TR201902328T4 - Pladienolid piridin bileşikleri ve kullanım yöntemleri. - Google Patents

Abstract

Mevcut buluş, yeni pladienolid piridin bileşikleri, bu bileşikleri ihtiva eden farmasötik bileşimler ve bileşiklerin terapötik ajanlar olarak kullanılması için yöntemler sağlamaktadır. Bu bileşikler kanserin, özellikle splisozomu ve buradaki mutasyonları hedefleyen ajanların faydalı olduğu bilinen kanserlerin tedavisinde faydalı olabilir.

Description

TARIFNAME PLADIENOLID PIRIDIN BILESIKLERI VE KULLANIM YÖNTEMLERI BULUSUN ALT YAPISI Mevcut bulus yeni organik bilesikler ve bu tip bilesikleri ihtiva eden farmasötik bilesimler saglamaktadir. Bu bilesikler kanserin, özellikle splisozomlari ve buradaki mutasyonlari hedef alan ajanlarin faydali oldugu bilinen kanserlerin tedavisinde faydali olabilir. Ökaryot organizmalarda, yakin zamanda sentezlenen mesajci RNA'Iar tipik olarak, olgun mRNA'yi saglamak için kesip çikarilan çoklu intronlara sahiptir. Splisozom bu görevi yerine getiren bir çoklu-alt birimli komplekstir. Splisozom çesitli proteinlerle kombinasyon halinde bes küçük nükleer RNA'dan (snRNA'Iar; U1-6) olusur. Splisozom genlerindeki mutasyonlar çesitli kanser tiplerinde bulunmustur. Örnegin, splisozomun uç birlestirme faktörü SB alt birimi 1”deki (SF381) mutasyonlar bir dizi kanserde ortaya çikar ve anti-kanser ajanlari için bir hedef içerir. Bu tip kanserlere, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, miyelodisplastik sendrom (MDS), kronik (AML) gibi lösemi ve meme kanseri ve uveal melanom gibi kati tümörler dahildir.

Streptomyces platensis bakterisinden izole edilen (Sakai, Takashi; Sameshima, Tomohiro; Matsufuji, Motoko; Kawamura, Naoto; Dobashi, Kazuyuki; Mizui, Yoshiharu.

Pladienolids, New Substances from Culture of Streptomyces platensis Mer-11107. 1.

Taxonomy, Fermentation, Isolation and Screening. The Journal of Antibiotics. 2004, Vol. 57, N0.3.), pladienolidler olarak isimlendirilen ve vasküler endotelyal büyüme faktörünün (VEGF) inhibitörleri için tarama yapilirken kesfedilen bilesikler, insan VEGF promotörü tarafindan kontrol edilen bir raportör genin ekspresyonunu önler ve bu önleme anti-kanser ajanlari için faydali bir eylem mekanizmasi olarak bilinmektedir.

Bu bilesikler ayrica U251 insan gliyom hücrelerinin çogalmasini in vitro önler. Bu bilesiklerin en kuvvetlisi olan Pladienolid B, VEGF-destekli gen ekspresyonunu 1,8 nM,lik bir leo ile önler ve hücre çogalmasini 3,5 nM'Iik bir leo ile önler. Pladienolid Binin yapisi bilinmektedir (Sakai, Takashi; Sameshima, Tomohiro; Matsufuji, Motoko; Kawamura, Naoto; Dobashi, Kazuyuki; Mizui, Yoshiharu. Pladienolids, New Substances from Culture of Streptomyces platensis Mer-11107. ll. Physico-chemical Properties and Structure Elucidation. The Journal of Antibiotics. Vol. 57, No.3. (2004)) ve pladienolid B'nin. uç birlestirmeyi degistirmek ve gen ekspresyonunun örüntüsünü degistirmek için SF3b splisozomunu hedefledigi bilinmektedir (Kotake et al., “Splicing factor SFSb as a target of the antitumor natural product pladienolid”, Nature Chemical Belirli pladienolid B bilesiklerinin yani sira diger pladienolid bilesikleri de, asagidaki patent basvurularinda açiklandigi üzere benzer sekilde bilinmektedir: WO bilinen bir pladienolid bilesigi (8E,12E,14E)-7-((4-Sikloheptilpiperazin-1-il)karbonil)oksi- olid, dogal ürün olan pladienolid D'nin yari-sentetik bir türevidir ve bunun Evre I çalismalarinin sonuçlari bildirilmistir.

Ancak, kanserin, özellikle splisozomu ve buradaki mutasyonlari hedefleyen ajanlarin faydali oldugunun bilindigi kanserlerin tedavisinde faydali olan ilave ajanlara ihtiyaç BULUSUN KISA AÇIKLAMASI Mevcut bulusun amaci formül 1'In bir bilesigini (“Bilesik 1”), formül 2'nin bir bilesigini (”Bilesik 2"), formül 3'ün bir bilesigini (“Bilesik 3”) ve formül 4'ün bir bilesigini ("Bilesik ve bunlarin farmakolojik olarak kabul edilen tuzlarini saglamaktir.

Mevcut bulusun bir diger amaci, Bilesik 1; Bilesik 2, Bilesik 3, Bilesik 4 veya bunlarin farmakolojik olarak kabul edilen bir tuzunu içeren farmasötik bilesimler saglamaktir. Bu tip farmasötik bilesimler bir veya daha fazla farmakolojik olarak kabul edilen tasiyicilarla formüle edilebilir. Bu tip bilesimler, intravenöz, oral, subkütan veya intramusküler verilis dahil olmak üzere çesitli konvansiyonel verilis yollari yoluyla kullanim için formüle edilir.

Mevcut bulus ayrica, kanseri olan bir süjenin tedavi edilmesi için, süjeye Bilesik 1, Bilesik 2, Bilesik 3, Bilesik 4 veya bunun farmakolojik olarak kabul edilir bir tuzunun terapötik olarak faydali bir yanit saglamak için etkili bir miktarinin verilisini içeren bir yöntemde kullanimiyla da ilgili olabilir. Kanser miyelodisplastik sendrom, kronik lenfositik lösemi, akut lenfoblastik lösemi, kronik miyelomonositik lösemi veya akut miyeloid lösemi gibi lösemi veya kolon kanseri, pankreas kanseri, endometriyal kanser, yumurtalik kanseri, meme kanseri, uveal melanom, mide kanseri, kolanjiyokarsinom, akciger kanseri gibi bir kati tümör veya bunlarin herhangi bir alt grubu olabilir. Kanser, bir splisozom geni veya proteinindeki, Tablo 1'de Iistelenenler gibi bir veya daha fazla mutasyon için pozitif test edilebilir.

Mevcut bulus ayrica, Bilesik 1, Bilesik 2, Bilesik 3, Bilesik 4 veya bunun farmakolojik olarak kabul edilir bir tuzunun bir terapötik tedavi, örnegin, bir kanserin tedavisi yönteminde kullanimini da açiklamaktadir. Kanser miyelodisplastik sendrom, kronik lenfositik lösemi, akut lenfoblastik lösemi, kronik miyelomonositik lösemi veya akut miyeloid lösemi gibi lösemi veya kolon kanseri, pankreas kanseri, endometriyal kanser, yumurtalik kanseri, meme kanseri, uveal melanom, mide kanseri, kolanjiyokarsinom, akciger kanseri gibi bir kati tümör veya bunlarin herhangi bir alt grubu olabilir. Kanser, bir splisozom geni veya proteinindeki, Tablo 1'de Iistelenenler gibi bir veya daha fazla mutasyon için pozitif test edilebilir.

Mevcut bulus ayrica, Bilesik 1, Bilesik 2, Bilesik 3, Bilesik 4 veya bunun farmakolojik olarak kabul edilir bir tuzunun bir ilacin hazirlanmasinda kullanimiyla da ilgili olabilir. Özellikle, ilaç kanser tedavisi için olabilir. Kanser miyelodisplastik sendrom, kronik lenfositik lösemi, akut lenfoblastik lösemi, kronik miyelomonositik lösemi veya akut miyeloid lösemi gibi lösemi veya kolon kanseri, pankreas kanseri, endometriyal kanser, yumurtalik kanseri, meme kanseri, uveal melanom, mide kanseri, kolanjiyokarsinom, akciger kanseri gibi bir kati tümör veya bunlarin herhangi bir alt grubu olabilir. Kanser, bir splisozom geni veya proteinindeki, Tablo 1'de Iistelenenler gibi bir veya daha fazla mutasyon için pozitif test edilebilir.

Mevcut bulus ayrica, Bilesik 1, Bilesik 2, Bilesik 3, Bilesik 4 veya bunun farmakolojik olarak kabul edilir bir tuzunun, splisozomu, örnegin, SF3B splisozomunun alt birim 1'ini hedeflemek için kullanimini da açiklamaktadir.

SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI SEKIL 1, 5 mg/kg intravenöz (IV) veya 10 mg/kg oral verilis (PO) dozlarda Bilesik 2'nin verildigi CD-1 farelerindeki bir farmakokinetik (PK) çalismasinin sonuçlarini göstermektedir.

SEKIL 2, islenmis bir SFSBlK700E mutasyonuna sahip bir Naim-6 (Insan ön B- hücre çizgisi) fare ksenograft modelinde Bilesik 2'nin etkililigini göstermektedir.

Farelere 14 gün boyunca günde bir kez (QD) 2,5, 5 veya 10 mg/kg Bilesik 2 verilmis ve tümör hacmi 40 günlük bir periyot boyunca ölçülmüstür.

SEKIL 3, islenmis bir SF13B1K700E mutasyonuna sahip bir Naim-6 (insan ön B- hücre çizgisi) fare ksenograft modelinde Bilesik 2'nin farmakokinetik ve farmakodinamik analizini göstermektedir. Farelere 10 mg/kg PO dozunda Bilesik 2 verilmis ve tümör konsantrasyonu (ug/g) ve Pre-EIF4A1'in (EIF4A1 transkriptinin ön-mRNA'si) ve SLC25A19`un (SL025A19 transkriptinin olgun mRNA'si) araca bagli ekspresyonundaki kat degisimi belirlenmistir.

SEKIL 4, dogal-sus SFSB1 pankreas kanseri hücre çizgileri BXPCS, HPAFII, PANCO403, PANC1005. CFPACl ve MIAPACA2'ye kiyasla PANCOSO4 kanser hücre çizgisindeki (SFSBtMUT) (mutant PANC 05.04) Bilesik 2 ile bir hücresel viyabilite tayinin sonuçlarini göstermektedir.

SEKIL 5, E710? ve Bilesik 2 (blsk 2) için alternatif uç birlestirmenin Nanostring analizine dayali modülasyonunu göstermektedir. “+” ve “"- farkli uç birlestirme kesismelerinin degisen ekspresyon seviyelerini isaret eden gölgeli anahtardaki pozitif veya negatif degerleri göstermektedir.

SEKIL 6, 5 mg/kg intravenöz (IV) veya 12 mg/kg oral verilis (PO) dozlarda Bilesik 1'in verildigi CD-1 farelerindeki bir PK çalismasinin sonuçlarini göstermektedir.

SEKIL 7, islenmis bir SF3BtK7°°E mutasyonuna sahip bir Naim-6 fare ksenograft modelinde Bilesik 1'in etkililigini göstermektedir. Farelere 14 gün boyunca günde bir kez (QD) 7,5 veya 10 mg/kg Bilesik 1 verilmis ve tümör hacmi 30 günlük bir periyot boyunca ölçülmüstür.

SEKIL 8, islenmis bir SF381K7°ÜE mutasyonuna sahip bir Naim-6 fare ksenograft modelinde Bilesik 1'in farmakokinetik ve farmakodinamik analizini göstermektedir. Farelere bir tekli PO dozunda Bilesik 1 verilmis ve tümör konsantrasyonu (pg/g) ve Pre-EIF ve SLC araca bagli ekspresyonundaki kat degisimi belirlenmistir. dozlarda Bilesik 3'ün verildigi CD-1 farelerindeki bir PK çalismasinin sonuçlarini göstermektedir.

SEKIL 10, 5 mg/kg intravenöz (IV) veya 10 mg/kg oral verilis (PO) dozlarda Bilesik 4'ün verildigi CD-1 farelerindeki bir PK çalismasinin sonuçlarini göstermektedir.

BELIRLI UYGULAMALARIN DETAYLI AÇIKLAMASI A. Tanimlar Burada kullanildigi sekliyle, aksi belirtilmedigi sürece asagidaki tanimlar geçerli olacaktir. ancak atomlarin düzenlenmesi veya yapilandirilmasi açisindan farklilik gösteren bilesikleri ifade etmektedir. “Stereoizomerler”, ayni atomik baglantisalliga ancak uzamda atomlarinin farkli düzenlemelerine sahip bilesikleri ifade etmektedir. ifade etmektedir. “Enantiyomerler”, birbirinin çakisabilir-olmayan ayna görüntüleri olan stereoizomerleri ifade etmektedir. “Geometrik izomerler", bir çift bag veya halka veya merkez atomu açisindan gruplarin farkli konumlarina sahip cis-trans izomerleri ifade etmektedir.

Burada ögretilen enantiyomerler, belirli bir asimetrik merkezde veya merkezlerde, büyük ölçüde bir tekli enantiyomer, örnegin, bir tekli enantiyomerin %QO'indan, içerebilir. Bir “asimetrik merkez” veya “kiral merkez”, dört farkli ornatik içeren bir dört yüzlü karbon atomunu ifade etmektedir.

Burada kullanildigi sekliyle “stereomerik olarak saf" terimi, bir bilesigin bir adet stereoizomerini içeren ve o bilesigin diger stereoizomerlerini büyük ölçüde içermeyen bir bilesik veya bunun bilesimi anlamina gelmektedir. Örnegin, bir kiral merkeze sahip bir bilesigin stereomerik olarak saf bir bilesimi, bilesigin zit enantiyomerini büyük ölçüde içermeyecektir. Iki kiral merkeze sahip bir bilesigin stereomerik olarak saf bilesimi, bilesigin diastereomerlerini ve zit enantiyomerini büyük ölçüde içermeyecektir. Tipik bir stereomerik olarak saf bilesik, bilesigin bir stereoizomerinin agirliginca yaklasik azini, daha tercihen bilesigin bir stereoizomerinin agirliginca yaklasik %90'indan fazlasini ve bilesigin diger izomerlerinin agirliginda yaklasik %10'undan azini, daha da tercihen bilesigin bir stereoizomerinin agirliginca yaklasik %95`inden fazlasini ve bilesigin diger izomerlerinin agirliginda yaklasik %5'inden azini ve en tercihen bilesigin bir stereoizomerinin agirliginca yaklasik %97'sinden fazlasini ve bilesigin diger izomerlerinin agirliginda yaklasik %3'ünden azini içerir. Bakiniz, örnegin, ABD Patenti No 7.189.715. izomerleri tarif ettikleri sekilde “R” ve “”,S asimetrik olarak ikame edilmis bir karbon atomundaki stereokimyasal yapilandirmanin tanimlayicilaridir. Asimetrik olarak ikame edilmis bir karbon atomunun “R” veya “8“ olarak belirlenmesi, teknikte uzman kisilerce iyi bilindigi ve Uluslararasi Saf ve Uygulamali Kimya Birligi (IUPAC) Organik Kimya Isimlendirme Kurallari, Kisim E, Stereokimya'da tarif edildigi üzere Cahn-IngoId-Prelog öncelik kurallarinin uygulanmasiyla yapilir.

Kanserin “tedavisi", kanseri “tedavi etmek” veya kanserin ”tedavi edilmesi”, burada tarif edilen sekildeki bir kanserin tersine çevrilmesini (örnegin, hücrelerin bir farklilastirma blokajinin üstesinden gelinmesi), hafifletilmesini (örnegin, kansizligin neden oldugu yorgunluk, düsük kan sayimi vb. gibi bir veya daha fazla semptomun hafifletilmesi) ve/veya ilerleyisinin geciktirilmesini (örnegin, AML'ye dönüsme gibi durumun ilerleyisinin geciktirilmesi) ifade etmektedir.

Burada kullanildigi sekliyle, “süje”, bir hayvan süje, tercihen bir memeli süje ve özellikle Burada kullanildigi sekliyle “farmakolojik olarak kabul edilen tasiyici“, formüle edildigi bilesigin farmakolojik aktivitesini yok etmeyen toksik olmayan bir tasiyiciyi, adjuvani veya araci ifade etmektedir. Bu bulusun bilesimlerinde kullanilabilen farmakolojik olarak kabul edilen tasiyicilara, adjuvanlara veya araçlara, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, iyon degistiriciler, alümin, alüminyum stearat, Iesitin, insan serum albümini gibi serum proteinleri, fosfatlar gibi tampon maddeleri, glisin, sorbik asit, potasyum sorbat, doymus bitkisel yag asitlerinin kismi gliserit karisimlari, protamin sülfat, disodyum hidrojen fosfat, potasyum hidrojen fosfat, sodyum klorür, çinko tuzlari, koloidal silika, magnezyum trisilikat, polivinil pirolidon gibi elektrolit tuzlari, selüloz-esasli maddeler, polietilen glikol, siklodekstrinler, sodyum karboksimetilselüloz, poliakrilatlar, vakslar, polietilen-polioksipropilen-blok polimerleri, polietilen glikol ve yün yagi dahildir. muhafaza eden ve istenmeyen toksikolojik etkilere neden olmayan bir tuzdur. Bu tip tuzlarin örnekleri sunlardir: (a) inorganik asitlerle, örnegin, hidroklorik asit, hidrobromik asit, sülfürik asit, fosforik asit, nitrik asit ve benzerleriyle olusturulan asit ilaveli tuzlar ve organik asitlerle, örnegin, asetik asit, oksalik asit, tartarik asit, süksinik asit, maleik asit, fümarik asit, glukonik asit, sitrik asit, malik asit, askorbik asit, benzoik asit, tanik asit, palmitik asit, aljinik asit, poliglutamik asit, naftalensülfonik asit, metansülfonik asit, p- tolüensülfonik asit, naftalendisülfonik asit, poligalaktüronik asit ve benzerleriyle olusturulan tuzlar ve (b) klorür, bromür ve iyodür gibi element anyonlarindan olusturulan tuzlar. Bakiniz, örnegin, burada referans olarak alinan Haynes et al., Cambridge Structural Database," J. Pharmaceutical Sciences, vol. 94, no. 10 (2005) ve Berge et al., “Pharmaceutical Salts", J. Pharmaceutical Sciences, vol. 66, no. 1 (1977).

B. Bilesikler Aksi belirtilmedigi sürece, burada anlatilan bilesikler, burada anlatilan bilesigin ve yapinin enantiyomerik, diastereomerik ve geometrik (veya konformasyonel) formlarinin herhangi birinin karisimlarini içerebilir; örnegin, her bir asimetrik merkez için R ve S yapilandirmalari, (2) ve (E) çift bag izomerleri ve (Z) ve (E) konformasyonel izomerler.

Aksi belirtilmedigi sürece, burada anlatilan ve totomerik formlarla es var olan bilesikler bulusun kapsami dahilindedir. Ek olarak, aksi belirtilmedigi sürece, burada anlatilan yapilar ayrica, yalnizca bir veya daha fazla izotopik olarak zenginlestirilmis atom varligi açisindan farklilik gösteren bilesikleri de içerme amacindadir. Örnegin, hidrojenin döteryum veya trityumla degistirilmesi veya bir karbonun bir 13C- veya 14C- zenginlestirilmis karbonla degistirilmesi haricinde mevcut yapilara sahip bilesikler bu bulusun kapsami dahilindedir. Bu tip bilesikler, örnegin, biyolojik tayinlerde analitik araçlar veya problar olarak faydali olabilir.

Bazi uygulamalara göre burada, formül 1'in bir bilesigi (“Bilesik 1”), formül 2'nin bir bilesigi (“Bilesik 2”), formül 3'ün bir bilesigi (“Bilesik 3") ve formül 4'ün bir bilesigi ve bunlarin farmakolojik olarak kabul edilen tuzlari saglanmaktadir.

C. Farmasötik formülasyonlar Mevcut bulusun bilesikleri, bunlarin farmasötik formülasyonlarini saglamak için farmakolojik olarak kabul edilen bir tasiyiciyla birlestirilebilir. Tasiyicinin ve formülasyonun özel seçimi, bilesimin amaçlandigi belirli verilis yoluna dayali olaraktir.

Mevcut bulusun farmasötik bilesimleri parenteral, oral, inhalasyon spreyi, topikal, rektal, nazal, bukkal, vajinal veya implante edilmis hazne verilisi vb. için uygun sekilde formüle edilebilir. Burada kullanildigi sekliyle “parenteral” terimine subkütan, intravenöz, intramusküler, intra-artiküler, intra-sinoviyal, intrasternal, intratekal, intrahepatik, intralezyonal ve intrakraniyal enjeksiyon veya infüzyon teknikleri dahildir. Belirli uygulamalarda, bilesikler intravenöz olarak, oral olarak, subkütan olarak veya intramusküler verilis yoluyla verilir. Bu bulusun bilesimlerinin steril enjekte edilebilir formlari suyu veya yagsi süspansiyon olabilir. Bu süspansiyonlar teknikte bilinen tekniklere göre, uygun dagitici veya islatici ajanlar ve süspanse edici ajanlar kullanilarak formüle edilebilir. Steril enjekte edilebilir preparat ayrica, bir toksik olmayan parenteral olarak kabul edilen seyreltici veya çözücü içinde bir steril enjekte edilebilir solüsyon veya süspansiyon, örnegin, 1,3-budanediol içinde bir solüsyon olabilir.

Kullanilabilecek kabul edilen araçlar ve çözücüler arasinda su, Ringer solüsyonu ve izotonik sodyum klorür solüsyonu yer almaktadir. Ek olarak, steril, sabit yaglar da bir çözücü veya süspanse edici vasat olarak konvansiyonel olarak kullanilmaktadir.

Bu amaç dogrultusunda, sentetik mono- veya digliseritler dahil olmak üzere herhangi bir tahris etmeyen sabit yag kullanilabilir. Oleik asit ve bunun gliserit türevleri gibi yag asitleri enjekte edilebilir olanlarin hazirlanmasinda, zeytinyagi veya hintyagi gibi, özellikle polioksietilatli versiyonlarda dogal farmakolojik olarak kabul edilen yaglar olduklarindan faydalidir. Bu yag solüsyonlari veya süspansiyonlar ayrica, emülsiyonlar ve süspansiyonlar dahil olmak üzere farmakolojik olarak kabul edilen dozaj formlarinin formülasyonlarinda yaygin olarak kullanilan karboksimetil selüloz veya benzer dagitici ajanlar gibi bir uzun-Zincirli alkol seyreltici veya dagitici da ihtiva edebilir. Tweens, Spans ve farmakolojik olarak kabul edilen kati, sivi veya diger dozaj formlarinin üretiminde yaygin olarak kullanilan diger emülgatörler veya biyoyararlanim arttiricilar gibi diger yaygin olarak kullanilan sürfaktanlar da formülasyon amaciyla kullanilabilir.

Oral verilis için, bir bilesik, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla kapsüller, tabletler, sulu süspansiyonlar veya solüsyonlar dahil olmak üzere kabul edilen bir oral dozaj formunda saglanabilir. Oral kullanim için tabletler durumunda, yaygin olarak kullanilan tasiyicilara laktoz ve misir nisastasi dahildir. Magnezyum stearat gibi kayganlastirici ajanlar da eklenebilir. Bir kapsül formunda oral verilis için, faydali seyrelticilere laktoz ve kurutulmus misir nisastasi dahildir. Oral kullanim için sulu süspansiyonlar gerekli oldugunda, etken madde bir emülgatör ve/veya süspanse edici ajanla birlestirilir. Arzu edilirse, belirli tatlandirici, aroma verici veya renklendirici ajanlar da eklenebilir.

D. Süjeler ve kullanim yöntemleri Mevcut bulusun bir bilesigi, SF3B1'i hedefleyen ajanlara yanit verenler dahil olmak üzere çesitli kanser tiplerini tedavi etmek için kullanilabilir. Yukarida kaydedildigi üzere, pladienolid B'nin anti-tümör aktivitesi, SFßc kompleksinin hedeflenmesiyle, uç birlestirmenin önlenmesiyle ve gen ekspresyonu örüntüsünün degistirilmesiyle baglantili olarak bildirilmektedir (Kotake et al., “Splicing factor SF3b as a target of the birlestirme faktörü SB alt birim 1 (SFSB1) proteini gibi splisozom genlerindeki mutasyonlarin, hematolojik maligniteler ve kati tümörler gibi bir dizi kanserde dahil oldugu bilinmektedir. Scott et al., “Acquired mutations that affect pre-mRNA splicing in Hematolojik malignitelere kan kanserleri (lösemi) veya lenf bezleri (lenfomalar) kanserleri dahil olabilir. Lösemilere akut Ienfoblastik lösemi (ALL), akut miyelojen lösemi (AML), kronik Ienfositik lösemi (CLL), kronik miyelojen lösemi (CML), kronik miyelomonositik lösemi (CMML), akut monositik lösemi (AMoL) vb. dahil olabilir. Diger hematolojik malignitelere miyelodisplastik sendrom MDS) dahil olabilir.

Kati tümörlere adenokarsinom, örnegin, meme kanseri, pankreas kanseri, prostat kanseri, kolon veya kolorektal kanser, akciger kanseri, mide kanseri, servikal kanser, endometriyal kanser, yumurtalik kanseri, kolanjiyokarsinom, gliyom, melanom vb. gibi karsinomlar dahil olabilir.

Mevcut bulusun bir bilesigi ayrica, SF3B1'den farkli bir splisozom genini veya proteinini hedefleyen ajanlara yanit verebilen kanserlerin tedavi edilmesi için de kullanilabilir.

Asagidaki örnekler, splisozomu hedefleyen ajanlara yanit verebilen çesitli kanserlerin bazilarini örnekleyicidir ve bulusun kapsamini hiçbir sekilde kisitlama amaçli degildir.

Böylelikle, mevcut bulusun bilesikleri çesitli kanserlerin veya durumlarin tedavi edilmesi için, asagidakilerden muzdarip hastalar veya süjeler gibi süjelere verilebilir: a) Mivelodisplastik sendrom (MDS): Bakiniz, örnegin, “SF381 mutations iri myelodysplastic syndromes: clinical associations and prognostic implications," Damm F. et al. Leukemia, 2011, 1-4; “Frequent pathway mutations in splicing significance of SF3B1 mutations in myelodysplastic syndromes and myelodyspIastic/myeloproliferative neoplasms," Malcovati L. et al., Blood, 2011, 3210; “Somatic SF3B1 mutation in myelodysplasia with ring sideroblasts," 103283. b) Kronik Ienfomatik lösemi (CLL): Bakiniz, örnegin, “Defects in the spliceosomal machinery: a new pathway of Ieukaemogenesis," Maciejewski, J.P., Padgett, R.A., Br. J. Haematology, 2012, 1-9; “Mutations in the SF3B1 splicing factor in chronic lymphocytic Ieukemia: associations with progression and fludarabine- identifies recurrent mutations of the splicing factor SFSB1 gene in chronic 0) Kronik miyelomonositik lösemi (CMML): Bakiniz, örnegin, Yoshida et al, Nature 2011; “Spliceosomal gene mutations are frequent events in the diverse mutational spectrum of chronic myelomonocytic Ieukemia but largely absent iri juvenile myelomonocytic Ieukemia," Kar S.A. et al, Haematologia, 2012, DOI: reveals potential mechanism of cryptic 3' splice site selection in SFSB1-mutated d) Akut miveloid lösemi (AML): Bakiniz, ömegin, Malcovati et al., Blood 2011; Yoshida et al, Nature 2011. e) Meme kanseri: Bakiniz, örnegin, "Whole genome analysis informs breast cancer DeBoever et al., “Transcriptome sequencing reveals potential mechanism of cryptic 3' splice site selection in SFBB1-mutated cancers," PLOS Computational Biology, f) Uveal melanom: Bakiniz, örnegin,”SFSB1 mutations are associated with 1129; DeBoever et al., “Transcriptome sequencing reveals potential mechanism of cryptic 3' splice site selection in SFBB1-mutated cancers," PLOS Computational g) Endometriyal kanser: Bakiniz, örnegin, Tefferi et al., “Myelodysplastic analysis of splicing machinery genes SFSB1, U2AF1 and SRSF2 in myelodysplasia and other common tumors.” Je et al, myelodysplasia and other common tumors." Je et al. j) Kolaniiyokarsinom ve Pankreas kanseri qibi Safra Yolu kanserleri: Bakiniz, örnegin, Biankin et al., “Pancreatic cancer genomes reveal aberrations in axon k) Akciger kanseri: Bakiniz, örnegin, ”Exome sequencing identifies recurrent mutations of the splicing factor SFSB1 gene in chronic lymphocytic leukemia," that affect pre-mRNA splicing in hematologic malignancies and solid tumors," JNCI Ek olarak, kanserdeki somatik mutasyonlar katalogu (COSMIC) (Wellcome Trust Sanger Institute, Genome Research Limited, Ingiltere), SFSB1 mutasyonlarinin çesitli tiplerde kanser örneklerinde bulunmus oldugunu bildirmektedir.

Mevcut bulusun bir bilesigi bir süjeye bir tedavi etkili veya terapötik olarak etkili bir miktarda verilebilir. Mevcut bulusun bir bilesiginin, bir tekli dozaj formunda bir bilesim üretmek için bir tasiyici materyalle birlestirilebilen miktari, tedavi edilen süjeye ve belirli verilis yoluna bagli olarak degisecektir. Tercihen bilesimler, bu bilesimleri almakta olan bir süjeye aktif maddenin 0,01 - 100 mg/vücut kg/gün arasinda bir dozajinin verilebilecegi sekilde formüle edilmelidir. Belirli uygulamalarda, mevcut bulusun bilesimleri 0,01 mg ila 50 mg arasinda bir dozaj saglamaktadir. Diger uygulamalarda, 0,1 mg ila 25 mg arasinda veya 5 mg ila 40 mg arasinda bir dozaj saglanmaktadir.

Ayrica, herhangi bir belirli hasta için spesifik bir dozaj ve tedavi rejiminin, kullanilan spesifik bilesigin aktivitesi, yas, vücut agirligi, genel saglik, cinsiyet, beslenme, verilis zamani, atilim hizi, ilaç kombinasyonu, tedavi eden hekimin karari ve tedavi edilmekte olan belirli hastaligin ciddiyeti dahil olmak üzere çesitli faktörlere bagli olacagi da anlasilmalidir. Bilesimdeki mevcut bulusun etken maddesinin miktari da bilesimdeki belirli bilesige/tuza bagli olacaktir.

Bazi uygulamalarda, kanser bir splisozom geni veya proteinindeki bir veya daha fazla mutasyon için test edilir ve/veya pozitiftir, burada mutasyonun (mutasyonlarin) varligi (“pozitif”), süjenin kanserinin, bu proteini ve/veya splisozomu hedefleyen bir bilesigin verilisini içeren bir tedavi yöntemine yanit verdigini gösterebilir. Bu tip splisozom genlerinin örneklerine, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, Tablo 1'de sunulanlar dahildir.

Tablo 1: Splisozom genleri ve etkilenen potansiyel hastaliklar Splisozom geni Hastalik(lar) Uç birlestirme faktörü SB alt birimi 1 (SFSB1) Bakiniz yukaridaki liste U2 küçük nükleer RNA yardimci faktör 1 MDS, AML, CMML, LUAD, UCEC (U2AF1) CMML, MDS, PMF, AML Splisozom geni Serin/arjinin-zengini uç birlestirme faktörü 2 Çinko parmak (CCCH tipi), RNA-baglayici motif ve serin/arjinin zengini 2 (ZRSR2) Ön-mRNA-isleyen-uç birlestirme faktörü 8 (PRPF8) U2 Küçük Nükleer RNA Yardimci Faktörü 2 (U2AF2) Uç birlestirme faktörü 3a alt birim 1 (SF3A1) PRP4O ön-mRNA isleme faktörü 40 homolog B RNA Baglayici Motif Protein 10 (RBM10) POIi(rC) baglayici protein 1 (PCBP1) Egik boyunlu ön-mRNA uç birlestirme faktörü 1 DEAH (Asp-GIu-AIa-His) kutu helikaz 9 (DHX9) PeptidiI-prolil cis-trans izomeraz-benzeri 2 (PPIL2) RNA baglayici motif protein 22 (RBM22) Küçük nükleer ribonükleoprotein Sm D3 (SNRPDS) Muhtemel ATP-bagimli RNA helikaz DDX5 (DDX5) Ön-mRNA-uç birlestirme faktörü ATP-bagimli RNA helikaz DHX15 (DHX15) Poliadenilat-baglayici protein 1 (PABPC1) Simgeler: AML = Akut Miyeloid Lösemi CMML = kronik miyelomonositik lösemi Hastalik(lar) Retinit Pigmentoza Miyeloid neoplazmalar MDS, PRAD. COAD miyeloid neoplazmalar, miyeloid neoplazmalar Splisozom geni Hastalik(lar) LUAD = Akciger adenokarsinom UCEC = Uterin Korpus Endometriyal Karsinom PMF = Progresif Masif Fibroz PRAD = Prostat adenokarsinom COAD = Kolon adenokarsinom OV = Yumurtalik seröz kistadenokarsinom SKCM = Deri Kütanöz Melanom LUSC = Akciger skuamöz hücre karsinom STAD = Mide adenokarsinom GBM = Gliyoblastom multiform LGG = Beyin Düsük Kademe Gliyom DLBCL = Difüz Büyük B-Hücresi Lenfoma Bazi uygulamalarda, süjenin kanseri, bir splisozom geni veya proteininde bu tip mutasyonlarin yoklugunda bile bu proteini ve/veya splisozomu hedefleyen bir bilesigin verilisini içeren bir tedavi yöntemine yanit verebilir.

Mutasyonlarin taranmasi veya test edilmesi bilinen herhangi bir araçla, örnegin, genotiplemeyle, fenotiplemeyle vb., nükleik asit güçlendirme yoluyla, elektroforez, mikrodizilimler, Iekeleme, fonksiyonel tayinler, immün-tayinler vb. yoluyla gerçeklestirilebilir. Tarama yöntemlerine, örnegin, kanserli hücreleri/dokulari ihtiva eden söz konusu süjeden bir biyolojik numunenin alinmasi dahil olabilir.

Burada tarif edilen bulusun daha iyi anlasilabilmesi amaciyla, asagidaki örnekler ortaya konulmaktadir. Bu örneklerin yalnizca tanimlama amaçli oldugu ve bu bulusu herhangi bir biçimde sinirlayici olarak kabul edilmedigi anlasilmalidir. ÖRNEKLER Bilesikler 1, 2, 3 ve 4'ün Hazirlanmasi Mikrodalga isitma bir Biotage Emrys Liberator veya lnitiator mikrodalga kullanilarak yapildi. Kolon kromatografi bir lsco Rf200d kullanilarak gerçeklestirildi. Çözücü yok edilmesi ya bir Büchi döner buharlastirici veya bir Genevac santrifüjlü buharlastirici kullanilarak gerçeklestirildi. Hazirlayici LC/MS, asitli hareketli evre kosulu altinda bir Waters oto-saflastirici ve 19 X 100mm XTerra 5 mikron MS 018 kolon kullanilarak yürütüldü. NMR spektrumlari bir Varian 400MHz spektrometre kullanilarak kaydedildi.

Bir reaktörü (örnegin, bir tepkime kabi, sisesi, cam reaktör ve benzerleri) tarif etmek için “etkisizlestirilmis” terimi kullanildiginda, reaktörün içindeki havanin esasen nemsiz veya kuru, etkisiz bir gazla (mesela nitrojen, argon ve benzerleri) degistirilmis oldugu kastedilmektedir.

Mevcut bulusun bilesiklerinin hazirlanmasi için genel yöntemler ve deney araçlari asagida ortaya konulmaktadir.

Burada asagidaki kisaltmalar kullanilmaktadir: MeOH: Metanol DMF: Dimetilformamid KHMDS: Potasyum bis(trimetilsilil)amid LCMS: Sivi kromatografi - kütle spektrometri TBSCI: tert-Bütildimetilsilil klorür THF: Tetrahidrofüran TLC: Ince-katman kromatografi Gereçler: Asagidaki bilesikler piyasada bulunmaktadir ve/veya organik sentez tekniginde uzman bir kisi tarafindan bilinen çesitli yollarla hazirlanabilir. Daha spesifik olarak, açiklanan bilesikler burada tarif edilen tepkimeler ve teknikler kullanilarak hazirlanabilir. Asagida tarif edilen sentetik yöntemlerin tarifinde, çözücü seçimi, tepkime atmosferi, tepkime sicakligi, deney süresi ve tetkik prosedürleri dahil olmak üzere önerilen tüm tepkime kosullarinin, aksi belirtilmedigi sürece o tepkime için standart kosullar olarak seçilebilecegi anlasilmalidir. Organik sentez tekniginde uzman bir kisi tarafindan, molekülün çesitli kisimlarinda mevcut fonksiyonelligin, önerilen belirteçlerle ve tepkimelerle uyumlu olmasi gerektigi anlasilmaktadir. Tepkime kosullariyla uyumlu olmayan ornatiklar teknikte uzman kisi tarafindan bilinmektedir ve bu nedenle alternatif yöntemler gösterilmektedir. Örnekler için baslangiç materyalleri ya piyasada bulunmaktadir veya bilinen materyallerden standart yöntemlerle kolayca hazirlanabilir.

LCMS bilgisi Hareketli evreler: A (H2O içinde %O,1 formik asit) ve B (asetonitril içinde %O,1 formik asit).

Kolon: Acquity BEH C18 kolon (1,7 um, 2,1 x 50 mm).

Her ikisi de Pladienolid B ve Pladienolid D'nin Total Sentezi için Islem baslikli ABD bilinen yöntemleri tarif etmektedir. Pladienolid B ve D'nin sentezi ayrica teknikte bilinen ve Kanada et al., “Total Synthesis of the Potent Antitumor Macrolids Pladienolid B and da gerçeklestirilebilir. Kanada et al. ve Yeni Fizyolojik Olarak Aktif Maddeler baslikli etmektedir. Karsilik gelen bir ABD Patenti, Kotake et al.'e verilen 7.550.503'tür.

BILESIKLERIN EMSAL SENTEZI TBSCi (3,9 9, 25,7 mmol, 5,0 esd.) eklendi. Tepkimenin oda sicakligina isinmasi saglandi ve 20 saat süreyle veya tepkimenin LCMS veya TLC tarafindan tamamlandigi belirlenene kadar karistirildi. Tepkime etil asetat ile seyreltildi ve organik katman tuzlu suyla yikandi, sodyum sülfat üzerinde kurutuldu, filtre edildi ve vakumda konsantre edildi. Ortaya çikan yag, istenen ürünün (B, 4,7 9, 5,0 mmol, %96) saglanmasi için silika jel kolon kromatografiyle (elüan olarak heksanlar/etil asetat) saflastirildi. sikloheptilpiperazin-1-karboksilat sentezi. THF:H20 (10:1, içinde bir olefin solüsyonuna B (4,7 9, 5,0 mmol, 1,0 esd.) nitrojen altinda O°C'de osmiyum tetroksit ( ve ardindan N-metilmorfolin N- oksit (1,16 9, 9,9 mmol, 2,0 esd.) eklendi. Tepkimenin oda sicakligina isinmasi saglandi ve 13 saat süreyle veya tepkimenin LCMS veya TLC tarafindan tamamlandigi belirlenene kadar karistirildi. Tepkime sodyum sülfit ile sönümlendi, etil asetatla seyreltildi ve organik katman suyla yikandi, magnezyum sülfat üzerinde kurutuldu, filtre edildi ve vakumda konsantre edildi. Ortaya çikan yag, arzu edilen ürünün (C, 4,8 9, 4,9 mmol, %99) saglanmasi için silika jel kolon kromatografiyle (elüan olarak diklorometan/metanol) saflastirildi. karboksilat sentezi. Benzen ( içinde bir diol solüsyonuna C (4,4 9, 4,5 mmol, 1,0 esd.) nitrojen altinda oda sicakliginda kursun tetraasetat (4,0 9, 9,0 mmol, 2,0 esd.) eklendi. Tepkime 30 dakika süreyle veya tepkimenin LCMS veya TLC tarafindan tamamlandigi belirlenene kadar karistirildi. Tepkime sodyum sülfitle sönümlendi ve diklorometan ile seyreltildi. Organik katman suyla yikandi, sodyum sülfat üzerinde kurutuldu, filtre edildi ve vakumda konsantre edildi. Arzu edilen ürün (D, 1,5 9, 2,3 mmol, %52) ham olarak elde edildi. sikloheptilpiperazin-1-karboksilat sentezi.

Not: (S)-2-(1-((1-fenil-1H-tetrazol-S-il)sülfonil)propan-2-il)piridin sentezi asagida tarif edilmektedir ve Sema V'te gösterilmektedir. esd.) kuru THF ( içinde nitrojen altinda -78°C'de KHMDS (8,53 ml, 4,265 mmol, 2,1 esd.) damlatilarak eklendi ve tepkime 10 dakika süreyle karistirildi. damlatilarak eklendi. Tepkime -78°C`de bir saat süreyle karistirildi ve daha sonra gece boyunca oda sicakligina isinmasi saglandi. Tepkime suyla sönümlendi ve etil asetatla seyreltildi. Organik katman su ve tuzlu suyla yikandi, magnezyum sülfat üzerinde kurutuldu, filtre edildi ve vakumda konsantre edildi. Ortaya çikan yag arzu edilen ürünün (E, 1,20 9, 2,03 mmol, %79) saglanmasi için silika jel kolon kromatografiyle (elüan olarak heksan/etil asetat) saflastirildi. (piridin-2-il)hepta-2,4-dien-2-iI)oksasiklododes-4-en-6-il 4-sikloheptilpiperazin-1- karboksilat (bilesik 1) sentezi. MeOH ( içinde bir silil eter solüsyonuna mmol, 2,5 esd.) ile muamele edildi. Tepkime 2 saat süreyle veya tepkimenin LCMS veya TLC tarafindan tamamlandigi belirlenene kadar karistirildi. Tepkime daha sonra etil asetatla seyreltildi ve tuzlu suyla yikandi, magnezyum sülfat üzerinde kurutuldu, filtre edildi ve vakumda konsantre edildi. Ortaya çikan yag, arzu edilen ürünün (bilesik diklorometan/metanol) ile saflastirildi. 1H NMR ( 6: 0.88 (d, Bilesik 2tnin Sentezi ((28,38)-3-((tenf-bütildimetilsilil)oksi)pentari-2-il)0ksiran-2-iI)-6-hidroksi-ö-metilhepta- pladienolid D solüsyonu (F, 5,3 9, 9,7 mmol, 1,0 esd.) nitrojen altinda DMF (80 mL, Tepkimenin oda sicakligina isinmasi saglandi ve 20 saat süreyle veya tepkimenin LCMS veya TLC tarafindan tamamlandigi belirlenene kadar karistirildi. Tepkime etil asetat ile ekstrakte edildi ve organik katman tuzlu suyla yikandi, sodyum sülfat üzerinde kurutuldu, filtre edildi ve vakumda konsantre edildi. Ortaya çikan yag, istenen ürünün (G, 7,5 9, 9,6 mmol, %99) saglanmasi için silika jel kolon kromatografiyle (elüan olarak heksanlar/etil asetat) saflastirildi. ((teit-bütildimetilsilil)oksi)pentan-2-il)oksiran-2-il)-4,5,6-trihidrox-6-metilhept-2-en-2-iI)-7- hidroksi-3,7-dimetiI-12-oksooksasiklododes-4-en-6-il asetat sentezi. Gazi alinmis THF:H20 ( içinde bir olefin solüsyonuna G (7,6 9, 9,7 mmol, 1,0 esd.) nitrojen altinda 0°Cide osmiyum tetroksit (tert bütanol içinde 24,4 mL, 1,9 mmol, esd.) eklendi. Tepkimenin oda sicakligina isinmasi saglandi ve 13 saat süreyle veya tepkimenin LCMS veya TLC tarafindan tamamlandigi belirlenene kadar karistirildi.

Tepkime sodyum sülfit ile sönümlendi, etil asetatla seyreltildi ve organik katman suyla yikandi, magnezyum sülfat üzerinde kurutuldu, filtre edildi ve vakumda konsantre edildi. Ortaya çikan yag, arzu edilen ürünün (H, 6,8 9, 8,3 mmol, %86) saglanmasi için silika jel kolon kromatografiyle (elüan olarak diklorometan/metanol) saflastirildi. 0kso-2-((E)-4-0ksobut-2-en-2-il)0ksasiklododes-4-en-6-il asetat sentezi. Benzen ( nitrojen altinda dakika süreyle veya tepkimenin LCMS veya TLC tarafindan tamamlandigi belirlenene kadar karistirildi. Tepkime konsantre edildi ve arzu edilen ürünün (l, 2,5 9, 5,26 mmol, saflastirild i. dimetiI-12-okso-2-((E)-4-0ksobut-2-en-2-il)oksasiklododes-4-en-6-il asetat sentezi. THF sicakliginda etoksieten ( ve piridinyum p-tolüensülfonat (0,07 9, 0,3 mmol, 0,1 esd.) eklendi. Tepkime 24 saat süreyle veya tepkimenin LCMS veya TLC tarafindan tamamlandigi belirlenene kadar karistirildi. Tepkime sodyum bikarbonat ile sönümlendi ve etil asetatla seyreltildi. Etil asetat suyla, tuzlu suyla yikandi, magnezyum sülfat üzerinde kurutuldu, filtre edildi ve vakumda konsantre edildi. Ortaya çikan yag arzu edilen ürünün (J, 1,2 9, 2,2 mmol, %75) saglanmasi için silika jel kolon kromatografiyle (elüan olarak heksan/etil asetat) saflastirildi. il)sülfonil)propan-2-il)piridin solüsyonuna (695,0 mg, 2,1 mmol, 1,5 esd.) nitrojen altinda -78°C'de damlatilarak KHMDS ( eklendi ve tepkime 20 dakika süreyle karistirildi. Daha sonra THF ( içinde aldehit J (780,0 mg, 1,4 mmol, 1,0 esd.) damlatilarak eklendi. Tepkime -78°C'de 90 dakika süreyle karistirildi ve daha sonra 1 saat süreyle -20°C'ye isinmasi saglandi. Tepkime amonyum klorür ile sönümlendi, etil asetatla seyreltildi ve oda sicakligina isitildi. Organik katman suyla, tuzlu suyla yikandi, magnezyum sülfat üzerinde kurutuldu, filtre edildi ve vakumda konsantre edildi. Ortaya çikan yag arzu edilen Julia ürününün (K, 490 mg, 0,7 mmol, saflastirildi. 1,0 esd.) oda sicakliginda potasyum karbonat (155 mg, 0,4 mmol, 1,5 esd.) eklendi.

Tepkime 24 saat süreyle veya tepkime LSMS veya TLC tarafindan tamamlandigi belirlenene kadar çalistirildi. Tepkime suyla sönümlendi, etil asetatla seyreltildi, tuzlu suyla yikandi, magnezyum sülfat üzerinde kurutuldu, filtre edildi ve vakumda konsantre edildi. Ortaya çikan köpüklü kati madde (L, 459 mg, 0,7 mmol, %100) ilave saflastirma olmadan sonraki adima geçirildi. 4-metilpiperazin-1-karboksilat sentezi. Diklorometan ( içinde bir alkol solüsyonuna L (459 mg, 0,7 mmol, 1,0 esd.) oda sicakliginda N,N-dimetilaminopiridin (27,3 mg, 0,2 mmol, 0,3 esd.) ve trietilamin (, ardindan 4- nitrofenil kloroformat (451 mg, 02,2 mmol, 3:0 esd.) eklendi. Tepkime oda sicakliginda üç saat süreyle karistirildi. Daha sonra, oda sicakliginda N-metiI-piperazin (299 mg, 2,98 mmol, 4,0 esd.) eklendi. Bir saat süreyle karistirmadan sonra, tepkime suyla sönümlendi ve diklorometan ile seyreltildi. Organik katman IN sodyum hidroksit solüsyonuyla yikandi ve organik katman konsantre edildi. Ortaya çikan yag, arzu edilen ürünün (M, 553 mg, 0,75 mmol, %100) saglanmasi için silika jel kolon kromatografiyle (elüan olarak heksanlar/etil asetat) saflastirildi. (piridin-2-il)hepta-2,4-dien-2-il)oksasiklododes-4-en-6-il 4-metilpiperazin-1-karboksilat (bilesik 2) sentezi. Metanol (20 mL, 0,04M) içinde bir silil eter solüsyonuna (M, 553 mmol, 3,0 esd.) eklendi. Tepkime 3 saat süreyle veya tepkime LCMS veya TLC tarafindan tamamlandigi belirlenene kadar karistirildi. Tepkime sodyum bikarbonatla sönümlendi ve etil asetatla seyreltildi. Organik katman suyla, tuzlu suyla yikandi, magnezyum sülfat üzerinde kurutuldu, filtre edildi ve vakumda konsantre edildi. Ortaya çikan yag, arzu edilen ürünün (bilesik 2, 184 mg, 0,33 mmol, %44) saglanmasi için silika jel kolon kromatografiyle (elüan olarak heksan/etil asetat) saflastirildi. 1H NMR Bilesik 3tün Sentezi Adimlar 1-6, L alkolünün saglanmasi için yukarida Bilesik 2`nin sentezinde saglandigi sekildedir. 4-(azepan-1-il)piperidine-1-karboksilat sentezi. Diklorometan ( içinde bir alkol solüsyonuna L (300 mg, 0,49 mmol, 1,0 esd.) oda sicakliginda N,N- Tepkime oda sicakliginda üç saat süreyle karistirildi. Daha sonra oda sicakliginda 1- (piperidin-4-il)azepan (265 mg, 1,46 mmol, 3,0 esd.) eklendi. Bir saat süreyle karistirmadan sonra, tepkime suyla sönümlendi ve diklorometan ile seyreltildi. Organik katman IN sodyum hidroksit solüsyonuyla yikandi ve organik katman konsantre edildi.

Ortaya çikan yag, arzu edilen ürünün (N, 400 mg, 0,48 mmol, %100) saglanmasi için silika jel kolon kromatografiyle (elüan olarak heksanlar/etil asetat) saflastirildi. karboksilat (bilesik 3) sentezi. Metanol içinde ( bir silil eter solüsyonuna mg, 1,2 mmol, 2,5 esd.) eklendi. Tepkime 3 saat süreyle veya tepkime LCMS veya TLC tarafindan tamamlanmis olarak belirlenene kadar karistirildi. Tepkime sodyum bikarbonat ile sönümlendi ve etil asetatla seyreltildi. Organik katman suyla, tuzlu suyla yikandi, magnezyum sülfat üzerinde kurutuldu, filtre edildi ve vakumda konsantre edildi. Ortaya çikan yag, arzu edilen ürünün (bilesik 3, 226, mg, 0,35 mmol, %73) saglanmasi için silika jel kromatografiyle (elüan olarak heksan/etil asetat) saflastirildi. 1H NMR ( Bilesik 4*ün Sentezi Adimlar 1-6, L alkolünün saglanmasi için yukarida Bilesik 2'nin sentezinde saglandigi sekildedir.

ScmaIV solüsyonuna L (20 mg, 0,032 mmol, 1,0 esd.) oda sicakliginda N,N-dimetilaminopiridin (4,8 mg, 0,04 mmol, 0,1 esd.) ve trietilamin (, ardindan 4- nitrofenil kloroformat (13,1 mg, 0,065 mmol, 2,0 esd.) eklendi. Tepkime oda sicakliginda üç saat süreyle karistirildi. Daha sonra oda sicakliginda 1,4'-bipiperidine (16,4 mg, 0,97 mmol, 3,0 esd.) eklendi. Bir saat süreyle karistirmadan sonra, tepkime suyla sönümlendi ve diklorometan ile seyreltildi. Organik katman IN sodyum hidroksit solüsyonuyla yikandi ve organik katman konsantre edildi. Ortaya çikan yag, arzu edilen ürünün (N, 18 mg, 0,22 mmol, %68,4) saglanmasi için silika jel kolon kromatografiyle (elüan olarak heksanlar/etil asetat) saflastirildi. (bilesik 4) sentezi. Metanol içinde ( bir silil eter solüsyonuna (N, 18 mg, mmol, 2,5 esd.) eklendi. Tepkime 3 saat süreyle veya tepkime LCMS veya TLC tarafindan tamamlanmis olarak belirlenene kadar karistirildi. Tepkime sodyum bikarbonat ile sönümlendi ve etil asetatla seyreltildi. Organik katman suyla, tuzlu suyla yikandi, magnezyum sülfat üzerinde kurutuldu, filtre edildi ve vakumda konsantre edildi. Ortaya çikan yag, arzu edilen ürünün (bilesik 4, 4,0 mg, 0,006 mmol, %29) saglanmasi için silika jel kromatografiyle (elüan olarak heksan/etil asetat) saflastirildi. 1H NMR ( 1.46 = 624.6 [M+H].

(S)-2-(1-((1-feniI-1H-tetrazoI-5-iI)süIfonil)propan-2-il)piridin Sentezi Adim 1: Metanol (asetik asit hidroklorür tuzu klorür ( eklendi. Tepkime 0°C'de 60 dakika süreyle veya tepkime LCMS veya TLC tarafindan tamamlanmis olarak belirlenene kadar karistirildi.

Tepkime dikkatli bir sekilde sodyum karbonatla sönümlendi ve sulu katman etil asetatla ekstrakte edildi. Birlesmis organik katmanlar suyla, tuzlu suyla yikandi, magnezyum sülfat üzerinde kurutuldu, filtre edildi ve vakumda konsantre edildi. Ortaya çikan ürün Adim 2: THF ( içinde bir ester solüsyonuna NNNNNN (41,5 9, 275,0 eklendi ve tepkime karisimi iyodometan ( eklenmeden önce 30 dakika süreyle O°C'de karistirildi. Tepkime oda sicakliginda 1 saat süreyle veya tepkime LCMS veya TLC tarafindan tamamlanmis olarak belirlenene kadar karistirildi. Tepkime amonyum klorür ile sönümlendi ve fazla çözücü vakumda yok edildi. Ham materyal daha sonra etil asetatla ekstrakte edildi. Birlesmis organik katmanlar tuzlu suyla yikandi ve magnezyum sülfat üzerinde kurutuldu. Filtrasyondan 250 mmol, %91) saflastirma olmadan sonraki adima tasindi. mmol, eklendi. Tepkimenin kademeli olarak 30 dakika süreyle 0°C`ye ve daha $0nra 1 saat süreyle oda sicakligina veya tepkime LCMS veya TLC tarafindan tamamlanmis olarak belirlenene kadar isinmasi saglandi. Tepkime dikkatli bir sekilde suyla, sodyum hidroksitle ve suyla sönümlendi. Karisimin 30 dakika süreyle karistirilmasindan sonra, beyaz çökelti filtre edildi ve çözücü vakumda yok edildi. Tepkime daha sonra dietil eter ile ekstrakte edildi ve birlesmis organik katmanlar suyla, tuzlu suyla yikandi, magnezyum sülfat üzerinde kurutuldu, filtre edildi ve saflastirma olmadan sonraki adima tasindi.

Adim 4: Diklorometan ( içinde bir alkol solüsyonuna PPPPPP (30,0 9, 219,0 mmol, 1,0 esd.) O°C`de trietilamin ( ve DMAP (2,7 9, 21,9 mmol, 0,1 esd.) eklendi. Asetik anhidrit ( eklendi ve tepkime karisimi 30 dakika süreyle veya tepkime LCMS veya TLC tarafindan tamamlanmis olarak belirlenene kadar karistirildi. Tepkime amonyum klorür ile sönümlendi, organik katman tuzlu suyla yikandi, magnezyum sülfat üzerinde kurutuldu ve filtre edildi. Ortaya çikan solüsyon daha sonra buharlastirildi ve ham asetat kullanildi. yok edildi ve ham kati madde daha sonra pH 7 sulu tamponda ( (sodyum hidroksit / sodyum fosfat monobazik / su) seyreltildi. Domuz pankreatik lipaz tip II (3,3 9 (15mg/mm0l)) eklendi ve tepkime 37°Clde dört saat süreyle veya TLC veya LCMS tarafindan tamamlanmis olarak belirlenene kadar karistirildi. (Dört saat sonra, dönüsüm ELSD'ye göre %40,a ulasti ve enantiyomerik fazlalik kiral SFC ile belirlendi ve 1321 S:R'Iik bir enantiyomerik oran gösterdi). (SFC kosulu: SFC Investigator (Waters/Thar), yazilim: Chromscope v1.2, yöntem: Isokratik %15 es-çözücü 9525 Firin sicakligi 35°C'ye ayarlandi ve sistem basinci 100 bara ayarlandi, Tutulum Süreleri: istenen ve majör (8)-enantiyomer 6,9 dk, minör (R)-enantiy0mer 8,4 dk). Silika jel filtreyle çikarildi ve sulu katman etil asetatla üç kez ekstrakte edildi. Birlesmis organik katmanla tuzlu suyla yikandi, magnezyum sülfat üzerinde kurutuldu ve konsantre edildi. Ürün, arzu edilen alkolün (RRRRRR, 12,5 9, 91 mmol, %41) saglanmasi için silika jel kolon kromatografiyle (elüan olarak heksanlarzetil asetat) saflastirild i.

Adim 6: Diklorometan ( içinde bir alkol solüsyonuna RRRRRR (12,5 9, 91,0 mmol, 1,00 esd.) oda sicakliginda trietilamin ( eklendi. Tepkime 0°C`ye sogutuldu ve daha sonra metansülfonil klorür (7,44 mL, 95,5 mmol, 1,05 esd.) eklendi. Tepkime 0°C'de 30 dakika süreyle veya TLC veya LCMS tarafindan tamamlanmis olarak belirlenene kadar karistirildi. Tepkime sodyum bikarbonatla sönümlendi ve katmanlar ayrildi. Sulu katman daha sonra diklorometan ile ekstrakte edildi. Birlesmis organik katmanlar tuzlu suyla yikandi, magnezyum sülfat üzerinde kurutuldu ve vakumda konsantre edildi. Ortaya çikan sülfonat 888888 (19,2 9, 89 mmol, %98) ilave saflastirma yapilmadan sonraki adima tasindi. 50°C`de 48 saat süreyle veya TLC veya LCMS tarafindan tamamlanmis olarak belirlenene kadar karistirildi. Karisimin oda sicakligina sogutulmasindan sonra, tuzlu su eklendi ve sulu katman üç kez dietil eterle ekstrakte edildi. Birlesmis organik katmanlar suyla, tuzlu suyla yikandi ve magnezyum sülfat üzerinde kurutuldu.

Filtrasyondan sonra, çözücü vakumda yok edildi ve kalinti arzu edilen ürünün (TTTTTT, 28,9 9, 88 mmol, %99) saglanmasi için silika jel kolon kromatografi (heksanlar/etil asetat) kullanilarak saflastirildi. peroksit ( eklendi. Karisim -10°C'de dört saat süreyle veya TLC veya LCMS tarafindan tamamlanmis olarak belirlenene kadar karistirildi. Tepkime suyla ve sodyum metabisülfit solüsyonuyla sönümlendi.

Ham ürün filtrasyonla toplandi ve arzu edilen ürünün (UUUUUU, 23,2 9, 70,4 mmol, saflastirildi. 1H NMR ( 1.66 (br.

Renksiz yag daha sonra tolüen/heptan (1/1) kullanilarak yeniden kristallestirildi. (100 mg bilesik basina 1 mL tolüen ve 1 mL heptan. Iki çözücünün karistirilmasi için karisimi nazikçe isitin. Karisimin 12 saat süreyle oda sicakligina sogumasini saglayin.

Hiç yeniden kristallesme gözlemlenmezse. solüsyona bir adet kristal ekleyin. Kristal tohumlama islemi vasitasiyla kristallerin elde edilmesine yardimci olacaktir.) Zamanla kristaller yavasça olustu. Bunlar filtrasyon vasitasiyla veya sivi katmanin pipet vasitasiyla yok edilmesiyle izole edilebilir. Kristaller daha sonra heptan ile ve daha sonra hizlica tolüen ile yikandi. Sülfonun efsi yeniden kristallesme öncesinde ve sonrasinda analiz edildi. (SFC kosullari: SFC kosulu: SFC Investigator (Waters/Thar), yazilim: Chromscope v1.2, yöntem: 10 dakika boyunca Isokratik %10 es-çözücü MeOH, Kolon: ChiralPak IC, 4.6x250mm, 5um. Toplam Akis: 4mI/dk (CO2 pompasindan 3,80ml, modifiye edici pompadan 0,20 ml), Firin sicakligi 35°C'ye ayarlandi ve sistem basinci 100 bara ayarlandi, Tutulum Süreleri: istenen ve majör (S)- enantiyomer 3,5 dk, minör (R)-enantiyomer 3,8 dk). pH Stabilite Ölçümleri Bilesikler 96-kuyucuklu plakalarda saglandi ve üç kopya olarak test edildi. DMSO içinde bilesigin 10 mMilik bir stok solüsyonunun dört mikrolitresi üç kuyucugun her birine dagitildi. Plaka analiz gününe kadar -20°C`de veya altinda saklandi. Seyreltiler için metanol (HPLC sinifi) ve kullanildi. Iki analiz için hareketli evrenin hazirlanmasi için asetonitril (HPLC sinifi), su (Milli-Q filtre edilmis), triroroasetik asit (izgesel sinif) ve 0,2M fosfat tamponu (Wako, katalog no 163-14471) kullanildi.

Stabilite verisi, bir UV detektörüyle (Waters TUV) ve tekli dört kutuplu MS detektörüyle (Waters SQD) donatilan bir Waters Acquity UPLC kullanilarak elde edildi. Ilgi konusu bilesigi (bilesikleri) ihtiva eden 96-kuyucuklu plaka dondurucudan çikarildi ve bir saat süreyle oda sicakligina isinmasi saglandi. UPLC hazirlandi, dengelendi ve sistem performansi bir standart enjekte edilerek dogrulandi. 1 saat sonra, üç kuyucugun her biri pH = 1 saglamak için 266 uL 0,1 N HCI ile seyreltildi. Plaka örtüldü ve 45 dakika süreyle 600 rpm'de bir çalkalayiciya (Eppindorf Thermomixer R) yerlestirildi. Plaka çalkalayicidan alindi ve her bir kuyucugun içerigi bir filtrasyon plakasi (Millipore katalog no MSSLBPCSO) üzerinden vakumla filtre edildi ve UPLC'ye enjekte edildi. Yaklasik 24 saat sonra, kuyucuklarin içerikleri UPLClye yeniden-enjekte edildi.

UPLC Cihaz Parametreleri (Çözünürlük ve Stabilite Ölçümü) Kolon Acquity HSS T3 kolonu, 2,1 X100 mm, 1,8 pm A=Suda %0,05TFA Hareketli Evre B=CH3CN içinde %0,05TFA Süre Hareketli Evre A:B Elüsyon Gradyani 0,75 3/97 1,0 3/97 1,01 90/10 1,5 90/10 Kolon sicakligi 50°C Saptama UV @ 220 nm Enjeksiyon hacmi 1 pL Akis hizi 0,9 mL/dakika Çesitli tamponlardaki stabilite, metanoldeki analitin pik alanina-% karsilik 0,1 N HCI tamponunda 24 saat zaman noktasi enjeksiyonunda ayni tutulum zamaninda analitin pik alaninin-% karsilastirilmasiyla ölçüldü. Tablo 2'de bildirilen stabilite tayinleri 1-4 bilesiklerin 24-saatlik bir süre boyunca pH 1'de E7107'ye göre daha büyük stabiliteye Tablo 2: Stabilite Tayini Sonuçlari Bilesik % ana kalan (pH = 1, 24 saat) E710? %44 Bilesik 1 %91 Bilesik 2 %96 Bilesik 3 %98 Bilesik 4 %99 Biyolojik Tayinler ücra vivalgilitesi t_avin protokolü sekilde 96-kuyucuklu plakalara ekildi ve gece boyunca inkübe edildi. Tükenen vasat çikarildi ve bilesik stok solüsyonundan DMSO konsantrasyonu %0,1 olarak ayarlanarak bilesigin 9 farkli konsantrasyonunu (100uL/kuyuouk) ihtiva eden taze vasat eklendi. Her bir konsantrasyon islemi her bir konsantrasyonda iki veya üç kopya olarak yapildi.

Ekili hücrelere sahip bir baska plaka bir sifir zaman (Tz) plakasi olarak atandi ve buna vasatta (100uL/kuyucuk) %0,1 DMSO vasati ve hücre viyabilitesinin bir vekili olarak ATP ölçümü için ardindan CellTiter-Gl0® (Promega Corporation, Madison, Wisconsin) eklendi. Bu plakanin birden fazla kuyucugundan alinan ölçümden ortalama deger Tz olarak kullanilir.

BilesikIe-muamele görmüs plakalar 72 saat süreyle 37°C'de inkübe edildi. Daha sonra, CeIITiter-Glo® belirteci (50iJL/kuyucuk) eklendi ve ATP ölçüldü. Iki kopya veya üç kopya bilesikIe-muamele görmüs kuyucuklarin ölçümünden ortalama deger Ti olarak kullanilir ve bilesik olmadan %O,1 DMSO'ya sahip ekili plakalar kontrol büyümesi (C) olarak kullanilir.

Büyüme önlenmesi yüzdesiNiyabilite yüzdesi asagidaki gibi hesaplandi: Ti>l=Tz olan konsantrasyonlar için [(Ti-Tz)/(C-Tz)] x 100 Ti *sifir zaman (Tz), kontrol büyümesi (C) ve bilesik varliginda test büyümesi (Ti) Büyüme önlenmesi yüzdesiNiyabilite yüzdesi, Emax'in belirlenmesi için bilesik konsantrasyonuna karsilik çizilir. bilesik muamelesi esnasinda kontrol büyümesinde (C) ATP'nin net artisinda %50'Iik bir indirgemeyle sonuçlandi.

In vitro uç birlestirme (biyokimyasal) tayin protokolü Müdahaleci dizinin (Ad2) bir silintisine sahip bir adenovirüs tip 2 yapisinin biyotin- transkripsiyonla hazirlandi. Ekson 1 (41 nükleotid), Intron (231 nükleotid) ve Ekson 2 (72 nükleotid) ihtiva eden Ad2 yapisi gen senteziyle üretildi ve Genewiz® (South Plainfield, New Jersey) tarafindan pGEM®-3Z vektörünün (Promega) EcoRl ve Xbal alanlarinin içine klonlandi. Plazmid daha sonra Xbal sindirimiyle dogrusallastirildi ve saflastirildi. Transkribe edilmis ön-mRNA'nin in vitro transkripsiyonu ve saflastirmasi, üreticinin talimatlari izlenerek, sirasiyla, MEGAscript® T7 transkripsiyon kiti (InvitrogenT'V', Life TechnologiesT'V', Grand Island, New York) ve MEGAcIearTM transkripsiyon temizleme kiti (InvitrogenTM, Life TechnologiesTM, Grand Island, New York) kullanilarak gerçeklestirildi. Biyotin 16-UTP'nin (Roche Diagnostics Corporation, iki biyotin molekülü katmak için 1:13'tü.

In vitro tayini 30°C`de, 95pg HeLa nükleer ekstrakt (Promega Corporation, Madison, Wisconsin), 47nM Ad2 ön-mRNA, 25U RNasin RNase inhibitörü (Promega Corporation, Madison, Wisconsin), IX SP tamponu (0,5 mM ATP, 20mM kreatin fosfat, bilesikler ihtiva eden 25uL tepkime karisimlarinda gerçeklestirildi. 90 dk inkübasyondan sonra, tepkime 18uL 5M NaCI eklenmesiyle durduruldu ve karisimlar 10uL M-280 streptavidin-kapli manyetik boncuklarla (InvitrogenT'V', Life TechnologiesTM, Grand yakalamak için inkübe edildi. Boncuklar iki kez 10mM Tris pH=7,5, 1mM EDTA ve 2M NaCI ihtiva eden 100uL tamponla yikandi ve daha sonra RNA'Iarin ayristirilmasi için edildi. RNA'Iar %6 TBE-UREA jeliyle çözündürüldü, bir naylon membrana aktarildi, UV çapraz-baglandi ve bir IRDye® etiketli streptavidin (LI-COR, Lincoln, Nebraska) ile problandi. Uç birlestirilmis RNA miktari, LI-COR Image Studio yazilimi kullanilarak bant florisima yogunlugunun ölçülmesiyle belirlendi.

Sonuçlar Veriler asagidaki Tablo 3'te bildirilmektedir. Emax, negatif bir degerin hücresel öldürücülügü gösterdigi sekilde bir test edilen doz araliginda bir bilesige karsi maksimum elde edilebilen yaniti ifade etmektedir. Daha büyük bir negatif Emax degeri, belirli bir bilesik için daha büyük hücresel öldürücülügü göstermektedir. Örnegin, bir mutant SFSB1 hücre çizgisi olan Panc 05.04 hücrelerinde, daha büyük negatif Emx degeri, Bilesik 1'in Bilesik 2'den daha büyük hücresel öldürücülüge sahip oldugunu göstermektedir.

WiDr-R hücreleri, bir kimyasal olarak-indüklü R1074H mutasyona sahip kolon kanseri hücreleridir ve büyüme önlenmesi açisindan pladienolid B'ye dirençli olduklari gösterilmistir (Yokoi, A., et al., . Bu viyabilite tayininde ”dirençli” bir WiDr-R hücre çizgisiyle bilesiklerin karsi-taramasi, bu bilesiklerin hedef-disi etkiye (etkilere) sahip olup olmadigini gösterebilir. Dirençli WiDr-R hücre çizgisinde büyüme önleyici (Glso) aktiviteden yoksun olan ancak parental WiDr- hücre çizgisinde aktiviteyi muhafaza eden bilesikler, mekanizma-üzeri uç birlestirme modülasyonunun, parental WiDr hücre çizgisinde gözlemlenen büyüme önlenmesinden sorumlu oldugunu öne sürmektedir.

Yukarida tarif edilen in vitro uç birlestirme (IVS) tayini, emsal bir ön-mRNA'nin bir mRNA içine uç birlestirilmesinin önlenmesini izleyen biyokimyasal bir tayindir. Bu biyokimyasal tayin, arastirmacilarin, bu belirli transkriptin uç birlestirilmesinin hangi bilesik konsantrasyonunda, hücresel-olmayan bir baglamda önlendigini tayin etmelerini saglar ve mekanik uç birlestirme önleyici aktiviteyi göstermek Için kullanilir.

Tablo 3: Bilesikler 1, 2, 3 ve 4'ün Biyolojik Aktivitesi Panc 05.04 Pano 05.04 (mt In vitro uç Bilesik (mt SF381 SFSB1 WiDr WiDr-R birlestirme sayisi hücreleri) hücreleri), GI50(nM) GI50(n M) (IVS) tayini Emax(%) GI50(n M) (nM) Açiklamalar Panc 05.04 hücreleri: Pankreas kanseri hücreleri, mutant SF3B1 hücre çizgisi (SF381”de Q699H ve K700E mutasyonlari) WiDr hücreleri: Kolon kanseri hücreleri (dogal sus SF3B1) WiDr-R hücreleri: Kolon kanseri hücreleri (E7107'ye dirençli kimyasal-indüklü SFBBi mutanti (R1074H mutasyonu» BILESIKLERIN ILAVE TESTLERI Fare Farmakokinetik (PK) Çalismasi Bilesik 2 5 mg/kg IV (intravenöz) veya 10 mg/kg PO (oral verilis) olarak CD-1 farelerine dozlandi. Verilisin ardindan, kari örnekleri önceden-belirlenmis zaman noktalarinda bes fareden kuyruk damarinin seri kanatilmasiyla alindi. Kan, verilisten sonra 0,083 (yalniz dakikasi içerisinde plazmanin toplanmasi için 5000 RPM'de 5 dakika süreyle santrifüjlendi. Ekstraksiyondan sonra, örnekler LCMS kullanilarak tayin edildi. PK parametreleri, bölümlü-olmayan analiz kullanilarak WinNonIin v6.3'te hesaplandi.

Veriler, Bilesik 2'nin fare modelinde oral biyoyararlanim ve faydali farmakokinetik özellikleri gösterdigini isaret etmektedir. (SEKIL 1, Tablo 4).

Farmakokinetik Ozellik mglkg IV 10 mglkg PO Cmax (nglmL) NA 840.73 CmaxID (nglmL/D) NA 84.07 tmax (saat) NA 1 .00 Farmakokinetik Özellik mglkg IV 10 mglkg PO AUCo-inf/D (ng-saat/mL/D) 832.71 1.58 NA Vss (Llkg) 2.37 NA Fare Ksenograft Modeli Bilesik 2'nin etkililigi bir fare ksenograft modelinde test edildi. Naim-6 SF3B1K700E izojenik hücreleri (insan ön B-hücre çizgisi, 10x106 hücre) subkütan olarak disi CB17- SCID farelerinin bögrüne implante edildi. Farelere Bilesik 2 (%10 etanol, %5 TWEEN- 80, %85 salin) veya araç kontrolüyle muamele edildi. Hayvanlara oral olarak günlük sekilde 14 gün süreyle (QDx14 PO) SEKIL 2'de gösterilen miktarlarda ilaç verildi ve asagidaki son noktalarin herhangi birine ulasana kadar izlendi: 1) haftada üç kez ölçülen asiri tümör hacmi (tümör hacmi elipsoit formülü kullanilarak hesaplandi: (boy X en2)/2) veya 2) felç veya asiri vücut agirligi kaybi gibi herhangi bir saglik sorununun ortaya çikmasi. Tüm hayvan çalismalari Laboratuvar Hayvanlarinin Bakimi ve Kullanimi için H3 Biyo-tip Kilavuzuna göre gerçeklestirildi.

Sonuçlar, Bilesik 2'nin oral yol vasitasiyla verildiginde etkili oldugunu ve ksenograft fare modelinde tümör büyümesini indirgedigini göstermistir (SEKIL 2).

Fare Ksenoggift Modelinde PKIPD Testi Bilesik 2'nin farmakokinetikleri (PK)/farmak0dinamikleri (PD) ayrica Naim-8 fare ksenograft modelinde de analiz edildi. Naim-6 SF3B1K700E izojenik hücreleri (insan ön B-hücre çizgisi, 10x106 hücre) subkütan olarak disi CB17-SCID farelerinin bögrüne implante edildi. Farelere tek bir oral dozda 10 mglkg Bilesik 2 (%10 etanol, %5 TWEEN-80, %85 salin) verildi ve tümörler analiz için verilisten sonra gösterilen zamanlarda alindi.

RNA, RiboPureTM RNA saflastirma kiti (Ambion®) kullanilarak izole edildi ve qPCR analizi için kullanildi. RNA, SuperScript® VILOTM cDNA sentez kitinin (InvitrogenTM) talimatlarina göre geriye dogru transkribe edildi ve cDNA'nin 0,04 ul'si kantitatif PCR (qPCR) için kullanildi. Ön-mRNA ElF4A1 ve olgun mRNA SLC24A19 için qPCR ve PK degerlendirilmesi önceden bildirildigi sekilde gerçeklestirildi (Eskens, F. A. et al. Phase . Tüm hayvan çalismalari Laboratuvar Hayvanlarinin Bakimi ve Kullanimi için H3 Biyo-tip Kilavuzuna göre gerçeklestirildi.

SEKIL 3'te gösterilen sonuçlar, Bilesik 2'nin oral verilis yolu vasitasiyla tolere edilen bir dozda PD yanitlari gösterdigini isaret etmistir.

Hücresel Viyabilite Tayini Bilesik 2 varliginda Panc (8F3B1'de Q699H ve K700E mutasyonlari) viyabilitesini tayin etmek için, hücreler 384-kuyucuklu bir plakada kuyucuk basina 750 hücre olarak ekildi ve SEKIL 4'te gösterilen konsantrasyonlarda 72 saat süreyle 37°C'de Bilesik 2 ile muamele edildi. Viyabil veya apoptotik hücrelerin bagil sayisi, CELLTITER-GLO® Luminesan Hücre Viyabilite Tayini (Promega) kullanilarak Iuminesanla ölçüldü.

Sonuçlar, farkli mutant SF3B1 pankreas kanseri hücre çizgisinde, dogal-sus SF3B1 pankreas kanseri hücre çizgilerine göre farkli hücresel öldürücülük göstermistir (SEKIL E7107 ve Bilesik 2 için Alternatif Uc Birlestirmenin Karsilastirilmasi E7107 ve Bilesik 2 için alternatif uç birlestirme modülasyonu, nCounter® analiz sistemi (NanoString Techologies, Inc., Seattle, Washington) kullanilarak belirlendi. Naim-6 izojenik hücrelerine 10 x Glso'de 6 saat süreyle Bilesik 2 veya (Eisai, Inc. firmasindan elde edilen) E7107 ile muamele edildi. RNA, RiboPureTM RNA saflastirma kiti (Ambion®) kullanilarak izole edildi ve analiz için kullanildi. RNA, SuperScript® VILOTM cDNA sentez kitinin (InvitrogenTM) talimatlarina göre geriye dogru transkribe edildi ve cDNA'nin 0,04 ul'si qPCR için kullanildi.

SEKIL 5'te gösterilen sonuçlar, Bilesik 2 için uç birlestirme modülasyon profilinin E7107'nin profilinden farkli oldugunu isaret etmistir.

Bilesik 1 5 mg/kg IV veya 12 mg/kg PO CD-1 farelerine dozlandi. Verilisin ardindan, kan örnekleri önceden-belirlenmis zaman noktalarinda bes fareden kuyruk damarinin 8 ve 24ncü saatlerde alindi. Kan örnekleri, kari alinmasinin 30 dakikasi içerisinde plazmanin toplanmasi için 5000 RPM'de 5 dakika süreyle santrifüjlendi.

Ekstraksiyondan sonra, örnekler LCMS kullanilarak tayin edildi. PK parametreleri, bölümlü-olmayan analiz kullanilarak WinNonIin v6.3'te hesaplandi.

Veriler, Bilesik 1'in fare modelinde oral biyoyararlanim ve faydali farmakokinetik özellikleri gösterdigini isaret etmektedir. (SEKIL 6, Tablo 5).

Farmakokinetik Ozellik mg/kg IV 12 mg/kg PO Cmax (nglmL) NA 1810.81 Cmax/D (ng/mL/D) NA 141.47 tmax (saat) NA 0.50 Vss (Llkg) 2.10 NA Farmakokinetik Özellik mglkg IV 12 mglkg PO Bilesik 1'in Bir Fare Ksenograft Modelindeki Etkililigj Bilesik 1'in etkililigi birfare ksenograft modelinde test edildi. NaIm-6 SFSB1K700E izojenik hücreleri (insan ön B-hücre çizgisi, 10x106 hücre) subkütan olarak disi CB17-SCID farelerinin bögrüne implante edildi. Farelere Bilesik 1 (%10 etanol, %5 TWEEN-80, 14 gün süreyle (QDX14 PO) 7,5 mg/kg veya 10 mglkg Bilesik 1 veya araç verildi ve asagidaki son noktalarin herhangi birine ulasana kadar izlendi: 1) haftada üç kez ölçülen asiri tümör hacmi (tümör hacmi elipsoit formülü kullanilarak hesaplandi: (boy x en2)/2) veya 2) felç veya asiri vücut agirligi kaybi gibi herhangi bir saglik sorununun ortaya çikmasi. Tüm hayvan çalismalari Laboratuvar Hayvanlarinin Bakimi ve Kullanimi için H3 Biyo-tip Kilavuzuna göre gerçeklestirildi.

Sonuçlar, Bilesik 1'in oral yol vasitasiyla verildiginde etkili oldugunu ve ksenograft fare modelinde tümör büyümesini indirgedigini göstermistir (SEKIL 7).

Fare Ksenograft Modelinde Bilesik 1'in PKIPD Testi Bilesik 1'In farmakokinetikleri (PK)/farmakodinamikleri (PD) ayrica Nalm-6 fare ksenograft modelinde de analiz edildi. Naim-6 SF'BBimOE izojenik hücreleri (insan ön B-hücre çizgisi, '10x106 hücre) subkütan olarak disi CB17-SCID farelerinin bögrüne implante edildi. Farelere tek bir oral dozda Bilesik 1 (%10 etanol, %5 TWEEN-80, %85 salin) verildi ve tümörler analiz için verilisten sonra gösterilen zamanlarda alindi.

RNA, RiboPureT'V' RNA saflastirma kiti (Ambion®) kullanilarak izole edildi ve qPCR analizi için kullanildi. RNA, SuperScript® VILOTM CDNA sentez kitinin (lnvitrogenTM) talimatlarina göre geriye dogru transkribe edildi ve cDNA'nin 0,04 pl'si kantitatif PCR (qPCR) için kullanildi. Ön-mRNA EIF4A1 ve olgun mRNA SLCZ4A19 için qPCR ve PK degerlendirilmesi önceden bildirildigi sekilde gerçeklestirildi (Eskens, F. A. et al. Phase l pharmacokinetic and pharmacodynamic study of the first-in-class spliceosome . Tüm hayvan çalismalari Laboratuvar Hayvanlarinin Bakimi ve Kullanimi için H3 Biyo-tip Kilavuzuna göre gerçeklestirildi.

SEKIL 8'de gösterilen sonuçlar, Bilesik 1'in oral verilis yolu vasitasiyla tolere edilen bir dozda PD yanitlari gösterdigini isaret etmistir.

Bilesik 3'ün Fare Farmakokinetik (PK) Çalismasi ardindan, kan örnekleri önceden-belirlenmis zaman noktalarinda bes fareden kuyruk damarinin seri kanatilmasiyla alindi. Kan, verilisten sonra 0,083 (yalniz , 0,5, 1, 2, 4, 6, 8 ve 24ncü saatlerde alindi. Kan örnekleri, kan alinmasinin 30 dakikasi içerisinde plazmanin toplanmasi için 5000 RPM'de 5 dakika süreyle santrifüjlendi.

Ekstraksiyondan sonra, örnekler LCMS kullanilarak tayin edildi. PK parametreleri, bölümlü-olmayan analiz kullanilarak WinNonIin v6.3,te hesaplandi.

Veriler, Bilesik 3'ün fare modelinde oral biyoyararlanim ve faydali farmakokinetik özellikleri gösterdigini isaret etmektedir. (SEKIL 9, Tablo 6).

Farmakokinetik Özellik Cmax (ug/mL) NA 1.567 tmax (saat) NA 2.000 Vss (lekg) 2975.561 NA CLtot (lesaat/kg) 954.975 NA Farmakokinetik Ozellik Bilesik 4'ün Fare Farmakokinetik (PK) Çalismasi Bilesik 4 5 mglkg IV veya 10 mglkg PO CD-1 farelerine dozlandi. Verilisin ardindan, kan örnekleri önceden-belirlenmis zaman noktalarinda bes fareden kuyruk damarinin ve 24ncü saatlerde alindi. Kan örnekleri, kan alinmasinin 30 dakikasi içerisinde plazmanin toplanmasi için 5000 RPM'de 5 dakika süreyle santrifüjlendi.

Ekstraksiyondan sonra, örnekler LCMS kullanilarak tayin edildi. PK parametreleri, bölümlü-olmayan analiz kullanilarak WinNonIin v6.3'te hesaplandi.

Veriler, Bilesik 4'ün fare modelinde oral biyoyararlanim ve faydali farmakokinetik özellikleri gösterdigini isaret etmektedir. (SEKIL 10, Tablo 7).

Farmakokinetik Ozellik mglkg IV 10 mglkg PO Cmax (ngmL) NA 1 .252 tmax (saat) NA 2.000 Vss (lekg) 1893.683 NA CLtot (mLIsaat/kg) 754.924 NA Yukarida sunulan sonuçlar, bilesikler 1, 2, 3 ve 4'ün her birinin oral biyoyararlanim ve faydali farmakokinetik özelliklere haiz oldugunu ortaya koymaktadir. Bu, hastalara yetersiz oral biyoyararlanimi nedeniyle intravenöz infüzyon olarak verilmis olan

Claims (1)

ISTEMLER

1. Formül 1'in bir bilesiginden: formül 3'ün bir bilesiginden: 15 formül 4'ün bir bilesiginden: seçilen bir bilesik ve bunun farmakolojik olarak kabul edilen tuzlaridir. Formül 1'in bir bilesiginden seçilen istem 1'e göre bilesik: ve bunun farmakolojik olarak kabul edilen tuzlaridir. Formül 2'nin bir bilesiginden seçilen istem 1`e göre bilesik: ve bunun farmakolojik olarak kabul edilen tuzlaridir. Formül 3'ün bir bilesiginden seçilen istem 1'e göre bilesik: ve bunun farmakolojik olarak kabul edilen tuzlaridir. Formül 4'ün bir bilesiginden seçilen istem 1'e göre bilesik: ve bunun farmakolojik olarak kabul edilen tuzlaridir. Istemler 1 - 5'ten herhangi birine göre bilesik veya bunun farmasötik olarak kabul edilen bir tuzudur, burada söz konusu bilesik stereomerik olarak saftir. Istemler 1 - 5'ten herhangi birine göre bilesik veya bunun farmasötik olarak kabul edilen bir tuzudur, burada söz konusu bilesik bilesigin bir stereoizomerinin agirliginca yaklasik %97lden fazlasini ve bilesigin diger stereoizomerlerinin agirliginca %3`ten azini içerir. Istemler 1 - 7'den herhangi birine göre bilesigi veya bunun farmasötik olarak kabul edilen tuzunu içeren farmasötik bir bilesimdir. Istem 87e göre farmasötik bilesimdir, burada söz konusu bilesim intravenöz, oral, subkütan veya intramusküler verilis için formüle edilir. istem 9'a göre farmasötik bilesimdir, burada söz konusu bilesim oral verilis için formüle edilir. Istemler 1 - 7'den herhangi birine göre bir bilesik veya bunun farmakolojik olarak kabul edilen tuzudur, miyelodisplastik sendromun, kronik Ienfositik Iöseminin, akut Ienfoblastik Iöseminin, kronik miyelomonositik Iöseminin, akut miyeloid yumurtalik kanserinin, meme kanserinin, uveal melanomun, mide kanserinin, kolanjiyokarsinomun veya akciger kanserinin terapötik tedavisinde kullanim Istem 11`e göre bir bilesik veya bunun farmakolojik olarak kabul edilen tuzudur akut miyeloid Iöseminin tedavisinde kullanim içindir. Istem 11'e göre bir bilesik veya bunun farmakolojik olarak kabul edilen tuzudur miyelodisplastik sendromun tedavisinde kullanim içindir. istem ne göre bir bilesik veya bunun farmakolojik olarak kabul edilen tuzudur kronik Ienfositik Iöseminin tedavisinde kullanim içindir. istem 11`e göre bir bilesik veya bunun farmakolojik olarak kabul edilen tuzudur akut Ienfoblastik Iöseminin tedavisinde kullanim içindir. istem 11'e göre bir bilesik veya bunun farmakolojik olarak kabul edilen tuzudur kronik miyelomonositik Iöseminin tedavisinde kullanim içindir. istem 11'e göre bir bilesik veya bunun farmakolojik olarak kabul edilen tuzudur kolon kanserinin tedavisinde kullanim içindir. istem 11'e göre bir bilesik veya bunun farmakolojik olarak kabul edilen tuzudur pankreas kanserinin tedavisinde kullanim içindir. istem 11'e göre bir bilesik veya bunun farmakolojik olarak kabul edilen tuzudur endometriyal kanserin tedavisinde kullanim içindir. istem 11'e göre bir bilesik veya bunun farmakolojik olarak kabul edilen tuzudur yumurtalik kanserinin tedavisinde kullanim içindir. istem 11`e göre bir bilesik veya bunun farmakolojik olarak kabul edilen tuzudur meme kanserinin tedavisinde kullanim içindir. istem ne göre bir bilesik veya bunun farmakolojik olarak kabul edilen tuzudur uveal melanomun tedavisinde kullanim içindir. istem 11'e göre bir bilesik veya bunun farmakolojik olarak kabul edilen tuzudur mide kanserinin tedavisinde kullanim içindir. istem 11'e göre bir bilesik veya bunun farmakolojik olarak kabul edilen tuzudur kolanjiyokarsinomun tedavisinde kullanim içindir. Istem 11`e göre bir bilesik veya bunun farmakolojik olarak kabul edilen tuzudur akciger kanserinin tedavisinde kullanim içindir. istem 11'e göre bir bilesik veya bunun farmakolojik olarak kabul edilen tuzudur burada söz konusu miyelodisplastik sendrom, kronik Ienfositik lösemi, akut kanseri, pankreas kanseri, endometriyal kanser, yumurtalik kanseri, meme kanseri, uveal melanom, mide kanseri, kolanjiyokarsinom veya akciger kanseri bir splisozom geni veya proteinindeki bir veya daha fazla mutasyon için pozitiftir. istem 26'ya göre kullanim için bir bilesik veya bunun farmakolojik olarak kabul edilen tuzudur, burada söz konusu splisozom geni veya proteini, uç birlestirme faktörü SB alt birimi 1 (SFSB1), U2 küçük nükleer RNA yardimci faktör 1 (U2AF1), serin/arjinin-zengini uç birlestirme faktörü 2 (SRSF2), çinko parmak (CCCH tipi) RNA-baglayici motif ve serin/arjinin zengini 2 (ZRSR2), ön-mRNA- isleyen-uç birlestirme faktörü 8 (PRPF8), U2 küçük nükleer RNA yardimci faktör 2 (U2AF2), uç birlestirme faktörü 1 (SF1), uç birlestirme faktörü 3a alt birimi 1 baglayici motif protein 10 (RBM10), poli(rC) baglayici protein 1 (PCBPl), egik boyunlu ön-mRNA uç birlestirme faktörü 1 (CRNKL1), DEAH (Asp-GIu-Ala-His) kutu helikaz 9 (DHXQ), peptidiI-prolil cis-trans izomeraz-benzeri 2 (PPIL2), RNA baglayici motif protein 22 (RBM22), küçük nükleer ribonükleoprotein Sm D3 (SNRPDS), muhtemel ATP-bagimli RNA helikaz DDX5 (DDX5), ön-mRNA-uç birlestirme faktörü ATP-bagimli RNA helikaz DHX15 (DHX15) ve poliadenilat- baglayici protein 1 (PABPC1)”den seçilir. istem 27'ye göre kullanim için bir bilesik veya bunun farmakolojik olarak kabul edilen tuzudur, burada söz konusu splisozom geni veya proteini uç birlestirme faktörü BB alt birimi 1'dir.