JPH06503366A - 直鎖状ポリマーを用いる生体分子の単離方法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 直鎖状ポリマーを用いる生体分子の単離方法本発明の方法は、生体分子の分離お よび単離に関し、より詳細には、生物学的試料からタンパク質を単離するための ポリマーの使用に関する。

発明の背景 ム２二叉１亘厘Ｉ タンパク質の単離は、生物学的な研究、臨床診断および薬剤の生産、特に、組換 え技術による生産において重要な手段である。科学の研究者は、高い特異的活性 を維持するタンパク質を速やかに入手しなければならず；臨床医は、正確な診断 を下すために、生物学的試料中のタンパク質を同定しなければならず；そして分 子生物学者は、組換え生命体によって生産された大量のタンパク質を、回収およ び精製しなければならない。

科学者は伝統的に、硫酸アンモニウムなどの塩、またはエタノールなどの有機溶 媒を用いて、生物学的試料から沈澱させることによって、タンパク質を単離して いる。そのような方法で用いられる化学薬品に曝すことにより、タンパク質はし ばしば変性する。その上に、沈澱試薬からのタンパク質の分離は困難であり、さ らに変性を引き起こし得る。

硫安沈澱法は、「塩析」としても知られ、はとんどのタンパク質の溶解度が高電 解質濃度で減少するという事実に基づ（。多価イオンが一価イオンよりもより有 効であるために、硫酸塩が用いられる。この方法は、通常はｐＨを中性付近に制 御して冷所（０−４℃）で行われる。加えられる塩の濃度に応じて、異なるクラ スのタンパク質が沈澱する。この方法の欠点は、沈澱物または上清から残余の塩 を除去することが困難であることである。多くの場合透析が用いられるが、透析 は非常に時間がかかる。

有機溶媒は、タンパク質の分画沈澱にしばしば用いられる。

しかし、温度を凝固点付近に保たなければ、溶媒がタンパク質を変性するという 危険がある。さらに、溶媒はタンパク質から除去されなければならない。エタノ ールなどの溶媒は、一般に、沈澱したタンパク質を凍結乾燥して除去される。

タンパク質精製の最近の進歩は、高性能イオン交換、アフィニティークロマトグ ラフィー、疎水的相互作用およびゲル濾過クロマトグラフィーの開発に集中して いる。生物学的試料はクロマトグラフィーカラムに載せられ、適切な溶媒で溶出 されて画分となり、タンパク質活性が分析される。この方法は高価で、時間がか かり、そして大量のタンパク質の精製にはあまり適さない。

多（の科学者が、伝統的な方法を、単独または最近開発されたクロマトグラフィ ー法と組み合わせて使用し続けている。

例えば、硫酸アンモニウムにより生物学的試料からタンパク質を沈澱させた後、 タンパク質はクロマトグラフィーによって硫酸アンモニウム塩から分離される。

多くの場合タンパク質は１つかまたはそれ以上の工程の段階の間に活性を失うか 、または変性され、その結果、収率が低（なるかまたは同定が不正確になる。

望しヱニ且墓封 １９６０年中頃、Ｐｏ１ｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｊｔ　Ｂｊｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ 　８２：４６３−４７５（１９６４）は、タンパク質を精製するための、ポリエ チレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、ノニルフェノール−ニド牛シレー ト（ＮＰＥｓ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）およびポリビニルピロリドン （ＰＶＰ）を含む多様な高分子量ポリマーを分析した。

Ｐｏ１ｓｏｎらは、試験したポリマーの中でＰＥＧがタンパク質の沈澱に最適で あると結論づけている。ＰＥＧの欠点は、タンパク質を吸着する条件下でＤＥＡ Ｅもしくはセルロースカラムを通し、そして溶出液でＰＥＧを洗い流す方法によ るか、またはエタノールを加えて上清からタンパク質を沈澱させ、ＰＥＧを上清 中に残す方法によって、タンパク質から除去されなければならないことである。

Ｐｏ１ｓｏｎらは、ＰＶＥ、　ＰＶＰおよびＮＰＥ５の高い固有粘度のため、そ して、彼らの観察によると、それらのポリマーが著しいタンパク質変性を起こす ために、それらのポリマーの使用に対してはっきりと警告している。Ｐｏ１ｓｏ ｎらの結果は、ＺｅｐｐｅｚａｕｅｒおよびＢｒｉｓｈａｍｍａｒ、　Ｂｉｏｃ ｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　９４：５８１−５８３（１９６５）に よって確証され、そして拡張された。彼らは、Ｕｎｉｏｎ　Ｃａｒｂｉｄｅ　Ｃ ａｒｐ、（Ｄａｎｂｕｒｙ、　ＣＴ）から入手されるＰＥＧ樹脂であるＰｏ１ｙ ｏｘ”ｏ３種の高分子量調製物を用いて、腎臓のタンパク質を沈澱させた。

ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）はポリ（オキシエチレン）グリコールとして も知られ、一般化学式ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２０）Ｊｌを有するエチレンオキサイド と水との縮合ポリマーである。ＰＥＧは、ゴム、織物および金属の製造のための 水溶性潤滑剤；食品、化粧品、水性塗料、紙のコーティング剤、および光沢剤中 に；ならびに医薬品における軟膏基剤として用いられる。

デキストランは、シタ糖基質上で増殖する細菌によって生産されたポリサッカラ イドに適用される用語である。Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ　ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉ ｄｅｓおよびＬａｃｔｏｂａｃｔｅｒｉａ　ｄｅｘｔｒａｎｉｃｕｍなどの細菌 によって産生された天然のデキストランは、通常高分子量を有する。血漿容量の 増量剤または血流補助剤として用いられる、より低分子量のデキストランは、通 常、天然のデキストランの解重合によってまたは合成によって調製される。

ＮＰＥ５は、界面活性剤としてしばしば用いられる長鎖化合物のクラスである。

それらは通常、所望の溶解度の要求に応じて誘導体化される。

ＰＶＡは、ポリビニルアセテートから、アセテート基をヒドロキシル基に置換し て調製されるポリマーであり、式（ＣＨ２ＣＨＯ［Ｉ）・を有する。はとんどの ポリビニルアルコールは水溶性であり、そしてプラスチック工業におけるエラス トマーとして、医薬品工業における増粘剤として、および眼科用の潤滑剤として 用いられる。

ＰＶＰは、約１０．０００から７００．０００＋７）範囲の平均分子量、および 化学式（Ｃ６Ｈ９ＮＯ）、を有する、非イオン発生性の親水性ポリマーである。

ＰＶＰはまた、ポリ［１−（２−オキソ−１−ピロリジニル）エチレン］、Ｐｏ ｖｔｄｏｎｅ”、、Ｐｏ１ｙｖｉｄｏｎｅ”、ＲＰ　１４３”、Ｋｏｌｌｉｄｏ ｎ”、Ｐｅｒｅｇａｌ　ＳＴＴ″、Ｐｅｒｉｓｔｏｎ”、Ｐｌａｓｄｏｎｅ”、 Ｐｌａｓｗｏｓａｎ”″、Ｐｒ。

ｔａｇｅｎｔ”″、５ｕｂｔｏｓａｎｓ　およびＶｌｎｉｓＨ”としても知られ て（する。

ＰＶＰは無毒性で、高い吸湿性であり、そして水または有機溶媒に容易に溶解す る。ＰＶＰは、医薬品における結合剤としての使用、および化学薬品の解毒のた めの使用など、多様な用途を有する。ＰｖＰはまた、製錠、写真用感光乳剤、化 粧品、界面活性剤、接着剤、ならびにビールおよびワインの清澄剤にお０て用い られる。第二次世界大戦の間、ＰＶＰは血漿増量剤として用いられたが、高分子 量物質が組織に吸着されることがわかったとき、この用途は廃止された。経静脈 的なＰｖＰは、５ａｎｂａｒおよびＳ＋ｓｅｔ、　Ｃ１ｒｃｕｌａｔｉｏｎ　３ ８ニア７１７１−７７６（１９６＋こ記載されたように、ヒト血清脂質を減少す るために用いられて−する。

ＰＥＧ、デキストラン、ＰＶＡおよびＰＶＰは、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ 　Ｃ。

ｍｐａｎｙ　（Ｓｔ、　ＬｏｕｔｓｌＭＯ）などの化学薬品供給者から、入手可 能、である。ＮＰＥ５は慣習的な合成を必要とし、特別な化学薬品製造者から注 文され得る。

糺逸人狭五 例えば、ヒト成長ホルモンおよびインスリンなどの多くのタンパク質が、現在組 換え技術によって生産されて（Ａる。タンパク質をコードする遺伝子が、細菌性 またはウィルス性のベクター中に挿入されて大量のタンパク質を生産し、そして そのタンパク質は、次に増殖培地または発酵用流体中の他のタンパク質から単離 されなければならない。組換え技術によって生産されたタンパク質を精製するた めの、迅速で費用のかからない方法は、コスト低減を助け、この方法で生産され たタンパク質の回収率を改善する。

１艷立丘血 所望の効果を発揮するためには、充分な量の薬剤または薬剤が、その作用部位に 到達しなければならない。投与部位から血液中に吸収された薬物は、多くの場合 、アルブミンなどのタンパク質に結合し、薬物の作用部位への送達を妨げる。

血清タンパク質に対してより高い親和性を有する薬物は、所望の効果を達成する ためにより多い投与量を必要とする。

医薬品開発の間、血清タンパク質に結合する薬物の量を測定するために、薬物の 分布の検討が行われる。薬物投与の後、血清タンパク質はクロマトグラフィーに よって単離されるか、または硫酸アンモニウムなどの化学薬品で沈澱される。分 析技術を介して、タンパク質画分中の薬物濃度が測定され、何も操作を加えてい ない試料の総薬物濃度と比較される。これらの方法は時間がかかり、そして薬物 が結合しているタンパク質の同定に関する充分な情報を提供しない。

薬物が排出され、生体に保持されないことを確認するために、尿試料もまた、薬 物または薬物代謝物の濃度が分析される。妨害するタンパク質は、多くの場合、 上述のように時間のかかる方法によって薬物から分離される。

二土１土ヱ皇星Ｉ アルブミンは植物および動物の組織および体液の全体に分布している単純なタン パク質であり、鶏卵の卵白部分に存在することが周知である。アルブミンは水溶 性であり、熱、酸または中性の溶液によって容易に変性される。ウシ血清アルブ ミン（ＢＳＡ）はウシ血清に由来し、インビトロの生物学的研究においてしばし ば用いられる。正常ヒト血清アルブミンは、健常者から得た血漿タンパク質を分 画して得られ、輸血物質として用いられる。血清アルブミンはまた、例えば、血 液量および心拍出量の測定における放射性ヨウ素化血清アルブミンの使用など、 診断に用いられる。従って、精製アルブミンを大量に生産する費用のかからない 方法に対する、大きな必要性がある。

グロブリンの 免疫グロブリンＩｇＧ、　ＩｇＭ、　ＩｇＡ、　ＩｇＥおよびＩｇＤは、を椎動 物の血清タンパク質のガンマグロブリン分画中に見い出され、循環する抗体の集 合体を構成し、そして感染および疾病に抵抗するために必要な体液性の免疫応答 を提供する。血清中のグロブリンとアルブミンの比を測定することにより、感染 に対する免疫応答の存在およびその感染と戦う個体の能力の良好な指標が得られ る。血清中の異常に高いグロブリン濃度は、多くの場合、骨髄腫またはペンスジ ヲーンズ蛋白などの高増殖性の障害の指標である。精製免疫グロブリンは、科学 的な研究、特にワクチンの開発に必要であり、そしてワクチンがまだ入手可能で ない細菌またはウィルスに最近曝された個体の受動的な免疫化に必要である。従 って、研究、診断または治療の目的のために、血液から免疫グロブリンを単離す る迅速な方法が、必要である。

乳体 最近に免疫された実験動物の肺臓から得られた正常な抗体産生リンパ球を骨髄腫 細胞系に融合してハイブリドーマを形成することにより、モノクローナル抗体が 産生される。骨髄腫細胞は目的とする抗体の連続的な生産をもたらし、その抗体 は通常腹水液から回収される。診断用キット、科学研究用試薬として使用する前 、または薬物に結合させて悪性腫瘍などの標的部位に方向づけられた「魔法の弾 丸（■ａｇｉｃ　ｂｕｌｌｅｔ）Ｊを作成する前に、モノクローナル抗体は、腹 水液中に存在する他のタンパク質から単離されなければならない。マウス、ラッ トまたはウサギなどの動物に抗原を注射し、血液を収集し、抗原に結合する免疫 グロブリン分画を、通常は、その抗体が固定されたアフィニティーカラムに免疫 グロブリン分画を通して単離することによって、ポリクローナル抗体が生産され る。特定の抗原に対するポリクローナル抗体の特異性があまり大きくない場合を 除いて、得られたポリクローナル抗体は、上述のモノクローナル抗体と同じ目的 で用いられる。

モノクローナルまたはポリクローナル抗体を単離および精製するための、費用の かからない、迅速な方法は、抗体の生産を大きく単純化する。

゛および　の 疾病および障害の医学的診断は、多（の場合、を髄液または尿などの体液を分析 することによって成される。を髄液または尿の試料中の妨害物質から生体分子を 分離することによって、より迅速で、より信頼性のある診断が行われ得る。

必要であるのは、簡単で、費用がかからず、そして迅速で、かつ、比較的純粋な 活性生体分子を単離するための、生体分子の単離方法である。

従って、本発明の１つの目的は、生体分子を変性しない生体分子の単離方法を提 供することである。

本発明のさらに他の目的は、迅速で、再現性のある比較的純粋なタンパク質の単 離方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、単一の工程で、生物学的試料から生体分子を単離す る方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、比較的純粋なタンパク質を大量に単離する方法を提 供することである。

本発明のさらに他の目的は、血清中のグロブリンとアルブミンの比を測定する方 法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、血清タンパク質中での薬物の分布を測定する方法を 提供することである。

発明の要旨 生物学的試料からの、タンパク質などの活性生体分子の単離のための、方法、組 成物、およびキットが、提供される。

可溶性の直鎖状ポリマーが試料に添加され、沈澱物が形成される。目的とする生 体分子が、沈澱物または上清がら単離される。目的とする生体分子は、次に、ポ リマー沈澱、または亜鉛化合物を用いる沈澱によって、単離される。ポリマーを 用いる沈澱の前に、タンパク質複合体を可溶化する生物学的界面活性剤を試料に 添加することにより、沈澱の程度が増加する。

いかなる特定の生体分子の単離も、ポリマー添加の前、間、または後の試料のｐ Ｈに依存する。ポリマー添加の前または後に、酸または塩基を用いて、好ましく は、イミダゾール、アミノカプロン酸、アミノ酸もしくはそれらの混合物のよう な、カルボ牛シルもしくはアミノ基を含有する１つもしくはそれ以上の低分子量 部分を用いて、試料は所定のｐＨに調整される。

あるいは、直鎖状ポリマーのｐａｌを調整し、そしてそのｐＨを調整したポリマ ーを試料に添加することによって、沈澱の生成、および単一の工程による選択的 な生体分子の単離が起こる。

ｐＨ：１℃整に用いる低分子量部分の好ましい濃度は、単離工程で望まれるｐ旧 こ依存する。

好ましくは、ポリマーはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）の水溶液である。ある いは、ポリマーは、ポリビニルピロリドンと、１種もしくはそれ以上の、ポリエ チレングリコール、デキストラン、ノニルフェノールエトキシレートまたはポリ ビニルアルコールなどの可溶性直鎖状ポリマーとの混合物であり、最も好ましく は、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）とポリエチレングリコール（ＰＥＧ）との 混合物である。

好ましくは、生物学的試料からの生体分子の沈澱は、２℃と２０℃との間の温度 のような、室温または室温より低い温度で起こる。最も好ましくは、４°Ｃなど の、ポリマーまたはポリマーの混合物が粘性である温度で、沈澱が起こる。

好ましい方法では、ポリビニルピロリドンとポリエチレングリコールとのポリマ ー溶液のｐＨを、最初に中性のｐ旧こ調整することによって、血清などの生物学 的試料から免疫グロブリンが単離される。ｐＨは、イミダゾールとアミノカプロ ン酸との混合物を用いて調整される。あるいは、ｐＨは、グルタミン酸、ヒスチ ジン、およびリジンを含有するアミノ酸溶液を用いて調整される。ポリオキシエ チレンソルビタン（ｐｏｌｙｘｏｙｅｔｈｙｌｅｎｅｓｏｒｂｔｔａｎ）、最も 好ましくはポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートのような、生物学的界 面活性剤を含有する溶液が試料に加えられ、そして次にこのポリマー溶液を試料 に加えて、比較的純粋な免疫グロブリン分画を沈澱させ、アルブミンなどの妨害 タンパク質、および他の物質を上清に残す。好ましくは、沈澱したガンマグロブ リンは、グリセロールおよびイミダゾール、グリセロールおよび重炭酸ナトリウ ム、イミダゾールなどのアルカリ性溶液、またはＴｒｉｚｍａＴ″塩基（トリス ［ヒドロキシメチル］−アミノメタン）などの塩溶液に、溶解度および安定性を 増強するために、再懸濁される。

他の好ましい方法では、タンパク質は、ポリビニルピロリドンおよびポリエチレ ングリコールのポリマー溶液のｐＨを、最初にグリシン溶液、好ましくは亜鉛グ リシネート溶液を用いて中性のｐ旧こ調整し、次にポリマー溶液を試料に合わせ ることによって、尿またはを髄液の試料から沈澱される。

血清タンパク質中の薬物の分布についての方法もまた、グロブリン分画を単離し 、上清からアルブミンを沈澱し、そして次にそれぞれの分画中の薬物量を測定す ることによって、記載される。

診断の目的のために血清中のグロブリンとアルブミンの比を測定する方法もまた 、グロブリンおよびアルブミンを上述のように単離し、次に試料中のそれぞれの 濃度およびそれらの比を測定することによって提供される。

発明の詳細な説明 生物学的試料からの、生物学的に活性な生体分子を直鎖状ポリ′マーを用いて単 離するための、方法、組成物、およびキＩトが、提供される。単離される生体分 子としては、タンパク質、脂質、核酸、炭水化物、および非タンパク質性のホル モンを含む。単離された生体分子はまた、薬物のような標的化分子であり得るこ とが、当業者に理解される。

目的とする生体分子は、可溶性の直鎖状ポリマー、またはポリマー混合物の充分 な量を生物学的試料に加えて、沈澱を形成することによって単離される。生体分 子はまた、傾斜法またはその次の沈澱法によって、沈澱物または上清から単離さ れる。

試料中の他の生体分子または妨害物質からの目的とする特定の生体分子の選択は 、ポリマー添加の前、間、または後に、試料のｐＨを所定の値に調整することに よって達成される。好ましくは、ｐＨを調整したポリマー溶液を試料に添加して ｐＨを調整することにより、試料を４と９．２の間の所定のｐＨに調整し、単一 の工程により所望の生体分子が沈澱し、そして単離される。酸または塩基、好ま しくは、イミダゾール、カプロン酸、アミノ酸もしくはそれらの混合物などの、 カルボキシルまたはアミン基を含有する塩形成が最も少ない低分子量部分をを添 加することによって、ポリマー溶液のｐＨが調整される。あるいは、ポリマー添 加の前または後に、酸、塩基、または低分子量部分の溶液を試料に直接加えるこ とによって、試料が調整される。

得られた上清からの目的とする生体分子の単離は、異なるポリマーの混合物もし くは異なるｐＨを有する第２のポリマー溶液を加えるか、または硫酸亜鉛などの 亜鉛化合物を加えて、目的とする生体分子を上清から沈澱させることにより、達 成好ましくは、ポリオキシエチレンソルビタン、２３ラウリルエーテル（市販用 Ｂｒ１ｇ３５”として知られる）もしくはＴｒｉｔｏｎ１″界面活性剤（好まし くはＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１０２”″）などのポリオキシエチレンエーテル、また はドデンル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）のような、タンパク質複合体を可溶化する 生物学的界面活性剤が、沈澱物の収率および純度を向上するために、ポリマー溶 液を加える前に試料に加えられる。好ましい界面活性剤はポリオキシエチレンソ ルビタンであり、最も好ましくは、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａ ｎｙｓ　Ｓｔ、　Ｌｏｕｔｓ、　ＭＯからＴｖｅｅｎ−２０’″として市販され ている、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートである。２３ラウ’）　 ルｘ−チル（Ｂｒｉｊ３５”）、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１０２”、およびドデンル 硫酸ナトリウムもまた、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｗｐａｎｙから市 販されている。タンパク質複合体の可溶化に有用な、他の市販されている生物学 的界面活性剤としては、例えば、アニオン性生物学的界面活性剤である、カプリ ル酸、コール酸１−デカンスルホン酸、デオキシコール酸、グリココール酸、グ リコデオキシフール酸、ラウリル硫酸、タウロコール酸、およびタウロデオキシ コール酸；カチオン性生物学的界面活性剤である、セチルピリジニウムクロライ ド、ドデシルトリメチルアンモニウムブロマイド、ヘキサデシルトリメチルアン モニウムブロマイド、およびテトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイド； 双性イオン性（両性イオン性）生物学的界面活性剤である、　（３−［３−コー ルアミドプロピルジメチルアンモニオ］−１−プロパン−スルホネート（ＣＨＡ ＰＳ）および（３−［３−コールアミドプロピルジメチルアンモニオ］−２−ヒ ドロキシ−１−プロパンスルホネート）　（ＣＩＩＡＰＳＯ）　；および非イオ ン性生物学的界面活性剤である、ｎ−デシルベーターローグルコピラノシド、ｄ ｉｇｉｔｏｎｉｎ”（ジギチン）、ｎ−ドデシルベーターローグルコピラノシド 、ｎ−ドデシルベーターローマルトシド、ｎ−へブチルベーターＤ−グルコピラ ノシド、ｎ−オクチルアルファー〇−クルコビラノシド、ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ− ４０”、ｎ−／　＝ルヘ−９−Ｄ−）ｆ　ルーｙ　ヒラノシドおよびＴｒｉｔｏ ｎ　Ｘ−１００”を含むが、これに限定されない。これらの生物学的界面活性剤 もまた、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｗｔｐａｎｙから市販されている 。

界面活性剤の好ましい濃度は、約０．５と５．０％の間である。

好ましくは、界面活性剤溶液および試料の等容量を組合せ、充分に長い時間イン キュベートし、試料中に含まれるタンパク’！複合体を可溶化する。室温での５ から３０分のインキュベーション時間が、一般的には充分である。

好ましくは、生物学的試料からの生体分子の沈澱が、室温（２０°Ｃ）または室 温より低い温度で起こる。最も好ましくは、ポリマーまたはポリマーの混合物が 粘性である温度で、沈澱が起こる。例えば、ＰＶＰとＰＥＧとのボワマー混合物 は、４℃でわずかに粘性である。ポリマーまたはポリマーの混合物の凝固点より も温度を下げるべきでないことが、当業者に理解される。従って、ポリマーまた はポリマーの混合物は、ポリマーまたはポリマーの混合物の凝固点と室温との間 の温度、最も好ましくは４°Ｃで、維持され、そして沈澱反応が行われるべきで ある。

−の　に　い゛れるポリマー ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、ノニルフェノール−エトキ シレート（ＮＥＰｓ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＥ）、ポリビニルピロリド ン（ＰＶＰ）、またはそれらの混合物などの、水溶性の直鎖状ポリマーの充分な 量を加えて沈澱物を形成することによって、生体分子が単離される。好ましくは 、ポリマーは、１０．０００と３６０．０００の間、最も好ましくは４０．００ ０の分子量を有するＰＹＰの水溶液である。ＰＶＰは、ポリマーの分子量に応じ て、１と３０ｇ／１ｏｏｌｌの間の濃度で水に溶解される。最も好ましくは、分 子量（ＭＷ）　４０．０００ノＰＶＰノ２０ｇ／１００ｍ１の溶液が、用いられ る。試料に加えるポリマーの容量は、目的とする生体分子が上清中に保持される か、または沈澱するかによって変化する。

炙しヱニ貰 単独のポリマーとして、２ｆ！もしくはそれ以上のポリマーとして、またはポリ マー網に、可溶性の直鎖状ポリマーが添加される。ポリマー網は、均質な、不溶 性の、架橋化または蜂の巣様構造のポリマーの非共有結合であり、結合したポリ マーの水と結合する特性を妨害しない。ポリマー網は、Ｓｐｅｒｌｉｎｇ、　Ｌ 、Ｈ，によって、　ｒ　Ｉｎｔｅｒｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ　Ｐｏｌｙｍｅｒ　 Ｎｅｔｗｏｒｋｓａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　ＮｅｔｖｏｒｋｓＪという表題の著 書、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｎ、　Ｙ、、１９８１年に詳細に記載されており、その教示は本明細書に援用さ れる。参考として本明細書に援用されている、Ａ臘。

Ｃｈｅｔ　Ｓｏｃ、Ｓｙ＋５ｐｏｓｉａ　５ｅｒｉｅｓ、３６７：２４４−２６ ８（１９８８）で、Ｆｅ１ｄｓ＋ａｎおよびＨｕａｎｇが記載しているように、 ４，４−ビスフェノールＡジシアネート、またはジシアネートおよびシアネート 化合物の混合物などの、芳香族ジシアニン化合物は、ポリマーを網状化するため の適切な試薬となる。

好ましくは、２容量のジシアネート化合物を１容量のポリマーまたはポリマーの 混合物に結合し、網を作り出す。ジシアネートの融点より高い温度に混合物を加 熱すれば、ジシアネートエステルはシクロ三量体化（ｃｙｃｌｏｔｒｉｍｅｒｉ ｚａｔｉｏｎ）反応を受け、トリアジン環およびポリマー分子を固定化する、比 較的開口した網目を形成する。好ましくは、混合物は８０°Ｃと９０゛Ｃとの間 の温度で約４０分間加熱される。得られた架橋化構造は、熱的にも機械的にも安 定であり、吸水性ポリマーの均質な混合物を提供する。

ポリマー網は、好ましくは、スポンジまたは蜂の巣様構造として試料に添加され 、目的とする生体分子を速やかに単離する。網中に分散したポリマーは、試料中 の水を吸収し、沈澱を生じる。次に、試料からポリマー網を除去する。目的とす る生体分子は、沈澱から単離されるか、または水などの適切な溶媒によりポリマ ー網から溶出される。

吐旦且！ ポリマーまたは試料のｐＨは、２とＸｏ、５の間のｐＨを有する酸または塩基の 溶液を用いて、４と９．２の間の所定のｐＨに調整されるのが好ましい。酸もし くは塩基の溶液がポリマー溶液に加えられ、次にそのポリマー溶液が試料に加え られるか、または酸もしくは塩基の溶液が、ポリマーの添加の前もしくは後に試 料に直接加えられる。

好ましくは、酸または塩基の溶液は、荷電したカルボキシル基または荷電したア ミ７基を所有する低分子量部分を含有する。例えば、酸または塩基の溶液は、イ ミダゾール、アミノカプロン酸、１つもしくはそれ以上のアミノ酸、または、好 ましくは塩の形成を回避する低分子量のシラン塩基性シラン化合物を含有し得る 。最も好ましくは、酸または塩基の溶液は、イミダゾールまたはアミノカプロン 酸を含有する。そのような化合物は、アミノ酸よりも低コストである。あるいは 、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジンなどの荷電 したアミノ酸、もしくはそれらの塩；グリシン、セリン、スレオニン、システィ ン、チロシン、アスパラギン、もしくはグルタミンなどの非荷電の極性アミノ酸 、もしくはそれらの塩；またはグリシン、システィン、およびリジン、もしくは それらの塩の混合物などの、荷電および非荷電の極性アミノ酸を含有する溶液を 用いて、ｐＨを調整し、所望のｐｇを得る。

ｐＨを調整した種々のポリマーを試料に加えるか、または種々のｐＨに調整した 試料の一部にポリマーを加えることにより、適切な酸もしくは塩基の混合物との 試料のｐｉ勾配を確立し、そして、ゲル電気泳動、イムノプロット、もしくは酵 素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）などの慣用法により、得られた 上清または沈澱物を分析することによって、目的とする生体分子の最大量を最高 の純度で生成するｐＨを決定し、これによって最適ｐＨが決定される。

・に・　るポ１マーの 充分な量のポリマーが生物学的試料に加えられて、目的とする生体分子を沈澱す るか、または、妨害となる生体分子および他の物質を沈澱して目的とする生体分 子を上清中に残す。

１．１から２０：１の、試料に対するポリマーの容量比が、最適な分離をもたら す。好ましくは、試料に対するポリマーの容量比は、２：１である。

必要なポリマーの量は、試料中に存在する水の量に依存する。尿などの、大量の 水を含有する試料は、血清などのより濃縮された試料よりも、より多くのポリマ ーを必要とする。

ンノずり　の ＰＶＰとＰＥＧとの組合せは、２つの異なる機構により試料から水を吸収してタ ンパク質をうまく分離すると考えられる。ＰｖＰはペプチド結合を介して水と結 合し、ＰＥＧはヒドロキシル基を介して水と結合する。これらの組み合わされた 吸収機構が、現在利用可能なタンパク質の精製および単離方法では知られていな いタンパク質の純粋な分離を達成する、と考えられる。

グロブＷンの 例えば、本明細書に記載した方法は、１つもしくはそれ以上のタンパク質の分離 に以下のように適用される：免疫グロブリンは、ＰｖＰとＰＥＧとの混合物のポ リマー水溶液を用いて、ヒト血清試料から単離され、そのＰＥＧは２００と３５ ．０（ｔｏの間の分子量範囲を有する。４０．０００の分子量を有するＰＶＰ、 および３５００の分子量を有するＰＥＧが好ましい。好ましくは、ＰＶＰが水に 溶解され、ＰＥＧはＰＥＧの水溶液に加えられる。それぞれのポリマーの濃度は 、好ましくは１と３０ｇ／ｌｏＯｗ＋１の間、最も好ましくは、２０ｇ７１００ ｍｌ、または分子量３５００を有するＰＥＧに関しては２０％である。ＰＶＰお よびＰＥＧの等しい濃度により、一般に、タンパク質は最も好都合に単離される 。

ポリマー溶液を試料に加える前に、ポリマー溶液は、酸または塩基の溶液を用い て６．８と７．２との間の中性のｐＨに調整される。好ましくは、ポリマー溶液 のｐＨは、約２．０％の６−アミ／カプロン酸および２ｍｇ／ｍｌのイミダゾー ルを含有する溶液を用いて調整される。あるいは、約１．２＋ｅｇ／ｍｌのアス コルビン酸、約１．５■ｇ／■Ｉのヒスチジン、および約１．５■ｇ／ｍ　ｌの リジンの水溶液を用いて、ｐＨが調整される。

ｐＨを調整したＰＶＰ／ＰＥＧポリマー混合物の約２容量が、１容量の血清に加 えられて、沈澱を形成する。最も好ましくは、１■ｌのポリマーが０．５ｗ１ｌ の血清に加えられる。好ましくは、血液に加えられるポリマー混合物は、粘性で ある。ポリマーの凝固点よりも高いが、室温よりは低い温度にポリマー混合物を 保つことによって、粘性が得られる。好ましくは、血液中に存在　・するタンパ ク質を完全に沈澱させるために、ポリマー混合物および血液は、充分長い時間静 置される。最も好ましくは、ポリマー混合物は４℃の温度に保たれ、ポリマー混 合物と血液とを組み合せた液は、４°Ｃで約２０分間かけて沈澱される。

上清がアルブミン分画を保持する一方、沈澱物は免疫グロブリン分画を含有する 。

充分な量の亜鉛化合物、最も好ましくは硫酸亜鉛７水和物を加えることにより、 アルブミンは上清から沈澱される。

イムノアッセイ 生物学的試料中の特定の抗体を検出するためのイムノアッセイに、上述の生体分 子分離方法が用いられ得ることが、当業者に理解される。抗原は、その抗原に特 異的な抗体を含有する生物学的試料と混合され、そしてその混合物は充分長い時 間インキコベートされて、抗体−抗原複合体が産生ずる。

遊離の抗原からの抗体−抗原複合体の単離は、上述の免疫グロブリンの単離方法 と同様の方法で行われる。

支り主立亙戒藤 血漿、尿、を髄液、発酵液、リンパ液、組織培養液および腹水液を含む、血清以 外の生物学的な液体からの生体分子の単離に、本明細書に提供される方法が有用 であることが、当業者に理解される。

および　か゛の　ンパク　の この他の好ましい方法では、グリシンで所定のｐＨに調整した可溶性の直鎖状ポ リマーを含有する溶液を用いる沈澱により、タンパク質が尿またはを髄液から単 離される。最も好ましくは、ポリビニルピロリドンおよびポリエチレングリコー ルの混合物が亜鉛グリシネートの溶液と組み合わされ、その組み合わされた溶液 が尿またはを髄液の試料に加えられて、タンパク質を含有する沈澱物を産生ずる 。

キット 生物学的試料から生体分子を単離するためのキットが提供され、そのキットは可 溶性の直鎖状ポリマーまたはポリマー混合物を含有する。好ましくは、ポリマー は、タンパク質を、最も好ましくは免疫グロブリンを、ヒト血清試料などの生物 学的試料から単離するためのポリビニルピロリドントポリエチレングリコールと の混合物である。好ましくは、ポリマーは、試料中の他の成分から目的とする生 体分子を最適に分離させるｐＨに、前調整される。

試料とポリマーとの組み合せによって形成した沈澱物中で、目的とする生体分子 が単離される場合は、キットはその沈澱物を再溶解するための再懸濁液をさらに 含有し得る。好ましくは、再懸濁液は、沈澱物の再懸濁を安定にするためのアル カリ性溶液である。

上述したタンパク質の単離方法は、以下の実施例を参考としてさらに理解される が、これに限定されるものではない。

実施例１： ＰｖＰとＰＥＧとのポリマー混合物を用いるヒト血清からの免疫グロブリンの単 離における、ｐＨの効果 ＰＶＰ　（Ｍｌｆ−４０，０００）とＰＥＧ（ＭＷ＝３５００）とのポリマー混 合物を用いて、免疫グロブリンをヒト血清から単離した。Ｓｉｇ■ａ、　Ｓｔ、 　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯから入手したポリマーの２０グラムを、１００ｍ１の、１ ０Ｘリン酸緩衝液添加生理食塩水（ＰＢＳ）、１　ｘ　ＰＢＳ、または蒸留水の いずれかに加えて、各ポリマーの２０％溶液を調製した。

各２０％ポリマー溶液のｐｉを、１．１ｇ／■ｌの塩酸グリシン、１．２１ｇ／ ■ｌのンスティン、およびｆ、４６ｇ／ｓｌのリジンを含有するアミノ酸水溶液 を用いて、約７のｐＨに調整した。各アミノ酸は、Ｓｉｇｍａ　（Ｓｔ、　Ｌｏ ｕｉｓ、　ＭＯ）から入手した。ポリマー溶液中のアミノ酸の濃度は、最終的に は１０ｍＭであった。

１０ミリリツトルのｐＨを調整したポリマー溶液を、１．２５＊＋１のヒト血清 に加えた。各試料に加えたＰｖＰおよびＰＥＧの水溶液の容量を、下記表１に記 載する。

表Ｉ：タンパク質試料に加えたＰｖＰおよびＰＥＧの量２　１０ｍ１　０ｗ１ ３　９■ｌ　１謙１ ４　８簡１　２ｍ１ ５　７■ｌ　３ｍ１ ６　６曹ｌ　４■１ ７　５１　５麿Ｉ ８　４■ｌ　６＋＊１ ９　３１　７■１ １０　２■ｌ　８曹１ １１　１■ｌ　９ｍ１ １２　０ｓｌ　１０ｍ１ １０ＸＰＢＳ、　ＩＸＰＢＳ、または水のいずれかに溶解したポリマーの容量を 、下記表ＩＩに記載する。

表ＩＩ：溶液に溶解したポリマーの容量Ａ　１０．ｈｌ　Ｏ，０■ｌ　Ｏ，０ｍ １Ｂ　Ｓ、Ｏｓｌ　５．Ｏｍｌ　０．０ｍ１Ｃ２，５■ｌ　７．５■ｌ　０．０ ｍ１Ｄ　１．　Ｏｍｌ　９．０■ｌ　Ｏ，０ｗ１Ｅ　Ｏ，Ｏｗｌ　５．０■ｌ　 ５．０ｍ１Ｆ　Ｏ，Ｏｍｌ　２．５＋ｓｌ　７．５■ｌＧ　Ｏ，Ｏ＋＋１　１． 　Ｏｍｌ　９．０ｍ１ＨＯ，Ｏｓｌ　Ｏ，Ｏｗｌ　１０．０■ｌいずれの試料の 組も、４℃で１８時間インキュベートした。沈澱が形成した。上清を、沈澱物か ら傾斜法によって除去した。

沈澱物を、リン酸緩衝液添加生理食塩水に再溶解した。各試料の沈澱物および上 清はいずれも、２次元アガロース電気泳動ゲルで１８時間泳動した。この電気泳 動ゲルは、グロブリンとアルブミンとの良好な分離を示した。

各試料から得た沈澱物を再溶解した溶液の３μｌアリコートをウェルに載せ、ゲ ルの左側部分で泳動させた。各試料から得た上清の３μｌアリコートをウェルに 載せ、ゲルの右側部分で泳動させた。血清タンパク質を、全分子抗ヒト血清抗体 （ａｗｈｏｌｅ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ　ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ　ｓｅｒｕｍ　ａｎ ｔｉｂｏｄｙ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ。

Ｌｏｕｔｓ、　ＭＯ）を用いる沈降法によって検出した。免疫グロブリンを、抗 ヒト全１ｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ＞を用いる沈降 法によって検出した。タンパク質アッセイ試薬であるクーマン−ブルー（Ｃｏｏ ｍａｓｓｔｅ　Ｂｌｕｅ）（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｒｏ ｃｋｆ。

ｒｄ、　ＩＬ）を用いて、沈降物を染色した。

沈澱物中のグロブリン量は、試料９−１２、ＧおよびＨで最大であった。また、 これらの試料、特に試料９−１０は上清中にはグロブリンを実質的に有さなかっ た。

実施例２： ＰＶＰとＰＥＧとのポリマー混合物および亜鉛グリシネートを用いるヒト尿から のタンパク質の沈澱 以下の３種の実験を行って、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ。

４０．０００　ＭＷ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、３，３５０μｌ）、 および亜鉛グリシネートを含有する溶液の、尿またはを髄液からタンパク質を沈 澱する能力と、脱イオン水および亜鉛グリシネートを含有する溶液の能力とを、 比較した。

支１Ｍ ５１ｇｗ＋ａ、　ＳＬ、　Ｌｏｕｔｓ、　ＭＯから入手した、１４グラムのポリ マーを１００＋＊ｌの蒸留水に加えて、各ポリマーの２８％溶液を調整した。

各ポリマーの等容量を組み合わせて、ＰｖＰ＼ＰＥＧ混合物を形成した。ＰＶＰ ／ＰＥＧ混合物のｐＨは、３，６であった。

１Ｍグリシンと０．４Ｍ酸化亜鉛とを脱イオン水中で反応させ、亜鉛グリシネー トの溶液を調製した。

１容量の亜鉛グリシネート溶液を、９容量のＰＶＰ／ＰＥＧ混合物と組み合わせ た。コントロールとして、１容量の亜鉛グリシネート溶液を、９容量の脱イオン 水と組み合せ、１：１０の希釈液を作成した。

下記表Ｉ１１に示すように、ＰＶＰ／ＰＥＧと亜鉛グリシネートとの混合物（Ｐ ＶＰ／ＰＥＧ／ＺｎＧ１ｙ）、またはコントロール混合物（ｄＨ２０／ＺｎＧ１ ｙ）の種々のアリコートを、１１のヒト尿に加え、各チュー・ブ中に形成した沈 澱物の量を肉眼で比較した。

表Ｉｌｌ：尿からノタンハク質沈澱におけルＰＶＰ／ＰＥＧ／ＺｎＧｌｙ（ｐＨ ３，６）またはｄＨ２０／ＺｎＧＩｙの容量の効果加えた　形成した沈澱物 」　■Ｕム以１政ｎ　岨徨ａ皿打 １００μｍ　２．ＯＸ　１．０Ｘ ２００μｍ　４．ＯＸ　１．０Ｘ ３００μｌ　４．５Ｘ　１．５Ｘ ４００μｌ　５．ＯＸ　２．５Ｘ ５００μｔ　ｓ、ｓｘ　ｚ、５ｘ ６００μｍ　６．ＱＸ　２．５Ｘ ７００μｌ　６．ＯＸ　２．５Ｘ ８００μｍ　６．’ＯＸ　２．５Ｘ ９００μＩ　６．Ｏｘ　２．５ｘ １０００μｌ　６．ＯＸ　２．５Ｘ この結果は、ＰＶＰ／ＰＥＧ／亜鉛グリシネート溶液によって尿から沈澱したタ ンパク質の量の方が、等量のｄＨ２０／亜鉛グリシネート溶液によって沈澱した タンパク質の量よりも大きいことを示した。

支骸−詫 ＰＶＰ／ＰＥＧ／亜鉛グリシネートおよびｄＨ２０／亜鉛グリシネートを含有す る溶液を、上記実験例２Ａに記載したようにして調整した。各溶液のｐＨを、塩 酸グリシンの溶液（１０膳ｌの脱イオン水中に５００ｍｇのグリシン１（ＣＩ） を用いてより中性のｐＨに調整した。

塩酸グリシンの１．２謹１アリコートを、ＰＶＰ／ＰＥＧ／亜鉛グリシネート溶 液に加えて、ｐＨを６．２に上昇させた。塩酸グリシンの２．２１アリコートを 、ｄＨ２０／亜鉛グリ亜鉛−リンネート溶液、ｐＦＩを６４に上昇させた。

下記表＋Ｖに示すように、ＰＶＰ／ＰＥＧ／亜鉛グリシネート混合物（ＰＶＰ／ ＰＥＧ／ＺｎＧＩｙ）、またはコントロール混合物（ｄＨ２０／ＺｎＧ１ｙ）の 種々のアリコートを、ｌ１１１のヒト尿に加え、各チューブ中に形成した沈澱物 の量を肉眼で比較した。

表１ｖ尿からのタンパク質沈澱におけるＰＶＰ／ＰＥＧ／ＺｎＧ１ｙ　（ｐＨ６ ゜２）またはｄＨ２０／ＺｎＧｌｙ（ｐＨ６，４）の容量の効果加えた　形成し た沈澱物 Ｌ！　旺閏１票律」　姐設μ刷ｎ ２００μｍ３．ＯＸ１．０Ｘ ４００μｌ　ｓ、ｏｘ　２．０ｘ ６００μｌ　６．ＯＸ　４．ＱＸ ８００μｍ　ｇ、Ｏｘ　８．０ｘ １０００μｌ　８．ＯＸ　８．Ｏｘ この結果は、８ｏｏμｍより少ない容量では、ＰＶＰ／ＰＥＧ／亜鉛グリシネー ト溶液によって尿から沈澱したタンパク質の量の方が、等容量のｄＨ２０／亜鉛 グリシネート溶液によって沈澱した量よりも大きいことを示した。さらに、ｐＨ を６．２に調整することによって、ＰＶＰ／ＰＥＧ／亜鉛グリシネート混合物の 添加により生じる沈澱の量は、加える容量が大きくなるに従って増加した。

支１ｘ ＰＶＰ／ＰＥＧ／亜鉛グリシネートおよびｄＨ２ｏ／亜鉛グリシネートを含有す る溶液を調製し、上記実験例２Ｂに記載のようにｐｉを調整した。

下記表ＩＶに示すように、ＰＶＰ／ＰＥＧ／亜鉛グリシネート混合物（ＰＶＰ／ ＰＥＧ／ＺｎＧ１ｙ）　１７）種ｋ（ｒ）７１）コート、または５０（１８ｍ） ：２　：、ｙトロール混合物（ｄＨ２０／ＺｎＧ１ｙ）を、１ｍｌのヒト脳を髄 液に加え、混合物を２０°Ｃで３０分間インキュベートし、各チューブ中に形成 した沈澱物の量を肉眼で比較した。

表Ｖ：を髄液からのタンパク質沈澱におけるＰＶＰ／ＰＥＧ／ＺｎＧｌｙの容量 の効果 加えた　形成した Ｕ　渡五血 ｉｏｏμｍ　０Ｊｘ Ｚｏｏμｌ　１．０Ｘ ３００μｍ　２．０ｘ ４００μｍ　３．０Ｘ ５００μ１５．ＯＸ コントロール　０．０× この結果は、ＰＶＰ／ＰＥＧ／亜鉛グリシネート溶液の添加量を増加させること により、を髄液から沈澱するタン１＜り質の量が増加することを示した。これと は対照的に、ｄＨ２０／亜鉛グリシネート溶液は肉眼で確認し得るタンノ（り實 の沈澱を生成しなかった。

実施例３： ４℃でのマウス腹水液からのガンマグロブリンの沈澱以下の実験を行って、ポリ ビニルピロリドン（ＰＶＰ、４０，０００　ＭＷ）、およびポリエチレングリコ ール（ＰＥＧ、３．３５０　ＭＷ）を含有する溶液を用いるマウス腹水液からの ガンマグロブリンの沈澱における、温度の効果を測定した。

Ｓｉｇｍａ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｔｓ、　ＭＯから人手した、２８グラムのポリマ ーを、１００１の０．１Ｍ酢酸ナトリウムに加えて、各ポリマーの２８％溶液を 調製した。各ポリマー溶液の等容量を組み合わせて、ＰＶＰ／ＰＥＧ混合物を形 成した。ＰＶＰ／ＰＥＧ混合物のｐＨを、氷酢酸を用いて５．８に調整した。

マウス腹水液（０，５■ｌ）と２．０閣ｌのＰＶＰ／ＰＥＧ混合物とを、以下の 各反応条件下で組み合わせた： 反応１−沈澱反応を２０℃で行った。沈澱後、混合物を直ちに遠心分離した。

反応２−沈澱反応を４°Ｃで行った。沈澱後、混合物を直ちに遠心分離した。

反応３−沈澱反応を２０℃で行った。沈澱後、混合物を遠心分離する前に、２０ ℃で３０分間静置した。

反応４−沈澱反応を４℃で行った。沈澱後、混合物を遠心分離する前に、４°Ｃ で３０分間静置した。

遠心分離を、４５００ｒｐｍで、２０°Ｃで３０分間行った。上清を傾斜法で除 去し、沈澱物を再懸濁緩衝液中に再懸濁した。結果は以下の通りである： 表ｖ■：腹水液からのタンパク質の沈澱における、温度の効果反応　沈澱物　上 清 ｌ豆　巨星　ｕ　ｌ■度 １　オフホワイト　１．０×　濁っている２　褐色　１．５×　澄明 ３　オフホワイト　１．０×　澄明 ４　褐色　２．０×　澄明 各反応から得た沈澱物を再溶解した溶液の３μｍアリコートをウェルに載せ、ア ガロース電気泳動ゲルで泳動させた。各反応から得た上清の３μｍアリコートを ウェルに載せ、第２のアガロース電気泳動ゲルで泳動させた。ガンマグロブリン を、抗マウス全１ｇＧ抗体（Ｓｉｇｇ＋ａ、Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）を用 いる沈降法によって検出した。タンパク質アンセイ試薬であるクーマシーブルー （Ｃｏｏｓａｓｓｉｅ　Ｂｌｕｅ）（ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｓｉｃａｌ　Ｃｏ、、 　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉ＋、）を用いて、沈降物を染色した。

電気泳動ゲルの結果は、反応２および４が、反応１および３よりもより多くのガ ンマグロブリンを沈澱物中に含有することを示した。また、反応２および４は、 反応１および３よりもより少ないガンマグロブリンを上清中に有した。反応４は 、沈澱物中に最大量のガンマグロブリンを有し、上清中に最少量のガンマグロブ リンを有した。４つの反応の各上清中の他のタンパク質の量は、４つの各沈澱物 中の量よりもはるかに大きかった。

この結果は、より大きい粘性を有するポリマー混合物は沈澱物中のガンマグロブ リンを単離する能力がより大きいことを示している。　ＰＶＰ／ＰＥＧポリマー 混合物は、２０℃よりも、４℃においてより高い粘性を有する。

（以下余白） 実施例４： イミダゾールおよび６−アミノカプロン酸を用いてＰＶＰ／ＰＥＧ溶液のｐＨを 調整した後の、血液からのタンパク質の沈澱以下の実験を行って、イミダゾール および６−アミンカプロン酸を含有するＰＶＰ／ＰＥＧ溶液のｐｔ＋安定性を、 測定した。

爽骸−ロ 上述の実施例３に記載に従って調製した、各１４％のＰＶＰおよびＰＥＧを含有 するポリマー溶液を、６−アミ７カプロン酸およびイミダゾールを用いてｐＨ７ ，２に調整した。溶液（５０■ｌのＰＶＰ／ＰＥＧ）は最終的に、２．１％の６ −アミノカプロン酸および１００＋＊ｇのイミダゾールを含有した。

ヤギ血清の０．５園ｌアリコートを２℃に冷却し、２．０閣ｌ、　３．０■１１ ４．０閣ｌ、および５．０ｗ１（７）、ＩＩＩ（７，２）ＰＶＰ／ＰＥＧボＩＪ 　？−溶液とともに、短時間ポルテックス攪拌して、次に２℃で２０分間反応生 成物を静置することによって反応させた。反応液を次に、４５００ｒｐ−で、２ ０°Ｃで３０分間遠心分離した。上清を傾斜除去し、沈澱物の量を肉眼で観察し 、そして沈澱物を２．０閣ｌの再懸濁緩衝液に再懸濁した。結果は以下の通りで あった。

血清に加えるＰｖＰ／ＰＥＧポリマー溶液の容量が増加した時、観察された沈澱 物の量が増加した。さらに、ＰＶＰ／ＰＥＧポリマー溶液のｐＨｌは、時間の経 過に係わらず一定であった。

爽鳳−廷 各１４％のｌ’ｌ／ＰおよびＰＥＧを含有するポリマー溶液のｐｌ’ｌを、実験 ４Ａに上述したように調整した。

ヤギ血清の０．５■ｌアリコートを４℃に冷却し、２ｏ■ｌ、および４０■１の ｐＨ７，２のＰＶＰ／ＰＥＧポリマー溶液とともに、短時間ポルテックス攪拌し て、次に４℃でｚｏ分間反応生成物を静置することによって反応させた。反応液 を次に、４５００ｒｐｍで、２０’Ｃで３０分間遠心分離した。上清を傾斜除去 １２、沈澱物の量を肉眼で観察した。上清は澄明であった。４０ｍ１のＰＹＰ／ ＰＥＧポリマー溶液を含有する反応における沈澱物は、２ｏ■ｌのＰＶＰ／ＰＥ Ｇ溶液を含有する反応における沈澱物よりも僅かに多くの沈澱物を含んだ。

いずれの沈澱物も、１■ｌの冷却した（４℃）重炭酸ナトリウム再懸濁緩衝液に 再懸濁した。

６−アミノカプロン酸を用いてｐ）１６．２に調整した２、　０ｗ＋１の冷却し た（２°Ｃ）ＰＶＰ／ＰＥＧポリマー溶液を、各再懸濁した沈澱物に加えて、第 ２の沈澱を行った。混合物を短時間ポルテックス攪拌して、２°Ｃで３０分間静 置した。遠心分離および上清の傾斜を、上記のように行った。いずれの上演も澄 明であった。いずれの沈澱物も、最初の沈澱物よりも、１／３という、より少な い沈澱物を有し、そしてより明るい色調であった。

実施例５； 腹水液からのタンパク質の沈澱におけるＴｗｅｅｎ−２０Ｔ″の効果ＰＶＰ／Ｐ ＥＧ溶液を用いる沈澱の前に、界面活性剤であるポリオキシエチレンエルビタン （Ｔｖｅｅｎ−２０Ｔ″）を腹水液に加えることによる効果を示すために、以下 の実験を行った。

ＰＶＰ／ＰＥＧポリマー溶液（各２１％ポリマー）を、実施例３に上述したよう に調製した。ポリマー溶液のｐＨを、イミダゾールを用いてｐＨ７，０に調整し た。

０．５■ｌのＴｗｅｅｎ−２０”（Ｓｉｇｉ＋ａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐ ａｎｙ、Ｓｔ、Ｌｏｕｔｓ。

ＭＯ）を１０ｍ１の脱イオン水に溶解して、４．７％のＴｖｅｅｎ−２０”の脱 イオン水溶液を調製した。４．７％溶液を脱イオン水でさらに希釈して、０．９ ４％、１．８８％、２．８２％、および３．７６％の濃度の溶液を調製した。

各１ミリリツトルの上記Ｔｖｅｅｎ−２０Ｔ″溶液を、１．０■ｌのマウス腹水 液に加えた。コントロールとして、１ミリリツトルの脱イオン水を、１．０■ｌ のマウス腹水液に加えた。すべての試料を十分に混合し、２０℃で１５分間静置 した。

２ミリリツトルのＰＶＰ／ＰＥＧポリマー溶液を、次に、ポルテックス攪拌しな がら各試料に加えた。すべての試料を２０℃で１５分間混合した。反応生成物を 次に、４５００ｒｐ−で、２０℃で３０分間遠心分離し、上清を傾斜除去し、沈 澱物を、１．０■ｌの重炭酸ナトリウム緩衝液に再懸濁した。

１ミリリツトルのＰＶＰ／ＰＥＧポリマー溶液を、再懸濁した沈澱物に、ポルテ ックス攪拌しながら加えた。すべての試料を２０℃で１５分間混合し、遠心分離 し、上清を傾斜除去し、沈澱物を上記のように再懸濁した。

各試料を、アガロースゲルおよびロケット電気泳動（ｒｏｃｋｅｔ　ｅｌｅｔｒ ｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）の両方で泳動した。各試料の４つの分画のそれぞれのガン マグロブリンのパーセントを、算出した０結果を表Ｖｌ＋に示す。

表Ｖｌｌ：腹水液からのタンパク質の沈澱における界面活性剤濃度の効果 反応　丁ｖｅｅｎ−２０”　分画当りの％ガンマグロブリン１号　のパーセント 　１　ｚ　旦　生 １　０　６．７　６３，０　１９．５　１０．８２　０．９４　３．６　７０． １　１７．９　Ｂ、４３　１．８ｇ　２．７　７４，８　１５．７　６．８４　 ２．８２　Ｌ、６　７８．７　１３．７　６．Ｑ５　３．７６　２．１　７８． ０　１３．９　６．０この結果は、Ｔｗｅｅｎ−２０”″のパーセントが増加す る時、沈澱物中のガンマグロブリンの純度が増加することを示した。１゜８８Ｌ 　２．８２％もしくは３．７６％のＴｖｅｅｎ−２０”″を含有する、反応番号 ３．４または５では、アルブミンが検出されなかった。従って、ＰＶＰ／ＰＥＧ 溶液を用いる沈澱の前にＴｖｅｅｎ−２０Ｔ″を試料に加えると、試料中のタン パク質複合体が分散し、ポリマー溶液によってより純粋なガンマグロブリン分画 が沈澱した。

実施例６゜ ヒト血漿からのタンパク質の沈澱における、Ｂｒ１ｊ　３５”およびＴｒｉｔｏ ｎ　Ｘ−１０２”を用いるプレインキュベージぢンの効果２つの異なるＰＶＰ／ ＰＥＧ溶液を用いる沈澱の前に、ポリオキシエチレンエーテルであるＢｒ１ｊ　 ３５１″およびＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１０２”″（２種の市販の生物学的界面活性 剤）をヒト血漿に加えることによる効果を示すために、以下の実験を行った。

ＰＶＰ／ＰＥＧポリマー溶液（各２０％ポリマー）を、実施例３に上述したよう に調製した。ポリマー溶液のｐＨを、６−アミノカプロン酸およびイミダゾール を用いてｐＨ５，８に調整した。各６．６％の各ポリマーおよび３３％エタノー ルを含有する第２のＰＶＰ／ＰＥＧポリマー溶液も、調製した。エタノールは、 汚染ウィルスを不活化するために、日常的に血液試料に加えられる。

１％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１０２”溶液および１５蔦のＢｒ１ｊ　３５Ｔ″溶液 （いずれもＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕ ｔｓ、　ＭＯから入手した）の脱イオン水溶液を調製し、Ｂｒ１ｊ　３５ＴＦ′ 溶液を１％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１０２１１溶液でさらに希釈して、１５％、７ ．５％、３．７５％、１．９％、０．９％および０．５％の濃度のＢｒ１ｊ　３ ５”溶液を調製した。

各１ミリリツトルの上記Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　１０２”／Ｂｒ１ｊ　３５Ｔ″溶液 を、１．０讃ｌのヒト血漿に加え、十分に混合し、２０’Ｃで３５分間静置した 。

２ミリリツトルの２０％のＰＶＰ／ＰＥＧポリマー溶液を、次に、ポルテックス 攪拌しながら各試料に加えた。すべての試料を２０℃で１５分間混合した。次に 、反応生成物を３６０Ｏｒｐｍで、２０℃で３０分間遠心分離し、上清を傾斜除 去し、沈澱物を、１．ｈｌの脱イオン水に再懸濁した。各再懸濁した沈澱物の２ ００μｌアリコートを、分析するために移した。

残すの８００μｌの中から４００μｌアリコートを取り、清潔な遠心チューブに 入れ、この実験において第１群とする。残りの４００μｍの試料を、この実験に おいて第１Ｉ群とする。６．６ｚのＰＶＰ／ＰＥＧ溶液（エタノールを含有する ）の１．２鵬ｌアリコートを、第１群のチューブに加えた。２０％のＰＶＰ／Ｐ ＥＧ溶液の０．４−１アリコートを、第１１群のチューブに加えた。両方の群の チューブを、２０℃で３０分間混合し、上述のように遠心分離し、上清を傾斜除 去し、沈澱物を０．４１の重炭酸す）　ＩＪウム緩衝液に再懸濁した。

各試料を、タンパク質セルロースアセテート電気泳動で分析した。両方の群にお いて、Ｂｒ１ｊ　３５”″のパーセントが減少すれば、アルブミン、ベータおよ びアルファグロブリンの量もまた、減少した。しかし、再懸濁した沈澱物中のガ ンマグロブリンの量は増加した。

各試料について、第１および１１群からの再懸濁した各沈澱物の２００μｍアリ コートに、２５μｌの再構成トロンビンを加えて、フィブリノーゲンの存在をア ッセイした。結果を下記表’／Ｉ１１に示す。

表Ｖｌ！Ｉ：ヒト血漿から沈澱したガンマグロブリンのフィブリノーゲン汚染に おける、Ｂｒ１ｊ　３５”の濃度の効果反応　Ｂｒ１ｊ　３５Ｔ″　フィブリノ ーゲン１号　パーセント　１度 第１群 コントロール　Ｏ＋＋＋＋＋ １　１５．０％　＋＋＋＋＋ ２　７．５％　＋＋＋ ３　３．７５％　＋＋ ４１．９％　＋（微量） この結果より、ウィルスを不活化するためにエタノールの存在下でＰＶＰ／ＰＥ Ｇポリマー溶液を用いる場合、ガンマグロブリン沈澱物のフィブリノーゲンによ る汚染を防ぐためには、Ｂｒ１ｊ　３５Ｔ″の量は１％より大きくするべきでな いことを示す。

実施例７： 腹水液力らのタンパク質の沈澱における、ドデシル硫酸ナトリウムの効果 界面活性剤であるドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）をＰＶＰ／ＰＥＧ溶液に加 えることにより、続く腹水液からのガンマグロブリンの沈澱に関する効果を示す ために、以下の実験を行った。

ＰＶＰ／ＰＥＧポリマー溶液（各２１％ポリマー）を、実施例３に上述したよう に調製した。ポリマー溶液のｐＨを、イミダゾールを用いてｐｆ１６．５に調整 した。ＰＶＰ／ＰＥＧ溶液を含有するチューブにＳＤＳを加え、１．０から０パ ーセントの範囲で濃度を変えたＳＤＳを含有する溶液を調製した。

２％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００”溶液（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍ ｐａｎｙ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）の０．５箇１アリコートを０．５Ｉ ｌｌのマウス腹水液に加え、十分に混合し、２０°Ｃで１５分間静置した。

１ミリリツトルのＰＶＰ／ＰＥＧ／ＳＤＳ溶液を、ポルテックス攪拌しながら各 試料に加えた。反応液を２０℃で３０分間混合し、３６００ｒｐｍで、２０°Ｃ で３０分間遠心分離し、上清を傾斜除去し、沈澱物を０．５ｍｌの脱イオン水に 再懸濁した。

ＳＤＳを含まなイＰＶＰ／ＰＥＧ溶液（ＤＯ，Ｓｍ１７　リ−ｙ　−トを、次に 、ポルテックス攪拌しなから各再懸濁溶液に加え、２０°Ｃで３０分間混合し、 上述のように遠心分離し、上清を傾斜除去し、沈澱物を０．５１の重炭酸ナトリ ウム緩衝液に再懸濁した。

再懸濁した沈澱物を、ロケ、）電気泳動にかけた。この結果は、ＰＶＰ／ＰＥＧ ポリマー溶液中のＳＤＳ量が増加する時、最終的な沈澱物中の総タンパク質量が 減少するが、ガンマグロブリンの量は一定に保たれることを示し、アルファおよ びベータグロブリン汚染がより少なかったことから、ＳＤＳの存在が沈澱したガ ンマグロブリンの純度を増すことを示した。

実施例８： ＰＥＧとＰＶＰ／ＰＥＧ、ｆリマー混合物とを用いた、腹水液からのモノクロー ナル抗体の沈澱の比較検討 マウス腹水液から沈澱したモノクローナル抗体の量および純度を、ＰＥＧポリマ ー混合物またはＰＶＰ／ＰＥＧポリマー混合物について比較するために、以下の 実験を行った。

ＰＶＰ／ＰＥＧポリマー溶液（各２０％ポリマー）を、実施例３に上述したよう に調製した。２０％のＰＥＧ（Ｍｌｆ８０００）ポリマー溶液を、同様に調製し た。各ポリマー溶液のｐＨを、イミダゾールを用いてｐｆ１６．６に調整した。

１ミリリツトルの腹水液を、１．０ｍｌの脱イオン水（反応Ｉ）、１、０ｍｌの ２％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１０２’″（反応２）、または１．０ｍｌの１．８％Ｔ ｒｉｔｏｎ　Ｘ−１０２”／３％Ｂｒ１ｊ　３５”　（反応３）ノイずれかと共 にブレインキュベートした。これらの３つの反応液をそれぞれ十分に混合し、２ ０℃で１５分間静置した。

２．０　ミ’Ｊ　！Ｊ　ットル（ＤＰＶＰ／ＰＥＧ溶液（第１群）ｔｆｉ−ＬＰ ＥＧｍ液（第１Ｉ群）のいずれかを、ブレインキュベーション混合物にそれぞれ 加えた。いずれの群も２０°Ｃで３０分間混合し、４０００ｒｐ■で、２０°Ｃ で３０分間遠心分離し、上清を傾斜除去し、沈澱物を、１゜０冒ｌの脱イオン水 に再懸濁した。

１ミリリ、ｌ−ルのＰＶＰ／ＰＥＧ溶液を、第１群の反応２および３に、ポルテ ックス攪拌しながら加えた（反応１は、遠心分離しなかった）。１ミリリｙ）ル のＰＥＧ溶液を、第１１群の反応１−３に、ポルテックス攪拌しながら加えた。

両方の群を、３０℃で３０分間混合し、上述のように遠心分離し、上清を傾斜除 去し、沈澱物を１厘１の重炭酸ナトリウムに再懸濁した。

以下の結果は注目される。第１１群の一連の反応（ＰＥＧにより沈澱）は、第１ 群の一連の各反応（ＰＶＰ／ＰＥＧにより沈澱）と比較して、最初の沈澱をより 多（有した。第１１群の一連の反応（ＰＥＧ）は上清が濁っており、すべてのタ ンパク質がチューブの底部に遠沈され得ないことを示した。第１群の反応２およ び３（ＰＶＰ／ＰＥＧ）は、上清が澄明であったが、第１＋群の同じ反応から得 た上清は非常に濁っていた。

アガロースゲルタンパク質電気泳動で試料を分析した。結果は、第１Ｉ群の一連 の反応（ＰＥＧ）の方が、第１群（ＰＶＰ／ＰＥＧ）から得られた最初の沈澱よ りも、最初の沈澱において、より多くのアルブミン、ベータグロブリン、および 他の汚染タンパク質を有することを示した。

実施例９： ＰＶＰ／ＰＥＧポリマー溶液を用いて血清から沈澱したガンマグロブリンの溶解 性における、ｐＨの効果 ＰＶＰ／ＰＥＧポリマー溶液を用いて血清から沈澱したガンマグロブリンの溶解 性および安定性について、再懸濁液のｐＨが効果があるかどうかを測定するため に、以下の実験を行った。

裏層−臥 １ミリリツトルのヤギ血清またはウサギ血清（Ｓｉｇ＋ｓａ　Ｃｈｅ謙１ｃａｌ 　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｔ、Ｌｏｕｔｓ、ＭＯ）を、１．０ｍｌの２％Ｔｒｌｔｏ ｎ　Ｘ−１０２’″（Ｓｉｇ■ａ）でプレインキコベートし、十分に混合し、２ ０℃で１５分間静置した。

ＰＩ／Ｉ’／ＰＥＧポリマー溶液（各２０％ポリマー）を、実施例３に上述した ように調製した。各ポリマー溶液のｐＨを、イミダゾールを用いてｐｉ（６，６ に調整した。

ＰＶＰ／ＰＥＧ溶液の２．０１アリコートを、ブレインキュベートした試料に、 それぞれポルテックス攪拌しながら加え、２０℃で３０分間混合し、３６０Ｏｒ ｐｍで、２０℃で３０分間遠心分離し、上清を傾斜除去し、そして、５寓ｌの０ ．５Ｍイミダゾールの脱イオン水溶液、および５ｍｌのｐＨ９，４のグリセロー ル（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｉ＋１ｃａｌ　Ｃ。

ｍｐａｎｙ、　Ｍｉｌｖａｕｋｅｅ、　Ｗｌ）を含有する溶液のうちの１ｍｌに 、沈澱物を再懸濁した。再懸濁した沈澱物を、２０°Ｃで１０分間静置した。

ＰＶＰ／ＰＥＧポリマー溶液の１．ｈｌアリフートを、各チューブにポルテック ス攪拌しながら加え、そのチューブを上述のように混合し、遠心分離し、上清を 傾斜除去した。１．０ｍｌの脱イオン水に沈澱物を再懸濁し、第２の沈澱工程を 繰り返した。ｐＨ８，２の、グリセロールおよび０．０６Ｍ重炭酸ナトリウムの ５０７５０の溶液の２５０μｔ、　ｓｏｏμｍ、７５０μｌまたは１０００μｍ に、得られた沈澱物を、再懸濁した。

結果は、ヤギまたはウサギのガンマグロブリンをアルカリ性の溶液に再懸濁する 場合は、中性または酸性の溶液に再懸濁する場合よりも、沈澱物が容易に溶解し 、そしてより澄明であることを、示した。

尖鳳−ル ０、５ｍｌのヒト血漿を含有する１０本の試験管を、２％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１ ０２”の脱イオン水溶液で、上述のように１５分間ブレインキュベートした。続 くインキュベーションでは、１ミリリツトルの上記ＰＶＰ／ＰＥＧポリマー溶液 ・（各２０％ポリマー）を、ブレインキュベートした各試料にポルテックス攪拌 しながら加え、２０℃で３０分間混合し、次に２５００ｒｐ−で、２０℃で３０ 分間遠心分離し、上清を傾斜除去し、そして、０．５■１の、以下の各ｐＨ値の ０．５Ｍイミダゾール溶液に、沈澱物を再懸濁した（ｐＨは、氷酢酸で調整した ）。

表１ｘ・イミダゾール再懸濁液のｐＨ ｐＨ勾配は、ｐＨと再懸濁したガンマグロブリンの澄明度との間の明瞭な相関関 係を示した。ｐＨＪｌ整の一滴ごとに、試料の濁度が増加した。ｐＨ１０，４の 試料１は、澄明であった。ｐＨ７，０の試料５までは、ｐＨ１ｌ整の一滴ごとに 濁度が増加したが、それでもかなり澄明であった。ｐＨ６，４で、試料は乳濁し た。試料８および９では、ガンマグロブリンが溶液から析出した。

結果は、ガンマグロブリンの再懸濁液のｐＨが、アルカリ性のｐｏによって明瞭 にもたらされる再懸濁の澄明度に直接比例することを示した。

尖鳳−銭 １．０ｍｌのヒト血漿を含有する１０本の試験管を、２％７ｒｉｔｏｎ　Ｘ−１ ０２”の脱イオン水溶液で、上述のように１５分間ブレインキュベートした。次 のインキュベーションでは、２ミリリットルの上記ＰＶＰ／ＰＥＧポリマー溶液 （各２０％ポリマー）を、プレインキコベートした各試料に、ポルテックス攪拌 しながら加え、２０°Ｃで３０分間混合し、３６０Ｏｒｐｍで、２０″Ｃで３０ 分間遠心分離し、上清を傾斜除去し、そして、以下のようにして調製したＴｒｆ ｚ■ａ１１塩基の溶液の１．０ｍｌに、タンパク質沈澱物を再懸濁した。

０．１ＭのＴｒｉｚｍａ”塩基（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎ ｙ、Ｓｔ、ＬｏｕＩｓ、ＭＯ）を調製した。製氷酢酸を用いてＴｒｉｓＴ″溶液 のｐａを調整して、ｐＩ（勾配を作った。以下のｐＨ値について、ガンマグロブ リンを含有するタンパク質沈澱物を再懸濁する能力を分析した。

表Ｘ：ＴｒｉｓＴ″再懸濁液のｐＨ ７６，５ ８　５．９ イミダゾールを用いる実験に見られたように（上記実験９Ｂ）、ｐＨ勾配は、ｐ Ｈとタンパク質懸濁液の澄明度との間の明瞭な相関関係を示した。澄明度は、ア ルカリ性のｐＨで最大であり、ｐ［Ｉは、−滴ごとに減少した。しかし、イミダ ゾール溶液に再懸濁した試料（実験９Ｂ）は、全般に、Ｔｒｉｓ”″溶液に再懸 濁した試料よりもより澄明であった。ｐＨ１０，４で再懸濁した沈澱物はかなり 澄明であったが、ｐＨ８，０では澄明度が低下して、はとんど濁っていた。ｐＨ ７，０では明かな沈澱物を含有した。試料８および９のタンパク質沈澱物は、再 懸濁しなかった。４℃で一夜静置した後、ｐＨ７，４よりも低いｐＨを有する溶 液に再懸濁したすべての試料に、沈澱が現れた。

結果は再び、ポリマー溶液によって沈澱したタンパク質を、安定かつ完全に再懸 濁するためには、タンパク質の再懸濁溶液がアルカリ性であるべきであることを 、示した。

本発明の生体分子単離方法の改変および変更は、前述した本発明の詳細な説明か ら、当業者に自明である。そのような改変および変更は、添付した請求の範囲の 範囲内に入ることを特徴する

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．生物学的試料から１つまたはそれ以上の生体分子を単離する、方法であって ： ａ）充分な量の可溶性の直鎖状ポリマーを該生物学的試料の溶液に加えて沈澱を 形成する工程であって、該溶液が所定のｐＨに調整される、工程；および ｂ）該溶液を上清および沈澱物の２つの分画に分離する工程であって、該生体分 子が上清または沈澱物のいずれかに存在する、工程； を包含する、方法。
2. ２．前記ｐＨが、アミノ基またはカルボキシル基を含有する低分子量部分を用い て調整される、請求項１に記載の方法。
3. ３．前記ポリマーが、ポリエチレングリコール、デキストラン、ノニルフェノー ル−エトキシレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンおよびそれ らの混合物からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
4. ４．前記低分子量部分が、イミダゾール、アミノカプロン酸、アミノ酸およびそ れらの混合物からなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
5. ５．前記ポリマーが、ポリビニルピロリドンおよびポリエチレングリコールの混 合物であって、該ポリマー混合物が前記試料に加えられる、請求項１に記載の方 法。
6. ６．前記ポリビニルピロリドンが約４０．０００の分子量を有し、そして前記ポ リエチレングリコールが約３５００の分子量を有する、請求項５に記載の方法。
7. ７．前記生体分子が、タンパク質、炭水化物、非タンパク質性のホルモン、およ び核酸からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
8. ８．前記タンパク質が、免疫グロブリンである、請求項７に記載の方法。
9. ９．血漿中のアルブミンとグロブリンとの比を測定するための、アッセイ法であ って； ａ）充分な量のポリビニルピロリドンおよびポリエチレングリコールのポリマー 溶液を血漿に加え、グロブリンを沈澱し、アルブミンを上清に残す工程であって 、該血漿のｐＨがほぼ中性のｐＨに調整される、工程； ｂ）該上清から該沈澱物を分離する工程；ｃ）グロブリンおよびアルブミンの濃 度を測定する工程；および ｄ）グロブリンに対するアルブミンの比を算出する工程；を包含する、アッセイ 法。
10. １０．ポリビニルピロリドンおよびポリエチレングリコールの混合物を含有する 、生物学的試料からのタンパク質の単離に用いるための、組成物。
11. １１．前記ポリビニルピロリドンが約４０，０００の分子量を有し、そして前記 ポリエチレングリコールが約３５００の分子量を有する、請求項１０に記載の組 成物。
12. １２．亜鉛グリシネートをさらに含有する、請求項１０に記載の組成物。
13. １３．血清タンパク質中の薬物の分布を決定するための方法であって： ａ）充分な量のポリビニルピロリドンおよびポリエチレングリコールの水溶液を 血清に加えてグロブリンを沈澱する工程であって、該血清のｐＨが所定の値に調 整される、工程；ｂ）該溶液を上清および沈澱物の２つの分画に分離する工程で あって、グロブリンに結合した薬物が一方の分画に存在し、アルブミンに結合し た薬物が他方の分画に存在する、工程；および ｃ）該沈澱物および該上清の分画を分析して薬物を検出する工程； を包含する、方法。
14. １４．安定な溶液中の可溶性の直鎖状ポリマーを用いて生物学的試料から沈澱し たタンパク質を、溶解するための方法であって、沈澱したタンパク質をアルカリ 性の水溶液に溶解する工程を包含する、方法。
15. １５．前記アルカリ性の水溶液が、グリセロール、重炭酸ナトリウム、イミダゾ ール、アルカリ性塩溶液、トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン、およびそ れらの混合物からなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
16. １６．生物学的試料から１つまたはそれ以上の生体分子を単離するための、キッ トであって： ａ）該生物学的試料から該生体分子を沈澱するために所定のｐＨに調整された、 可溶性の直鎖状ポリマー；およびｂ）該沈澱物を安定して再懸濁するための、溶 液；を包含する、キット。
17. １７．前記ポリマーが、ポリエチレングリコール、デキストラン、ノニルフェノ ール−エトキシレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンおよびそ れらの混合物からなる群より選択される、請求項１６に記載のキット。
18. １８．前記溶液がアルカリ性溶液である、請求項１６に記載のキット。