CN100333790C - 含白细胞介素－2的药物组合物在制药中的应用 - Google Patents

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Abstract

提供了一组通过肺吸入施用白细胞介素-2(IL-2)或其变体的方法。本方法包括以含水或非水溶液或悬浮液或干粉形式制备含有IL-2或其变体的药物组合物以备输递之用。这些组合物还可以含有一种足够量的表面活性剂，以在肺吸入该组合物后提高其吸收作用。当用在本发明的输递方法时，这些高吸收性的组合物可提高IL-2的生物利用率。

Description

含白细胞介素-2的药物组合物在制药中的应用
发明领域
本发明涉及对哺乳动物进行蛋白质输递的各种方法，具体地说，是通过肺吸入方法输递白细胞介素-2蛋白质，以及本发明方法中所用的一些组合物。
发明背景
肺吸入方法为一些因为不能有效通过肠胃道上皮或第一关肝清除较高而导致口服生物利用率低的肽和蛋白质提供了一种有前途的途径。对含有肽或蛋白质的药物而言，这种输递途径的潜在优势，是因为其吸收表面积约为140m2且有大量的血液(人肺中流量每分钟有5000毫升)流经肺部而很大程度提高了吸收量(Hollinger(1985)，Respiratory Pharmacology and Toxicology(Saunders，PA)，第1-20页)。与肠胃道相比，它缺少某些肽酶/蛋白酶，且被吸收的组合物不经过第一关肝代谢作用，这又加强了蛋白质药物经肺吸入施用的潜在优势。近年来人们对这种输递途径的关注日益增长，因为有些含有肽或蛋白质的药物通过肺吸收可能要比通过肠胃道吸收更加有效(Patton and Platz(1992)Adv.DrugDel.Rev.8：179-196；Niven(1993)Pharm.Technol.17：72-82)。
通过肺吸入方法施用含有肽和/或蛋白质的药物制剂的输递方法已经为人所知，尽管已定量证实的实施例还不是很多。例如可以参看Hubbard等(1989)Ann.Internal Med..3(3)：206-212(血浆α-1-抗胰蛋白酶)；Smith等(1989)J.Clin.Invest.84：1145-1154(α-1-蛋白酶抑制物)。用实验动物进行的实验表明，与皮下注射相比，重组人类生长激素(用气雾剂输递)从肺部能被更快吸收并导致生长更快速(Oswein等(1990)，“Aerosolization of Proteins”in Proceedingsof Symposium on Respiratory Drug Delivery II(Keystone，Colorado，March，1990)。还用气雾剂经肺给药后已观察到血流中的重组型细胞因子干扰素γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)(Debs等(1988)J.Immunol.140：3482-3488)。对哺乳动物通过肺输递粒细胞落刺激因子(G-CSF)和红细胞生成素(EPO)的可行性也已得到了证实。这可分别参看美国专利第5,284,656号和5,354,934号。也可以参看美国专利第5,997,848号，这里通过吸入含有胰岛素的干粉气雾剂完成了向哺乳类宿主进行胰岛素的全身输递。
除了这些通过肺部途径进行蛋白质输递的实施例，能否用这种方式输递某一特定的多肽以产生全身作用仍然是未知数。此外，通过肺部途径输递各种多肽的生物利用率通常都很低。例如，对内皮素-1(ET-1)这种由内皮细胞产生的含有21个氨基酸的血管收缩肽而言，肺部给药就不及静脉给药有效(Braquet等(1989)J.Cardio.Pharm.13，增刊5：143-146)。例如对动物(包括人类)经静脉给药时，作用于血管的肠肽这种分子量为3,450道尔顿(D)的小分子多肽会导致支气管扩张，如用吸入法给药就不会有此功效(Barrowcliffe等，(1986)Thorax.41/42：88-93)。
能否将肽或蛋白质成功输递至肺部深层组织是由若干因素决定的。肺组织内对所给药物的吸收程度，会随着多肽的结构与大小以及所使用的输递设备而改变，变化范围可根据所给剂量而为0-95％。输递设备包括喷雾器、计量吸入器(metered-does inhalers)和粉末吸入器。为肺部给药制备的含有蛋白质或肽的水相液体气雾剂、非水相的悬液气雾剂、或干粉气雾剂药物组合物，使用这些输递装置时可以影响多肽的稳定性和生物利用率，以及输递后的生物学活性。参看Wall(1995)Drug Delivery 2：1-20；Kishnamurthy(3月，1999)Bio Pharm.，第34-38页)。因此，在动物模型实验之前是无法预断通过肺成功输递特定的治疗性蛋白质并带来全身效果的。气管内(IT)技术就是这样一种模型(Niven等(1994)Pharm.Res.12：1142-1149；Niven等(1995)Pharm.Res.12：1889-1895)。这一模型预测了治疗性蛋白质的肺部吸收作用(例如，可参见Patton等(1994)J.Controlled Release 28：79-85)。
白细胞介素-2通常是通过静脉内或皮下注射给药的。对这种蛋白质进行肺部给药是一种可选择的有吸引力的非侵入性给药途径。白细胞介素-2的肺吸入已被证实，采用喷雾器输递含有IL-2的水相液态制剂(美国专利第5,399,341和5,780,012号)。然而，用喷雾系统进行多肽(作为气雾剂)的肺部给药已证明可以使某些多肽变性(参看Ip等(1995)J.Pharm.Sci.84：1210-12-14(干扰素)；Niven等(1994)Int.J.Pharm.109：17-26(重组型粒细胞集落刺激因子)；和Niven等(1995)Pharm.Res.12：53-59)。在喷雾操作过程中，多肽暴露在剪切应力中会严重丧失生物学活性。
综上所述，以高生物利用率输递蛋白质仍然是一个有挑战性的任务。此外，以非侵入性的施用IL-2达到全身性反应也是需要的。
发明概要
一种通过肺吸入施用白细胞介素-2(IL-2)或其变体的给药方法。本方法包括为以后的输递以水相溶液或非水相溶液或悬浮液或干粉形式制备的含有IL-2或其变体的药物组合物。本方法中使用的组合物包括含有稳定的单体IL-2或其变体的组合物、含有多聚体IL-2或其变体的组合物、以及含有稳定冻干的或喷雾干燥的IL-2或其变体的组合物。每一种组合物还可以含有足量的表面活性剂以提高肺吸入后该组合物的吸收。这些组合物被称为高吸收性组合物。
本发明进一步提供了一种在用肺吸入法对个体给药后提高IL-2生物利用率的方法。本方法包括制备本文公开的高吸收性组合物的气雾剂或其它合适的制剂，然后用肺吸入法将气雾剂或其它合适的制剂施用于个体。
附图简述
图1显示了对大鼠进行气管内(IT)(750μg rhIL-2/动物)和皮下(SC)(150μgrhIL-2/动物)给药后，Proleukin的平均血浆浓度。
图2显示了对大鼠进行气管内(IT)(375μg/动物)和皮下(SC)(75μg/动物)给药后，含有聚山梨醇酯80(Tween-80)的单体rhIL-2的平均血浆浓度。
图3显示了用含和不含聚山梨醇酯80(吐温80)的单体rhIL-2对大鼠进行气管内(IT)(375μg/动物)、皮下(SC)(150μg/动物)、或静脉内(IV)(150μg/动物)给药后，血浆rhIL-2的浓度。
图4显示了用含和不含聚山梨醇酯80(吐温80)或精氨酸的单体rhIL-2对大鼠进行气管内(IT)(400μg/动物)、皮下(SC)或静脉内(IV)(0.50mg/kg)给药后，血浆rhIL-2的浓度。
图5显示了用单体rhIL-2和含有各种表面活性剂(泊洛沙姆188、PEG 4600、和聚山梨醇酯80(吐温80))的Proleukin对大鼠进行气管内(IT)(400μg/动物)给药后，血浆rhIL-2的浓度。所有的单体rhIL-2制剂中含有精氨酸而Proleukin制剂中不含有精氨酸。
发明详述
本发明是关于通过肺吸入法对个体进行白细胞介素，尤其是白细胞介素-2(IL-2)或其变体给药的方法。白细胞介素-2是一种由普通外周血液淋巴细胞产生的淋巴因子，它以低浓度存在于身体中。在接触植物凝集素、抗原或其它刺激物后它会导致抗原或促细胞分裂原刺激的T细胞的增殖。Morgan等人(1976)Science193：1007-1008第一次描述了IL-2，并原创地称其为T细胞生长因子，因为它可以导致受激T淋巴细胞的增殖。它是一种蛋白质，报道分子量为13,000到17,000(Gillis和Watson(1980)J.Exp.Med.159：1709)，等电点为6-8.5。现在认识到除了有生长因子的功能外，它还可以在活体内和活体外调节免疫系统的不同功能。IL-2是几种淋巴细胞产生并的信使调节的分子中的一种，可以调节细胞间的相互作用和功能。这里描述的方法包括IL-2或其变体的肺吸入方法。下面公开详细描述了本发明所包含的IL-2蛋白质或其变体，公开了本发明的方法以及一些组合物。
本发明的方法包括以适于肺部输递的方式制备含有IL-2或其变体的药用组合物，以及通过肺吸入法对个体给药。“肺吸入法”是指将组合物以气雾剂或其它合适的制剂的方式由输递设备输递至个体的口腔，当个体用口腔吸气时，该药用组合物就可直接施入肺部。“气雾剂”是指分散在流动空气或其它在生理上可接受气流中的一种固体或液体粒子的悬浮物。其它合适制剂还包括(但不限于)，烟雾剂、蒸汽、或喷雾剂，只要被输递的含有蛋白质组合物的粒子与下面所说的药物组合物的干粉形式尺寸一致就可以了。肺吸入法也可以用这一领域的技术人员熟悉的其它合适的方法来实施。包括使用合适设备点滴输液或其它类似的方法。肺吸入法的结果是吸入的蛋白质组合物沉积在个体的肺泡中。一旦沉积下来，蛋白质就会被主动或被动的吸收，穿过肺泡上皮和毛细管上皮层进入血流，并进行全身分配。
如IL-2之类的多肽或蛋白质的肺部给药需要在吸入过程中从输递设备的个体口腔施予生物活性物质。以本发明的目的而言，含有IL-2或其变体的组合物是根据所使用的输递设备，通过吸入气雾剂或其它合适的制剂(从水相或非水相的溶液或悬浮液形式，或固体或干粉形式药物组合物中获得)给药的。这些输递设备是这一技术领域中广为人知的，包括(但不限于)喷雾器、计量吸入器(metered-doseinhalers)、和干粉吸入器、或其它可施放水相或非水相的溶液或悬浮液或固体或干粉形式的药物组合物的合适的各种输递设备。“水相的”是指用水制备、含有水、或溶解在水中的一种组合物，包括以水为主要物质的混合物。主要物质在混合物中含量高于其它组分。“非水相的”是指制备、含有或溶解在除水以外的物质中的一种组合物，或是其中水不是主要物质的混合物。“溶液”是指两种或多种物质的均质制剂，它可以是固体、液体、气体、或它们的组合物。“悬浮液”是指几种物质的混合物，其中一种或多种不可溶的物质均匀分散在另一种主要物质中。
对于本发明的目的，术语“固体”和“干粉”是可以互换使用的。药物组合物的“固体”或“干粉”形式，是指该组合物已被干燥成细微的粉末，且含水量低于约10％(重量)，通常应低于5％(重量)，更好是低于3％(重量)。组合物的干粉形式中含有由IL-2或其变体组成的粒子。优选的粒子平均直径小于约10.0μm，较好的是小于约7.0μm，更好的是小于约6.0μm，尤好是在0.1-5.0μm之间，最好是在约1.0-5.0μm。
因此，供本发明的一些方法所使用的含有IL-2或其变体的液态药物组合物，可作为液态溶液或悬浮液，或先用本领域中已被人熟知的冻干法或喷雾干燥技术将其制成干粉在输递设备中使用。在输递装置(喷雾器、计量吸入器、或其它合适的设备)中使用的液态溶液或悬浮液时，可以将单份或多份剂量，与上述干粉形式同样粒度范围的液滴通过肺吸入药用有效量的组合物到达个体的肺部。“药用有效量”是指在治疗、预防、或诊断疾病或症状中有效的量。组合物的液态溶液或悬浮液可和生理上合适的稳定剂、赋形剂、膨胀剂、表面活性剂、或它们的组合物一起使用，下面将会讨论到。合适的赋形剂有(但不限于)缓冲剂、粘度调整剂、或其它没有疗效的功能性添加剂。
对于先经冻干处理再在本发明的输递方法中使用的液态药物组合物，冻干的组合物需磨碎以获得含有如上述理想粒度范围的粒子的细微干粉。对液态药物组合物用喷雾干燥法获得干粉形式时，其加工条件应能获得基本上如上述所需粒度范围内的粒子组成的无定形的细微干粉。同样，如果药物组合物已经处于冻干状态，就可以将其磨碎成干粉形式，可供以后制成气雾剂或其它适合肺吸入的制剂。如果最初的药物制剂为喷雾干燥状态，较好是将这种组合物制备成具有分散成如水相或非水相的溶液或悬浮液或干粉形式一样的、有合适粒度的适用于本发明肺部给药方法的干粉形式。药物组合物的干粉形式的制备方法，可以参看例如，WO 96/32149，WO97/41833，WO 98/29096，以及美国专利第5,976,574号、5,985,248号和第6,001,336号，在此全文收入以供参考。
所得的组合物的干粉形式就可装入合适的输递设备中，以便随后制成通过肺吸入法输递给个体的气雾剂或其它合适的制剂。要将干粉形式的药物组合物制备和分散成水相或非水相的溶液或悬浮液时，可使用计量吸入器或其它合适的输递设备。有效药量的干粉形式的组合物可以气雾剂或其它适合肺吸入的形式来施用。装入输递设备中的干粉形式的组合物的量，须足够对吸入的个体输递有效药量的组合物。因此，装入输递设备中的干粉形式的量，应对在储藏过程和输递过程中干粉形式组合物的损失有一定的补偿量。把干粉形式放在输递设备中以后，符合上述大小的粒子可悬浮形成气溶胶喷射剂。个体在吸药时，压缩的非水相悬浮剂就从输递装置中释放至该个体的气管道中。通过肺吸入法，输递装置可以将单剂份或多剂份的有效药量的组合物送至个体的肺中。气溶胶喷射剂可以是用于此目的的任何常规材料，比如氯氟碳化合物、氯氟烃、氟烃化合物、或烃类化合物，包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟甲烷、二氯四氟乙烷、和1，1，1，2-四氟乙烷，或这些物质的混合物。可在药物组合物中加入表面活性剂，以减少含有蛋白质的干粉在施放气雾剂的输递装置器壁上粘附。合适的表面活性剂包括(但不限于)山梨聚糖三油酸酯、大豆卵磷脂、和油酸。市售供应的适合用于肺部输递非水相悬浮型的蛋白质组合物的干粉形式的设备都有商品供应。这些设备包括，Ventolin型计量吸入器(Ventolin metered-dose inhaler)(Galxo Inc.，Research Triangle Park，NC)和Intal型吸入器(Fisons，Corp.，Bedford，MA)。其它的气雾输递设备还可以参见美国专利第5,522,378号、5,775,320号、5,934,272号和5,960,792号，在此全文收入以供参考。
药物组合物的固体或干粉形式以干粉形式被输递时，较佳可以使用干粉吸入器或其它合适的输递设备。药物组合物的干粉形式较佳的是制成可用合适的方法将其分散在流动的空气或其它生理上可接受的气流中使用的干粉气雾剂。市售的适合用本发明的方法使用的干粉吸入器有Spinhaler型粉末吸入器(Fisons Corp.，Bedford，MA)和Ventolin型Rotahaler(Glaxo，Inc.，Research Triangle Park，NC)。还可以参看WO 93/00951、WO 96/09085、WO 96/32152和美国专利第5,458,135号、5,785,049号和5,993,783号论述的干粉输递设备，在此全文收入以供参考。
含有IL-2或其变体的干粉状药物组合物可以重建成水溶液，以便随后以水溶液气雾剂的形式用喷雾器、计量吸入器或其它合适的设备进行输递。当用喷雾器时，储存在贮液槽中的水溶液被转变成水雾，每次给药时只会有一小部分离开喷雾器而输递入个体体内。多余的水雾又回到喷雾器的贮液槽中，在那里它重新雾化成水雾。这一过程重复进行直到贮液槽完全排空或是给药过程结束。商品供应的这类喷雾器包括，例如，Ultravent型喷雾器(Mallinckrodt Inc.，St.Louis，MO)和Acorn II型喷雾器(Marquest Medical Products，Englewood，CO)。其它的喷雾器还可以参看WO 93/00951，输递雾化的水相制剂的设备，可以参看美国专利第5,544,646号；在此全文收入以供参考。
任何IL-2药物组合物都可以用在本发明的方法中。这些药物组合物在这一技术领域中已为人所知，并已在美国专利第4,745,180号、4,766,106号、4,816,440号、4,894,226号、4,931,544号和5,078,997号中公开(不限于此)，在此全文收入以供参考。含有IL-2或其变体的液态的、冻干的或喷雾干燥的组合物以及这一技术领域已经知道的一些组合物可以被制成水相或非水相的溶液或悬浮液或干粉形式，以便以后通过肺吸入法对个体给药。其中每一种组合物都含有IL-2或其变体作为治疗或预防的有效组分。“治疗或预防的有效组分”是指在组合物中特别加入的IL-2或其变体，当对个体施用该药物组合物时，可在个体体内根据疾病的治疗、预防、或诊断情况产生所需的治疗或预防反应。较佳的是药物组合物含有合适的稳定剂、膨胀剂、或同时含有这两者，以减少在本发明肺部给药方法中进行冻干、喷雾干燥、和雾化处理时发生蛋白质稳定性和生物学活性降低等相关问题。
在本发明的一些优选的实施方案中，在本发明方法中有用的药物组合物是含有稳定的单体IL-2或其变体的组合物、含有多聚体IL-2或其变体的组合物、含有稳定的冻干的或喷雾干燥的IL-2或其变体的组合物、以及这里所提到的这些组合物的各种高吸收性形式。
含有稳定的单体IL-2或其变体的药物组合物已在于1999年10月4日归档的以“含有稳定性液态多肽的药物组合物”为题提出的临时申请中公开，并获得了美国临时申请序列号60/157696，该分开资料在此全文收入以供参考。“单体”IL-2是指这里所述的药物组合物中主要以单体形式存在而不是以聚合体的形式存在的各种蛋白质分子。所以不存在共价形式或疏水性寡聚物或聚合体形式的IL-2。简单地说，这类液态组合物中的IL-2或其变体是与一定数量的足以减少保存过程中产生的聚合形式的IL-2或其变体的氨基酸基团混合配制的。氨基酸基团可以是一种氨基酸或若干氨基酸的组合，这里任何给定的氨基酸要么以游离碱基的形式要么以盐的形式出现。优选的氨基酸选自精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。这些组合物还可含有缓冲剂，以保持液态组合物的pH在可接受的范围内，从而保证IL-2或其变体的稳定性，缓冲剂可以是基本上没有盐形式的酸、盐形式的酸、或是酸与其盐的混合物。优选的酸选自琥珀酸、柠檬酸、磷酸和谷氨酸。
组合物中的氨基酸碱基是用来稳定IL-2或其变体以避免液态药用组合物在保存过程中出现聚合体，在用基本上没有盐形式的酸、盐形式的酸、或是酸与其盐的混合物作为缓冲剂，可使液态组合物的渗透压接近于等渗。液态药物组合物中还可以另外添加其它的稳定剂，以进一步增加多肽的稳定性，最好是甲硫氨酸、非离子型表面活性剂(如聚山梨醇酯80)和EDTA。当添加氨基酸碱基和完全没有盐形式的酸、盐形式的酸、或是酸与盐的混合物时，这些液态药物组合物将变得稳定，结果显示，与没有添加这两种化合物的液态药物组合物相比，可提高其保存时的稳定性。
含有稳定的单体IL-2或其变体的这类液态药物组合物可以上述形式或以水相形式使用，也可制成固体或干粉形式后用在本发明的方法中。
在美国专利第4,604,377号中公开了关于含有多聚体人体IL-2或其变体的药物组合物的一些实施例，该分开资料在此全文收入以供参考。“多聚体”是指药物组合物中的蛋白质分子是以微团聚体的形式存在，平均10-50个分子组成一个分子缔合体。这类多聚体以松弛结合、物理相关性的IL-2分子出现。市场上有一种商标名为Proleukin(Chiron公司)的这些组合物的冻干形式供应。该参考资料中公开的冻干制剂中含有经选择的由微生物产生的氧化的重组人IL-2(“rhIL-2”)，其中重组IL-2与一种水溶性载体(如甘露醇)混合而形成膨胀剂，还加入了足够量的十二烷基硫酸钠以保证重组IL-2在水中的可溶性。这些组合物应能重建成水相注射剂以便肠道外投药，同时在病人体内要稳定且有良好的耐受性。重建时，IL-2或其变体要保持多聚体状态。这类含有多聚体IL-2或其变体的冻干的或液态的组合物，都可包含在本发明方法中。
含有IL-2或其变体的药物组合物可制成固体或干粉形式，以便随后以气雾剂输递，它最好是可以含有作为膨胀剂或稳定剂的载体物质。本发明以此方式公开了本发明方法中使用的含有IL-2或其变体的稳定性冻干的或喷雾干燥的药物组合物。这些组合物还可以含有至少一种膨胀剂、至少一种足量的在干燥过程中使蛋白质稳定的制剂，或两种都要。“稳定性”是指IL-2蛋白质或其变体在为获得固体或干粉形式的组合物而进行冻干或喷雾干燥后，能保持单体或多聚体的状态、以及品质、纯度、和药效等其它主要性状。
优选的作为膨胀剂使用的载体物质包括，甘氨酸、甘露醇、丙氨酸、缬氨酸或这些物质的不同组合物，最好是甘氨酸。制剂中膨胀剂的含量为0％-10％(w/v)，由所用试剂决定。若用甘氨酸作为膨胀剂，用量为约0％-4％，较好是约0.25％-3.5％，更好是约0.5％-3.0％，尤好是约1.0％-2.5％，最好是约2.0％。若用甘露醇作为膨胀剂，用量为约0％-5.0％，较好是约1.0％-4.5％，更好是约2.0％-4.0％，最好是约4.0％。若用丙氨酸或缬氨酸作为膨胀剂，用量为约0％-5.0％，较好是约1.0％-4.0％，更好是约1.5％-3.0％，最好是约2.0％。
优选的作为稳定剂使用的载体物质包括，任何糖类或糖醇或任何氨基酸。优选的糖类包括，蔗糖、海藻糖、棉子糖、水苏糖、山梨糖醇、葡萄糖、乳糖、右旋葡萄糖或这些物质的不同组合物，较好是蔗糖。若用糖作为稳定剂，用量为约0％-9.0％(w/v)，较好是约0.5％-5.0％，更好是约1.0％-3.0％，最好是约1.0％。若用氨基酸作为稳定剂，用量为约0％-1.0％(w/v)，较好是约0.3％-0.7％，最好是约0.5％。
这些冻干的或喷雾干燥的稳定性组合物可任选含有甲硫氨酸、乙二胺四乙酸(EDTA)或它们的盐类，比如EDTA二钠盐或其它的螯合剂，这些试剂可以防护IL-2或其变体被甲硫氨酸氧化。美国临时申请系列第60/157696号中论述了这些试剂的这种用法，在此全文收入以供参考。冻干的或喷雾干燥的稳定性药物组合物中甲硫氨酸的浓度为约0-10.0mM，较好是约1.0-9.0mM，更好的是约2.0-8.0mM，再好的是约3.0-7.0mM，尤好是约4.0-6.0mM，最好是约5.0mM。EDTA的浓度为约0-10.0mM，较好是约0.2-8.0mM，更好为约0.5-6.0mM，再好的是约0.7-4.0mM，尤好是约0.8-3.0mM，特好是约0.9-2.0mM，最好是约1.0mM。
冻干的或喷雾干燥的稳定性组合物可用缓冲剂配制，这样在液相时(比如，在配制过程中或后来将干粉形式的组合物重建时)可使药物组合物的pH值保持在合适的范围内。较好的pH值范围为约pH4.0-pH 8.5，更好的为约pH4.5-pH7.5，再好的是约pH5.0-pH6.5，更好是约pH5.6-pH6.3，最好是约pH5.7-pH6.2。合适的pH值包括约4.0、约4.5、约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、最高为约8.5，最好的是pH值约5.8。
合适的缓冲剂包括(但不限于)，柠檬酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂，优选柠檬酸钠/柠檬酸。可以用咪唑或组氨酸或其它能将pH值保持4.0-8.5的碱/酸。选择缓冲剂时，要注意它们要能经受干燥过程，且在制作与保存过程中不会影响蛋白的品质、纯度、药效、和稳定性。
本发明的一个实施方案中，冻干的或喷雾干燥的稳定性药物组合物中含有IL-2或其变体、(含量为)约0％-2.0％的甘氨酸、(含量为)约0％-9.0％的蔗糖、浓度为约0mM-10.0mM的甲硫氨酸、约0mM-10.0mM的EDTA，用约10.0mM柠檬酸钠/柠檬酸缓冲液使pH缓冲至约pH5.0-pH8.0的。在一个优选的实施方案中，在含有IL-2或其变体的冻干的或喷雾干燥的稳定性药物组合物中，再含有2.0％的甘氨酸、1.0％的蔗糖、5.0mM的甲硫氨酸、1.0mM的EDTA以及大于0％-约1.0％的聚山梨醇酯80，用10.0mM柠檬酸钠/柠檬酸缓冲液使pH缓冲至约pH6.0-pH7.0的。组合物中IL-2或其变体的浓度为约0.01mg/ml-1.0mg/ml，较好是约0.2mg/ml-0.8mg/ml，更好的是约0.3mg/ml-0.6mg/ml，最好是约0.3mg/ml-0.5mg/ml。
本发明方法中预期将使用的任何含有IL-2或其变体的药物组合物，还应配制至少一种足够量的表面活性剂以提高被吸入的含有IL-2或其变体的粒子的吸收性，从而可以获得本发明肺吸入方法中所用的高吸收性组合物。“高吸收性”是指用本发明的肺部施药方法所用的含有IL-2或其变体以及至少一种表面活性剂的药物组合物，与没有表面活性剂的含IL-2或其变体的对照制剂相比较，它们的生物利用率为要高约1.5-20倍，较好的为约1.6-17倍，更好为约1.7-15倍，再好为约1.8-13倍，尤好为约1.9-11倍，最好为约2.0-10倍。如下所述，以此方式所用的表面活性剂，可以提高吸入的IL-2或其变体的生物利用率。
这里公开的任何可以提高含有IL-2或其变体的药物组合物吸收率的表面活性剂，都可以用来获得高吸收性的含有蛋白质的药物组合物。能提高IL-2或其变体的吸收率的表面活性剂包括(但不限于)：聚氧乙烯山梨糖醇酯类，如聚山梨醇酯80(吐温80)和聚山梨醇酯20(吐温20)；聚氧丙烯-聚氧乙烯酯类如泊洛沙姆188；聚氧乙烯醇类如玻雷吉35；各种聚山梨醇酯与磷脂类的混合物，如磷酯酰胆碱及其衍生物(二棕榈酰、二油酰、二豆蔻酰或相应的混合衍生物，如1-棕榈酰、2-油酰等)、二豆蔻酰甘油和其它磷酸甘油类物质；溶血磷酯酰胆碱及其衍生物；多山梨醇酯与溶血卵磷脂或胆固醇的混合物；多山梨醇酯表面活性剂与山梨聚糖表面活性剂的混合物(如山梨聚糖单油酸酯、二油酸酯、三油酸酯或这一类的其它物质)；泊洛沙姆表面活性剂；胆酸盐类及其衍生物如胆酸钠、脱氧胆酸钠、脱氧甘胆酸钠、牛磺胆酸钠等；IL-2与胆酸盐和磷脂的混合胶粒；玻雷吉表面活性剂(如玻雷吉35-PEG923)月桂酰醇等。表面活性剂的添加量为约0.005％-1.0％(w/v)，较好为约0.005％-0.5％，更好的是约0.01％-0.4％，再好的是约0.03％-0.3％，最好是约0.05％-0.2％。
在一个实施方案中，高吸收性药物组合物中含有单体IL-2和足量的上述表面活性剂中的至少一种以提高吸入的IL-2的吸收率。这种组合物与含有稳定IL-2或其变体的高吸收性药物组合物是类似的，只是没有氨基酸碱基。
前面这些可以选择的稳定剂或膨胀剂和表面活性剂都可以加到药物组合物中一起制成固体或干粉形式。这种情况下，这些添加剂可以与IL-2或其变体同时形成粒子并作为它们的一部分。用这种方法制备时，每一单独粒子中IL-2或其变体的重量百分比为约0.01％-100％，较好是约0.1％-10％。粒子中其余部分主要是稳定剂，但也可含有缓冲剂和上述其它成分。或者，药物组合物中原来所没有的这类成分也可以单独制成干粉形式，然后再与药物组合物干粉混合以制备用作气雾剂的最终的干粉状组合物。
根据本发明的方法含有IL-2或其变体的水相或非水相溶液或悬浮液或固体或干粉形式的组合物是以气雾剂或其它适合肺吸入法方式的制剂对个体给药。“个体”是指任何动物。较好的是个体为哺乳动物，最好的是人类。除了人类以外，特别重要的哺乳动物有(但不限于)，狗、猫、牛、马、羊和猪。
当用药的目的是处置疾病时，用药可以分为预防目的和治疗目的。如果以预防为目的，应在任何症状出现之前就给药。预防性给药的目的是防止或减弱任何以后的症状的出现。如果以治疗为目的，则应在症状发作时(或症状出现后即刻)给药。治疗性给药是为了减弱任何已有症状。
本发明还提供了一种提高经肺吸入法施用的IL-2或其变体的生物利用率的方法。该方法包括，制备这里所说的高吸收性组合物作为气雾剂或其它合适制品，并通过肺吸入法将气雾剂或其它合适制品施于个体体内。“生物利用率”是指，经肺部施用IL-2或其变体后，通过肺组织进入血流的IL-2或其变体的吸收量，与静脉注射(绝对生物利用率)或皮下注射(相对生物利用率)后血行中的IL-2或其变体的量的比值。在对个体用药之前先在含有IL-2或其变体的药物组合物中加入表面活性剂，可以提高吸入的IL-2或其变体的生物利用率。
对于本发明的目的，可以用气管内(IT)技术决定含有IL-2的药物组合物的生物利用率(Niven等(1994)Pharm.Res.12：1142-1149；Niven等(1995)Pharm.Res.12：1889-1895)。为此，用注射器将含有IL-2制剂的溶液注入哺乳动物，可直接打进气管(IT)、或直接打进静脉(IV)，或者皮下注射(SC)。每隔一段时间采集血液并分析IL-2的存在情况。可通过IT(或SC)给药对比IV给药(绝对生物利用率)或IT对比SC给药(相对生物利用率)后以剂量标准化的曲线下面积(AUC)的比值估算出生物利用率，在下面的各实施例中作了详细描述。
这里说的本发明方法所用的药物组合物中的IL-2，可以是原先的，也可以是通过重组技术获得的，它可以来自于任何来源，包括哺乳类源如，大鼠、大鼠、家兔、灵长类动物、猪和人类。较好的是这类多肽来自人类，更好的是来源于微生物宿主的人类蛋白质重组体。
本发明方法可用的药物组合物中可含有IL-2的生物活性变体。这类变体应保留原生的多肽的所需的生物学活性，当对个体用药时，含有这种变体多肽的药物组合物和含有原生多肽的药物组合物应当具有同样的疗效。即变体多肽能够以与原生多肽同样的方式，在药物组合物中作为治疗用的活性成分。本领域有一些办法可以检测变体多肽是否保留所需的生物学活性，以及是否可以在药物组合物中作为治疗用的活性成分。可以用专门设计的用于检测原生多肽或蛋白质活性的方法(包括本发明中提到的试验方法)检测其生物学活性。另外，也可以测试抗有生物学活性的原生多肽而产生的抗体与变体多肽的结合能力，如能有效结合就说明此多肽含有与原生多肽相类似的结构。
合适的原生的或自然产生的IL-2的有生物学活性的变体，可以是这种多肽的片段、类似物和衍生物。“片段”是指仅含有完整多肽序列和结构一部分的多肽，可以是原生多肽的C末端缺失或N末端缺失。“类似物”是指原生多肽或原生多肽片段的类似物，这种类似物中含有一个或多个氨基酸被取代、插入或缺失的原生多肽序列和结构。像这里所说的“突变蛋白质”以及有一个或多个类肽(肽的模拟物)的肽类都包含在类似物这一术语中(见WO 91/04282)。“衍生物”是指对相关的原生多肽、原生多肽的片段、或其各自的类似物(如糖基化、磷酸化、与聚合物共轭(比如与聚乙二醇))的任何合适的修饰物或加入其它的外源分子部分，只要所需的原生多肽的生物学活性仍然保留即可。制作多肽片段、类似物和衍生物的方法，在这一技术领域中是可随时提供的。
例如，多肽的各种氨基酸序列的变异体，可以由克隆的可编码相关的原生多肽的DNA序列经突变而制备。诱变和改变核苷酸序列的方法在这一技术领域中已熟知的。例如，可以参看Walker和Gaastra编的(1983)Techniques in MolecularBiology(MacMillan Publishing Company，New York)；Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492；Kunkel等(1987)MethodsEnzymol.154：367-382；Sambrook等(1989)Molecular Cloning：A LaboratoryManual(Cold Spring Harbor，New York)；美国专利第4,783,192号；以及这其中所引用的资料；在此全文收入以供参考。在Dayhoff等人(1978)Atlas of ProteinSequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.)一书的模式中可找到不影响目的多肽生物学活性的适当的氨基酸取代方法的指导。在此全文收入以供参考。优选保守性取代方法，比如，将一种氨基酸用另一种性质类似的氨基酸替换。保守性取代方法包括(但不限于)，GlyAla、ValIleLeu、AspGlu、LysArg、AsnGln和PheTrpTyr。
在合成目的IL-2多肽的变体时，需经过修饰以使变体能继续保持所需的活性。显然，在可编码变体多肽的DNA上发生的任何突变，其序列都不得超出阅读框，且最好不要形成互补区域，以免产生次级mRNA结构。参见欧洲专利申请公报第75,444号。
IL-2的各种生物学活性变体通常有至少70％，较好的至少有80％，更好的有约90％-95％或更多，最好的有约98％或更多的氨基酸序列与参考多肽分子(这作为比较的基础)的氨基酸序列是同一性的。目的原生多肽的有生物学活性的变体与原生多肽之间只有少到1-15个氨基酸的差别，也可能少到1-10个(比如6-10个)，少到5个、4个、3个、2个，甚至一个氨基酸残基的差别。“序列同一性”是指，当将变体中特定的邻接的氨基酸序列片段与参考分子的氨基酸序列并列比较时，在变体多肽与作为参考的多肽分子内发现的相同的氨基酸残基。通过确定两个序列中出现相同氨基酸残基的位点的数目从而得到匹配位点的数目，将匹配位点的数目除以与参考分子相比的片段中总位点的数目，再将结果乘以100，就可以计算出两个氨基酸序列之间序列同一性的百分比。
为使两个序列达到最优化的排比，与参考分子的氨基酸序列相比，变体氨基酸序列的邻接片段可以含有附加的氨基酸残基或缺失氨基酸残基。用于和参考氨基酸分子比较的邻接片段，可包含至少20个邻接的氨基酸残基，也可以有30、40、50、100或更多的残基。通过分配缺口损失可对与各种变体氨基酸序列内的缺口相关的增多的序列同一性进行修正。序列排比的方法在氨基酸序列技术领域和可编码氨基酸序列的核苷酸序列技术领域中广为人知。
因此，用数学算法可以确定任何两个序列间同一性的百分比。一个优选的、非限制性的用于序列比较的的数学算法的实施例是Myers和Miller算法(1988)CABIOS 4：11-17。这一算法被用在ALIGN程序中(2.0版)，这是GCG序列排比软件包的一部分。当比较氨基酸序列时，在ALIGN程序中可以使用PAM120重量残留表(PAM120 weight residue table)、缺口长度损失为12和缺口损失为4。另一个优选的、非限制性的用于序列比较的数学算法的实施例是，Karlin和Altschul算法(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264，经Karlin和Alt schul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877的改进法。这一算法包含在Alschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403的NBLAST和XBLAST程序中。用NBLAST程序，可以完成BLAST核苷酸查找，以score＝100、wordlength＝12可以得到与可编码目的多肽的核苷酸序列同源的核苷酸序列。用XBLAST程序可以完成BLAST蛋白质查找，以score＝50、wordlength＝3可以得到与目的多肽同源的氨基酸序列。为获得对形成的缺口排比以供比较，可以用如Altschul等(1997)Nucleic AcidsRes.25：3389中所描述的对形成的缺口的BLAST。或者也可以用PSI-Blast来完成反复查找，这样可以发现分子间的远缘关系。可参见Altschul等(1997)，NucleicAcids Res。当使用BLAST、形成缺口的BLAST和PSI-Blast程序时，可以使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的各默认参数。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。也可参见ALIGN程序(Dayhoff(1978)载：Atlas ofProtein Sequence and Structure 5：增刊.3(National Biomedical ResearchFoundation，Washington，D.C.))和Wisconsin Sequence Analysis Package第8版(来自于Genetics Computer Group，Madi son，Wisconsin)中的各项程序，例如，使用了各项程序的默认参数的GAP程序。
当考查氨基酸序列同一性的百分比时，某些氨基酸残基的位置可以因保守性氨基酸取代方法的结果而不同，这并不会影响蛋白质的功能的性质。在这些实例中，百分序列同一性可以向上调整以解释保守性取代的氨基酸中的相似性。这种调整已是这一技术领域所熟知的。例如，可以参见Myers和Miller(1988)ComputerApplic.Biol.Sci.4：11-17。
多肽的精细化学结构依赖于许多因素。当分子中出现离子化的氨基和羧基时，一个具体的多肽可以酸性盐或碱性盐或中性的形式获得。所有这些放置在合适环境条件下可保持其生物活性的制品，都可包括在这里所使用的多肽的定义。另外，多肽的原始氨基酸序列可以用糖的分子部分(糖基化作用)或其它补加的分子如脂质类、磷酸盐、乙酰基或类似物通过衍生化作用而增大。也可以与糖类结合而增大。通过生产者的跨国后制造体系(post-transnational processing systems)可以实现这种增大过程的某些方面；其它的这类修饰可以引入活体内进行。无论如何，只要多肽的活性没有被破坏，这类修饰就都可包括在这里所使用的多肽的定义内。预期在不同的试验方法中，这类修饰可对活性有质量上或数量上的影响，提高或降低多肽的活性。另外，在分子链中的单个氨基酸残基可以通过氧化、还原或其它的衍生化作用来修饰，许多肽就会被裂解而获得保持活性的一些片段。这种不破坏活性的改变，还不至于没有将这种多肽序列从这里所使用的目的多肽的定义中排除。
本发明提供了关于制备和使用多肽变体的实质性指导。在制备IL-2变体时，本领域的技术之一是能很容易确定对原生蛋白质核苷酸或氨基酸序列作何种修饰，才会产生一种适用于本发明的方法中作为药物组合物具有治疗活性的组分的变体。
用在本发明方法中的IL-2或其变体和本发明的组合物可以来自任何来源，但较好的是重组体IL-2。“重组体IL-2”是指生物学活性与原生序列IL-2相当的白细胞介素-2，它是用如Taniguchi等(1983)Nature 302：305-310和Devos(1983)Nucleic Acids Research 11：4307-4323所述的重组DNA技术，或是用如Wang等(1984)Science 224：1431-1433所述的突变的IL-2制备的。通常，编码IL-2的基因可被克隆然后在转化的生物中表达，较好的是微生物，最好是像这里所描述的大肠杆菌。在各种表达条件下宿主生物可表达外源基因而产生IL-2。合成重组体IL-2也可以在真核原生中制成，如酵母或人类细胞。生长、收获、分裂、或从细胞中提取IL-2的过程，主要(例如)美国专利第4,604,377；4,738,927；4,656,132；4,569,790；4,748,234；4,530,787；4,572,798；4,748,234和4,931,543号中都有描述，在此全文引入以供参考。
变体IL-2蛋白质的一些实施例，可以参看欧洲专利申请第136,489号；提交于1983年2月3号的欧洲专利申请第83101035.0号(以公布号91539发表于1983年10月19号)；提交于1982年12月22号的欧洲专利申请第82307036.2号(以公布号88195发表于1983年9月14号)；提交于1983年10月13号的欧洲专利申请第83306221.9号(以公布号109748发表于1984年5月30号)所描述的重组体IL-2突变蛋白质与比利时专利第893,016号和同时拥有的美国专利第4,518,584号是相同的；美国专利第4,752,585号和W0 99/60128所描述的突变蛋白质；以及这里的各实施例中使用的和美国专利第4,931,543号所描述的IL-2突变蛋白质；以上所述在此全文引入以供参考。此外，IL-2也可被聚乙二醇修饰以获得较高的溶解性和改变了的药物动力学特征。(参见美国专利第4,766,106号，在此全文引入以供参考)
下面提供的一些实施例只是进行阐述而不是对本发明进行限制。
实验
IL-2是一种潜在的促细胞分裂剂，它可以刺激T-细胞的增殖。它有广泛的治疗方面的应用，可用于癌扩散作为癌症治疗的辅助剂、以及用于传染病的联合剂。随着采用IL-2治疗的各种临床试验的发展，人们认识到需要有一些可选择非侵入性的给药途径。
几种含有重组人IL-2(“rhIL-2”)的药物制剂，在肺部给药方面的潜在功效已经得到了评价。已测试的制剂包括Proleukin，一种由Chiron公司生产最近上市的用于治疗转移性肾细胞癌或转移性黑色素瘤的冻干的rhIL-2制剂。它还被用在治疗HIV传染患者的III期试验中。用注射用水(WFI)重建后，它含有0.05-2.0mg/ml的rhIL-2，3-7％的甘露醇，5.0-20.0mM的磷酸钠，大约130-230μgSDS/mlrhIL-2，pH5.5-8.0。制剂中的IL-2以平均为10-50个分子的分子络合物微聚体的形式存在。其聚集作用可能会影响肺吸过程。
共同拥有的美国临时申请系列第60/157696号公开的一种新发展的稳定性液态IL-2制剂也已进行了测试。在这组研究中该液态IL-2制剂指定是用单体rhIL-2。与Proleukin制剂不同的是，这种液态制剂中的rhIL-2分子以稳定的单体形式存在。这种制剂含有0.03-3.0mg/mlrhIL-2、150-300mM L-精氨酸碱基、50-150mM琥珀酸、0.5-5.0mM EDTA二钠、1.0-10.0mM甲硫氨酸和0.05-0.2％聚山梨醇酯80(吐温80)，pH5.0-8.0。据推测，这种稳定性单体IL-2制剂通过深层肺表面的吸收比多聚体Proleukin制剂要好。此外，制剂中使用的氨基酸和聚山梨醇酯80可能为肺部输递方法带来其它的好处，比如，可提高IL-2通过肺组织的吸收。
与皮下注射相比，采用气管内大鼠模型评价了这些IL-2制剂的相对肺部生物利用率。通过气管内滴注法(IT)或皮下(SC)注射法对Sprague-Dawley大鼠施用两种IL-2制剂。每次IT给药时，先用异氟烷或CO2/O2的混合物将动物麻醉，然后将它以胸骨位或仰式保定。所有通过IT给药的各IL-2剂份都用导管或圆顶注射针用1-mL消毒的一次性注射容滴注。经IT给药后，使将动保持仰式位大约20秒钟以使注入的溶液进入肺中。在预定的时间间隔收集这些大鼠的血液样品加肝抗凝。分离血液样品的血浆并用免疫测定法分析IL-2的浓度。
用大鼠进行气管内、皮下、或静脉内输递后，通过四项研究评价了Proleukin和单体IL-2制剂的全身性生物利用率。各单体制剂根据是否含有聚山梨醇酯80(吐温80)和/或精氨酸而各不相同。研究中得到的血浆IL-2浓度的分布显示在图1-4中。各项药物动力学参数被分别研究归纳在表1-4中。计算了每种制剂全身性吸收剂量的比例，作为IT对比SC给药(相对生物利用率)或SC(或IT)对比IV给药(绝对生物利用率)后的剂量标准的AUC率。对于没有相应的SC给药的某些单体制剂进行的研究，根据以前的经验，这些单体制剂的SC AUC是类似的，可通过类似的单体制剂用SC输递的AUC来计算相对生物利用率。
表1：8只大鼠(4/性别)中Proleukin制剂IT或SC给药后的PK参数a
  途径   平均BW(g) 每个动物的剂量(μg)   Cmax(ng/ml)    Tmax(小时)     t1/2(小时)     AUC(0-无穷大)(ng-小时/ml)    R.B.(IT/SC)(％)
  IT   319 750   19     2     3.7     80    14
  SC   327 150   43     1     1.1     118
a表格中使用的符号：IT代表气管内给药，SC代表皮下给药，BW代表身体重量，Cmax指测得的血浆IL-2浓度的最大值，Tmax指Cmax的时间，t1/2指清除了一半的时间，AUC是血浆IL-2对时间的曲线下的面积，R.B.是通过在剂量标准化后将IT的AUC除以SC的AUC，再将结果乘以100所得的以百分率为基础的相对生物利用率。
表2：8只大鼠(4/性别)中稳定性单体rhIL-2制剂(含聚山梨醇酯80)经IT或SC给药后的PK参数a
  途径   平均BW(g)   每个动物的剂量(μg)    Cmax(ng/ml)     Tmax(小时)     t1/2(小时) AUC(0-无穷大)(ng-小时/ml)    R.B.(IT/SC)(％)
  IT   311   375    202     1.5     0.6 482    146
  SC   320   75    26     0.5     1.3 66
a表格中使用的符号：IT代表气管内给药，SC代表皮下给药，BW代表身体重量，Cmax指测得的血浆IL-2浓度的最大值，Tmax指Cmax的时间，t1/2指清除了一半的时间，AUC是血浆IL-2对时间的曲线下的面积，R.B.是通过在剂量标准化后将IT的AUC除以SC的AUC，再将结果乘以100所得的以百分率为基础的相对生物利用率。
表3：8只大鼠(4/性别)中含或不含聚山梨醇酯80(吐温80)的单体rhIL-2制剂经IT、SC或IV给药后的PK参数a
  吐温(SC/IV)   途径   平均BW(g)   每个动物的剂量(μg)   Cmax(ng/ml)   Tmax(小时)    AUC(0-无穷大)(ng-小时/ml)   R.B.(IT/SC)(％)     A.B.(SC/IV)(％)
  +   IT   ～320   375   190   0.5   327   90b
  -   IT   ～320   375   51   0.2   88   24
  -   SC   ～320   150   72   0.5   145     10
  -   IV   ～320   150   4238   0   1532
a表格中使用的符号：IT代表气管内给药，SC代表皮下给药，BW代表身体重量，Cmax指测得的血浆IL-2浓度的最大值，Tmax指Cmax的时间，t1/2指清除了一半的时间，AUC是血浆IL-2对时间的曲线下的面积，R.B.是通过在剂量标准化后，将IT的AUC除以SC的AUC计算所得的相对生物利用率，A.B.是通过在剂量标准化后，将SC的AUC除以IV的AUC，再将结果乘以100计算所得的以百分率为基础的相对生物利用率。
b用不含聚山梨醇酯80的单体制剂的SC的AUC计算的含有聚山梨醇酯80的单体制剂的相对生物利用率。
表4：4只雄性大鼠中用含有聚山梨醇酯80和精氨酸的单体rhIL-2制剂、不含聚山梨醇酯80的单体制剂和不含精氨酸的单体制剂经IT、SC或IV给药后的PK参数a
制剂 途径 平均BW(g) 每个动物的剂量(μg)   Cmax(ng/ml)   Tmax(小时)     AUC(0-无穷大)(ng-小时/ml)   R.B.(IT/SC)(％)     A.B.(SC/IV)(％)
单体b IT ～400 400   441   0.5     697   185
单体 SC ～400 ～200   156   0.5     188     15
单体 IV ～400 ～200   14068   0     1250
无吐温80c IT ～400 400   176   0.17     298   79d
无精氨酸e IT ～400 400   637   0.17     530   141d
a表格中使用的符号：IT代表气管内给药，SC代表皮下给药，BW代表身体重量，Cmax指测得的血浆IL-2浓度的最大值，Tmax指Cmax的时间，t1/2指清除了一半的时间，AUC是血浆IL-2对时间的曲线下的面积，R.B.是通过在剂量标准化后将IT的AUC除以SC的AUC所得的相对生物利用率，A.B.是通过在剂量标准化后将SC的AUC除以IV的AUC再将结果乘以100所得的以百分率为基础的相对生物利用率。
b含有0.1％聚山梨醇酯80和230mM精氨酸的制剂
c含有230mM精氨酸的制剂
d用不含聚山梨醇酯80的单体制剂SC的AUC计算的不含聚山梨醇酯80的单体制剂的相对生物利用率。
e含有0.1％聚山梨醇酯80的制剂
以上这些关于IL-2通过这些给药途径的全身性吸收的数据，可归纳如下。相对SC给药，IT给药后Proleukin的相对生物利用率为14％(表1)。经IT输递后，含有聚山梨醇酯80的单体IL-2的吸收明显好于Proleukin。SC对比IV的绝对生物利用率是15％(表4)，而IT对比SC的相对生物利用率则平均为140％(表2、3、4)，这说明IT给药的吸收与SC给药相当或更好。含有聚山梨醇酯80但不含精氨酸的单体IL-2的吸收与同时含有聚山梨醇酯80和精氨酸的单体IL-2相当(表4)。不含聚山梨醇酯80的单体IL-2的吸收好于Proleukin，但不如含有聚山梨醇酯80的单体IL-2。其绝对生物利用率为10％(表3)、相对生物利用率为52％(表3、表4)。
进行第五项研究是为了进一步研究低浓度的聚山梨醇酯80(吐温80)和其它表面活性剂(0.1％泊洛沙姆188(以商品名Pluronic F68销售，BASF制造)和PEG4600(平均分子量为4600的聚乙二醇，购自Aldrich))对气管内(IT)给药的Proleukin和单体IL-2的生物利用率的影响。
像以前的研究一样，在第五项研究中，雄性Sprague-Dawley大鼠被分成相应的试验组(4只/组)。每只大鼠接受一剂400μg剂量的rhIL-2。用上述其它四项试验的方法进行IT给药。在预定的时间间隔收集所有大鼠的血液样品并用肝素处理。分离血液样品的血浆并用免疫测定法分析IL-2的浓度。
单体制剂会随着与所有被测单体制剂中含有的230mM精氨酸一起使用的表面活性剂的类型和用量而变化。Proleukin制剂则与是否含有0.1％的浓度的聚山梨醇酯80而不同。各Proleukin制剂都不使用精氨酸。
研究得出的血浆IL-2浓度分布显示在图5中。每种制剂经IT给药的血浆浓度-时间曲线下的面积(AUC)显示在表5中。Proleukin和单体制剂的相对生物利用率，是以百分率为基础、用特定制剂的AUC与含0.1％聚山梨醇酯80(吐温80)的参照单体制剂的AUC相比较计算的，结果显示在表5中。
表5：气管内以400μg rhIL-2/动物剂量施用的各种制剂的生物利用率的比较
 制剂     AUC(ng-小时/ml)     相对生物利用率(对单体IT的％)
 单体(0.1％吐温80)*     664     100
 单体(0.03％吐温80)     503     76
 单体(0.01％吐温80)     637     96
 单体(0.001％吐温80)     668     101
 单体(0.1％泊洛沙姆188)     724     109
 单体(0.1％PEG 4600)     596     90
 Proleukin(无吐温80)     28.4     4
 Proleukin(0.1％吐温80)     86.2     13
*用于计算相对生物利用率的参照制剂
上表的数据显示，在IT给药的Proleukin的全身性吸收中，聚山梨醇酯80的存在可能起着一定的作用。数据同时显示，用泊洛沙姆188、PEG 4600、0.1％聚山梨醇酯80和0.001％聚山梨醇酯80制备的单体rhIL-2的生物利用率是类似的。含0.1％聚山梨醇酯80和精氨酸的单体制剂的生物利用率，则要高于含0.1％聚山梨醇酯80的Proleukin制剂。
说明书中提到的所有的出版物和专利申请，都体现了本发明所属领域的熟练技术人员的水平。在此将所有的出版物和专利申请全文引入以供参考，与特别和单独指定每一种出版物和专利申请以引入参考是同等程度的。
尽管为了便于理解而用图表和实施例对上述发明作了较详细的描述，但在附件权利要求书的范围内显然仍可实行某些改变和修饰。

Claims (12)

1.包含能引起T-细胞增殖的IL-2的药物组合物在制备用肺吸入法向所述个体输递的药物中的应用，其中所述的药物组合物还包含以游离碱形式或以盐形式出现的氨基酸基团，所述的氨基酸基团是赖氨酸，所述氨基酸基团的存在量为足以降低所述IL-2在保存所述组合物的过程中出现聚合体的量，其中所述的组合物为水相或非水相的溶液、水相或非水相的悬浮液、或干粉形式。
2.根据权利要求1所述的应用，其中所述的IL-2是稳定的单体IL-2。
3.根据权利要求1所述的应用，其中所述的IL-2是多聚体IL-2。
4.根据权利要求1，2或3所述的应用，其中所述的组合物是一种水相形式。
5.根据权利要求1，2或3所述的应用，其中所述的组合物是一种干粉形式，其中所述的干粉形式选自冻干形式或喷雾干燥形式。
6.根据权利要求1，2或3所述的应用，其中所述的溶液或悬浮液由喷雾器或计量吸入器输递。
7.根据权利要求1，2或3所述的应用，其中所述的干粉形式由计量吸入器或干粉吸入器输递。
8.根据权利要求7所述的应用，其中所述的干粉形式由平均直径小于10μm的粒子组成。
9.根据权利要求8所述的应用，其中所述粒子的平均直径在1-5μm之间。
10.根据权利要求1，2或3所述的应用，其中所述的组合物是高吸收性组合物，此外还含有至少一种足够量的表面活性剂以在肺吸入所述组合物后提高所述组合物的吸收。
11.根据权利要求10所述的应用，其中所述的表面活性剂选自聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80。
12.根据权利要求11所述的应用，其中所述的表面活性剂是聚山梨醇酯80。
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