KR20160082256A - 플라디에놀리드 피리딘 화합물 및 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규 플라디에놀리드 피리딘 화합물, 이러한 화합물을 함유하는 제약 조성물, 및 상기 화합물을 치료제로서 사용하는 방법을 제공한다. 이들 화합물은 암, 특히 스플라이세오솜 및 그 안에서의 돌연변이를 표적으로 하는 작용제가 유용한 것으로 공지된 암의 치료에서 유용할 수 있다.

Description

플라디에놀리드 피리딘 화합물 및 사용 방법 {PLADIENOLIDE PYRIDINE COMPOUNDS AND METHODS OF USE}
배경
본 발명은 신규 유기 화합물 및 이러한 화합물을 함유하는 제약 조성물을 제공한다. 이들 화합물은 암, 특히 스플라이세오솜(spliceosome) 및 그 안에서의 돌연변이를 표적으로 하는 작용제가 유용한 것으로 공지된 암의 치료에서 유용할 수 있다.
진핵 생물 유기체에서, 새로 합성된 전령 RNA는 전형적으로 성숙 mRNA를 제공하도록 절제되는 다수의 인트론을 갖는다. 스플라이세오솜은 이러한 과제를 완수하는 다중아단위 복합체이다. 스플라이세오솜은 다양한 단백질과 조합된 다섯가지 소형 핵 RNA (snRNA; U1-6)로 이루어진다. 스플라이세오솜 유전자에서의 돌연변이는 다양한 유형의 암에서 밝혀졌다.
예를 들어, 스플라이세오솜의 스플라이싱 인자 3B 아단위 1 (SF3B1)에서의 돌연변이는 다수의 암에 존재하고 항암제의 표적을 포함한다. 이러한 암은 골수이형성 증후군 (MDS), 백혈병, 예컨대 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 만성 골수단구성 백혈병 (CMML), 및 급성 골수성 백혈병 (AML), 및 고형 종양, 예컨대 유방암 및 포도막 흑색종을 포함하나, 그에 제한되지는 않는다.
박테리아 스트렙토마이세스 플라텐시스(Streptomyces platensis)로부터 단리되고 (Sakai, Takashi; Sameshima, Tomohiro; Matsufuji, Motoko; Kawamura, Naoto; Dobashi, Kazuyuki; Mizui, Yoshiharu. Pladienolides, New Substances from Culture of Streptomyces platensis Mer-11107. I. Taxonomy, Fermentation, Isolation and Screening. The Journal of Antibiotics. 2004, Vol. 57, No.3.), 플라디에놀리드로 칭해지며 혈관 표피 성장 인자 (VEGF) 촉진제의 억제제를 선별하면서 발견된 화합물은, 인간 VEGF 촉진제에 의해 제어되는 리포터 유전자의 발현을 억제하고, 이러한 억제는 항암제의 작용의 유용한 메커니즘인 것으로 공지되어 있다.
이들 화합물은 또한 시험관내에서 U251 인간 신경교종 세포의 증식을 억제한다. 이들 화합물 중 가장 효능 있는, 플라디에놀리드 B는, VEGF-촉진 유전자 발현을 1.8 nM의 IC50으로 억제하고, 신경교종 세포 증식을 3.5 nM의 IC50으로 억제한다. 플라디에놀리드 B의 구조는 공지되어 있고 (Sakai, Takashi; Sameshima, Tomohiro; Matsufuji, Motoko; Kawamura, Naoto; Dobashi, Kazuyuki; Mizui, Yoshiharu. Pladienolides, New Substances from Culture of Streptomyces platensis Mer-11107. II. Physico-chemical Properties and Structure Elucidation. The Journal of Antibiotics. Vol. 57, No.3. (2004)), 플라디에놀리드 B는 SF3b 스플라이세오솜을 표적으로 하여 스플라이싱을 억제하고 유전자 발현의 패턴을 변경하는 것으로 공지되어 있다 (Kotake et al., "Splicing factor SF3b as a target of the antitumor natural product pladienolide", Nature Chemical Biology 2007, 3, 570-575).
특정 플라디에놀리드 B 화합물뿐만 아니라, 다른 플라디에놀리드 화합물이, 하기 특허 출원, WO 2002/060890; WO 2004/011459; WO 2004/011661; WO 2004/050890; WO 2005/052152; WO 2006/009276; 및 WO 2008/126918에 개시된 바와 같이, 마찬가지로 공지되어 있다. 예를 들어, E7107로도 공지된, 플라디에놀리드 화합물, (8E,12E,14E)-7-((4-시클로헵틸피페라진-1-일)카르보닐)옥시-3,6,16,21-테트라히드록시-6,10,12,16,20-펜타메틸-18,19-에폭시트리코사-8,12,14-트리엔-11-올리드는, 천연 산물 플라디에놀리드 D의 반합성 유도체이고, 그의 임상 I 연구의 결과가 보고되었다.
그러나, 암, 특히 스플라이세오솜 및 그 안에서의 돌연변이를 표적으로 하는 작용제가 유용한 것으로 공지된 암의 치료에 유용한 추가적 작용제가 필요하다.
본 발명의 목적은 화학식 1의 화합물 ("화합물 1"), 화학식 2의 화합물 ("화합물 2"), 화학식 3의 화합물 ("화합물 3"), 및 화학식 4의 화합물 ("화합물 4"), 및 그의 제약상 허용되는 염을 제공하는 것이다:
Figure pct00001
본 발명의 추가 목적은 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조성물을 제공하는 것이다. 이러한 제약 조성물은 1종 이상의 제약상 허용되는 담체로 제제화될 수 있다. 이러한 조성물은 정맥내, 경구, 피하, 또는 근육내 투여를 포함한, 투여의 다양한 통상적인 경로를 통해 사용하기 위해 제제화된다.
본 발명은 또한 암을 갖는 대상체에게 치료상 유익한 반응을 초래하는데 효과적인 양의 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체를 치료하는 방법에 관한 것일 수 있다. 암은 골수이형성 증후군, 백혈병, 예컨대 만성 림프구성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 골수단구성 백혈병, 또는 급성 골수성 백혈병, 또는 고형 종양, 예컨대 결장암, 췌장암, 자궁내막암, 난소암, 유방암, 포도막 흑색종, 위암, 담관암종, 폐암, 또는 그의 임의의 하위세트일 수 있다. 암은 스플라이세오솜 유전자 또는 단백질에서의 하나 이상의 돌연변이, 예컨대 표 1에 기재된 것들에 대해 양성반응을 보일 수 있다.
본 발명은 또한 치유적 치료, 예를 들어 암의 치료 방법에서, 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도에 관한 것일 수 있다. 암은 골수이형성 증후군, 백혈병, 예컨대 만성 림프구성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 골수단구성 백혈병, 또는 급성 골수성 백혈병, 또는 고형 종양, 예컨대 결장암, 췌장암, 자궁내막암, 난소암, 유방암, 포도막 흑색종, 위암, 담관암종, 폐암, 또는 그의 임의의 하위세트일 수 있다. 암은 스플라이세오솜 유전자 또는 단백질에서의 하나 이상의 돌연변이, 예컨대 표 1에 기재된 것들에 대해 양성반응을 보일 수 있다.
본 발명은 또한 의약의 제조에서, 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도에 관한 것일 수 있다. 특히, 의약은 암의 치료를 위한 것일 수 있다. 암은 골수이형성 증후군, 백혈병, 예컨대 만성 림프구성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 골수단구성 백혈병, 또는 급성 골수성 백혈병, 또는 고형 종양, 예컨대 결장암, 췌장암, 자궁내막암, 난소암, 유방암, 포도막 흑색종, 위암, 담관암종, 폐암, 또는 그의 임의의 하위세트일 수 있다. 암은 스플라이세오솜 유전자 또는 단백질에서의 하나 이상의 돌연변이, 예컨대 표 1에 기재된 것들에 대해 양성반응을 보일 수 있다.
본 발명은 추가로 스플라이세오솜, 예를 들어, SF3B 스플라이세오솜의 아단위 1을 표적으로 하는, 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도에 관한 것일 수 있다.
도 1은 5 mg/kg 정맥내 (IV) 또는 10 mg/kg 경구 투여 (PO)의 용량에서 화합물 2가 투여된 CD-1 마우스에서 약물동태학적 (PK) 연구의 결과를 도시한다.
도 2는 조작된 SF3B1K700E 돌연변이를 갖는 Nalm-6 (인간 프레 B-세포주) 마우스 이종이식 모델에서 화합물 2의 효능을 도시한다. 마우스에게 2.5, 5, 또는 10 mg/kg 화합물 2를 14일 동안 1일 1회 (QD) 투여하고, 종양 부피를 40일 기간에 걸쳐 측정하였다.
도 3은 조작된 SF3B1K700E 돌연변이를 갖는 Nalm-6 (인간 프레 B-세포주) 이종이식 모델에서 화합물 2의 약물동태학적 및 약력학적 분석을 도시한다. 마우스에게 화합물 2의 10 mg/kg PO 용량을 투여하고, 종양 농도 (μg/g) 및 비히클에 대비한 Pre-EIF4A1 (EIF4A1 전사물의 pre-mRNA) 및 SLC25A19 (SLC25A19 전사물의 성숙 mRNA)의 발현에서의 배수 변화(fold change)를 측정하였다.
도 4는 야생형 SF3B1 췌장암 세포주 BXPC3, HPAFII, PANC0403, PANC1005, CFPAC1 및 MIAPACA2와 비교된 PANC0504 암 세포주 (SF3B1MUT) (돌연변이체 PANC 05.04)에서 화합물 2를 이용한 세포 생존력 검정의 결과를 도시한다.
도 5는 나노스트링(Nanostring) 분석을 기반으로 E7107 및 화합물 2 (cmpd 2)에 대한 대안적 스플라이싱의 조정을 나타낸다. "+" 및 "-"는 음영 키(shade key)에서, 각각 양 또는 음의 값을 나타내며, 이는 상이한 스플라이스 접합의 발현의 다양한 수준을 나타낸다.
도 6은 5 mg/kg 정맥내 (IV) 또는 12 mg/kg 경구 투여 (PO)의 용량에서 화합물 1이 투여된 CD-1 마우스에서 PK 연구의 결과를 도시한다.
도 7은 조작된 SF3B1K700E 돌연변이를 갖는 Nalm-6 마우스 이종이식 모델에서 화합물 1의 효능을 도시한다. 마우스에게 7.5 또는 10 mg/kg 화합물 1을 14일 동안 1일 1회 (QD) 투여하고, 종양 부피를 30일 기간에 걸쳐 측정하였다.
도 8은 조작된 SF3B1K700E 돌연변이를 갖는 Nalm-6 이종이식 모델에서 화합물 1의 약물동태학적 및 약력학적 분석을 도시한다. 마우스에게 화합물 1의 단일회 PO 용량을 투여하고, 종양 농도 (μg/g) 및 비히클에 비한 Pre-EIF4A1 (EIF4A1 전사물의 pre-mRNA) 및 SLC25A19 (SLC25A19 전사물의 성숙 mRNA)의 발현에서의 배수 변화를 측정하였다.
도 9는 5.964 mg/kg 정맥내 (IV) 또는 13.307 mg/kg 경구 투여 (PO)의 용량에서 화합물 3이 투여된 CD-1 마우스에서 PK 연구의 결과를 도시한다.
도 10은 5 mg/kg 정맥내 (IV) 또는 10 mg/kg 경구 투여 (PO)의 용량에서 화합물 4가 투여된 CD-1 마우스에서 PK 연구의 결과를 도시한다.
특정 실시양태의 상세한 설명
A. 정의
본원에서 사용된 바와 같이, 달리 명시되지 않는 한, 하기 정의가 적용되어야 한다.
"이성질체"는 동일한 원자 수 및 종류, 그리고 그런 이유로 동일한 분자량을 갖지만, 원자의 배열 또는 배위에 관하여 상이한 화합물을 지칭한다. "입체 이성질체는"는 동일한 원자 연결성을 갖지만 공간에서 그의 원자의 상이한 배열을 갖는 화합물을 지칭한다. 부분입체이성질체 ("diastereoisomer" 또는 "diastereomer")는 거울상이성질체가 아닌 입체이성질체를 지칭한다. "거울상이성질체"는 서로 겹쳐지지 않는 거울 상인 입체이성질체를 지칭한다. "기하 이성질체"는 이중 결합 또는 고리 또는 중심 원자에 관하여 기의 상이한 위치를 갖는 시스-트랜스 이성질체를 지칭한다.
본원에 교시된 거울상이성질체는 특정의 비대칭 중심 또는 중심들에서, 실질적으로 단일 거울상이성질체, 예를 들어, 90%, 92%, 95%, 98%, 또는 99% 이상, 또는 100%에 상당하는 단일 거울상이성질체를 포함하는 "거울상이성질체적으로 순수한" 이성질체를 포함할 수 있다. "비대칭적 중심" 또는 "키랄 중심"은 4개의 상이한 치환기를 갖는 정사면체 탄소 원자를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "입체이성질체적으로 순수한"은 화합물의 하나의 입체이성질체를 포함하고 그 화합물의 다른 입체이성질체들은 실질적으로 없는, 화합물 또는 그의 조성물을 의미한다. 예를 들어, 하나의 키랄 중심을 갖는 화합물의 입체이성질체적으로 순수한 조성물은 화합물의 대향 거울상이성질체가 실질적으로 없을 것이다. 두개의 키랄 중심을 갖는 화합물의 입체이성질체적으로 순수한 조성물은, 화합물의, 부분입체이성질체가 실질적으로 없고, 대향 거울상이성질체가 실질적으로 없을 것이다. 전형적인 입체이성질체적으로 순수한 화합물은 약 80 중량% 초과의 화합물의 하나의 입체이성질체 및 약 20 중량% 미만의 화합물의 다른 입체이성질체들, 보다 바람직하게는 약 90 중량% 초과의 화합물의 하나의 입체이성질체 및 약 10 중량% 미만의 화합물의 다른 입체이성질체들, 훨씬 보다 바람직하게는 약 95 중량% 초과의 화합물의 하나의 입체이성질체 및 약 5 중량% 미만의 화합물의 다른 입체이성질체들, 가장 바람직하게는 약 97 중량% 초과의 화합물의 하나의 입체이성질체 및 약 3 중량% 미만의 화합물의 다른 입체이성질체들을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 번호 7,189,715 참조.
이성질체를 기술하는 용어로서 "R" 및 "S"는 비대칭적으로 치환된 탄소 원자에서 입체화학적 배위의 기술어이다. "R" 또는 "S"와 같은 비대칭적으로 치환된 탄소 원자의 지정은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 바와 같이, 칸-인골드-프렐로그(Cahn-Ingold-Prelog) 우선순위 규칙을 적용하여 행하고, 유기 화학 명명법에 관한 국제 순수 응용 화학 연합의 규칙의 섹션 E, 입체화학[International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) Rules for the Nomenclature of Organic Chemistry. Section E, Stereochemistry]에 기재되어 있다.
암을 "치료", "치료하다", 또는 "치료하는"은 본원에 기재된 바와 같은 암을 반전시키는 것 (예를 들어, 세포의 분화 차단을 극복하는 것), 완화시키는 것 (예를 들어, 하나 이상의 증상, 예컨대 빈혈, 낮은 혈구수 등으로 인한 피로를 완화시키는 것), 및/또는 암의 진행을 지연시키는 것 (예를 들어, 병태의 진행, 예컨대 AML로의 형질전환을 지연시키는 것)을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은, "대상체"는, 동물 대상체, 바람직하게는 포유동물 대상체, 특히 인간을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "제약상 허용되는 담체"는 제제화되는 화합물의 약리학상 활성을 파괴하지 않는, 무독성 담체, 아주반트, 또는 비히클을 지칭한다. 본 발명의 조성물에서 사용될 수 있는 제약상 허용되는 담체, 아주반트 또는 비히클은 이온 교환제, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민, 완충제 물질, 예컨대 인산염, 글리신, 소르브산, 포타슘 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분 글리세리드 혼합물, 물, 염 또는 전해질, 예컨대 프로타민 술페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨, 아연 염, 콜로이드성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로오스계 물질, 폴리에틸렌 글리콜, 시클로덱스트린, 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 폴리아크릴레이트, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모지를 포함하나, 그에 제한되지는 않는다.
"제약상 허용되는 염"은 모 화합물의 목적하는 생물학적 활성을 보유하고 바람직하지 않은 독성학적 효과를 부여하지 않는 염이다. 이러한 염의 예는, (a) 무기산, 예를 들어, 염산, 브로민화수소산, 황산, 인산, 질산 등과 함께 형성된 산 부가 염; 및 유기산, 예를 들어, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 글루콘산, 시트르산, 말산, 아스코르브산, 벤조산, 탄닌산, 팔미트산, 알긴산, 폴리글루탐산, 나프탈렌술폰산, 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 나프탈렌디술폰산, 폴리갈락투론산 등과 함께 형성된 염; 및 (b) 원소상 음이온, 예컨대 염소, 브로민, 및 아이오딘으로부터 형성된 염이다. 예를 들어, 문헌 [Haynes et al., "Commentary: Occurrence of Pharmaceutically Acceptable Anions and Cations in the Cambridge Structural Database," J. Pharmaceutical Sciences, vol. 94, no. 10 (2005)], 및 [Berge et al., "Pharmaceutical salts", J. Pharmaceutical Sciences, vol. 66, no. 1 (1977)]을 참조하며, 이들 문헌은 본원에 참조로 포함된다.
B. 화합물
달리 언급되지 않는 한, 본원에 서술된 화합물은 본원에 서술된 화합물의 혼합물, 및 구조의 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 및 기하 (또는 형태) 형태 중 어느 한 형태; 예를 들어, 각각의 비대칭적 중심에 대한 R 및 S 배위, (Z) 및 (E) 이중 결합 이성질체, 및 (Z) 및 (E) 형태 이성질체를 포함할 수 있다. 달리 언급되지 않는 한, 호변이성질체 형태와 공존하는 본원에 서술된 화합물은 본 발명의 범주 내에 있다. 게다가, 달리 언급되지 않는 한, 본원에 서술된 구조는 또한 단지 하나 이상의 동위원소 농축(enrich) 원자의 존재가 상이한 화합물을 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, 중수소 또는 삼중수소에 의한 수소의 대체, 또는 13C- 또는 14C-농축 탄소에 의한 탄소의 대체를 제외하고 본 구조를 갖는 화합물이 본 발명의 범주 내에 있다. 이러한 화합물은, 예를 들어, 생물학적 검정에서 분석 도구 또는 탐침으로서 유용할 수 있다.
일부 실시양태에 따라 본원에는 화학식 1의 화합물 ("화합물 1"), 화학식 2의 화합물 ("화합물 2"), 화학식 3의 화합물 ("화합물 3"), 및 화학식 4의 화합물 ("화합물 4"), 및 그의 제약상 허용되는 염이 제공된다:
Figure pct00002
C. 제약 제제
본 발명의 화합물은 제약상 허용되는 담체와 조합되어 그의 제약 제제를 제공할 수 있다. 담체 및 제제의 특정의 선택은 조성물이 의도되는 투여의 특정의 투여에 따라 달라질 것이다.
본 발명의 제약 조성물은 비경구, 경구, 흡입 분무, 국소, 직장, 비강, 협측, 질 또는 이식 저장소(implanted reservoir) 투여 등을 위해 적합하게 제제화될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "비경구"는 피하, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액막내, 흉골내, 척추 강내, 간내, 병소내 및 두개내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 특정의 실시양태에서, 화합물은 정맥내로, 경구로, 피하로, 또는 근육내 투여에 의해 투여된다. 본 발명의 조성물의 멸균 주사제 형태는 수성 또는 유성 현탁액일 수 있다. 이들 현탁액은 적절한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 관련 기술분야에 공지된 기술에 따라 제제화될 수 있다. 멸균 주사제 제제는 또한, 예를 들어, 1,3-부탄디올 중 용액으로서, 무독성 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중 멸균 주사액 또는 현탁액일 수 있다. 사용될 수 있는 허용되는 비히클 및 용매 중에는 물, 링커액(Ringer's solution) 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 게다가, 멸균, 고정 오일은 용매 또는 현탁화 매질로서 통상적으로 사용된다.
이를 위해, 합성 모노 - 또는 디-글리세리드를 포함한 임의의 자극적이지 않은(bland) 고정 오일이 사용될 수 있다. 지방산, 예컨대 올레산 및 그의 글리세리드 유도체는, 천연의 제약상 허용되는 오일, 예컨대 올리브 오일 또는 피마자 오일로서, 특히 그의 폴리옥시에틸화 형태로, 주사제의 제조에 유용하다. 이들 오일 용액 또는 현탁액은 또한 장쇄 알콜 희석제 또는 분산제, 예컨대 에멀젼 및 현탁액을 포함한 제약상 허용되는 투여 형태의 제제화에서 통상적으로 사용되는 카르복시메틸 셀룰로스 또는 유사한 분산제를 함유할 수 있다. 다른 통상적으로 사용되는 계면활성제, 예컨대 트윈(Tween), 스판(Span) 및 제약상 허용되는 고체, 액체, 또는 다른 투여 형태의 제조에서 통상적으로 사용되는 다른 유화제 또는 생체이용률 증진제가 또한 제제화의 목적으로 사용될 수 있다.
경구 투여를 위해, 화합물은 캡슐, 정제, 수성 현탁액 또는 용액을 포함하나, 그에 제한되지는 않는, 허용되는 경구 투여 형태로 제공될 수 있다. 경구 사용을 위한 정제의 경우에, 통상적으로 사용되는 담체는 락토스 및 옥수수 전분을 포함한다. 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트가 또한 첨가될 수 있다. 캡슐 형태로의 경구 투여를 위해, 유용한 희석제는 락토스 및 건조 옥수수 전분을 포함한다. 수성 현탁액이 경구 사용에 필요한 경우, 활성 성분은 유화제 및/또는 현탁화제와 조합된다. 원하는 경우, 특정 감미제, 향미제 또는 착색제가 또한 첨가될 수 있다.
D. 대상 및 사용 방법
본 발명의 화합물은 SF3B1을 표적으로 하는 작용제에 반응하는 것들을 포함한, 다양한 유형의 암을 치료하는데 사용될 수 있다. 상기에서 언급된 바와 같이, 플라디에놀리드 B의 항종양 활성은 SF3b 복합체의 그의 표적화에 결부되어 있고, 스플라이싱을 억제하며 유전자 발현의 패턴을 변경시키는 것으로 보고되어 있다 (Kotake et al., "Splicing factor SF3b as a target of the antitumor natural product pladienolide," Nature Chemical Biology 2007, 3, 570-575). 스플라이세오솜 유전자, 예컨대 스플라이싱 인자 3B 아단위 1 (SF3B1) 단백질에서의 돌연변이는 다수의 암, 예컨대 혈액 악성 종양 및 고형 종양에 관계되는 것으로 공지되어 있다. (Scott et al., "Acquired mutations that affect pre-mRNA splicing in hematologic malignancies and solid tumors," JNCI 105, 20, 1540-1549).
혈액 악성 종양은 혈액의 암 (백혈병) 또는 림프절의 암 (림프종)을 포함할 수 있다. 백혈병은 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 만성 골수성 백혈병 (CML), 만성 골수단구성 백혈병 (CMML), 급성 단구성 백혈병 (AMoL) 등을 포함할 수 있다. 림프종은 호지킨 림프종 및 비호지킨 림프종을 포함할 수 있다. 다른 혈액 악성 종양은 골수이형성 증후군 (MDS)을 포함할 수 있다.
고형 종양은 암종, 예컨대 선암종, 예를 들어, 유방암, 췌장암, 전립선암, 결장 또는 결장직장암, 폐암, 위암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 담관암종, 신경교종, 흑색종 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 화합물은 또한 SF3B1이 아닌 스플라이세오솜 유전자 또는 단백질을 표적으로 하는 작용제에 반응성일 수 있는 암을 치료하는데 사용할 수 있다. 하기 예는 스플라이세오솜을 표적으로 하는 작용제에 반응성일 수 있는 다양한 암의 일부의 예시적인 것이고, 본 발명의 범주를 어떤 식으로도 제한하고자 하는 것이 아니다. 따라서, 본 발명의 화합물은 다양한 이러한 암 또는 병태를 치료하기 위해 대상체, 예컨대 하기 암에 걸린 환자 또는 대상체에게 투여될 수 있다:
a) 골수이형성 증후군 (MDS): 예를 들어, 문헌 ["SF3B1 mutations in myelodysplastic syndromes: clinical associations and prognostic implications," Damm F. et al. Leukemia, 2011, 1-4]; ["Frequent pathway mutations in splicing machinery in myelodysplasia," Yoshida K. et al, Nature, 2011, 478, 64-69]; ["Clinical significance of SF3B1 mutations in myelodysplastic syndromes and myelodysplastic/myeloproliferative neoplasms," Malcovati L. et al., Blood, 2011, 118, 24, 6239-6246]; ["Mutations in the spliceosome machinery, a novel and ubiquitous pathway in leukemogenesis," Makishima et al, Blood, 2012, 119, 3203-3210]; ["Somatic SF3B1 mutation in myelodysplasia with ring sideroblasts," Pappaemannuil, E. et al, New England J. Med. 2011, DOI 10.1056/NEJMoa1103283] 참조.
b) 만성 림프구성 백혈병 ( CLL ): 예를 들어, 문헌 ["Defects in the spliceosomal machinery: a new pathway of leukaemogenesis," Maciejewski, J.P., Padgett, R.A., Br. J. Haematology, 2012, 1-9]; ["Mutations in the SF3B1 splicing factor in chronic lymphocytic leukemia: associations with progression and fludarabine-refractoriness," Rossi et al, Blood, 2011, 118, 6904-6908]; ["Exome sequencing identifies recurrent mutations of the splicing factor SF3B1 gene in chronic lymphocytic leukemia," Quesada et al, Nature Genetics, 2011, 44, 47-52] 참조.
c) 만성 골수단구성 백혈병 ( CMML ): 예를 들어, 문헌 [Yoshida et al, Nature 2011]; ["Spliceosomal gene mutations are frequent events in the diverse mutational spectrum of chronic myelomonocytic leukemia but largely absent in juvenile myelomonocytic leukemia," Kar S.A. et al, Haematologia, 2012, DOI: 10.3324/haematol.2012.064048]; [DeBoever et al., "Transcriptome sequencing reveals potential mechanism of cryptic 3' splice site selection in SF3B1-mutated cancers," PLOS Computational Biology, 2013, DOI: 10.1371/journal.pcbi.1004105] 참조.
d) 급성 골수성 백혈병 ( AML ): 예를 들어, 문헌 [Malcovati et al., Blood 2011]; [Yoshida et al, Nature 2011] 참조.
e) 유방암: 예를 들어, 문헌 ["Whole genome analysis informs breast cancer response to aromatase inhibition," Ellis et al., Nature, 2012, 486, 353-360]; [DeBoever et al., "Transcriptome sequencing reveals potential mechanism of cryptic 3' splice site selection in SF3B1-mutated cancers," PLOS Computational Biology, 2013, DOI: 10.1371/journal.pcbi.1004105]; [Maguire et al., "SF3B1 mutations constitute a novel therapeutic target in breast cancer," J Pathol 2015, 235, 571-580] 참조.
f) 포도막 흑색종: 예를 들어, 문헌 ["SF3B1 mutations are associated with alternative splicing in uveal melanoma," Furney et al., Cancer Disc. 2013, 10, 1122-1129]; [DeBoever et al., "Transcriptome sequencing reveals potential mechanism of cryptic 3' splice site selection in SF3B1-mutated cancers," PLOS Computational Biology, 2013, DOI: 10.1371/journal.pcbi.1004105] 참조.
g) 자궁내막암: 예를 들어, 문헌 [Tefferi et al., "Myelodysplastic syndromes." N Engl J Med. 2009; 361:1872-85] 참조.
h) 위암: 예를 들어, 문헌 [Int J Cancer. 2013 Jul;133(1):260-5, "Mutational analysis of splicing machinery genes SF3B1, U2AF1 and SRSF2 in myelodysplasia and other common tumors." Je et al.] 참조
i) 난소암: 예를 들어, 문헌 [Int J Cancer. 2013 Jul;133(1):260-5, "Mutational analysis of splicing machinery genes SF3B1, U2AF1 and SRSF2 in myelodysplasia and other common tumors." Je et al.] 참조.
j) 담도암, 예컨대 담관암종 및 췌장암: 예를 들어, 문헌 [Biankin et al., "Pancreatic cancer genomes reveal aberrations in axon guidance pathway genes," Nature 2012, 491, 399-405] 참조.
k) 폐암: 예를 들어, 문헌 ["Exome sequencing identifies recurrent mutations of the splicing factor SF3B1 gene in chronic lymphocytic leukemia," Quesada et al., Nature Genetics 44, 47-52 (2012)]; [Scott et al., "Acquired mutations that affect pre-mRNA splicing in hematologic malignancies and solid tumors," JNCI 105, 20, 1540-1549] 참조.
게다가, 암에서 체세포 돌연변이의 카탈로그(Catalogue of somatic mutations in cancer) (COSMIC) (웰컴 트러스트 생어 인스티투트(Wellcome Trust Sanger Institute), 게놈 리서치 리미티드(Genome Research Limited), 영국)는 SF3B1 돌연변이가 암 샘플의 다양한 유형에서 발견되었다는 것을 보고한다.
본 발명의 화합물은 대상체에게 치료 유효량 또는 치료상 유효량으로 투여될 수 있다. 담체 물질과 조합되어 단일회 투여 형태로 조성물을 생성할 수 있는 본 발명의 화합물의 양은 치료되는 대상체 및 투여의 특정 경로에 따라 달라질 것이다. 바람직하게는, 0.01 - 100 mg/kg 체중/일의 활성제의 투여량이 이들 조성물을 수령하는 대상체에게 투여될 수 있도록 조성물을 제제화하여야 한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 0.01 mg 내지 50 mg의 투여량을 제공한다. 다른 실시양태에서, 0.1 mg 내지 25 mg 또는 5 mg 내지 40 mg의 투여량이 제공된다.
또한 임의의 특정의 환자에 대한 구체적 투여량 및 치료 요법은 사용되는 구체적 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 식이, 투여 시간, 배설량, 약물 조합, 치료 의사의 판단, 및 치료되는 특정의 질환의 중증도를 포함한, 다양한 인자에 따라 달라질 것이라는 점이 이해되어야 한다. 조성물 중의 본 발명의 활성제의 양은 또한 조성물 중의 특정의 화합물/염에 따라 달라질 것이다.
일부 실시양태에서, 암은 스플라이세오솜 유전자 또는 단백질에서 하나 이상의 돌연변이에 대해 검사되고/거나 양성이며, 여기서 돌연변이(들)의 존재 ("양성")는 대상체의 암이 이러한 단백질 및/또는 스플라이세오솜을 표적으로 하는 화합물의 투여를 포함하는 치료 방법에 반응한다는 것을 나타낼 수 있다. 이러한 스플라이세오솜 유전자의 예는 표 1에 제시된 것들을 포함하나, 그에 제한되지는 않는다.
<표 1>
스플라이세오솜 유전자 및 걸릴 가능성이 있는 질환
Figure pct00003
약어 풀이:
MDS = 골수이형성 증후군
AML = 급성 골수성 백혈병
CMML = 만성 골수단구성 백혈병
LUAD = 폐 선암종
UCEC = 자궁 체부 자궁내막 암종
PMF = 진행성 괴상 섬유증
PRAD = 전립선 선암종
COAD = 결장 선암종
OV = 난소 장액성 낭선암종
SKCM = 피부 흑색종(SKIN CUTANEOUS Melanoma)
LUSC = 폐 편평세포 암종
STAD = 위 선암종
GBM = 다형성 교모세포종
LGG = 뇌 저등급 신경교종
DLBCL = 미만성 큰 B-세포 림프종
일부 실시양태에서, 대상체의 암은 심지어 스플라이세오솜 유전자 또는 단백질 중에 이러한 돌연변이의 부재하에도 이러한 단백질 및/또는 스플라이세오솜을 표적으로 하는 화합물의 투여를 포함하는 치료 방법에 반응할 수 있다.
돌연변이를 선별하거나 검사하는 것은 핵산 증폭, 전기 영동, 마이크로어레이, 블롯, 기능 검정, 면역 검정 등을 통해, 임의의 공지된 수단, 예를 들어, 유전자형결정, 표현형검사 등에 의해 수행될 수 있다. 선별 방법은, 예를 들어, 암성 세포/조직을 함유하는 상기 대상체로부터 생물학적 샘플을 수집하는 것을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 발명이 보다 완전히 이해될 수 있도록, 하기 실시예가 설명된다. 이들 실시예는 단지 예시를 목적으로 하는 것이며 어떠한 방식으로든 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다는 점이 이해되어야 한다.
실시예
화합물 1, 2, 3, 및 4의 제조
일반:
마이크로파 가열은 바이오티지 엠리스 리버레이터(Biotage Emrys Liberator) 또는 이니시에이터(Initiator) 마이크로파를 사용하여 행하였다. 칼럼 크로마토그래피는 이스코(Isco) Rf200d를 사용하여 수행하였다. 용매 제거는 부치(Buechi) 회전식 증발기 또는 제네박(Genevac) 원심 증발기를 사용하여 수행하였다. 제조용 LC/MS는 산성 이동상 상태하에 워터스(Waters) 자동정제기 및 19 x 100 mm 엑스테라(XTerra) 5 마이크로미터 MS C18 칼럼을 사용하여 수행하였다. NMR 스펙트럼은 베리언(Varian) 400MHz 분광계를 사용하여 기록하였다.
반응기 (예를 들어, 반응 용기, 플라스크, 유리 반응기 등)를 기술하는데 사용되는 용어 "불활성화됨"은 반응기 내의 공기가 본질적으로 수분이 없는 또는 건조한, 불활성 기체 (예컨대, 질소, 아르곤 등)로 대체된 것을 의미한다.
본 발명의 화합물을 제조하는 일반적인 방법 및 실험이 이하에 설명된다.
하기 약어가 본원에서 사용된다:
MeOH: 메탄올
DMF: 디메틸포름아미드
KHMDS: 포타슘 비스(트리메틸실릴)아미드
LCMS: 액체 크로마토그래피 - 질량 분석법
TBSCl: tert-부틸디메틸실릴 클로라이드
THF: 테트라히드로푸란
TLC: 박층 크로마토그래피
물질: 하기 화합물은 시판되고 있고/있거나 유기 합성의 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 다수의 방법으로 제조될 수 있다. 보다 구체적으로, 개시된 화합물은 본원에 기재된 반응 및 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 이하에 기재된 합성 방법의 기재에서, 달리 명시되지 않는 한, 용매의 선택, 반응 분위기, 반응 온도, 실험의 지속시간, 및 후처리 절차를 포함한 모든 제안된 반응 조건은 그 반응을 위한 표준 조건으로 선택될 수 있다는 점이 이해되어야 한다. 분자의 다양한 부분에 존재하는 관능가는 제안된 시약 및 반응과 적합하여야 한다는 점이 유기 합성의 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해된다. 반응 조건과 적합하지 않은 치환기는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백하며, 따라서 대안적 방법이 명시된다. 실시예를 위한 출발 물질은 시판되거나 공지된 물질로부터 표준 방법에 의해 용이하게 제조된다.
LCMS 정보
이동상: A (H2O 중 0.1% 포름산) 및 B (아세토니트릴 중 0.1% 포름산).
구배: B 5% → 1.8분내 95%.
칼럼: 액쿼티(Acquity) BEH C18 칼럼 (1.7 um, 2.1 x 50 mm).
둘 다 플라디에놀리드 B 및 플라디에놀리드 D의 전체 합성 방법(Process for Total Synthesis of Pladienolide B and Pladienolide D)이라는 명칭의 미국 특허 번호 7,884,128 및 7,816,401은, 플라디에놀리드 B 및 D의 합성에 대해 관련 기술분야에 공지된 방법을 기재한다. 플라디에놀리드 B 및 D의 합성은 또한 관련 기술분야에 공지되고 문헌 [Kanada et al., "Total Synthesis of the Potent Antitumor Macrolides Pladienolide B and D," Angew . Chem . Int . Ed. 46:4350-4355 (2007)]에 기재된 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 문헌 [Kanada et al.] 및 신규 생리학상 활성 물질(Novel Physiologically Active Substances)이라는 명칭의 PCT 출원 공개 WO 2003/099813은, 플라디에놀리드 D (WO '813의 11107D)로부터 E7107 (WO '813의 화합물 45)의 합성을 위한 관련 기술분야에 공지된 방법을 기재한다. 상응하는 미국 특허는 7,550,503 (Kotake et al.)이다.
화합물의 예시적 합성
화합물 1의 합성
<반응식 I>
Figure pct00004
단계 1: (2S,3S,6S,7R,10R,E)-10-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-((R,2E,4E)-7-((2R,3R)-3-((2S,3S)-3-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)펜탄-2-일)-6-히드록시-6-메틸헵타-2,4-디엔-2-일)-7-히드록시-3,7-디메틸-12-옥소옥사시클로도데크-4-엔-6-일 4-시클로헵틸피페라진-1-카르복실레이트의 합성. 0℃에서 DMF (100 mL, 0.05M) 중 질소하에 E7107 (A, 3.7 g, 5.1 mmol, 1.0 당량)의 용액을 이미다졸 (2.5 g, 36.1 mmol, 7.0 당량)로 처리하고 TBSCl (3.9 g, 25.7 mmol, 5.0 당량)을 첨가하였다. 반응물을 실온으로 가온하고 20시간 동안 또는 LCMS 또는 TLC에 의해 반응이 완료된 것으로 결정될 때까지 교반하였다. 반응물을 에틸 아세테이트로 희석하고 유기 층을 염수로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 중에서 농축하였다. 생성된 오일을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 (용리액으로서 헥산/에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 목적 생성물 (B, 4.7 g, 5.0 mmol, 96%)을 수득하였다.
단계 2: (2S,3S,6S,7R,10R,E)-10-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-2-((6R,E)-7-((2R,3R)-3-((2S,3S)-3-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)펜탄-2-일)옥시란-2-일)-4,5,6-트리히드록시-6-메틸헵트-2-엔-2-일)-7-히드록시-3,7-디메틸-12-옥소옥사시클로도데크-4-엔-6-일 4-시클로헵틸피페라진-1-카르복실레이트의 합성. 0℃에서 질소하에 THF:H2O (10:1, 133 mL:13 mL, 0.03M) 중 올레핀 B (4.7 g, 5.0 mmol, 1.0 당량)의 용액에 사산화오스뮴 (12.4 mL, 1.0 mmol, 0.2 당량, 2.5% 용액)에 이어서 N-메틸모르폴린 N-옥시드 (1.16 g, 9.9 mmol, 2.0 당량)를 첨가하였다. 반응물을 실온으로 가온하고 13시간 동안 또는 LCMS 또는 TLC에 의해 반응이 완료된 것으로 결정될 때까지 교반하였다. 반응물을 아황산나트륨으로 켄칭하고, 에틸 아세테이트로 희석하고, 유기 층을 물로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 중에서 농축하였다. 생성된 오일을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 (용리액으로서 디클로로메탄/메탄올)에 의해 정제하여 목적 생성물 (C, 4.8 g, 4.9 mmol, 99%)을 수득하였다.
단계 3: (2S,3S,6S,7R,10R,E)-10-((tert-부틸디메틸실릴)옥시-7-히드록시-3,7-디메틸-12-옥소-2-((E)-4-옥소부트-2-엔-2-일)옥사시클로도데크-4-엔-6-일 4-시클로헵틸피페라진-1-카르복실레이트의 합성. 실온에서 질소하에 벤젠 (100 mL, 0.05M) 중 디올 C (4.4 g, 4.5 mmol, 1.0 당량)의 용액에 사아세트산납 (4.0 g, 9.0 mmol, 2.0 당량)을 첨가하였다. 반응물을 30분 동안, 또는 LCMS 또는 TLC에 의해 반응이 완료된 것으로 결정될 때까지 교반하였다. 반응물을 아황산나트륨으로 켄칭하고 디클로로메탄으로 희석하였다. 유기 층을 물로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 중에서 농축하였다. 목적 생성물 (D, 1.5 g, 2.3 mmol, 52%)은 고도로 조질이었다.
단계 4: (2S,3S,6S,7R,10R,E)-10-((tert-부틸디메틸실릴)옥시-7-히드록시-3,7-디메틸-12-옥소-2-((R,2E,4E)-6-(피리딘-2-일)헵타-2,4-디엔-2-일)옥사시클로도데크-4-엔-6-일 4-시클로헵틸피페라진-1-카르복실레이트의 합성.
주: (S)-2-(1-((1-페닐-1H-테트라졸-5-일)술포닐)프로판-2-일)피리딘의 합성을 이하에 기재하고 반응식 V에 도시하였다.
-78℃에서 질소하에 무수 THF (30.0 mL, 0.05M) 중 (S)-2-(1-((1-페닐-1H-테트라졸-5-일)술포닐)프로판-2-일)피리딘 (1.67 g, 5.08 mmol, 2.5 당량)에 KHMDS (8.53 ml, 4.265 mmol, 2.1 당량)를 적가하고 반응물을 10분 동안 교반하였다. 그 다음에 THF (10 mL) 중 알데히드 D (2S,3S,6S,7R,10R,E)-10-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-7-히드록시-3,7-디메틸-12-옥소-2-((E)-4-옥소부트-2-엔-2-일)옥사시클로-도데크-4-엔-6-일 4-시클로헵틸피페라진-1-카르복실레이트 (1.318 g, 2.031 mmol, 1.0 당량)를 적가하였다. 반응물을 1시간 동안 -78℃에서 교반한 다음에 밤새 실온으로 가온하였다. 반응물을 물로 켄칭하고 에틸 아세테이트로 희석하였다. 유기 층을 물 및 염수로 희석하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 중에서 농축하였다. 생성된 오일을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 (용리액으로서 헥산/에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 목적 생성물 (E, 1.20 g, 2.03 mmol, 79%)을 수득하였다.
단계 5: (2S,3S,6S,7R,10R,E)-7,10-디히드록시-3,7-디메틸-12-옥소-2-((R,2E,4E)-6-(피리딘-2-일)헵타-2,4-디엔-2-일)옥사시클로도데크-4-엔-6-일 4-시클로헵틸피페라진-1-카르복실레이트 (화합물 1)의 합성. 실온에서 질소하에 MeOH (10.0 mL, 0.24M) 중 실릴 에테르 E (1.80 g, 2.39 mmol, 1.0 당량)의 용액을 pTsOH (1.14 g, 5.98 mmol, 2.5 당량)로 처리하였다. 반응물을 2시간 동안, 또는 LCMS 또는 TLC에 의해 반응이 완료된 것으로 결정될 때까지 교반하였다. 그 다음에 반응물을 에틸 아세테이트로 희석하고 염수로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 중에서 농축하였다. 생성된 오일을 제조용 TLC (용리액으로서 디클로로메탄/메탄올)에 의해 정제하여 목적 생성물 (화합물 1, 1.19 g, 1.83 mmol, 76%)을 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ: 0.88 (d, J=6.65 Hz, 6 H) 1.23 (s, 3 H) 1.34 - 1.78 (m, 12 H) 1.44 (d, J=7.03 Hz, 3 H) 1.73 (s, 3 H) 2.28 - 2.39 (m, 1 H) 2.45 - 2.66 (m, 8 H) 3.48 (br. s., 5 H) 3.72 (m, 2 H) 5.01 (d, J=9.54 Hz, 1 H) 5.14 (d, J=10.67 Hz, 1 H) 5.55 - 5.72 (m, 2 H) 6.00 (dd, J=15.00, 7.47 Hz, 1 H) 6.11 (d, J=11.29 Hz, 1 H) 6.28 - 6.35 (m, 1 H) 7.12 (ddd, J=7.47, 4.89, 1.07 Hz, 1 H) 7.16 (d, J=7.78 Hz, 1 H) 7.61 (t, J=7.65 Hz, 1 H) 8.55 (d, J=4.91 Hz, 1 H). MS (ES+) = 638.4 [M+H]+.
화합물 2의 합성
<반응식 II>
Figure pct00005
단계 1: (2S,3S,6S,7R,10R,E)-10-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-2-((R,2E,4E)-7-((2R,3R)-3-((2S,3S)-3-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)펜탄-2-일)옥시란-2-일)-6-히드록시-6-메틸헵타-2,4-디엔-2-일)-7-히드록시-3,7-디메틸-12-옥소옥사시클로도데크-4-엔-6-일 아세테이트의 합성. 0℃에서 DMF (80 mL, 0.1M) 중 질소하에 플라디에놀리드 D (F, 5.3 g, 9.7 mmol, 1.0 당량)의 용액을 이미다졸 (4.6 g, 67.8 mmol, 7.0 당량) 및 TBSCl (7.3 g, 48.4 mmol, 5.0 당량)로 처리하였다. 반응물을 실온으로 가온하고 20시간 동안, 또는 LCMS 또는 TLC에 의해 반응이 완료된 것으로 결정될 때까지 교반하였다. 반응물을 에틸 아세테이트로 추출하고 유기 층을 염수로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 중에서 농축하였다. 생성된 오일을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 (용리액으로서 헥산/에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 목적 생성물 (G, 7.5 g, 9.6 mmol, 99%)을 수득하였다.
단계 2: (2S,3S,6S,7R,10R,E)-10-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-2-((6R,E)-7-((2R,3S)-3-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)펜탄-2-일)옥시란-2-일)-4,5,6-트리히드록스-6-메틸헵트-2-엔-2-일)-7-히드록시-3,7-디메틸-12-옥소옥사시클로도데크-4-엔-6-일 아세테이트의 합성. 0℃에서 질소하에 탈기된 THF:H2O (210 mL:21 mL, 0.01M) 중 올레핀 G (7.6 g, 9.7 mmol, 1.0 당량)의 용액에 사산화오스뮴 (24.4 mL, 1.9 mmol, 0.2 당량, tert-부탄올 중 2.5% 용액)에 이어서 N-메틸모르폴린 N-옥시드 (2.3 g, 19.5 mmol, 2.0 당량)를 첨가하였다. 반응물을 실온으로 가온하고 13시간 동안, 또는 LCMS 또는 TLC에 의해 반응이 완료된 것으로 결정될 때까지 교반하였다. 반응물을 아황산나트륨으로 켄칭하고, 에틸 아세테이트로 희석하고, 유기 층을 물로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 중에서 농축하였다. 생성된 오일을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 (용리액으로서 디클로로메탄/메탄올)에 의해 정제하여 목적 생성물 (H, 6.8 g, 8.3 mmol, 86%)을 수득하였다.
단계 3: (2S,3S,6S,7R,10R,E)-10-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-7-히드록시-3,7-디메틸-12-옥소-2-((E)-4-옥소부트-2-엔-2-일)옥사시클로도데크-4-엔-6-일 아세테이트의 합성. 실온에서 질소하에 벤젠 (350 mL, 0.03M) 중 디올 H (7.9 g, 9.7 mmol, 1.0 당량)의 용액에 사아세트산납 (8.6 g, 19.4 mmol, 2.0 당량)을 첨가하였다. 반응물을 30분 동안, 또는 LCMS 또는 TLC에 의해 반응이 완료된 것으로 결정될 때까지 교반하였다. 반응물을 농축하고 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 (용리액으로서 헥산/에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 목적 생성물 (I, 2.5 g, 5.26 mmol, 54%)을 수득하였다.
단계 4: (2S,3S,6S,7R,10R,E)-10-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-7-(1-에톡시에톡시)-3,7-디메틸-12-옥소-2-((E)-4-옥소부트-2-엔-2-일)옥사시클로도데크-4-엔-6-일 아세테이트의 합성. THF (9.5 mL, 0.5M) 중 알데히드 I (1.4 g, 2.9 mmol, 1.0 당량)의 용액에 에톡시에텐 (11.1 mL, 40.0 당량) 및 피리디늄 p-톨루엔술포네이트 (0.07 g, 0.3 mmol, 0.1 당량)를 실온에서 첨가하였다. 반응물을 24시간 동안, 또는 LCMS 또는 TLC에 의해 반응이 완료된 것으로 결정될 때까지 교반하였다. 반응물을 중탄산나트륨으로 켄칭하고 에틸 아세테이트로 희석하였다. 에틸 아세테이트를 물, 염수로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 중에서 농축하였다. 생성된 오일을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 (용리액으로서 헥산/에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 목적 생성물 (J, 1.2 g, 2.2 mmol, 75%)을 수득하였다.
단계 5: (2S,3S,6S,7R,10R,E)-10-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-7-(1-에톡시에톡시)-3,7-디메틸-12-옥소-2-((R,2E,4E)-6-(피리딘-2-일)헵타-2,4-디엔-2-일)옥사시클로도데크-4-엔-6-일 아세테이트의 합성. -78℃에서 질소하에 THF (20 mL, 0.06M) 중 (S)-2-(1-((1-페닐-1H-테트라졸-5-일)술포닐)프로판-2-일)피리딘 (695.0 mg, 2.1 mmol, 1.5 당량)의 용액에 KHMDS (4.2 mL, 2.1 mmol, 1.5 당량)를 적가하고 반응물을 20분 동안 교반하였다. 그 다음에 THF (1.0 mL) 중 알데히드 J (780.0 mg, 1.4 mmol, 1.0 당량)를 적가하였다. 반응물을 90분 동안 -78℃에서 교반한 다음에 1시간 동안 -20℃로 가온하였다. 반응물을 염화암모늄으로 켄칭하고, 에틸 아세테이트로 희석하고, 실온으로 가온하였다. 유기 층을 물, 염수로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 중에서 농축하였다. 생성된 오일을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 (용리액으로서 헥산/에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 목적하는 줄리아(Julia) 생성물 (K, 490 mg, 0.7 mmol, 53%)을 수득하였다.
단계 6: (4R,7R,8S,11S,E)-4-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-7-(1-에톡시에톡시)-8-히드록시-7,11-디메틸-12-((R,2E,4E)-6-(피리딘-2-일)헵타-2,4-디엔-2-일)옥사시클로도데크-9-엔-2-온의 합성. 실온에서 메탄올 (15 mL, 0.05M) 중 아세테이트 K (490 mg, 0.7 mmol, 1.0 당량)의 용액에 탄산칼륨 (155 mg, 0.4 mmol, 1.5 당량)을 첨가하였다. 반응물을 24시간 동안, 또는 LCMS 또는 TLC에 의해 반응이 완료된 것으로 결정될 때까지 시행하였다. 반응물을 물로 켄칭하고, 에틸 아세테이트로 희석하고, 염수로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 중에서 농축하였다. 생성된 발포성 고체 (L, 459 mg, 0.7 mmol, 100%)를 추가 정제 없이 다음 단계로 진행시켰다.
단계 7: (2S,3S,6S,7R,10R,E)-10-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-7-(1-에톡시에톡시)-3,7-디메틸-12-옥소-2-((R,2E,4E)-6-(피리딘-2-일)헵타-2,4-디엔-2-일)옥사시클로도데크-4-엔-6-일 4-메틸피페라진-1-카르복실레이트의 합성. 실온에서 디클로로메탄 (0.5 mL, 0.1M) 중 알콜 L (459 mg, 0.7 mmol, 1.0 당량)의 용액에 N,N-디메틸아미노피리딘 (27.3 mg, 0.2 mmol, 0.3 당량) 및 트리에틸아민 (1.0 mL, 7.4 mmol, 10.0 당량)에 이어서 4-니트로페닐 클로로포르메이트 (451 mg, 02.2 mmol, 3.0 당량)를 첨가하였다. 반응물을 3시간 동안 실온에서 교반하였다. 그 다음에, N-메틸-피페라진 (299 mg, 2.98 mmol, 4.0 당량)을 실온에서 첨가하였다. 1시간 동안 교반한 후, 반응물을 물로 켄칭하고 디클로로메탄으로 희석하였다. 유기 층을 1N 수산화나트륨 용액으로 세척하고, 유기 층을 농축하였다. 생성된 오일을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 (용리액으로서 헥산/에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 목적 생성물 (M, 553 mg, 0.75 mmol, 100%)을 수득하였다.
단계 8: (2S,3S,6S,7R,10R,E)-7,10-디히드록시-3,7-디메틸-12-옥소-2-((R,2E,4E)-6-(피리딘-2-일)헵타-2,4-디엔-2-일)옥사시클로도데크-4-엔-6-일 4-메틸피페라진-1-카르복실레이트 (화합물 2)의 합성. 실온에서 메탄올 (20 mL, 0.04M) 중 실릴 에테르 (M, 553 mg, 0.74 mmol, 1.0 당량)의 용액에 p-메톡시톨루엔술폰산 (425 mg, 2.2 mmol, 3.0 당량)을 첨가하였다. 반응물을 3시간 동안, 또는 LCMS 또는 TLC에 의해 반응이 완료된 것으로 결정될 때까지 교반하였다. 반응물을 중탄산나트륨으로 켄칭하고 에틸 아세테이트로 희석하였다. 유기 층을 물, 염수로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 중에서 농축하였다. 생성된 오일을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 (용리액으로서 헥산/에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 목적 생성물 (화합물 2, 184 mg, 0.33 mmol, 44%)을 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ: 0.82-1.00 (m, 3H) 1.22-1.48 (m, 8H) 1.50-1.63 (m, 1H) 1.66-1.83 (m, 4H) 1.97 (s, 1H) 2.07 (s, 1H) 2.33 (s, 3H) 2.40 (br. s., 3H) 2.45-2.68 (m, 3H) 3.44-3.61 (m, 5H) 3.74 (dd, J=14.2, 7.2 Hz, 2H) 5.04 (d, J=9.3 Hz, 1H) 5.17 (d, J=10.5 Hz, 1H) 5.57-5.76 (m, 2H) 6.02 (dd, J=15.1, 7.5 Hz, 1H) 6.13 (d, J=10.8 Hz, 1H) 6.34 (ddd, J=15.1, 10.7, 1.0 Hz, 1H) 7.14 (t, J=6.2 Hz, 1H) 7.18 (d, J=7.4 Hz, 1H) 7.63 (t, J=7.3 Hz, 1H) 8.57 (d, J=5.1 Hz, 1H). MS (ES+) = 556.4 [M+H].
화합물 3의 합성
단계 1 내지 6은 알콜 L을 수득하기 위해, 화합물 2의 합성에서 상기에 제공된 바와 같다.
<반응식 III>
Figure pct00006
단계 7: (2S,3S,6S,7R,10R,E)-10-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-7-(1-에톡시에톡시)-3,7-디메틸-12-옥소-2-((R,2E,4E)-6-(피리딘-2-일)헵타-2,4-디엔-2-일)옥사시클로도데크-4-엔-6-일 4-(아제판-1-일)피페리딘-1-카르복실레이트의 합성. 실온에서 디클로로메탄 (3.0 mL, 0.15M) 중 알콜 L (300 mg, 0.49 mmol, 1.0 당량)의 용액에 N,N-디메틸아미노피리딘 (71.4 mg, 0.58 mmol, 1.2 당량) 및 트리에틸아민 (0.27 mL, 1.95 mmol, 4.0 당량)에 이어서 4-니트로페닐 클로로포르메이트 (196 mg, 0.97 mmol, 2.0 당량)를 첨가하였다. 반응물을 3시간 동안 실온에서 교반하였다. 그 다음에, 1-(피페리딘-4-일)아제판 (265 mg, 1.46 mmol, 3.0 당량)을 실온에서 첨가하였다. 1시간 동안 교반한 후, 반응물을 물로 켄칭하고 디클로로메탄으로 희석하였다. 유기 층을 1N 수산화나트륨 용액으로 세척하고, 유기 층을 농축하였다. 생성된 오일을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 (용리액으로서 헥산/에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 목적 생성물 (N, 400 mg, 0.48 mmol, 100%)을 수득하였다.
단계 8: (2S,3S,6S,7R,10R,E)-7,10-디히드록시-3,7-디메틸-12-옥소-2-((R,2E,4E)-6-(피리딘-2-일)헵타-2,4-디엔-2-일)옥사시클로도데크-4-엔-6-일 4-(아제판-1-일)피페리딘-1-카르복실레이트 (화합물 3)의 합성. 실온에서 메탄올 (4.0 mL, 0.1M) 중 실릴 에테르 (N, 400 mg, 0.48 mmol, 1.0 당량)의 용액에 p-메톡시톨루엔술폰산 (231 mg, 1.2 mmol, 2.5 당량)을 첨가하였다. 반응물을 3시간 동안, 또는 LCMS 또는 TLC에 의해 반응이 완료된 것으로 결정될 때까지 교반하였다. 반응물을 중탄산나트륨으로 켄칭하고 에틸 아세테이트로 희석하였다. 유기 층을 물, 염수로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 중에서 농축하였다. 생성된 오일을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 (용리액으로서 헥산/에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 목적 생성물 (화합물 3, 226 mg, 0.35 mmol, 73%)을 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ: 0.88 (d,　J=6.53 Hz, 3 H) 1.20 - 1.28 (m, 4 H) 1.35 (s, 3 H) 1.45 (d,　J=7.03 Hz, 4 H) 1.59 (br. s., 10 H) 1.74 (d,　J=0.75 Hz, 3 H) 1.75 - 1.83 (m, 2 H) 1.99 (s, 1 H) 2.46 - 2.62 (m, 3 H) 2.62 - 2.71 (m, 4 H) 2.79 (br. s., 2 H) 3.51 (d,　J=9.79 Hz, 1 H) 3.63 - 3.82 (m, 2 H) 4.03 - 4.26 (m, 2 H) 5.01 (d,　J=9.54 Hz, 1 H) 5.16 (d,　J=10.79 Hz, 1 H) 5.54 - 5.64 (m, 1 H) 5.65 - 5.75 (m, 1 H) 6.01 (dd,　J=15.06, 7.53 Hz, 1 H) 6.12 (d,　J=11.04 Hz, 1 H) 6.25 - 6.39 (m, 1 H) 7.12 (ddd,J=7.47, 4.83, 1.25 Hz, 1 H) 7.17 (dt,　J=8.03, 1.00 Hz, 1 H) 7.62 (td,　J=7.65, 1.76 Hz, 1 H) 8.56 (ddd,　J=4.96, 1.82, 1.00 Hz, 1 H). MS (ES+) = 638.6 [M+H].
화합물 4의 합성
단계 1 내지 6은 알콜 L을 제공하기 위해, 화합물 2의 합성에서 상기 제공된 바와 같다.
<반응식 IV>
Figure pct00007
단계 7: (2S,3S,6S,7R,10R,E)-10-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-7-(1-에톡시에톡시)-3,7-디메틸-12-옥소-2-((R,2E,4E)-6-(피리딘-2-일)헵타-2,4-디엔-2-일)옥사시클로도데크-4-엔-6-일 [1,4'-비피페리딘]-1'-카르복실레이트의 합성. 실온에서 디클로로메탄 (0.3 mL, 0.1M) 중 알콜 L (20 mg, 0.032 mmol, 1.0 당량)의 용액에 N,N-디메틸아미노피리딘 (4.8 mg, 0.04 mmol, 1.2 당량) 및 트리에틸아민 (0.02 mL, 0.13 mmol, 4.0 당량)에 이어서 4-니트로페닐 클로로포르메이트 (13.1 mg, 0.065 mmol, 2.0 당량)를 첨가하였다. 반응물을 3시간 동안 실온에서 교반하였다. 그 다음에, 1,4'-비피페리딘 (16.4 mg, 0.97 mmol, 3.0 당량)을 실온에서 첨가하였다. 1시간 동안 교반한 후, 반응물을 물로 켄칭하고 디클로로메탄으로 희석하였다. 유기 층을 1N 수산화나트륨 용액으로 세척하고, 유기 층을 농축하였다. 생성된 오일을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 (용리액으로서 헥산/에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 목적 생성물 (N, 18 mg, 0.22 mmol, 68.4%)을 수득하였다.
단계 8: (2S,3S,6S,7R,10R,E)-7,10-디히드록시-3,7-디메틸-12-옥소-2-((R,2E,4E)-6-(피리딘-2-일)헵타-2,4-디엔-2-일)옥사시클로도데크-4-엔-6-일 [1,4'-비피페리딘]-1'-카르복실레이트 (화합물 4)의 합성. 실온에서 메탄올 (0.5 mL, 0.04M) 중 실릴 에테르 (N, 18 mg, 0.022 mmol, 1.0 당량)의 용액에 p-메톡시톨루엔술폰산 (10.6 mg, 0.56 mmol, 2.5 당량)을 첨가하였다. 반응물을 3시간 동안, 또는 LCMS 또는 TLC에 의해 반응이 완료된 것으로 결정될 때까지 교반하였다. 반응물을 중탄산나트륨으로 켄칭하고 에틸 아세테이트로 희석하였다. 유기 층을 물, 염수로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 중에서 농축하였다. 생성된 오일을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 (용리액으로서 헥산/에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 목적 생성물 (화합물 4, 4.0 mg, 0.006 mmol, 29%)을 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ: 0.90 (d, J=6.8 Hz, 3H) 1.17-1.42 (m, 5H) 1.46 (d, J=7.0 Hz, 6H) 1.51-1.65 (m, 6H) 1.65-1.78 (m, 5H) 1.85 (d, J=11.5 Hz, 2H) 2.44 (d, J=11.3 Hz, 2H) 2.49-2.66 (m, 6H) 2.80 (br. s., 2H) 3.42-3.62 (m, 1H) 3.63-3.82 (m, 2H) 4.18 (br. s., 2H) 5.02 (d, J=9.5 Hz, 1H) 5.17 (d, J=10.8 Hz, 1H) 5.57-5.75 (m, 2H) 6.02 (dd, J=15.2, 7.4 Hz, 1H) 6.14 (d, J=11.0 Hz, 1H) 6.34 (ddd, J=15.1, 10.8, 1.0 Hz, 1H) 7.14 (t, J=6.1 Hz, 1H) 7.18 (d, J=7.5 Hz, 1H) 7.29 (s, 2H) 7.63 (td, J=7.7, 1.9 Hz, 1H) 8.57 (d, J=5.1 Hz, 1H). MS (ES+) = 624.6 [M+H].
(S)-2-(1-((1-페닐-1H- 테트라졸 -5- 일 )술포닐) 프로판 -2- 일 )피리딘의 합성
<반응식 V>
Figure pct00008
단계 1: 0℃에서 메탄올 (500 mL, 0.5M) 중 2-(피리딘-2-일)아세트산 히드로클로라이드 염 MMMMMM (50.0 g, 288.0 mmol, 1.0 당량)의 용액에 티오닐 클로라이드 (31.5 mL, 432.0 mmol, 1.5 당량)를 적가하였다. 반응물을 0℃에서 60분 동안, 또는 LCMS 또는 TLC에 의해 반응이 완료된 것으로 결정될 때까지 교반하였다. 반응물을 탄산나트륨으로 주의하여 켄칭하고 수성 층을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합해진 유기 층을 물, 염수로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 중에서 농축하였다. 생성된 생성물 (NNNNNN, 41.5 g, 275.0 mmol, 95%)을 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.
단계 2: 0℃에서 THF (1500 mL, 0.2M) 중 에스테르 NNNNNN (41.5 g, 275.0 mmol, 1.0 당량)의 용액에 소듐 2-메틸프로판-2-올레이트 (28.6 g, 288.3 mmol, 1.05 당량)를 첨가하고 반응 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반한 후에 아이오도메탄 (34.3 mL, 549.1 mmol, 2.0 당량)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1시간 동안 또는 LCMS 또는 TLC에 의해 반응이 완료된 것으로 결정될 때까지 교반하였다. 반응물을 염화암모늄으로 켄칭하고 과도한 용매를 진공 중에서 제거하였다. 그 다음에 조 물질을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합해진 유기 층을 염수로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조하였다. 여과 후, 혼합물을 진공 중에서 농축하였다. 생성된 메틸 에스테르 (OOOOOO, 41.3 g, 250 mmol, 91%)를 정제 없이 진행시켰다.
단계 3: 0℃에서 THF (1500 mL, 0.1M) 중 메틸 에스테르 OOOOOO (43.0 g, 260.3 mmol, 1.0 당량)의 용액에 수소화알루미늄리튬 (312 mL, 312.4 mmol, 1.2 당량, THF 중 용액)을 적가하였다. 반응물을 서서히 0℃로 30분 동안, 그리고 그 다음에 실온으로 1시간 동안 또는 LCMS 또는 TLC에 의해 반응이 완료된 것으로 결정될 때까지 가온하였다. 반응물을 물, 수산화나트륨 및 물로 주의하여 켄칭하였다. 혼합물을 30분 동안 교반한 후, 백색 침전물을 여과해내고 용매를 진공 중에서 제거하였다. 그 다음에 반응물을 디에틸 에테르로 추출하고 합해진 유기 분획을 물, 염수로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 중에서 농축하였다. 생성된 알콜 (PPPPPP, 30.0 g, 219.0 mmol, 84%)을 정제 없이 진행시켰다.
단계 4: 0℃에서 디클로로메탄 (700 mL, 0.3M) 중 알콜 PPPPPP (30.0 g, 219.0 mmol, 1.0 당량)의 용액에 트리에틸아민 (61.5 mL, 437.4 mmol, 2.0 당량), 및 DMAP (2.7 g, 21.9 mmol, 0.1 당량)을 첨가하였다. 아세트산무수물 (24.8 mL, 262.4 mmol, 1.2 당량)을 첨가하고 반응 혼합물을 30분 동안 또는 LCMS 또는 TLC에 의해 반응이 완료된 것으로 결정될 때까지 교반하였다. 반응물을 염화암모늄으로 켄칭하고, 유기 층을 염수로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고 여과하였다. 그 다음에 생성된 용액을 증발시키고 조 아세테이트 (QQQQQQ, 37.0 g, 206.0 mmol, 94%)를 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.
단계 5: 아세테이트 QQQQQQ (39.4 g, 219.8 mmol, 1.0 당량)의 용액을 디에틸 에테르 (100 mL)에 용해시킨 다음에 118 g의 실리카겔을 첨가하였다. 과도한 에테르를 진공 중에서 제거한 다음에 조 고체를 pH 7 수성 완충제 (1970 mL, 0.1M) (수산화나트륨 / 일염기성 인산나트륨 / 물)에 희석하였다. 돼지 췌장 리파제 유형 II (3.3 g, (15 mg/mmol))를 첨가하고 반응물을 37℃에서 4시간 동안 또는 TLC 또는 LCMS에 의해 완료된 것으로 결정될 때까지 교반하였다. (4시간 후, 전환은 ELSD에 따르면 40%에 이르렀고 거울상이성질체 과잉률은 키랄 SFC에 의해 측정하고, 13:1 S:R의 거울상이성질체 비를 나타냈다). (SFC 조건: SFC 인베스티게이터(Investigator) (워터스/타르(Thar)), 소프트웨어: 크롬스코프(Chromscope) v1.2, 방법: 등용매 15% 공용매 95:5 헵탄:IPA +0.1% DEA, 10분에 걸쳐, 칼럼: Lux-아밀로스-2, 4.6x250 mm, 5 μm, 총 유량: 4 ml/분 (CO2 펌프로부터 3.80 ml, 변경자 펌프(modifier pump)로부터 0.20 ml), 35℃로 설정된 오븐 온도 및 100 bar로 설정된 시스템 압력, 체류 시간: 목적 및 주(major) (S)-거울상이성질체 6.9분, 부(minor) (R)-거울상이성질체 8.4분). 실리카겔을 여과해내고 수성 층을 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 합해진 유기 층을 염수로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고 농축하였다. 생성물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 (용리액으로서 헥산:에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 목적 알콜 (RRRRRR, 12.5 g, 91 mmol, 41%)을 수득하였다.
단계 6: 실온에서 디클로로메탄 (570 mL, 0.16M) 중 알콜 RRRRRR (12.5 g, 91.0 mmol, 1.00 당량)의 용액에 트리에틸아민 (13.9 mL, 100.1 mmol, 1.1 당량)을 첨가하였다. 반응물을 0℃로 냉각한 다음에 메탄술포닐 클로라이드 (7.44 mL, 95.5 mmol, 1.05 당량)를 첨가하였다. 반응물을 0℃에서 30분 동안 또는 TLC 또는 LCMS에 의해 완료된 것으로 결정될 때까지 교반하였다. 반응물을 중탄산나트륨으로 켄칭하고 층을 분리하였다. 그 다음에 수성 층을 디클로로메탄으로 추출하였다. 합해진 유기 층을 염수로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 진공 중에서 농축하였다. 생성된 술포네이트 SSSSSS (19.2 g, 89 mmol, 98%)를 추가 정제 없이 진행시켰다.
단계 7: 실온에서 DMF (120 mL, 0.1M) 중 술포네이트 SSSSSS (19.2 g, 89 mmol, 1.0 당량)의 용액에 탄산세슘 (40.7 g, 125.0 mmol, 1.4 당량) 및 1-페닐-1H-테트라졸-5-티올 (19.1 g, 107.1 mmol, 1.2 당량)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 50℃에서 48시간 동안, 또는 TLC 또는 LCMS에 의해 완료된 것으로 결정될 때까지 교반하였다. 혼합물을 실온으로 냉각한 후, 염수를 첨가하고 수성 층을 디에틸 에테르로 3회 추출하였다. 합해진 유기 층을 물, 염수로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조하였다. 여과 후, 용매를 진공 중에서 제거하고 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 (헥산/에틸 아세테이트)를 사용하여 정제하여 목적 생성물 (TTTTTT, 28.9 g, 88 mmol, 99%)을 수득하였다.
단계 8: -10℃에서 EtOH (700 mL, 0.1M) 중 술피드 TTTTTT (31.5 g, 105.9 mmol, 1.0 당량)의 용액에 몰리브덴산암모늄 사수화물 (6.5 g, 5.3 mmol, 0.05 당량) 및 과산화수소 (108 mL, 1060 mmol, 5.0 당량, 33% 수용액)를 첨가하였다. 반응물을 -10℃에서 4시간 동안 또는 TLC 또는 LCMS에 의해 완료된 것으로 결정될 때까지 교반하였다. 반응물을 물로 켄칭하고 메타중아황산나트륨 용액으로 켄칭하였다. 조 생성물을 여과에 의해 수집하고 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 (용리액으로서 헥산:에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 목적 생성물 (UUUUUU, 23.2 g, 70.4 mmol, 66%)을 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ: 1.50 (d, J=7.03 Hz, 3 H) 1.66 (br. s., 1 H) 3.75 (m, 1 H) 3.94 (dd, J=14.81, 5.02Hz, 1 H) 4.55 (dd, J=14.68, 7.91 Hz, 1 H) 7.14 - 7.22 (m, 2 H) 7.29 (s, 1 H) 7.57 - 7.70 (m, 6 H) 8.44 - 8.49 (m, 1 H).
그 다음에 무색 오일을 톨루엔/헵탄 (1/1) (100 mg의 화합물 당 1 mL의 톨루엔 및 1 mL의 헵탄)을 사용하여 재결정화하였다. 혼합물을 약하게 가열하여 두 용매를 혼합하였다. 혼합물을 12시간 동안 실온으로 냉각하였다. (어떤 재결정화도 관찰되지 않는 경우, 하나의 결정을 용액에 첨가한다. 상기 결정은 시딩 과정을 통해 결정들을 얻는데 도움을 줄 것이다.) 결정들이 시간이 지남에 따라 서서히 형성되었다. 이들은 피펫을 통해 액체 층을 제거함으로써 또는 여과를 통해 단리할 수 있었다. 그 다음에 결정을 헵탄으로 세척한 다음에 톨루엔으로 급속히 세척하였다. 술폰의 er을 재결정화 전후에 분석하였다. (SFC 조건: SFC 상태: SFC 인베스티게이터 (워터스/타르), 소프트웨어: 크롬스코프 v1.2, 방법: 등용매 10% 공용매 MeOH, 10분에 걸쳐, 칼럼: 키랄팩(ChiralPak) IC, 4.6x250 mm, 5 um, 총 유량: 4 ml/분 (CO2 펌프로부터 3.80 ml, 변경자 펌프로부터 0.20 ml), 35℃로 설정된 오븐 온도 및 100 bar로 설정된 시스템 압력, 체류 시간: 목적 및 주 (S)-거울상이성질체 3.5분, 부 (R)-거울상이성질체 3.8분).
pH 안정성 측정
화합물을 96-웰 플레이트에 제공하고 삼중으로 시험하였다. DMSO 중 화합물의 10 mM 스톡 용액의 4 마이크로리터를 3개의 웰 각각에 분배하였다. 플레이트를 분석일까지 -20℃ 이하에서 보관하였다. 메탄올 (HPLC 등급) 및 0.1 N HCl (EMD 카탈로그 HX0603A-6)을 희석에 사용하였다. 아세토니트릴 (HPLC 등급), 물 (밀리(Milli)-Q 여과됨), 트리플루오로아세트산 (스펙트럼 등급) 및 0.2M 인산염 완충제 (와코(Wako), 카탈로그 번호 163-14471)를 사용하여 두가지 분석을 위한 이동상을 제조하였다.
안정성 데이터를 UV 검출기 (워터스 TUV) 및 단일 사중극자 MS 검출기 (워터스 SQD)가 장착된 워터스 액쿼티(Waters Acquity) UPLC를 사용하여 수득하였다. 관심 화합물(들)을 함유하는 96-웰 플레이트를 냉동고로부터 꺼내고 1시간 동안 실온으로 가온하였다. UPLC를 프라이밍하고, 평형화시키고 시스템 성능을 표준물을 주입함으로써 확인하였다. 1시간 후, 3개의 웰 각각을 266 μL 0.1 N HCl로 희석하여 pH = 1을 얻었다. 플레이트를 덮고 600 rpm에서 45분 동안 진탕기 (에핀도르프 써모믹서(Eppindorf Thermomixer) R) 상에 놓았다. 플레이트를 진탕기에서 꺼내고, 각각의 웰의 내용물을 진공에 의해 여과 플레이트 (밀리포어(Millipore) 카탈로그 번호 MSSLBPC50)로부터 여과하고 UPLC에 주입하였다. 대략 24시간 후, 웰의 내용물을 UPLC에 재주입하였다.
UPLC 기기 파라미터 (용해도 및 안정성 측정)
Figure pct00009
다양한 완충제에서의 안정성을 메탄올 중 분석물의 피크 면적-%를 24시간 시점 주입에서 0.1 N HCl 완충제 중 동일 체류 시간에서 분석물의 피크 면적-%와 비교함으로써 측정하였다. 표 2에 보고된 안정성 검정은 화합물 1 내지 4가 24시간 기간에 걸쳐 화합물 E7107보다 pH 1에서 더 큰 안정성을 갖는다는 것을 나타낸다.
<표 2>
안정성 검정 결과
Figure pct00010
생물학적 검정
세포 생존력 검정 프로토콜
세포 (ATCC로부터 입수된 WiDr 및 Panc05.04)를 96-웰 플레이트에, 2000개 세포/100 μL/웰로 시딩하고, 밤새 인큐베이션하였다. 소비된 배지를 제거하고, 화합물 (100 μL/웰)의 9개의 상이한 농도를 함유하는 새로운 배지를 첨가하고, 화합물 스톡 용액으로부터의 DMSO 농도를 0.1%로 조정하였다. 각각의 화합물 처리를 각각의 농도에서 이중 또는 삼중으로 행하였다.
시딩된 세포를 갖는 또 다른 플레이트를 타임 제로 (Tz) 플레이트 전용으로 하고, 여기에 배지 중 0.1% DMSO (100 μL/웰)에 이어서 셀티터-글로(CellTiter-Glo)® 시약 (프로메가 코포레이션(Promega Corporation), 위스콘신주 매디슨) (50 μL/웰)을 첨가하여 세포 생존력의 대용품으로서 ATP를 측정하였다. 이 플레이트의 다중 웰의 측정으로부터의 평균 값을 Tz로서 사용하였다.
화합물-처리 플레이트를 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음에, 셀티터-글로® 시약 (50 μL/웰)을 첨가하고 ATP를 측정하였다. 이중 또는 삼중 화합물-처리 웰의 측정으로부터의 평균 값을 Ti로서 사용하고, 화합물 없이 0.1% DMSO를 갖는 배지로 시딩된 플레이트를 대조군 성장 (C)으로서 사용하였다.
성장 억제 백분율/생존력 백분율을 다음과 같이 계산하였다:
Ti>/=Tz인 경우의 농도 [(Ti-Tz)/(C-Tz)] x 100
Ti<Tz인 경우의 농도 [(Ti-Tz)/Tz] x 100.
*타임 제로 (Tz), 대조군 성장 (C), 및 화합물 (Ti)의 존재하에 시험군 성장
성장 억제 백분율/생존력 백분율을 화합물 농도에 대하여 플로팅하여 Emax를 결정하였다.
50%의 성장 억제 (GI50)는 [(Ti-Tz)/(C-Tz)] x 100 = 50으로부터 계산하고, 이는 화합물 처리 동안에 대조군 성장 (C)에서 ATP의 순증가에서의 50% 감소를 초래하는 약물 농도이다.
시험관내 스플라이싱 (생화학) 검정 프로토콜
개재 서열의 결손을 갖는 아데노바이러스 유형 2 구축물 (Ad2)의 비오틴-표지된 pre-mRNA (Berg, M.G., et al. 2012 Mol. Cell Bio., 32(7):1271-83)를 시험관내 전사에 의해 준비하였다. 엑손 1 (41개 뉴클레오티드), 인트론 (231개 뉴클레오티드), 및 엑손 2 (72개 뉴클레오티드)를 함유하는 Ad2 구축물을 유전자 합성에 의해 발생시키고 젠위즈(Genewiz)® (뉴저지주 사우스 플레인필드)에 의한 pGEM®-3Z 벡터 (프로메가)의 EcoRI 및 XbaI 부위로 클로닝하였다. 그 다음에 플라스미드를 XbaI 절단(digestion)에 의해 선형화하고 정제하였다. 시험관내 전사 및 전사된 pre-mRNA의 정제를 제조업체의 사용설명서에 따라, 각각 메가스크립트(MEGAscript)® T7 전사 키트 (인비트로겐(Invitrogen)™, 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)™, 뉴욕주 그랜드 아일랜드) 및 메가클리어(MEGAclear)™ 전사 클린-업 키트 (인비트로겐™, 라이프 테크놀로지스™, 뉴욕주 그랜드 아일랜드)를 사용하여 수행하였다. 냉 UTP에 대한 비오틴-16-UTP (로슈 다이아그노스틱스 코포레이션(Roche Diagnostics Corporation), 인디애나주 인디애나폴리스)의 비는 1:13이어서 스플라이싱된 Ad2 mRNA당 대략 2개의 비오틴 분자를 혼입하였다.
시험관내 스플라이싱 검정을 95 μg HeLa 핵 추출물 (프로메가 코포레이션, 위스콘신주 매디슨), 47nM Ad2 pre-mRNA, 25U RNasin RNase 억제제 (프로메가 코포레이션, 위스콘신주 매디슨), 1X SP 완충제 (0.5 mM ATP, 20 mM 크레아틴 포스페이트, 1.6 mM MgCl2), 및 (DMSO의 1% 최종 농도를 갖는) DMSO 중 화합물을 함유하는 25 μL 반응 혼합물에서 30℃에서 수행하였다. 90분의 인큐베이션 후, 18 μL의 5M NaCl을 첨가하여 반응을 중단시키고, 혼합물을 실온에서 30분 동안 10 μL의 M-280 스트렙타비딘-코팅된 자기 비드 (인비트로겐™, 라이프 테크놀로지스™, 뉴욕주 그랜드 아일랜드)와 함께 인큐베이션하여 Ad2 pre- 및 스플라이싱된 mRNA를 포획하였다. 비드를 10 mM 트리스(Tris) pH=7.5, 1mM EDTA 및 2M NaCl을 함유하는 100 uL 완충제로 2회 세척한 다음에, 10분 동안 70℃에서 95% 포름아미드를 함유하는, RNA 겔 로딩 완충제에서 인큐베이션하여 RNA를 용출시켰다. Ad2 RNA를 6% TBE-UREA 겔에 의해 분해시키고, UV 교차 결합된 나일론 막에 옮기고 IRDye® 표지된 스트렙타비딘 (LI-COR, 네브라스카주 링컨)으로 탐침하였다. LI-COR 이미지 스튜디오(Image Studio) 소프트웨어를 사용하여 밴드 형광 강도를 측정함으로써 스플라이싱된 RNA의 양을 정량화하였다.
결과
데이터를 이하에 표 3에 보고하였다. Emax는 시험된 용량 범위에서 화합물에 대한 최대 달성가능한 반응을 지칭하고, 음의 값은 세포 치사율을 나타낸다. 보다 큰 음의 Emax 값은 특정의 화합물의 경우에 보다 큰 세포 치사율을 나타낸다. 예를 들어, Panc 05.04 세포, 돌연변이체 SF3B1 세포주에서, 보다 큰 음의 Emax 값은 화합물 1이 화합물 2보다 더 큰 세포 치사율을 가졌음을 나타낸다.
WiDr-R 세포는 화학적으로 유도된 R1074H 돌연변이를 갖고 성장 억제의 측면에서 플라디에놀리드 B에 내성인 것으로 나타난 결장암 세포이다 (Yokoi, A., et al., 2011 FEBS Journal, 278:4870-4880). "내성" WiDr-R 세포주를 이용한 이러한 생존력 검정에서 화합물의 반대-선별(counter-screening)은 이들 화합물이 오프-타겟(off-target) 효과를 갖는지 여부를 나타낼 수 있다. 내성 WiDr-R 세포주에서 성장 억제 (GI50) 활성이 결핍되어 있지만 모 WiDr 세포주에서 활성을 유지하는 화합물은 온-메커니즘(on-mechanism) 스플라이싱 조정이 모 WiDr 세포주에서 관찰되는 성장 억제에 원인이 된다는 점을 시사한다.
상기 기재된 시험관내 스플라이싱 (IVS) 검정은 예시적 pre-mRNA의 mRNA로의 스플라이싱의 억제를 모니터링하는 생화학 검정이다. 이러한 생화학 검정으로 인해 연구자들은 어떤 화합물 농도에서 이러한 특정의 전사물의 스플라이싱이 비세포 맥락에서 억제되는 지를 평가할 수 있게 되고 이 생화학 검정을 사용하여 메커니즘적 스플라이싱 억제 활성을 입증한다.
<표 3>
화합물 1, 2, 3 및 4의 생물학적 활성
Figure pct00011
약어 풀이
Panc 05.04 세포: 췌장암 세포, 돌연변이체 SF3B1 세포주 (SF3B1에서 Q699H 및 K700E 돌연변이)
WiDr 세포: 결장암 세포 (야생형 SF3B1)
WiDr-R 세포: 결장암 세포 (E7107 (R1074H 돌연변이)에 내성인 화학적으로 유도된 SF3B1 돌연변이체)
화합물의 추가 시험
마우스 약물동태학적 (PK) 연구
화합물 2를 5 mg/kg IV (정맥내) 또는 10 mg/kg PO (경구 투여)에서 CD-1 마우스에게 투여하였다. 투여 후, 5마리 마우스로부터 꼬리 정맥의 연속 채혈을 통해 미리 결정된 시점에서 혈액 샘플을 수집하였다. 투여 후 0.083 (단지 0.167 PO), 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 및 24시간에서 혈액을 수집하였다. 혈액 샘플을 5분 동안 5000 RPM에서 원심분리하여 혈액 수집 30분 내에 혈장을 수집하였다. 추출 후, LCMS를 사용하여 샘플을 검정하였다. 윈논린(WinNonlin) v6.3에서 비구획 분석(non-compartmental)을 사용하여 PK 파라미터를 계산하였다.
데이터는 화합물 2가 마우스 모델에서 경구 생체이용률 및 유리한 약물동태학적 특성을 보인다는 것을 나타냈다 (도 1, 표 4).
<표 4>
Figure pct00012
마우스 이종이식 모델
화합물 2의 효능을 마우스 이종이식 모델에서 시험하였다. Nalm-6 SF3B1K700E 동질유전자 세포 (인간 프레 B-세포주, 10x106개 세포)를 암컷 CB17-SCID 마우스의 옆구리에 피하 이식하였다. 마우스를 화합물 2 (10% 에탄올, 5% 트윈-80, 85% 생리식염수) 또는 비히클 대조군으로 처리하였다. 동물에게 도 2에 명시된 양으로 14일 동안 매일 경구 투여 (QDx14 PO)하고 이들이 하기 평가항목 중 어느 한쪽에 이를 때까지 이들을 모니터링하였다: 1) 1주에 3회 측정된 과도한 종양 부피 (타원체 식: (길이 × 폭2)/2을 사용함으로써 계산된 종양 부피); 또는 2) 임의의 건강 문제, 예컨대 마비 또는 과도한 체중 감량의 발생. 모든 동물 연구는 실험 동물의 관리 및 사용에 관한 H3 생물 의학 지침서(H3 Biomedicine Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)에 따라 수행하였다.
결과는 화합물 2가 경구 경로를 통해 투여시 효과적이고 이종이식 마우스 모델에서 종양 성장을 감소시켰다는 것을 나타냈다 (도 2).
마우스 이종이식 모델에서 PK/PD 시험
화합물 2의 약물동태학 (PK)/약력학 (PD)을 또한 Nalm-6 마우스 이종이식 모델에서 분석하였다. Nalm-6 SF3B1K700E 동질유전자 세포 (인간 프레 B-세포주, 10x106개 세포)를 암컷 CB17-SCID 마우스의 옆구리에 피하 이식하였다. 마우스에게 단일회 경구 용량의 10 mg/kg 화합물 2 (10% 에탄올, 5% 트윈-80, 85% 생리식염수)를 투여하고, 분석을 위해 투여후 명시된 시간에서 종양을 수집하였다.
RNA를 리보퓨어(RiboPure)™ RNA 정제 키트 (앰비온(Ambion)®)를 사용하여 단리하고 qPCR 분석에 사용하였다. RNA를 슈퍼스트립트(SuperScript)® 빌로(VILO)™ cDNA 합성 키트 (인비트로겐™)의 사용설명서에 따라 역전사시키고, 0.04 μl의 cDNA를 정량적 PCR (qPCR)에 사용하였다. pre-mRNA EIF4A1 및 성숙 mRNA SLC24A19에 관한 qPCR 및 PK 평가를 이전에 보고된 바와 같이 수행하였다 (Eskens, F. A. et al. Phase I pharmacokinetic and pharmacodynamic study of the first-in-class spliceosome inhibitor E7107 in patients with advanced solid tumors. Clin Cancer Res. 19, 6296-6304, doi:10.1158/1078-0432.CCR-13-0485 (2013)). 모든 동물 연구는 실험 동물의 관리 및 사용에 관한 H3 생물 의학 지침서에 따라 수행하였다.
도 3에 도시된 결과는 화합물 2가 경구 투여 경로를 통해 내성 용량에서 PD 반응을 보였다는 것을 나타냈다.
세포 생존력 검정
화합물 2의 존재하에 Panc 05.04 암 세포 (SF3B1MUT) (SF3B1에서 Q699H 및 K700E 돌연변이)의 생존력을 평가하기 위해, 세포를 384-웰 플레이트에서 웰당 750개 세포로 시딩하고 37℃에서 72시간 동안 도 4에 명시된 농도에서 화합물 2로 처리하였다. 셀티터-글로® 발광성 세포 생존력 검정 (프로메가)을 사용한 발광에 의해 생존 또는 아폽토시스성 세포의 상대수를 측정하였다.
결과는 야생형 SF3B1 췌장암 세포주에 비해 돌연변이체 SF3B1 췌장암 세포주에서 차별적인 세포 치사율을 나타냈다 (도 4).
E7107 및 화합물 2 에 관한 대안적 스플라이싱의 비교
E7107 및 화합물 2에 관한 대안적 스플라이싱의 조정을 엔카운터(nCounter)® 분석 시스템 (나노스트링 테크놀로지스, 인크.(NanoString Techologies, Inc.), 워싱턴주 시애틀)을 사용하여 결정하였다. Nalm-6 동질유전자 세포를 6시간 동안 10 x GI50에서 화합물 2 또는 E7107 (에자이, 인크.(Eisai, Inc.)로부터 입수됨)로 처리하였다. RNA를 리보퓨어™ RNA 정제 키트 (앰비온®)를 사용하여 단리하고 분석에 사용하였다. RNA를 슈퍼스트립트® 빌로™ cDNA 합성 키트 (인비트로겐™)의 사용설명서에 따라 역전사시키고, 0.04 μl의 cDNA를 qPCR에 사용하였다.
도 5에 도시된 결과는 화합물 2에 관한 스플라이싱 조정 프로파일이 E7107의 프로파일과 뚜렷이 구별된다는 것을 나타냈다.
화합물 1 의 마우스 약물동태학적 (PK) 연구
화합물 1을 5 mg/kg IV 또는 12 mg/kg PO에서 CD-1 마우스에게 투여하였다. 투여 후, 5마리 마우스로부터 꼬리 정맥으로부터의 연속 채혈을 통해 미리 결정된 시점에서 혈액 샘플을 수집하였다. 투여 후 0.083 (단지 0.167 PO), 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 및 24시간에서 혈액을 수집하였다. 혈액 샘플을 5분 동안 5000 RPM에서 원심분리하여 혈액 수집 30분 내에 혈장을 수집하였다. 추출 후, LCMS를 사용하여 샘플을 검정하였다. 윈논린 v6.3에서 비구획 분석을 사용하여 PK 파라미터를 계산하였다.
데이터는 화합물 1이 마우스 모델에서 경구 생체이용률 및 유리한 약물동태학적 특성을 보였다는 것을 나타냈다 (도 6, 표 5).
<표 5>
Figure pct00013
마우스 이종이식 모델에서 화합물 1 의 효능
화합물 1의 효능을 마우스 이종이식 모델에서 시험하였다. Nalm-6 SF3B1K700E 동질유전자 세포 (인간 프레 B-세포주, 10x106개 세포)를 암컷 CB17-SCID 마우스의 옆구리에 피하 이식하였다. 마우스를 화합물 1 (10% 에탄올, 5% 트윈-80, 85% 생리식염수) 또는 비히클 대조군으로 처리하였다. 동물에게 7.5 mg/kg 또는 10 mg/kg 화합물 1 또는 비히클로 14일 동안 매일 경구 투여 (QDx14 PO)하고 이들이 하기 평가항목 중 어느 한쪽에 이를 때까지 이들을 모니터링하였다: 1) 1주에 3회 측정된 과도한 종양 부피 (타원체 식: (길이 × 폭2)/2을 사용함으로써 계산된 종양 부피); 또는 2) 임의의 건강 문제, 예컨대 마비 또는 과도한 체중 감량의 발생. 모든 동물 연구는 실험 동물의 관리 및 사용에 관한 H3 생물 의학 지침서에 따라 수행하였다.
결과는 화합물 1이 경구 경로를 통해 투여시 효과적이고 이종이식 마우스 모델에서 종양 성장을 감소시켰다는 것을 나타냈다 (도 7).
마우스 이종이식 모델에서 화합물 1 의 PK/PD 시험
화합물 1의 약물동태학 (PK)/약력학 (PD)을 또한 Nalm-6 마우스 이종이식 모델에서 분석하였다. Nalm-6 SF3B1K700E 동질유전자 세포 (인간 프레 B-세포주, 10x106개 세포)를 암컷 CB17-SCID 마우스의 옆구리에 피하 이식하였다. 마우스에게 단일회 경구 용량의 화합물 1 (10% 에탄올, 5% 트윈-80, 85% 생리식염수)을 투여하고, 분석을 위해 투여후 명시된 시간에서 종양을 수집하였다.
RNA를 리보퓨어™ RNA 정제 키트 (앰비온®)를 사용하여 단리하고 qPCR 분석에 사용하였다. RNA를 슈퍼스트립트® 빌로™ cDNA 합성 키트 (인비트로겐™)의 사용설명서에 따라 역전사시키고, 0.04 μl의 cDNA를 정량적 PCR (qPCR)에 사용하였다. pre-mRNA EIF4A1 및 성숙 mRNA SLC24A19에 관한 qPCR 및 PK 평가를 이전에 보고된 바와 같이 수행하였다 (Eskens, F. A. et al. Phase I pharmacokinetic and pharmacodynamic study of the first-in-class spliceosome inhibitor E7107 in patients with advanced solid tumors. Clin Cancer Res. 19, 6296-6304, doi:10.1158/1078-0432.CCR-13-0485 (2013)). 모든 동물 연구는 실험 동물의 관리 및 사용에 관한 H3 생물 의학 지침서에 따라 수행하였다.
도 8에 도시된 결과는 화합물 1이 경구 투여 경로를 통해 내성 용량에서 PD 반응을 보였다는 것을 나타냈다.
화합물 3 의 마우스 약물동태학적 (PK) 연구
화합물 3을 5.964 mg/kg IV 또는 13.307 mg/kg PO에서 CD-1 마우스에게 투여하였다. 투여 후, 5마리 마우스로부터 꼬리 정맥으로부터의 연속 채혈을 통해 미리 결정된 시점에서 혈액 샘플을 수집하였다. 투여 후 0.083 (단지 0.167 PO), 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 및 24시간에서 혈액을 수집하였다. 혈액 샘플을 5분 동안 5000 RPM에서 원심분리하여 혈액 수집 30분 내에 혈장을 수집하였다. 추출 후, LCMS를 사용하여 샘플을 검정하였다. 윈논린 v6.3에서 비구획 분석을 사용하여 PK 파라미터를 계산하였다.
데이터는 화합물 3이 마우스 모델에서 경구 생체이용률 및 유리한 약물동태학적 특성을 보였다는 것을 나타냈다 (도 9, 표 6).
<표 6>
Figure pct00014
화합물 4 의 마우스 약물동태학적 (PK) 연구
화합물 4를 5 mg/kg IV 또는 10 mg/kg PO에서 CD-1 마우스에게 투여하였다. 투여 후, 5마리 마우스로부터 꼬리 정맥으로부터의 연속 채혈을 통해 미리 결정된 시점에서 혈액 샘플을 수집하였다. 투여 후 0.083 (단지 0.167 PO), 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 및 24시간에서 혈액을 수집하였다. 혈액 샘플을 5분 동안 5000 RPM에서 원심분리하여 혈액 수집 30분 내에 혈장을 수집하였다. 추출 후, LCMS를 사용하여 샘플을 검정하였다. 윈논린 v6.3에서 비구획 분석을 사용하여 PK 파라미터를 계산하였다.
데이터는 화합물 4가 마우스 모델에서 경구 생체이용률 및 유리한 약물동태학적 특성을 보였다는 것을 나타냈다 (도 10, 표 7).
<표 7>
Figure pct00015
상기 제시된 결과는 화합물 1, 2, 3 및 4 각각이 경구 생체이용률 및 유리한 약물동태학적 특성을 보유한다는 것을 입증한다. 이는, 그의 불충분한 경구 생체이용률로 인해 환자에게 정맥내 주입으로서 투여된 E7107에 비해 개선된 것이다 (Hong et al. (2014), Invest New Drugs 32, 436-444).

Claims (49)

  1. 화학식 1의 화합물, 화학식 2의 화합물, 화학식 3의 화합물, 및 화학식 4의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염:
    <화학식 1>
    Figure pct00016

    <화학식 2>
    Figure pct00017

    <화학식 3>
    Figure pct00018

    <화학식 4>
    Figure pct00019
  2. 제1항에 있어서, 화학식 1의 화합물인 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염:
    <화학식 1>
    Figure pct00020
  3. 화학식 2의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염:
    <화학식 2>
    Figure pct00021
  4. 제1항에 있어서, 화학식 3의 화합물인 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염:
    <화학식 3>
    Figure pct00022
  5. 제1항에 있어서, 화학식 4의 화합물인 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염:
    <화학식 4>
    Figure pct00023
  6. 제1항에 있어서, 입체이성질체적으로 순수한 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 정맥내, 경구, 피하, 또는 근육내 투여를 위해 제제화되는 제약 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 경구 투여를 위해 제제화되는 제약 조성물.
  10. 골수이형성 증후군, 만성 림프구성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 골수단구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 결장암, 췌장암, 자궁내막암, 난소암, 유방암, 포도막 흑색종, 위암, 담관암종, 또는 폐암인 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 상기 암을 치료하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 암이 결장암인 방법.
  12. 제10항에 있어서, 암이 췌장암인 방법.
  13. 제10항에 있어서, 암이 백혈병인 방법.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 스플라이세오솜 유전자 또는 단백질에서 하나 이상의 돌연변이에 대해 양성인 암을 갖는 대상체인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 스플라이세오솜 유전자 또는 단백질이 스플라이싱 인자 3B 아단위 1인 방법.
  16. 골수이형성 증후군, 만성 림프구성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 골수단구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 결장암, 췌장암, 자궁내막암, 난소암, 유방암, 포도막 흑색종, 위암, 담관암종, 또는 폐암의 치료를 위한 것인 치유적 치료의 방법에서 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도.
  17. 제16항에 있어서, 결장암의 치료를 위한 용도.
  18. 제16항에 있어서, 췌장암의 치료를 위한 용도.
  19. 제16항에 있어서, 백혈병의 치료를 위한 용도.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 골수이형성 증후군, 만성 림프구성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 골수단구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 결장암, 췌장암, 자궁내막암, 난소암, 유방암, 포도막 흑색종, 위암, 담관암종, 또는 폐암이, 스플라이세오솜 유전자 또는 단백질에서 하나 이상의 돌연변이에 대해 양성인 용도.
  21. 제20항에 있어서, 상기 스플라이세오솜 유전자 또는 단백질이 스플라이싱 인자 3B 아단위 1인 용도.
  22. 의약의 제조에서 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도.
  23. 제22항에 있어서, 상기 의약이 골수이형성 증후군, 만성 림프구성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 골수단구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 결장암, 췌장암, 자궁내막암, 난소암, 유방암, 포도막 흑색종, 위암, 담관암종, 또는 폐암의 치료를 위한 것인 용도.
  24. 제23항에 있어서, 상기 의약이 결장암의 치료를 위한 것인 용도.
  25. 제23항에 있어서, 상기 의약이 췌장암의 치료를 위한 것인 용도.
  26. 제23항에 있어서, 상기 의약이 백혈병의 치료를 위한 것인 용도.
  27. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 골수이형성 증후군, 만성 림프구성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 골수단구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 결장암, 췌장암, 자궁내막암, 난소암, 유방암, 포도막 흑색종, 위암, 담관암종, 또는 폐암이, 스플라이세오솜 유전자 또는 단백질에서 하나 이상의 돌연변이에 대해 양성인 용도.
  28. 제27항에 있어서, 상기 스플라이세오솜 유전자 또는 단백질이 스플라이싱 인자 3B 아단위 1인 용도.
  29. 화학식 2의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조성물:
    <화학식 2>
    Figure pct00024
  30. 제29항에 있어서, 경구 투여를 위해 제제화되는 제약 조성물.
  31. 골수이형성 증후군, 만성 림프구성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 골수단구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 결장암, 췌장암, 자궁내막암, 난소암, 유방암, 포도막 흑색종, 위암, 담관암종, 또는 폐암인 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 제29항 또는 제30항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 상기 암을 치료하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 암이 결장암인 방법.
  33. 제31항에 있어서, 암이 췌장암인 방법.
  34. 제31항에 있어서, 암이 백혈병인 방법.
  35. 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 스플라이세오솜 유전자 또는 단백질에서 하나 이상의 돌연변이에 대해 양성인 암을 갖는 것인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 스플라이세오솜 유전자 또는 단백질이 스플라이싱 인자 3B 아단위 1인 방법.
  37. 골수이형성 증후군, 만성 림프구성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 골수단구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 결장암, 췌장암, 자궁내막암, 난소암, 유방암, 포도막 흑색종, 위암, 담관암종, 또는 폐암의 치료를 위한 것인 치유적 치료의 방법에서 제29항 또는 제30항의 제약 조성물의 용도.
  38. 제37항에 있어서, 상기 치유적 치료가 결장암의 치료를 위한 것인 용도.
  39. 제37항에 있어서, 상기 치유적 치료가 췌장암의 치료를 위한 것인 용도.
  40. 제37항에 있어서, 상기 치유적 치료가 백혈병의 치료를 위한 것인 용도.
  41. 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 골수이형성 증후군, 만성 림프구성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 골수단구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 결장암, 췌장암, 자궁내막암, 난소암, 유방암, 포도막 흑색종, 위암, 담관암종, 또는 폐암이, 스플라이세오솜 유전자 또는 단백질에서 하나 이상의 돌연변이에 대해 양성인 용도.
  42. 제41항에 있어서, 상기 스플라이세오솜 유전자 또는 단백질이 스플라이싱 인자 3B 아단위 1인 용도.
  43. 의약의 제조에서 제29항 또는 제30항의 제약 조성물의 용도.
  44. 제43항에 있어서, 상기 의약이 골수이형성 증후군, 만성 림프구성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 골수단구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 결장암, 췌장암, 자궁내막암, 난소암, 유방암, 포도막 흑색종, 위암, 담관암종, 또는 폐암의 치료를 위한 것인 용도.
  45. 제44항에 있어서, 상기 의약이 결장암의 치료를 위한 것인 용도.
  46. 제44항에 있어서, 상기 의약이 췌장암의 치료를 위한 것인 용도.
  47. 제44항에 있어서, 상기 의약이 백혈병의 치료를 위한 것인 용도.
  48. 제44항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 골수이형성 증후군, 만성 림프구성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 골수단구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 결장암, 췌장암, 자궁내막암, 난소암, 유방암, 포도막 흑색종, 위암, 담관암종, 또는 폐암이, 스플라이세오솜 유전자 또는 단백질에서 하나 이상의 돌연변이에 대해 양성인 용도.
  49. 제48항에 있어서, 상기 스플라이세오솜 유전자 또는 단백질이 스플라이싱 인자 3B 아단위 1인 용도.





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