ES2640282T3 - Método de formulación de fármacos basado en el aumento de la afinidad de superficies de micropartículas cristalinas para agentes activos - Google Patents

Abstract

Una micropartícula cristalina que comprende una dicetopiperacina y polisorbato 80, incluyendo la micropartícula un agente activo adsorbido, y en donde la dicetopiperacina es 3,6-di(fumaril-4-aminobutil)-2,5-dicetopiperacina, en donde el agente activo comprende una insulina.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

DESCRIPCION

Metodo de formulacion de farmacos basado en el aumento de la afinidad de superficies de micropartfculas cristalinas para agentes activos

Campo de la invencion

Esta invencion esta generalmente dentro del area de las formulaciones farmacologicas y se refiere particularmente a metodos para revestir agentes activos sobre la superficie de micropartfculas cristalinas.

Antecedentes de la invencion

El aporte de agentes terapeuticas es un problema importante. La administracion oral es una de las vfas mas comunes y preferidas de aporte debido a la facilidad de administracion, el cumplimiento terapeutico de los pacientes y el coste reducido. Sin embargo, las desventajas de esta via incluyen una potencia baja o variable y una adsorcion ineficaz del agente terapeutico. Esto es particularmente evidente cuando el compuesto que se va a aportar es inestable bajo las condiciones encontradas en el tracto gastrointestinal. Se ha desarrollado en la tecnica una variedad de revestimientos y metodos de encapsulacion, pero solo unos pocos son eficaces para tratar este problema. Ademas, existen compuestos terapeuticos que tienden a ser menos activos en las condiciones del tracto gastrointestinal y se deben administrar en dosificaciones superiores para ser adsorbidos en la corriente sangumea en una cantidad eficaz.

Se ha desarrollado una amplia gama de sistemas de formulacion de farmacos para tratar el problema del aporte optimo de farmacos y se basan en la incorporacion de farmaco en una matriz que actua como un vehnculo. Factores considerados en la formulacion de farmacos incluyen los requisitos de que el sistema sea atoxico, no reactivo con el farmaco que se va a aportar, de fabricacion economica, este formado por componentes facilmente disponibles y sea coherente con respecto a la composicion final y las caractensticas ffsicas, incluyendo estabilidad y velocidad de liberacion. Tambien es preferible que el sistema de aporte de farmacos este formado por materiales que se retiren facilmente del cuerpo mediante procesos fisiologicos normales.

Las formulaciones farmacologicas en micropartfculas se pueden usar en numerosas vfas de administracion, pero particularmente son muy adecuadas para el aporte pulmonar. Ventajas de los pulmones para el aporte de agentes que tienen efectos sistemicos incluyen la gran cantidad de superficie espedfica y la facilidad de captacion por la superficie mucosa. La Patente de Estados Unidos N° 6.071.497 describe un sistema de aporte de farmaco pulmonar basado en la formacion de micropartfculas de dicetopiperacina asf como micropartfculas basadas en polfmero. El documento WO 2004/012672 divulga un complejo que contiene un compuesto y una dicetopiperacina para el aporte a celulas diana. El documento WO 01/00654 divulga micropartfculas de DKP en solucion donde las micropartfculas tienen un revestimiento de agente activo. El documento WO 96/13250 divulga metodos para revestir con un agente activo micropartfculas de latex preformadas.

Compendio de la invencion

Se proporcionan medios para formar un revestimiento de agente activo sobre micropartfculas cristalinas, que son las propias micropartfculas proporcionadas. En general, las micropartfculas se revisten con un agente activo al modificar las propiedades superficiales de las micropartfculas de modo que el agente activo tenga una afinidad superior por la superficie de las micropartfculas que por lo restante en solucion.

Se describen en la presente memoria metodos para revestir partfculas cristalinas tales como micropartfculas de fumarildicetopiperacina (FDKP) con agentes activos, tales como protemas, usando asociaciones estimuladas electrostaticamente, hidrofobamente o por enlaces de hidrogeno. El lfquido se puede retirar opcionalmente (para la recuperacion de micropartfculas revestidas con agente activo) mediante filtracion o secado, o se puede reemplazar al intercambiar por un medio de solucion diferente. En cualquier caso, la retirada del medio lfquido no es una etapa obligatoria en la formacion del complejo de agente activo-micropartfcula. Se divulga un metodo para el revestimiento de micropartfculas basado en el cambio de las propiedades superficiales de las micropartfculas cristalinas para conseguir la adsorcion del agente activo en la micropartfcula.

Tambien se proporciona un metodo para revestir una micropartfcula cristalina preformada en suspension con un agente activo que comprende; i) ajustar la interaccion energetica entre el agente activo y la micropartfcula cristalina independientemente de la retirada del disolvente; y ii) dejar tiempo para que el agente activo se adsorba sobre la superficie de la micropartfcula. El metodo para revestir una micropartfcula cristalina preformada en suspension con un agente activo puede comprender ademas una etapa de retirada o intercambio del disolvente sin un efecto sustancial sobre la interaccion entre el agente activo y la micropartfcula.

El metodo de revestimiento de la micropartfcula con agente activo se puede efectuar al modificar las propiedades superficiales de la micropartfcula. La modificacion de las propiedades superficiales de la micropartfcula se consigue al alterar las condiciones de la solucion. Estas condiciones, de un modo no limitativo, comprenden el cambio del pH. Las propiedades superficiales de la micropartfcula se pueden modificar mediante: 1) la alteracion de la polaridad de la solucion; 2) la adicion de iones monovalentes o multivalentes; y 3) la derivacion qrnmica de la micropartfcula.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Tambien se describen metodos que comprenden ademas una etapa de disolver el agente activo en la fase fluida de la suspension de micropardculas y posteriormente cambiar el pH. Esta etapa de disolucion del agente activo en una fase fluida se refiere a la disolucion de un solido. Ademas, esta etapa de disolucion del agente activo se refiere a la adicion de una solucion mas concentrada del agente activo ademas de anadir un solido.

Las condiciones de pH de la suspension de micropardculas se pueden alterar para favorecer interacciones entre el agente activo y la micropartfcula antes de, o despues, de la adicion de agente activo.

El agente activo puede tener mas de un tipo de interaccion energeticamente favorable con la superficie de las micropartmulas.

El agente activo es preferiblemente insulina o puede ser un analogo de la misma.

Las propiedades superficiales que crean una interaccion favorable entre el agente activo y la micropartfcula se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste en propiedades electrostaticas, propiedades hidrofobas y propiedades de union por enlaces de hidrogeno.

La micropartmula puede ser porosa y tener superficies interiores accesibles a la masa fluida de la solucion. La micropartmula puede comprender una dicetopiperacina tal como fumarildicetopiperacina pero no se limita a esta.

El metodo de revestimiento puede producir una monocapa de agente activo sobre la superficie de la micropartmula. La monocapa puede ser continua. El agente activo en la monocapa puede tener una orientacion preferida.

Tambien se describe un metodo para revestir una micropartfcula cristalina preformada en suspension con insulina que comprende ajustar la interaccion energetica entre el agente activo y la micropartfcula cristalina independientemente de la retirada de disolvente; y absorber la insulina sobre la superficie de las micropartfculas.

Disolvente, segun se usa en la presente, se refiere al medio fluido en el que se “banan” en agente activo y la micropartmula. No se debe interpretar que se requiera que todos los componentes esten en solucion. En efecto, en muchos casos, se puede usar para referirse al medio lfquido en el que estan suspendidas las micropartfculas.

Breve descripcion de los dibujos

Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para mostrar adicionalmente ciertos aspectos de los ejemplos divulgados en la presente memoria. La invencion se puede entender mejor mediante la referencia a uno o mas de estos dibujos en combinacion con la descripcion detallada de las realizaciones espedficas presentadas en esta memoria.

La Figura 1 representa los perfiles de valoracion ultrasonica de Hel para separar los componentes de la suspension de fumarildicetopiperacina (FDKP), partfculas de FDKP y tampon, segun las ensenanzas de la presente invencion. La magnitud de los cambios en el perfil de valoracion de la velocidad ultrasonica (Figura 1; Panel A) refleja los cambios de hidratacion provocados por la protonacion de grupos carboxilato ionizables de los componentes de la muestra. Los picos de exceso de atenuacion ultrasonica (Figura 1; Panel B) resultan de la relajacion rapida en la reaccion de intercambio de protones en el punto de saturacion. La frecuencia (F) es 15 MHz, la temperatura es 25°C.

La Figura 2 representa los perfiles de valoracion ultrasonica de acido acetico glacial para partfculas de FDKP + insulina y partfculas de FDKP solas segun las ensenanzas de la presente invencion. El perfil de velocidad ultrasonica se calculo al sustraer la contribucion de la insulina; la frecuencia es 8 MHz, la temperatura es 25°C. Tambien se representa el exceso de atenuacion ultrasonica como una funcion de la concentracion de acido acetico glacial anadido. Dos pasos de acidificacion inducida por acido acetico glacial son similares a lo observado mediante valoracion de HCI. El panel recuadrado de la izquierda (Panel A) representa la asociacion del agente activo con la micropartfcula de FDKp a un pH mayor de aproximadamente 2,9. El panel recuadrado de la derecha (Panel B) representa la interaccion reducida entre el agente activo y la micropartmula a un pH por debajo de aproximadamente 2,9.

La Figura 3 representa la adsorcion de protemas sobre micropartmulas ionizables segun las ensenanzas de la presente invencion. Se anadio protema a la suspension de micropartmulas despues del ajuste del pH, la protema no unida se separo por filtracion y las micropartmulas se disolvieron para liberar protema no unida.

La Figura 4 representa la dependencia con el pH de la adsorcion de agentes activos sobre micropartmulas de FDKP segun las ensenanzas de la presente invencion. La Figura 4A representa la adsorcion de insulina; la Figura 4B representa la adsorcion de anticuerpo monoclonal anti-SSX-241-49, La Figura 4C representa la adsorcion de hormona paratiroidea (PTH) y la Figura 4D representa la adsorcion de grelina.

La Figura 5 representa la dependencia con el pH de la adsorcion de insulina sobre micropartmulas de FDKP con concentracion limitativa de insulina segun las ensenanzas de la presente invencion.

La Figura representa el cambio en la velocidad ultrasonica en una suspension de micropartmulas de FDKP (11

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

mg/ml) durante la valoracion por etapas de micropartmulas de FDKP con protema (10 mg/ml) segun las ensenanzas de la presente invencion. La contribucion de protema libre y el efecto de la dilucion de micropartmulas de FDKP se sustrajeron. La temperatura es 25°C.

La Figura 7 representa las curvas de saturacion para la adsorcion del agente activo sobre micropartmulas de FDKP segun las ensenanzas de la presente invencion. Se muestran curvas de carga para agente activo/micropartmulas de FDKP como una funcion de la concentracion de agente activo a pH 5,0. La Figura 7A representa la adsorcion de peptido glucagonoide 1 (GLP-1); la Figura 7B representa la adsorcion de PTH; la Figura 7C representa la adsorcion de anticuerpo monoclonal anti-SSX24i-49 y la Figura 7D representa la adsorcion de anticuerpo monoclonal anti- MOPC-21.

La Figura 8 representa la adsorcion de agentes activos sobre micropartmulas a pH 5,0 que esta influenciada por concentraciones crecientes de sal segun las ensenanzas de la presente invencion. El agente activo se anadio a la suspension de micropartmulas despues del ajuste del pH, el agente no unido se separo por filtracion y las micropartmulas se disolvieron para liberar agente unido. La Figura 8A representa la adsorcion de insulina, la Figura 88 representa la adsorcion de anticuerpo monoclonal anti-SSX-241-49, la Figura 8C representa la adsorcion de PTH y la Figura 8D representa la adsorcion de grelina.

Descripcion detallada de la invencion

Agentes a aportar

La sustancia que se va a revestir sobre la micropartmula cristalina se denomina en la presente memoria el agente activo. Ejemplos de clases de agente activo incluyen composiciones farmaceuticas, compuestos sinteticos y macromoleculas organicas que tienen utilidad terapeutica, profilactica y/o diagnostica.

Generalmente, cualquier forma de agente activo se puede revestir sobre la superficie de una micropartmula cristalina. Estos materiales pueden ser macromoleculas organicas incluyendo acidos nucleicos, compuestos organicos sinteticos, polipeptidos, peptidos, protemas, polisacaridos y otros azucares, y lfpidos. Los peptidos, las protemas y los polipeptidos son todos cadenas de aminoacidos conectados por enlaces peptfdicos. Generalmente, se considera que los peptidos tienen menos de 30 residuos de aminoacido, pero pueden incluir mas. Las protemas son polfmeros que pueden contener mas de 30 residuos de aminoacido. El termino polipeptido, segun se conoce en la tecnica y segun se usa en la presente memoria, se puede referir a un peptido, una protema o cualquier otra cadena de aminoacidos de cualquier longitud que contenga multiples enlaces peptfdicos, aunque generalmente contiene al menos 10 aminoacidos. Los agentes activos usados en la formulacion de revestimiento pueden entrar dentro de una variedad de clases de actividad biologica, tales como agentes vasoactivos, agentes neuroactivos, hormonas, anticoagulantes, agentes inmunomoduladores, agentes citotoxicos, antibioticos, agentes antivirales, antfgenos y anticuerpos. Mas particularmente, los agentes activos pueden incluir, de un modo no limitativo, insulina y analogos de la misma, hormona del crecimiento, hormona paratiroidea (PTH), grelina, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrofagos (GM-CSF), peptido glucagonoide 1 (GLP-1), rojo de Texas, alquinos, ciclosporinas, clopiogrel y PPACK (D-fenilalanil-L-prolil-L-arginina-clorometil-cetona), anticuerpos y fragmentos de los mismos, incluyendo, pero no limitados a, anticuerpos humanizados o quimericos; F(ab), F(ab)2 o anticuerpo monocatenario solo o fusionado a otros polipeptidos; anticuerpos monoclonales terapeuticos o diagnosticos para antfgenos cancerosos, citocinas, agentes infecciosos, mediadores inflamatorios, hormonas y antfgenos de la superficie celular. Ejemplos no limitativos de anticuerpos para antfgenos tumorales incluyen anti-SSX-241-49 (sarcoma sinovial, X punto de ruptura 2), anti-NY-ESO-1 (antigeno asociado a tumor esofagico), anti-PRAME (antfgeno de melanoma expresado preferentemente), anti-PSMA (antfgeno membranario espedfico de la prostata), anti-Melan-A (antfgeno asociado a tumor de melanoma), antitirosinasa (antfgeno asociado a tumor de melanoma) y anti-MOPC-21 (protema de celula plasmatica de mieloma).

Sistema de aporte - Micropartmulas cristalinas

Esencialmente, el termino "micropartmula" se refiera a una partmula con un diametro de aproximadamente 0,5-1.000 pm, independientemente de la estructura exterior o interior precisa. Dentro de la amplia categona de micropartmulas, "microesferas" se refiere a micropartmulas con una conformacion esferica uniforme. Micropartmulas cristalinas, segun se usa en la presente memoria, se refiere a micropartmulas que tienen la estructura interna aunque no necesariamente la forma externa de un cristal y tienen una disposicion regular de atomos en una red espacial. Superficies cristalinas ionizables se refiere a micropartfculas cristalinas que tienen la capacidad adicional de soportar una carga electrica. Preferiblemente, la sustancia qrnmica que compone la micropartfcula cristalina es reversiblemente reactiva con el agente activo que se va a aportar, asf como atoxica y no metabolizada, al menos por roedores y seres humanos. Ademas, la estructura cristalina de las micropartfculas preferidas no se altera sustancialmente en el procedimiento de revestimiento con agente activo. La composicion de la micropartfcula cristalina determina que tipo de interacciones qrnmicas se puede manipular para estimular la adsorcion de un agente activo a la superficie de las micropartmulas.

Se puede usar un numero de sustancias para formar las micropartmulas cristalinas. Las micropartfculas como tales tienen una superficie externa, cuyas propiedades se pueden manipular en el procedimiento de revestimiento.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Materiales representativos a partir de los cuales se pueden formar micropartfculas cristalinas incluyen pero no se limitan a: aminoacidos aromaticos, sales con solubilidad limitada en un intervalo de pH definido tales como dicetopiperacinas y sulfatos de morfolina.

Las Patentes de Estados Unidos N° 5.352.461 y 5.503.852 describen un sistema de aporte de farmacos basado en la formacion de micropartfculas de dicetopiperacina (DKP) a partir de derivados de dicetopiperacina tales como 3,6- bis[N-fumaril-N-(n-butil)amino] (tambien denominada fumarildicetopiperacina o FDKP; tambien denominada (E)-3,6- bis[4-(N-carboxi-2-propenil)amidobutil]-2,5-dicetopiperacina) que son estables a pH bajo y se disuelven al pH de la sangre o el intestino delgado. Segun se divulga en las patentes anteriores, el farmaco que se va a aportar se combina o se carga con las partfculas de dicetopiperacina al formar micropartfculas de DKP en presencia de farmaco (carga util). Un sistema basado en elementos estructurales de dicetopiperacina, o uno de sus derivados de sustitucion, incluyendo, pero no limitados a, dicetomorfolinas y dicetodioxanos, forma micropartfculas con distribuciones de tamano e intervalos de pH deseables asf como buena tolerancia de carga util. Se puede generar una amplia gama de caractensticas reproducibles estables con manipulaciones apropiadas de los grupos sustituyentes. Otras dicetopiperacinas que se pueden contemplar en la presente invencion pueden incluir 3,6-di(4- aminobutil)-2,5-dicetopiperacina; 3,6-di(succinil-4-aminobutil)-2,5-dicetopiperacina (succinildicetopiperacina o SDKP); 3,6-di(maleil-4-aminobutil)-2,5-dicetopiperacina; 3,6-di(citraconil-4-aminobutil)-2-5-dicetopiperacina; 3,6- di(glutaril-4-aminobutil)-2,5-dicetopiperacina; 3,6-di(malonil-4-aminobutil)-2,5-dicetopiperacina; 3,6-di(oxalil-4- aminobutil)-2,5-dicetopiperacina y derivados de las mismas. Tambien se pueden utilizar en la presente invencion sales de dicetopiperacina y pueden incluir, por ejemplo, una sal farmaceuticamente aceptable tal como la Na, K, Li, Mg, Ca, amonio, o mono-, di- o tri-alquilamonio (segun se derive de trietilamina, butilamina, dietanolamina, trietanolamina, o piridinas, y similares). La sal puede ser una monosal, una disal o una sal mixta. Tambien se contemplan sales de orden superior para dicetopiperacinas en las que los grupos R contienen mas de un grupo acido. En otros aspectos de la invencion, una forma basica del agente se puede mezclar con la dicetopiperacina a fin de formar una sal con farmaco de la dicetopiperacina, de modo que el farmaco sea el ion conjugado de la dicetopiperacina.

Las Patentes de Estados Unidos N° 6.444.226 y 6.652.885 describen preparar y proporcionar micropartfculas de DKP en suspension acuosa a la que se anade una solucion de agente activo, y a continuacion la etapa cntica de liofilizar la suspension para dar micropartfculas que tienen un revestimiento de agente activo. La base de esta formulacion es que el revestimiento de la micropartfcula con agente activo se estimule mediante la retirada del medio lfquido por liofilizacion. (Vease ademas la Patente de Estados Unidos N° 6.440.463). En contraste con las ensenanzas de la tecnica anterior, la presente invencion proporciona medios para ajustar la asociacion del agente activo con la micropartfcula antes de la retirada del disolvente. Asf, la retirada del medio lfquido mediante metodos ffsicos en masa (p. ej., filtracion o sedimentacion) o metodos evaporativos (p. ej., liofilizacion o secado por pulverizacion) puede dar como resultado cargas comparables.

Revestimiento controlado de micropartfculas cristalinas

El revestimiento controlado se refiere al procedimiento dirigido de adsorber agente activo sobre la superficie de una micropartfcula cristalina. El procedimiento de revestimiento implica cambiar las propiedades superficiales de las micropartfculas cristalinas en una suspension fluida bien al cambiar las condiciones de la solucion (tales como pH, temperatura, polaridad, fuerza ionica y codisolventes), bien mediante complejacion a iones mono- o multivalentes, o bien mediante derivacion qrnmica. Alterar las propiedades superficiales de la micropartfcula bien antes o bien despues de la adicion de agente activo afecta a sus interacciones qrnmicas con el agente activo, dando de ese modo como resultado la adsorcion de agente activo a la micropartfcula cristalina. La interaccion qrnmica entre la micropartfcula y el agente activo impulsa la adsorcion y da como resultado una monocapa del agente activo sobre la superficie de la micropartfcula. Una vez que se adsorbe una molecula de agente activo, esa porcion de la superficie de la micropartfcula no se expone a mas interaccion y adsorcion de agente activo adicional en ese punto superficial particular. La monocapa resultante puede ser bien continua (sin huecos entre moleculas de agente activo adsorbidas sobre la superficie accesible) o bien discontinua (huecos de superficie de micropartfcula expuesta entre moleculas de agente activo adsorbidas).

Adsorcion de agente activo sobre micropartfculas

Segun se analiza anteriormente, la adsorcion del agente activo sobre la micropartfcula da como resultado una formacion de monocapa (revestimiento) del agente activo sobre la micropartfcula. Sin embargo, existe mas de un mecanismo en juego en la adsorcion de un agente activo, tal como por ejemplo insulina, a las micropartfculas cristalinas:

La monocapa de un agente activo, tal como insulina, que reviste la micropartfcula es una fase del procedimiento de carga de insulina sobre la micropartfcula pero no es necesariamente el resultado final en el procedimiento de carga ya que se pueden formar capas tanto monomeras como multfmeras basandose en la energetica del sistema.

Bajo condiciones de solubilidad permisiva, tales como baja concentracion de insulina y/o bajo pH (sustancialmente por debajo de 5,0), las fuerzas atractivas entre la insulina y la superficie de las partfculas de FDKP son mucho mayores que las fuerzas autoasociativas para la insulina. Asf, el revestimiento de insulina sobre la micropartfcula se

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

produce en modo de monocapa y se observa saturacion sin agregacion o formacion de multiples capas sobre la superficie de la micropardcula (vease el Ejemplo 6). A medida que la solubilidad alcanza la saturacion, debido a una alta concentracion de insulina y/o un pH cercano a 5,0 (un mmimo de solubilidad para insulina natural), la autoasociacion de la insulina se hace mas favorable energeticamente. Asf, el revestimiento puede ir mas alla del punto de una monocapa saturada y se pueden anadir a la partfcula capas adicionales de insulina. Se pueden reconocer dos formas de autoasociacion: multimerizacion y agregacion. La multimerizacion se caracteriza por interacciones intermoleculares espedficas y estequiometna fija. La agregacion se caracteriza por interacciones moleculares inespedficas y estequiometna indefinida. En general, los agentes activos multfmeros pueden ser adsorbidos en estado multimero, o se pueden desasociar en monomeros, o multfmeros de orden inferior, y adsorberse a la superficie en ese estado. En cualquier caso, la agregacion puede mediar en la formacion de capas del agente activo sobre la micropartfcula. Segun el conocimiento actual de los inventores, bajo las condiciones generales usadas en los ejemplos de la presente divulgacion (tal como disolucion de insulina en acido acetico), la deposicion de capas adicionales de insulina avanza como la agregacion de insulina no hexamera.

Metodo para revestir micropartfculas

El procedimiento para revestir micropartfculas cristalinas, tales como micropartfculas cristalinas preformadas, con agentes activos se describe generalmente como sigue: micropartfculas cristalinas previamente formadas mediante precipitacion, u otro metodo, se suspenden en medio lfquido, tal como agua, y el medio se ajusta para alterar la superficie de las partfculas bien antes o bien despues de la adicion del agente activo. En este punto el agente activo se adsorbera a la superficie de las micropartfculas y despues de un espacio de tiempo (por ejemplo <1, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 minutos; preferiblemente de <1 a al menos 5 minutos) se completara el proceso de carga. El medio lfquido puede retirarse mediante cualquier medio incluyendo filtracion, centrifugacion, liofilizacion o secado por pulverizacion o reemplazarse mediante intercambio de medio. La adsorcion se puede confirmar mediante cualquiera de dos enfoques experimentales: 1) demostrar la ausencia de cantidades significativas de agente activo en un filtrado o sobrenadante y/o 2) demostrar la presencia del agente activo en la fase solida mientras se muestra que el agente activo no precipita cuando se toma a traves del mismo procedimiento en ausencia de las micropartfculas.

Manipulacion de las propiedades superficiales de las micropartfculas

Segun se divulga en cualquier parte en la presente memoria, las propiedades superficiales de la micropartfcula se pueden manipular por diversos medios. Las propiedades superficiales de las micropartfculas que se pueden manipular incluyen, pero no se limitan a, propiedades electrostaticas, hidrofobas y de union por enlaces de hidrogeno. En diversas realizaciones estas manipulaciones se llevan a cabo en ausencia o presencia del agente activo, o antes o despues de que las micropartfculas y el agente activo se mezclen entre sf Cuando la manipulacion tiene lugar en presencia del agente activo, por ejemplo al alterar una condicion de la solucion, tambien puede haber efectos sobre el agente activo que modifiquen su afinidad por la superficie. Asf, en algunas realizaciones de la presente invencion, el revestimiento de la micropartfcula puede implicar la manipulacion de las propiedades superficiales y la modificacion de las propiedades del agente activo.

Las interacciones electrostaticas son atracciones entre cargas opuestas o repulsiones entre cargas iguales que se hacen mas fuertes a medida que las cargas se acercan entre sf Las interacciones electrostaticas constituyen un componente clave para entender las interacciones entres cuerpos cargados en soluciones ionicas. Por ejemplo, la estabilidad de partfculas coloidales dispersadas en un disolvente se puede explicar al considerar la competicion entre interacciones electrostaticas repulsivas y las interacciones de van der Waals atractivas. Ademas, la funcionalidad qrnmica (por ejemplo, pero no limitada a, COOH, NH, etc.) de la superficie de la micropartfcula se puede utilizar como un ion conjugado con un agente activo ionizado de modo que el material compuesto de agente activo/partfcula comprenda una sal. Las interacciones electrostaticas tambien son importantes cuando se considera la interaccion y la adherencia entre partfculas.

Alterar el pH del sistema de solucion circundante puede cambiar las propiedades electrostaticas de micropartfculas cristalinas ionizables en suspension. Segun se demuestra en el Ejemplo 3, cambiar el pH de la solucion cambia la ionizacion de una micropartfcula se modo que el agente activo se adsorbe a la superficie de la micropartfcula. Espedficamente, el Ejemplo 4 muestra que las micropartfculas compuestas por FDKP (3,6-bis[N-fumaril-N-(n- butil)amino]-2,5-dicetopiperacina) son ionizables. Las micropartfculas son insolubles en agua por debajo de pH 3,5 pero la solubilidad se incrementa rapidamente entre pH 3,5 y 5,0, presumiblemente debido a la ionizacion de los grupos carboxilo. La micropartfcula de FDKP es parciamente ionizada a pH 5 antes de la disolucion completa a pH superior, lo que se puede observar indirectamente a traves de espectroscopfa ultrasonica. El Ejemplo 5 demuestra el revestimiento controlado de protema sobre la superficie de micropartfculas de FDKP.

En una realizacion, se suspenden micropartfculas de dicetopiperacina en una solucion acida, se anade agente activo a la suspension y el pH de la solucion se eleva despues de que el agente activo y las micropartfculas se mezclen entre sf El incremento de pH altera las propiedades superficiales de las micropartfculas para crear un ambiente en el que el agente activo tiene una afinidad superior por la micropartfcula que por el disolvente.

Alternativamente, el pH de la suspension de micropartfculas se puede elevar inmediatamente antes de la adicion de agente activo a la solucion. Las propiedades de carga superficial de la micropartfcula son alteradas por el cambio en

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

el pH de modo que el agente activo tenga una afinidad superior por la micropartmula que por lo restante en solucion y sea adsorbido a la superficie de la micropartmula durante la adicion.

Los Ejemplos 6 y 7 muestran la carga de insulina sobre partmulas de FDKP mediante la manipulacion de las condiciones de pH. Finalmente, la saturacion de la micropartmula mediante adsorcion de protema y la formacion de una monocapa se describen en el Ejemplo 6.

Otros metodos para manipular las superficies de micropartfculas

Ademas de las propiedades electrostaticas, otras propiedades de una superficie de micropartfcula se pueden explotar para controlar la adsorcion de agente activo. Las micropartfculas que contienen compuestos con imidazol, piridina, bases de Schiff, cetona, bioisosteros de acido carboxflico, amidas u otros grupos funcionales que pueden existir en multiples estructuras se podnan manipular para modificar las propiedades superficiales.

Las interacciones hidrofobas son asociaciones de grupos no polares entre sf en soluciones acuosas debido a su insolubilidad en agua. Las interacciones hidrofobas pueden afectar a un numero de procesos moleculares incluyendo, pero no limitados a, estabilizacion estructural (sea de moleculas simples, complejos de dos o tres moleculas o formaciones mayores) y dinamica, y hacen importantes contribuciones a los procesos de union protema-protema y protema-ligando. Tambien se sabe que estas interacciones representan un papel en casos tempranos de plegamiento de protemas, y estan implicadas en fenomenos de formacion de complejos y autoformacion (p. ej., formacion de membranas).

Las interacciones hidrofobas se pueden manipular al cambiar la protonacion de micropartmulas cristalinas compuestas por histidina. La protonacion de la histidina reducira la nucleofilia de las micropartmulas cristalinas e impartira una carga positiva.

Las interacciones por enlaces de hidrogeno son fuerzas dipolo-dipolo especialmente fuertes entre moleculas; un atomo de hidrogeno en un enlace polar (p. ej., H-F, H-O o H-N) puede experimentar una fuerza atractiva con una molecula o ion electronegativo proximo, que tiene un par de electrones no compartido (habitualmente un atomo de F, O o N de otra molecula). Los enlaces de hidrogeno son responsables de las propiedades unicas del agua y son muy importantes en la organizacion de las moleculas biologicas, especialmente al influir en la estructura de las protemas y el ADN.

En la presente invencion, las propiedades de la union por enlaces de hidrogeno de la superficie de las micropartmulas se pueden controlar mediante derivacion qrnmica. Se pueden anadir qmmicamente donantes/aceptores de enlaces de hidrogeno para alterar la superficie de la micropartmula. Por ejemplo, el hidrogeno en un enlace N-H puede someterse a union por enlace de hidrogeno al oxfgeno en un enlace C=O. Si el N-H se reemplaza por un N-CH3, entonces esta interaccion por enlace de hidrogeno particular se retira. Asimismo, la sustitucion del grupo C=O por un grupo C=C tambien retira esta interaccion particular.

Las micropartmulas con superficies que contienen grupos aromaticos ionizables son polares cuando estan ionizadas pero hidrofobas en su estado no ionizado. Partir de superficies protonadas y manipular las condiciones de la solucion para reducir la ionizacion superficial de las partmulas hace que los agentes activos hidrofobos o aromaticos revistan la superficie de las micropartmulas.

Las micropartmulas con grupos superficiales cetonicos se podnan manipular al cambiar la polaridad de la solucion. Al reducir la polaridad del disolvente (anadiendo disolventes organicos de baja polaridad a una solucion acuosa) la forma enolica se convierte en la especie predominante en la superficie de la partmula. Esta forma enolica es un donantes de enlaces de hidrogeno mientras que la forma cetonica es un aceptor de enlaces de hidrogeno. La adsorcion de farmacos que contienen nitrogeno sobre la superficie de la micropartmula se promueve de este modo.

Tambien se puede inducir a las micropartmulas con grupos superficiales que sufren isomerizacion inducida por pH o temperatura a adsorber moleculas de farmaco al manipular las condiciones de la solucion. En el caso de estas superficies, la introduccion de un pliegue en un grupo superficial lineal debido a la isomerizacion incrementa la movilidad (fluidez) de los grupos en la superficie de las micropartmulas. Esto permite que la superficie forme mas contactos con el agente activo de los que son posibles con una superficie ordenada. Si las interacciones adicionales con el agente activo son cada una favorables, entonces la energfa de interaccion neta se hace favorable y el farmaco se adsorbe a la superficie de la micropartmula.

Tecnicas de retirada del medio fluido

La retirada del disolvente despues de un revestimiento controlado de las superficies cristalinas con agente activo se puede conseguir mediante metodos que incluyen, pero no se limitan a, sedimentacion, filtracion o secado. Tecnicas de secado incluyen, pero no se limitan a, liofilizacion y secado por pulverizacion. Estas tecnicas son conocidas por los expertos en la especialidad. En una realizacion de la presente invencion, el disolvente se retira mediante secado por pulverizacion. Metodos para secar por pulverizacion micropartfculas de dicetopiperacina se divulgan, por ejemplo, en la Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. N° 60/776.605 presentada el 22 de febrero de 2006.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Analisis de modificaciones de las propiedades superficiales

La presente invencion emplea la tecnica de espectroscop^a ultrasonica para analizar los cambios en las propiedades superficiales de micropartmulas cristalinas en una suspension fluida, que promueven o potencian la adsorcion de un agente activo a la micropartmula cristalina. Segun se divulga en cualquier parte en la presente memoria, estos cambios implica cambiar las condiciones de la solucion (tales como pH, temperatura, polaridad, fuerza ionica y codisolventes), mediante complejacion hasta iones mono- o multivalentes, o mediante derivacion qmmica para alterar las propiedades superficiales de la micropartfcula bien antes o bien despues de la adicion del agente activo. La espectroscopfa ultrasonica es una herramienta analftica conocida por los expertos. En resumen, la espectroscopfa ultrasonica emplea ondas sonoras. En particular, usa una onda acustica de alta frecuencia que sondea fuerzas intermoleculares en muestras/materiales. La compresion (y descompresion) oscilatoria en la onda ultrasonica provoca la oscilacion de las disposiciones moleculares de la muestra, lo que responde a atraccion o repulsion intermolecular.

Viajando a traves de las muestras, la onda ultrasonica pierde su energfa (una disminucion en la amplitud) y cambia su velocidad. Esta disminucion en la amplitud y cambio de velocidad se analizan como caractensticas de la muestra. Por lo tanto, la propagacion de ondas ultrasonicas se determina mediante velocidad y atenuacion ultrasonicas.

La velocidad ultrasonica se determina por la elasticidad y la densidad del medio. Los solidos tienen las interacciones mas fuertes entre las moleculas seguidos por los lfquidos y los gases y por lo tanto son mas ngidos en comparacion con los lfquidos y los gases. La atenuacion ultrasonica es una medida de la energfa que las ondas ultrasonicas pierden a medida que viajan a traves de una muestra. Caracteriza la transparencia ultrasonica de las muestras y se puede observar como una reduccion de la amplitud de la onda.

La medida multifrecuencial de la atenuacion ultrasonica en sistemas homogeneos permite el analisis de reacciones qmmicas rapidas tales como, pero no limitadas a, intercambio protonico, transiciones estructurales (p. ej., isomerizacion), autoasociacion (p. ej., dimerizacion), agregacion, union de ligandos a macromoleculas, etc.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar realizaciones de la presente invencion. Se debe apreciar por los expertos en la especialidad que las tecnicas divulgadas en los ejemplos que siguen representan tecnicas descubiertas por el inventor para funcionar bien en la practica de la presente invencion, y asf se puede considerar que constituyen modos preferidos para su practica. Sin embargo, los expertos en la tecnica, a la luz de la presente invencion, deben apreciar que se pueden realizar muchos cambios en las realizaciones espedficas que se divulgan y obtener aun asf un resultado igual o similar sin apartarse del espmtu y el alcance de la invencion.

Ejemplo 1

Procedimiento general para cargar micropartmulas con agentes activos

La Tabla 1 posterior es un ejemplo de un revestimiento estimulado electrostaticamente de una micropartmula cristalina ionizable (micropartmulas de FDKP) utilizando adsorcion controlada por pH. En estos experimentos, se prepararon suspensiones de micropartmulas de FDKP a pH 2,0 y 4,5. A continuacion, se anadio protema (hormona del crecimiento) a cada una para dar condiciones finales de 5 mg/ml de partmulas de FDKP y 200 pg/ml de protema. Despues de la mezcladura, el lfquido en masa se retiro de la suspension mediante filtracion. A continuacion, el material atrapado sobre el filtro se disolvio y se recogio. La concentracion de protema en todas las fracciones se cuantifico mediante HPLC.

A pH bajo (2,0), la protema no se adsorbfa a las partmulas y toda la protema se encontraba en el primer filtrado. al incrementar el pH hasta 4,5, las propiedades superficiales de las partmulas se cambiaron para tener una alta afinidad por la protema. Bajo estas condiciones, la protema se urna a las micropartfculas y no se observaba en el filtrado. Para determinar la cantidad de protema asociada con las micropartfculas, la protema se recuperaba cuando las micropartmulas se disolvfan. Los controles libres de partfculas demuestran que la protema, por sf misma, no se retema sobre el filtro bajo las condiciones usadas, es decir la protema no se autoasociaba o agregaba de otro modo en partfculas mayores que los poros del filtro.

Tabla 1. Concentracion de protema en un experimento de adsorcion con micropartfculas de FDKP.

Fraccion

pH 2,0 con partfculas pH 2,0 sin partfculas pH 4,5 con partfculas pH 4,5 sin partfculas

Conc. inicial (pg/ml)

200 200 200 200

Filtrado (protema no unida)

146 181 0 145

Partfculas disueltas

0 0 180 0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Los valores mostrados son resultados de la cuantificacion por HPLC de las soluciones despues de la filtracion Ejemplo 2

Control de la ionizacion de micropartmulas de FDKP al manipular el pH

La FDKP es una molecula en forma de barra con un grupo funcional acido carboxflico en cada extremo que es esencialmente insoluble en agua por debajo de pH 3,5 cuando los acido carboxflicos estan protonados y no soportan carga. La solubilidad de FDKP se incrementa rapidamente por encima de pH 3,5 correspondiendo a la ionizacion de los grupos carboxilo. El modelado de los cristales de FDKP, que estan formados como placas con dos caras planas grandes y bordes estrechos, indica que las moleculas de FDKP de tipo barra se alinean perpendiculares a los bordes de las placas de modo que los extremos de acido carboxflico de las moleculas esten dispuestos sobre las caras grandes de las placas. Teoricamente, las superficies de los cristales de FDKP se deben ionizar parcialmente alrededor de pH 5,0, donde la solubilidad es aproximadamente 1 mg/ml, justo por debajo del pH al que se disolvera una suspension de 10 mg/ml de micropartmulas.

La ionizacion de las superficies de los cristales de FDKP se ha observado indirectamente con espectroscopfa ultrasonica. En la Figura 1, se muestra la curva de valoracion ultrasonica de micropartmulas de FDKP y tampon. En este experimento, una solucion que contema 200 mM de HCI se anadio en pequenas partes almuotas a una suspension de 10 mg/ml agitada de micropartmulas de FDKP en tampon de acetato amonico 20 mM. El pH inicial era 4,8. Despues de cada adicion de HCl, se permitio que el sistema se equilibrara y se recogieron los datos ultrasonicos.

La disminucion en la velocidad ultrasonica observada con concentracion de acido creciente (pH decreciente) refleja la protonacion de grupos acido carboxflico en el sistema. A medida que los grupos se protonaban y se descargaban, la estructura del agua alrededor de ellos se relajaba y las ondas ultrasonicas se transmitfan mas lentamente (la velocidad ultrasonica disminuye). Debido a las micropartmulas de FDKP, las superficies del carboxilato y el grupo carboxilato en el tampon de acetato son muy similares qmmicamente, las curvas tambien eran similares. Sin embargo, las diferencias estaban provocadas por las micropartmulas de FDKP. En primer lugar, la magnitud del cambio de velocidad con micropartmulas de FDKP era mayor. Esta diferencia resulta de la protonacion de grupos carboxilato ionizados sobre la superficie de las micropartmulas de FDKP. El pico en la curva de atenuacion, que se encuentra cerca del punto de protonacion completa, se desplazo hasta una concentracion de acido ligeramente superior en la suspension de FDKP. Finalmente, ambos parametros de FDKP continuaban cambiando a medida que el pH se reduda de 3,5 a 2,3. Estos cambios reflejan modificaciones adicionales en las propiedades superficiales de las partmulas que pueden incluir la ordenacion de los grupos carboxilo superficiales u otras modificaciones microestructurales.

Ejemplo 3

Carga de protema sobre micropartmulas de FDKP mediante manipulacion por pH de las propiedades superficiales

La adsorcion de protemas sobre superficies de micropartmulas ionizables mediante manipulacion por pH se puede conseguir de dos modos. La protema se puede anadir y a continuacion el pH se puede ajustar para provocar la ionizacion de la superficie con absorcion concomitante de protema. Este proceso es reversible. Alternativamente, el pH de la suspension de partmulas se puede ajustar para provocar la ionizacion de la superficie antes de que se anada la protema.

Los datos de valoracion ultrasonica mostrados en la Figura 2 indican la asociacion de protema (insulina) con las micropartmulas de FDKP a pH mayor de aproximadamente 2,9 y una reduccion de la interaccion a un pH por debajo de aproximadamente 2,9.

Se preparo una suspension de micropartmulas de FDKP en tampon de acetato amonico 20 mM, pH 4,8, y se combino con una solucion madre de insulina para dar 800 pl de suspension con una concentracion final de 10 mg/ml de micropartmulas de FDKP y una concentracion de insulina de 1 mg/ml. Esta suspension se introdujo en un espectrometro ultrasonico. Mientras se agitaba suavemente, se anadio gradualmente acido acetico glacial en partes almuotas de 5 p para disminuir el pH. En cada etapa en la valoracion, se recogieron los datos ultrasonicos.

El cambio en la velocidad ultrasonica estaba relacionado (era proporcional) a la cantidad de superficie espedfica (agua de hidratacion) de las partmulas y/o las macromoleculas en la muestra. La Figura 2 ilustra que por encima de un pH de aproximadamente 2,9 (10% v/v de acido acetico anadido), las curvas de velocidad para micropartmulas solas (partmulas de FDKP) y micropartmulas con insulina (partmulas de FDKP + insulina) coincidfan. Esto indicaba que la cantidad de superficie espedfica en el sistema es esencialmente la misma que la superficie espedfica de micropartmulas de FDKP solas. La insulina tema una contribucion insignificante debido a que es muy pequena en comparacion con las micropartmulas. Por debajo de pH 2,9, las curvas de las partmulas de FDKP y las partfculas de FDKP + insulina divergfan. La velocidad ultrasonica de la curva de las partfculas de FDKP + insulina era superior aqrn, lo que indicaba que no habfa mas superficie espedfica expuesta a agua que en la muestra de partmulas de FDKP solas. Esta superficie espedfica adicional procedfa de insulina libre en la suspension. A medida que el pH se incrementaba desde aproximadamente 2,7 hasta aproximadamente 2,9, la superficie espedfica de la insulina se

pe^a por la adsorcion de insulina a las superficies de micropartmulas de FDKP, y la intensidad superior de la curva de micropartmulas de FDKP + insulina desapareda a medida que la insulina libre desapareda del sistema.

Segun se apunta anteriormente, el segundo metodo estimulado por pH para revestir partmulas con protema es suspender las partmulas en un medio fluido y ajustar las condiciones de la solucion para ionizar la superficie de las 5 partmulas. A continuacion, la protema se puede anadir a la suspension y las moleculas de protema se adsorberan

inmediatamente. La Figura 3 ilustra la cantidad de protema (insulina) que era adsorbida durante la adicion a suspensiones de pH ajustado de micropartmulas de FDKP.

Se prepararon suspensiones de micropartmulas de FDKP en 5 mg/ml y se anadio un exceso de protema (2 mg/ml). (Un exceso de protema, segun se menciona en la presente memoria, es la cantidad por encima de la cual se cree 10 que es necesario formar una monocapa que cubra la superficie accesible de la micropartmula de FDKP). Despues de la incubacion, la protema no adsorbida se retiro mediante filtracion. Los solidos retenidos sobre el filtro (retenido) se disolvieron y las cantidades de micropartmulas de FDKP y protema retenidas sobre el filtro se cuantificaron mediante HPLC. La relacion en masa de protema/partmulas se determino a partir de esta cuantificacion. Basandose en la superficie espedfica conocida de estas partmulas y las dimensiones moleculares de la protema, se estimo que 15 se produda una monocapa continua de protema adsorbida a una en masa de aproximadamente 0,07. Basandose en

esa estimacion, se puede observar a partir de este ejemplo que se formaba una monocapa continua a pH 5,0 y que se formaban monocapas no continuas a de pH 3,5 a pH 4,5.

Adicionalmente, diferentes lotes de micropartmulas de FDKP revestidas con agente activo deshidratado se suspendieron bien en solucion acida (pH final aproximadamente 2,0) o bien en agua (pH final aproximadamente 4,5). 20 Los diferentes agentes activos incldan insulina, hormona del crecimiento e insulina aspart (un tipo de insulina de accion rapida), segun se muestra en la Tabla 2. El disolvente se filtro de estas suspensiones y las partmulas retenidas se disolvieron y se recogieron. La cantidad de agente activo en todas estas muestras se cuantifico mediante HPLC. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

Para cada uno de los lotes, el agente activo se libero de las partmulas en la solucion acida. Por lo tanto, al protonar 25 las superficies de los microcristales, el agente activo se desorbe de las superficies de los cristales. Cuando las partmulas se resuspendfan en agua, lo que no cambia el estado de ionizacion de la superficie de las partmulas, la protema segrna adsorbida.

Tabla 2. Agentes activos revestidos sobre micropartmulas de FDKP

Hormona del Insulina Insulina

crecimiento aspart

Solucion estandar de agente activo

250 1103 1099

Resuspendidas en solucion acida

240 980 893

Redisueltas despues de separar por filtracion la solucion acida

0 49 29

Resuspendidas en agua

0 4 0

Redisueltas despues de separar por filtracion el agua

191 936 982

Los valores de la tabla son areas de pico integradas a partir de la cuantificacion por HPLC (mAU*s a 215 nm).

30

Ejemplo 4

Caracterizacion de la adsorcion estimulada por pH de insulina sobre micropartmulas de FDKP

La insulina se adsorbio (cargo) sobre micropartmulas de FDKP en un procedimiento controlado por pH al mezclar una suspension acuosa de micropartmulas de FDKP con una solucion acuosa de insulina. Para caracterizar el efecto 35 del pH sobre la union de insulina a micropartmulas de FDKP, se preparo una suspension de 5 mg/ml de partmulas de FDKP a valores de pH variables. A continuacion, se anadio un exceso de insulina disuelta, se dejo que se adsorbiera durante aproximadamente 5 minutos, despues de lo cual la insulina no unida se retiro mediante filtracion. Las partmulas solidas con insulina adsorbida se recuperaron del filtro (retenido), se disolvieron y se recogieron. Las cantidades de insulina y las micropartmulas de FDKp disueltas se cuantificaron mediante HPLC. La cantidad de 40 insulina adsorbida se calculo como una fraccion de la masa total de retenido. La dependencia con el pH de la adsorcion de insulina se muestra en la Figura 4A; la adsorcion de insulina se incrementaba como una funcion del pH. Se obtuvieron resultados similares para el anticuerpo monoclonal SSX-241-49, PTH y grelina segun se ilustra en las Figuras 4B, C y D, respectivamente.

Adicionalmente, partmulas de FDKP se suspendieron en solucion de insulina (10 mg/ml) de diferentes pH. La

5

10

15

20

25

relacion en masa de partfculas de FDKP a insulina era 10:1. La concentracion de insulina no unida en el sobrenadante se determino mediante HPLC despues de que el sobrenadante se hubiera separado de las partfculas mediante centrifugacion. La union a insulina se determino como la diferencia con respecto a la concentracion inicial de insulina. Los datos presentados en la Figura 5 demuestran que el incremento del pH daban como resultado una reduccion de insulina en solucion y un incremento del contenido de insulina sobre las partfculas de FDKP.

Asf, la union de insulina a partfculas de FDKP se incrementa con el pH creciente desde aproximadamente pH 3,0 hasta aproximadamente pH 5. Preferiblemente, la solucion de insulina se anade a pH 3,6 y bajo estas condiciones aproximadamente 75% de la insulina es adsorbida de la solucion sobre las partfculas. La union a insulina se incrementa hasta > 95% a medida que el pH se incrementa hasta > 4.0. La union sustancialmente completa se alcanza a aproximadamente pH > 4,2, preferiblemente aproximadamente 4,4. A un pH superior a 5,0, las micropartfculas de FDKP se empiezan a disolver y ya no retienen la estructura de una micropartfcula cristalina.

Ejemplo 5

Descripcion de la carga de micropartfculas de FDKP con insulina

En un formato de escala de produccion (2-5 kg), se forman micropartfculas de FDKP mediante precipitacion en acido con acido acetico y se lavan. Una solucion de insulina a pH 3,6 se anade a la suspension de partfculas de FDKP. La solucion madre de insulina es 10% en peso de insulina y 2,5% de acido acetico (pH de aproximadamente 3,6). Se usa hidroxido amonico para ajustar el pH de la mezcla hasta 4,5. La Tabla 3 indica las cantidades de los diversos componentes por kilogramo de formulacion usado para preparar partfculas que contienen ~11,4% en peso de insulina. Se puede incorporar polisorbato 80 durante la formacion de las partfculas y puede mejorar las caractensticas de manejo de las partfculas finales. Se deja tiempo para la adsorcion de insulina sobre las partfculas de FDKP y para asegurar la mezcladura a fondo. A continuacion, la mezcla se anade gota a gota a nitrogeno lfquido para congelar instantaneamente la suspension. El medio fluido se retira mediante liofilizacion para producir un producto farmacologico a granel de partfculas de FDKP/insulina. Alternativamente, la mezcla se seca por pulverizacion. La Tabla 4 indica las cantidades de los diversos componentes en el producto a granel despues de la retirada del medio fluido.

Tabla 3. Composicion de la formula de la partida de partfculas de FDKP/insulina

Componente

11,4% de FDKP/insulina (Gramos por kg de formulacion)

Insulina, USP

114 g

FDKP

870 g

Polisorbato 80, USP*

34.8 g

Solucion fuerte de amomaco, NF

572 g

Acido acetico (glacial), NF

3.680 g

Agua purificada, NF

179.000 g

Nitrogeno, NF

segun sea necesario

Tabla 4. Composicion de las partfculas de FDKP/insulina

Componente

11,4% de FDKP/insulina, procedimiento (Cantidad por gramo de formulacion)

Insulina, USP

3,0 UI (0,11 mg)

FDKP

0,87 mg

Polisorbato 80, USP*

0,007 mg

Solucion fuerte de amomaco, NF

Retirado durante el procedimiento

Acido acetico (glacial), NF

Retirado durante el procedimiento

Agua purificada, NF

0,012 mg

Nitrogeno, NF

Retirado durante el procedimiento

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

En las Tablas 3 y 4 anteriores, NF indica - National Formulary * El contenido de polisorbato 80 se estima mediante un ensayo de HPLC/MS.

** La formulacion de FDKP/insulina contiene aproximadamente 1,2% de agua residual despues de la liofilizacion. Tambien pueden estar presentes cantidades vestigiales de acido acetico e hidroxido amonico.

Ejemplo 6

Saturacion de las superficies de micropartmulas mediante protema (formacion de una monocapa continua)

El revestimiento superficial de una micropartmula con una monocapa debe ser un procedimiento saturable. Esto es, su superficies espedfica accesible y el diametro de la molecula de agente activo dictaran la capacidad de la superficie de las micropartmulas. La Figura 6 ilustra esta saturacion.

Se preparo una suspension de micropartmulas de FDKP y el pH se ajusto entre pH 3,0 y pH 3,5 en cuyo punto las superficies se ionizan parcialmente. En este procedimiento, no se podfa usar un pH superior debido a que provocana la autoasociacion del agente activo, insulina. Porciones pequenas de una solucion concentrada de insulina se anadieron a la suspension agitada. Despues de cada adicion, se dejo que la muestra se estabilizara y se recogieron datos ultrasonicos.

La Figura 6 muestra que se observa una reduccion en la velocidad ultrasonica a medida que se incrementaba la concentracion de protema. Este tipo de cambio en la velocidad ultrasonica es tfpico para la union del ligando en soluciones acuosas e indica la adsorcion de la protema activa a las superficies de las micropartmulas de FDKP. La disminucion de velocidad resulta de la liberacion del agua de hidratacion de las superficies de las micropartmulas de FDKP y la protema. Cuando el agua de hidratacion se desplaza mediante la adsorcion del agente activo, su estructura se relaja y produce una disminucion neta en la velocidad ultrasonica a traves de la muestra. Cuando se han saturado todos los sitios de union sobre la superficie de las micropartmulas de FDKP, es decir, se ha formado una monocapa protemica, la curva se nivela. La formacion de la monocapa tambien se demostro por los datos de las Figuras 7A-7d que mostraban que la adsorcion de diversos agentes activos (GLP-1 [Figura 7A]; PTH [Figura 78]; anticuerpo monoclonal anti-SSX-241-49 [Figura 7C]; y anticuerpo monoclonal anti-MOPC-21 [Figura 7D]), sobre las micropartmulas alcanzaba la saturacion a medida que la concentracion del agente activo se incrementa a una concentracion constante de micropartmulas de FDKP (5 mg/ml). Estos estudios se efectuaron a pH 5,0 donde se observa la adsorcion optima del agente activo a micropartmulas. El GLP-1 no se autoasocia a las concentraciones usadas (segun se divulga en la Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. N° 60/744.882) .

Ejemplo 7

Evidencia del mecanismo de interaccion electrostatica

La evidencia de un mecanismo de interaccion electrostatico es la capacidad para interferir con la adsorcion al debilitar interacciones electrostaticas. Esto se demuestra al anadir sal al sistema de partmula ionizada/agente activo. Las Figuras 8A-8D ilustran que incrementar la fuerza ionica en un sistema de agente activo-micropartmulas de FDKP reduda la adsorcion del agente activo sobre la micropartmula.

Se preparo una serie de muestras a pH 5,0 donde la adsorcion del agente activo sobre las superficies de las micropartmulas de FDKP es fuerte. Cada muestra contema una cantidad diferente de sal (cloruro sodico), segun se indica bajo cada barra en las Figuras 8A-8D (las unidades son mM). El agente activo se mezclo en la suspension para dar una concentracion final de 5 mg/ml de micropartmulas de FDKP y 0,75 mg/ml de insulina (un exceso; Figura 8A). Despues de una breve incubacion, el agente activo no unido se retiro mediante filtracion y las partmulas con agente activo adsorbido se redisolvieron. La cantidad de agente activo y partmula recubierta se cuantifico mediante HPLC, y se expreso como una relacion en masa (% de carga). Las Figuras 8A-8D ilustran que incrementar la fuerza ionica en un sistema de agente activo-micropartmulas de FDKP reduda el grado de adsorcion de agentes activos incluyendo anticuerpo monoclonal anti-SSX-241-49 (0,2 mg/ml; Figura 8B), grelina (0,1 mg/ml; Figura 8C) y PTH (0,25 mg/ml; Figura 8D) en presencia de 5 mg/ml de micropartmulas de FDKP.

La Figura 8 muestra una correlacion inversa entre la adsorcion medida y la concentracion de sal en la suspension de carga. Esto se puede interpretar como una evidencia de que la sal competfa con el agente activo por la interaccion con la superficie de las partmulas. A medida que se incrementaba la concentracion de sal, competfa fuertemente y eficazmente por los sitios de union superficiales, y esencialmente desplazaba al agente activo de las superficies de las partmulas. Tambien se especulaba que la disminucion de la union del agente activo a la micropartmula se puede atribuir al blindaje de Debye.

A menos que se indique otra cosa, se debe entender que todos los numeros que expresen cantidades de ingredientes, propiedades tales como el peso molecular, condiciones de reaccion, etc. usados en la memoria descriptiva y las reivindicaciones estan modificados en todos los casos por el termino "aproximadamente". Segun esto, a menos que se indique lo contrario, los parametros numericos indicados en la siguiente memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que

5

10

15

20

25

30

35

se busca obtener por la presente invencion. Como mmimo, y no como un intento de limitar la aplicacion de la doctrina de equivalentes al alcance de las reivindicaciones, cada parametro numerico se debe considerar al menos a la luz del numero de d^gitos significativos presentados y al aplicar tecnicas de redondeo normales. Sin perjuicio de que los intervalos y parametros numericos que indican el amplio alcance de la invencion sean aproximaciones, los valores numericos indicados en los ejemplos espedficos se presentan tan precisamente como sea posible. Sin embargo, cualquier valor numerico contiene inherentemente ciertos errores que resultan necesariamente de la desviacion estandar encontrada en sus medidas de prueba respectivas.

Se debe considerar que los terminos "un” y "uno/a" y "el/la" y referencias similares usadas en el contexto de la descripcion de la invencion (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) cubren tanto el singular como el plural, a menos que se indique otra cosa en la presente memoria o sea contradicho claramente por el contexto. La cita de intervalos de valores en la presente memoria simplemente pretende servir como un metodo abreviado para hacer referencia individualmente a cada valor separado que este dentro del intervalo. A menos que se indique otra cosa en la presente memoria, cada valor individual se incorpora en la memoria descriptiva como si se citara individualmente en la presente. Todos los metodos descritos en la presente se pueden realizar en cualquier orden adecuado a menos que se indique otra cosa en la presente memoria o sea claramente contradicho por el contexto. El uso de todos y cada uno de los ejemplos, o el leguaje ejemplar (p. ej. "tal como") proporcionado en la presente memoria esta destinado simplemente a ilustrar mejor la invencion y no plantea una limitacion sobre el alcance de la invencion reivindicado de otro modo. No se debe considerar que ninguna redaccion de la memoria descriptiva indique ningun elemento no reivindicado esencial para la practica de la invencion.

El uso del termino "o" en las reivindicaciones se usa para significar "y/o" a menos que se indique explfcitamente que se refiere solamente a alternativas o las alternativas sean mutuamente exclusivas, aunque la divulgacion apoya una definicion que se refiere solamente a alternativas e "y/o."

Los agrupamientos de elementos o realizaciones alternativos de la invencion divulgada en la presente no se deben considerar limitaciones. Cada miembro del grupo se puede mencionar y reivindicar individualmente o en cualquier combinacion con otros miembros del grupo u otros elementos encontrados en la presente. Se anticipa que uno o mas miembros de un grupo se pueden incluir en, o eliminarse de, un grupo por razones de comodidad y/o patentabilidad. Cuando se produzca cualquiera de estas inclusiones o eliminaciones, se considera que la memoria descriptiva contiene el grupo segun esta modificado cumpliendo asf la descripcion escrita de todos los grupos de Markush usados en las reivindicaciones adjuntas.

Ademas, se debe entender que las realizaciones de la invencion divulgadas en la presente memoria son ilustrativas de los principios de la presente invencion. Otras modificaciones que se puedan emplear estan dentro del alcance de la invencion. Asf, a modo de ejemplo, pero no de limitacion, se pueden utilizar configuraciones alternativas de la presente invencion segun las ensenanzas de la presente. Segun esto, la presente invencion no se limita a lo que se muestra y describe precisamente.

Claims (11)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   REIVINDICACIONES

   1. Una micropartfcula cristalina que comprende una dicetopiperacina y polisorbato 80, incluyendo la micropartfcula un agente activo adsorbido, y en donde la dicetopiperacina es 3,6-di(fumaril-4-aminobutil)-2,5-dicetopiperacina, en donde el agente activo comprende una insulina.
2. 2. La micropartfcula segun la reivindicacion 1, en la que el agente activo se adsorbe a una superficie cristalina de la micropartfcula de dicetopiperacina.
3. 3. La micropartfcula segun la reivindicacion 1 o 2, en la que el agente activo forma una monocapa sobre la superficie cristalina.
4. 4. La micropartfcula segun la reivindicacion 3, en la que la monocapa es continua.
5. 5. La micropartfcula segun la reivindicacion 3, en la que la adsorcion del agente activo esta mediada por una interaccion electrostatica, una interaccion hidrofoba o union por enlaces de hidrogeno.
6. 6. La micropartfcula segun la reivindicacion 1, que comprende polisorbato 80 y dicetopiperacina en una relacion en peso de aproximadamente 0,008 a 1; y que comprende ademas el agente activo revestido sobre la superficie de la micropartfcula.
7. 7. Un metodo para mejorar las caractensticas de manejo de una micropartfcula de dicetopiperacina que comprende formar una micropartfcula de dicetopiperacina en presencia de polisorbato 80, preparando de ese modo una micropartfcula que comprende dicetopiperacina y polisorbato 80, donde la dicetopiperacina es 3,6-di(fumaril-4- aminobutil)-2,5-dicetopiperacina.
8. 8. El metodo segun la reivindicacion 7, en donde el metodo comprende obtener una solucion de la dicetopiperacina, polisorbato 80 y acido acetico, en donde la dicetopiperacina tiene solubilidad limitada y precipita a pH bajo.
9. 9. Un metodo para revestir una micropartfcula cristalina con un agente activo en una suspension, comprendiendo dicho metodo las etapas en la secuencia indicada de:

   i) realizar el metodo segun la reivindicacion 8 para preparar una micropartfcula cristalina que comprende 3,6- di(fumaril-4-aminobutil)-2,5-dicetopiperacina y polisorbato 80;

   ii) proporcionar una suspension que comprende la micropartfcula, un agente activo y un disolvente;

   iii) a continuacion alterar las condiciones de la suspension en dicha suspension proporcionada para modificar una interaccion energetica entre dicho agente activo y dicha micropartfcula cristalina preformada, en donde dicha alteracion de las condiciones de la suspension se seleccion del grupo que consiste en alterar el pH del disolvente, anadir iones monovalentes o multivalentes, alterar la polaridad y anadir donantes o aceptores de enlaces de hidrogeno para modificar una propiedad superficial de dicha micropartfcula cristalina preformada, en donde dicha etapa de alteracion no incluye una etapa de retirada de dicho disolvente de dicha suspension; y

   iv) adsorber dicho agente activo sobre una superficie de dicha micropartfcula cristalina para proporcionar un revestimiento de dicho agente activo sobre dicha micropartfcula cristalina sin retirar el disolvente de dicha suspension; en donde dicha etapa de alteracion provoca la adsorcion de dicho agente activo sobre una superficie de dicha micropartfcula cristalina; en donde el agente activo comprende una insulina.
10. 10. La micropartfcula segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el polisorbato 80 mejora las caractensticas de manejo de la micropartfcula.
11. 11. La micropartfcula segun la reivindicacion 1, que comprende polisorbato 80 y 3,6-di(fumaril-4-aminobutil)-2,5- dicetopiperacina en una relacion en peso de aproximadamente 0,008 a 1.