JP2001501619A

JP2001501619A - ｍｐｌリガンドを含有する医薬組成物

Info

Publication number: JP2001501619A
Application number: JP10516562A
Authority: JP
Inventors: ブレムス，デビット，エヌ．; トリューヘイト，マイケル，ジェイ．
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1996-10-04
Filing date: 1997-09-12
Publication date: 2001-02-06
Also published as: CN1239480A; HK1024490A1; KR100408229B1; AU4344697A; CN1142940C; WO1998014476A1; KR20000048905A; TW561050B

Abstract

(57)【要約】本発明の主題は、ｍｐｌリガンドの組成物に関するものであり、この組成物は、場合によつては少なくとも１種の水溶性ポリマーに共重合されている、天然のヒトｍｐｌリガンドのアミノ酸７−１５１から１−３３２までに対応するアミノ酸の配列を有する全長あるいは末端切断型のｍｐｌリガンドからなるｍｐｌリガンド；グルタミン酸塩、リン酸塩、ヒスチジン、イミダゾール、酢酸塩よりなる群から選ばれる緩衝化剤；ソルビトール、ショ糖、マンニトール、グリセロール、ポリエチレングリコール、非極性アミノ酸よりなる群から選ばれる賦形剤を含み、必要に応じて界面活性剤あるいは脂質、たとえば、Tweenを含み、必要に応じてグルタチオン、メチオニン、シトレート、EDTAから選ばれる抗酸化剤あるいはキレート剤を含み、ｐＨが好ましくは５．０以上６．０以下である。この組成物は、液状（好ましくは、水系）、凍結形態（好ましくは水系）、あるいは凍結乾燥形態とすることができる。

Description

【発明の詳細な説明】 mplリガンドを含有する医薬組成物発明の分野本発明は医薬としての適用に好適な、mplリガンドを含有する組成物に関する。発明の背景天然のヒトmplリガンドは、循環血小板レベルの主要なレギュレーターであると見られる、最近クローニングされたサイトカインである。Bartley,T.D.ら、Ce ll 77:1117-1124(1994)；Lok,S.ら、Nature 369:565-568(1994)；de Sauvage,F. J.ら、Nature 369:533-538(1994)：Miyazake,H.ら、Exp.Hematol.22:838(1994) ；およびKuter,D.J.ら、PNAS USA,91:11104-11108(1994)を参照されたい。トロンボポエチン(TPO)およびメガポエチンとも称される、天然のヒトmplリガンドは総計332個のアミノ酸を有するタンパク質である。チャイニーズハムスターの卵巣(CHO)および大腸菌細胞中の両方で産生された組換えmplリガンドは、マウス、ラットおよびサルにおいてin vivoで巨核球および／または血小板を特異的に剌激または増加させる、生物学的活性を有することが証明された。例えば、Hunt,P.ら、Blood 84(10):390A(1994)を参照されたい。Ｃ-末端から181個までのアミノ酸を末端切断されたヒトmplリガンドはin vivoで生物学的活性を保持している。生成したmplリガンドはヒトの全長配列のアミノ酸1〜151から1〜331までに相当する配列を有する。ヒトmplリガンドのＮ-末端から最初の6個までのアミノ酸を除去しても、生物学的活性を保持することが可能である。したがって、生物学的活性はヒトmplリガンドの成熟アミノ酸配列のアミノ酸7〜151（両端を含む）内に保持されているものと見られる。 in vivo試験において、mplリガンドの誘導体が巨核球および／または血小板の産生を刺激するのに有利な活性を有することが証明された。PCT公開公報WO95/26 746を参照されたい。特に、ポリエチレングリコール（"PEG"）部分などの水溶性ポリマーを使用して誘導体化したmplリガンドはin vivoで長寿命かつ活性であるため、臨床方面において興昧深い。 mplリガンドおよび関連する誘導体を含有する組成物は一般的な意味では開示されている。PCT公開公報WO95/26746，WO95/21919，WO95/18858，およびWO95/21 920を参照されたい。しかし、本明細書に記載されたような、mplリガンドを含有するどの組成物が医薬としての使用のために適切な安定性を有するかを決定するに至った対照実験(controlled experiment)は、これ以前には報告されていない。こうした組成物はヒトなどの患者に対してmplリガンドを実際に適用するのに重要である。このように、血小板の増加をもたらすために、患者にmplリガンドを投与するのに使用するための組成物への需要が当業界で存在し続けている。発明の要約したがって、mplリガンドを含有する、医薬として許容される安定な組成物を提供することが、本発明の一つの目的である。本発明のもう一つの目的は、患者へ投与するための、mplリガンドを含有する組成物を提供することである。一態様において、本発明の主題は、場合によっては１以上の水溶性ポリマーと共有結合で連結した、天然のヒトmplリガンドのアミノ酸7〜151から1〜332まで（両端を含む）に相当するアミノ酸配列を有する、全長または末端切断されたmp lリガンド；グルタメート、ホスフェート、ヒスチジン、イミダゾール、およびアセテートから選択される緩衝剤；ソルビトール、スクロース、マンニトール、グリセロール、ポリエチレングリコール、および非極性アミノ酸から選択される賦形剤；任意成分としてTweenなどの界面活性剤；任意成分としてグルタチオン、メチオニン、シトレートおよびEDTAから選択される抗酸化剤またはキレート化剤を含み、5.0〜6.0（両端を含む）の範囲のpHを有する、mplリガンドの組成物に関する。こうした組成物は液状（好ましくは水性）、凍結状態（好ましくは水性）または凍結乾燥状態とすることができる。本発明の別の態様は、以下の詳細な説明で述べる。図面の簡単な説明図１はmplリガンドの天然のヒトｃＤＮＡおよび対応するタンパク質の配列（配列番号１および２）を示す。この配列にはリーダー配列（アミノ酸-21〜-1(両端を含む)）が含まれており、ｃＤＮＡにコードされたタンパク質からin vivoで切断されて、成熟タンパク質が生成する。発明の詳細な説明本発明は、mplリガンド、および人間などの対象に適用するのに好適な、安定で生物学的に活性な組成物を生成するためのその他の薬剤をともに含む、組成物を提供する。第１の態様において、本発明の主題はmplリガンドの組成物に関する。「mplリガンド」は最も広い意味において、mplレセプターに特異的に結合して活性化し、その結果巨核球および／または血小板の産生をin vivoで刺激する能力を有する、いずれのタンパク質性分子をも意味する。好ましい態様では、mplリガンドは、天然のヒトの配列のアミノ酸1〜332（配列番号２）などの、ヒトから取得し得るものと同一のアミノ酸配列を有する。別の好ましい態様において、mplリガンドは配列番号２の少なくともアミノ酸7〜151、好ましくは配列番号２に対応する、1〜171±20番目のアミノ酸（すなわち、アミノ酸1〜151から1〜191まで）、特に好ましくは1〜161±10番目のアミノ酸に同一のアミノ酸配列を有する。mpl リガンドのいくつかの特定の好ましい種類は以下のとおりである：配列番号２のアミノ酸1〜151、1〜152、1〜153、1〜154、1〜163、1〜174、1〜191、〜232、1 〜244アミノ酸。最も好ましい種類は配列番号２のアミノ酸1〜163を有する。 mplリガンドを、１以上のポリエチレングリコール（PEG）基などの１種以上の水溶性ポリマーを使用して誘導体化してもよい。選択されるポリマーは、これが結合するmplリガンドが生理的環境などの水性環境中で沈殿しないように、水溶性のものでなければならない。水溶性ポリマーの例はPCT公開公報WO95/26746に記載されている（前記公報は、引用により本明細書に含まれるものとする）。 PCT公開公報WO95/26746に記載されたような化学反応によって、水溶性ポリマーを結合させることができる。好ましい結合の化学反応はアシル化およびアルキル化である。本発明のmplリガンド誘導体を多数のポリマー性分子に結合させることができる。例えば、誘導体に2〜6、好ましくは2〜5個の結合ポリマー基を含有させてもよい。ポリマー基は通常はアミノ酸のαまたはεアミノ基の位置でタンパク質に結合されるが、好適な反応条件下でポリマー基に結合するのに十分な反応性があれば、タンパク質に結合したいずれのアミノ基にでもポリマー基を結合させ得ることをも意図している。好ましい態様では、mplリガンドに１個のポリマー分子を結合させる。このような場合、mplリガンドと反応させるために選択するポリマーは、アシル化のための活性エステルまたはアルキル化のためのアルデヒドなどの単一の反応性基を有するように改変すべきであり、これによって重合の程度を制御することができる。ポリマーは分枝でも非分枝でもよい。好ましくは、最終生成物を治療用に使用するためには、ポリマーは医薬として許容されるものである。水溶性ポリマーは、例えば、ポリエチレングリコール、モノメトキシポリエチレングリコール、デキストラン、ポリ-（Ｎ-ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ボリプロピレンオキサイド／エチレンオキサイドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）およびポリビニルアルコールからなる群から選択することができる。アシル化反応を介したmp lリガンドの誘導体化のためには、選択されるポリマーは単一の反応性エステル基を有するべきである。還元性アルキル化反応を介したmplリガンドの誘導体化のためには、選択されるポリマーは単一の反応性アルデヒド基を有するべきである。一般的に、水溶性ポリマーは天然に存在するグリコシル残基からは選択されないであろう。なぜならば、これらは通常、哺乳動物の組換え発現系によって、より好都合に製造されるからである。ポリマーは、得られるmplリガンド誘導体の生物学的活性を実質的に妨害または排除しないかぎり、どんな分子量のものでもよい。本明細書中で使用するために特に好ましい水溶性ポリマーはポリエチレングリコールであり、PEGと短縮して称する。本明細書で使用するポリエチレングリコールまたはPEGは、モノ-(C1−C10)アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールなどの、他のタンパク質を誘導体化するのに使用されてきたいずれの形態のPEGをも包含することを意味する（米国特許第5,252,714号を参照されたい）。 mplリガンドのペギル化は当業界で知られているペギル化反応のいずれかにより行われてもよい。例えば、Focus on Growth Factors 3(2):4-10(1992);EPO 15 4 316;EP 0 401 384;およびペギル化に関する本明細書に引用されたその他の刊行物を参照のこと。ペギル化はアシル化反応または反応性ポリエチレングリコール分子とのアルキル化反応により行われることが好ましい。したがって、好ましい局面では、本発明は、PEG基がアシル基またはアルキル基により結合されるペギル化されたmplリガンドに関する。先に説明したように、このような生成物はモノ−ペギル化またはポリ−ペギル化されてもよい（例えば２−６個、好ましくは２−５個のPEG基を含む）。PEG基は一般にアミノ酸のα アミノ基またはεアミノ基の位置でタンパク質に結合されるが、PEG基がタンパク質に結合されたアミノ基（これは好適な反応条件下でPEG基に結合されるようになるのに充分に反応性である）に結合し得ることがまた意図されている。 PEG基は還元アルキル操作により結合され、５kdから50kdまでの分子量を有することが好ましい。最も好ましい実施態様では、PEG-mplリガンドは約20kd（例えば、20kd±2kd）の平均分子量を有するPEG基を有する。特に好ましいmplリガンド誘導体は最初のアミノ酸のαアミノ基について単一P EG基に結合された配列番号２のアミノ酸1-163に相当する誘導体であり、そのPEG はPEGアルデヒド反応体との還元アルキル化反応により結合される。この型のmpl リガンドが本明細書中に略号「PEG-rHuMGDF」により表される。好ましい実施態様では、mplリガンドは宿主細胞にトランスフェクトされた外来ＤＮＡ配列の発現の産物である。すなわち、好ましい実施態様では、mplリガンドは「組換えmplリガンド」である。組換えmplリガンドはこの目的に知られているあらゆる細胞、例えば、CHO細胞中でつくられてもよい。好ましい宿主はバクテリア細胞、特に好ましくはE.coli細胞である。組換えmplリガンドはクローニングおよびmplリガンドの発現に関して本明細書に引用された刊行物に記載された操作に従って好適に生成される。従来の研究者らは天然ヒトmplリガンド(配列番号２のアミノ酸1-332)を含む組成物について報告していたが、今までに、本明細書に示されたように組成物成分と広範な安定性データとの関係報告した者はいなかった。こうして、mpl リガンド組成物の安定性の予測が本発明の以前になされていたが、望ましい安定性を有する組成物が特にトランケートされた誘導体化mplリガンドについて明らかに実証されていなかった。以下に示されるデータに基いて、本発明者らは必要により少なくとも一種の水溶性ポリマーに共有結合される、天然ヒトmplリガンドのアミノ酸1-332中のアミノ酸7-151に相当するアミノ酸の配列を有する完全長またはトランケートされたm plリガンド；グルタミン酸塩、リン酸塩、ヒスチジン、イミダゾール、および酢酸塩から選ばれた緩衝剤：ソルビトール、蔗糖、マンニトール、グリセロール、ポリエチレングリコール、および非極性アミノ酸から選ばれた賦形剤；必要により、Tweenのような界面活性剤；必要により、グルタチオン、メチオニン、クエン酸塩およびEDTAから選ばれた酸化防止剤またはキレート剤を含み、かつ好ましくは5.0〜6.0の範囲のpHを有する或る種の安定な組成物を発見した。このような組成物は液体（好ましくは、水性）であってもよく、凍結されていてもよく（好ましくは、水性）、または凍結乾燥されていてもよい。最終組成物中のタンパク質（mplリガンド）の濃度は一般に約0.1mg/ml〜５mg/ ml、好ましくは0.2mg/ml〜３mg/ml、特に好ましくは0.3mg/ml〜１mg/mlの範囲であるべきである。緩衝剤は５〜20mM、特に好ましくは約10±2mMの濃度の酢酸塩であろう。特定の緩衝剤および濃度の要約が下記の表１に示される。組成物のpHは特別な緩衝剤およびその他の因子に応じて変化するであろう。適当な酸性緩衝剤（例えば、酢酸塩）による増進された安定性に好ましいpH範囲は4.0-6.0である。更に好ましい範囲は4.5-5.5であり、約5.0が最も好ましい実施態様である。組成物はまた賦形剤を含むべきである。幾つかの例示の賦形剤および代表的濃度が表２に列挙される。賦形剤は一般に等張性溶液を生じるような量で添加されるであろう。組成物はアミノ酸を更に含んでもよく、これは或る場合に安定性を増進するであろう。アミノ酸は極性または非極性であってもよく、非極性アミノ酸が好ましい。例示の極性アミノ酸はアルギニンおよびリジンであり、例示の非極性アミノ酸はグリシン、プロリン、およびアラニンである。酸化防止剤またはキレート剤がまた本発明の組成物中に含まれてもよい。好ましい酸化防止剤はEDTA、アスコルビン酸、グルタチオン、メチオニンおよびクエン酸塩である。これらの薬剤の組み合わせ、例えば、クエン酸塩＋EDTAがまた意図されている。このような薬剤はmplリガンドの酸化を減少または排除するのに適する量で含まれる。例示の濃度は0.1-10mM、好ましくは0.5-5mM、典型的には1 -3mMである。界面活性剤または脂質がまた本発明の組成物中に含まれてもよい。幾つかの代表的な界面活性剤はポリソルベートのTweenブランド（例えば、Tween 20およびTween 80）、Brij35、Pluronics(例えば、F-127およびF-68)、ドデシル硫酸ナトリウム、Triton(例えば、X-100)、ジミリストイルホスファチジルグルセロール(DMPG)、PEGヒマシ油（例えば、PEG-40）、オレス−３−ホスフェート、ジエタノールアミンオレス−10−ホスフェート、および例えば、C8（カプリル）脂質およびC14(ミリスチック)脂質を含む短鎖、長鎖単層小胞(SLUV)の混合物(例えば、1:1)である。これらの界面活性剤／脂質は一般に表面への粘着または凝集のためのmplリガンドの損失を阻止するのに充分な量で含まれる。或る例示の界面活性剤濃度は0.004mg/ml-50mg/ml、好ましくは0.004mg/ml-10mg/ml、最も好ましくは0.006mg/ml-0.060mg/mlである。これらの界面活性剤／脂質を含ませる要望は、mplリガンドの濃度が低く、例えば、特に0.2mg/ml以下のmplリガンドであるときに、より大きいであろう。このような組成物は液体であってもよく（好ましくは、水性）、凍結されていてもよく（好ましくは、水性）、または凍結乾燥されていてもよい。凍結乾燥された組成物に関して、液体組成物と比較してタンパク質凝集が増大する可能性がある。特に好ましい凍結乾燥された組成物は4.0-6.0の範囲内のpH でグルタミン酸塩、蔗糖およびマンニトールの組み合わせを含む。特に好ましい組成物のリストが下記の表３に示される。本発明の組成物は「安定」であり、これはそれらがSECクロマトグラフィーのみにより分析して37℃の温度で12週間の貯蔵後にインタクトなmplリガンド誘導体の少なくとも約87％、好ましくは約90％、最も好ましくは約93％を保持することを意味する（表４を参照のこと）。安定性の低さは、患者に許容できない安全性についての懸念をもたらすため、安定性の程度は実用的な意味で重要である。本明細書に使用される「治療有効量」は被験者中で好適な生物学的効果、通常、患者中で所定の条件および投与レジメについて治療効果を与える量をいう。本発明の組成物は非経口、静脈内または皮下で全身投与し得る。全身投与される場合、本発明における使用のための治療組成物は発熱源を含まない生理的に許される水溶液の形態であってもよい。選ばれる特別な経路は治療される症状に依存するであろう。必要とされる投薬量は患者の血小板レベルおよび／または巨核球レベルを上昇させるのに充分な量であり、治療される症状の重篤度、使用される投与の方法等に応じて変化するであろう。本発明の方法および組成物により治療される症状は、一般に既存の巨核球／血小板欠乏または将来予想される巨核球／血小板欠乏（例えば、計画された手術のため）を伴う症状である。このような症状は通常in vivoの活性mplリガンドの欠乏（一時的または永久的）の結果であろう。血小板欠乏に関する一般用語は血小板減少症であり、それ故、本発明の方法および組成物は一般に血小板減少症を治療するのに有益である。血小板減少症（血小板欠乏）は化学療法および種々の薬剤によるその他の療法、放射線療法、手術、偶発的血液損失、およびその他の特定の症状を含む種々の理由のために存在し得る。血小板減少症を伴い、本発明に従って治療し得る例示の特定の症状は再生不良性貧血、突発性血小板減少症、血小板減少症を生じる転移性腫瘍、全身性エリテマトーデス、巨牌腫、ファンコニ症候群、ビタミンB12 欠乏症、葉酸欠乏症、May-Hegglin奇形、Wiskott-Aldrich症候群、および発作性夜間ヘモグロビン尿症である。また、エイズの或る種の治療が血小板減少症を生じる(例えば、AZT)。或る種の創傷治癒障害がまた血小板の数の増加から利益を得るかもしれない。例えば、将来の手術のために予想される血小板欠乏に関して、本発明のmplリガンド類似体は血小板についての要求の数日〜数時間前に投与し得る。急性の状況、例えば、偶発かつ大量の血液損失に関して、mplリガンド類似体は血液または精製血小板とともに投与し得る。 mplリガンド組成物はまた将来血小板またはその他の関連細胞を供与する計画のある正常なヒト被験者に投与されてもよい。本発明の組成物の投与は、患者が一度に供与し得る血小板および／または関連細胞の量を増大するであろう。上記症状を治療するための方法に関係する投薬レジメは、薬剤の作用を変更する種々の因子、例えば、患者の年齢、状態、体重、性別および食事、感染症の重篤度、投与の時点およびその他の臨床上の因子を考慮して、担当医師により決められるであろう。一般に、毎日のレジメは体重１キログラム当たりmplリガンド類似体0.01-1000マイクログラムの範囲であるべきである。また、本発明の組成物は、その他の症候並びに血小板欠乏を特徴とする症状の治療に単独で、またはその他のサイトカイン、可溶性Mpl(すなわち、mplリガンド)受容体、造血因子、インターロイキン、増殖因子もしくは抗体と組み合わせて使用されてもよい。このような組成物は造血の一般的刺激物質、例えば、IL-3 またはGM-CSFと組み合わせて血小板減少症の幾つかの形態を治療するのに有益と判明するものと予想される。その他の巨核球刺激因子、すなわち、meg-CSF、幹細胞因子(SCF)、白血病抑制因子(LIF)、オンコスタチンM（OSM）、または巨核球刺激活性を有するその他の分子がまたmplリガンドとともに使用されてもよい。このような同時投与のための付加的な例示のサイトカインまたは造血因子として、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-11、コロニー刺激因子- 1(CSF-1)、GM-CSF、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、EPO、インターフェロン− α(IFN-α)、IFN-β、またはIFN-γが挙げられる。有効量の可溶性哺乳類Mpl受容体を同時または連続的に投与することが更に有益なことがあり、これは巨核球が一旦成熟形態に達すると巨核球を血小板に断片化させる効果を有することが明らかである。こうして、PEG-mplリガンドの投与（成熟巨核球の数を高めるため）、続いて可溶性Mpl受容体の投与（類似体を不活化し、成熟巨核球に血小板を生じさせるため）は血小板生産を刺激する特に有効な手段であると予想される。上記投薬量は治療組成物中のこのような付加的な成分を補償するように調節されるであろう。治療された患者の経過は通常の方法により監視し得る。下記の実施例は本発明を更に充分に説明するために提示され、本発明の範囲を限定するものと見なされるべきではない。実施例１下記の表４および５は下記の実施例の幾つかに示されたデータの要約である。これらの実施例のそれぞれでは、試験したmplリガンドはPEG-rHuMGDFであり、これは約20kDaの平均分子量を有するポリエチレングリコール基でＮ末端アミノ酸のαアミノ基の位置でモノ−ペギル化された配列番号２のアミノ酸1-163を含む。 ¹付加的な安定性を示すアッセイ、詳しくは、逆相クロマトグラフィーおよび陽イオン交換クロマトグラフィーがSECと同様の結果を生じた。主ピークの減少％は、4.0-6.0、好ましくは5.0-6.0のpH範囲が好ましいことを示す。加えて、pH範囲4.0-6.0内の緩衝効果は、この範囲内の或る種の緩衝剤が好ましくないことを示す。ソルビトール、蔗糖、グリセロール、マンニトールおよびポリエチレングリコールを含む、試験した全てのポリオールは同様の結果を示した。 NaCl、CaCl₂、CuCl₂、MgCl₂、MnCl₂、NiCl₂、ZnCl₂およびFeCl₂を含む全ての塩（１価および２価の両方）が同様の結果を示した。アルギニン、およびリジンを含む、試験した全ての極性アミノ酸は同様の結果を示した。グリシン、プロリン、およびアラニンを含む、試験した全ての非極性アミノ酸は同様の結果を示した。 EDTA、アスコルビン酸、グルタチオン、メチオニン、メチオニン＋EDTAおよびクエン酸塩を含む、試験した全ての酸化防止剤はA5OS（定義に関する実施例２を参照のこと）を越えるPEG-rHuMGDFの安定性の実質的な増大を示さなかった。実施例２ pH 評価 A．出発物質： PEG-rHuMGDF B．製剤： 10mM酢酸塩pH5.0、５％ソルビトール（A50S） 10mM酢酸塩pH4.0、５％ソルビトール（A40S） 10mMコハク酸塩pH3.5、５％ソルビトール（S35S） 10mMコハク酸塩pH4.0、５％ソルビトール（S40S） 10mMコハク酸塩pH5.0、５％ソルビトール（S50S） 10mMヒスチジンpH6.0、５％ソルビトール（H60S） 10mMイミダゾールpH6.0、５％ソルビトール（I60S） 10mM酒石酸塩pH4.0、５％ソルビトール（T40S） 10mMグルタミン酸塩pH4.0、５％ソルビトール（E40S） 10mMリン酸塩pH6.0、５％ソルビトール（P60S） 10mMリン酸塩pH7.0、５％ソルビトール（P70S） 10mMTrispH8.0、５％ソルビトール（T80S） 10mMヒスチジンpH5.0、５％ソルビトール（H50S） 10mMヒスチジンpH6.0、５％ソルビトール（H60S） 10mMヒスチジンpH7.0、５％ソルビトール（H70S） 10mMヒスチジンpH8.0、５％ソルビトール（H80S） C．バイアル：0.5mg/mLのタンパク質濃度で入れられた3ccバイアル中１mL D．温度＆時点：37℃；表に示された時点 E．分析： HPLC:サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)、逆相クロマトグラフィー(RP)、イオン交換クロマトグラフィー(IEX) F．データ表６−11は示された時間にわたる37℃のインキュベーション後のサイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーおよび陽イオン交換クロマトグラフィーによる主ピーク％を示す。 pHの評価−37℃にて指示時間にわたってインキュベートした後でのサイズ排除クロマトグラフィーによる主要ピーク(％) pHの評価−37℃にて指示時間にわたってインキュベートした後での逆相クロマトグラフィーによる主要ピーク(％) pHの評価−37℃にて指示時間にわたってインキュベートした後での陽イオン交換クロマトグラフィーによる主要ピーク（％）実施例３ Mpl リガンド濃度の評価 A.出発材料： PEG-rHuMGDF B.処方： 10mM 酢酸塩 pH5.0、5%ソルビトール、2.0mg/ml （20A5S） 10mM 酢酸塩 pH5.0、5%ソルビトール、1.0mg/ml （10A5S） 10mM 酢酸塩 pH5.0、5%ソルビトール、0.5mg/ml （05A5S） 10mM 酢酸塩 pH5.0、5%ソルビトール、0.2mg/ml （02A5S） C.バイアル： 3cc容のバイアルに所定のタンパク質濃度で1ml満たす D.温度および時点： 37℃；表に示す時点 E.分析： HPLC：SEC、RP、IEX F.データ表12〜14には、37℃にて指示時間にわたってインキュベートした後でのサイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーおよび陽イオン交換クロマトグラフィーによる主要ピーク(％)を示す。 Mplリガンド濃度の評価−指示時間37℃でインキュベーションした後の主要ピーク(％) 表12 サイズ排除クロマトグラフィー *Form.＝処方表13 逆相クロマトグラフィー表14 陽イオン交換クロマトグラフィー実施例４賦形剤の評価 A.出発材料： PEG-rHuMGDF B.処方： 10mM 酢酸塩 pH5.0、5%ソルビトール、5mM EDTA（A5SE） 10mM 酢酸塩 pH5.0、2%アラニン（A5A） 10mM 酢酸塩 pH5.0、1.6%グリシン（A5G） 10mM 酢酸塩 pH5.0、2.7%プロリン（A5P） 10mM 酢酸塩 pH5.0、3.5%リシン（A5K） 10mM 酢酸塩 pH5.0、4.3%アルギニン（A5R） 10mM グルタミン酸 pH5.0、9.3%ショ糖（E5Su） 10mM グルタミン酸 pH5.0、5%ソルビトール（E5S） C.バイアル： 3cc容バイアルにタンパク質濃度0.5mg/mlで1ml満たす D.温度および時点： 37℃；表に示す時点 E.分析： HPLC：SEC、RP、IEX F.データ表15〜17には、37℃にて指示時間にわたってインキュベートした後でのサイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーおよび陽イオン交換クロマトグラフィーによる主要ピーク(％)を示す。賦形剤の評価−指示時間37℃でインキュベーションした後の主要ピーク(％) 表15 サイズ排除クロマトグラフィー表16 陽イオン交換クロマトグラフィー表17 逆相クロマトグラフィー実施例５等張性の評価 A.出発材料： PEG-rHuMGDF B.処方： 10mM 酢酸塩 pH5.0、9.3%ショ糖（A5SU） 10mM 酢酸塩 pH5.0、5%マンニトール（A5MA） 10mM 酢酸塩 pH5.0、140mM NaCl （A5N） 10mM 酢酸塩 pH5.0、2%PEG 8000 （A5P8） 10mM 酢酸塩 pH5.0、2.5%グリセロール（A5G） 10mM 酢酸塩 pH5.0、5%ソルビトール、0.01%Tween20（A5ST） 10mM ヒスチジン pH6.0、5%ソルビトール（H6S） 10mM ヒスチジン pH6.0、5%ソルビトール、0.001%アスコルビン酸（H6AA） C.バイアル： 3cc容バイアルにタンパク質濃度0.5mg/mlで1ml満たす D.温度および時点： 37℃；表に示す時点 E.分析： HPLC：SEC、RP、IEX F.データ表18〜20には、37℃にて指示時間にわたってインキュベートした後でのサイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーおよび陽イオン交換クロマトグラフィーによる主要ピーク(％)を示す。等張性の評価−指示時間37℃でインキュベーションした後の主要ピーク(％) 表18 サイズ排除クロマトグラフィー *Form.＝処方表１９逆相クロマトグラフィー表２０陽イオン交換クロマトグラフィー実施例６抗酸化剤／キレート剤の評価Ａ．出発物質：PEG-rHuMGDF Ｂ．処方： 10mM酢酸塩pH5.0、５％ソルビトール３mMグルタチオン（A5S GT） 10mM酢酸塩pH5.0、５％ソルビトール５mMメチオニン（A5S M） 10mM酢酸塩pH5.0、５％ソルビトール５mMメチオニン、１mM EDTA （A5S ME） 10mM酢酸塩pH5.0、５％ソルビトール１mMクエン酸塩（A5S C） 10mM酢酸塩pH5.0、５％ソルビトール 0.5mMクエン酸塩（A5S 05C） 10mM酢酸塩pH5.0、５％ソルビトール 1mM EDTA （A5S 1E） 10mM酢酸塩pH5.0、５％ソルビトール 0.5mM EDTA （A5S E）Ｃ．バイアル：3cc容のバイアルにタンパク質濃度0.5mg/mlで１ml満たす。Ｄ．温度および時点：37℃；表に示す時点Ｅ．分析：HPLC：SEC、RP、IEX Ｆ．データ表21〜23は、37℃にて指示時間にわたってインキュベートした後でのサイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、および陽イオン交換クロマトグラフィーによる主要ピーク(％)を示す。抗酸化剤／キレート剤の評価−37℃で指示時間にわたってインキュベートした後での主要ピーク（％）表２１サイズ排除クロマトグラフィー表２２逆相クロマトグラフィー表２３陽イオン交換クロマトグラフィー実施例７界面活性剤の評価Ａ．出発物質：PEG-rHuMGDF Ｂ．処方：全ての処方は、５％ソルビトールおよび0.050mg/mlのPEG-rHuMGDFと共に10mM 酢酸塩（pH5.0）を含む。 004T20：0.004mg/mlのTween-20 006T20：0.006mg/mlのTween-20 010T20：0.010mg/mlのTween-20 040T20：0.040mg/mlのTween-20 060T20：0.060mg/mlのTween-20 004T80：0.004mg/mlのTween-80 006T80：0.006mg/mlのTween-80 010T80：0.010mg/mlのTween-80 040T80：0.040mg/mlのTween-80 060T80：0.060mg/mlのTween-80 Ｃ．データ表24は、主要ピーク（％）に基づく逆相HPLC精製の結果を示す。Ｄ．結果 PEG-rHuMGDF処方物には、化学的安定性に悪影響を及ぼすことなしに物理的安定性および回収率を増大させるために、Tweenのような界面活性剤を含有させてもよい。Tween-20およびTween-80は、PEG-rHuMGDF処方物に最終濃度約0.060mg/m lまで添加することが可能であり、この場合、過度のメチオニン酸化は起こらない。Tween-20およびTween-80は0.006mg/ml〜0.06mg/mlの濃度範囲で最も効果的である。実施例８凍結乾燥した組成物以下の表25は、mplリガンドを含む凍結乾燥した組成物について得られたデータをまとめたものである。これらの例の各々において、試験したmplリガンドはP EG-rHuMGDFであり、これは配列番号２のアミノ酸1〜163を含み、Ｎ末端アミノ酸のαアミノ基においてポリエチレングリコール基によりモノPEG化されており、平均分子量が約20kDaである。表25〜27では、分析の前に、凍結乾燥したPEG-rHuMGDFを注射用として約１mlの水で戻し、主要ピーク（％）は、凍結乾燥の結果としてのPEG-rHuMGDFの回収率を表す。注：Mplリガンド濃度は0.5mg/mlとした。凍結乾燥したサンプルでは、サイズ排除により測定したところ、pHが６、７および８では物理的安定性がさらに達成されることはなかった。調べたショ糖の濃度範囲調べた緩衝液（10mM濃度）の範囲表２７アミノ酸（例えば、等張アルギニン、リシン、プロリンおよびヒスチジン）のような全ての安定化剤および非晶化剤（例えば、トレハロースおよびPEG）は凍結乾燥の間に改善された安定性を示さなかった。最良の主要ピーク回収率および最小レベルの凝集を示す処方： 10mMグルタメート、６％ショ糖、２％マンニトール、pH5.0 本発明はその好ましい実施形態と思われるものについて記載してきたが、開示した実施形態に限定されるものではなく、それどころか、添付の請求の範囲の精神および範疇に含まれる種々の修飾および等価物を包含しようとするものであり、その範疇には、かかる修飾および等価物を全て包含するような最も広い解釈が与えられるものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者トリューヘイト，マイケル，ジェイ. アメリカ合衆国 91320 カリフォルニア州，ニューバリーパーク，パメラウッドストリート 824

Claims

【特許請求の範囲】１． mplリガンド；グルタミン酸塩、リン酸塩、ヒスチジン、イミダゾール、酢酸塩よりなる群から選ばれる緩衝化剤；ソルビトール、ショ糖、マンニトール、グリセロール、ポリエチレングリコール、非極性アミノ酸よりなる群から選ばれる賦形剤を含み、ｐＨが５．０以上６．０以下である組成物。２． mplリガンドが、少なくとも配列番号２のアミノ酸７−１５１を含む請求の範囲第１項に記載の組成物。３． mplリガンドが、少なくとも配列番号２のアミノ酸１−１７１±２０アミノ酸を含む請求の範囲第１項に記載の組成物。４． mplリガンドが、少なくとも配列番号２のアミノ酸１−１６１±１０アミノ酸を含む請求の範囲第１項に記載の組成物。５． mplリガンドが、少なくとも配列番号２のアミノ酸１−１５１を含む請求の範囲第１項に記載の組成物。６． mplリガンドが、少なくとも配列番号２のアミノ酸１−１６３を含む請求の範囲第１項に記載の組成物。７． mplリガンドが、ポリエチレングリコール、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコール単独重合体、ならびにプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオールよりなる群から選ばれる水溶性ポリマーに付着されている請求の範囲第１項に記載の組成物。８．水溶性ポリマーがポリエチレングリコールである請求の範囲第７項に記載の組成物。９．緩衝化剤として酢酸塩を含み、賦形剤としてソルビトールを含み、ｐＨが約５．０で、水系溶媒への溶液である請求の範囲第６項に記載の組成物。１０．非極性アミノ酸が、グリシン、プロリン、アラニンよりなる群から選ばれるものである請求の範囲第１項に記載の組成物。１１．さらに、抗酸化剤を含む請求の範囲第１項に記載の組成物。１２．抗酸化剤が、EDTA、アスコルビン酸、グルタチオン、メチオニン、シトレートよりなる群から選ばれるものである請求の範囲第１１項に記載の組成物。１３．さらに、界面活性剤あるいは脂質を含む請求の範囲第１項に記載の組成物。１４．界面活性剤が、Tween；Brij 35；Pluronic；ドデシル硫酸ナトリウム； Triton；ジミリストイルホスファチジルグリセロール（DMPG）；PEG−４０ヒマシ油、オレス−３−リン酸塩；オレス−１０−リン酸ジエタノールアミン；Ｃ８（カプリル）およびＣ１４（ミリスチン）脂質を含む短鎖および長鎖のユニラメラ小胞（SLUV）の混合物よりなる群から選ばれるものである請求の範囲第１３項に記載の組成物。１５．水系溶媒への溶液である請求の範囲第１項に記載の組成物。１６．凍結乾燥形態である請求の範囲第１項に記載の組成物。１７．リン酸塩緩衝化剤と５％のソルビトールを含み、ｐＨが約６．０であり、水系溶媒への溶液である請求の範囲第１項に記載の組成物。１８．ヒスチジン緩衝化剤と約５％のソルビトールを含み、水系溶媒への溶液である請求の範囲第１項に記載の組成物。１９．イミダゾール緩衝化剤と約５％のソルビトールを含み、水系溶媒への溶液である請求の範囲第１項に記載の組成物。２０．グルタミン酸塩緩衝化剤と約５％のソルビトールを含み、水系溶媒への溶液である請求の範囲第１項に記載の組成物。２１．グルタミン酸塩緩衝化剤と５％のソルビトールを含み、ｐＨが約５．０であり、水系溶媒への溶液である請求の範囲第１項に記載の組成物。２２．グルタミン酸塩緩衝化剤、約６％のショ糖、約２％のマンニトールを含み、ｐＨが約５．０であり、凍結乾燥形態である請求の範囲第１項に記載の組成物。