CN102875512A

CN102875512A - 一种抗凝血鼠药大隆半抗原及完全抗原的制备方法

Info

Publication number: CN102875512A
Application number: CN2012104213385A
Authority: CN
Inventors: 董颖; 杜鸿雁; 栾玉静; 王炯; 王瑞花; 常靖; 于忠山; 何毅; 王芳琳; 侯小平; 张云峰; 姚伊人
Original assignee: Institute of Forensic Science Ministry of Public Security PRC
Current assignee: Institute of Forensic Science Ministry of Public Security PRC
Priority date: 2012-10-29
Filing date: 2012-10-29
Publication date: 2013-01-16
Anticipated expiration: 2032-10-29
Also published as: CN102875512B

Abstract

本发明涉及一种抗凝血鼠药大隆半抗原及完全抗原的制备方法，包括如下步骤：（1）将大隆和丁二酸酐分别加入到四氢呋喃中，在搅拌下进行反应；（2）将步骤（1）中反应得到的混合物倒入水中，有灰白色固体析出；（3）过滤，乙醇重结晶，得到大隆半抗原；（4）分别将大隆半抗原、二环己基碳二亚胺和BSA加入到二甲亚砜中，然后再加入pH为6～7的磷酸缓冲溶液，搅拌；（5）透析，冷冻干燥后制成大隆完全抗原。本发明的制备方法简便、快速，可用于免疫动物，制备大隆的单克隆抗体，进而建立抗凝血鼠药大隆的快速检测方法，广泛适用于法庭科学、临床医学等领域中。

Description

一种抗凝血鼠药大隆半抗原及完全抗原的制备方法

技术领域

本发明涉及免疫学技术领域中半抗原和完全抗原的制备方法，特别涉及一种抗凝血鼠药大隆半抗原及完全抗原的制备方法。

背景技术

大隆是一种缓效灭鼠剂，为香豆素类化合物，利用该类化合物能够破坏老鼠体内的凝血酶原，造成体内各脏器及粘膜大面积出血，最后达到杀死老鼠的目的，故铜称为抗凝血类杀鼠药。近年来随着毒鼠强、氟乙酰胺等急性灭鼠药被禁用，取而代之的是这些新一代的抗凝血灭鼠剂。

虽然此类灭鼠剂有良好的灭鼠效果，但是随着近年来的广泛应用，因误用、自杀等导致的案件及事件时有发生。这就要求公安司法鉴定部门对各种涉及抗凝血类杀鼠药的检材进行检测。临床上建立生物样品中这些抗凝血灭鼠剂的检测方法，对配合中毒病人的临床诊断与治疗有很大意义。

免疫是生物体识别和排除抗原异物达到维护自身生理的平衡和稳定。以抗原抗体反应为基础的各种免疫技术发展迅速，广泛应用于医学和生物学研究领域的定性、定量和定位，因其高度特异性和灵敏性（可达10-12～10-9g水平），尤其适于生物样本等复杂体系的分析检验。

大隆属于小分子物质(分子量小于1000Da)，缺乏T细胞表位而无法直接诱导动物机体产生特异性抗体，但与蛋白质大分子载体偶联后，可借助其T细胞表位来间接诱导B细胞的增殖及分化，产生特异性抗体。小分子与蛋白载体的偶联物称为完全抗原。如果小分子自身带有供偶联的活性官能团(如氨基、羧基等)，则偶联反应可直接进行，否则就必须对毒物分子进行衍生化，接上供偶联反应的活性官能团以合成人工抗原，这一步又称为半抗原的合成。半抗原及人工抗原的合成对于建立其免疫分析法至关重要，许多因素都将直接影响到能否制备出高质量的抗体，如选择合适的中间体、活性官能团引入位点的选择、半抗原产物的分离纯化、偶联臂的长短、半抗原与载体分子的偶联比等。有的毒物因在半抗原合成过程中合成步骤多、产物分离纯化困难，有时甚至无法制备出令人满意的抗体。有关大隆半抗原及完全抗原的制备方法还未见相关文献报道。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明的目的在于针对大隆作为小分子毒物不能直接诱导动物机体产生特异性抗体，提供一种抗凝血鼠药大隆半抗原及完全抗原的制备方法。

本发明的技术方案是这样实现的：一种抗凝血鼠药大隆半抗原的制备方法，包括如下步骤：

（1）将大隆和丁二酸酐分别加入到四氢呋喃中，在搅拌下进行反应（如式Ⅰ所示）；

（2）将步骤（1）中反应得到的混合物倒入水中，有灰白色固体析出；

（3）过滤，乙醇重结晶，得到大隆半抗原。

上述抗凝血鼠药大隆半抗原的制备方法，在步骤（1）中，在温度为10-30℃的条件下搅拌5-24h。

上述抗凝血鼠药大隆半抗原的制备方法，在步骤（1）中，在温度为20-21℃的条件下搅拌12h。

上述抗凝血鼠药大隆半抗原的制备方法，在步骤（2）中，水的温度为0℃。

上述抗凝血鼠药大隆半抗原的制备方法，大隆与丁二酸酐的物质的量之比为1:1～4。

上述抗凝血鼠药大隆半抗原的制备方法，大隆在四氢呋喃中的浓度为0.1～0.5mol/L。

上述抗凝血鼠药大隆半抗原的制备方法，大隆在四氢呋喃中的浓度为0.2mol/L。

上述抗凝血鼠药大隆完全抗原的制备方法，包括如下步骤：

（1）将大隆和丁二酸酐分别加入到四氢呋喃中，在搅拌下进行反应；

（3）过滤，乙醇重结晶，得到大隆半抗原；

（4）分别将大隆半抗原、二环己基碳二亚胺和BSA加入到二甲亚砜中，然后再加入pH为6～7的磷酸缓冲溶液，搅拌；

（5）透析，冷冻干燥后制成大隆完全抗原。

上述抗凝血鼠药大隆完全抗原的制备方法，在步骤（4）中：大隆半抗原与二环己基碳二亚胺的质量之比为1:1～1.8，大隆半抗原与BSA的质量之比为2～3:1，每100毫克大隆半抗原需要二甲亚砜0.5～2毫升、需要pH为6～7的磷酸缓冲溶液1～2.5毫升。

上述抗凝血鼠药大隆完全抗原的制备方法，步骤（4）中：在15～30℃的条件下搅拌。

本发明的有益效果是：本发明的制备方法简便、快速，得到的抗原可用于免疫动物，制备大隆的单克隆抗体，进而建立抗凝血鼠药大隆的快速检测方法，具有广阔的应用前景，将广泛适用于法庭科学、临床医学等领域中，以满足公安系统、疾控中心及医院等单位对中毒案（事）件快速检验的需求。

本发明建立了大隆半抗原的制备方法，可用于免疫动物，制备大隆的单克隆抗体，进而建立抗凝血鼠药大隆的快速检测方法。解决了大隆作为小分子毒物不能直接诱导动物机体产生特异性抗体的问题，通过制备半抗原及完全抗原，进而制备抗体。

具体实施方式

实施例1

本实施例抗凝血鼠药大隆半抗原的制备方法，包括如下步骤：

（1）将大隆和丁二酸酐分别加入到四氢呋喃中，大隆与丁二酸酐的物质的量之比为1:1，大隆在四氢呋喃中的浓度为0.1mol/L，在温度为30℃的条件下搅拌5h（反应如式Ⅰ所示，实施例2-6与此相同）；

（2）将步骤（1）中反应得到的混合物倒入10℃水中，有灰白色固体析出；

（3）过滤，乙醇重结晶，得到大隆半抗原，产率85.6%。

实施例2

（1）将大隆和丁二酸酐分别加入到四氢呋喃中，大隆与丁二酸酐的物质的量之比为1:1，大隆在四氢呋喃中的浓度为0.1mol/L，在温度为30℃的条件下搅拌5h；

（2）将步骤（1）中反应得到的混合物倒入5℃水中，有灰白色固体析出；

（3）过滤，乙醇重结晶，得到大隆半抗原，产率82.4%。

实施例3

（2）将步骤（1）中反应得到的混合物倒入冰水混合物中，有灰白色固体析出；

（3）过滤，乙醇重结晶，得到大隆半抗原，产率91.2%。

实施例4

（1）将大隆和丁二酸酐分别加入到四氢呋喃中，大隆与丁二酸酐的物质的量之比为1:4，大隆在四氢呋喃中的浓度为0.5mol/L，在温度为10℃的条件下搅拌24h；

（3）过滤，乙醇重结晶，得到大隆半抗原，产率92%。

实施例5

（1）将大隆和丁二酸酐分别加入到四氢呋喃中，大隆与丁二酸酐的物质的量之比为1:4，大隆在四氢呋喃中的浓度为0.2mol/L，在温度为20℃的条件下搅拌12h；

（3）过滤，乙醇重结晶，得到大隆半抗原，产率94%。

实施例6

（1）将大隆和丁二酸酐分别加入到四氢呋喃中，大隆与丁二酸酐的物质的量之比为1:2，大隆在四氢呋喃中的浓度为0.2mol/L，在温度为21℃的条件下搅拌12h；

（3）过滤，乙醇重结晶，得到大隆半抗原，产率95%。

实施例7

利用实施例1中制备的大隆半抗原制备抗凝血鼠药大隆完全抗原：分别将大隆半抗原、二环己基碳二亚胺和BSA加入到二甲亚砜中【大隆半抗原与二环己基碳二亚胺的质量之比为1:1，大隆半抗原与BSA的质量之比为2:1，每100毫克大隆半抗原需要二甲亚砜0.5毫升、需要pH为6的磷酸缓冲溶液1毫升】；然后再加入pH为6的磷酸缓冲溶液，在15℃的条件下搅拌；透析，冷冻干燥后制成大隆完全抗原，以大隆半抗原计算，大隆完全抗原的产率为86%。

对本实施例制备的大隆完全抗原进行紫外分析、红外分析及飞行质谱分析，结果表明：大隆完全抗原的紫外光谱中存在大隆半抗原的吸收峰，大隆完全抗原的红外光谱中也存在大隆半抗原的吸收峰，飞行质谱表明大隆半抗原与BSA发生了偶联反应（物质的量之比为大隆半抗原：BSA=11:1），生成了大隆半抗原BSA结合物。

实施例8

利用实施例2中制备的大隆半抗原制备抗凝血鼠药大隆完全抗原：分别将大隆半抗原、二环己基碳二亚胺和BSA加入到二甲亚砜中【大隆半抗原与二环己基碳二亚胺的质量之比为1:1.8，大隆半抗原与BSA的质量之比为3:1，每100毫克大隆半抗原需要二甲亚砜～2毫升、需要pH为7的磷酸缓冲溶液1～2.5毫升】；然后再加入pH为7的磷酸缓冲溶液，在15℃的条件下搅拌；透析，冷冻干燥后制成大隆完全抗原，以大隆半抗原计算，大隆完全抗原的产率为85%。

实施例9

利用实施例3中制备的大隆半抗原制备抗凝血鼠药大隆完全抗原：分别将大隆半抗原、二环己基碳二亚胺和BSA加入到二甲亚砜中【大隆半抗原与二环己基碳二亚胺的质量之比为1:1.5，大隆半抗原与BSA的质量之比为2.3:1，每100毫克大隆半抗原需要二甲亚砜1.6毫升、需要pH为7的磷酸缓冲溶液2毫升】；然后再加入pH为7的磷酸缓冲溶液，在20℃的条件下搅拌；透析，冷冻干燥后制成大隆完全抗原，以大隆半抗原计算，大隆完全抗原的产率为90%。

实施例10

利用实施例4中制备的大隆半抗原制备抗凝血鼠药大隆完全抗原：分别将大隆半抗原、二环己基碳二亚胺和BSA加入到二甲亚砜中【大隆半抗原与二环己基碳二亚胺的质量之比为1:1.3，大隆半抗原与BSA的质量之比为2.8:1，每100毫克大隆半抗原需要二甲亚砜1.8毫升、需要pH为6.5的磷酸缓冲溶液1～2.5毫升】；然后再加入pH为6.5的磷酸缓冲溶液，在20℃的条件下搅拌；透析，冷冻干燥后制成大隆完全抗原，以大隆半抗原计算，大隆完全抗原的产率为91%。

实施例11

利用实施例5中制备的大隆半抗原制备抗凝血鼠药大隆完全抗原：分别将大隆半抗原、二环己基碳二亚胺和BSA加入到二甲亚砜中【大隆半抗原与二环己基碳二亚胺的质量之比为1:1.2，大隆半抗原与BSA的质量之比为2.7:1，每100毫克大隆半抗原需要二甲亚砜0.8毫升、需要pH为6的磷酸缓冲溶液2.2毫升】；然后再加入pH为6的磷酸缓冲溶液，在15℃的条件下搅拌；透析，冷冻干燥后制成大隆完全抗原，以大隆半抗原计算，大隆完全抗原的产率为90%。

实施例12

利用实施例6中制备的大隆半抗原制备抗凝血鼠药大隆完全抗原：分别将大隆半抗原、二环己基碳二亚胺和BSA加入到二甲亚砜中【大隆半抗原与二环己基碳二亚胺的质量之比为1:1.6，大隆半抗原与BSA的质量之比为2.5:1，每100毫克大隆半抗原需要二甲亚砜1.2毫升、需要pH为7的磷酸缓冲溶液2.5毫升】；然后再加入pH为7的磷酸缓冲溶液，在15～30℃的条件下搅拌；透析，冷冻干燥后制成大隆完全抗原，以大隆半抗原计算，大隆完全抗原的产率为87%。

上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明创造所作的举例，而并非对本发明创造具体实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造权利要求的保护范围之中。

Claims

1.一种抗凝血鼠药大隆半抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将大隆和丁二酸酐分别加入到四氢呋喃中，在搅拌下进行反应；反应式如下：

（3）过滤，乙醇重结晶，得到大隆半抗原。

2.根据权利要求1所述的抗凝血鼠药大隆半抗原的制备方法，其特征在于，在步骤（1）中，在温度为10-30℃的条件下搅拌5-24h。

3.根据权利要求1所述的抗凝血鼠药大隆半抗原的制备方法，其特征在于，在步骤（1）中，在温度为20-21℃的条件下搅拌12h。

4.根据权利要求1所述的抗凝血鼠药大隆半抗原的制备方法，其特征在于，在步骤（2）中，水的温度为0℃。

5.根据权利要求1-4任一所述的抗凝血鼠药大隆半抗原的制备方法，其特征在于，大隆与丁二酸酐的物质的量之比为1:1～4。

6.根据权利要求5所述的抗凝血鼠药大隆半抗原的制备方法，其特征在于，大隆在四氢呋喃中的浓度为0.1～0.5mol/L。

7.根据权利要求5所述的抗凝血鼠药大隆半抗原的制备方法，其特征在于，大隆在四氢呋喃中的浓度为0.2mol/L。

8.抗凝血鼠药大隆完全抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（3）过滤，乙醇重结晶，得到大隆半抗原；

（5）透析，冷冻干燥后制成大隆完全抗原。

9.根据权利要求8所述抗凝血鼠药大隆完全抗原的制备方法，其特征在于，在步骤（4）中：大隆半抗原与二环己基碳二亚胺的质量之比为1:1～1.8，大隆半抗原与BSA的质量之比为2～3:1，每100毫克大隆半抗原需要二甲亚砜0.5～2毫升、需要pH为6～7的磷酸缓冲溶液1～2.5毫升。

10.根据权利要求8所述抗凝血鼠药大隆完全抗原的制备方法，其特征在于，步骤（4）中：在15～30℃的条件下搅拌。