CN109748891B

CN109748891B - 多西他赛衍生物和其药物组合物与用途

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Publication number: CN109748891B
Application number: CN201811270679.0A
Authority: CN
Inventors: 方唯硕; 马运涛
Original assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Current assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Priority date: 2017-11-01
Filing date: 2018-10-29
Publication date: 2023-07-28
Anticipated expiration: 2038-10-29
Also published as: CN109748891A

Abstract

本发明公开了如通式(Ⅰ)所示的多西他赛衍生物及其药学上可接受的盐，含有这类化合物的组合物，以及这类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，尤其是在制备抗耐药肿瘤药物中的应用。

Description

多西他赛衍生物和其药物组合物与用途

技术领域

背景技术

四环二萜类的紫杉烷类化合物，自1960年的紫杉醇首次分离至今，依然是生物学和化学领域关注的研究内容。1979年，Susan Horwitz报道了紫杉醇的作用机理，揭示了紫杉醇的靶点是微管，结合位点命名为紫杉醇结合位点。作为一类微管稳定剂，紫杉醇在临床上对多种肿瘤细胞株表现出强效的抑制活性，1992年，获得FDA的批准上市，其结构如下：

紫杉醇类似物多西他赛，肿瘤抑制活性明显高于紫杉醇，于1998年获FDA批准上市，其结构如下：

尽管紫杉醇和多西他赛作为抗癌药有较好的疗效，但长期使用易产生耐药性，目前已有多种肿瘤细胞株对紫杉醇和多西他赛产生耐药性，使它们的疗效极大下降。紫杉烷类药物水溶性差，常用聚氧乙基蓖麻油助溶，易致过敏。因此，需要研制新的化学治疗剂，能够对P糖蛋白和(或)β-Ⅲ微管蛋白过表达介导的耐药有效，并能改善水溶性。

发明内容

本发明要解决的一个技术问题是提供一种针对P糖蛋白和β-Ⅲ微管蛋白过表达介导的耐药肿瘤细胞有效的新的多西他赛衍生物及其药学上可接受的盐。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种药物组合物，其中包括作为活性成分的通式(Ⅰ)的化合物及其药学上可接受的盐，和药学上可接受的载体。

本发明要解决的又一个技术问题是提供一种新的多西他赛衍生物及其药学上可接受的盐，和其组合物作为抗肿瘤剂的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案，

具体地讲，本发明涉及的多西他赛衍生物及其药学上可接受的盐如通式(Ⅰ)所示

其特征在于，

R选自取代的C_1-15直链烷基，取代的C_2-15链烯基，取代的C_2-15炔基；

R优选取代的C_1-10直链烷基，取代的C_2-10烯基，取代的C_2-10炔基；

R更优选取代的C_1-6直链烷基，取代的C_2-6烯基，取代的C_2-6炔基；

所述直链烷基、烯基、炔基上的取代基选自羟基，氨基，羧基，C_1-5烷氧基，氯，溴或碘；

最优选的R选自取代的乙基，取代的丙基，取代的正丁基；

取代的丙烯基，取代的异丙烯基，取代的丁烯基，取代的异丁烯基，取代的己烯基；

取代的丙炔基，取代的异丙炔基，取代的丁炔基，取代的异丁炔基，取代的己炔基；

文中所用符号和术语的含义是：

“Bz”指苯甲酰基；“Ph”指苯基；“Ac”指乙酰基；“Me”指甲基；“Et”指乙基；“R”除另外定义外一般是指烷基；“TES”指三乙基硅烷基；“TBS”指叔丁基二甲基硅烷基；“TIPS”指三异丙基硅烷基；“t-BuO”指叔丁氧基；“DMAP”指4-二甲氨基吡啶；“DMF”指N,N-二甲基甲酰胺；“THF”指四氢呋喃；“DCM”指二氯甲烷；“ACN”指乙腈；“CAN”指硝酸铈氨；“Boc”指叔丁氧羰酰基；“TEA”指三乙胺；“DIEA”指N,N-二异丙基乙基胺；“Im”指咪唑；“LHMDS”指六甲基二硅基胺基锂；“n-BuLi”指正丁基锂；“NMO”指N-甲基吗啉-N-氧化物；“PCC”指氯铬酸吡啶鎓盐；“PDC”指重铬酸吡啶鎓盐；“PMP”指对甲氧基苯基；“Py”指吡啶；“Ts”指对甲苯磺酰基；“DTBMP”指2,6-二叔丁基-4-甲基吡啶；“TMEDA”指四甲基乙二胺；“rt”指室温；

本发明还涉及以本发明化合物作为活性成分的药物组合物。该药物组合物可根据本领域公知的方法制备。可通过将本发明化合物与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂和/或辅剂结合，制成适于人或动物使用的任何剂型。本发明化合物在其药物组合物中的含量通常为0.1-95重量％。

本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔黏膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括o/w型、w/o型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括输液、粉针剂和水针剂)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括软降囊、硬胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。

本发明化合物可以制成普通制剂，也可以制成是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。

为了将本发明化合物制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是水、乙醇、异丙醇等；黏合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。

还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片或双层片和多层片。

为了将给药单元制成胶囊剂，可以将有效成分本发明化合物与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备本发明化合物片剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备本发明化合物的胶囊剂。

为将本发明化合物制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二醇或它们的混合物作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、pH调节剂、渗透压调节剂。增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；pH调节剂可以是磷酸盐、醋酸盐、烟酸、氢氧化钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其他添加剂。

按照本发明，发现通式(Ⅰ)化合物在药理筛选中显示显著的生物活性，是有价值的抗肿瘤剂。可用于抑制包括人在内的动物体内肿瘤的生长。

本发明的化合物经过体内外药理实验(包括微管亲和常数测定，细胞毒活性测试和动物肿瘤模型体内活性测试)、药代动力学性质研究和水溶性测定，发现本发明的多西他赛衍生物水溶性得到很大程度的改善，均优于多西他赛(是紫杉醇的46-91倍)。分子水平上，部分化合物的微管结合能力优于多西他赛，尽管细胞水平的药理活性弱于多西他赛，但是我们选取了本系列衍生物中药理活性最强(微管结合能力是多西他赛的4.6倍)的化合物进行了动物体内药理活性筛选，结果显示，在A2780卵巢癌肿瘤模型，该化合物的肿瘤抑制活性与阳性对照药紫杉醇和多西他赛相当，而在A2780AD卵巢癌耐药肿瘤模型，显著优于紫杉醇和多西他赛。结果说明该化合物具有很强的抗耐药活性。同时水溶性是多西他赛的3.2倍，明显高于多西他赛，据药代动力学性质分析，该化合物在给药后12，24，48，72和96小时，血浆药物浓度明显高于多西他赛，体内药物累积和清除的时间明显长于多西他赛。综上，该化合物的水溶性显著高于多西他赛，同时药效和药代动力学性质明显优于多西他赛。

为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。

本发明化合物药物组合物的给药剂量依照所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的个体情况，给药途径和剂型等可以有大范围的变化。一般来讲，本发明化合物的每天的合适剂量范围为0.001-150mg/Kg体重，优选为0.1-100mg/Kg体重，更优选为1-60mg/Kg体重，最优选为2-30mg/Kg体重。上述剂量可以一个剂量单位或分成几个剂量单位给药，这取决于医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。

本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其它治疗药物或对症药物合并使用。当本发明的化合物与其它治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整它的剂量。

附图说明

图1实施例1在鼠A2780和A2780AD模型中对肿瘤的抑制活性。

图2实施例1和多西他赛在SD大鼠给药(单次10mg/kg)后的药时曲线。

具体实施方式

下面的实施例用来进一步说明本发明，但是这并不意味着对本发明的任何限制。

实施例1-2由下面反应流程制得

实施例1 3’-(3-羟基-1-丙炔基)-3’-去苯基多西他赛

步骤1：4-叔丁基二甲基硅氧基-1-羟基-2-丁炔

将1,4-丁炔二醇(10g,116mmol)溶于12.5mL DMF，加入咪唑(0.59g,8.74mmol)和TBSCl(1.05g,6.97mmol)，室温下反应过夜。加入4mL甲醇淬灭反应，加入24mL水，乙酸乙酯稀释，顺序用饱和碳酸氢钠溶液，饱和氯化钠溶液洗涤，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，柱层析(乙酸乙酯:石油醚＝1:2)，得目标产物(9.77g,70％)。

步骤2：4-叔丁基二甲基硅氧基-2-丁炔醛

将4-叔丁基二甲基硅氧基-1-羟基-2-丁炔(4.77g,23.9mmol)溶于30mL无水DCM，加入PCC(10.3g,47.8mmol)，室温反应1h，加入硅胶，反应液经短粗硅胶柱过滤，乙酸乙酯洗脱，减压浓缩，柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝10:1)，得目标产物(2.6g,55％)。

步骤3：4-甲氧基-N-(3-叔丁基二甲基硅氧基-1-丙炔亚甲基)苯胺

将4-叔丁基二甲基硅氧基-2-丁炔醛(120mg,0.61mmol)溶于1mL无水DCM，加入无水Na₂SO₄(170.4mg,1.2mmol)。将对甲氧苯胺(73.8mg,0.6mmol)溶于1mL无水DCM中，用恒压滴液漏斗滴加到反应液中，室温反应过夜，过滤，二氯甲烷洗涤，将滤液蒸干，得粗产物，直接用于下步反应。

步骤4：cis-(±)-1-(4-甲氧基苯基)-3-乙酰氧基-4-(3-叔丁基二甲基硅氧基-1-丙炔基)-2-氮杂环丁酮

将乙酰氧基乙酰氯(96.7μL,0.9mmol)溶于1mL无水DCM，加入TEA(165μL,1.08mmol)，将4-甲氧基-N-(3-叔丁基二甲基硅氧基-1-丙炔亚甲基)苯胺粗品溶于1mL无水DCM中，冰浴下用恒压滴液漏斗滴加到反应液中，室温反应过夜，乙酸乙酯稀释，顺序用饱和碳酸氢钠溶液，饱和氯化钠溶液洗涤，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，柱层析(乙酸乙酯:石油醚＝1:10)，得目标产物(90mg,37％for two steps)。

步骤5：cis-(±)-3-乙酰氧基-4-(3-叔丁基二甲基硅氧基-1-丙炔基)-2-氮杂环丁酮

将cis-(±)-1-(4-甲氧基苯基)-3-乙酰氧基-4-(3-叔丁基二甲基硅氧基-1-丙炔基)-2-氮杂环丁酮(370mg,0.92mmol)置于4mL乙腈，CAN(606mg,2.75mmol)溶于4mL水中，-15℃下在10分钟内将溶液滴加至反应液中，继续反应30分钟，补加CAN(203mg,0.92mmol)，继续反应10分钟，加入饱和NaHCO₃水溶液7mL，反应5分钟，加入饱和NaHSO₃溶液7mL，反应5分钟，加入饱和NaHCO₃水溶液调溶液pH至8～9，加入乙酸乙酯稀释，过滤，用乙酸乙酯洗涤滤渣，滤液进行萃取分层，合并滤液，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，柱层析(乙酸乙酯:石油醚＝1:3)，得目标产物(120mg,44％)。

步骤6：cis-(±)-3-乙酰氧基-4-(3-羟基-1-丙炔基)-2-氮杂环丁酮

将cis-(±)-3-乙酰氧基-4-(3-叔丁基二甲基硅氧基-1-丙炔基)-2-氮杂环丁酮(120mg,0.4mmol)溶于2mL乙腈，冰浴下加入Py(9.73mL,121mmol)和HF(5mL,121mmol),室温反应12h。乙酸乙酯稀释，顺序用饱和碳酸氢钠溶液，饱和氯化钠溶液洗涤，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，柱层析(丙酮:石油醚＝1:2)得目标产物(51mg,70％)。

步骤7：(3R,4S)-3-乙酰氧基-4-(3-羟基-1-丙炔基)-2-氮杂环丁酮

缓冲液的配置:K₂HPO₄·3H₂O(28.5g,125mmol)和KH₂PO₄(1.22g,9.00mmol)溶于250mLH₂O制备缓冲液。

肝匀浆的配置：新鲜猪肝50g和100mL缓冲液制成肝匀浆。

将cis-(±)-3-乙酰氧基-4-(3-羟基-1-丙炔基)-2-氮杂环丁酮(130mg,0.52mmol)置于反应瓶中，加入3.9mL乙醚，2.6mL缓冲液，0.3mL乙腈，磁子剧烈搅拌，使成悬浮液，加入0.65mL肝匀浆。室温反应3h。加入适量丙酮使肝液沉淀，硅藻土助滤，乙酸乙酯洗脱，滤液用饱和氯化钠溶液洗涤，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，柱层析(乙酸乙酯:石油醚＝1:2)得目标产物(24mg,19％)。

步骤8：(3R,4S)-3-叔丁基二甲基硅氧基-4-(3-叔丁基二甲基硅氧基-1-丙炔基)-2-氮杂环丁酮

将(3R,4S)-3-乙酰氧基-4-(3-羟基-1-丙炔基)-2-氮杂环丁酮(67.3mg,0.367mmol)置于5mL圆底烧瓶中，加入0.97mL无水THF，0℃下依次加入Py(60μL,0.734mmol)和pyrrolidine(60μL,0.734mmol)，室温反应18h，0℃加入Py(177μL,2.2mmol)和TBSCl(332mg,2.2mmol)，反应6h，乙酸乙酯稀释，顺序用饱和碳酸氢钠溶液，饱和氯化钠溶液洗涤，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝5.5：1)，得目标产物(20mg,15％)。

步骤9：(3R,4S)-1-叔丁氧羰酰基-3-叔丁基二甲基硅氧基-4-(3-叔丁基二甲基硅氧基-1-丙炔基)-2-氮杂环丁酮

将(3R,4S)-3-叔丁基二甲基硅氧基-4-(3-叔丁基二甲基硅氧基-1-丙炔基)-2-氮杂环丁酮(20mg,0.054mmol)溶于0.15mL无水DCM，依次加入DMAP(3mg,0.027mmol)，三乙胺(0.05mL,0.36mmol)。(Boc)₂O(23.8mg,0.108mmol)溶于0.1mLDCM滴加入反应体系，室温反应18h，乙酸乙酯稀释，顺序用饱和碳酸氢钠溶液，饱和氯化钠溶液洗涤，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝15:1)，得目标产物(18mg,71％)。

步骤10:7,10-二(三乙基硅基)-10-DAB

将10-DAB(1.82g,3.3mmol)溶于36mL无水THF，氩气保护，加入DMAP(400mg,3.3mmol)和三乙胺(8.3mL,69.4mmol)，滴加TESCl(4.5mL,26.4mmol)进入反应体系，室温反应5.5h后，10-DAB消失，溶于无水THF(1.8mL)的无水溴化锂(291mg,3.3mmol)加入，反应在65℃-70℃间回流7h，反应完全，冷却至室温，乙酸乙酯稀释，顺序用饱和碳酸氢钠溶液，饱和氯化钠溶液洗涤，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，柱层析(丙酮:石油醚＝1:7)，得目标产物(2.13g,84％)。

步骤11：3’-(3-羟基-1-丙炔基)-3’-去苯基多西他赛

将7,10-二(三乙基硅基)-10-DAB(25mg,0.0323mmol)溶于0.42mL无水THF，氩气保护，-45℃滴加LHMDS(1.0M in THF/ethylbenzene,48.5μL,0.048mmol)，20min后滴加(3R,4S)-1-叔丁氧羰酰基-3-叔丁基二甲基硅氧基-4-(3-叔丁基二甲基硅氧基-1-丙炔基)-2-氮杂环丁酮(18mg,0.039mmol)的无水THF溶液(0.1mL)，-45℃反应80min后，补加LHMDS(1.0M in THF/ethylbenzene,48.5μL,0.048mmol)，继续反应1h后加入饱和氯化铵溶液淬灭反应，乙酸乙酯萃取，顺序用饱和氯化铵溶液，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得粗产物，直接用于下一步脱保护。

将粗产物溶于1.4mL乙腈，加入Py/HF(V:V＝2：1,1.3mL,9.69mmol)，室温反应24h，乙酸乙酯稀释，顺序用饱和碳酸氢钠溶液，饱和氯化钠溶液洗涤，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，柱层析(二氯甲烷:甲醇＝25:1)，得目标产物(13.5mg，53％for twosteps)。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ1.13(s,3H,CH₃),1.21(s,3H,CH₃),1.36(s,9H,t-BuO),1.76(s,3H,CH₃),1.84-1.89(m,1H,H-6b),1.95(s,3H,CH₃),2.25-2.32(m,2H,H-14),2.41(s,3H,OAc),2.55-2.63(m,1H,H-6a),3.91(d,J＝7.0Hz,1H,H-3),4.18-4.33(m,5H,H-20,H-7,CH₂),4.44(s,1H,H-2’),4.95-4.99(m,2H,H-5,NH),5.25(s,1H,H-10),5.36(d,J＝6.5Hz,1H,H-3’),5.67(d,J＝6.5Hz,1H,H-2),6.21(t,J＝8.5Hz,1H,H-13),7.50(t,J＝8.0Hz,2H,Ar),7.61(t,J＝7.0Hz,1H,Ar),8.10(d,J＝7.5Hz,2H,Ar)；¹³C NMR(150MHz,CDCl₃)δ9.9,14.2,20.5,22.5,26.4,28.2,35.6,37.0,43.1,46.6,57.7,60.4,72.0,72.4,74.6,74.8,76.6,78.8,81.1,81.4,83.1,84.1,128.7,129.1,130.1,133.7,136.0,138.4,154.9,167.0,170.6,171.2,211.2；MS(ESI)m/z786.3(M+H)⁺,808.3(M+Na)⁺.

实施例2 3’-((反)-3-羟基-1-丙烯基)-3’-去苯基多西他赛

步骤1：(反)-4-三异丙基硅氧基-1-羟基-2-丁烯

将(反)-1,4-二羟基-2-丁烯(1.11g,12.6mmol)溶于22mL DMF，冰浴下加入TEA(1.75mL,12.6mmol)和TIPSCl(1.6mL,7.56mmol)，室温下反应24h。反应液减压浓缩，乙酸乙酯稀释，顺序用饱和碳酸氢钠溶液，饱和氯化钠溶液洗涤，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，柱层析(丙酮:石油醚＝1:10)，得目标产物(1.57g,51％)。

步骤2：(反)-4-三异丙基硅氧基-2-丁烯醛

将(反)-4-三异丙基硅氧基-1-羟基-2-丁烯(1.583g,6.5mmol)溶于22mL无水DCM，冰浴下分批加入dess-martin periodinane(2.75g,6.5mmol)，冰浴下反应20min，加入预冷的Na₂S₂O₃·5H₂O(0.1g/mL)的饱和碳酸氢钠溶液(11mL)，二氯甲烷萃取，顺序用饱和食盐水和水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝20:1)，得目标产物(1.15g,73％)。

步骤3-11：同实施例1中步骤3-11描述的方法。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ1.13(s,3H,CH₃),1.23(s,3H,CH₃),1.34(s,9H,t-BuO),1.76(s,3H,CH₃),1.83-1.88(m,1H,H-6b),1.93(s,3H,CH₃),2.25-2.35(m,2H,H-14),2.40(s,3H,OAc),2.55-2.63(m,1H,H-6a),3.92(d,J＝7.0Hz,1H,H-3),4.18-4.26(m,4H,H-20b,H-7,CH₂),4.32(d,J＝8.5Hz,1H,H-20a),4.39(d,J＝2.0Hz,1H,H-2’),4.71(br s,1H,3’NH),4.96(d,J＝8.5Hz,1H,H-5),5.07(d,J＝7.0Hz,1H,H-3’),5.24(s,1H,H-10),5.68(d,J＝7.0Hz,1H,H-2),5.81(dd,J＝15.5Hz,5.5Hz,1H,CH＝),5.91(dt,J＝15.5Hz,4.0Hz,1H,CH＝),6.22(t,J＝8.5Hz,1H,H-13),7.50(t,J＝8.0Hz,2H,Ar),7.61(t,J＝7.5Hz,1H,Ar),8.10(d,J＝7.5Hz,2H,Ar)；¹³C NMR(150MHz,CDCl₃)δ9.9,14.2,20.6,22.5,26.4,28.2,35.6,36.9,43.1,46.5,57.7,60.4,72.0,72.3,74.6,74.8,76.6,78.7,81.1,84.1,127.5,128.7,129.1,130.2,132.0,133.7,135.9,138.5,155.3,167.0,170.4,171.2,211.3；MS(ESI)m/z 810.4(M+Na)⁺.

实施例3-4由下面反应流程制得

实施例3 3’-((顺)-3-羟基-1-丙烯基)-3’-去苯基多西他赛

步骤1：3’-((顺)-3-羟基-1-丙烯基)-3’-去苯基多西他赛

将3’-(3-羟基-1-丙炔基)多西他赛(28.4mg,0.036mmol)溶于0.36mL无水甲醇，加入Lindar催化剂(Pd-CaCO3-PbOAc)(2.0mg)，氢气球充入反应，室温反应12h后，补加Lindar催化剂(Pd-CaCO3-PbOAc)(7.5mg)，继续反应12h，乙酸乙酯稀释，硅藻土助滤，乙酸乙酯洗脱，减压浓缩，柱层析(二氯甲烷:甲醇＝20:1)，得目标产物(7.1mg，25％)。

¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ1.13(s,3H,CH₃),1.22(s,3H,CH₃),1.36(s,9H,t-BuO),1.76(s,3H,CH₃),1.83-1.88(m,1H,H-6b),1.93(s,3H,CH₃),2.26-2.29(m,2H,H-14),2.38(s,3H,OAc),2.55-2.60(m,1H,H-6a),3.92(d,J＝7.2Hz,1H,H-3),4.19-4.25(m,3H,H-20b,CH₂),4.31-4.35(m,3H,H-20a,H2’,H-7),4.95(dd,J＝9.0Hz,1.2Hz,1H,H-5),5.05(m,1H,3’NH),5.23-5.25(m,2H,H-10,H-3’),5.63-5.67(m,2H,H-2,CH＝),5.90(dt,J＝10.8Hz,6.6Hz,1H,CH＝),6.20(t,J＝8.4Hz,1H,H-13),7.50(t,J＝7.8Hz,2H,Ar),7.62(t,J＝7.2Hz,1H,Ar),8.09(d,J＝7.2Hz,2H,Ar)；¹³C NMR(150MHz,CDCl₃)δ9.9,14.2,20.4,22.3,26.5,28.2,35.7,37.0,43.0,46.6,57.7,60.4,72.0,72.3,74.6,74.7,76.6,78.8,81.2,84.1,127.7,128.7,129.1,130.1,132.7,133.8,136.3,138.1,155.7,167.0,170.7,171.2,211.2；MS(ESI)C₄₀H₅₃NO₁₅m/z 810.3306(M+Na)⁺。

实施例4 3’-(3-羟基丙基)-3’-去苯基多西他赛

步骤1：3’-(3-羟基丙基)-3’-去苯基多西他赛

将3’-(3-羟基-1-丙炔基)多西他赛(28.4mg,0.036mmol)溶于0.36mL无水甲醇，加入10％Pd/C(4.2mg)，氢气球充入反应，室温反应12h后，补加10％Pd/C(15mg)，继续反应12h，乙酸乙酯稀释，硅藻土助滤，乙酸乙酯洗脱，减压浓缩，柱层析(二氯甲烷:甲醇＝20:1)，得目标产物(8.2mg，29％)。

¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ1.12(s,3H,CH₃),1.22(s,3H,CH₃),1.32(s,9H,t-BuO),1.63-1.75(m,7H,CH₂,CH₃),1.83-1.88(m,1H,H-6b),1.92(s,3H,CH₃),2.25-2.36(m,2H,H-14),2.40(s,3H,OAc),2.55-2.61(m,1H,H-6a),3.67-3.75(m,2H,CH₂),3.92(d,J＝6.6Hz,1H,H-3),4.20(d,J＝8.4Hz,1H,H-20b),4.24(dd,J＝10.8Hz,6.6Hz,1H,H-7),4.29(s,1H,H-2’),4.32(d,J＝8.4Hz,1H,H-20a),4.85(d,J＝9.6Hz,1H,3’NH),4.96(d,J＝7.8Hz,1H,H-5),5.23(s,1H,H-10),5.67(d,J＝6.6Hz,1H,H-2),6.20(t,J＝8.4Hz,1H,H-13),7.50(t,J＝7.8Hz,2H,Ar),7.61(t,J＝7.8Hz,1H,Ar),8.11(d,J＝7.2Hz,2H,Ar)；¹³C NMR(150MHz,CDCl₃)δ9.9,14.2,20.7,22.5,26.3,28.2,28.8,35.7,37.0,43.1,46.5,52.8,57.6,60.4,72.0,72.4,74.5,74.9,76.6,78.8,81.0,84.1,128.7,129.2,130.2,133.7,135.8,138.7,155.8,167.0,170.3,171.2,211.4；MS(ESI)C₄₀H₅₅NO₁₅m/z 812.3477(M+Na)⁺.

药理实验

实验例1本发明的化合物水溶性测试

采用HPLC的方法，以紫杉醇和多西他赛为对照，测定本发明化合物的水溶性。

1.1标准溶液配制和标准曲线绘制

准确称取样品，溶于色谱甲醇，配制0.5mg/mL的标准溶液。以0.5mg/mL的标准溶液，分别取500μL，100μL和10μL标准溶液，加入500μL，900μL和990μL色谱甲醇稀释，配制0.25mg/mL，0.05mg/mL和0.005mg/mL的标准溶液。每一标准溶液的浓度以HPLC的峰面积进行定量分析。分析数据，样品浓度对HPLC峰面积作图，为样品的标准曲线。对照品紫杉醇和多西他赛的标准溶液按照相同的操作配置。

1.2测试溶液配制

准确称取样品，置于水中(2mg/mL)，超声15min，配置样品的过饱和溶液。溶液离心(10000g,25℃,30min)，未溶解的样品过0.45μm微孔滤膜，配置测试溶液，测试溶液的浓度以HPLC的峰面积进行定量分析。对照品紫杉醇和多西他赛的测试溶液按照相同的操作配置。

1.3 HPLC分析条件：

流动相：55％-65％甲醇/水

色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C8 4.6*150mm

检测器：DAD 227nm

流速：1.0mL/min

进样量：10μL

1.4计算

测试溶液的浓度以HPLC的峰面积和标准溶液的标准曲线为基础进行计算。(结果列于表1中)

表1.本发明的化合物的水溶性测定结果

实验例2本发明化合物的微管结合常数测试

Flutax-2为紫杉烷类荧光探针，能够可逆结合于微管的紫杉醇位点。当其他紫杉烷加入后，由于竞争性结合而使Flutax-2与微管解离。游离Flutax-2的荧光偏振值减小，根据体系荧光偏振值的变化可以计算出游离态及结合态的Flutax-2和待测化合物的浓度。由于Flutax-2与微管的平衡结合常数已知，可以据此计算出待测化合物与微管的平衡结合常数。

2.1材料与缓冲液的配制

1)微管：参照修改的Weisenberg法由动物脑组织中提取微管蛋白，37℃交联成微管并测定其有效紫杉醇结合位点浓度。

2)Flutax-2：中国医学科学院药物研究所方唯硕课题组实验室合成，DMSO配制成10mM贮液，-20℃保存。

3)GAB缓冲液(3.4M甘油,10mM NaPi,1mM EGTA,6mM MgCl₂,0.1mM GTP,pH 6.5-6.7)：取5mL 0.2M NaPi缓冲液(pH 7.0)，加入1mL 0.1M EGTA、0.6mL1M MgCl₂、0.1mL0.1MGTP、25mL甘油，调pH到6.5-6.7，加入双蒸水定容至100mL。

4)待测化合物用DMSO溶解成10mM贮液，根据需要系列稀释后备用。

2.2仪器与设备

1)荧光偏振酶标仪：Infinite-F200，TECAN。

2)移液器，96孔黑色酶标板。

3)Magellan 6.4(酶标仪控制)，Sigma Plot 9.0(饱和百分数计算)，Equigra 5.0(Kb计算)。

2.3操作步骤

1)配制含50nM Flutax-2、50nM Sites(结合位点)的GAB溶液，分装入96孔板，200μL/孔。此外在三孔中加入50nM Flutax-2(不含Sites)作为参照，三孔中加入50nM Sites(不含Flutax-2)作为空白。

2)加入不同浓度的待测小分子。每行一种待测物，第一孔浓度为0，其余根据初步测定结果设定7-9个浓度梯度，确保最后1-2个浓度达到饱和，即全部Flutax-2处于游离态。例如对于Kb＝10⁷-10⁸M^-1的化合物，浓度梯度可设为0，10nM，50nM，100nM，200nM，500nM，1μM，5μM。在其中一列加入相应浓度的多西他赛作为阳性对照。

3)将酶标板置于酶标仪中，设定温度(如26℃)，达到设定温度后至少保温15min后在荧光偏振模式下读数，Ex＝485nm/Em＝535nm。

4)设定参照的荧光偏振值为73mP，由程序计算出各样品孔的荧光偏振值及荧光各向异性值(r)。通常当未加入竞争物时，r值为120左右；当Flutax-2完全游离时，r值为50左右。

5)运行程序SigmaPlot 9.0，得到同一种小分子不同浓度下，Flutax-2的饱和百分数。

6)运行程序Equigra 5.0，计算该温度下待测样品的Kb值。(结果列于表2中)

实验例3本发明化合物的细胞毒活性测试

取对数生长期细胞培养于96孔培养板内，每孔100μL(含1000-1200个肿瘤细胞)。次日，给药组加入含有不同浓度化合物，每药设4～5个剂量组，每组至少设三个平行孔。对照组加入与化合物等体积的溶剂。至37℃，5％CO₂温箱中培养，4天后弃去培养液，每孔加入200μL 0.2％MTT溶液(RPMI 1640配制)。37℃孵育4小时，弃去上清液，每孔加入DMSO 200μL溶解甲簪颗粒，轻度震荡后，用酶标仪，在参考波长450nm、检测波长570nm条件下测定光密度值(OD)。以溶剂对照处理的肿瘤细胞为对照组，计算药物对肿瘤细胞的抑制率，并计算IC₅₀。(结果列于表2中)

表2.本发明化合物的微管结合常数和细胞毒活性测试结果。

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HeLa为人宫颈癌细胞株，HeLa/βIII为βIII转染的人宫颈癌耐药细胞株，A2780为人卵巢癌细胞株，A2780AD为P糖蛋白过表达的人卵巢癌耐药细胞株。

实验例4本发明化合物的动物体内生物活性测试

裸鼠(6-8周，BALB/c，雌性)用于建立异体移植的肿瘤模型，即卵巢癌细胞A2780细胞(5×10⁶)或卵巢癌耐药细胞A2780AD细胞(1×10⁷)通过皮下注射的方式移植在裸鼠的背部。当肿瘤体积达到300mm³时，裸鼠随机分为五组，分别为空白组，紫杉醇(20mg/kg)，多西他赛(10mg/kg)，实施例1(10mg/kg)和实施例1(20mg/kg)，每组包含6-7只鼠。这些鼠每周两次通过腹腔注射的方式给药，给药期间，肿瘤的增长和动物体重每三天测量一次。给药结束后，裸鼠被杀死取出肿瘤并称重。动物的使用完全遵照动物保护和使用的道德行为准则，并获得了烟台大学动物实验伦理委员会的批准。

动物体内活性测试结果见图1，表3和表4。在A2780卵巢癌肿瘤模型，实施例1的抗肿瘤活性与阳性对照药紫杉醇和多西他赛相当，而在A2780AD卵巢癌耐药肿瘤模型，实施例1显著优于紫杉醇和多西他赛。结果说明实施例1具有很强的抗耐药活性。

表3实施例1在鼠A2780肿瘤模型中对肿瘤的抑制活性

*:P<0.05，空白组作参照。

表4实施例1在鼠A2780AD肿瘤模型中对肿瘤的抑制活性

*:P<0.05，空白组作参照。

实验例5本发明化合物的药代动力学性质分析

实施例1的脂质体和多西他赛(多西他赛注射液)的药代动力学性质通过单次腹腔注射(给药剂量10mg/kg)的SD大鼠开展研究。给药后在0小时，10分钟，15分钟，30分钟，1小时，2小时，4小时，8小时，12小时，24小时，48小时，72小时和96小时通过后眼眶采集约500微升的血样，收集在肝素化的真空抗凝管内。血样在4度离心(4000rpm)10分钟获得血浆样品，在-80度冷冻保存待分析。每支血浆样品(50微升)加入200微升乙腈，涡旋混合30秒，在4度离心(12000rpm)10分钟。然后，上层清液转移到其他样品管。实施例1在血浆的样品浓度通过HPLC(Diamonsil C18柱(4.6mm x 6250mm；Φ5mm)，温度30度)定量分析。流动相为实施例1：乙腈/水＝55/45，多西他赛：乙腈/水＝70/30，流速为1ml/min。检测波长为230nm，采用峰面积作为定量分析数据。药代动力学性质的各参数通过DAS2.0软件测定。结果见图2和表5。

结果显示，在给药后的12，24，48，72和96小时，实施例1的血浆内药物浓度明显高于多西他赛，而多西他赛的药物累积和清除与实施例1相比，在较短的时间内完成。因此，实施例1与多西他赛相比，药代动力学性质更优。

表5实施例1在SD大鼠单次给药(10mg/kg)后的药代动力学参数

AUC：曲线下面积；MRT：平均保留时间；C_max：最高药物浓度；CLz/F：清除率；Vz/F：表观分布体积。

总结

本发明是以多西他赛为先导物进行结构改造的抗肿瘤剂。尽管多西他赛作为抗癌药有较好的疗效，但长期使用易产生耐药性，目前已有多种肿瘤细胞株对多西他赛产生耐药性，使它的疗效极大下降。紫杉烷类药物水溶性差，制剂时使用聚氧乙基蓖麻油助溶，易致过敏。

本发明的一系列多西他赛衍生物水溶性得到很大的改善，均优于多西他赛(是紫杉醇的46-91倍)。分子水平上，部分化合物的微管结合能力优于多西他赛，尽管细胞水平的药理活性弱于多西他赛，但是我们选取了本系列衍生物中药理活性最强(微管结合能力是多西他赛的4.6倍)的实施例1进行了动物体内药理活性筛选，结果显示，在A2780卵巢癌肿瘤模型，实施例1的抗肿瘤活性与阳性对照药紫杉醇和多西他赛相当，而在A2780AD卵巢癌耐药肿瘤模型，实施例1显著优于紫杉醇和多西他赛。结果说明实施例1具有很强的抗耐药活性。同时，实施例1的水溶性是多西他赛的3.2倍，明显高于多西他赛；据实施例1的药代动力学性质分析，实施例1在给药后12，24，48，72和96小时，血浆药物浓度明显高于多西他赛，体内药物累积和清除的时间明显长于多西他赛。

Claims

1.如下式的多西他赛衍生物及其药学上可接受的盐，

2.一种药物组合物，其特征在于，含有作为活性成分的权利要求1所述的多西他赛衍生物及其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体。

3.如权利要求1所述的多西他赛衍生物及其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。

4.根据权利要求3的应用，其特征在于，所述的肿瘤选自耐药的宫颈癌，卵巢癌，乳腺癌或人口腔上皮癌。