、抗溃疡、抗着床、抗早孕、抗银屑、保肝或者升白药物中的应用。