JP5798628B2

JP5798628B2 - ウシ顆粒球コロニー刺激因子のための製剤およびその変異体

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Publication number: JP5798628B2
Application number: JP2013530298A
Authority: JP
Inventors: フアン・ダバニーノ; キャサリン・ニャン・カー; アラン・ボスキャンプ・クロッツ
Original assignee: イーライリリーアンドカンパニー
Priority date: 2010-09-23
Filing date: 2011-09-22
Publication date: 2015-10-21
Anticipated expiration: 2031-09-22
Also published as: BR112013005697B1; ES2540862T3; UA110799C2; WO2012040421A1; KR20150061030A; DK2618830T3; HK1183247A1; PL2618830T3; US11273202B2; US20220152155A1; ME02103B; AU2011305386B2; KR20130055665A; HRP20150476T1; ZA201301208B; CA2812704A1; CR20130067A; TW201305194A; PE20131339A1; CN103096916B

Description

本発明は、ウシ顆粒球コロニー刺激因子のための製剤およびその変異体に関する。

顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）は、成長ホルモン超遺伝子ファミリーのメンバーである。Ｇ−ＣＳＦは、特定の骨髄前駆細胞の増殖およびそれらの顆粒球への分化を刺激する。更に、Ｇ−ＣＳＦは、インビボでの好中球の増殖および成熟に対する強い刺激である（非特許文献１；非特許文献２もまた参照のこと）。Ｇ−ＣＳＦはまた、インビトロでの成熟好中球の機能的活性化または「プライミング」を誘導することができる（非特許文献３）。Ｇ−ＣＳＦは、ヒト顆粒球にプライミングし、走化性ペプチドＮ−ホルミル−メチオニル−ロイシル−フェナルアラニンにより刺激される超酸化物放出を促進し（非特許文献４および非特許文献５）、ヒト好中球ＩｇＡ媒介食作用を活性化する（非特許文献６）ことが示されている。

Ｇ−ＣＳＦは、好中球が増加する兆候の処置に有用であり、利益をもたらすことが見出されている。Ｇ−ＣＳＦはまた、例えば骨髄移植について、培養液中の細胞の増殖または拡大に対して、単体または他の化合物（例えば他のサイトカイン）との組み合わせでも有用である。

組み換えヒトＧ−ＣＳＦ（ｈＧ−ＣＳＦ）のｃＤＮＡクローニングおよび発現が説明されており、また、組み換えｈＧ−ＣＳＦは、天然分子の生物学的特性の大部分を、全部ではないが示している（非特許文献７）。ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡのクローンの配列解析は、アミノ酸配列を差し引き、タンパク質が、３０アミノ酸のシグナル配列を含む２０４アミノ酸長であることを明らかにしている。成熟タンパク質は、１７４アミノ酸長であり、有効なＮ結合糖鎖付加部位を有さないが、０結合グリコシル化のためのいくつかの候補部位を有する。

ｈＧ−ＣＳＦを含有する医薬品は当該技術分野で公知であり、多数の製剤が挙げられる。例えば、ｈＧ−ＣＳＦの種々の製剤は、非特許文献８、非特許文献９、Ｍｉｃｈａｅｌｉｓらの特許文献１、および、Ｓａｔｏらの特許文献２に説明されている。従来、界面活性剤は、ｈＧ−ＣＳＦ製剤中に含まれ、潜在的に不安定な接触面でのｈＧ−ＣＳＦを、処理中の接触面に対して、および、その立体配座の安定性の変更に対して、保護し得る。

組み換えウシＧ−ＣＳＦ（ｂＧ−ＣＳＦ）のｃＤＮＡクローニングおよび発現もまた説明されている。例えば、成熟ｂＧ−ＣＳＦのポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、特許文献３に記載されており、この特許文献３はまた、ポリペプチドおよびその類似体をクローニングし、単離し、精製する方法を説明している。成熟ｂＧ−ＣＳＦは、１７４アミノ酸長であり、ｈＧ−ＣＳＦに対して８２％の相同性を有する。上記非特許文献２は、ｂＧ−ＣＳＦの発現、精製、および、生物学的活性を説明している。

畜牛へのｂＧ−ＣＳＦの投与は、治療的有用性を提供することができる。従って、ｂＧ−ＣＳＦを含有する医薬製剤は、その治療可能性を利用することが望ましい。しかしながら、当該技術分野で公知の典型的な方法に従って開発されたｂＧ−ＣＳＦ医薬製剤は、望ましくない製品の特性、例えば、ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドおよび／または製剤の凝集および不安定化をもたらす。

米国特許第５，９１９，７５７号明細書米国特許第６，９０８，６１０号明細書米国特許第５，８４９，８８３号明細書

Ｃｏｈｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９８７；８４：２４８４−２４８８Ｈｅｉｄａｒｉら，Ｖｅｔ．Ｉｍｍｏｌ．Ｉｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．２００１；８１：４５−５７Ｗｅｉｓｂａｒｔ，Ｒ．Ｈ．ら，ＡｎｎａｌｓｏｆＩｎｔｅｒｎａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ１９８９；１１０：２９７−３０３Ｓ．Ｋｉｔａｇａｗａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９８７；１４４：１１４３−１１４６Ｃ．Ｆ．Ｎａｔｈａｎ，Ｂｌｏｏｄ１９８９；７４：３０１−３０６Ｗｅｉｓｂａｒｔ，Ｒ．Ｈ．ら，Ｎａｔｕｒｅ１９８８；３３２：６４７−６４９Ｓｏｕｚａ，Ｌ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３２，６１−６５（１９８６）Ｐｉｅｄｍｏｎｔｅら，ＡｄｖａｎｃｅｄＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＲｅｖｉｅｗｓ，６０：５０−５８（２００８）Ｈｅｒｍａｎら，ｉｎＦｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄＳｔａｂｉｌｉｔｙｏｆＰｒｏｔｅｉｎＤｒｕｇｓ，ＲｏｄｎｅｙＰｅａｒｌｍａｎａｎｄＹ．ＪｏｈｎＷａｎｇ，ｅｄｓ．，ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９６）

よって、望ましい特性、例えば、最小限の製剤凝集および不安定特性などの、安定ｂＧ−ＣＳＦ医薬製剤が必要とされている。従って、本発明は、望ましい特性を示しかつ関連する利点も提供するｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体を有する安定水性医薬製剤を提供する。

本発明は、ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体、緩衝物質、および、賦形剤を含む安定水性製剤を提供する。ここで、前記製剤は、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートを実質的に含まない。本発明はまた、前記製剤の凍結乾燥形態または粉末形態を用いる方法、および前記製剤を調製するためのプロセスを提供する。

本発明にかかるウシ顆粒球コロニー刺激因子（「ｂＧ−ＣＳＦ」）の安定水性製剤は、ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体を含む。本願明細書において、「ウシＧ−ＣＳＦポリペプチド」（あるいは、「ｂＧ−ＣＳＦポリペプチド」、「ウシＧ−ＣＳＦ」または「ｂＧ−ＣＳＦ」と呼ぶ）およびその変異体は、それらのポリペプチドおよびタンパク質を含み得、これらは、生物活性が同じであるかに関わらず、また更にその合成または製造の方法に関わらず、ＣＳＦ、ｂＧ−ＣＳＦ類似体、ｂＧ−ＣＳＦ変異体、改変グリコシル化ｂＧ−ＣＳＦ、ＰＥＧ結合ｂＧ−ＣＳＦ、ｂＧ−ＣＳＦアイソフォーム、Ｇ−ＣＳＦ模倣物、ｂＧ−ＣＳＦ断片、ハイブリッドｂＧ−ＣＳＦタンパク質、融合タンパク質、オリゴマーおよびマルチマー、同族体、糖鎖付加パターン変異体、変異体、スプライス変異体、および、その突然変異タンパク質のうち少なくとも１つの生物活性を有する。その合成または製造の方法としては、これらに限定されないが、核酸分子のマイクロインジェクション、合成方法、トランスジェニック方法、および遺伝子活性化方法による、インビトロ、インビボでの（ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは核酸の他の形態から生成されるかに関わらず）組み換えが挙げられる。加えて、用語ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体は、１つ以上のアミノ酸置換、付加または欠失を含むｂＧ−ＣＳＦポリペプチドを包含する。ウシＧ−ＣＳＦの類似体の例として米国特許５，８４９，８８３号明細書を参照のこと。成熟ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドの配列は、以下のように１７４アミノ酸長である。

ＴＰＬＧＰＡＲＳＬＰＱＳＦＬＬＫＣＬＥＱＶＲＫＩＱＡＤＧＡＥＬＱＥＲＬＣＡＡＨＫＬＣＨＰＥＥＬＭＬＬＲＨＳＬＧＩＰＱＡＰＬＳＳＣＳＳＱＳＬＱＬＴＳＣＬＮＱＬＨＧＧＬＦＬＹＱＧＬＬＱＡＬＡＧＩＳＰＥＬＡＰＴＬＤＴＬＱＬＤＶＴＤＦＡＴＮＩＷＬＱＭＥＤＬＧＡＡＰＡＶＱＰＴＱＧＡＭＰＴＦＴＳＡＦＱＲＲＡＧＧＶＬＶＡＳＱＬＨＲＦＬＥＬＡＹＲＧＬＲＹＬＡＥＰ

更に、初期メチオニンアミノ酸残基を有するｂＧ−ＣＳＦポリペプチドは以下に示すとおりである。

ＭＴＰＬＧＰＡＲＳＬＰＱＳＦＬＬＫＣＬＥＱＶＲＫＩＱＡＤＧＡＥＬＱＥＲＬＣＡＡＨＫＬＣＨＰＥＥＬＭＬＬＲＨＳＬＧＩＰＱＡＰＬＳＳＣＳＳＱＳＬＱＬＴＳＣＬＮＱＬＨＧＧＬＦＬＹＱＧＬＬＱＡＬＡＧＩＳＰＥＬＡＰＴＬＤＴＬＱＬＤＶＴＤＦＡＴＮＩＷＬＱＭＥＤＬＧＡＡＰＡＶＱＰＴＱＧＡＭＰＴＦＴＳＡＦＱＲＲＡＧＧＶＬＶＡＳＱＬＨＲＦＬＥＬＡＹＲＧＬＲＹＬＡＥＰ

ｂＧ−ＣＳＦにおけるアミノ酸位置の多種多様な置換が説明されている。置換は、これらに限定されないが、薬剤安定性を調節し、アゴニスト活性を増加させ、プロテアーゼ抵抗性を増加させ、ポリペプチドをアンタゴニストへ変換するなどのものが挙げられ、これらは、用語ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体に包含される。

用語ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体はまた、グリコシル化ｂＧ−ＣＳＦ、例えばこれらに限定されないが、任意のアミノ酸位置でグリコシル化されたポリペプチド、ポリペプチドのＮ結合グリコシル化形態、またはポリペプチドのＯ結合グリコシル化形態を含む。単一のヌクレオチド変化を含む変異体はまた、ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドの生物学的に活性な変異体として考えられている。単一のヌクレオチド変化を含む変異体はまた、ｂＧ−ＣＳＦの生物学的に活性な変異体として考えられている。加えて、スプライス変異体もまた含まれる。用語ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体はまた、化学的手段により結合されたかまたは融合タンパク質として発現された、任意の１つ以上のｂＧ−ＣＳＦまたは任意の他のポリペプチド、タンパク質、炭水化物、ポリマー、小分子、リンカー、リガンド、または、他のあらゆるタイプの活性分子の、ｂＧ−ＣＳＦヘテロダイマー、ホモダイマー、ヘテロマルチマー、またはホモマルチマーを含み（例えば、米国特許第６，２６１，５５０号明細書；米国特許第６，１６６，１８３号明細書；米国特許第６，２０４，２４７号明細書；米国特許第６，２６１，５５０号明細書；および米国特許第６，０１７，８７６号明細書を参照のこと）、ならびに、例えば、生物活性を維持しながらの特定の欠失または修飾を含むポリペプチド類似体を含む（例えば、米国特許第６，２６１，５５０号明細書；米国特許第６，００４，５４８号明細書；および米国特許第６，６３２，４２６号明細書を参照のこと）。ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドおよびその変異体は、本願明細書において参照により組み込まれた、例えば米国特許出願１２／５０７，２３７号明細書（現在、米国特許出願公開２０１０／００３５８１２号明細書）に記載される。いくつかの実施形態において、１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸は、１つ以上の以下のｂＧ−ＣＳＦでの位置：８，６２，６９，１２５，１３３，１３６、およびそれの任意の組み合わせに組み込まれる（成熟ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたは初期メチオニンアミノ酸残基を有するｂＧ−ＣＳＦポリペプチドにおいて対応するアミノ酸）。いくつかの実施形態において、非天然にコードされたアミノ酸パラ−アセチルフェニルアラニン（ｐＡＦ）は、以下の位置：Ｓ８，Ｓ６２，Ｌ６９，Ｇ１２５，Ｔ１３３，Ａ１３６、および、それの任意の組み合わせのうちの１つで天然にコードされたアミノ酸と置換される（成熟ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたは初期メチオニンアミノ酸残基を有するｂＧ−ＣＳＦポリペプチドにおいて対応するアミノ酸。

一実施形態において、ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体は、ｂＧ−ＣＳＦ−Ｓ８ｐＡＦであり、以下の配列を有する。

ここで、単一パラ−アセチルフェニルアラニン（ｐＡＦ）置換は、位置Ｓ８で起こる。

一実施形態において、ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体は、ｂＧ−ＣＳＦ−Ｓ６２ｐＡＦであり、以下の配列を有する。

ここで、単一パラ−アセチルフェニルアラニン（ｐＡＦ）置換は、位置Ｓ６２で起こる。

一実施形態において、ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体は、ｂＧ−ＣＳＦ−Ｌ６９ｐＡＦであり、以下の配列を有する。

ここで、単一パラ−アセチルフェニルアラニン（ｐＡＦ）置換は、位置Ｌ６９で起こる。

一実施形態において、ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体は、ｂＧ−ＣＳＦ−Ｇ１２５ｐＡＦであり、以下の配列を有する。

ここで、単一パラ−アセチルフェニルアラニン（ｐＡＦ）置換は、位置Ｇ１２５で起こる。

一実施形態において、ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体は、ｂＧ−ＣＳＦ−Ｔ１３３ｐＡＦであり、以下の配列を有する。

ここで、単一パラ−アセチルフェニルアラニン（ｐＡＦ）置換は、位置Ｔ１３３で起こる。

一実施形態において、ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体は、ｂＧ−ＣＳＦ−Ａ１３６ｐＡＦであり、以下の配列を有する。

ここで、単一パラ−アセチルフェニルアラニン（ｐＡＦ）置換は、位置Ａ１３６で起こる。

本発明の製剤は、リンカー、ポリマー、または生物学的に活性な分子と結合するｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体を含み得る。リンカー、ポリマー、および、生物学的に活性な分子は、米国特許出願１２／５０７，２３７号明細書（現在、米国特許出願公開２０１０／００３５８１２号明細書）に記載されている。本願明細書において用いられる用語「結合（ｌｉｎｋａｇｅ）」または「リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）」は、通常は化学反応の結果に形成され、典型的には共有結合により形成される基または結合を意味する。加水分解に安定な結合は、水中で実質的に安定であり、有用なｐＨ値（例えば、これらに限定されないが、長時間、おそらくいつまでも生理条件下）では水に反応しない結合を意味する。加水分解に不安定または分解可能な結合は、結合が水中または水性溶液（例えば血液）中で分解可能であることを意味する。酵素的に不安定または分解可能な結合は、１つ以上の酵素により分解され得る結合を意味する。当該技術分野において理解されるように、ＰＥＧおよび関連ポリマーは、ポリマー骨格とポリマー分子の１つ以上の末端官能基との間でのポリマー骨格またはリンカー基で分解可能な結合を含み得る。例えば、生物学的に活性因子上でのＰＥＧカルボン酸またはアルコール基を有するＰＥＧカルボン酸の反応により形成されたエステル結合は、一般的に生理条件下で加水分解して、因子を放出する。他の加水分解で分解可能な結合としては、これらに限定されないが、アミンとアルデヒドの反応から得られたカーボネート結合、イミン結合；リン酸基を有するアルコールの反応により形成されたリン酸エステル結合；ヒドラジドとアルデヒドの反応生成物であるヒドラゾン結合；アルデヒドとアルコールの反応生成物であるアセタール結合；ギ酸塩とアルコールの反応生成物であるオルトエステル結合；ペプチドのアミン基（例えば、これに限定されないが、ポリマー（例えばＰＥＧの末端基）およびカルボキシル基により形成されたペプチド結合；および、オリゴヌクレオチドのホスホラミダイト基（例えば、これに限定されないが、ポリマーの末端基）および５’ヒドロキシル基が挙げられる。

いくつかの実施形態において、ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体は、水溶性ポリマーと結合する。本願明細書において用いられるように、用語「水溶性ポリマー」は、水溶媒に可溶なあらゆるポリマーを意味する。水溶性ポリマーとｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体の結合は、例えば、これに限定されないが、血中半減期の増加または調節、未修飾形態に関連する治療的半減期の増加または調節、免疫原性の調節、物理的結合特性（例えば、凝集およびマルチマー形成）の調節、レセプター結合の変更、１つ以上の結合パートナーに対する結合の変更、および、レセプター二量化または多量化の変更などの変化をもたらし得る。水溶性ポリマーは、それ自身の生物活性を有し得るかまたは有し得ず、他の物質（例えば、これに限定されないが、１つ以上のｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体、または、１つ以上の生物学的に活性な分子）にｂＧ−ＣＳＦを付着させるリンカーとして使用され得る。適切なポリマーとしては、これに限定されないが、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、そのモノＣ１−Ｃ１０アルコキシまたはアリールオキシ誘導体（米国特許５，２５２，７１４号明細書に記載される）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアミノ酸、ジビニルエーテル無水マレイン酸、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−メタクリルアミド、デキストラン、デキストラン誘導体（例えば、硫酸デキストラン）、ポリプロピレングリコール、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ヘパリン、ヘパリン断片、多糖類、オリゴ糖、グリカン、セルロースおよびセルロース誘導体（例えば、これに限定されないが、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロース）、澱粉および澱粉誘導体、ポリペプチド、ポリアルキレングリコールおよびその誘導体、ポリアルキレングリコールのコポリマーおよびその誘導体、ポリビニルエチルエーテル、およびアルファ−ベータ−ポリ［（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルトアミドなどまたはその誘導体が挙げられる。このような水溶性ポリマーの例としては、これに限定されないが、ポリエチレングリコールおよび血清アルブミンが挙げられる。国際特許公開０３／０７４０８７号および国際特許公開０３／０７４０８８号は、ヒドロキシアルキル澱粉（ＨＡＳ）に対するタンパク質または小分子の共役を説明している。ヒドロキシアルキル澱粉の例としては、これに限定されないが、ヒドロキシアルキル澱粉が挙げられる。ヒドロキシアルキル澱粉および別の分子の共役体は、例えば、ＨＡＳの末端アルデヒド基と他の分子の反応基との間の共有結合を含み得る。

いくつかの実施形態において、水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）部分である。いくつかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）部分は、約０．１ｋＤａから約１００ｋＤａの間の分子量を有する。別の実施形態において、水溶性ポリマーは、約０．１ｋＤａから約５０ｋＤａの間の分子量を有する。いくつかの実施形態において、水溶性ポリマーは、約１０ｋＤａから約３０ｋＤａの間の分子量を有する。別の実施形態において、水溶性ポリマーは、約１５ｋＤａから約２５ｋＤａの間の分子量を有する。さらに別の実施形態において、水溶性ポリマーは、約２０ｋＤａの分子量を有する。当業者は、「約２０ｋＤａ」の分子量を有する水溶性ポリマーが、本願明細書に基づく約１５％（すなわち、約１７ｋＤａから約２３ｋＤａ）の分子量の変動性およびその部分のポリ分散物を含むことが理解される。

ここで、単一パラ−アセチルフェニルアラニン（ｐＡＦ）置換は、位置Ｓ８で起こり、ポリ（エチレングリコール）部分と結合する。例えば、ポリ（エチレングリコール）部分は、約２０ｋＤａの分子量を有する場合、この実施形態のｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体は、２０ｋＤａポリ（エチレングリコール）部分が位置Ｓ８で起こるｐＡＦ置換に結合することを示す「ｂＧ−ＣＳＦ−Ｓ８ｐＡＦ−２０ＫＰＥＧ」として特定され得る。

ここで、単一パラ−アセチルフェニルアラニン（ｐＡＦ）置換は、位置Ｓ６２で起こり、ポリ（エチレングリコール）部分と結合する。例えば、ポリ（エチレングリコール）部分は、約２０ｋＤａの分子量を有する場合、この実施形態のｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体は、２０ｋＤａポリ（エチレングリコール）部分が位置Ｓ６２で起こるｐＡＦ置換に結合することを示す「ｂＧ−ＣＳＦ−Ｓ６２ｐＡＦ−２０ＫＰＥＧ」として特定され得る。

一実施形態において、ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体は、ｂＧ−ＣＳＦ−Ｓ６９ｐＡＦであり、以下の配列を有する。

ここで、単一パラ−アセチルフェニルアラニン（ｐＡＦ）置換は、位置Ｓ６９で起こり、ポリ（エチレングリコール）部分と結合する。例えば、ポリ（エチレングリコール）部分は、約２０ｋＤａの分子量を有する場合、この実施形態のｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体は、２０ｋＤａポリ（エチレングリコール）部分が位置Ｓ６９で起こるｐＡＦ置換に結合することを示す「ｂＧ−ＣＳＦ−Ｓ６９ｐＡＦ−２０ＫＰＥＧ」として特定され得る。

ここで、単一パラ−アセチルフェニルアラニン（ｐＡＦ）置換は、位置Ｇ１２５で起こり、ポリ（エチレングリコール）部分と結合する。例えば、ポリ（エチレングリコール）部分は、約２０ｋＤａの分子量を有する場合、この実施形態のｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体は、２０ｋＤａポリ（エチレングリコール）部分が位置Ｇ１２５で起こるｐＡＦ置換に結合することを示す「ｂＧ−ＣＳＦ−Ｇ１２５ｐＡＦ−２０ＫＰＥＧ」として特定され得る。

ここで、単一パラ−アセチルフェニルアラニン（ｐＡＦ）置換は、位置Ｔ１３３で起こり、ポリ（エチレングリコール）部分と結合する。例えば、ポリ（エチレングリコール）部分は、約２０ｋＤａの分子量を有する場合、この実施形態のｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体は、２０ｋＤａポリ（エチレングリコール）部分が位置Ｔ１３３で起こるｐＡＦ置換に結合することを示す「ｂＧ−ＣＳＦ−Ｔ１３３ｐＡＦ−２０ＫＰＥＧ」として特定され得る。

一実施形態において、ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体は、ｂＧ−ＣＳＦ−Ｔ１３６ｐＡＦであり、以下の配列を有する。

ここで、単一パラ−アセチルフェニルアラニン（ｐＡＦ）置換は、位置Ａ１３６で起こり、ポリ（エチレングリコール）部分と結合する。例えば、ポリ（エチレングリコール）部分は、約２０ｋＤａの分子量を有する場合、この実施形態のｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体は、２０ｋＤａポリ（エチレングリコール）部分が位置Ａ１３６で起こるｐＡＦ置換に結合することを示す「ｂＧ−ＣＳＦ−Ａ１３６ｐＡＦ−２０ＫＰＥＧ」として特定され得る。

本願明細書に用いられるように、用語「安定性（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）」および「安定な（ｓｔａｂｌｅ）」は、ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体を含む製剤では、所与の製造条件、調製条件、輸送条件、および保存条件下での、ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体の熱変性および化学変性、凝集、分解、変性、断片化、または、不安定化を意味する。本発明の「安定な」製剤は、所与の製造条件、調製条件、輸送条件、および保存条件下での、望ましくは８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または９９．５％以上の生物活性の保持をもたらす構造的完全性を維持する。製剤の安定性は、当業者が公知の方法および更に本願明細書に記載された方法による、凝集、脱ペグ化、分解、変性、または断片化の程度によって評価され得る。

本願明細書において用いられるように、ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体を含む製剤では、用語「水性」は、水、１つ以上の水溶性有機溶媒、または、その混合物を意味する。用語「有機溶媒」は、その従来の意味で本願明細書で用いられ、液体有機化合物、典型的には液体形態の単量体有機材料、好ましくは比較的非粘着性の液体、酸素原子、炭素原子、および任意に他の原子も含有し、かつ、抗体、気体、または液体を溶解可能な分子構造を意味する。

本発明の医薬製剤は、薬学的に受容可能な担体を含み得る。薬学的に受容可能な担体は、投与される特定の組成物により、ならびに、組成物を投与するのに用いられる特定の方法により、部分的に決定される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈｅｄ．（１９８５）を参照のこと）。適切な薬学的に受容可能な担体としては、これに限定されないが、緩衝物質および賦形剤を含み、例えばこれらは、食塩水、緩衝食塩水、グルコース、水、グリセロール、エタノール、および／または、それらの組み合わせを含有する。適切な担体は、コハク酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩、ＨＥＰＥＳ、クエン酸塩、ヒスチジン、イミダゾール、酢酸塩、重炭酸塩、および、他の有機酸を含有する緩衝物質であり得る。適切な担体は、多価糖アルコール、アミノ酸（例えば、アルギニン、リシン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、ロイシン、フェニルアラニン、グルタミン酸、トレオニン等）、有機糖または糖アルコール（例えば、ラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイノシトール、ガラクチトール、グリセロール糖）を含有し、シクリトール（例えば、イノシトール）；ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー、含硫還元剤（例えば、尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリコール、α−モノチオグリコール、および、チオ硫酸ナトリウム）；低分子量ポリペプチド（すなわち、１０残基未満）；タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；単糖（例えば、キシロース、マンノース、フルクトース、およびグリコース）；二糖（例えば、ラクトース、マルトース、およびスクロース）；三糖（例えば、ラフィノース）および多糖類（例えば、デキストラン）を含む賦形剤であり得る。

クエン酸塩、ヒスチジン、マレイン酸塩、コハク酸塩、リン酸塩、またはその組み合わせは、緩衝物質として本発明に従って使用され得る。いくつかの実施形態において、クエン酸またはコハク酸エステルは、安定水性製剤での緩衝物質として使用される。いくつかの実施形態において、緩衝物質は、約１０ｍＭから約５０ｍＭの間の部分を有する。いくつかの実施形態において、緩衝物質は、約３０ｍＭの部分を有する。緩衝物質は、対応する遊離酸の形態またはアルカリ塩、アルカリ土類塩またはアンモニウム塩の形態のいずれかで存在し得る。製剤は、更に共通の薬学的補助物質を含有し得る。液体医薬製剤の生成の間における種々の補助物質または活性物質の追加物の配列は、本発明に従って見出された保存における安定化効果とは大きく独立しており、当業者の裁量によるものである。

塩化ナトリウム、トレハロース、ソルビトール、アルギニン、またはその組み合わせは、本発明に従って賦形剤として用いられ得る。一実施形態において、賦形剤は、アルギニンである。いくつかの実施形態において、アルギニンは、約１００ｍＭから約５００ｍＭの間のモル濃度である。他の実施形態において、アルギニンは、約２００ｍＭから約３００ｍＭの間のモル濃度である。いくつかの実施形態において、アルギニンは、約２５０ｍＭのモル濃度である。

従来、タンパク質の医薬製剤は、界面活性剤を含む。界面活性剤の包含は、処理の間に出くわす表面に対して、および、それらの熱力学的立体配座の安定性の変更に対して、潜在的な不安定化面においてタンパク質を保護し得る。界面活性剤は、当該技術分野において周知であり、例えば、ポリソルベート界面活性剤である。ポリソルベート界面活性剤の一例は、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートであり、商品名Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）とも知られる。しかしながら、微量レベルのポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートを含有するｂＧ−ＣＳＦ製剤の研究は、凝集が２５℃での５日間のインキュベーション後に、３．２％まで（サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により測定される）増加することを示している。よって、本発明の製剤は、界面活性剤、ポリソルベート界面活性剤、および／またはポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートを実質的に含まない。本願明細書において用いられるように、界面活性剤、ポリソルベート界面活性剤、および／またはポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートを「実質的に含まない」という用語は、界面活性剤、ポリソルベート界面活性剤、および／またはポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートを０．０３３％未満、０．００１％未満、０．０００５％未満、０．０００３％未満、または、０．０００１％未満で含有する製剤を意味する。本発明の製剤は、望ましい特性（例えば、最小限の製剤凝集および最小限の不安定化、および、適用可能であれば脱ペグ化）を有する安定製剤を達成するために、界面活性剤、ポリソルベート界面活性剤、および／またはポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートを実質的に含まない。

本願明細書において用いられる用語「生物学的に活性な分子」は、有機体（例えば、これに限定されないが、ウイルス、バクテリア、バクテリオファージ、トランスポゾン、プリオン、昆虫、菌類、植物、動物、およびヒト）に関連する生物学的システム、経路、分子、相互作用あらゆる物理的または生化学的特性に影響を与え得るあらゆる物質を意味する。特に、本願明細書において用いられる、生物学的に活性な分子としては、これに限定されないが、ヒトまたは他の動物の疾患についての診断、治療、緩和、処置、または予防を対象とし、あるいは、一方でヒトまたは動物における肉体的または精神的幸福を促進することを対象とするあらゆる物質を含む。生物学的に活性な分子の例としては、これに限定されないが、ペプチド、タンパク質、酵素、小分子薬物、ワクチン、免疫源、硬性薬物、軟性薬物、炭水化物、無機原子、または、分子、染料、脂質、ヌクレオシド、放射性核種、オリゴヌクレオチド、トキソイド、毒素、原核生物および真核生物、ウイルス、多糖、核酸、およびその部分が挙げられ、これらは、ウイルス、バクテリア、昆虫、動物またはあらゆる他の細胞または細胞タイプ、リポソーム、微小分子およびミセルから得られるかまたはこれら由来である。

本発明の医薬製剤はまた、１つ以上の他の活性成分を、ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体に加えて任意に含む。本願明細書において用いられるように、用語「活性成分」または「治療成分」は、治療的に活性な化合物、ならびに、その任意のプロドラッグおよび薬学的に受容可能な塩、化合物およびプロドラッグの水和物と溶媒和物を意味する。他の活性成分は、ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体と組み合わされ得、別個に投与され得るか、同じ薬学的製剤中で投与され得る。与えられる他の活性成分の量は、ｂＧ−ＣＳＦを用いる治療に基づいて当業者によって容易に決定され得る。

本発明の医薬製剤はまた、１つ以上の他の不活性成分を、ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体に加えて任意に含む。本願明細書において用いられるように、用語「不活性成分」は、治療的に不活性な化合物、ならびに、その任意のプロドラッグおよび薬学的に受容可能な塩、化合物およびプロドラッグの水和物と溶媒和物を意味する。他の不活性成分は、ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体と組み合わされ得、別個に投与され得るか、同じ薬学的製剤中で投与され得る。与えられる他の不活性成分の量は、ｂＧ−ＣＳＦを用いる治療に基づいて当業者によって容易に決定され得る。

安定水性製剤中のｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体の量は、治療効果を達成するのに適切である。本願明細書において用いられるように、用語「治療有効量」は、動物に対する所望の利点を与え、かつ、治療投与および予防投与の両方の利点を与える量である。この量は、ある固体から別の固体まで異なり、患者の体調および治療状態の根本原因を含む因子数に依存する。治療に用いられるｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体の量は、受容可能な変化速度を与え、有益なレベルでの所望な反応を維持する。本発明の組成物の治療有効量は、公的に入手可能な材料および手順を用いて当業者に容易に確認され得る。例えば、ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体の量は、約０．５から約１２グラム／リットルの間、好ましくは約５グラム／リットルの量で製剤中に存在し得る。

本発明によると、ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体の安定水性製剤は、種々のｐＨ値で製剤化され得る。いくつかの実施形態において、安定水性製剤は、約５．７から約６．６の間のｐＨ値を有し得る。一実施形態において、安定水性製剤は、約６．０から約６．３の間のｐＨ値を有し得る。製剤の望ましいｐＨ値は、例えば、アルカリ性水酸化物、アルカリ土類水酸化物、または、アンモニウム水酸化物等の塩基を加えることで調整される。水酸化ナトリウムは、好ましくは、ｐＨ調節のために用いられ得る。所望のｐＨ値の調節は、原則的に、酸性溶液を加えることで達成され得る。一般的に、弱酸を有する強塩基の塩（例えば、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムまたはリン酸二水素カリウムまたは酢酸カリウム等）が用いられ得る。補助物質の薬学的溶液が基本ｐＨ値を有する場合、それは、所望のｐＨ範囲の４−５または７−８に達するまで酸で滴定することで調節される。生理学的に許容される無機酸および有機酸は、例えば、塩酸、リン酸、酢酸、クエン酸、または、酸性ｐＨ値を有する物質の典型的な溶液等の酸として考えられる。この局面において、いくつかの例の物質は、弱塩基を有する強酸（例えば、リン酸二水素ナトリウムまたはリン酸二水素カリウム）である。

以下の実施例で実証しているように、本発明のｂＧ−ＣＳＦ製剤は、ストレス下保存条件および促進された保存条件下でｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体の望ましい低い凝集濃度を示している。本願明細書において用いられる、ストレス保存条件は、製剤サンプルが２５℃で５日間インキュベートされた後に評価される。本願明細書において用いられる、促進された保存条件は、製剤サンプルが４０℃で１日間インキュベートされた後に評価される。保存条件はまた、本発明の目的のために他の種々の温度および継続時間で評価され得る。例えば、保存条件は、製剤サンプルが２５℃で２８日間インキュベートされた後、または、製剤サンプルが４０℃で３日間インキュベートされた後に評価され得る。

ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体の凝集濃度は、以下のストレス下保存条件および促進された保存条件で分析される。いくつかの実施形態において、本発明のｂＧ−ＣＳＦ製剤は、ストレス下保存条件で約２．１％（重量／重量パーセント）未満のｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体の凝集濃度を有する。他の実施形態において、本発明のｂＧ−ＣＳＦ製剤は、ストレス保存条件で約１．５％（重量／重量パーセント）未満のｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体の凝集濃度を有する。いくつかの実施形態において、本発明のｂＧ−ＣＳＦ製剤は、促進された保存条件で約１．５％（重量／重量パーセント）未満のｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体の凝集濃度を有する。

加えて、強制攪拌研究または凍結融解研究は、本発明の製剤の安定特性を評価するために使用され得る。例えば、強制攪拌研究は、磁気スターラーを用いて設定速度（例えば、６０ｒｐｍ）でガラスビーカー中で製剤サンプルを混合する工程からなり得る。攪拌を、製剤サンプルの特徴を決定するために、所定期間（例えば、２時間）の間で起こし得る。凍結融解サイクルは、約７５℃で１時間の間製剤サンプルを凍結する工程、および、氷が観察されなくなるまで室温で約１時間融解する工程からなり得る。

更に、以下の実施例で実証しているように、本発明のｂＧ−ＣＳＦ製剤は、ストレス下保存条件および促進された保存条件下でｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体の望ましい不安定化および／または脱ペグ化特性を示し得る。本願明細書において用いられるように、用語「脱ペグ化」は、ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体に結合するペグ化部分の付着の安定性を意味し、すなわち、例えば水性溶液中で保存する間にこのようなペグ化部分が時間とともにポリペプチドと結合し続けるか否か、または、それらが例えばエステル結合加水分解の結果として分離しやすい傾向にあるか否かを意味する。

いくつかの実施形態において、ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体の安定水性製剤は、緩衝物質としてクエン酸および賦形剤としてアルギニンを用いて製剤化し得る。一実施形態において、水性製剤は、緩衝物質としてクエン酸一水和物（Ｆｉｓｈｅｒ，Ｃ／６２００／６０または同等物）および賦形剤としてＬ−アルギニン（Ｓｉｇｍａ，Ａ８０９４または同等物）を用いて調製され得る。水性製剤は、１．６±０．１グラムのクエン酸一水和物および１０．９±０．１グラムのＬ−アルギニンを２００ｍＬの高品質水に加えることで調製され得る。その後、ｐＨは、塩酸を用いて６．０±０．１まで調整され得、混合物は、高品質水を用いて２５０ｍＬに希釈され得る。得られた製剤は、６．０のｐＨで、３０ｍＭクエン酸、２５０ｍＭアルギニン、およびｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体を含み得る。

本発明にかかる水性製剤は、従来の凍結乾燥または粉末によって凍結乾燥物を生成するために使用され得る。本発明にかかる製剤は、水または他の水性溶液中に凍結乾燥物を溶解することで再度得られる。フリーズドライ（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ）としても知られる用語「凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）」は、対象のタンパク質調製物から水を除去するのに役立つタンパク質を提供するのに一般的に利用される技術である。凍結乾燥は、乾燥させる材料をまず凍結し、次いで氷または凍結溶媒を真空環境での昇華によって除去する工程である。賦形剤は、凍結乾燥前の製剤中に含まれ得、フリーズドライ工程の間に安定性を促進し、および／または、保存の際の凍結乾燥生成物の安定性を向上させる。例えば、Ｐｉｋａｌ，Ｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．３（９）２６−３０（１９９０）およびＡｒａｋａｗａら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．８（３）：２８５−２９１（１９９１）を参照のこと。

薬学的成分のスプレー乾燥もまた当業者に公知である。例えば、Ｂｒｏａｄｈｅａｄ，Ｊ．ら、ＤｒｕｇＤｅｖ．Ｉｎｄ．Ｐｈａｒｍ，１８（１１＆１２），１１６９−１２０６（１９９２）の「ＴｈｅＳｐｒａｙＤｒｙｉｎｇｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ」を参照のこと。小分子調剤に加えて、種々の生物学的材料（例えば、酵素、血清、微生物、および酵母）はスプレー乾燥されている。スプレー乾燥は、液体薬学的調製物を、純度の高い、埃のないまたは凝集した粉末へと一工程で変換できるので有用な技術である。基本技術は、以下の４工程を含む。（ａ）与えられた溶液（ｆｅｅｄｓｏｌｕｔｉｏｎ）のスプレーへの噴霧；（ｂ）スプレーエアー接触；（ｃ）スプレーの乾燥；（ｄ）乾燥空気からの乾燥生成物の分離。例えば、米国特許第６，２３５，７１０号明細書および米国特許第６，００１，８００号明細書は、スプレー乾燥による組み換えエリスロポエチンの生成を記載している。

ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体を含有する製剤を使用する方法もまた、本発明に含まれる。ｂＧ−ＣＳＦは、限定されないが、その受容体に対する結合、その受容体の二量化を引き起こすこと、好中球産生の刺激、ならびに細胞増殖および分化を刺激することを含む、種々の生物学的活性を有する。顆粒球コロニー刺激因子およびｂＧ−ＣＳＦの生物学的活性の一部は、上記ならびに米国特許第６，６７６，９４７号；同第６，５７９，５２５号；同第６，５３１，１２１号；同第６，５２１，２４５号；同第６，４８９，２９３号；同第６，３６８，８５４号；同第６，３１６，２５４号；同第６，２６８，３３６号；同第６，２３９，１０９号；同第６，１６５，２８３号；同第５，９８６，０４７号；同第５，８３０，８５１号；同第５，０４３，１５６号；および同第５，７７３，５６９号に記載されている。本発明のｂ−ＧＣＳＦポリペプチドまたはその変異体を含有する製剤は、広範囲の障害の治療または予防に有用である。「予防」とは、受容者が、病態のいずれかを発生または発症する可能性を減少させることを指す。「予防」という用語は特に、特定の病理学的状態の影響を受けやすい患者に適用できる。「治療」という用語は、疾患または病態を仲介し、疾患の臨床作用を予防し、反転するか、またはそのさらなる進行を軽減するか、または疾患もしくは病態に関連した症状を寛解することを指す。

Ｇ−ＣＳＦ生成物の投与は白血球形成を生じる。従って、本発明のｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体を含有する製剤の投与は、感染の危険性のある動物における感染を予防するのに有用であり得る。本発明のｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体を含有する製剤は、感染を有する動物に投与されてもよい。本発明のｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体を含有する製剤を用いて治療され得る感染には、限定されないが、乳腺炎および輸送熱が含まれる。本発明のｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体を含有する製剤は、例えば、２週間の間、および誕生の一日前に動物に投与されてもよく、必要に応じて、追加投与が誕生の日または誕生後、１週間まで与えられてもよい。一部の実施形態において、本発明のｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体を含有する製剤を投与される動物はウシであり、誕生は「分娩」と称される。一実施形態において、本発明のｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体を含有する製剤は、乳腺炎を予防するために周産期のウシに投与されてもよい。

本発明によれば、本発明のｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体を含有する製剤は、限定されないが、皮下または静脈内または注射もしくは点滴の任意の他の形態を含む、限定されないが、非経口、例えば注射を含む、タンパク質またはペプチドに適切な任意の従来の経路により投与されてもよい。ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体を含有する製剤は、限定されないが、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、経皮、皮下、局所、舌下腺、血管内、乳房内、または直腸手段を含む、複数の経路により投与されてもよい。ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体を含有する製剤はまた、リポソームにより投与されてもよい。このような投与経路および適切な製剤は一般に当業者により公知である。単独で、または他の適切な成分と組み合わせて、ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体を含有する製剤はまた、吸入により投与されるエアロゾル製剤にされてもよい（すなわちそれらは「噴霧」され得る）。エアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの加圧を許容できる推進剤に入れられてもよい。

例えば、関節内（接合部分におて）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、および皮下経路により非経口投与に適切なｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体を含有する製剤には、酸化防止剤、緩衝剤、静菌薬、および製剤等張を対象とする受容者の血液に与える溶質を含有し得る、水性および非水性の無菌等張注射溶液、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および防腐剤を含有し得る水性および非水性の無菌懸濁液が含まれる。ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体を含有する製剤は、アンプルおよびバイアルなどの単回投与または複数回投与の密閉容器に提供されてもよい。ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体を含有する製剤はまた、予め充填されたシリンジなどのシリンジに提供されてもよい。

非経口投与および静脈内投与が本発明の製剤の投与の可能な方法である。特に、現在使用する製剤と共に、天然のアミノ酸相同体治療薬のために既に使用されている投与経路（限定されないが、ＥＰＯ、ＧＨ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ、インターロイキン、抗体、ＦＧＦ、および／または任意の他の薬学的に送達されるタンパク質について典型的に使用されているものを含む）が、本発明のｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体を含有する製剤の可能な投与経路である。

一部の実施形態において、ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体を含有する本発明の製剤は、約０．５〜約１２グラム／リットルの間の量である。本発明に関して、動物へ投与する用量は、時間にわたる動物における有益な治療応答、または用途に応じて他の適切な活性を有するのに十分である。用量は、特定のベクターまたは製剤の有効性、および利用される非天然アミノ酸ポリペプチドの活性、安定性または血中半減期、および動物の病態、ならびに治療される動物の体重または表面積により決定される。用量のサイズもまた、特定の動物における特定のベクター、製剤などに伴う存在度、性質、およびあらゆる副作用の範囲により決定される。

本発明に関して動物に投与される用量は、時間にわたって被験体に有益な応答を引き起こすのに十分である。通常、用量当たり非経口で投与される本発明のｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体の全体の薬学的に有効な量は、動物の体重の約０．０１μｇ／ｋｇ／日〜約１００μｇ／ｋｇ、または約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇの範囲であるが、これは治療裁量による。あるいは、用量当たり非経口に投与される本発明のｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体の薬学的に有効な量は、約１ｍｇ〜約２５ｍｇ、または約５ｍｇ〜約２０ｍｇである。例えば、用量当たり非経口で投与される本発明のｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体の薬学的に有効な量は約１４ｍｇであってもよい。投与頻度はまた、治療裁量による。

ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体の薬学的に有効な量は、単一用量として、または複数回投与スケジュールの一部として動物に投与されてもよい。例えば、ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体は、複数回投与されてもよく、そのスケジュールは少なくとも２回の投薬レジメンである。一実施形態において、複数回投与スケジュールは２回の投薬レジメンである。

一実施形態において、複数回投与スケジュールは、動物の誕生の約１日〜約１４日前に動物に投与される第１の用量と、動物の誕生の約４日〜約７日後に動物に投与される第２の用量とを含む。別の実施形態において、複数回投与スケジュールは、動物の誕生の約７日前に動物に投与される第１の用量と、動物の誕生の日に動物に投与される第２の用量とを含む。

以下の実施形態もまた意図される。
項１ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体、緩衝物質、および賦形剤を含む安定水性製剤であって、前記製剤は、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートを実質的に含まない、製剤。
項２前記ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体は、リンカー、ポリマー、または生物学的に活性な分子と結合する、項１に記載の製剤。
項３前記ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体は、水溶性ポリマーと結合する、項１または項２に記載の製剤。
項４前記水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）部分を含む、項３に記載の製剤。
項５前記水溶性ポリマーは、約０．１ｋＤａから約１００ｋＤａの間の分子量を有する、項３または項４に記載の製剤。
項６前記水溶性ポリマーは、約０．１ｋＤａから約５０ｋＤａの間の分子量を有する、項３〜５のいずれか１つに記載の製剤。
項７前記水溶性ポリマーは、約２０ｋＤａの分子量を有する、項３〜６のいずれか１つに記載の製剤。
項８前記ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体は、ｂＧ−ＣＳＦ−Ｔ１３３ｐＡＦ−２０ＫＰＥＧである、項１〜７のいずれか１つに記載の製剤。
項９前記ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体は、約０．５から約１２グラム／リットルの間の量で存在する、項１〜８のいずれか１つに記載の製剤。
項１０前記ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体は、約５グラム／リットルの量で存在する、項１〜９のいずれか１つに記載の製剤。
項１１前記緩衝物質は、クエン酸塩、ヒスチジン、マレイン酸塩、コハク酸塩、リン酸塩、またはそれらの組み合わせである、項１〜１０のいずれか１つに記載の製剤。
項１２前記緩衝物質は、クエン酸塩またはコハク酸塩である、項１〜１１のいずれか１つに記載の製剤。
項１３前記緩衝物質は、クエン酸塩である、項１〜１２のいずれか１つに記載の製剤。
項１４前記緩衝物質は、コハク酸塩である、項１〜１２のいずれか１つに記載の製剤。
項１５前記緩衝物質は、約１０ｍＭから約５０ｍＭの間のモル濃度を有する、項１〜１４のいずれか１つに記載の製剤。
項１６前記緩衝物質は、約３０ｍＭのモル濃度を有する、項１〜１５のいずれか１つに記載の製剤。
項１７前記賦形剤は、塩化ナトリウム、トレハロース、ソルビトール、アルギニン、またはそれらの組み合わせである、項１〜１６のいずれか１つに記載の製剤。
項１８前記賦形剤は、アルギニンである、項１〜１７のいずれか１つに記載の製剤。
項１９前記アルギニンは、約１００ｍＭから約５００ｍＭの間のモル濃度を有する、項１８に記載の製剤。
項２０前記アルギニンは、約２００から約３００ｍＭのモル濃度を有する、項１８または項１９に記載の製剤。
項２１前記アルギニンは、約２５０ｍＭのモル濃度を有する、項１８〜２０のいずれか１つに記載の製剤。
項２２前記製剤は、約５．７から約６．６の間のｐＨを有する、項１〜２１のいずれか１つに記載の製剤。
項２３前記製剤は、約６．０から約６．３の間のｐＨを有する、項１〜２２のいずれか１つに記載の製剤。
項２４前記製剤は、ストレス下での保存条件にて５日のインキュベーション期間後、約２．１％重量／重量％未満のｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体の平均凝集濃度を有する、項１〜２３のいずれか１つに記載の製剤。
項２５前記製剤は、促進された保存条件にて１日のインキュベーション期間後、約１．５％重量／重量％未満のｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体の平均凝集濃度を有する、項１〜２４のいずれか１つに記載の製剤。
項２６１種以上の他の治療成分を任意に含む、項１〜２５のいずれか１つに記載の製剤。
項２７項１〜２６のいずれか１つに記載の製剤の凍結乾燥物または粉末。
項２８項２７に記載の凍結乾燥物または粉末を水に溶解することにより生成される水溶液。
項２９ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体、緩衝物質、および賦形剤を含む安定水溶液を形成する工程を含む、項１〜２６のいずれか１つに記載の製剤を調製するためのプロセスであって、前記製剤は、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートを実質的に含まない、プロセス。
項３０ｂＧ−ＣＳＦにより変調された疾患を有する動物を治療する方法であって、前記動物に対して治療有効量の項１〜２６のいずれか１つに記載の製剤を投与する工程を含む、方法。
項３１前記疾患は、感染症である、項３０に記載の方法。
項３２前記感染症は、乳腺炎であり、前記動物は、周産期のウシである、項３１に記載の方法。
項３３ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体、クエン酸塩またはコハク酸塩緩衝剤、アルギニン、および任意にアルギニンに対する対イオンを含む、安定水性製剤。
項３４前記製剤は、ポリソルベート界面活性剤を実質的に含まない、項３３に記載の製剤。
項３５前記ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体は、リンカー、ポリマー、または生物学的に活性な分子と結合する、項３３または項３４に記載の製剤。
項３６前記ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体は、水溶性ポリマーと結合する、項３３〜３５のいずれか１つに記載の製剤。
項３７前記水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）部分を含む、項３６に記載の製剤。
項３８前記水溶性ポリマーは、約０．１ｋＤａから約１００ｋＤａの間の分子量を有する、項３６または項３７に記載の製剤。
項３９前記水溶性ポリマーは、約０．１ｋＤａから約５０ｋＤａの間の分子量を有する、項３６〜項３８のいずれか１つに記載の製剤。
項４０前記水溶性ポリマーは、約２０ｋＤａの分子量を有する、項３６〜項３９に記載の製剤。
項４１前記ポリソルベート界面活性剤は、ナトリウムモノラウレートのポリオキシエチレン誘導体である、項３４〜４０のいずれか１つに記載の製剤。
項４２前記ポリソルベート界面活性剤は、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートである、項３４〜４１のいずれか１つに記載の製剤。
項４３前記ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体は、ｂＧ−ＣＳＦ−Ｔ１３３ｐＡＦ−２０ＫＰＥＧである、項３３〜４２のいずれか１つに記載の製剤。
項４４ｂＧ−ＣＳＦ−Ｔ１３３ｐＡＦ−２０ＫＰＥＧは、約０．５から約１２グラム／リットルの間の量で存在し、前記クエン酸塩緩衝剤は、約３０ｍＭのモル濃度を有し、アルギニンは、約２５０ｍＭのモル濃度を有し、前記製剤は、約６．０のｐＨ値を有する、項４３に記載の製剤。
項４５前記製剤は、２５℃で２８日のインキュベーション期間後、約１．６％重量／重量％未満のｂＧ−ＣＳＦ−Ｔ１３３ｐＡＦ−２０ＫＰＥＧの平均凝集濃度を有する、項４３または項４４に記載の製剤。
項４６前記製剤は、４０℃で３日のインキュベーション期間後、約２．８％重量／重量％未満のｂＧ−ＣＳＦ−Ｔ１３３ｐＡＦ−２０ＫＰＥＧの平均凝集濃度を有する、項４３〜４５のいずれか１つに記載の製剤。
項４７前記製剤は、強制攪拌研究の後で、約１．６％重量／重量％未満のｂＧ−ＣＳＦ−Ｔ１３３ｐＡＦ−２０ＫＰＥＧの平均凝集濃度を有する、項４３〜４６のいずれか１つに記載の製剤。
項４８前記製剤は、５回の凍結融解サイクルの後で、約１．６％重量／重量％未満のｂＧ−ＣＳＦ−Ｔ１３３ｐＡＦ−２０ＫＰＥＧの平均凝集濃度を有する、項４３〜４７のいずれか１つに記載の製剤。
項４９前記アルギニンに対する対イオンは、塩化物または硫酸塩である、項３３〜４８のいずれか１つに記載の製剤。
項５０１種以上の他の治療成分を任意に含む、項３３〜４９のいずれか１つに記載の製剤。
項５１項３３〜５０のいずれか１つに記載の製剤の凍結乾燥物または粉末。
項５２項５１に記載の凍結乾燥物または粉末を水に溶解することにより生成される水溶液。
項５３ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体、クエン酸塩緩衝剤、アルギニン、および任意にアルギニンに対する対イオンを含む安定水溶液を形成する工程を含む、項３３〜５０のいずれか１つに記載の製剤を調製するためのプロセス。
項５４前記製剤は、ポリソルベート界面活性剤を実質的に含まない、項５３に記載のプロセス。
項５５前記ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体は、ｂＧ−ＣＳＦ−Ｔ１３３ｐＡＦ−２０ＫＰＥＧである、項５３または項５４に記載のプロセス。
項５６ｂＧ−ＣＳＦにより変調された疾患を有する動物を治療する方法であって、前記動物に対して治療有効量の項３３〜５０のいずれか１つに記載の製剤を投与する工程を含む、方法。
項５７前記疾患は、感染症である、項５６に記載の方法。
項５８前記感染症は、乳腺炎であり、前記動物は、周産期のウシである、項５７に記載の方法。
項５９ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体、クエン酸塩またはコハク酸塩緩衝剤、アルギニン、および任意にアルギニンに対する対イオンを本質的に含む、安定水性製剤。
項６０前記製剤は、界面活性剤を実質的に含まない、項５９に記載の製剤。
項６１前記ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体は、リンカー、ポリマー、または生物学的に活性な分子と結合する、項５９または項６０に記載の製剤。
項６２前記ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体は、水溶性ポリマーと結合する、項５９〜６１のいずれか１つに記載の製剤。
項６３前記水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）部分を含む、項６２に記載の製剤。
項６４前記水溶性ポリマーは、約０．１ｋＤａから約１００ｋＤａの間の分子量を有する、項６２または項６３に記載の製剤。
項６５前記水溶性ポリマーは、約０．１ｋＤａから約５０ｋＤａの間の分子量を有する、項６２〜６４のいずれか１つに記載の製剤。
項６６前記水溶性ポリマーは、約２０ｋＤａの分子量を有する、項６２〜６５のいずれか１つに記載の製剤。
項６７前記界面活性剤は、ポリソルベート界面活性剤である、項６０〜６６のいずれか１つに記載の製剤。
項６８前記界面活性剤は、ナトリウムモノラウレートのポリオキシエチレン誘導体である、項６０〜項６７のいずれか１つに記載の製剤。
項６９前記界面活性剤は、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートである、項６０〜項６８のいずれか１つに記載の製剤。
項７０前記ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体は、ｂＧ−ＣＳＦ−Ｔ１３３ｐＡＦ−２０ＫＰＥＧである、項５９〜６９のいずれか１つに記載の製剤。
項７１ｂＧ−ＣＳＦ−Ｔ１３３ｐＡＦ−２０ＫＰＥＧは、約０．５から約１２グラム／リットルの間の量で存在し、前記クエン酸塩緩衝剤は、約３０ｍＭのモル濃度を有し、アルギニンは、約２５０ｍＭのモル濃度を有し、前記製剤は、約６．０のｐＨ値を有する、項７０に記載の製剤。
項７２前記製剤は、２５℃で２８日のインキュベーション期間の後、約１．６％重量／重量％未満のｂＧ−ＣＳＦ−Ｔ１３３ｐＡＦ−２０ＫＰＥＧの平均凝集濃度を有する、項７０または項７１に記載の製剤。
項７３前記製剤は、４０℃で３日のインキュベーション期間の後、約２．８％重量／重量％未満のｂＧ−ＣＳＦ−Ｔ１３３ｐＡＦ−２０ＫＰＥＧの平均凝集濃度を有する、項７０〜７２のいずれか１つに記載の製剤。
項７４前記製剤は、強制攪拌研究の後、約１．６％重量／重量％未満のｂＧ−ＣＳＦ−Ｔ１３３ｐＡＦ−２０ＫＰＥＧの平均凝集濃度を有する、項７０〜７３のいずれか１つに記載の製剤。
項７５前記製剤は、５回の凍結融解サイクルの後、約１．６％重量／重量％未満のｂＧ−ＣＳＦ−Ｔ１３３ｐＡＦ−２０ＫＰＥＧの平均凝集濃度を有する、項７０〜７４のいずれか１つに記載の製剤。
項７６前記アルギニンに対する対イオンは、塩化物または硫酸塩である、項５９〜７５のいずれか１つに記載の製剤。
項７７１種以上の他の治療成分を任意に含む、項５９〜７６のいずれか１つに記載の製剤。
項７８項５９〜７７のいずれか１つに記載の製剤の凍結乾燥物または粉末。
項７９項７８に記載の凍結乾燥物または粉末を水に溶解することにより生成される水溶液。
項８０ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体、クエン酸塩緩衝剤、アルギニン、および任意にアルギニンに対する対イオンから本質的になる安定水溶液を形成する工程を含む、項５９〜７７のいずれか１つに記載の製剤を調製するためのプロセス。
項８１前記製剤は、界面活性剤を実質的に含まない、項８０に記載のプロセス。
項８２前記ｂＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはその変異体は、ｂＧ−ＣＳＦ−Ｔ１３３ｐＡＦ−２０ＫＰＥＧである、項８０または項８１に記載のプロセス。
項８３ｂＧ−ＣＳＦにより変調された疾患を有する動物を治療する方法であって、前記動物に対して治療有効量の項５９〜７７のいずれか１つに記載の製剤を投与する工程を含む、方法。
項８４前記疾患は、感染症である、項８３に記載の方法。
項８５前記感染症は、乳腺炎であり、前記動物は、周産期のウシである、項８４に記載の方法。
項８６ｂＧ−ＣＳＦ−Ｔ１３３ｐＡＦ−２０ＫＰＥＧ、クエン酸塩緩衝剤、アルギニン、および任意にアルギニンに対する対イオンから本質的になる安定水性製剤であって、前記クエン酸塩緩衝剤は、約３０ｍＭのモル濃度を有し、前記アルギニンは、約２５０ｍＭのモル濃度を有する、安定水性製剤。

実施例１
緩衝剤および賦形剤スクリーニング研究
バックグランド中にポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートを有さないｂＧＣＳＦ−Ｔ１３３−２０ＫＰＥＧ製剤を、複数の緩衝剤および賦形剤（塩化ナトリウム、トレハロース、およびアルギニン）を用いて生産物安定性を評価するためにスクリーニングできる。全ての透析緩衝剤についての標的ｐＨはｐＨ６．０である。比較のために、ｐＨ６．０にて１０ｍＭリン酸塩、１８０ｍＭマンニトール、および６０ｍＭトレハロースを含有する製剤を調製できる。その製剤は、酸素の存在および非存在下でタンパク質凝集および脱ペグ化に対する効果について評価できる。

サンプルは、各製剤中に２〜８℃にて１ｍＬのｂＧＣＳＦ−Ｔ１３３−２０ＫＰＥＧを透析することにより調製できる。透析したサンプルのタンパク質濃度は、タンパク質濃度を５ｍｇ／ｍＬに正規化する前に測定できる。透析および濃度正規化後、約３×１ｍＬの透析後の希釈したプールを５ｍＬのガラスバイアルに充填できる。サンプルの１つのセットは初期条件を提供するために試験できる。第２のセットは、試験前に５日間、２５℃／６０％ＲＨにて保存できる。サンプルの第３のセットは、不活性雰囲気（窒素）下で閉じた、凍結乾燥チャンバ中で脱気でき、次いで試験前に５日間、２５℃／６０％ＲＨにて保存できる。５日後、ＳＥＣにより測定して、凝集レベルが２．０％以下になった場合、脱気した、および脱気していない両方のサンプルは、１日間４０℃にてインキュベートできる。

５日のインキュベーション後、各サンプルのタンパク質濃度を測定できる。表１はタンパク質濃度を示す。

表２は各サンプルについてのｐＨの結果を示す。

各製剤におけるタンパク質凝集および脱ペグ化レベルはＳＥＣにより分析できる。表３はＳＥＣの結果を示し、凝集および脱ペグ化レベルが全てのサンプルにわたって類似していたことを示す。

表４は、１日間、４０℃でインキュベートしたサンプルについてのＳＥＣの結果を示す。凝集組成物の比較は、アルギニンを含有する製剤が最も低い生成物凝集を有したことを示す。さらに、基準製剤である１０ｍＭリン酸塩、１８０ｍＭマンニトール、および６０ｍＭトレハロースｐＨ６は、スクリーニング研究における全ての他の製剤と比較して最も高いレベルの凝集を有する。

このスクリーニング研究からの結果は、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートを全て有さないコハク酸塩、ヒスチジン、マレイン酸塩、およびクエン酸塩の製剤は、２５℃での５日のインキュベーション後、ごく少量の凝集増加（ＳＥＣにより１％未満）を有することを示す。また、脱気および非脱気サンプルの間でタンパク質安定性における相違は存在しない。さらに、１日間、４０℃でのストレス下でのサンプルからのＳＥＣの結果は、０．１Ｍアルギニンを含有する製剤が、塩化ナトリウムおよびトレハロース賦形剤を含有する製剤と比較してほとんど凝集しないことを示す。

実施例２
ｂＧ−ＣＳＦ製剤に対するポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートの効果
凝集に対するポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートの効果を評価して、攪拌研究についての将来の製剤に対する影響を決定できる。サンプルは、ｐＨ６．０にて１０ｍＭリン酸塩および１５０ｍＭＮａＣｌ中に２〜８℃で４ｍＬのｂＧＣＳＦ−Ｔ１３３−２０ＫＰＥＧを透析することにより調製できる。透析後、透析したプールは、１％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートストック溶液でスパイクでき、次いで５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度までｐＨ６．０にて１０ｍＭリン酸塩および１５０ｍＭＮａＣｌで希釈できる。各製剤からのサンプルは、２セットのサンプルを形成するために１ｍＬガラスバイアルに充填した２×１ｍＬアリコートに分けることができる。１セットは２〜８℃にて保存でき、初期条件で試験でき、第２のセットは１日間４０℃にて保存できる。

表５は、ＳＥＣ積分データを示し、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート濃度が増加すると、凝集レベルが増加することを示す。サンプルのＳＥＣ分析は、ｂＧＣＳＦ−Ｔ１３３−２０ＫＰＥＧ凝集が、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート濃度と共に造以下することを示す。結果として、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートは、ｂＧＣＳＦ−Ｔ１３３−２０ＫＰＥＧについて試験する将来の製剤から除外できる。

実施例３
Ｂｏｘ−Ｂｅｈｎｋｅｎ応答表面設計（ＤＯＥ＃１）
他の重要な過去の製剤パラメータと共に種々のアルギニン濃度の効果を試験して、主要な効果およびそれらの相互作用を評価できる。実験設計は、各々の数因子が低、中、および高レベルで変化するＢｏｘ−Ｂｅｈｎｋｅｎ応答表面であり得る。さらに、緩衝剤の種類はカテゴリカル因子であり得る。パラメータの組み合わせは、各々３つの中心点でクエン酸塩およびコハク酸塩について繰り返した。ｐＨは全ての条件について６．０に設定できる。ｐＨ６にて１０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭＮａＣｌ、および０．００３３％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートを含むコントロール条件を、過去の結果との比較のために含んでもよい。

全ての透析緩衝剤はｐＨ６．０±０．１にて調製できる。ＰＥＧ−ｂＧＣＳＦは、ＤＯＥ＃１研究の全ての緩衝剤条件を表わす１８の緩衝剤条件に透析できる。透析工程にわたるタンパク質回収はほぼ７８％であり得るので、透析サンプルセット内に一致する。透析後、透析したプールのタンパク質濃度は、Ｂｏｘ−Ｂｅｈｎｋｅｎ応答表面設計において示した標的値に透析緩衝剤で調整できる。これにより、２４の製剤の組み合わせプラスクエン酸塩において３つの中心点およびコハク酸塩において３つの中心点が得られ得る。各製剤は、３セットのサンプルを形成するために１ｍＬガラスバイアルに充填した３×１ｍＬアリコートに分けることができ、１セットは開始条件として試験でき、次いで２〜８℃に保存でき、第２のセットは２週間２５℃にて保存でき、第３のセットは１日間４０℃にて保存できる。

生成物濃度の変化を分析して生成物安定性を評価できる。表６は、インキュベーション前後のサンプルの生成物濃度を示す。１０ｍＭクエン酸塩、３００ｍＭアルギニン（８ｍｇ／ｍＬ）および１０ｍＭクエン酸塩、３００ｍＭアルギニン（８ｍｇ／ｍＬ）におけるサンプルは、最も高い増加（０．５〜０．６ｍｇ／ｍＬ）を有するのに対して、全ての他のサンプルについての差はほとんどない。

ｐＨの変化を分析して、サンプルのｐＨ安定性を評価できる。全てのサンプルのｐＨは６．０〜６．３の範囲内であり得る。表７は、ｐＨ値およびゼロ時からの差を示す。サンプルのｐＨは、ＤＯＥ＃１研究の全期間、安定である。

ＳＥＣ凝集、モノマー、および脱ペグ化レベルの変化を分析して、タンパク質安定性を評価できる。表８、９および１０は、各々のサンプル組成におけるそれぞれの凝集、モノマー、および脱ペグ化の組成を示す。

ＳＥＣの結果は、クエン酸塩サンプルにおける凝集レベルが相対的に未変化であることを示す。コハク酸塩サンプルもまた、１００ｍＭアルギニンを含むサンプルを除いて低い凝集レベルを有し、コハク酸塩ベースの緩衝剤が、低いタンパク質凝集を維持するために１００ｍＭアルギニンより多くを必要とすることを示唆する。コントロール条件（ｐＨ６および５ｍｇ／ｍＬにおける１０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭＮａＣｌ、および０．００３３％（ｗ／ｖ）ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）は、４０℃での１日のインキュベーション後、３．７％凝集を有する（表８を参照のこと）。

脱ペグ化は別のタンパク質分解経路である。表１０は、脱ペグ化生成物についてのＳＥＣの結果を示し、コハク酸塩サンプルにおける脱ペグ化レベルがクエン酸塩サンプルにおけるもの（≦０．３）より高い（０．４％〜０．８％）ことを示す。リン酸塩コントロールにおける脱ペグ化レベルは、全てのクエン酸塩製剤サンプルより高く、ほとんどのコハク酸塩製剤よりわずかに高い。

４０℃で１日間インキュベートしたクエン酸塩サンプルについてのＳＥＣの結果は最小の凝集を有するので、ＤＯＥ＃１サンプルのサブセットは、２５℃にて２８日間、インキュベートできる。以下のサンプル条件はＳＥＣにより分析できる：
１．２ｍｇ／ｍＬにおける３０ｍＭクエン酸塩、１００ｍＭアルギニン
２．２ｍｇ／ｍＬにおける３０ｍＭクエン酸塩、５００ｍＭアルギニン
３．８ｍｇ／ｍＬにおける３０ｍＭクエン酸塩、１００ｍＭアルギニン
４．８ｍｇ／ｍＬにおける３０ｍＭクエン酸塩、５００ｍＭアルギニン
５．５ｍｇ／ｍＬにおける３０ｍＭクエン酸塩、３００ｍＭアルギニン。

表１１は２８日の実験のＳＥＣ結果を示す。さらに、ＲＰ−ＨＰＬＣによる分析は、生成物分解の欠如を確保するために２８日にインキュベートしたサンプルで実施できる。表１２はこれらの結果を示す。

実施例４
対イオンおよび注射器適合性評価
アルギニンに対する対イオンとして塩化物および硫酸塩の比較を評価できる。サンプル条件は、５ｍｇ／ｍＬ（ｐＨ６）において３０ｍＭクエン酸塩および３００ｍＭアルギニンであり得る。さらに、薬物製剤を含有するためのＭＯＮＯＪＥＣＴ３ｍＬポリプロピレン注射器における製剤適合性を１ｍＬガラスバイアルと比較できる。３０ｍＭクエン酸塩、３００ｍＭアルギニンｐＨ６（塩化物）緩衝剤は、クエン酸ナトリウムおよびアルギニン−ＨＣｌを用いて調製でき、溶液は６ＮＨＣｌで滴定できる。３０ｍＭクエン酸塩、３００ｍＭアルギニンｐＨ６（硫酸塩）緩衝剤は、クエン酸一水和物、クエン酸ナトリウム、およびアルギニン塩基を用いて調製でき、ナトリウムは濃硫酸で滴定できる。ｂＧＣＳＦＴ１３３−２０ＫＰＥＧは２つの緩衝剤中に透析できる。サンプルはゼロ時にてＳＥＣにより分析できる。１セットのサンプルは、１ｍＬガラス凍結乾燥バイアルに入れることができ、第２セットは、４０℃にて３日までインキュベーション前に３ｍＬ注射器に入れることができる。

表１３はＳＥＣの結果を示す。ＳＥＣの結果は、凝集形成が、ガラスバイアルより注射器に保存されたサンプルにおいて２〜３倍高いことを示す。製剤の脱ペグ化はゼロ時のサンプルと同じままである。両方の対イオンに関して、ガラスバイアル中のサンプルは、４０℃にて３日後、凝集の最小の変化を有する。塩化物は、凝集形成に影響を与えずに対イオンとして硫酸塩の代わりに使用できる。

実施例５
３つのパラメータ、２レベルの全ての要因（ＤＯＥ＃２）
第２のＤＯＥ研究は、クエン酸塩緩衝剤におけるｐＨ、アルギニン濃度、およびタンパク質濃度の効果を評価するために実施できる。表１４はＤＯＥ＃２に使用される製剤条件を示す。

ｂＧＣＳＦ−Ｔ１３３−２０ＫＰＥＧは５つの緩衝剤条件に透析できる。サンプル１および２は、ｐＨ５．０にて３０ｍＭクエン酸塩および２００ｍＭアルギニンを含有する緩衝剤に透析できる。サンプル３および４は、ｐＨ５．０にて３０ｍＭクエン酸塩および２００ｍＭアルギニンを含有する緩衝剤に透析できる。サンプル５および６は、ｐＨ６．０にて３０ｍＭクエン酸塩および２５０ｍＭアルギニンを含有する緩衝剤に透析できる。サンプル７および８は、ｐＨ６．０にて３０ｍＭクエン酸塩および３００ｍＭアルギニンを含有する緩衝剤に透析できる。サンプル９および１０は、ｐＨ５．５にて３０ｍＭクエン酸塩および３００ｍＭアルギニンを含有する緩衝剤に透析できる。各々の透析後のサンプルは最終標的生成物濃度に調整でき、次いでガラス凍結乾燥バイアル中に２×１ｍＬアリコートに分けることができ、２セットのサンプルを生成する：第１のセットはコントロールとして２〜８℃に保存でき、第２のセットは４０℃にて３日間保存できる。

表１５はＳＥＣの結果を示す。凝集の変化は−０．１％〜２．１％の間である。より高い凝集は、より高い生成物濃度と強力に相関する。デルタ脱ペグ化は０．１％〜０．８％の間である。わずかに高い脱ペグ化は低いｐＨにおける低い生成物濃度と相関する。ｐＨが減少すると、脱ペグ化が増加し、この傾向は製剤前研究の過去の観察と一致する。

実施例６
攪拌研究
強制攪拌研究を実施して、製剤のタンパク質安定性を評価できる。サンプルは、ｐＨ６．０にて３０ｍＭクエン酸塩および２５０ｍＭアルギニンに対してｂＧＣＳＦ−Ｔ１３３−２０ＫＰＥＧ（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、５％ソルビトールｐＨ４．０中の１６．６ｍｇ／ｍＬタンパク質）を透析することにより調製できる。透析した材料の一部は、ｐＨ６．０にて緩衝剤の３０ｍＭクエン酸塩および２５０ｍＭのアルギニンを用いて５ｍｇ／ｍＬの標的濃度まで希釈できる。次いでプールを０．２２ミクロンフィルターを通して濾過でき、次いで磁気スターラーを使用して６０ｒｐｍにて室温で２時間、混合することによりガラスビーカー内で強制攪拌に供すことができる。サンプルを３０分ごとに得ることができる。

全てのサンプルは透明で、無色であり、全ての時点について目に見える粒子を含まない。各時点についてのタンパク質濃度、５５０ｎｍにおける吸光度、およびｐＨ測定を表１６に示す。

タンパク質濃度は混合時間全体にわたって安定なままである。ｐＨは実験全体にわたって一定のままである。ＳＥＣによる生成物の組成もまた、図１７に示すように、研究全体にわたって一定である。全体として、この研究からの結果は、強制攪拌の全体の時間、タンパク質が安定であることを示す。

実施例７
凍結融解研究
凍結融解研究を実施して、種々のサンプルのタンパク質濃度およびｐＨを測定できる。サンプル中のタンパク質は５回までの凍結および融解サイクルに供することができる。サンプルは０．２２ミクロンフィルターを通して濾過でき、１５ｍＬバイアルに分配できる。１つのアリコートをコントロールとして余分に設定できる。残っている３つのアリコートに関して、各凍結融解サイクルは、−７５±５℃にて１時間、タンパク質溶液を透析し、氷が観測されなくなるまで約１時間、室温にて解凍することからなる。サンプルバイアルを３回穏やかに回転させて、サンプルを混合できる。試験するために第１、第２、および第５の凍結および融解サイクルの後に１つのアリコートを余分に設定できる。

全てのサンプルは透明で、無色であり、全ての時点について目に見える粒子を含まない。各時点についてのタンパク質濃度、５５０ｎｍにおける吸光度、ｐＨ測定を表１８に示す。

タンパク質濃度は各凍結融解サイクルの後、安定なままである。さらに、ｐＨは５回の凍結融解サイクルにわたって一定のままである。ＳＥＣによる生成物の組成は全ての時点にわたって類似しており、表１９に示す。

Claims

ｂＧ−ＣＳＦ−Ｔ１３３ｐＡＦ−２０ＫＰＥＧ、クエン酸塩またはコハク酸塩緩衝物質、アルギニン、および任意にアルギニンに対する対イオンを含む安定水性製剤であって、前記製剤が、０．００１％未満の界面活性剤を含む製剤。
アルギニンに対する対イオンが、塩化物または硫酸塩である、請求項１に記載の製剤。
界面活性剤が、ポリソルベート界面活性剤である、請求項１または２に記載の製剤。
ｂＧ−ＣＳＦ−Ｔ１３３ｐＡＦ−２０ＫＰＥＧが、約０．５から約１２グラム／リットルの間の量で存在し、緩衝物質が、クエン酸塩であり、クエン酸緩衝物質が、約３０ｍＭのモル濃度を有し、アルギニンが、約２５０ｍＭのモル濃度を有し、製剤が、約５．７から約６．６のｐＨ値を有する、請求項１〜３のいずれか一つに記載の製剤。
１種以上の他の治療成分を任意に含む、請求項１〜４のいずれか一つに記載の製剤。
ｂＧ−ＣＳＦにより変調された疾患を有するヒト以外の動物を治療する方法であって、該動物に対して治療有効量の請求項１〜５のいずれか１つに記載の製剤を投与することを含む、方法
疾患が、乳腺炎であり、動物が、周産期のウシである、請求項６に記載の方法。