BRPI0616071A2 - método de formulação de fármaco com base no aumento da afinidade de superfìcies de micropartìculas cristalinas para agentes ativos - Google Patents

Abstract

MéTODO DE FORMULAçãO DE FáRMACO COM BASE NO AUMENTO DA AFINIDADE DE SUPERFìCIES DE MICROPARTìCULAS CRISTALINAS PARA AGENTES ATIVOS Métodos são fornecidos para revestir micropartículas cristalinas com um agente ativo através da alteração das propriedades de superfície das micropartículas a fim de facilitar a associação favorável na microparticula pelo agente ativo. Tipo de propriedades de superfície que são alteradas pelos métodos descritos inclui propriedades eletrostáticas, propriedades hidrofóbicas e propriedades de ligação de hidrogênio.

Description

"MÉTODO DE FORMULAÇÃO DE FÁRMACO COM BASE NOAUMENTO DA AFINIDADE DE SUPERFÍCIES DE MICROPARTÍCULASCRISTALINAS PARA AGENTES ATIVOS"

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

O presente pedido reivindica o beneficio sob 35U.S.C. §119 (e) ao Pedido Provisória dos Estados Unidos No.Serial 60/717.524 depositado no dia 14 de setembro de 2005,e Pedido Provisório dos Estados Unidos No. Serial60/744.882, depositado no dia 14 de abril de 2006, os conte-údos completos dos quais estão aqui incorporados através dereferência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção geralmente está na área de formula-ções de fármaco e é particularmente referida aos métodos derevestimento de agentes ativos sobre a superfície de micro-partículas cristalinas.

ANTECEDENTE DA INVENÇÃO

A liberação de agentes terapêuticos foi um proble-ma principal. Administração oral é uma das rotinas mais co-muns e preferidas de liberação devido a facilidade de admi-nistração, concordância do paciente, e custo diminuído. Po-rém, as desvantagens desta rota incluem potência baixa ouvariável e adsorção ineficiente do terapêutico. Isto é par-ticularmente evidente quando o composto a ser liberado éinstável sob condições encontradas no trato gastrointesti-nal. Uma variedade de revestimentos e métodos de encapsula-ção foi desenvolvida na arte, mas apenas alguns são eficazesna focalização deste assunto. Entretanto, há compostos te-rapêuticos que tendem a ser menos ativos nas condições dotrato gastrointestinal e devem ser administrados em dosagensmais altas a ser adsorvidas na circulação sangüínea em umaquantidade eficaz.

Uma ampla faixa de sistemas de formulação de fár-maco foi desenvolvida para focalizar o problema de liberaçãode fármaco ideal e é baseada na incorporação de fármaco emuma matriz que age como um portador. Fatores considerados naformulação de fármaco incluem exigências que o sistema é nãotóxico, não reativo com o fármaco a ser liberado, econômicopara fabricação, formado de componentes facilmente disponí-veis, e consistente com respeito à composição final e carac-terísticas físicas, incluindo estabilidade e taxa de libera-ção. É, da mesma forma, preferível que o sistema de libera-ção de fármaco seja formado facilmente de materiais facil-mente removidos do corpo através de processos fisiológicosnormais.

Formulações de fármaco de micropartícuias podemser empregadas em numerosas rotinas de administração, massão particularmente bem adaptadas à liberação pulmonar. Van-tagens dos pulmões para liberação de agentes que têm efeitossistêmicos incluem a quantidade grande da área de superfíciee facilidade de captação pela superfície mucosal. Patentedos Estados Unidos No. 6.071.497, aqui incorporada por refe-rência, descreve um sistema de liberação de fármaco pulmonarcom base na formação de micropartículas de dicetopiperazinacomo também micropartículas com base em polímero.

SUMÁRIO DA INVENÇÃOMétodos são fornecidos para formar um revestimentode agente ativo sobre as microparticulas cristalinas. Em ge-ral, microparticulas são revestidas com um agente ativo a-través da modificação das propriedades de superfície das mi-cropartículas tal que o agente ativo tem uma afinidade maisalta para a superfície de micropartícuia do que por permane-cer na solução.

A presente invenção fornece métodos melhorados pa-ra revestir partículas cristalinas tais como microparticulasde dicetopiperazina de fumaíila (FDKP) com agentes ativos,tais como proteínas, empregando-se associações direcionadasà ligação de hidrogênio, hidrofobicamente ou eletrostatica-mente. Na presente invenção, o líquido pode opcionalmenteser removido (para recuperação de microparticulas revestidaspor agente ativo) através de filtração ou secagem, ou subs-tituído através da troca para um meio de solução diferente.Em todo caso, a remoção do meio líquido não é uma etapa o-brigatória na formação do complexo de agente ativo-micropartícula. Esta invenção descreve um método para reves-timento de micropartícula com base na mudança das proprieda-des de superfície das microparticulas cristalinas para al-cançar a adsorção do agente ativo à micropartícula.

Em modalidades particulares da presente invenção,é fornecido um método de revestimento de uma micropartículacristalina pré-formada na suspensão com um agente ativo quecompreende; i) ajustar a interação enérgica entre o agenteativo e a micropartícula cristalina independente da remoçãodo solvente; e ii) permitir tempo pelo agente ativo adsor-ver-se sobre a superfície da micropartícula. Em algumas mo-dalidades, o método de revestir uma micropartícula cristali-na pré-formada na suspensão com um agente ativo pode tambémcompreender uma etapa de remover ou trocar o solvente semefeito significativo sobre a interação entre o agente ativoe a micropartícula.

Em outras modalidades particulares da presente in-venção, o método de revestir a micropartícula com agente a-tivo é realizado através da modificação das propriedades desuperfície da micropartícula. Modificação das propriedadesde superfície da micropartícula é obtida através da altera-ção das condições da solução. Estas condições, de uma manei-ra não limitante, compreendem mudar o pH. Em outras modali-dades da invenção, as propriedades de superfície do micro-partícula são modificadas através da: 1) alteração da pola-ridade da solução; 2) adição de íons monovalentes ou multi-valentes; e 3) derivação química da micropartícula.

Em ainda outra modalidade, a presente invençãotambém compreende uma etapa de dissolver o agente ativo nafase fluida da suspensão de micropartículas e subseqüente-mente mudar o pH. Tal etapa de dissolução do agente ativoem uma fase fluida refere-se à dissolução de um sólido. Alémdisso, tal etapa de dissolução do agente ativo refere-se àadição de uma solução mais concentrada do agente ativo alémda adição de sólido.

Todavia, em ainda outra modalidade, as condiçõesdo pH da suspensão de micropartícula são alteradas para fa-vorecer as interações entre o agente ativo e micropartículaantes ou depois da adição do agente ativo.

Em outras modalidades, o agente ativo tem mais deum tipo de interação energicamente favorável com a superfí-cie de microparticula.

Em outra modalidade particular da presente inven-ção, o agente ativo é insulina ou um análogo deste.

Em outras modalidades particulares da presente in-venção, as propriedades de superfície que criam uma intera-ção favorável entre o agente ativo e microparticula são se-lecionadas a partir do grupo que consiste em propriedadeseletrostáticas, propriedades hidrofóbicas, e propriedades deligação de hidrogênio.

Em outra modalidade da presente invenção, a micro-particula é porosa e tem superfícies interiores acessíveisao líquido volumoso da solução. Em uma modalidade, a micro-particula compreende uma dicetopiperazina tal como dicetopi-perazina de fumarila mas não está limitada a tal.

Em modalidades da presente invenção, o método derevestimento produz uma monocamada de agente ativo sobre asuperfície de microparticula. Em outras modalidades da in-venção, a monocamada é contínua. Em outras modalidades dainvenção, o agente ativo na monocamada pode ter uma orienta-ção preferida.

Em ainda outra modalidade, um método é fornecidopara revestir uma microparticula cristalina pré-formada nasuspensão com insulina compreendendo ajustar a interação e-nérgica entre o agente ativo e a microparticula cristalinaindependente da remoção do solvente; e absorver a insulinasobre a superfície das micropartícuias.

Solvente, quando empregado aqui, refere-se ao mé-dio líquido em que o agente ativo e a micropartícula são"banhados". Não deve ser interpretado requerer que todos oscomponentes estejam na solução. Na verdade, em muitos exem-plos eles podem ser empregados para referir-se ao meio lí-quido no qual as micropartícuias são suspensas.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Os desenhos seguintes formam parte da especifica-ção presente e são incluídos para também demonstrar certosaspectos dos exemplos descritos aqui. A invenção pode sermelhor entendida através da referência a um ou mais destesdesenhos em combinação com a descrição detalhada das modali-dades específicas apresentadas aqui.

Figura 1 descreve os perfis de titulação de HClultra-sônicos para componentes separados da suspensão de di-cetopiperazina de fumarila (FDKP), partículas de FDKP e tam-pão, de acordo com os ensinamentos da presente invenção. Amagnitude das mudanças no perfil de titulação de velocidadeultra-sônica (Figura 1; Painel A) reflete mudanças de hidra-tação causadas por protonação de grupos carboxilato ionizá-veis dos componentes da amostra. Os picos de atenuação ul-tra-sônicos em excesso (Figura 1; Painel B) resulta do rela-xamento rápido na reação de troca de próton no ponto de sa-turação. Freqüência (F) é 15 MHz, temperatura é 25°C.

Figura 2 descreve os perfis de titulação de ácidoacético glacial ultra-sônicos para partículas de FDKP + in-sulina e partículas de FDKP sozinhas de acordo com os ensi-namentos da presente invenção. 0 perfil de velocidade ultra-sônica foi calculado através da subtração da contribuição deinsulina; freqüência é 8 MHz, temperatura é 25°C. Atenuaçãoultra-sônica em excesso como uma função da concentração deácido acético glacial adicionado é da mesma forma descrita.Dois estágios de acidificação induzida por ácido acéticoglacial são similares àqueles observados através da titula-ção de HCl. 0 painel de inserção à esquerda (Painel A) des-creve a associação do agente ativo com a microparticula deFDKP em pH maior que aproximadamente 2,9. O painel de in-serção à direita (Painel B) descreve a interação reduzidaentre o agente ativo e a microparticula em pH abaixo de cer-ca de 2,9.

Figura 3 descreve adsorção de proteína sobre mi-cropartículas ionizáveis de acordo com os ensinamentos dapresente invenção. Proteína foi adicionada à suspensão demicroparticula depois do ajuste de pH, proteína não ligadafoi filtrada e as micropartícuias dissolvidas para liberar aproteína não ligada.

Figura 4 descreve a dependência de pH para adsor-ção de agentes ativos sobre micropartículas de FDKP de acor-do com os ensinamentos da presente invenção. Figura 4A des-creve adsorção de insulina; Figura 4B descreve adsorção deanticorpo monoclonal anti-SSX-24i_48, Figura 4C descreve ad-sorção de paratormônio (PTH) e Figura 4D descreve adsorçãode grelina.

Figura 5 descreve a dependência de pH de adsorçãode insulina sobre micropartículas de FDKP com concentraçãode insulina limitante de acordo com os ensinamentos da pre-sente invenção.

Figura 6 descreve a mudança na velocidade ultra-sônica na suspensão de microparticula de FDKP (11 mg/mL) natitulação em etapas de microparticulas de FDKP com proteína(10 mg/ml) de acordo com os ensinamentos da presente inven-ção. A contribuição da proteína livre e o efeito da diluiçãode microparticula de FDKP foram subtraídos. Temperatura é25°C.

Figura 7 descreve as curvas de saturação para ad-sorção do agente ativo sobre microparticulas de FDKP de a-cordo com os ensinamentos da presente invenção. Curvas decarregamento são mostradas para agente ativo/ microparticu-las de FDKP como uma função da concentração do agente ativoem pH 5,0. Figura 7A descreve adsorção de peptídeo gluca-gon-símile 1 (GLP-I); Figura 7B descreve adsorção de PTH;Figura 7C descreve adsorção de anticorpo monoclonal anti-SSX241-49 e Figura 7D descreve adsorção de anticorpo monoclo-nal anti-MOPC-21.

Figura 8 descreve adsorção de agentes ativos sobremicroparticulas em pH 5,m vista que influenciado através deconcentrações crescentes de sal de acordo com os ensinamen-tos da presente invenção. O agente ativo foi adicionado àsuspensão de microparticula depois do ajuste de pH, o agentenão ligado foi filtrado e as microparticulas dissolvidas pa-ra liberar o agente ligado. Figura 8A descreve adsorção deinsulina, Figura 8B descreve adsorção de anticorpo monoclo-nal anti-SSX-24i-49, Figura 8C descreve adsorção de PTH e Fi-gura 8D descreve adsorção de grelina.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Agentes a ser liberados

A substância a ser revestida sobra a micropartícu-la cristalina é referida aqui como o agente ativo. Exemplosde classes de agente ativo incluem composições farmacêuti-cas, compostos sintéticos e macromoléculas orgânicas que têmutilidade terapêutica, profilática e/ou diagnostica.

Geralmente, qualquer forma do agente ativo podeser revestida sobre a superfície de uma microparticuia cris-talina. Estes materiais podem ser macromoléculas orgânicasincluindo ácidos nucléico, compostos orgânicos sintéticos,polipeptideos, peptídeos, proteínas, polissacarídeos e ou-tros açúcares e lipídios. Peptídeos, proteínas e polipeptí-deos são todas as cadeias de aminoácidos unidas por ligaçõesde peptídeo. Peptídeos são geralmente considerados ser menosque 30 resíduos de aminoácido, mas podem incluir mais. Pro-teínas são polímeros que podem conter mais de 30 resíduos deaminoácido. O termo polipeptídeo como é conhecido na artequando empregado aqui, pode referir-se a um peptídeo, umaproteína, ou qualquer outra cadeia de aminoácidos de qual-quer comprimento que contém ligações de peptídeo múltiplas,entretanto geralmente contendo pelo menos 10 aminoácidos. Osdem incluir-se sob uma variedade de classes de atividade bi-ológica, tais como agentes vasoativos, agentes neuroativos,hormônios, anticoagulantes, agentes imunomodulantes, agentescitotóxicos, antibióticos, agentes antiviróticos, antígenose anticorpos. Mais particularmente, agentes ativos podemincluir, de uma maneira não limitante, insulina e análogosdestes, hormônio de crescimento, paratormônio (PTH), greli-na, fator estimulador de colônia de granulócito e macrófago(GM-CSF), peptideo glucagon-simile 1 (GLP-I) , Vermelho Te-xas, alcinas, ciclosporinas, clopiogrel e PPACK (clorometilcetona de D-fenilalanul-L-prolil-L-arginina) , anticorpos efragmentos destes, incluindo, mas não limitados a, anticor-pos humanizados ou quiméricos; F(ab), F(ab)2, ou anticorpode cadeia única sozinho ou fundido a outros polipeptideos ;anticorpos monoclonais terapêuticos ou diagnósticos para an-tigenos de câncer, citocinas, agentes infecciosos, mediado-res inflamatórios, hormônios, e antigenos de superfície ce-lular. Exemplos não limitantes de anticorpos a antigenos detumor incluem anti-SSX-24i-49 (sarcoma sinovial, ponto deruptura 2 X) , anti-NY-ESO-1 (antígeno associado ao tumor e-sofagiano), anti-PRAME (antígeno preferencialmente expressode melanoma) , anti-PSMA (antígeno de membrana específico depróstata), anti-Melan-A (antígeno associado ao tumor de me-lanoma), anti-tirosinase (antígeno associado ao tumor de me-lanoma) , e anti-MOPC-21 (proteína de célula-plasma de mielo-ma) .

Sistema de Liberação - Micropartículas CristalinasEssencialmente, o termo "micropartícula" refere-sea uma partícula com um diâmetro de cerca de 0, 5-1000 μπι, in-dependente da estrutura interior ou exterior precisa. Den-tro da categoria ampla de micropartículas, "microsferas" re-ferem-se a micropartículas com forma esférica uniforme. Mi-croparticulas cristalinas quando empregadas aqui referem-sea microparticulas que têm a estrutura interna entretanto nãonecessariamente a forma externa de um cristal e têm um ar-ranjo regular de átomos em uma treliça espacial. Superfi-cies cristalinas ionizáveis referem-se a microparticulascristalinas que tem a capacidade adicional de transportaruma carga elétrica.

Preferivelmente, a substância química que compõe amicroparticuia cristalina é reversivelmente reativa com oagente ativo a ser liberado, como também não tóxica e nãometabolizada, pelo menos por roedores e humanos. Além disso,a estrutura cristalina de microparticuias preferidas não érompida substancialmente no processo de revestimento com oagente ativo. A composição da microparticuia cristalina de-termina que tipo de interações químicas pode ser manipuladopara direcionar a adsorção de um agente ativo à superfícieda micropartícula.

Várias substâncias podem ser empregadas para for-mar microparticuias cristalinas. Microparticulas como taistêm uma superfície externa, as propriedades das quais podemser manipuladas no processo de revestimento. Materiais re-presentativos dos quais microparticuias cristalinas podemser formadas incluem mas. não são limitados a: aminoácidosaromáticos, sais com solubilidade limitada em uma faixa depH definida tal como dicetopiperazinas e sulfatos de morfo-lina.

Patente dos Estados Unidos Nos. 5.352.461 e5.503.852, aqui incorporada por referência em sua totalida-de, descreve um sistema de liberação de fármaco com base naformação de microparticulas de dicetopiperazina (DKP) de de-rivados de dicetopiperazina tal como 3,6-bis[N-fumaril-N-(n-butil)amino] (da mesma forma referido como dicetopiperazinade fumarila ou FDKP; da mesma forma chamado (E)-3,6-bis[4-(AJ-carbóxi-2-propenil) amidobutil] -2, 5-dicetopiperazina) quesão estáveis em pH baixo e dissolvem no pH do sangue ou nointestino delgado. Como descrito nas patentes anteriores, ofármaco a ser liberado é combinado ou carregado com as par-ticulas de dicetopiperazina através da formação de micropar-ticulas de DKP na presença de fármaco (carga útil). Um sis-tema baseado em elementos estruturais de dicetopiperazina,ou um de seus derivados de substituição, incluindo, mas nãolimitado a, dicetomorfolinas e dicetodioxanos, forma micro-partículas com distribuições de tamanho desejáveis e faixasde pH bem como boa tolerância da carga útil. Uma ampla faixade características reproduzíveis, estáveis pode ser geradacom manipulações apropriadas dos grupos de substituinte.

Outras dicetopiperazinas que podem ser considera-das na presente invenção podem incluir 3,6-di(4- aminobu-til)-2,5-dicetopiperazina; 3,6-di(sucinil-4-aminobutil)-2, 5-dicetopiperazina (dicetopiperazina de sucinila ou SDKP) ;3,6-di(maleil-4-aminobutil)-2,5-dicetopiperazina; 3,6-di(citraconil-4-aminobutil)-2-5-dicetopiperazina; 3,6-di(glutaril-4-aminobutil)-2,5-dicetopiperazina; 3,6-di(malonil-4-aminobutil)-2,5-dicetopiperazina; 3,6-di(oxalil-4-aminobutil)-2,5-dicetopiperazina e derivadosdestes. Sais de dicetopiperazina podem da mesma forma serutilizados na presente invenção e podem incluir, por exem-plo, um sal f armaceuticamente aceitável tal como o Na, K,Li, Mg, Ca, amônio, ou mono-, di- ou trialquilamônio (comoderivado de trietilamina, butilamina, dietanolamina, trieta-nolamina ou piridinas, e similares). 0 sal pode ser um mono,di, ou sal misturado.

Sais de ordem mais altos são considerados para di-cetopiperazinas em que os grupos R contêm mais de um grupoácido. Em outros aspectos da invenção, uma forma básica doagente pode ser misturada com a dicetopiperazina para formarum sal de fármaco da dicetopiperazina, tal que a fármaco é ocontra cátion da dicetopiperazina.

Patente dos Estados Unidos No. 6.444.226, e6.652.885, cada qual aqui incorporada através de referênciaem sua totalidade, descreve a preparação e fornecimento demicroparticulas de DKP em suspensão aquosa à qual uma solu-ção de agente ativo é adicionada, e em seguida a etapa cri-tica de liofilização da suspensão para produzir microparti-culas que tem um revestimento do agente ativo. A base paraesta formulação é que o revestimento da microparticula comagente ativo é direcionado através da remoção do meio liqui-do através de liofilização. (Veja, da mesma forma, Patentedos Estados Unidos No. 6.440.463 que está aqui incorporadaatravés de referência em sua totalidade). Ao contrário dosensinamentos na arte anterior, a presente invenção fornecemeios para ajustar a associação do agente ativo com a micro-particula antes da remoção do solvente. Desse modo, a remo-ção do meio liquido através de métodos físicos volumosos(por exemplo, filtração ou sedimentação) ou métodos evapora-tivos (por exemplo, liofilização ou secagem por pulveriza-ção) pode resultar em cargas comparáveis.

Revestimento Controlado de Microparticulas Cristalinas

Revestimento controlado refere-se ao processo di-recionado de adsorver o agente ativo sobre a superfície deuma micropartícula cristalina. O processo de revestimentoenvolve mudar as propriedades de superfície das micropartí-cuias cristalinas em uma suspensão líquida através da mudan-ça das condições da solução (tal como pH, temperatura, pola-ridade, resistência iônica e co-solventes), através da com-plexação para íons mono ou multi-valentes, ou através da de-rivação química. Alteração das propriedades de superfície damicropartícula antes ou depois da adição do agente ativo a-feta suas interações químicas com agente ativo, desse modoresultando na adsorção do agente ativo à micropartículacristalina. Interação química entre a micropartícula e o a-gente ativo direciona a adsorção e resulta em uma monocamadado agente ativo na superfície da micropartícula. Logo queuma molécula de agente ativo é adsorvida, esta porção da su-perfície de micropartícula não é exposta para outra intera-ção e adsorção do agente ativo adicional nesse ponto de su-perfície particular. A monocamada resultante pode ser contí-nua (nenhuma abertura entre moléculas de agente ativo adsor-vido sobre a superfície acessível) ou não contínua (abertu-ras de superfície de micropartícula exposta entre moléculasde agente ativo adsorvido.Adsorção de Agente Ativo sobre Micropartículas

Como discutido acima, adsorção do agente ativo so-bre as micropartícula resulta na formação de monocamadas(revestimento) do agente ativo sobre a micropartícula. Po-rém, há mais de um mecanismo em jogo na adsorção de um agen-te ativo, tal como insulina por exemplo, em micropartículascristalinas:

A monocamada de um agente ativo, tal como insuli-na, que reveste a micropartícula é um estágio do processo decarregamento de insulina sobre a micropartícula mas não énecessariamente o resultado final no processo de carregamen-to quando ambas camadas monoméricas e multiméricas podem serformadas com base nos energéticos do sistema.

Sob condições de solubilidade permissiva, tal comobaixa concentração de insulina e/ou baixo pH (substancial-mente abaixo de pH 5,0), forças atrativas entre insulina e apartícula de superfície de FDKP são muito maiores que asforças auto-associativas para insulina. Desse modo, o re-vestimento de insulina sobre a micropartícula ocorre de umamaneira em monocamada e a saturação é observada sem agrega-ção ou formação de multicamada sobre a superfície de micro-partícula (veja, Exemplo 6). Quando a saturação aproxima asolubilidade, devido à alta concentração de insulina e/ou pHpróximo de 5,0 (um mínimo de solubilidade para insulina tiposilvestre), auto-associação de insulina fica mais energica-mente favorável. Desse modo, o revestimento pode procederalém do ponto de uma monocamada saturado e outras camadas deinsulina podem ser adicionadas à partícula. Duas formas deauto-associação podem ser reconhecidas: multimerização e a-gregação. Multimerização é caracterizada através de intera-ções intermoleculares especificas e estequimetria fixada.Agregação é caracterizada através de interações intermolecu-lares não especificas e estequiometria indefinida. Geralmen-te falando, os agentes ativos multiméricos podem ser adsor-vidos no estado multimérico, ou desassociados em monômeros,ou multímeros de ordem mais baixa, e adsorvidos à superfícienesse estado. Em qualquer caso, a agregação pode mediar aformação de camadas do agente ativo sobre a micropartícuia.De acordo com os inventores, a compreensão atual, sob ascondições gerais empregadas nos exemplos da presente descri-ção (tal como dissolução de insulina em ácido acético) depo-sição de camadas adicionais de insulina procede como agrega-ção de insulina não hexamérica.

Método para Revestir Microparticulas0 procedimento para revestir micropartículas cris-talinas, tais como micropartículas cristalinas pré-formadas,com agentes ativos é geralmente descrito como segue: micro-partículas cristalinas previamente formadas através de pre-cipitação, ou outro método, são suspensas em meio líquido,tal como água; e o meio é ajustado para alterar a superfíciedas partículas antes ou depois de adição do agente ativo.Neste momento, o agente ativo adsorverá à superfície de mi-cropartícula e depois de um intervalo de tempo (por exemplo< 1, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 minutos; preferivel-mente a partir de < 1 a pelo menos 5 minutos) o processo decarregamento estará completo. 0 meio líquido pode ser remo-vido através de quaisquer meios incluindo filtração, centri-fugação, liofilização ou secagem por pulverização ou substi-tuído através de troca de meios. A adsorção pode ser con-firmada através de qualquer um de dois métodos experimen-tais: 1) demonstrar a ausência de quantidades significantesde agente ativo em um filtrado ou sobrenadante e/ou 2) de-monstrar a presença do agente ativo na fase sólida enquantomostrando para que o agente ativo não precipita quando pas-sado pelo mesmo procedimento na ausência das micropartículas.

Manipulação das Propriedades de Superfície de Mi-cropartícula

Como descrito em outro lugar aqui, as propriedadesde superfície da micropartícuia podem ser manipuladas atra-vés de vários meios. As propriedades de superfície de micro-partícula que podem ser manipuladas incluem, mas não são li-mitadas às, propriedades de ligação de hidrogênio, hidrofó-bicas e eletrostáticas. Em várias modalidades, estas manipu-lações são realizadas na ausência ou presença do agente ati-vo, ou antes ou depois as micropartí cuias e o agente ativosão misturados juntamente. Quando a manipulação ocorre napresença do agente ativo, por exemplo, através da alteraçãoda condição da solução, pode da mesma forma haver efeitossobre o agente ativo que modificará sua afinidade para a su-perfície. Desse modo, em algumas modalidades da presente in-venção, o revestimento da micropartícuia pode envolver a ma-nipulação de propriedades de superfície e modificação depropriedades do agente ativo. Métodos direcionados ao últimosão descritos no Pedido de Patente US co-pendente No.

(Parecer do Procurador No. 51300-00035) intitulado

METHOD OF DRUG FORMULATION BASED ON INCREASING THE AFFINITYOF ACTIVE AGENTS FOR CRYSTALLINE MICROPARTICLE SURFACES de-positado na data mesmo com o pedido presente e que é incor-porado aqui através de referência em sua totalidade.

Interações eletrostáticas são atrações entre car-gas opostas ou repulsões entre cargas similares que ficammais fortes quando as cargas ficam mais próximas uma da ou- tra. Interações eletrostáticas constituem um componente fun-damental no entendimento das interações entre corpos carre-gados em soluções iônicas. Por exemplo, a estabilidade departículas coloidais dispersas em um solvente pode ser ex-plicada considerando-se a competição entre interações ele-trostáticas repulsivas e as interações de van der Waals a-trativas. Da mesma forma, a funcionalidade química (por e-xemplo, mas não limitada a COOH, NH, etc.) da superfície demicropartícuia pode ser utilizada como o contra-íon a um a-gente ativo ionizado tal que o compósito de partícula/agentecompreende um sal. Interações eletrostáticas são da mesmaforma de importância ao considerar a interação e adesão en-tre as partículas.

Alteração do pH do sistema de solução circundantepode mudar as propriedades eletrostáticas de micropartícuiascristalinas ionizáveis na suspensão. Como demonstrado no E-xemplo 3, mudar o pH da solução muda a ionização de uma mi-cropartícula tal que o agente ativo adsorve à superfície demicropartícula. Especificamente, o Exemplo 4 mostra que mi-cropartículas compostas de FDKP (3, β-bis [Aí-fumaril-N- (n-butil)amino]2,5-dicetopiperazina) são ionizáveis. As raicro-partículas são insolúveis em água abaixo do pH 3,5 mas a so-lubilidade aumenta rapidamente entre pH 3,5 e 5,0, presumi-velmente devido à ionização dos grupos carboxila. A micro-particula de FDKP é ionizada parcialmente em pH 5 antes dadissolução completa em pH mais alto, que pode ser observadoindiretamente através de espectroscopia ultra-sônica. Exem-plo 5 demonstra o revestimento controlado da proteína sobrea superfície de micropartícula de FDKP. Em uma modalidade,micropartículas de dicetopiperazina são suspensas em uma so-lução ácida, o agente ativo é adicionado à suspensão, e o pHda solução é elevado depois que o agente ativo e as micro-partículas são misturados juntamente. O pH aumentado alteraas propriedades de superfície das micropartículas para criarum ambiente no qual o agente ativo tem uma afinidade maisalta para a micropartícula do que para o solvente.

Alternativamente, o pH da suspensão de micropartí-cula pode ser elevado imediatamente antes da adição do agen-te ativo à solução. As propriedades de carga de superfícieda micropartícula são alteradas pela mudança no pH tal que oagente ativo tem uma afinidade mais alta para a micropartí-cula do que durante a permanência na solução e é adsorvido àsuperfície de micropartícula na adição.

Exemplos 6 e 7 demonstram o carregamento de insu-lina sobre partículas de FDKP através da manipulação de con-dições de pH. Finalmente, a saturação da micropartícula a-través da adsorção de proteína e a formação de uma monocama-da são descritas no Exemplo 6.

Outros Métodos de Manipular as Superfícies das Mi-cropartículas

Além das propriedades eletrostáticas, outras pro-priedades de uma superfície de micropartícuia podem ser ex-ploradas para controlar a adsorção do agente ativo.. Micro-partículas que contém compostos com imidazol, piridina, ba-ses de Schiff funda, cetona, bioisósteres de ácido carboxí-lico, amidas, ou outros grupos funcionais que podem existirem estruturas múltiplas podem ser manipulados para modificarpropriedades de superfície.

Interações hidrofóbicas são associações de gruposnão polares entre si em soluções aquosas por causa de suainsolubilidade em água. Interações hidrofóbicas podem afe-tar vários processos moleculares incluindo, mas não limita-dos a, estabilização de estrutura (se de moléculas únicas,complexos de dois ou três moléculas, ou reuniões maiores) edinâmicos, e faz contribuições importantes para processos deligação de proteína-ligando e proteína-proteína. Estas inte-rações são da mesma forma conhecidas por desempenharem umpapel em eventos iniciais de duplicação de proteína, e estãoenvolvidas na reunião de complexo e fenômenos de auto-reunião (por exemplo, formação de membranas).

Interações hidrofóbicas podem ser manipuladas a-través da mudanção da protonação de micropartícuias crista-linas compostas de histidina. Protonação da histidina redu-zirá a nucleofilicidade das micropartículas cristalinas etransmitirão uma carga positiva.Interações de ligação de hidrogênio são forças dedipólo-dipólo especialmente fortes entre as moléculas; umátomo de hidrogênio em uma ligação polar (por exemplo, H-F,H-O ou H-N) pode experimentar uma força atrativa com um ionou molécula eletronegativa adjacente, que tem um par nãocompartilhado de elétrons (usualmente um átomo de F, O ou Nem outra molécula). Ligações de hidrogênio são responsáveispelas propriedades únicas de água e são muito importantes naorganização de moléculas biológicas, especialmente influen-ciando-se a estrutura de proteínas e DNA.

Na presente invenção, as propriedades de ligaçãode hidrogênio da superfície de micropartícuia podem ser con-troladas através da derivação química. Aceptores/doadores deligação de hidrogênio podem ser adicionados quimicamente pa-15 ra alterar a superfície de micropartícuia. Por exemplo, ohidrogênio em uma ligação de N-H pode sofrer ligação de hi-drogênio ao oxigênio em uma ligação de C=O. Se o N-H é subs-tituído por um N-CH3, em seguida esta interação de ligaçãode hidrogênio particular é removida. Igualmente, a substitu-20 ição do grupo C=O com um grupo C=C da mesma forma remove es-ta interação de ligação particular.

Micropartículas com superfícies que contêm gruposaromáticos ionizáveis são polares quando ionizadas, porém,hidrofóbicos em seu estado não ionizado. Começar com super-25 fícies protonadas e manipular condições de solução para re-duzir ionização de superfície de partícula faz os agentesativos hidrofóbicos ou aromáticos revestirem a superfície demicropartícula.Micropartícuias com grupos de superfície de cetonapodem ser manipuladas através da mudança da polaridade dasolução. Por redução da polaridade do solvente (adicionandosolventes orgânicos de baixa polaridade a uma solução aquo-sa) a forma de enol é feita das espécies predominantes nasuperfície de partícula. Esta forma de enol é um doador deligação de hidrogênio considerando que a forma de ceto é umaceptor de ligação de hidrogênio. A adsorção de fármacoscontendo nitrogênio sobre a superfície de micropartícula épromovida desta maneira.

Micropartícuias com grupos de superfície que so-frem isomerização induzida por temperatura ou pH podem damesma forma ser induzidas para adsorver moléculas de fármacoatravés da manipulação das condições de solução. No caso15 destas superfícies, a introdução de uma dobra em um grupo desuperfície linear devido à isomerização aumenta a mobilidade(fluidez) dos grupos na superfície de micropartícula. Istopermite a superfície formar mais contatos com o agente ativodo que é possível com uma superfície ordenada. Se as intera-20 ções adicionais com o agente ativo são cada qual favoráveis,em seguida a energia de interação líquida fica favorável e ofármaco adsorve à superfície de micropartícula.

Técnicas de Remoção de Meio LíquidoRemoção do solvente depois do revestimento contro-25 lado das superfícies cristalinas com agente ativo pode seralcançada através de métodos incluindo, mas não limitados a,sedimentação, filtração, ou secagem. Técnicas de secagem in-cluem, mas não são limitadas a, liofilização e secagem porpulverização. Estas técnicas são conhecidas por aqueles ver-sados na arte. Em uma modalidade da presente invenção, osolvente é removido através de secagem por pulverização.Métodos de microparticulas de dicetopiperazina se secagempor pulverização são descritos em, por exemplo, Pedido depatente Provisório U.S. No. 60/776.605 depositado em 22 defevereiro de 2006, incorporado através de referência aquipara todos que abrangem considerando microparticulas de di-cetopiperazina se secagem por pulverização.

Análise de Modificações de Propriedade de Superfí-cie

A presente invenção emprega a técnica de espec-troscopia ultra-sônica para analisar as mudanças nas propri-edades de superfície de microparticulas cristalinas em umsuspensão líquida, que promove ou realça a adsorção de umagente ativo à micropartícula cristalina. Como descrito emoutro lugar aqui, tais mudanças envolvem mudar as condiçõesda solução (tal como pH, temperatura, polaridade, resistên-cia iônica, e co-solventes), através da complexação em íonsmono ou multivalentes, ou através da derivação química paraalterar as propriedades de superfície da micropartícula an-tes ou depois da adição do agente ativo.

Epectroscopia ultra-sônica é uma ferramenta analí-tica conhecida pelo técnico versado. Em brevidade, espec-troscopia ultra-sônica emprega ondas sonoras. Em particular,usa uma onda acústica de freqüência alta que investiga for-ças intermoleculares em amostras/materiais. Compressão osci-lante (e descompressão) na onda onda ultra-sônica causa os-cilação de arranjos moleculares na amostra, que responde a-través da repulsão ou atração intermolecular.

Passar através das amostras, a onda ultra-sônicaperde sua energia (uma diminuição na amplitude) e muda suavelocidade. Esta diminuição na amplitude e mudança na velo-cidade são analisadas como características da amostra. Por-tanto, a propagação de ondas ultra-sônicas é determinada poratenuação e velocidade ultra-sônica.

Velocidade ultra-sônica é determinada pela elasti-cidade e pela densidade do meio. Sólidos têm as interaçõesmais fortes entre as moléculas seguidas por líquidos e gasese são, portanto, mais rígidos comparados com líquidos e ga-ses. Atenuação ultra-sônica é uma medida da energia que asondas ultra-sônicas perdem quando elas passam através de umaamostra. Caracteriza a transparência ultra-sônica da amos-tra e pode ser visto como uma redução de amplitude de onda.

Medida de multi-freqüência de atenuação ultra-sônica em sistemas homogêneos permite a análise de reaçõesquímicas rápidas tal como, mas não limitada a, troca de pró-ton, transições estruturais (por exemplo, isomerização), au-to-associação (por exemplo, dimerização), agregação, ligaçãode ligandos às macromoléculas etc.

EXEMPLOS

Os seguintes exemplos são incluídos para demons-trar modalidades da presente invenção. Deve ser apreciadopor aqueles de experiência na técnica que as técnicas des-critas nos exemplos que seguem representam técnicas descri-tas pelo inventor funcionar bem na prática da presente in-venção, e desse modo pode ser considerado constituir modospreferidos para sua prática. Entretanto, aqueles de experi-ência na técnica devem, levando em consideração a presentedescrição, apreciar que muitas mudanças podem ser feitas nasmodalidades especificas que são descritas e ainda obter umresultado igual ou semelhante sem partir do espirito e esco-po da invenção.

Exemplo 1

Procedimento Geral Para Carregar MicroparticulasCom Agentes Ativos

A Tabela 1 abaixo é um exemplo de revestimento e-letrostaticamente dirigido de uma microparticula cristalinaionizável (microparticulas de FDKP) utilizando adsorção con-trolada por pH. Nestas experiências, suspensões de micro-15 partícula de FDKP foram preparadas em pH 2,0 e 4,5. Proteí-na (hormônio de crescimento) foi em seguida adicionada a ca-da para produzir condições finais de 5 mg/mL de partículasde FDKP e 200 μg/mL de proteína. Depois de misturar, o lí-quido em volume foi removido da suspensão através de filtra-20 ção. 0 material capturado no filtro foi em seguida dissol-vido e coletado. A concentração de proteína em todas asfrações foi quantificada através de HPLC.

Em pH baixo (2,0), a proteína não adsorve as par-tículas e toda a proteína foi encontrada no primeiro filtra-25 do. Aumentando-se o pH em 4,5, as propriedades de superfí-cie das partículas foram mudadas por ter uma afinidade altapara a proteína. Sob estas condições, a proteína ligou-seàs microparticulas e não foi vista no filtrado. Para deter-minar a quantidade de proteína associada com as micropartí-culas, a proteína foi recuperada quando as micropartícuiasforam dissolvidas. Os controles livres de partícula demons-tram que a proteína, por si própria, não foi mantida no fil-5 tro sob as condições empregadas, isto é, a proteína não seauto-associa ou de outra maneira agrega-se em partículasmaiores que os poros do filtro.

Tabela 1. Concentrações de proteína em uma experi-ência de adsorção com micropartícuias de FDKP.

<table>table see original document page 27</column></row><table>

Valores mostrados são resultados de quantificaçãode HPLC das soluções depois da fraçãoExemplo 2

Controle da Ionização de Micropartícuia de FDKPAtravés da Manipulação do pH

FDKP é uma molécula em forma de bastão com um gru-po funcional de ácido carboxílico em cada extremidade que éessencialmente insolúvel em água abaixo do pH 3,5 quando osácidos carboxílicos são protonados e não carregam nenhumacarga. A solubilidade de FDKP aumenta rapidamente acima dopH 3,5 correspondendo à ionização dos grupos carboxila. Mo-delagem de cristais de FDKP, que formam-se como placas comduas faces grandes, planas e extremidades estreitas, indicaque as moléculas de FDKP semelhantes a bastão alinham-seperpendicularmente às extremidades das placas de forma queextremidades de ácido carboxilico da molécula são dispostasnas faces grandes das placas. Em uma base teórica, as su-perfícies de cristais de FDKP devem ser parcialmente ioniza-das em torno do pH 5,0, onde a solubilidade é cerca de 1mg/mL, exatamente abaixo do pH ao qual uma suspensão de 10mg/mL de micropartícuias dissolverá.

A ionização de superfícies cristalinas de FDKP foiobservada indiretamente com espectroscopia ultra-sônica. NaFigura 1, a curva de titulação ultra-sônica de micropartícu-ias de FDKP e tampão é mostrada. Nesta experiência, uma so-lução contendo 200 mM de HCl foi adicionada em alíquotas pe-quenas em uma suspensão agitada de 10 mg/mL de micropartícu-Ias de FDKP em 20 mM de tampão de acetato de amônio. O pHinicial foi 4,8. Depois de cada adição de HCl, o sistemafoi permitido equilibrar-se e dados ultra-sônicos foram co-letados .

A diminuição na velocidade ultra-sônica observadacom concentração ácida crescente (pH decrescente) reflete aprotonação de grupos ácidos carboxílicos no sistema. Quandoos grupos foram protonados e tornaram-se não carregados, aestrutura de água ao redor deles relaxou e ondas ultra-sônicas foram transmitidas mais lentamente (a velocidade ul-tra-sônica diminui). Por causa das micropartículas de FDKP,superfícies de carboxilato e o grupo carboxilato no tampãode acetato são quimicamente muito similares, as curvas foramda mesma forma similares. As diferenças, entretanto, foramcausadas pelas micropartículas de FDKP. Primeiro, a magni-tude da mudança de velocidade com micropartículas de FDKPfoi maior. Esta diferença resulta na protonação de gruposcarboxilato ionizados na superfície de micropartícuia deFDKP. 0 pico na curva de atenuação, que ocorre perto doponto de protonação completo, foi trocado para concentraçãoácida ligeiramente mais alta na suspensão de FDKP. Final-mente, ambos os parâmetros de FDKP continuaram a mudar quan-do o pH foi reduzido de 3,5 para 2,3. Estas mudanças refle-tem modificações adicionais nas propriedades de superfíciedas partículas que podem incluir ordenação dos grupos carbo-xila de superfície ou outras modificações micro-estruturais.

Exemplo 3

Carregamento de Proteína sobre Micropartículas deFDKP através da Manipulação de pH das Propriedades de Super-fície

A adsorção de proteínas sobre superfícies de mi-cropartícula ionizáveis através de manipulação de pH podeser obtida de duas maneiras. A proteína pode ser adicionadae em seguida o pH ajustado para causar a ionização da super-fície com adsorção concomitante de proteína. Este processoé reversível. Alternativamente o pH da suspensão de partí-cula pode ser ajustado para causar ionização da superfícieantes da proteína ser adicionada.

Os dados de titulação ultra-sônica mostrada na Fi-gura 2 indicam a associação de proteína (insulina) com asmicropartículas de FDKP em pH maior do que cerca de 2,9 einteração reduzida em pH abaixo de cerca de 2,9.

Uma suspensão de micropartículas de FDKP foi pre-parada em 20 mM de tampão de acetato de amônio, pH 4,8, ecombinada com uma solução de matéria-prima de insulina paraproduzir 800 μΐ de suspensão com uma concentração final de10 mg/mL de micropartículas de FDKP e concentração de insu-lina de 1 mg/mL. Esta suspensão foi introduzida em um es-pectrômetro ultra-sônico. Enquanto agitando suavemente, á-cido acético glacial foi gradualmente adicionado em alíquo-tas de 5 μΐι para diminuir o pH. Em cada etapa na titulação,dados ultra-sônicos foram coletados.

A mudança na velocidade ultra-sônica foi relacio-nada (proporcional) à quantidade de área de superfície (águade hidratação) das partículas e/ou macromoléculas na amos-tra. A Figura 2 ilustra que pH acima de cerca de 2,9 (10%em v/v de ácido acético adicionado), as curvas de velocidadepara micropartículas sozinhas (partículas de FDKP) e micro-partículas com insulina (partículas de FDKP + Insulina) co-incidiram-se. Isto indicou que a quantidade de área de su-perfície no sistema é essencialmente igual à área de super-fície de micropartículas de FDKP sozinhas. A insulina teveuma contribuição insignificante porque é muita pequena com-parada às micropartículas. pH abaixo de 2,9, as partículasde FDKP e partículas de FDKP + curvas de Insulina divergi-ram-se. A velocidade ultra-sônica das partículas de FDKP +curva de Insulina foi mais alta aqui, que indicou que houvemais área de superfície exposta à água do que nas amostrasde partículas de FDKP sozinhas. Esta área de superfície a-dicional foi de insulina livre na suspensão. Quando o pHaumentou de cerca de 2,7 para cerca de 2,9, a área de super-fície de insulina foi perdida através da adsorção de insuli-na em superfícies de micropartícuia de FDKP, e a intensidademais alta das micropartículas de FDKP + curva de Insulinadesapareceu quando a insulina livre desapareceu do sistema.

Como notado acima, o segundo método direcionado apH de partículas de revestimento com proteína é suspenderpartículas em um meio líquido e ajustar condições de soluçãopara ionizar a superfície de partícula. A proteína pode emseguida ser adicionada à suspensão e moléculas de proteínaimediatamente absorverão. A Figura 3 ilustra a quantidadede proteína (insulina) que foi adsorvida em adição para sus-pensões ajustadas por pH de micropartículas de FDKP.

Suspensões de micropartícuia de FDKP foram prepa-radas em 5 mg/mL e um excesso de proteína (2 mg/mL) foi adi-cionado. (Um excesso de proteína, como referido aqui, é a-quela quantidade em que é acreditado ser necessária paraformar um revestimento de monocamada a superfície acessívelda micropartícula de FDKP). Depois da incubação, proteínanão adsorvida foi removida através de filtração. Os sólidosmantidos no filtro (retentado) foram dissolvidos e as quan-tidades de micropartículas de FDKP e proteína mantidas nofiltro foram quantificadas através de HPLC. A relação demassa proteína / partícula foi determinada a partir destaquantificação. Com base na área de superfície conhecidadestas partículas e as dimensões moleculares da proteína,uma monocamada contínua de proteína adsorvida foi calculadapara ocorrer em uma relação de massa de cerca de 0,07. Nabase daquela estimativa pode ser visto a partir deste exem-pio que uma monocamada contínua foi formada em pH 5,0 e a-quelas monocamadas não contínuas formadas em pH 3,5 a pH4,5.

Adicionalmente, partes diferentes de micropartícu-las de FDKP revestidas com agente ativo seco foram suspensasem uma solução ácida (pH final cerca de 2,0) ou água (pH fi-nal cerca de 4,5). Os agentes ativos diferentes incluíraminsulina, hormônio de crescimento e insulina aspart (um tipode insulina de ação rápida), como mostrado na Tabela 2. Osolvente foi filtrado a partir destas suspensões e as partí-cuias mantidas foram dissolvidas e coletadas. A quantidadedo agente ativo em todas estas amostras foi quantificada a-través de HPLC. Os resultados são mostrados na Tabela 2.

Para cada uma das partes, o agente ativo foi libe-rado das partículas na solução ácida. Portanto, através daprotonação das superfícies dos microcristais, o agente ativodessorve as superfícies cristalinas. Quando as partículasforam re-suspensas em água, que não muda o estado de ioniza-ção da superfície de partícula, a proteína permaneceu adsor-vida .

Tabela 2. Agentes ativos revestidos sobre micro-partículas de FDKP_

<table>table see original document page 32</column></row><table>Solução Padrão de Agente Ativo 250 1103 1099Re-suspensos em Solução Ácida 240 980 893Re-dissolvidos depois da filtra- ção da solução ácida 0 49 29Re-suspensos em água 0 4 0Re-dissolvidos depois da filtra- ção em água 191 936 982

Valores na tabela são áreas de pico interagidas apartir da quantificação de HPLC (mAU*seg em, 215 nm)Exemplo 4

Caracterização de Adsorção Direcionada, ao pH deInsulina sobre Microparticulas de FDKP

Insulina foi■adsorvida (carregada) sobre micropar-ticulas de FDKP em um processo controlado por pH através damistura de uma suspensão aquosa a partir de microparticulasde FDKP com uma solução aquosa de insulina. Para caracteri-zar o efeito de pH sobre a ligação de insulina em micropar-ticulas de FDKP, uma suspensão de 5 mg/mL de partículas deFDKP em valores de pH variados foi preparada. Um excesso deinsulina dissolvida foi, em seguida, adicionado, permitidoadsorver cerca de 5 minutos, depois que a insulina não Iiga-da foi removida através de filtração. As partículas sólidascom insulina adsorvida foram recuperadas a partir do filtro(retentado), dissolvidas e coletadas. As quantidades de in-sulina e micropartículas de FDKP dissolvidas foram quantifi-cadas através de HPLC. A quantidade de insulina adsorvidafoi calculada como uma fração da massa total do retentado.A dependência de pH de adsorção de insulina é mostrada naFigura 4A; adsorção de insulina aumentou como uma função depH. Resultados similares foram obtidos para anticorpo mono-clonal SSX-24i-49, PTH, e grelina como ilustrado nas Figuras4B, C, e D respectivamente.

Adicionalmente, partículas de FDKP foram suspensasem soluções de insulina (10 mg/mL) de pHs diferentes. A re-lação em massa de partículas de FDKP para insulina foi de10:1. A concentração de insulina não ligada no sobrenadantefoi determinada através de HPLC depois que o sobrenadantefoi separado a partir das partículas através de centrifuga-ção. Ligação de insulina foi determinada como a diferençada concentração de insulina inicial. Os dados relatados naFigura 5 demonstram que pH crescente resultou na insulinareduzida na solução e teor de insulina aumentado nas partí-culas de FDKP.

Desse modo, ligação de insulina às partículas deFDKP aumenta com pH crescente de cerca de pH 3,0 até cercade pH 5. Preferivelmente, a solução de insulina é adiciona-da em pH 3,6 e sob estas condições aproximadamente 75% dainsulina é adsorvida a partir da solução sobre as partícu-las. Ligação de Insulina aumenta para > 95% quando o pH au-menta para > 4,0. Ligação substancialmente completa é obti-da em cerca de pH > 4,2, preferivelmente cerca de 4,4. EmpH mais alto do que 5,0, as microparticulas de FDKP começama dissolver e não mantém mais a estrutura de uma micropartí-cula cristalina.

Exemplo 5

Descrição de Carregamento de Microparticulas deFDKP Com Insulina

Em um formato de escala de produção (2-5 kg) ,microparticulas de FDKP são formadas através de precipitaçãode ácido com ácido acético e lavadas. Uma solução de insu-lina em pH 3,6 é adicionada à suspensão de partícula deFDKP. A solução de matéria-prima de insulina é 10% em pesode insulina e 2,5% em peso de ácido acético (pH de aproxima-damente 3,6). Hidróxido de amônio é empregado para ajustaro pH da mistura em 4,5. A Tabela 3 indica as quantidadesdos vários componentes por quilograma de formulação emprega-da para preparar partículas contendo -11,4% em peso de insu-lina. Polissorbato 80 pode ser incorporado durante a forma-ção de partícula e pode melhorar as características de mani-pulação das partículas finais. Tempo é permitido para ad-sorção de insulina sobre as partículas de FDKP e garantirmisturando completa. A mistura é, em seguida, adicionada emgotas ao nitrogênio líquido para o congelamento flash dasuspensão. 0 meio líquido é removido através da liofiliza-ção para produzir partícula de FDKP / produto de fármaco emvolume de insulina. Alternativamente, a mistura é liofili-zada. A Tabela 4 indica as quantidades dos vários componen-tes no produto em volume depois da remoção do meio líquido.Tabela 3. Composição de partículas de FDKP / Fór-mula em Batelada de Insulina

<table>table see original document page 36</column></row><table>

Tabela 4. Composição de partículas de FDKP / insu-lina

<table>table see original document page 36</column></row><table>

Nas Tabelas 3 e 4 acima, NF denota - Formulário

Nacional

* Teor de Polissorbato 80 é estimado por um ensaiode HPLC/MS.

** A formulação de FDKP / Insulina contém cerca de1,2% de água residual depois da Iiofilização. Quantidadesde traço de ácido acético e hidróxido de amônio podem damesma forma estar presentes.

Exemplo 6

Saturação de Superfícies de Microparticula atravésde Proteína (Formação de uma Monocamada Continua)

O revestimento de superfície de uma micropartículacom uma monocamada deve ser um processo saturável. Isto é,sua área de superfície acessível e o diâmetro da molécula deagente ativo ditarão a capacidade da superfície de micropar-tícula. A Figura 6 ilustra esta saturação.

Uma suspensão de micropartículas de FDKP foi pre-parada e o pH foi ajustado entre pH 3,0 e pH 3,5 ponto nosquais as superfícies ionizam-se parcialmente. Neste proce-dimento, pH mais alto não pode ser empregado porque teriacausado auto-associação do agente ativo, insulina. Porçõespequenas de uma solução de insulina concentrada foram adi-cionadas à suspensão agitada. Depois de cada adição, a a-mostra foi permitida estabilizar-se e dados ultra-sônicosforam coletados.

A Figura 6 mostra que uma redução na velocidadeultra-sônica é observada quando a concentração de proteínafoi aumentada. Este tipo de mudança na velocidade ultra-sônica é típico para ligação de ligando em soluções aquosase indica adsorção da proteína ativa às superfícies de micro-partícula de FDKP. A diminuição de velocidade resulta daliberação de água de hidratação da microparticula de FDKP esuperfícies de proteína. Quando a água de hidratação é des-locada através de adsorção do agente ativo, sua estruturarelaxa e produz uma diminuição líquida na velocidade ultra-sônica através da amostra. Quando todos os sítios de liga-ção na superfície das micropartículas de FDKP foram satura-dos, isto é, uma monocamada de proteína formou-se, a curvase iguala. A formação de monocamada foi da mesma forma de-monstrada pelos dados nas Figuras 7A-7D que mostrou que aadsorção de vários agentes ativos (GLP-1 [Figura 7A] ; PTH[Figura 7B] ; anticorpo monoclonal anti-SSX-241-49 [FiguraIC]; e anticorpo monoclonal anti-MOPC-21 [Figura 7D]), sobremicropartículas alcançou a saturação quando a concentraçãodo agente ativo é aumentada em uma concentração constante demicropartículas de FDKP (5 mg/mL). Estes estudos foram con-duzidos em pH 5,0 onde a adsorção ideal do agente ativo àsmicropartículas é observada. GLP-I não se auto-associa àsconcentrações empregadas (como descrito no Pedido de PatenteProvisório U.S. No. 60/744.882).

Exemplo 7

Evidência para Mecanismo de Interação Eletrostático

Evidência para um mecanismo eletrostático de inte-ração é a capacidade de interferir-se com adsorção atravésdo enfraquecimento das interações eletrostáticas. Isto édemonstrado adicionando-se sal ao sistema de partícula ioni-zada/agente ativo. As Figuras 8A - 8D ilustram que resis-tência iônica crescente em um sistema de agente ativo-microparticula de FDKP reduziu a adsorção do agente ativosobre a microparticula.

Uma série de amostras foi preparada em pH 5,0 ondea adsorção do agente ativo em superfícies de microparticulade FDKP é forte. Cada amostra continha uma guantidade dife-rente de sal (cloreto de sódio), como indicado sob cada barnas Figuras 8A - 8D (unidades são mM) . 0 agente ativo foimisturado na suspensão para produzir uma concentração finalde 5 mg/mL de microparticuias de FDKP e 0,75 mg/mL de insu-lina (um excesso; Figura 8A) . Depois de uma breve incuba-ção, agente ativo não ligado foi removido através de filtra-ção e as partículas com o agente ativo adsorvido foram re-dissolvidas. A quantidade de agente ativo e partícula recu-perada foi quantificada através de HPLC, e expressa como umarelação de massa (% de carregamento) . As Figuras 8A - 8Dilustram que resistência iônica crescente em um sistema deagente a.tivo-micropartícula de FDKP reduziu a extensão deadsorção de agentes ativos incluindo anticorpo monoclonalanti-SSX-24i-49 (0,2 mg/mL; Figura 8B) , grelina (0,1 mg/mL;Figura 8C) e PTH (0,25 mg/mL; Figura 8D) na presença de 5mg/mL de microparticuias de FDKP.

A Figura 8 mostra uma correlação inversa entre aadsorção medida e a concentração de sal na suspensão de car-regamento. Isto pode ser interpretado como evidência que osal competiu com o agente ativo para interação com a super-fície de partícula. Quando a concentração de sal foi aumen-tada, ela competiu fortemente e eficazmente para sítios deligação de superfície, e essencialmente deslocou o agenteativo das superfícies de partícula. É da mesma forma espe-culado, que ligação de diminuição do agente ativo à micro-partícula pode ser atribuível a proteção de Debye.

A menos que de outra maneira indicado, todos osnúmeros expressando quantidades de ingredientes, proprieda-des tais como peso molecular, condições de reação, e assimsucessivamente empregados na especificação e reivindicaçõesserão entendidos como sendo modificados em todos os exemplospelo termo "cerca de". Desta maneira, a menos que indicadoao contrário, os parâmetros numéricos mencionados na seguin-te especificação e reivindicações anexas são aproximaçõesque podem variar, dependendo das propriedades desejadas pro-curadas ser obtidas pela presente invenção. No mínimo, enão como uma tentativa de limitar o pedido da doutrina deequivalentes ao escopo das reivindicações, cada parâmetronumérico deve pelo menos ser interpretado levando em consi-deração o número de dígitos significantes informados e apli-cando-se técnicas de arredondamento ordinárias. Apesar dasfaixas numéricas e parâmetros que mencionam o amplo escopoda invenção sejam aproximações, os valores numéricos mencio-nados nos exemplos específicos são relatados quanto precisa-mente possível. Qualquer valor numérico, entretanto, ine-rentemente contém certos erros necessariamente resultantesdo desvio padrão encontrado em suas medidas de teste respec-tivas.

Os termos "um" e "uma" e "o" e referentes simila-res empregados no contexto da descrição da invenção (especi-almente no contexto das seguintes reivindicações) devem serinterpretados para abranger igualmente o singular e o plu-ral, a menos que de outra maneira indicado aqui ou claramen-te contradito através do contexto. Recitação de faixas devalores aqui é meramente pretendida servir como um método detaquigrafia de referir-se individualmente a cada valor sepa-rado que inclui-se na faixa. A menos que de outra maneiraindicado aqui, cada valor individual está incorporado na es-pecificação como se fosse individualmente relacionado aqui.Todos os métodos descritos aqui podem ser realizados emqualquer ordem adequada a menos que de outra maneira indica-do aqui ou de outra maneira claramente contradita através docontexto. 0 uso de qualquer e todos os exemplos, ou lingua-gem exemplar (por exemplo "tal como") fornecido aqui estámeramente destinado a melhor esclarecer a invenção e nãopropõe uma limitação no escopo da invenção de outra maneirareivindicada. Nenhuma linguagem na especificação deve serinterpretada como indicando qualquer elemento não reivindi-cado essencial para a prática da invenção.

0 uso do termo "ou" nas reivindicações é empregadopara significar "e/ou" a menos que explicitamente indicado areferir-se apenas às alternativas ou as alternativas são mu-tuamente exclusivas, embora a descrição suporte uma defini-ção que refere-se apenas às alternativas e "e/ou."

Agrupamentos de elementos alternativos ou modali-dades da invenção descritos aqui não devem ser interpretadoscomo limitações. Cada membro de grupo pode ser referido ereivindicado individualmente ou em qualquer combinação comoutros membros do grupo ou outros elementos encontrados a-qui. É antecipado que um ou mais membros de um grupo podeser incluido em, ou deletado de, um grupo por motivo de con-veniência e/ou possibilidade de patentear. Quando qualquertal inclusão ou deleção ocorre, a especificação é aqui jul-gada conter o grupo quando modificado desse modo realizandoa descrição escrita de todos os grupos de Markush empregadosnas reivindicações anexas.

Modalidades preferidas desta invenção são descri-tas aqui, incluindo a melhor maneira conhecida pelos inven-tores de realizar a invenção. É claro, variações nessas mo-dalidades preferidas tornar-se-ão evidentes por aqueles deexperiência ordinária na arte ao ler a descrição anterior.O inventor espera que os técnicos versados empreguem taisvariações quando apropriado, e os inventores planejam para ainvenção ser praticada de outra maneira do que especifica-mente descrita aqui. Desta maneira, esta invenção incluitodas as modificações e equivalentes da matéria objeto rela-cionados nas reivindicações anexadas até aqui como permitidopor lei aplicável. Além disso, qualquer combinação dos ele-mentos descritos acima em todas as possíveis variações é a-brangida pela invenção a menos que de outra maneira indicadoaqui ou de outra maneira claramente contradito através docontexto.

Além disso, numerosas referências foram feitas àspatentes e publicações impressas ao longo desta especifica-ção. Cada uma das referências citadas acima e publicaçõesimpressas está incorporada aqui individualmente através dereferência em sua totalidade.Além disso, deve ser entendido que as modalidadesda invenção descritas aqui são ilustrativas dos princípiosda presente invenção. Outras modificações que podem ser em-pregadas estão dentro do escopo da invenção. Desse modo,por meio de exemplo, porém não de limitação, configuraçõesalternativas da presente invenção podem ser utilizadas deacordo com os ensinamentos aqui. Desta maneira, a presenteinvenção não está limitada àquela como mostrado e descrito.

Claims (22)

1. Método de revestir uma microparticula cristali-na pré-formada em suspensão com um agente ativo,CARACTERIZADO pelo fato de compreender:i) ajustar a interação enérgica entre o agente a-tivo e a microparticula cristalina independente da remoçãodo solvente; eii) absorver o agente ativo sobre a superfície damicroparticula.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de adicionalmente compreender a eta-pa de remover ou trocar o solvente.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2,CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de remover ou trocaro solvente está sem efeito substancial sobre a interação en-tre o agente ativo e a microparticula.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que a referida etapa de ajustecompreende modificar as propriedades de superfície da micro-particula .

5. Método, de acordo com a reivindicação 4,CARACTERIZADO pelo fato de que a modificação das proprieda-des de superfície da microparticula compreende alterar ascondições da solução.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5,CARACTERIZADO pelo fato de que a alteração das condições desolução compreende mudar o pH.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6,CARACTERIZADO pelo fato de adicionalmente compreender a eta-pa de dissolver o agente ativo em uma fase fluida da suspen-são de microparticulas e subseqüentemente mudar o pH da fasefluida.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7,CARACTERIZADO pelo fato de que o pH é mudado antes ou depoisda adição do agente ativo.

9. Método, de acordo com a reivindicação 5,CARACTERIZADO pelo fato de que a modificação das proprieda-des de superfície da micropartícula compreende alterar a po-laridade da solução.

10. Método, de acordo com a reivindicação 5,CARACTERIZADO pelo fato de que a modificação das proprieda-des de superfície da micropartícula compreende adição de í-ons monovalentes ou multivalentes.

11. Método, de acordo com a reivindicação 5,CARACTERIZADO pelo fato de que a modificação das proprieda-des de superfície da micropartícula compreende a derivaçãoquímica da micropartícula.

12. Método, de acordo com a reivindicação 4,CARACTERIZADO pelo fato de que as propriedades de superfíciecompreendem propriedades eletrostáticas.

13. Método, de acordo com a reivindicação 4,CARACTERIZADO pelo fato de que as propriedades de superfíciecompreendem propriedades hidrofóbicas.

14. Método, de acordo com a reivindicação 4,CARACTERIZADO pelo fato de que as propriedades de superfíciecompreendem propriedades de ligação de hidrogênio.

15. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que a micropartícula é porosa etem superfícies interiores acessíveis ao fluido em volume dasolução.

16. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que a micropartícula compreendeuma dicetopiperazina.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16,CARACTERIZADO pelo fato de que a dicetopiperazina é diceto-piperazina de fumarila.

18. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o método de revestir produzuma monocamada do agente ativo sobre a superfície da micropartícula.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18,CARACTERIZADO pelo fato de que a monocamada é contínua.

20. Método, de acordo com a reivindicação 18 ou-19, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente ativo na mono-camada tem uma orientação preferida.

21. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o agente ativo é insulina ouum análogo de insulina.

22. Método de revestir uma micropartícula crista-lina pré-formada na suspensão com insulina, CARACTERIZADOpelo fato de compreender:i) ajustar a interação enérgica entre o agente a-tivo e a micropartícula cristalina independente da remoçãodo solvente; eii) absorver a insulina sobre a superfície das mi-cropartículas.