JP2002510966A - 自動蛋白質デザインのための装置および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、定量的蛋白質デザインおよび最適化のための装置および方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 自動蛋白質デザインのための装置および方法 本出願は１９９７年４月１１日に出願された米国特許出願第６０／０４３，４ ６４号、１９９７年８月４日に出願された第６０／０５４，６７８号および１９ ９７年１０月３日に出願された６０／０６１，０９７号の継続出願である。 発明の分野 本発明は定量的蛋白質デザインおよび最適化のための装置および方法に関する 。 発明の背景 ドォノボ（de novo）蛋白質のデザインは最近かなり注目を受けており、新規 配列を持つ安定でよく折り畳まれた蛋白質を生産する目標に向けてかなり進歩が なされてきた。蛋白質をデザインする努力は、配列中の疎水性および親水性残基 のパターン、塩ブリッジおよび水素結合、およびアミノ酸の二次構造選択性のご とき、蛋白質構造を決定する物理的特性の知識に頼るものである。これらの原理 を適用する種々のアプローチが試みられてきた。例えば、天然様配列を持つα− ラセンおよびβ−シート蛋白質の構築は、標的折り畳みにおける各位置で必要な 残基を個々に選択することによって試みられた(Hechtら、Science，249:884-891 （1990）；Quinnら、Proc．Natl．Acad．Sci USA 91:8747-8751（1994））。あ るいは、ミニマリストアプローチを用いて、ラセン蛋白質をデザインし、ここに 、折り畳まれた構造と合致すると考えられる最も単純な可能な配列が創製され(R eganら、Science，241:976-978（1988）；DeGradoら、Science，243:622-628(19 89)；Handelら、Science，261:879-885(1993))、種々の程度成功している。配列 の疎水性で極性（ＨＰ）のパターンに頼る実験方法が開発され、そこでは、４つ のラセン束についての正しいパターンを持つ配列のライブラリーが、ランダム突 然変異誘発によって創製された（Kamtekarら、Science，262:1680-1685(1993)） 。非ドォノボ（non de novo）アプローチの中で、天然に生じる蛋白質 のドメインは修飾され一緒にカップリングされて、所望の三次組織を達成する(P essiら、Nature，362:367-369(1993);Pomerantzら、Science，267:93-96(1995)) 。 正しい二次構造および総じての三次組織は前記技術のうちいくつかによって達 成されたが、多くのデザインされた蛋白質は天然蛋白質の構造特異性を欠くよう である。折り畳まれた蛋白質におけるアミノ酸の相補的幾何学的配置はこの特異 性の根本であり、配列中にコードされている。 いくつかのグループは系統的で定量的方法を、一般的デザインアルゴリズムを 開発する目標を持つ蛋白質デザインに適用し、実験的にテストしてきた(Helling aら、J．Mol．Biol．222:763-785(1991)；Hurleyら、J．Mol．Biol．224:1143-1 154(1992)；Desjartaislら、Protein Science 4:2006-2018(1995)；Harburyら、 Proc．Natl．Acad．Sci USA 92:8408-8412(1995)；Klembaら、Nat．Struc．Biol ．2:368-373(1995)；Nautiyalら、Biochemistry 34:11645-11651(1995)；Betzo ら、Biochemistry 35:6955-6962(1996)；Dahiyatら、Protein Science 5:895-90 3(1996)；Jones，Protein Science 3:567-574(1994)；Konoiら、Proteins:Struc ture，Function and Genetics 19:244-255(1994))。これらのアルゴリズムは、 考慮下にある原子配列を明示的にモデル化することによって、側鎖の空間的位置 決定および立体的相補性を考慮する。今日、かかる技術は、典型的には、蛋白質 のコアをデザインすることに焦点を当て、配列をファンデルワールスおよび時々 は疎水性溶媒和ポテンシャルでもって評価してきた。 加えて、多くのデザインアプローチの定量的性質が改良された二次生成蛋白質 の開発を妨げてきた。何故ならば、過去のデザインの成功および失敗から学ぶ客 観的な方法がないからである。 従って、汎用コンピューターで実行される客観的定量的デザイン技術蛋白質の コンピューターデザインおよびその最適化を提供するのが本発明の目的である。 発明の概要 前記概説の目的で、本発明は、プログラムの制御下でコンピューターによって 実行される方法を提供し、該コンピューターはプログラムを貯蔵するメモリーを 含む。該方法は可変残基位置を持つ蛋白質骨格構造を受け取り、可変残基位置の 各々につき可能なロタマーの群を確立し、ここに、少なくとも１つの可変残基は 少なくとも２つの異なるアミノ酸側鎖からのロタマーを有し、次いで、ロタマー の各々と蛋白質骨格構造の残りの全てまたは一部との相互作用を分析して最適化 蛋白質配列の組を創製する工程を含む。該方法は、さらに、各可変蛋白質をコア 、表面または境界残基いずれかとして分類することを含む。該分析工程は、デッ ドエンド除去（ＤＥＥ）計算を含み得る。一般に、該分析工程はファンデルワー ルスポテンシャルスコアリング機能、水素結合ポテンシャルスコアリング機能、 原子溶媒和スコアリング機能、二次構造性質スコアリング機能および静電スコア リング機能よりなる群から選択される少なくとも１つのスコアリング機能の使用 を含む。該方法は、さらに、全体的最適蛋白質配列からのさらなる最適配列のラ ンク付けリストを生成させることを含む。順序付けリストからの蛋白質配列のい くつかまたは全てをテストして、可能なエネルギーテスト結果を得ることができ る。 さらなる態様において、本発明は、本発明の方法によって創製された蛋白質配 列をコードする核酸配列、および該核酸を含有する発現ベクターおよび宿主細胞 を提供する。 さらなる態様において、本発明は、蛋白質骨格モデルの残基部分用の可能なロ タマーの群を相関させるための側鎖モジュール、および該ロタマーの各々と該蛋 白質の残りの全てまたは一部との相互作用を分析して、最適化蛋白質配列の組を 得るためのランキングモジュールを含む、特異的に機能するようにコンピュータ ーに指令するためのコンピューターリーダブルメモリーを提供する。該メモリー は、さらに、ポテンシャルエネルギーテスト結果および理論的ポテンシャルエネ ルギーデータの間の対応を評価するための評価モジュールをさらに含むことがで きる。 図面の簡単な説明 図１は、本発明の実施例に従って構成した汎用コンピューターを示す。 図２は、本発明の実施例に関連するプロセッシング工程を示す。 図３は、本発明の実施例に関するランキングモジュールに関連するプロセッシ ング工程を示す。いずれかのＤＥＥ工程後に、以前のＤＥＥ工程のうちのいずれ か１つを反復することができる。加えて、該ＤＥＥ工程のうちのいずれか１つを 排除することができる；例えば、オリジナルの単一ＤＥＥ（工程７４）は実行す る必要がない。 図４は、蛋白質デザイン自動化サイクルを示す。 図５は、コイルドコイルのラセンホイール流れ図である。１つのヘプタド反復 が、ラセンの主要軸から下方に示される。ａおよびｄ位置は分子の溶媒が接近で きないコアを規定する（Cohen & Parry，1990，Proteins，Structure，Function and Genetics 7:1-15）。 図６Ａおよび６Ｂは、実験Ｔｍに対するシミュレーションコスト機能の比較を 示す。図６Ａは最初のコスト機能を示し、これは８つのＰＤＡペプチドについて のファンデルワールス項のみを含有する。図６Ｂは、ＱＳＡＲ分析に由来する原 子溶媒和パラメーターによって重みを付けられた極性および非極性表面積項を含 有する改良されたコスト機能を示す：１６ｃａｌ／モル／Ųが疎水性表面埋も れに好都合である。 図７は、シミュレーションモジュール対λリプレッサー突然変異体の組合せ活 性スコアによって示されたエネルギーのランク相関を示す（Limら、J．Mol．Bio l．219:359−376(1991);Hellingaら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91:5803-580 7(1994)）。 図８は、Ｚｉｆ２６８の第２亜鉛フィンガーと整列させたｐｄａ８ｄの配列を 示す。箱の位置は配列選択アルゴリズムを用いて設計した。残基３３−６０から のＰＤＢ記録１ｚａａの座標(Paveletchら、Science 252:809-817(1991))を構造 鋳型として使用した。我々のナンバリングでは、位置１は１ｚａａ位置３３に対 応する。 図９Ａおよび９Ｂは、実施例３からのｐｄａ８ｄのＮＭＲスペクトルおよび溶 液二次構造を示す。図９Ａは、ｐｄａ８ｄのＴＯＣＳＹ Ｈα−ＨＮフィンガー プリントである。図９Ｂは、ｐｄａ８ｄのＮＭＲ ＮＯＥ結合性である。棒は明 確な結合性を表し、順次の結合の棒の太さは共鳴の強度の指標である。 図１０Ａおよび１０Ｂは、α９０、α８５、α７０およびα１０７の二次構造 含有量および熱的安定性を示す。図１０Ａは遠紫外スペクトルを示す（円二色性 ）。図１０ＢはＣＤによってモニターされた熱的変性を示す。 図１１は、Ｚｉｆ２６８の第２亜鉛フィンガーと整列させた実施例５のＦＳＤ −１の配列を示す。図の頂部の棒は残基位置の分類を示し、実線棒はコア位置を 示し、ハッチングを施した棒は境界位置を示し、塗っていない棒は表面位置を示 す。整列はＺｉｆ２６８の対応する骨格鋳型位置にＦＳＤ−１をマッチさせる。 ＦＳＤ−１およびＺｉｆ２６８の間の６つの同一位置（２１％）のうち、４つが 埋もれている（Ｉｌｅ７、Ｐｈｅ１２、Ｌｅｕ１８およびＩ１ｅ２２）。Ｚｉｆ ２６８の亜鉛結合残基は箱に入れる。モンテカルロシミュレートアニーリングプ ロトコルを用いて決定された代表的な非最適配列溶液をそれらのランクと共に示 す。垂直線はＦＳＤ−１との同一性を示す。図の底部の記号は、頂部１０００配 列を横切って計算された各残基位置についての配列保存性の程度を示す；塗りつ ぶした丸は９９％を超える保存を示し、半分塗りつぶした丸は９０および９９％ の間の保存を示し、塗りつぶしていない丸は５０および９０％の間の保存を示し 、記号の不存在は５０％未満の保存を示す。各位置における最高の出現を持つア ミノ酸を選択することによって決定されたコンセンサス配列はＦＳＤ−１の配列 と同一である。 図１２は、スピード強化を構築するのに使用される最小および最大量（方程式 ２４ないし２７で定義）の模式図である。／i_uj_v／_mb対を見出すために、および 極値の比較に、最小および最大を直接使用する。矢印で示した量の間の差異を用 いて、q_rsおよびq_uvメトリックスを構築する。 図１３Ａ、１３Ｂ、１３Ｃ、１３Ｄ、１３Ｅおよび１３Ｆは、方程式１８およ び１９の埋もれたおよび露出された面積を計算するに関与する面積を示す。ダッ シュ線の箱印は蛋白質鋳型であり、より肉太の実線は３つの異なる残基位置にお ける３つのロタマーに対応し、肉太度がより低い実線は表面積に対応する。ａ） 重線によって示される。方程式１８によって計算された埋もれた面積は（ｃ）で 示された鋳型によって埋もれた面積に、（ｆ）で表されたロタマー間で埋もれた 面積をｓ倍したものを加えたものである。計数逓減率ｓは（ｆ）における二重線 によって示された過剰計数を説明する。方程式１９によって計算された露出面積 は、（ｂ）で表された鋳型の存在下のものであり、（ｆ）で表されたロタマーの 間で埋もれた面積をｓ倍したものを引いたものである。 発明の詳細な説明 本発明は、所望の構造についての最適配列を求める、「逆蛋白質折り畳み」ア プローチを用いる、アミノ酸配列の定量的デザインおよび最適化に指向される。 逆折り畳みは蛋白質デザインに同様であり、それは所望の構造に折り畳まれる配 列または配列の組を求める。これらのアプローチは、所与の配列によって採られ る構造を予測するのを試みる「蛋白質結合」アプローチと対照することができる 。 本発明の一般的な好ましいアプローチは以下の通りであるが、別の具体例は後 記する。既知の蛋白質構造を出発点として使用する。対で、最適化すべき残基を 同定し、これは完全配列またはそのサブセットであり得る。対で、変化させるベ きいずれかの位置の側鎖を除去する。蛋白質骨格および残りの側鎖よりなる得ら れた構造は鋳型と呼ばれる。次いで、各可変残基位置を好ましくはコア残基、表 面残基、または境界残基として分類され；各分類は該位置についての可能なアミ ノ酸残基のサブセットを定義する（例えば、コア残基は一般に疎水性残基のセッ トから選択され、表面残基は一般に親水性残基から選択され、および境界残基は いずれかであり得る）。各アミノ酸はロタマーと呼ばれる、各側鎖全ての許され るコンフォーマーの区別されるセットによって表すことができる。かくして、骨 格についての最適配列に到達するには、ロタマーの可能な配列をスクリーニング しなければならず、ここに、各骨格位置は、全てのその可能なロタマー状態にお ける各アミノ酸、またはアミノ酸のサブセット、およびかくしてロタマーのサブ セットいずれかによって占めることができる。 次いで、相互作用の２セットを各々の位置において各ロタマーにつき計算する ：ロタマー側鎖の骨格の全てまたは一部との相互作用（「シングル」エネルギー 、ロタマー／鋳型またはロタマー／骨格エネルギーとも呼ばれる）、およびロタ マー側鎖と各々の他の位置または他の位置のサブセットにおける全ての他の可能 なロタマーとの相互作用（「ダブル」エネルギー、ロタマー／ロタマーエネルギ ーとも呼ばれる）。これらの相互作用の各々のエネルギーは、種々のスコアリン グ機能の使用を介して計算され、これはファンデルワールス力のエネルギー、水 素結合のエネルギー、二次構造傾向のエネルギー、表面積溶媒和のエネルギーお よび静電エネルギーを含む。従って、骨格および他のロタマーに関する、各ロタ マー相互作用の合計エネルギーが計算され、マトリックス形態で貯蔵される。 ロタマーセットの区別される性質はテストすべきロタマー配列の数の単純な計 算を可能とする。位置当たりｍ個の可能なロタマーの長さｎの骨格はmⁿ個の可能 なロタマー配列を有し、これは配列の長さと共に指数関数的に増加し、計算をリ アルタイムでは扱いにくいまたは不可能とする数である。従って、この組合せサ ーチ問題を解決するには、「デッドエンド除去」（ＤＥＥ）計算が好ましい。Ｄ ＥＥ計算は、もし最初のロタマーの最悪の合計相互作用が依然として第２ロタマ ーの最良合計相互作用よりも良好であるならば、第２ロタマーは全体的最適解決 の一部とはなり得ないという事実に基づいている。全てのロタマーのエネルギー は既に計算されているので、ＤＥＥアプローチはロタマーをテストし除去するた めに配列長さにわたっての合計を必要とするに過ぎず、これは、計算をかなりス ピードアップさせる。ＤＥＥを再実行してロタマーの対またはロタマーの組合せ を比較することができ、これは、結局は全体的最適エネルギーを表す単一配列の 決定となる。 一旦全体的解決が見出されたならば、モンテカルロサーチを行って、ＤＥＥ解 決の隣の配列のランク付けリストを得ることができる。ＤＥＥ解決で出発し、ラ ンダムな位置を他のロタマーに変え、新しい配列エネルギーを計算する。もし新 しい配列が許容の基準に適合すると、それをもう１つのジャンプ用の出発点とし て用いる。所定数のジャンプの後、配列のランク付けリストが得られる。 次いで、１以上の蛋白質配列を物理的に創製させ、続いて実験的にテストする ことによって、結果が実験的に証明することができる。次いで、テストから得ら れた情報を分析にフィードバックして、要すれば手法を修正することができる。 かくして、本発明は、蛋白質をデザインするコンピューター支援方法を提供す る。該方法は、可変側鎖位置を持つ蛋白質骨格構造を供し、次いで、残基位置の 各々につき可能なロタマーの群を確立することを含む。本明細書で用いる骨格ま たは鋳型は、骨格原子およびいずれの固定された側鎖も含む。蛋白質骨格および 可能なロタマーの間の相互作用、および可能なロタマーの対の間の相互作用を次 いで加工して、最適化蛋白質配列のセット、好ましくは単一全体的最適を得、次 いでこれを用いて他の関連配列を創製することができる。 図１は本発明の具体例に関する自動蛋白質デザインアプローチ２０を示す。装 置２０はメモリー２４およびバス２８を通じてのインプット／アウトプットデバ イスセット（例えば、キイボード、マウス、モニター、プリンター等）２６と連 絡する中央プロセッシングユニット２２を含む。中央プロセッシングユニット２ ２、メモリー２４、インプット／アウトプットデバイス２６、およびバス２８の 間の一般的相互作用は当該分野で知られている。本発明はメモリー２４に貯蔵さ れた自動蛋白質デザインプログラム３０に指向される。 自動蛋白質デザインプログラム３０は側鎖モジュール３２で実行することがで きる。後記で詳細に記載するごとく、側鎖モジュールは選択された蛋白質骨格構 造についての可能なロタマーの群を確立する。蛋白質デザインプログラム３０は ランキングモジュール３４で実行することもできる。後記で詳細に記載するごと く、ランキングモジュール３４は、ロタマーと蛋白質骨格構造との間の相互作用 を分析して、最適化蛋白質配列を創製する。また、蛋白質デザインプログラム３ ０は、最適化蛋白質配列に関して、サーチ、例えば後記するモンテカルロサーチ を実行するサーチモジュール３６を含むこともできる。最後に、評価モジュール ３８を用いて、さらに後記する誘導された蛋白質に関連する物理的パラメーター を評価することもできる。 また、メモリー２４はインプット／アウトプットデバイス２６を介してユーザ ーによってダウンロードされた、蛋白質後記構造４０を貯蔵する。また、メモリ ー２４は側鎖モジュール３２によって誘導された可能なロタマーに関する情報を 貯蔵する。加えて、メモリー２４はランキングモジュール３４によって創製され た蛋白質配列４４を貯蔵する。蛋白質配列４４はインプット／アウトプットデバ イス２６への出力として通過させることもできる。 自動蛋白質デザイン装置２０の操作は、図２を参照してより十分に認識される 。図２は、本発明の方法に関して実行されたプロセッシング工程を示す。後記す るごとく、プロセッシング工程の多くは蛋白質デザインプログラム３０によって 実行される。図２に示された第１のプロセッシング工程は蛋白質骨格構造を供す るものである（工程５０）。前記したごとく、蛋白質骨格構造は標準的技術を用 いインプット／アウトプットデバイス２６を介してダウンロードされる。 蛋白質骨格構造は選択された蛋白質に対応する。本明細書中で「蛋白質」とは 、ペプチド結合によって一緒に連結した少なくとも２個のアミノ酸を意味する。 本明細書で用いるごとく、蛋白質は、蛋白質、オリゴペプチドおよびペプチドを 含む。ペプチジル基は天然に生じるアミノ酸およびペプチド結合、または合成ペ プチドミメティックス構造、すなわち、ペプトイドのごとき「アナログ」を含む ことができる(Simonら、PNAS USA 89(20):9367(1992)参照)。当業者によって認 識されるごとく、アミノ酸は天然に生じるまたは天然に生じないものであり得、 ロタマーのセットが知られている、または生じさせることができるいずれの構造 もアミノ酸として用いることができる。側鎖は（Ｒ）または（Ｓ）立体配置いず れかであり得る。好ましい具体例において、アミノ酸は（Ｓ）またはＬ−立体配 置である。 選択された蛋白質は、三次元構造が知られている、または創製することができ る、すなわち、蛋白質の各原子につき三次元座標があるいずれの蛋白質でもあり 得る。一般に、これは、Ｘ線結品学的技術、ＮＭＲ技術、de novoモデリング、 相同性モデリング等を用いて決定することができる。一般に、もしＸ線構造を用 いれば、２Å以上の分解能における構造が好ましいが、必要ではない。 蛋白質は原核生物および真核生物を含めたいずれの生物からのものであっても よく、細菌、菌類、古細菌のごとき好極限性細菌、昆虫、魚類、動物（特に、哺 乳動物、特にヒト）および鳥類からの酵素は全て可能である。 適当な蛋白質は、限定されるものではないが、リガンド、細胞表面受容体、抗 原、抗体、サイトカイン、ホルモンおよび酵素を含めた産業的および医薬蛋白質 を含む。適当なクラスの酵素は限定されるものではないが、プロテアーゼ、カル ボヒドラーゼ、リパーゼのごときヒドロラーゼ；ラセマーゼ、エピメラーゼ、タ ウロメラーゼ、またはムターゼのごときイソメラーゼ；トランスフェラーゼ、キ ナーゼ、オキシドレダクターゼ、およびホスファターゼを含む。適当な酵素はSw iss-Prot酵素データベースにリストされている。 適当な蛋白質骨格は限定されるものではないがBrookhaven National Lab.によ って編集され供給される蛋白質データ中に見出されるものを全て含む。 特に、 「蛋白質」には、酵素ドメイン、結合ドメイン等のごとき機能的ドメ イン、およびターン、ループ等のごときより小さい断片を含めた公知の蛋白質の 断片およびドメインが含まれる。すなわち、蛋白質の一部も同様に使用すること ができる。 一旦蛋白質が選択されたならば、蛋白質骨格構造をコンピューターにインプッ トする。本明細書における「蛋白質骨格構造」または文法的同等物とは、特定の 蛋白質の三次元構造を規定する三次元座標を意味する。（天然に生じる蛋白質の ）蛋白質骨格構造を含む構造は、β−炭素に対するα−炭素からのベクターの方 向に沿った、窒素、カルボニル炭素、α−炭素、およびカルボニル酸素である。 コンピューターにインプットされる蛋白質骨格構造は、骨格およびアミノ酸側 鎖双方についての、または丁度骨格についての座標（すなわち、アミノ酸側鎖の 座標は除かれる）いずれかを含む。もし前者を行えば、蛋白質構造の各アミノ酸 の側鎖原子は当該分野で知られているように蛋白質の構造から「奪われる」また は除かれ、「骨格」原子（窒素、カルボニル炭素および酸素、およびα−炭素、 および該窒素およびα−炭素に結合した水素）についての座標のみが残る。 蛋白質構造骨格をインプットした後、構造に含まれていないならば、顕在的水 素を付加する（例えば、構造がＸ線結晶学によって創製されたならば、水素を付 加しなければならない）。水素付加の後、構造のエネルギー最小化を行って、水 素ならびに他の原子、結合角および結合長さを解放する。好ましい具体例におい て、これは、原子座標位置のコンジュゲート最小化の多数の工程(Mayoら、J．Ph ys．Chem．94:8897(1990))を行って、静電気のないドレイディング力場を最小化 することによって行われる。一般に、約１０ないし約２５０工程が好ましく、約 ５０が最も好ましい。 蛋白質骨格構造は少なくとも１つの可変残基位置を含有する。当該分野で知ら れているように、蛋白質の残基またはアミノ酸は、蛋白質のＮ−末端で出発して 順次にナンバリングされる。従って、そのＮ−末端にメチオニンを有する蛋白質 は、残基またはアミノ酸位置１のメチオニンを有すると言われ、次の残基は２、 ３、４等である。各位置において、野性型（すなわち、天然に生じる）蛋白質は 、いずれかの数のロタマーにおいて、少なくとも２０個のアミノ酸のうちの１つ を有することができる。本明細書における「可変残基位置」とは、特異的残基ま たはロタマー、一般的には野性型残基またはロタマーとしてデザイン方法で固定 されないデザインすべき蛋白質のアミノ酸位置を意味する。 好ましい具体例において、蛋白質の残基位置の全ては可変である。すなわち、 各々のアミノ酸側鎖は本発明の方法において変更することができる。これは特に より小さい蛋白質で望ましいが、本発明の方法は同様により大きい蛋白質のデザ インを可能とする。このようにしてデザインすることができる蛋白質の長さに理 論的限定はないが、現実的な電算機限界がある。 別の好ましい具体例において、蛋白質の残基位置のうちいくつかのみが可変で あり、残りは「固定されている」。すなわち、それはセット立体配座におけるご とく３次元構造において同定される。いくつかの具体例において、固定された位 置はその元の立体配座で残る（これは、使用されるロタマーライブラリーの特異 的ロタマーに対して相関するものであってもなくてもよい）。別法として、残基 は、例えば、公知の部位特異的突然変異誘発技術が特定の残基は（例えば、蛋白 質分解部位を排除するために、または酵素の基質特異性を変更するのに）望まし いことが示された場合には、残基は非野性型残基として固定することができ、残 基は特定のアミノ酸として固定することができる。別法として、本発明の方法を 用いて、後記するごとく、ドォノボ（de novo）で突然変異を評価することがで きる。別の好ましい具体例において、固定された位置は「浮いている」ものであ ってもよく、その位置におけるアミノ酸は固定されているが、そのアミノ酸の異 なるロタマーがテストされる。この具体例において、可変残基は少なくとも１つ であるか、あるいは残基の合計数の０．１％ないし９９．９％のどこかであって よい。かくして、例えば、数個（または１個）の残基のみ、または残基のほとん どを変化させることができ、その間に全ての可能性がある。 好ましい具体例において、固定することができる残基は、限定されるものでは ないが、構造的または生物学的に機能的残基を含む。例えば、酵素の活性部位、 酵素の基質結合部位、結合パートナー用の結合部位（リガンド／受容体、抗原／ 抗体等）、生物学的機能にとって非常に重要であるリン酸化またはグリコシル化 部位のごとき生物学的活性に非常に重要であることが知られている残基、または ジスルフィド架橋、金属結合部位、臨界的水素結合残基、プロリンまたはグリシ ンのごとき骨格の立体配座に非常に重要な残基、パッキング相互作用に非常に重 要な残基のような構造的に重要な残基等を、全て、立体配座を固定し、または単 ーロタマーとして固定し、あるいは「浮かす」ことができる。 同様に、可変残基として選択することができる残基は、蛋白質分解、脱重合化 または凝集部位、免疫応答に導き得るグリコシル化部位、望まない結合活性、望 まないアロステリー、望まない酵素活性のごとき望まない生物学的属性を付与す るが結合の保存等と共に付与するものであり得る。 当業者によって認識されるごとく、本発明の方法は、突然変異体を現実に作成 することなく、または突然変異体を作成するに先立って、「部位特異的突然変異 誘発」標的の電算機テストを可能とする。すなわち、少数の残基が変化する配列 の素早い分析を行って、提案された変化が望ましいものか否かを評価することが できる。加えて、これは公知の蛋白質で、または本明細書に記載したごとくに最 適化した蛋白質で行うことができる。 当業者によって認識されるごとく、より大きい蛋白質のドメインは小さな独立 した蛋白質として実質的にテストすることができる、すなわち、大きな蛋白質の 構造的もしくは機能的ドメインは該蛋白質の残りとの最小相互作用を有すること ができるか、あるいはそれが自律的であるかのごとく実質的に処理することがで きる。この具体例において、ドメインの残基の全てまたは一部は変化し得るもの でよい。 たとえ位置が可変位置として選択されても、本発明の方法は、該可変位置にお ける野性型残基を選択するように、配列を最適化することが可能であろうことに 注意すべきである。これは、一般に、コア残基で頻繁に起こり、表面残基では正 規には起こりにくい。加えて、同様に非野性型アミノ酸として残基を固定するこ とができる。 一旦蛋白質骨格構造が選択されインプットされ、かつ可変残基位置が選択され たならば、可変残基位置の各々についての可能なロタマーの群が確立される。こ の操作は図２の工程５２に示す。この工程は側鎖モジュール３２を用いて実行す ることができる。本発明の１つの具体例において、側鎖モジュール３２は後記す るごとく少なくとも１つのロタマーライブラリー、および選択された蛋白質骨格 構造を該ロタマーライブラリーにおける対応する情報と関係付けるプログラムコ ードを含む。別法として、側鎖モジュール３２を省略することができ、選択され た蛋白質骨格構造についての可能なロタマー４２はインプット／アウトプットデ バイス２６を通じてダウンロードすることができる。 当該分野で知られているように、各アミノ酸側鎖はロタマーと呼ばれる可能な コンフォーマーのセットを有する。引用によってその全てを明示的に一体化させ る、Ponderら、Acad．Press Inc．(London)Ltd.，775-791頁(1987)；Dunbrackら 、Struc．Biol．1(5):334-340(1994);Desmetら、Nature 356:539-542(1992)を参 照。かくして、各々のアミノ酸側鎖についての区別されるロタマーのセットを用 いる。ロタマーライブラリーの２つの一般的タイプがある：骨格依存的および骨 格依存的なもの。骨格依存的ロタマーライブラリーは、骨格における残基の位置 に依存して異なるロタマーを可能とし、かくして、例えば、もし位置がαラセン 内にあるならばある種のロイシンロタマーが可能であり、位置がα−ラセン内に ないならば、異なるロイシンロタマーが可能である。骨格非依存的ロタマーラセ ンは各々の位置においてアミノ酸の全てのロタマーを利用する。一般に、骨格非 依存的ライブラリーがコア残基の考慮で好ましい。というのは、コアにおけるフ レキシビリティーは重要だからである。しかしながら、骨格非依存的ライブラリ ーは計算ではより費用がかかり、かくして、表面および境界位置では、 骨格依存的ライブラリーが好ましい。しかしながら、いずれかのタイプのライブ ラリーはいずれかの位置で用いることができる。 加えて、好ましい具体例は、ライブラリーの区別性から生起し得る可能な誤差 を最小化するために、平均値の周りのプラスおよびマイナスの１標準偏差（また はそれ以上）により可能なχ（カイ）角度を広げることによってロタマーライブ ラリーの「微細テューニング」のタイプを有する。これは、特に芳香族残基で重 要であり、コアにおけるフレキシビリティーおよび芳香族環における合成のため の増大した要件のため、疎水性残基でかなり重要であり、他の残基については重 要ではない。かくして、好ましい具体例はＭｅｔ、ＡｒｇおよびＬｙｓを除き、 全てのアミノ酸につきχ₁およびχ₂角を広げる。 ロタマーの数を粗く説明するために、Dunbrack & Karplus骨格−依存的ロタマ ーライブラリーの１つのバージョンにおいて、アラニンは１つのロタマーを有し 、グリシンは１つのロタマーを有し、アルギニンは５５のロタマーを有し、スレ オニンは９つのロタマーを有し、リシンは５７のロタマーを有し、グルタミン酸 は６９のロタマーを有し、アスパラギンは５４のロタマーを有し、アスパラギン 酸は２７のロタマーを有し、トリプトファンは５４のロタマーを有し、チロシン は３６のロタマーを有し、システインは９つのロタマーを有し、グルタミンは６ ９のロタマーを有し、ヒスチジンは５４のロタマーを有し、バリンは９つのロタ マーを有し、イソロイシンは４５のロタマーを有し、ロイシンは３６のロタマー を有し、メチオニンは２１のロタマーを有し、セリンは９つのロタマーを有し、 およびフェニルアラニンは３６のロタマーを有する。 一般に、プロリンは一般的には使用されない。というのは、プロリンは所望で あれば含めることができるものの、いずれかの位置につき稀にしか選択されない だろうからである。同様に、好ましい具体例は、所望であればシステインを含め ることができるものの、可能なジスルフィド問題を避けるためのみで、考慮の結 果としてシステインを省略する。 当業者によって認識されるように、全ての食い違い二平面角を持つ他のロタマ ーライブラリーを使用するか創製することができる。 好ましい具体例において、最小、少なくとも１つの可変位置は少なくとも２つ の異なるアミノ酸側鎖からのロタマーを有し、すなわち、配列は構造よりもむし ろ最適化される。 好ましい具体例において、全てのアミノ酸（またはシステイン、グリシンおよ びプロリンを除くアミノ酸の全て）からのロタマーを各可変残基位置で使用し、 すなわち、各可変位置における可能なロタマーの群またはセットは各アミノ酸の 全ての可能なロタマーである。これは、分析のタイプが計算的に費用がかかり得 るにつれて可変位置の数が高くはならない場合に特に好ましい。 好ましい具体例において、各々の可変位置はコア、表面または境界残基位置い ずれかとして分類されるが、ある場合には、後記で説明するごとく、可変位置を グリシンにセットして骨格ひずみを最小化することができる。 本発明に先立っての定量的蛋白質デザインまたは最適化研究はコア残基にほと んど専ら焦点を当ててきたことは理解されるべきである。しかしながら、本発明 は、コア、表面および境界位置を含有する蛋白質をデザインする方法を提供する 。別の具体例は、コアおよび表面残基、コアおよび境界残基、および表面および 境界残基、ならびにコア残基単独（本発明のスコアリング機能を使用）、表面残 基単独、または境界残基単独を含有する蛋白質をデザインする方法を利用する。 コア、表面または境界としての残基位置の分類は当業者に認識されるごとくい くつかの方法で行うことができる。好ましい具体例において、分類は、側鎖を含 み、蛋白質モデリングの分野の当業者の主題評価に基づいて帰属させ、元の蛋白 質骨格構造を介して行う。別法として、好ましい具体例は鋳型Ｃα原子のみを用 いて計算した溶媒接近可能表面に対するＣα−Ｃβベクトルの向きの評価を利用 する。好ましい具体例において、標的折り畳みのＣα原子のみについての溶媒接 近可能表面は、約４ないし約１２Å（約６ないし約１０Åが好ましく、約８Åが 特に好ましい）のプローブ半径にてConnollyアルゴリズムを用いて創製される。 使用するＣα半径は約１．６Åないし約２．３Åであり、約１．８ないし約２． １Åが好ましく、１．９５Åが特に好ましい。残基は、もしａ）溶媒接近可能表 面に対するＣα−Ｃβベクトルに沿ったそのＣαについての距離が約４−６Åよ り大であり（約５．０Åより大であるのが特に好ましい）、およびｂ）最も近い 表面点に対するそのＣβについての距離が約１．５−３Åより大であれば（約２ ． ０Åが特に好ましい）、コア蛋白質として分類される。残りの残基は、もし溶媒 接近可能表面に対するそれらのＣα−Ｃβベクトルに沿ったそれらのＣαからの 距離の合計に最も近い表面点に対するそれらのＣβからの距離を加えたものが約 ２．５−４Å未満であれば（約２．７Å未満が特に好ましい）、表面蛋白質とし て分類される。全ての残りの残基は境界位置として分類される。 一旦各可変位置がそれらのコア、表面または境界として分類されたならば、ア ミノ酸側鎖のセット、かくしてロタマーのセットが各位置に帰属される。すなわ ち、特定の位置においてプログラムが考慮する可能なアミノ酸側鎖のセットが選 択される。引き続いて、一旦可能なアミノ酸側鎖が選択されたならば、特定の位 置において評価されるであろうロタマーのセットが決定することができる。従っ て、コア残基は一般的にアラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニル アラニン、チロシン、トリプトファンおよびメチオニン（ある具体例では、後記 するファンデルワールススコアリング機能についてのαスケーリング因子が低い 場合には、メチオニンは該セットから除かれる）よりなる疎水性残基の群から選 択され、各コア位置についてのロタマーセットはこれらの８つのアミノ酸側鎖に ついてのロタマーを含む（もし骨格非依存的ライブラリーを用いるならば全ての ロタマー、およびもしロタマー依存的骨格を用いるならばサブセット）。同様に 、表面蛋白質は一般にはアラニン、セリン、スレオニン、アスパラギン酸、アス パラギン、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、リシンおよびヒスチジンよ りなる親水性残基の群から選択される。各表面位置についてのロタマーセットは 、かくして、これらの１０の残基についてのロタマーを含む。最後に、境界位置 は一般にアラニン、セリン、スレオニン、アスパラギン酸およびアスパラギン、 グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、リシン、ヒスチジン、バリン、イソロ イシン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびメチオ ニンから選択される。かくして、各境界位置についてのロタマーセットは潜在的 にはこれらの１７残基についての各々のロタマーを含む（システイン、グリシン およびプロリンは使用されないが、それらは使用できると仮定する）。 かくして、当業者によって認識されるように、計算の数を減少させるにつれて 残基位置を分類する計算上の利益がある。また、コア、境界および表面残基は前 記したものから変化する状況があり得ることに注意すべきである。例えば、ある 状況下では、１以上のアミノ酸は許容されるアミノ酸のセットに付加され、また はそれから差し引かれる。例えば、脱重合するまたはマルチ重合する、あるいは リガンド結合部位を有するいくつかの蛋白質は、疎水性表面残基を含有すること ができる。加えて、ラセンの「キャッピング」またはα−ラセン二極との好都合 な相互作用を可能としない残基は許容される残基のセットから差し引くことがで きる。アミノ酸群のこの修飾は半径ベースに基づいて行われる。 好ましい具体例において、プロリン、システインおよびグリシンは可能なアミ ノ酸側鎖のリストには含まれず、かくして、これらの側鎖についてのロタマーは 使用されない。しかしながら、好ましい具体例において、可変残基位置がφ角（ すなわち、１）これまでのアミノ酸のカルボニル炭素、２）現在の残基の窒素原 子、３）現在の残基のα−炭素、および４）現在の残基のカルボニル炭素によっ て定義される二面角が０°より大）を有する場合、該位置はグリシンにセットさ れて骨格歪みを最小化する。 一旦可能なロタマーの群が各可変残基位置につき帰属決定されたならば、図２ の工程５４にプロセッシングを進行させる。このプロセッシング工程は、ロタマ ー相互との、および最適化蛋白質配列を創製するための蛋白質骨格との相互作用 を分析することを含む。ランキングモジュール３４を用いて、これらの操作を行 うことができる。すなわち、コンピューターコードを書き込んで、以下の機能を 実行する。単純化すると、一般的に概説されるごとく、プロセッシングは、まず 、後記する多数のスコアリング機能を使用して、骨格自体または他のロタマーい ずれかに対する、ロタマーの相互作用のエネルギーを計算することを含む。 スコアリング機能は、ファンデルワールスポテンシャルスコアリング機能、水 素結合ポテンシャルスコアリング機能、原子溶媒和スコアリング機能、二次構造 ポテンシャルスコアリング機能および静電的スコアリング機能を含む。さらに後 記するごとく、少なくとも１つのスコアリング機能を用いて、各機能をスコアリ ングするが、該スコアリング機能は、α−ラセン二極との好都合な相互作用のよ うな位置分類または他の考慮に依存して異なり得る。後記にて概説するごとく、 計算で使用される合計エネルギーは方程式１で一般的に示されるごとく、特定の 位置で使用される各スコアリング機能のエネルギーの合計である。 方程式１では、合計エネルギーはファンデルワールスポテンシャル（E_vdw）、 原子溶媒和のエネルギー（E_as）、水素結合のエネルギー（E_h-bonding）、二次 構造のエネルギー（E_ss）および静電的相互作用のエネルギー（E_elec）の合計で ある。項ｎは、後記でより十分に概説するごとく、該項が特定の残基位置につき 考慮されるべきか否かに応じて０または１のいずれかである。 好ましい具体例において、ファンデルワールススコアリング機能が使用される 。当該分野で知られているように、ファンデルワールス力は、原子および分子の 間の弱い、非共有結合性および非イオン性の力、すなわち、誘導された二極およ び電子反発（パウリ則）力である。 ファンデルワールススコアリング機能はファンデルワールスポテンシャルエネ ルギーに基づく。ドレイディング力場からの半径および井戸の深さのパラメータ ーにてのレナード−ジョーンズ１２／６ポテンシャル、出典明示して本明細書に 一体化させるMayoら、J．Prot．Chem.，1990、または指数関数６ポテンシャルを 含めた、多数のファンデルワールスポテンシャルエネルギー計算がある。以下に 示す方程式２は好ましいレナード−ジョーンズポテンシャルである。 R₀は考慮している２つの原子のファンデルワールス半径の幾何平均であり、D₀ は考慮している２つの原子の井戸深さの幾何平均である。E_vdwおよびＲは、考慮 している２つの原子の間のエネルギーおよび分子間距離であり、後記にてより十 分に記載する。 好ましい具体例において、ファンデルワールス力は、実施例４に記載したごと くスケーリング因子αを用いて、評価する。方程式３はファンデルワールスレナ ード−ジョーンズ方程式におけるαの使用を示す。 αスケーリング因子の役割は、いずれかの特定の蛋白質の計算およびデザイン におけるパッキング効果の重要性に対する変化である。実施例で議論するごとく 、異なる値αの結果、本方法によって創製される異なる配列となる。特に、減少 したファンデルワールス立体拘束は当該シミュレーションにおける固定された骨 格および区別される側鎖ロタマーの制限的効果を補償することができ、所望され る折り畳みに適合する配列のより広いサンプリングを可能とすることができる。 好ましい具体例において、α値は約０．７０ないし約１．１０の範囲の値を使用 することができ、約０．８ないし約１．０５の値が好ましく、約０．８５ないし 約１．０が特に好ましい。好ましい特別のα値は０．８０、０．８５、０．９０ 、０．９５、１．００および１．０５である。 一般的に、ファンデルワールススケール因子αの変化の結果、４つの方法のパ ッキング特異性がもたらされる：０．９≦α≦１．０５であって、パッキング拘 束が配列選択を支配する方法１；０．８≦α＜０．９であって、疎水性溶媒和ポ テンシャルはパッキング力と競合を始める方法２；α＜０．８であって、疎水性 溶媒和がデザインを支配する方法３；およびα＞１．０５であって、ファンデル ワールス分解が余りにもひどくて、意味のある配列選択ができない方法４。特に 、異なるα値をコア、表面および境界ポテンシャルで使用することができ、方法 １および２がコア残基に好ましく、方法１は表面残基で好ましく、方法１および ２は境界残基で好ましい。 好ましい具体例において、ファンデルワールススケーリング因子は、コア、表 面および境界残基を含めた、各可変残基位置についての合計エネルギー計算で使 用される。 好ましい具体例において、原子溶媒和ポテンシャルスコアリング機能を用いる 。当業者によって認識されるごとく、蛋白質の溶媒相互作用は蛋白質の安定性に おいて意味のある因子であり、残基／蛋白質疎水性は蛋白質折り畳みにおいて主 要な駆動力であることが示されてきた。かくして、誤折り畳みまたは凝集に対す るポテンシャルに加えて、溶媒和疎水性表面に対するエントロピーコストがある 。 従って、蛋白質構造内の疎水性表面の包埋は折り畳みおよび安定性双方に対して 便宜である。同様に、親水性残基を包埋する不利があり得る。蛋白質原子の接近 可能な表面積は、一般に、この原子とのファンデルワールス接触を行い、いずれ かの他の蛋白質原子に貫通せずに、水分子をその上に置くことができる表面の面 積として定義される。かくして、好ましい具体例において、溶媒和ポテンシャル は、一般に、参照面積であって「埋もれた」面積から差し引く、部位または２つ の独立した部位（ロタマーまたは第１ロタマーおよび第２ロタマー）の合計した 可能な露出表面積、すなわち、骨格または他のロタマーいずれかに関する相互作 用により溶媒暴露されていない面積を採用することによってスコア取りされる。 かくして、これは露出された表面積を与える。 別法として、好ましい具体例は「埋もれた」部分に基づいてスコアリング機能 を計算する。すなわち、合計した可能な露出表面積が計算され、次いで、部位の 相互作用後の計算した表面積を差し引き、埋もれた表面積が得られる。特に好ま しい方法はこれらの計算の双方を行う。 後記にてより十分に記載されるごとく、これらの方法の双方は種々の方法で行 うことができる。出典明示して本明細書に一体化させる、Eisenbergら、Nature ，319:199-203(1986);Connolly，Science 221:709-713(1983);およびWodakら、P roc．Natl．Acad．Sci USA 77(4):1736-1740(1980)を参照。当業者によって認識 されるごとく、この溶媒和スコアリング機能は、立体配座非依存的というよりも むしろ立体配座依存的である。 好ましい具体例において、後記にてより十分に記載されるごとく、対の溶媒和 ポテンシャルは２つの成分「シングル」（ロタマー／鋳型）および「ダブル」（ ロタマー／ロタマー）にて実行される。ロタマー／鋳型埋もれ面積では、参照状 態は残基ｉ−１、ｉおよびｉ＋１の骨格原子のみを持つ残基位置ｉにおける問題 のロタマーと定義されるが、いくつかの場合には、丁度ｉを使用することができ る。かくして、好ましい具体例において、溶媒和ポテンシャルは各骨格原子と特 定のロタマーとの相互作用では計算されないが、要すればより多くをなすことが できる。側鎖の面積は、該面積では計数されない溶媒を排除する骨格原子に関し て計算される。折り畳まれた状態は残基ｉにおける問題のロタマーの面積とし て定義されるが、今や、非最適化側鎖、すなわち、各他の固定位置残基を含めた 全鋳型構造の意味においてである。ロタマー／鋳型埋もれ面積は参照および折り 畳まれた状態の間の差異である。ロタマー／ロタマー参照面積は２つの方法で行 うことができる。単離されたロタマーの面積を単に合計することを使用すること による１つの方法。第２のものは全骨格を含む。折り畳まれた状態は、鋳型原子 が存在しない蛋白質スカフォールド上のそれらの相対的位置に置かれた２つのロ タマーの面積である。好ましい具体例において、溶媒接近可能表面積のリチャー ド定義（出典明示して本明細書に一体化させる、LeeおよびRichards，J．Mol．B iol．55:379-400，1971）を用い、プローブ半径は０．８ないし１．６Åの範囲 であり、１．４Åが好ましく、ドリーディングファンデルワールス半径は０．８ ないし１．０のスケールである。炭素および硫黄、および全ての結合水素は非極 性であると考えられる。窒素および酸素、および全ての結合水素は極性であると 考えられる。表面積は、１０Å−２のドット密度を用い、Connollyアルゴリズム で計算される（出典明示して本明細書に一体化させるConnolly，(1983)（前掲） ）。 好ましい具体例において、２つのロタマーの間の相互作用（ロタマーと骨格と の相互作用ではない）のエネルギーの計算に存在し得る埋もれた表面積の可能な 過剰評価についての修正がある。一般的に後記にて概説するごとく、ロタマーは 対においてのみ考慮され、すなわち、第１のロタマーは「ダブル」計算の間は第 ２のロタマーに対して比較されるのみであるので、これは、２を超えるロタマー が相互作用する、すなわち、３を超える残基位置が一緒になる位置における埋も れた表面積の量を過剰評価し得る。かくして、修正またはスケーリング因子は後 記にて概説するごとく使用される。 溶媒和の一般的エネルギーは方程式４： 式中、E_saは溶媒和のエネルギーであり、ｆは表面積およびエネルギーを修正す るのに使用される定数であて、ＳＡは表面積である。この方程式はいずれのパラ メーターが評価されているかに依存して、分類される。かくして、疎水性の埋も れた表面積を使用する場合、方程式５が適当である。 式中、f₁は約１０ないし５０ｃａｌ／モル／Ųの範囲の定数であり、２３また は２６ｃａｌ／モル／Ųが好ましい。親水性埋もれについてのペナルティが考 慮される場合、該方程式は方程式６で示される： 式中、f₂は−５０ないし−２５０ｃａｌ／モル／Ųの範囲の定数であり、−８ ６または−１００ｃａｌ／モル／Ųが好ましい。同様に、もし疎水性暴露につ いてのペナルティが使用されれば、方程式７または８を使用することができる。 好ましい具体例において、f₃＝-f₁である。 １つの具体例において、骨格原子は表面積の計算に含まれ、２３ｃａｌ／モル ／Ų（f₁）および−８６ｃａｌ／モル／Ų（f₂）の値が決定される。 好ましい具体例において、この過剰計算問題は、過剰計数に付される対面積に ついての表現の一部のみにつき補償するスケーリング因子を用いてアドレスされ る。この具体例において、−２６ｃａｌ／モル／Ų（f₁）および１００ｃａｌ ／モル／Ų（f₂）が決定される。 原子溶媒和エネルギーは、計算の時間およびソースの点では費用がかかる。従 って、好ましい具体例において、溶媒和エネルギーはコアおよび／または境界残 基につき計算され、表面残基については計算されず、コアおよび境界残基につい ての計算が好ましいが、３つのいずれかの組合せが可能である。 好ましい具体例において、水素結合ポテンシャルスコアリング機能が使用され る。水素結合ポテンシャルは、予測された水素結合がデザインされた蛋白質の安 定性に寄与するように使用される（共に出典明示して本明細書に一体化させる、 Stickleら、J．Mol．Biol．226:1143(1992);Huyghues-Despointesら、Biochem． 34:13267(1995)参照）。前記にて概説したように、明示的水素は蛋白質の骨格構 造で生じる。 好ましい具体例において、水素結合ポテンシャルは、方程式９に示すごとく、 距離−依存的項および角度−依存的項よりなる。 式中、R₀（２．８Å）およびD₀（８ｋｃａｌ／ｍｏｌ）は、各々、水素−結合平 衡距離および井戸深さであり、Ｒはアクセプター距離に対するドナーである。こ の水素結合ポテンシャルは、不都合な水素結合幾何学の発生を制限するより制限 的角度−依存的項でもってドレイディングで使用される。角度項は、方程式１０ 、１１、１２および１３で示されるように、ドナーおよびアクセプターの混成状 態に依存して変化する。方程式１０はsp³ドナー対sp³アクセプターで使用され、 方程式１１はsp³ドナー対sp²アクセプターで使用され、方程式１２はsp²ドナー 対sp³アクセプターで使用され、方程式１３はsp²ドナー対sp²アクセプターで使 用される。 方程式１０〜１３において、θはドナー−水素−アクセプター角度であり、φ は水素−アクセプター−ベース角度であり（該ベースはアクセプターに結合した 原子であり、例えば、カルボニル炭素カルボニル酸素アクセプターについてのベ ースであり）、ψはsp²中心に結合した６つの原子によって規定される面の法線 間の角度である（ψの補足はψが９０°未満である場合に使用される）。水素結 合機能は、sp³ドナー−sp³アクセプターの場合では２．６Å≦Ｒ≦３．２Å、θ ＞９０°、φ−１０９．５°＜９０°であり、sp³ドナー対sp²アクセプターの場 合にはφ＞９０°であり、好ましくは、スイッチング機能が使用される。鋳型− 鋳型水素結合に関与する鋳型ドナーおよびアクセプターが好ましく、ドナーおよ びアクセプターのリストに含まれていない。排除目的では、鋳型−鋳型結合は２ ．５Å≦Ｒ≦３．３Åであってθ≧１３５°である場合に存在すると考えられる 。 また、水素結合ポテンシャルは４０Ｒの距離−依存的誘電定数（ここに、Ｒは 原子間距離である）を誘導する弱いクローン項と組み合わされまたはそれと共に 使用することができる。部分的原子電荷が好ましくは、極性官能基に適用される のみである。＋１の正味の形式電荷がＡｒｇおよびＬｙｓで使用され、−１の正 味の形式電荷がＡｓｐおよびＧｌｕで使用される。Gasteigerら、Tetrahedron 3 6:3219-3288(1980);Rappeら、J．Phys．Chem．95:3358-3363(1991)。 好ましい具体例において、もう１つの原子に水素結合していない埋もれた極性 水素結合に明示的ペナルティーが与えられる。出典明示して本明細書に一体化さ せる、Eisenbergら（1986）(前掲)参照。好ましい具体例において、極性水素埋 もれについてのこのペナルティーは約０ないし３ｋｃａｌ／モルであり、約１な いし３が好ましく、２ｋｃａｌ／モルが特に好ましい。このペナルティーは、水 素結合に関与しない埋もれた極性水素にのみ適用される。水素結合は、E_HBが約 １ないし約４ｋｃａｌ／モルの範囲にある場合に存在すると考えられ、−２ｋｃ ａｌ／モル未満のE_HBが好ましい。加えて、好ましい具体例において、ペナルテ ィーは鋳型水素、すなわち、骨格の不対の埋もれた水素には適用されない。 好ましい具体例において、第１のロタマーおよび骨格の間の水素結合のみがス コアリングされ、ロタマー−ロタマー水素結合はスコアリングされない。別の具 体例において、第１のロタマーおよび骨格の間の水素結合はスコアリングされ、 ロタマー−ロタマー水素結合は０．５だけ評価される。 好ましい具体例において、水素結合スコアリング機能は、コア、表面および境 界位置を含めた全ての位置で使用される。別の具体例において、水素結合スコア リング機能はこれらのうちの１つまたは２つのみに対して使用することができる 。 好ましい具体例において、二次構造性質スコアリング機能が使用される。これ は特異的アミノ酸側鎖に基づく。すなわち、各アミノ酸は、φおよびψ角度に基 づいて、二次構造（α−ラセンまたはβ−シート）を取るある特性を有する。出 Biotech 6:382(1995)；Minorら、Nature 367:660-663(1994);Padmanabhanら、 (1996);およびChakrabarttyら、Protein Sci．3:843(1994)参照。かくして、骨 格中の認識可能な二次構造にある可変残基位置では、二次構造特性スコアリング 機能は好ましく使用される。すなわち、可変残基位置は骨格のα−ラセン領域に ある場合、後記するα−ラセン特性スコアリング機能が計算される。位置が骨格 のα−ラセンにあるか否かは、当業者に認識されるように、一般的には、φおよ びψ角度に基づいて決定される；α−ラセンでは、−２ないし−７０のφ角度お よび−３０ないし−１００のψ角度は一般的に骨格のα−ラセン領域を記載する 。 同様に、可変残基位置がβ−シート骨格立体配座にある場合、β−シート特性 スコアリング機能が使用される。β−シート骨格立体配座が一般的に−３０およ び−１００のφ角度および＋４０ないし＋１８０のχ角度によって記載される。 別の好ましい具体例において、β−シートまたはα−ラセン構造に帰属されない 骨格の領域内にある可変残基位置もまた二次構造特性計算に付すことができる。 好ましい具体例において、二次特性に伴うエネルギーは方程式１４を用いて計 算される。 方程式１４において、Ｅ_α（またはＥβ）はα−ラセンのエネルギーであり、 ΔG^o _aaはアミノ酸のラセン成長の標準自由エネルギーであって、ΔG^o _alaは、共 に文献で手に入るアミノ酸のβ−シート形成の標準または標準自由エネルギーと して使用されるアラニンのラセン成長の標準自由エネルギーであり(Chakrabartt yら（1994）(前掲)、およびMunozら、Folding & Design 1(3):167-178(1996)参 照)、Nssは１ないし４に設定される特性スケール因子であり、３．０が好まし い。このポテンシャルを好ましくは選択して、スコアリング機能における他の項 と同様の範囲に対する特性エネルギーを評価する。 好ましい具体例において、β−シート特性は好ましくはｉ−１およびｉ＋１残 基もまたβ−シート立体配座である場合のみ計算される。 好ましい具体例において、二次構造特性スコアリング機能は、表面可変残基位 置につきエネルギー計算でのみ使用する。別の具体例において、二次構造特性ス コアリングは同様にコアおよび境界残基についての計算でのみ使用される。 好ましい具体例において、方程式１５で以下に示すごとく、静電スコアリング 機能を用いる。 この方程式において、ｑは原子１の電荷であり、ｑ'は原子２の電荷であり、 ｒは相互作用距離である。好ましい具体例において、少なくとも１つのスコアリ ング機能は各可変残基位置で使用される。好ましい具体例において、２、３また は４つのスコアリング機能を各可変残基位置で使用される。 一旦使用すべき各可変位置につきスコアリング機能が同一であれば、計算解析 における好ましい第１工程は、各可能なロタマーと蛋白質の残りの全てまたは一 部との相互作用の決定を含む。すなわち、骨格または他のロタマーに関する各可 変残基位置におけるその各可能なロタマーの、１以上のスコアリング機能によっ て測定された相互作用のエネルギーが計算される。好ましい具体例において、各 ロタマーと蛋白質の全残り、すなわち、鋳型および全ての他のロタマーの双方と の相互作用がなされる。しかしながら、前記で概説したごとく、蛋白質の一部、 例えば、より大きい蛋白質のドメインを作成できるに過ぎず、かくしてある場合 には蛋白質の全てが考慮される必要はない。 好ましい具体例において、計算プロセッシングの最初の工程は、その位置が変 化されていようが浮いていようが、各々の位置における各ロタマーについての２ 組の相互作用：ロタマー側鎖と鋳型または骨格との相互作用（「シングル」エネ ルギー）、およびロタマー側鎖と各々の他の位置における他の可能なロタマーと の相互作用（「ダブル」エネルギー）を計算することによってなされる（図３の 工程７０）この場合における骨格は蛋白質構造骨格の原子、ならびにいずれかの 固定された残基（ここに、固定された残基はアミノ酸の特定の立体配座として定 義される）を共に含むことが理解されるべきである。 従って、「シングル」（ロタマー／鋳型）エネルギーは、スコアリング機能の いくつかまたは全てを用い、各々の可変残基位置における各々の可能なロタマー と骨格との相互作用につき計算される。かくして、水素結合スコアリング機能に ついては、ロタマーの水素結合原子および骨格の各々の水結合原子が計算され、 各々の可変位置における各可能なロタマーにつきE_HBが計算される。同様に、フ ァンデルワールススコアリング機能については、ロタマーの各々の原子を鋳型の 各々の原子と比較し（一般に、それ自体の残基の骨格原子を除く）、E_vdwが各々 の可変残基位置における各可能なロタマーにつき計算される。加えて、一般に、 もし原子が３つ以下の結合によって結合されているならば、ファンデルワールス エネルギーは計算されない。原子溶媒和スコアリング機能については、ロタマー の表面が鋳型の表面に対して測定され、各々の可変残基位置における各可能なロ タマーに対するE_asが計算される。二次構造特性スコアリング機能もまたシング ルエネルギーとして考慮され、かくして、合計シングルエネルギーはE_ss項を含 有し得る。当業者によって認識されるように、これらのエネルギー項の多くは、 ロタマーおよび鋳型位置との間の物理的距離に応じて、ゼロに近いであろう。す なわち、２つの部位が遠ければ遠いほど、エネルギーは低い。 従って、前記で概説したように、合計シングルエネルギーは、ロタマー位置で その特定のスコアリング機能が使用されるかに応じて、方程式１（ここに、ｎは １またはゼロである）で示されるごとく特定の位置で使用された各スコアリング 機能のエネルギーの合計である。 一旦計算されたならば、後記で概説するごとく、各可能なロタマーについての 各シングルE_totalを、それが引き続いての計算で使用できるように、コンピュー ター内のメモリー２４に保存する。 「ダブル」エネルギー（ロタマー／ロタマー）の計算については、各可能なロ タマーの相互作用エネルギーを、全ての他の可変残基位置における各々の可能な ロタマーと比較する。かくして、「ダブル」エネルギーは、いくつかのまたは全 てのスコアリング機能を用い、各々の可変残基位置における各可能なロタマーと 各々の他の可変残基位置における各々の可能なロタマーとの相互作用につき計算 される。かくして、水素結合スコアリング機能については、第１ロタマーの各々 の水素結合原子および各々の可能な第２ロタマーの各々の水素結合原子を計算し 、いずれかの２つの可変位置につき各可能なロタマー対につきE_HBが計算される 。同様に、ファンデルワールススコアリング機能については、第１ロタマーの各 々の原子を各々の可能な第２ロタマーの各々の原子と比較し、各々の２つの可変 残基位置における各々の可能なロタマー対につきE_vdwが計算される。原子溶媒和 スコアリング機能については、最初のロタマーの表面を各々の可能な第２ロタマ ーの表面に対して測定され、各々の２つの可変残基位置における各々の可能なロ タマー対についてのE_asが計算される。二次構造特性スコアリング機能は、それ が「シングル」エネルギーの成分として考えれるので、「ダブル」エネルギーと して実行される必要はない。当業者によって認識されるように、第１ロタマーお よび第２ロタマーの間の物理的距離に応じて、これらのダブルエネルギー項の多 くは、ゼロに近いであろう。すなわち、２つの位置が離れればそれだけエネルギ ーは低い。 従って、前記で概説したごとく、合計ダブルエネルギーは、ロタマー位置でそ の特定のスコアリング機能が使用されたかに応じて、方程式１６（ここに、ｎは １またはゼロである）に示されるごとく、ロタマーの各々の可能な対を評価する のに使用される各スコアリング機能のエネルギーの合計である。 例を説明する。第１の可変位置ｉはｉａ、ｉｂおよびｉｃと表示される３つの （非現実的に低い数）可能なロタマー（これは、単一アミノ酸または異なるアミ ノ酸いずれかである）を有する。第２可変位置ｊもまたｊｄ、ｊｅおよびｊｆと 表示される３つの可能なロタマーを有する。かくして、９つのダブルエネルギー （E_total）が全てにおいて計算される：E_total（ｉａ，ｊｄ）、E_total（ｉａ， ｊｅ）、E_total（ｉａ，ｊｆ）、E_total（ｉｂ，ｊｄ）、E_total（ｉｂ，ｊｅ） 、E_total（ｉｂ，ｊｆ）、E_total（ｉｃ，ｊｄ）、E_total（ｉｃ，ｊｅ）、およ びE_total（ｉｃ，ｊｆ）。 一旦計算すれば、後記で概説するごとく、各可能なロタマー対についての各ダ ブルE_totalを、それが引き続いての計算で使用できるように、コンピューター内 のメモリー２４に保存する。 一旦シングルおよびダブルエネルギーが計算され保存されれば、計算プロセッ シングの次の工程が起こり得る。一般に、計算プロセッシングの目標は最適化さ れた蛋白質配列のセットを決定することである。「最適化された蛋白質配列」と は、本明細書における数学方程式に最良にフィットする配列を意味する。当業者 に認識されるように、全体最適化配列は方程式１に最良にフィットする１つの配 列、すなわち、いずれかの可能な配列の最低エネルギーを有する配列である。し かしながら、全体最小ではなく低いエネルギーを有するいずれかの数の配列があ る。 好ましい具体例において、セット成分は最適立体配座における全体最適配列、 すなわち、各々の可変位置における最適ロタマーを含む。すなわち、計算プロセ ッシングを、シミュレーションプログラムが全体最適である単一配列に収束する まで実行する。 好ましい具体例において、該セットは少なくとも２つの最適化蛋白質配列を含 む。かくして、例えば、計算プロセッシング工程は多数の不都合な計算を排除で きるが、収束に先立って停止できるであろうし、これは、全体的に最適なものが １つである配列のセットを供する。加えて、例えば異なる方法を用い、さらなる 計算解析を該セットに対して実行して、配列をさらに排除し、それらを異なって ランク付けすることができる。別法として、後記にてより十分に記載されるごと く、全体最適化が達成でき、次いで、計算プロセッシングが起こり得るのであり 、これは全体最適化配列の近くにさらなる最適化配列を生じる。 もし１を超える最適化蛋白質配列のセットが得られたならば、後記にて十分に 記載されるごとく、それらは理論的量的安定性の点で順序付けてランキングする ことができる。 好ましい具体例において、計算プロセッシング工程は、まず、時々は「カット オフの適用」と呼ばれる排除工程（シングル排除またはダブル排除）を含む。シ ングル排除は、いずれかの計算に先立って、約１０ｋｃａｌ／モルを超える鋳型 相互作用エネルギーを持つ全てのロタマーの排除を含み、約１５ｋｃａｌ／モル を超える排除エネルギーが好ましく、約２５ｋｃａｌ／モルを超えるのが特に好 ましい。同様に、ロタマーが第２残基位置において約１０ｋｃａｌ／モルを超え る相互作用エネルギーを有する場合にダブル排除がなされ、約１５を超えるエネ ルギーが好ましく、約２５ｋｃａｌ／モルを超えるのが特に好ましい。 好ましい具体例において、計算プロセッシングは全体配列エネルギーの直接的 決定、続いての全体最適化を確認し、所望であれば他の可能な配列をランク付け するための全体配列の比較を含む。全体配列のエネルギーは方程式１７において 以下に示す。 かくして、骨格−骨格（時々は、鋳型−鋳型と本明細書ではいう）エネルギー （骨格は一定に保たれるので本明細書における全ての配列にわたって一定である E_(b-b)）、各ロタマーについてのシングルエネルギー（これは既に計算され保存 されている）、および各ロタマー対についてのダブルエネルギー（これは、既に 計算され貯蔵されている）を付加することによって、ロタマーの各々の可能な組 合せを評価することができる。次いで、各可能なロタマー配列の各全体配列が、 最良から最悪まで、または最悪から最良までランク付けできる。これは明らかに 計算上高価であって、蛋白質の長さが増加するにつれて非実用的になる。 好ましい具体例において、計算プロセッシングは１以上のデットエンド排除（ ＤＥＥ）計算工程を含む。該ＤＥＥ理論は、既知の配列を持つ固定化された骨格 に蛋白質側鎖をパッキングするように設計された非常に速い区別されるサーチプ ログラムについての基礎である。全て出典明示して本明細書に一体化させる、De smetら、Nature 356:539-542(1992);Desmetら、The Protein Folding Problem a nd Tertiary Structure Prediction，Ch．10:1-49(1994);Goldstein， Biophys．Jour．66:1335-1340(1994)参照。ＤＥＥは、もしロタマーが特定の位 置における考慮からはずすことができれば、すなわち、特定のロタマーが明らか に全体最適立体配座の一部ではないと判断するならば、該サーチのサイズは減少 される。これは、単一可変位置における最初のロタマーの最悪相互作用（すなわ ち、エネルギーまたはE_total）と同一可変位置における第２ロタマーの最良相互 作用とを比較することによってなされる。もし最初のロタマーの最悪ロタマーが 依然として第２ロタマーの最良相互作用よりも良好であれば、第２ロタマーは恐 らくは配列の最適立体配座にあり得る。オリジナルのＤＥＥ理論は方程式１８で 示される。 方程式１８において、ロタマーｉａはロタマーｉｂと比較される。不等式の左 側は蛋白質の残りに関するｉａの最良の可能な相互作用エネルギー（E_total）で ある。すなわち、「ｍｉｎ ｏｖｅｒ ｔ」は、ロタマーｉａとの最良の相互作 用を有する位置ｊについてのロタマーｔを見出すことを意味する。同様に、不等 式の右側は蛋白質の残りに関するロタマーｉｂの最悪可能（最大）相互作用エネ ルギーである。この不等式が真実であれば、ロタマーはデッドエンディングであ り、排除できる。ＤＥＥのスピードは、該理論がロタマーをテストし、排除する ための配列長さにわたっての合計を要するという事実に由来する。 好ましい具体例において、ＤＥＥの変形が実行される。ここに明示して本明細 書に一体化されるGoldstein(1994)（前掲）に基づくGoldstein ＤＥＥは、方程 式１９で示されるごとく、ＤＥＥ計算の変形である。 エッセンスを述べれば、Goldstein方程式１９は、特定位置ｉの最初のロタマ ー（ロタマーｉａ）は、もしｉａに関する立体配座のエネルギーが、その位置に おけるロタマーをｉｂに丁度変化させ、他の残基を同等に保持することによって 常に低下させることができれば、局所的エネルギー最小に寄与しないであろうと いうことを示す。もしその不等式が真実であれば、ロタマーはデッド−エンディ ングであって、排除することができる。 かくして、好ましい具体例において、最初のＤＥＥ計算が行われ、ここに、単 一可変位置におけるロタマーが比較されて（「シングル」ＤＥＥ）、単一位置に おけるロタマーを排除する。この解析を各々の可変位置につき反復させて、出来 る限り多くの単一ロタマーを排除する。加えて、ロタマーがＤＥＥを介して考慮 することからはずされる毎に、いずれのＤＥＥ変形が使用されるかに応じて、方 程式１８または１９の最小および最大計算が変化し、かくして、概念的にはさら なるロタマーの排除が可能である。従って、シングルＤＥＥ計算を、もはやロタ マーが排除できないまで、（すなわち、それらの全てが概念的に全体最適化で見 出されるように不等式がもはや成立しない場合）反復することができる。 好ましい具体例において、「ダブル」ＤＥＥがさらに行われる。ダブルＤＥＥ おいて、ロタマーの対が評価される。すなわち、オリジナルのまたはGoldstein ＤＥＥを用い、最初の位置における最初のロタマーおよび第２の位置における第 ２のロタマーを、最初の位置における第３ロタマーおよび第２位置における第４ ロタマーと比較する。次いで、単一ロタマーは排除できないが、対でありさえす れば対は許容されないとして標識される。再度、シングルＤＥＥに関しては、ロ タマー対が許容されないと標識される毎に、方程式１８または１９の最小計算は （いずれのＤＥＥ変化が使用されるかに応じて）変化し、かくして、概念的にさ らなるロタマーの標識化が可能である。従って、ダブルＤＥＥ計算を、もはやロ タマー対が標識できないまで反復することができる。すなわち、ここに、ロタマ ー対のエネルギーは、それらの全てが概念的に全体最適で見出すことができるよ うに重複する。 加えて、好ましい具体例において、ロタマー対を最初にプレスクリーニングし て、ＤＥＥに先立ってロタマー対を排除する。これは、比較的計算上安価な計算 を行って、フロントまである対を排除することによってなされる。これは、後記 にて概説されるごとく、いくつかの方法でなすことができる。 好ましい具体例において、系の残りとの最小相互作用エネルギーを持つロタマ ー対が見出される。試料マトリックスにおけるエネルギー分布の洞察は、特定の i_rj_sをデッド−エンド排除するi_uj_vもまた他のi_rj_s対を排除できることを明らか とした。事実、しばしば、かなりの数のi_rj_s対を排除する、「マジックブレット 」と我々が呼ぶ少数のi_uj_v対がある。我々は、ほとんどの優れたマジックブレッ トのうちの１つが、最大相互作用エネルギーt_max([i_uj_v])k_tがそれに対して最小 である対であることを見出した。この対を[i_uj_v]_mbという。もしこのロタマー対 を第１ラウンドのダブルＤＥＥで使用すれば、それは対をより速く排除する傾向 にある。 我々の最初の高速化は、[i_uj_v]_mb対に対応する列におけるマトリックス要素の みについての一次のダブル計算を評価することである。[i_uj_v]_mbの発見はn²計算 であり（ｎ＝位置当たりのロタマーの数）、このロタマー対に対応するマトリッ クスの単一列への方程式１９の適用はもう１つのn²計算であり、そこで、全一次 ダブル計算と比較して計算時間は短い。実際的には、この計算は非常に多数のデ ッド−エンディング対を生じ、しばしば、ダブルマトリックスのいずれのさらな るサーチングもなくして、シングル排除の次の繰り返しに進行するのに十分であ る。 また、マジックブレット一次計算は、方程式１８または１９によって発見され るであろう全てのデツド−エンディング対を発見し、それによりそれを不必要と するであろう。これは、方程式１８または１９によって、ε_max([i_uj_v]_mb)が、 対を首尾よく排除するであろういずれのε_max([i_uj_v])よりも小であるまたはそ れと等しくなければならないという事実に由来する。 いずれかの所与の対の最小および最大は本明細書に概説したごとくに予備計算 されたので、第２のスピード−増強予備計算が行える。極値を比較することによ って、デッド−エンドされない対を同定し、かくして、跳躍し、ＤＥＥ計算の時 間を減少させることができる。かくして、以下の基準のうちのいずれか１つを満 足させる対が跳躍される。 これらの計算を含むマトリックスは対象であるゆえに、この要素の半分は最初 の不等式方程式２０を満足し、残りの半分は他の不等式方程式２１を満足するで あろう。マトリックスのこれらの３／４は方程式１８または１９の評価に付す必 要がなく、その結果、４つの因子の理論的スピード増強がもたらされる。 最後のＤＥＥスピード増強は、マトリックスの残りの１／４のサーチを優れた ものとする。これは、予め計算された極値からメトリックを構築して、マトリッ クス要素を検出し、その結果デツド−エンディング対が得られるようであること によってなされる。 メトリックは異なる試料最適化からマトリックスの解析を介して見出された。 我々は、マトリックス要素がデツド−エンディング対を生じるであろう尤度を予 測する極値の組合せにつきサーチした。各対についての間隔サイズ（図１２参照 ）を、極値の差から計算した。j_rj_sおよびj_uj_v間隔の重複のサイズも、最小間の 差および最大間の最として同様に計算した。これらの質、ならびに孤立極値の組 合せを、デツド−エンディング対の発生を予測するそれらの能力につきテストし た。最大のうちいくつかは非常に大きいので、質も対数的に比較した。 組合せのほとんどは、種々の程度にデツド−エンディングマトリックス要素を 予測することができた。最良のメトリックはq_rsおよびq_uvとここではいう、各対 に関する間隔重複分率であった。 これらの値は最小および最大方程式２４、２５、２６および２７を用いて計算 される（図１４参照）。 これらのメトリックはテストした他のメトリックのいずれよりも高い、要素の 全発生に対するデッド−エンディングマトリックス要素の発生の比率を生じるゆ えに選択した。例えば、q_rs＞０．９８であるマトリックス要素はほとんどない （〜２％）が、これらの要素はデッド−エンディング対の全ての３０〜４０％を 生じる。 従って、一次ダブル基準はq_rs＞０．９８およびq_uv＞０．９９であるダブルに 対してのみ適用される。試料データ解析は、これらの２つのメトリックを用いる ことによって、デッド−エンディング要素の半分と同数が、２ないし５パーセン トにすぎない減少したマトリックスを評価することによって見出すことができる ことょ予測する。 一般に、後記にてより詳細に記載するごとく、オリジナルのおよびGoldstein ＤＥＥのいずれかまたは双方を用いるシングルおよびダブルＤＥＥを、さらなる 排除が可能でなくなるまで反復する。通常、収束は完全ではなく、さらなる排除 が起こって収束を達成しなければならない。これは一般に「スーパー残基」ＤＥ Ｅを用いてなされる。 好ましい具体例において、さらなるＤＥＥ計算は、一般に、Desmet，Nature 3 56:539-542(1992);Desmetら、The Protein Folding Problem and Tertiary Stru cture Prediction，Ch．19:1-49(1994);Goldsteinら、前掲に記載されているご とくに、「スーパー残基」または「単一化」の基準によってなされる。スーパー 残基は、次いで、単一単一残基位置として処理される２以上の可変残基の組合せ である。次いで、スーパー残基は、他の残基位置またはスーパー残基いず れかと共に、シングルＤＥＥおよびダブルＤＥＥで評価される。スーパー残基の 不利は、評価しなければならない多くのロタマーがある。すなわち、もし最初の 可変残基位置が５つの可能なロタマーを有し、第２の可変残基位置が４つの可能 なロタマーを有すれば、評価しなければならない２０の可能なスーパー残基ロタ マーがあることである。しかしながら、これらのスーパー残基はシングルと同様 に排除することができ、むしろ対のように標識される。 スーパー残基に組み合わせるべきその位置の選択は種々の方法で行うことがで きる。一般に、スーパー残基についてのランダム選択の結果、不十分な排除とな るが、それは行うことができるものの、これは好ましくはない。好ましい具体例 において、最初の評価はスーパー残基についての位置の選択であり、当該位置に おけるロタマー数である。もし該位置が余りにも多くのロタマーを有するならば 、計算が余りにも実用的でなくなるので、それは決してスーパー残基に単一化さ れない。かくして、約１００，０００未満のロタマーに関する位置のみが選択さ れ、約５０，０００未満が好ましく、約１０，０００未満が特に好ましい。 好ましい具体例において、スーパー残基を形成すべきか否かの評価は以下の通 りになされる。全ての可能なロタマー対を方程式２８を用いてランク付けし、最 高数を持つロタマー対が単一化のために選択される。 方程式２８は最小数のスーパーロタマーを除き標識化された対の最高分率また はパーセントを有する位置の対を探すものである。すなわち、方程式２８につき 最高値を与える対が好ましくは選択される。かくして、もし位置の対が最高数の 標識化対を有するが非常に多数のスーパーロタマー（すなわち、位置ｊにおける ロタマーの数に位置ｉにおけるロタマーの数を掛けたもの）も有するならば、少 数のスーパー残基を除いて低いパーセントの標識化対にわたって、この対は（選 択できるとしても）選択されないであろう。 別の好ましい具体例において、最高平均エネルギーを有するスーパー残基につ き位置が選択される。すなわち、位置ｉおよびｊについては、ｉについての全て のロタマーおよびｊについての全てのロタマーの平均エネルギーが計算され、最 高平均エネルギーを持つ対がスーパー残基として選択される。 スーパー残基は好ましくは一度に１つとされる。スーパー残基を選択した後、 シングルおよびダブルＤＥＥ計算を反復し、ここに、スーパー残基はあたかもレ ギュラー残基であるかのごとく処理される。シングルおよびダブルＤＥＥに関し ては、スーパー残基ＤＥＥにおけるロタマーの排除はＤＥＥの最小エネルギー計 算を変化させるであろう。かくして、シングルおよび／またはダブルＤＥＥの反 復の結果、ロタマーのさらなる排除がもたらされる。 図３は、本発明のランキングモジュール３４に関連するプロセッシング操作の 詳細な説明である。シングルおよびダブルエネルギー７０の計算および保存は最 初の工程であるが、これらの毎回再計算することができる。工程７２はカットオ フの任意の適用であり、ここに、高すぎるシングルまたはダブルエネルギーはさ らなる工程に先がけて除かれる。オリジナルのシングルＤＥＥ７４とGoldstein シングルＤＥＥ７６のいずれかまたは双方をなすことができ、オリジナルのシン グルＤＥＥ７４の排除が一般的に好ましい。一旦シングルＤＥＥが実行されると 、オリジナルのダブル（７６）および／またはGoldsteinダブル（８０）ＤＥＥ が実行される。次いで、スーパー残基ＤＥＥが一般的に実行される（オリジナル （８２）またはGoldstein（８４）スーパー残基ＤＥＥ）。この結果、好ましく は、全体最適化配列における収束がもたらされる。図３に示すごとく、いずれか の工程の後、前記工程のいずれかまたは全部をいずれかの順序で再度行うことが できる。 以前のＤＥＥ工程の反復を伴う、計算プロセッシングに対するスーパー残基Ｄ ＥＥの付加は、一般に、その結果、全体最適化において収束をもたらす。全体最 適化への収束は、もしカットオフ適用がなされないならば保証されるが、一般的 には、全体最適化はこれらの工程で達成される。好ましい具体例において、ＤＥ Ｅを全体最適配列が見出されるまで実行する。すなわち、最適化蛋白質配列のセ ットは単一メンバー、全体最適化配列を含有する。 好ましい具体例において、管理可能な数の配列が見出される、すなわち、さら なるプロセッシングが必要ないというまで種々のＤＥＥ工程が実行される。これ らの配列は最適化蛋白質配列のセットを表し、管理可能な数の配列は配列の長さ に依存するが、一般的には、約１ないし約10¹⁵の可能なロタマー配列の範囲であ る。 あるいは、ＤＥＥはポイント的に実行し、その結果、最適化配列のセット（こ の意味では、残りの配列のセット）がもたらされ、次いで、異なるタイプのさら なる計算プロセッシングを実行することができる。例えば、１つの具体例におい て、前記で概説した配列エネルギーの直接的計算は残りの可能な配列につき行わ れる。別法として、モンテカルロサーチを実行することができる。 好ましい具体例において、計算プロセッシングはＤＥＥ計算工程を含む必要が ない。この具体例において、当該分野で知れているように、モンテカルロサーチ が実行される。出典明示して本明細書に一体化させる、Metropolisら、J．Chem ．Phys．21:1087(1953)参照。この具体例において、ランダムロタマーを含むラ ンダム配列が出発点として選択される。１つの具体例において、可変残基位置は コア、境界または表面残基として分類され、各位置における利用可能な残基のセ ットがかくして定義される。次いで、ランダム配列を生じさせ、各アミノ酸につ いてのランダムロタマーを選択する。これは、モンテカルロサーチの出発配列と して働く。次いで、モンテカルロサーチは１つの位置において、同一アミノ酸の 異なるロタマーまたは異なるアミノ酸のロタマーへとジャンプを行い、次いで、 新しい配列エネルギー（E_{total sequence}）が計算され、もし新しい配列エネル ギーが許容性についてのボルツマン基準に適合すれば、それをもう１つのジャン プ用の出発点として使用する。もしボルツマンテストが失敗すれば、もう１つの ランダムジャンプが以前の配列から試みられる。このようにして、低および低エ ネルギーを持つ配列が見出され、低いエネルギー配列のセットが創製される。 もし計算プロセッシングの結果、単一全体最適配列が得られたならば、ランク 付けすることができる全体解決エネルギー隣接においてさらなる配列を創製する のがしばしば好ましい。これらのさらなる配列もまた最適化蛋白質配列である。 さらなる最適化配列の創製は、一般に、配列の理論エネルギーおよび実際のエネ ルギーの間の差異を評価するのに好ましい。一般に、好ましい具体例において、 配列のセットは相互に少なくとも約７５％相同であり、少なくとも約８０％相同 が好ましく、少なくとも約８５％相同が特に好ましく、少なくとも約９０％が特 別に好ましい。いくつかの場合、９５％ないし９８％もと高い相同性が望ましい 。この意味での相同性は配列同様性または同一性を意味し、同一性が好ましい。 この意味で同一とは、比較すべき２つの配列における対応する位置での同一アミ ノ酸を意味する。この意味における相同性は、同一であるアミノ酸および同様で あるアミノ酸（機能的に同等）を含む。この相同性は、好ましくは、相互に欠陥 設定を用いる、Devereuxら、Nucl．Acid．Res．12:387-395(1984)によって記載 されているベスト・フィット配列プログラム、またはBLASTXプログラム(Altschul ら、J．Mol．Biol．215:403-410(1990))のごとき、当該分野で知られている標準 的技術を用いて決定されるであろう。整列は整列させるべき配列へのギャップの 導入を含むことができる。加えて、最適配列よりも多いまたは少ないアミノ酸を 含有する配列については、相同性のパーセンテージはアミノ酸の合計数に対する 相同アミノ酸の数に基づいて決定されるであろうことが理解される。かくして、 例えば、最適より短い配列の相同性は、より短い配列におけるアミノ酸の数を用 いて決定されるであろう。 一旦最適化蛋白質配列が同定されたならば、図２のプロセッシングは所望によ り蛋白質配列をサーチすることを含む工程５６まで進行させる。このプロセッシ ングはサーチモジュール３６で実行することができる。例えばサーチモジュール ３６は書き込んで、前記したごとくにモンテカルロサーチを実行することができ る。全体解決で出発し、ランダム位置を特定位置で許容される他のロタマー（同 一アミノ酸からのロタマーおよび異なるアミノ酸からのロタマー双方）まで変化 させる。新しい配列エネルギー（E_{total sequence}）が計算され、もし該新しい 配列エネルギーが許容性についてのボルツマン基準に適合すれば、それをもう１ つのジャンプのための出発点として用いる。出典明示して本明細書に一体化させ る、Metropolisら、1953，前掲参照。もしボルツマンテストが失敗すれば、もう １つのランダムジャンプが以前の配列から試みられる。配列およびそれらのエネ ルギーのリストがサーチの間維持される。所定数のジャンプの後、最良のスコア リング配列がランク付けリストとしてアウトプットされる。好ましくは、少なく とも約10⁶のジャンプがなされ、少なくとも約10⁷のジャンプが好ましく、少なく とも 約10⁸のジャンプが特に好ましい。好ましくは、少なくとも約１００ないし１０ ００配列がセーブされ、少なくとも約１００，０００の配列が好ましく、少なく とも約１０，０００ないし１，０００，０００配列が特に好ましい。サーチの間 、温度は好ましくは１０００Ｋに設定される。 一旦モンテカルロサーチが終了すれば、温度をＯＫまで変化させ、次いで、各 位置においてアミノ酸同一性を固定することによって、セーブされた配列の全て をクエンチする。好ましくは、各々の位置における特定のアミノ酸についての各 々の可能なロタマージャンプを次いで試みる。 計算プロセッシングの結果、最適化蛋白質配列のセットが得られる。これらの 最適化蛋白質配列は一般的に、しかし常ではないが、骨格がそれから取られた野 性型配列とはかなり異なる。すなわち、各最適化蛋白質配列は好ましくは出発ま たは野性がて配列からの約５〜１０変異体アミノ酸を含み、少なくとも約１５〜 ２０％変化が好ましく、少なくとも約３０％変化が特に好ましい。 これらの配列は多数の方法で使用することができる。好ましい具体例において 、最適化蛋白質配列の１つ、いくつかまたは全てを、図２の工程５８で示すごと くにデザインされた蛋白質に構築される。しかる後、蛋白質配列を、図２の工程 ６０で示すごとくにテストすることができる。一般に、これは２つの方法のうち １つで行うことができる。 好ましい具体例において、デザインされた蛋白質は当該分野で知られているご とく化学的に合成される。これは、デザインされた蛋白質が短い、好ましくは長 さが１５０アミノ酸未満の場合に有用であり、１００アミノ酸未満が好ましく、 ５０アミノ酸が特に好ましいが、当該分野で知られているように、より長い蛋白 質を化学的または酵素的に作成することもできる。 好ましい具体例において、特に、より長い蛋白質または大きな試料が所望され る蛋白質については、最適化配列を用いて、最適化配列をコードし、次いで、宿 主細胞にクローン化し、発現できるＤＮＡのような核酸を創製する。かくして、 核酸、特に各最適化蛋白質配列をコードする核酸を作成することができる。これ はよく知られた手法を用いてなすことができる。コドン、適当な発現ベクトルお よび適当な宿主細胞の選択は、因子の数に応じて変化し、要すれば容易に最適化 することができる。 一旦作成すれば、デザインされた蛋白質を実験的に評価し、要すれば、構造、 機能および安定性につきテストする。これは当該分野で知られているようになさ れ、蛋白質骨格がそれから取られたオリジナルの蛋白質に部分的に依存するであ ろう。好ましくは、デザインされた蛋白質は、出発点として使用された公知の蛋 白質よりも安定であるが、ある場合には、もしいくつかの拘束が当該方法に置か れれば、デザインされた蛋白質は安定性が低いであろう。かくして、例えば、改 変された生物学的活性用にある残基を固定し、最も安定な配列を見出すことがで きるが、野性型蛋白質よりも依然として安定性が低いであろう。この意味におい て安定性とは、新しい蛋白質が、親分子がそうした地点を通過した生物学的活性 または立体配座いずれかを保有することを意味する。安定性は限定されるもので はないが、熱安定性、すなわち、可逆的または不可逆的変性が起こり始める温度 の上昇；蛋白質分解安定性、すなわち、特定のプロテアーゼの存在下で不可逆的 に開裂される蛋白質の量の減少（自己分解を含む）、ｐＨまたは酸化的条件にお ける変化に対する安定性；キレーター安定性；金属イオンに対する安定性；有機 溶媒、界面活性剤、処方化学物質等のごとき溶媒に対する安定性を含む。 好ましい具体例において、作成された蛋白質は元の蛋白質よりも少なくとも約 ５％安定であり、より好ましくは少なくとも約１０％、さらに好ましくは少なく とも約２０〜５０％である。 テスト操作の結果は、図２の工程６２で示すごとく、計算機で評価される。評 価モジュール３８はこの操作で用いられる。すなわち、コンピューターコードを 調製して、いずれかの数のメトリックに関してテストデータを解析することがで きる。 プロセッシング接合において、もし蛋白質が選択されたならば（ブロック６４ のイエス分岐）、該蛋白質を後記するごとくに利用する（工程６６）。もし蛋白 質が選択されなければ、蓄積された情報を用いて、ランキングモジュール３４を 変化させ、および／または工程５６を反復し、より多くの配列がサーチされる。 好ましい具体例において、実験結果がデザインフィードバックおよびデザイン 最適化で使用される。 一旦作成すれば、本発明の蛋白質は、当業者によって認識されるように、蛋白 質に応じて、産業ないし薬理学的使用の範囲の、非常に多くの応用が見出される 。かくして、例えば、増大した熱安定性を呈する蛋白質および酵素を、上昇した 温度でしばしば実行される産業プロセス、例えば、炭水化物加工（高フルクトー スコーンシロップおよび他の甘味剤を生成するための澱粉の糖化および液化を含 む）、蛋白質加工（例えば、洗濯洗剤におけるプロテアーゼの使用、食品加工、 飼料ストック加工、パン焼き）等で使用することができる。同様に、本発明の方 法は、より熱安定性で、より蛋白質分解の感受性が低く、または他の所望の変化 を含む公知の蛋白質性薬物のアナログのごとき、有用な医薬蛋白質の創製を可能 とする。 以下の実施例は、前記本発明を用いる様式をより十分に記載し、ならびに本発 明の種々の態様を実施するために考えられるベストモードを記載するように供す る。これらの実施例は本発明の真の範囲を断じて制限するものではなく、むしろ 例示的目的で提示する。全ての引用文献は出典明示して本明細書に一体化させる 。 実施例 実施例１ ＤＥＥと共にファンデルワールスおよび 原子溶媒和スコアリング機能を用いる蛋白質デザイン 理論、計算および実験テストをカップリングさせて特異性および学習の問題に 立ち向かわせる循環的デザイン戦略を開発した（図４）。我々の蛋白質デザイン 自動化（ＰＤＡ）サイクル４つの成分はデザイン凡例、シミュレーションモジュ ール、実験テストおよびデータ解析より構成される。デザイン凡例は逆折り畳み (Pabo，Nature，301:200(1983);Bowieら、Science 253:164-170(1991))の概念に 基づき、これは、側鎖ロタマーの配列をその上に置くことができる固定化骨格の 使用よりなり、ここに、ロタマーはアミノ酸側鎖の許容された立体配座である(P onderら、（1987）(前掲))。原子の三次元併置に基づく特異的三次相互作用を用 いて、標的折り畳みに潜在的に最良に適合する配列を決定する。インプット として各残基位置につき許容された骨格幾何学および可能なロタマーが与えられ れば、シミュレーションは、アウトプットとして、種々のロタマーにおいて原子 位置を明示的に考慮するコスト機能に基づいて解決のランク付けリストを生じな ければならない。原理的障害は、固定化された骨格が残基当たりｎ個の残基およ びｍ個の可能なロタマーよりなり（全ての許容されるアミノ酸の全てのロタマー ）、その結果、系のmⁿ個の可能な配列（小さなデザイン問題にしても巨大な数） となることである。例えば、１５個の位置において５０個のロタマーを考慮する ことは、10²⁵個にわたる配列の結果となり、これは、１秒当たり10⁹個の配列の 評価速度において（現行の能力をはるかに超える）、全体最小について網羅して サーチするのに10⁹年要するであろう。シミュレーションモジュールによって提 示されたアミノ酸配列のサブセットの合成および特徴付けは、解析モジュール用 の実験データを生じる。解析セクションは、シミュレートされた構造の計算可能 な特性および実験観察の間の修正を発見する。該解析の目標は、シミュレーショ ンに対する、ある場合には、デザイン凡例のガイドに対する定量的修正を示唆す ることである。換言すれば、シミュレーションモジュールで使用されたコスト機 能は、その水平軸が問題に対する手近な全ての可能な解決を含む理論的可能なエ ネルギー表面を記載する。この可能なエネルギー表面は、実験データから決定さ れた現実の可能なエネルギー表面にマッチするとは保証されない。これに徴すれ ば、解析の目標は、理論的および現実的ポテンシャルエネルギーの間に良好な一 致を生じさせるためのシミュレーションコストとなる。もしそのような修正を見 出すことができれば、引き続いてのシミュレーションのアウトプットは、標的特 性を良好に達成するアミノ酸配列であろう。このデザインサイクルは、一般に、 主題のヒト成分を除去することによって、いずれの蛋白質系にも適用でき、蛋白 質デザイン、すなわち、蛋白質デザイン自動化に対する大いに片寄りのないアプ ローチを可能とする。 ＰＤＡ側鎖選択アルゴリズムは、インプットとして、所望の折り畳みを規定す る骨格構造を必要とする。この折り畳みを取る配列をデザインする仕事は、所与 の骨格に対するアミノ酸側鎖の配置を発見するものとして総括することができる 。配列を評価する場合に、アミノ酸の同定のみを考慮するのは十分ではない。側 鎖 置換の幾何学的特異性を正しく説明するには、各側鎖の全ての可能な立体配座も 調べなければならない。蛋白質構造データベースの統計学的概観(Ponderら、前 掲)は、各アミノ酸側鎖につき、ロタマーと呼ばれる許容された立体配座の区別 されるセットを規定した。我々は、ＰＤＡにおける側鎖について許容された立体 配座を規定するためにPonderおよびRichardsライブラリーに基づいてロタマーラ イブラリーを使用する。 側鎖のロタマー記載を用い、ロタマーの全ての可能な配列をスクリーニングす ることによって、骨格についての最適配列を見出すことができ、ここに、各骨格 位置は全てのその可能なロタマー状態における各アミノ酸によって占められるこ とができる。ロタマーセットの区別される性質は、テストすべきロタマー配列の 数の単純な計算を可能とする。位置当たりｍ個の可能なロタマーを持つ長さｎの 骨格はmⁿ個の可能なロタマー配列を有するであろう。サーチスペースのサイズは 、ｎおよびｍの典型的な値については、網羅的サーチを取り扱いにくいものとす る配列長さで指数関数的に増大する。この計算「爆発」はＰＤＡのシミュレーシ ョン相で克服すべき主要な障害である。 シミュレーションアルゴリズム：計算サーチ問題を解決するためにデッドエン ド排除（ＤＥＥ）理論の拡張が開発された(Desmetら、1992(前掲)，Desmetら、 （1994）(前掲);Goldstein，（1994）(前掲))。ＤＥＥ理論は、既知の配列を持 つ固定化骨格に蛋白質側鎖をパッキングするようにデザインされた非常に速く区 別されるサーチアルゴリズムのための基礎である。側鎖はロタマーによって記載 され、原子論的力の場を用いて、ロタマー配置をスコアリングする。ＤＥＥ理論 は、もしアルゴリズムが収束すれば、全体最適化パッキングが見出されることで ある。ＤＥＥ法は、位置が単一アミノ酸のロタマーに限定される制限を解放する ことによって、我々の逆折り畳みデザイン凡例に容易に拡大される。ＤＥＥのこ の拡大は、各位置におけるロタマーの数を大いに増大させ、本明細書でさらに十 分に記載されるごとく、収束を保証するにはかなり修正された実行を要する。全 体最適化のみが見出されるという保証は依然として有効であり、我々の拡張にお いては、全体的最適配列がその最適収束で見出されることを意味する。 ＤＥＥはGoldstein(Goldstein，(1994)(前掲))によって示唆された改良への 新規に付加で実行された。記載したごとく、Ｒ＝１ロタマー排除およびＲ＝０ロ タマー対標識化方程式の網羅的適用およびＲ＝１ロタマー対標識化方程式の制限 的適用は全体解決を見出すのにルーチン的に失敗する。この問題は、「スーパー 残基」へ残基を単一化することによって克服することができる(Desmetら、（199 2）(前掲);Desmetら、（1994）(前掲);Goldstein（1994）(前掲)。しかしながら 、単一化はスーパー残基当たりのスーパーロタマーの数の管理できない増加を引 き起こし得、取り扱いにくく、遅い効率に導きかねない。というのは、Ｒ＝１ロ タマー対標識化方程式を適用する計算時間はロタマーの数の第４のパワーと共に 増加するからである。残基当たりの非常に多数のロタマーについての要件が与え られれば、蛋白質デザイン適用にこれらの問題は特に重要である。メモリーサイ ズを限定し、効率を増加させるには、我々は、いずれの残基が単一化されるか、 およびＲ＝１ロタマー対標識化方程式に含まれるロタマー（またはスーパー残基 ）対の数を支配する発見的方法を開発した。ＰＤＡ＿ＳＥＴＵＰからのロタマー エネルギーのリストを採用し、そのエネルギーを持つ最適立体配座における全体 最小配列をアウトプットするＰＤＡ＿ＤＥＥと呼ばれるプログラムを書き込んだ 。 スコアリング機能：使用したロタマーライブラリーは、Desmetおよび共同研究 者(Desmetら、（1992）(前掲))によって使用されたものと同様であった。Ｍｅｔ 、ＡｒｇおよびＬｙｓを除く全てのアミノ酸についてのロタマーのχ₁およびχ₂ 角を、PonderおよびRichardsライブラリー（前掲）からの平均値の周りに±１標 準偏差拡張して、ライブラリーの不連続性から生起し得る可能な誤差を最小化し た。データベース統計からは決定されていないc₃およびc₄角は、Ｇｌｎについて は０°および１８０°の値が割り当てられ、Ｍｅｔ、ＬｙｓおよびＡｒｇでは、 −６０°および１８００が割り当てられた。アミノ酸当たりのロタマーの数はＧ ｌｙ、１；Ａｌａ、１；Ｖａｌ、９；Ｓｅｒ、９；Ｃｙｓ、９；Ｔｈｒ、９；Ｌ ｅｕ、３６；Ｉｌｅ、４５；Ｐｈｅ、３６；Ｔｙｒ、３６；Ｔｒｐ、５４；Ｈｉ ｓ、５４；Ａｓｐ、２７；Ａｓｎ、５４；Ｇｌｕ、６９；Ｇｌｎ、９０；Ｍｅｔ 、２１；Ｌｙｓ、５７；Ａｒｇ、５５である。環状アミノ酸Ｐｒｏは該ライブラ リーには含まれない。さらに、該ライブラリーにおける全てのロタマーは明示 的水素原子を含有した。ロタマーはドレイディング力場(Mayoら、J．Phys．Chem ．94:8897(1990))からの結合長さおよび角度で作成された。 サーチで使用された配列配置のための最初のスコアリング機能は、原子ファン デルワールスポテンシャルであった。ファンデルワールスポテンシャルは、蛋白 質側鎖の特異的三次元配置の重要な決定基である排除された容量および立体的パ ッキング相互作用を反映する。ドレイディング力場からの半径および井戸深さパ ラメーターを持つLennard-Jones 12-6ポテンシャルをファンデルワールス相互作 用で使用した。１または２個の結合によって結合された原子についての非総合相 互作用は考慮しなかった。３個で結合された原子についてのファンデルワールス 半径は０．５だけ評価された。ロタマー／ロタマー対エネルギーおよびロタマー ／鋳型エネルギーは、公表されたＤＥＥアルゴリズムに合致するように計算され た(Desmetら、（1992）(前掲))。該鋳型は、蛋白質骨格および最適化されるべき でない残基位置の側鎖よりなるものであった。側鎖内ポテンシャルは計算されな かった。このスキームは、パッキング幾何学をスコアリングし、ロタマー内部エ ネルギーからの偏りを排除した。ＤＥＥに先立って、２５ｋｃａｌ／モルより大 きい鋳型相互作用エネルギーを持つ全てのロタマーを排除した。また、その相互 作用が、もう１つの残基位置における全ての他のロタマーでの２５ｋｃａｌ／モ ルを超える全てのロタマーを排除した。インプットとして、最適化されない位置 についての側鎖、ロタマーライブラリー、最適化されるべき位置のリストおよび 各位置において考慮すべきアミノ酸のリストを含めた骨格座標を採用するＰＤＡ ＿ＳＥＴＵＰと呼ばれるプログラムを書き込んだ。ＰＤＡ＿ＳＥＴＵＰはロタマ ー／鋳型およびロタマー／ロタマーエネルギーのリストをアウトプットする。 対の溶媒和ポテンシャルをＤＥＥ方法と依然として合致する２つの成分：ロタ マー／鋳型およびロタマー／ロタマー埋もれにおいて関係付けた。ロタマー／鋳 型埋もれ面積については、残基i-1、iおよびi+1のみの骨格原子を持つ残基ｉに おける問題のロタマーとして参照状態が規定された。側鎖の面積は、溶媒を排除 するが当該面積には計数されない骨格原子にて計算した。折り畳まれた状態は、 残基ｉにおける、しかし今や非最適化側鎖を含めた全鋳型構造の意味における問 題のロタマーの面積と定義された。ロタマー／鋳型埋もれ面積は参照および折り 畳まれた状態の間の差異である。ロタマー／ロタマー参照面積は、単純に、単離 されたロタマーの面積の合計である。折り畳まれた状態は、鋳型原子が存在しな い蛋白質スカフォールド上のそれらの相対的位置に置かれた２つのロタマーの面 積である。１．４Åのプローブ半径およびドレイディングファンデルワールス半 径と共に溶媒接近可能表面積のRichards定義（LeeおよびRichards，1971，前掲 ）を使用した。炭素および硫黄、および全ての結合した水素を非極性とみなした 。窒素および酸素、および全ての結合水素を極性とみなした。表面積は、１０Å^-2 のドット密度を用いるConnollyアルゴリズムで計算した(Connolly，（1983）( 前掲))。ＰＤＡ＿ＳＥＴＵＰのより最近の実行では、ScheragaのＭＳＥＥＤアル ゴリズムをConnollyアルゴリズムと共に使用して、計算をスピードアップした(P errotら、J．Comput．Chem.，13:1-11(1992))。 モンテカルロサーチ：ＤＥＥ最適化に従い、ＤＥＥ解決の近くにモンテカルロ サーチによって配列のランク付けリストを生成させた。配列のこのリストは、理 論および現実の可能な表面間の可能な差異のため必要であった。モンテカルロサ ーチはＤＥＥによって見出された全体最小配列において始める。側鎖はランダム に拾い、その部位において許容されるものから選択されたランダムロタマーに変 化させた。新しい配列エネルギーを計算し、もしそれが許容性についてのボルツ マン基準に適合すれば、新しい配列をもう１つのジャンプのための出発点として 使用した。もしボルツマンテストが失敗すれば、もう１つのランダムジャンプを 以前の配列から試みた。見出された最良の配列およびそれらのエネルギーのリス トをサーチを通じて維持した。典型的には、10⁶個のジャンプがなされ、１００ の配列がセーブされ、温度は１０００Ｋに設定された。サーチが終了した後、セ ーブされた配列の全てを、温度を０Ｋに変化させ、アミノ酸同一性を固定し、各 々の位置における各々の可能なロタマージャンプを試みることによってクエンチ した。該サーチは、そのインプットがＰＤＡ＿ＤＥＥからの全体最適解決および ＰＤＡ＿ＳＥＴＵＰからのロタマーエネルギーであるＰＤＡ＿ＭＯＮＴＥと呼ば れるプログラムで実行された。アウトプットはそれらのスコアによってランク付 けされた最良配列のリストであった。ＰＤＡ＿ＳＥＴＵＰ、ＰＤＡ＿ＤＥＥおよ びＰＤＡ＿ＭＯＮＴＥはＣＥＲＩＵＳ２ソフトウェア開発環境 (Biosym/Molecular Simulation，San Diego，CA)で実行された。 モデル系および実験テスト：αラセンのホモダイマーコイルドコイルを、最初 のデザイン標的で選択した。コイルドコイルは固相技術ならびにそれらのラセン 二次構造およびダイマー三次組織化ケース特徴付けによって容易に合成される。 それの配列は、ヘプタド反復（ａ・ｂ・ｃ・ｄ・ｅ・ｆ・ｇ）と呼ばれる７残基周期的 ＨＰパタンーンを呈する（CohenおよびParry，Proteins Struc．Func．Genet．7 :1-15（1990））。ａおよびｄ位置は、通常疎水性であって、ダイマー界面に埋 もれ、他方、他の位置は通常は極性であって溶媒に暴露されている（図５）。シ ミュレーションインモジュールへのプットに必要な骨格は、ＧＣＮ４−ｐ１の結 晶構造から採用した(O'Sheaら、Science 254:539(1991))。該１６の疎水性ａお よびｄ位置は、蛋白質の残りの結晶学的に決定された固定化場において最適化さ れた。ホモダイマー配列対称が実施され、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ 、Ｆ、ＹおよびＷ）からのロタマーのみが考慮され、ａ位置、Ａｓｎ１６におけ るアスパラギンは最適化されなかった。 ホモダイマーコイルドコイルがＧＣＮ４−ｐ１、ＰＤＢ確認コード２ＺＴＡの 骨格座標で作成された（Bernsteinら、J．Mol．Biol．112:535（1977）；O'Shea ら、前掲）。最適化されていない全ての側鎖をそれらの結晶学的に決定された位 置に残した。プログラムＢＩＯＧＲＡＦ（Biosym/Molecular Simulations，San Diego，CA）を用いて、構造上の明示的水素を創製し、次いで、これをドレイデ ィング力場を用いる５０工程のためにコンジュゲート勾配最小化した。最適化ａ およびｄ位置のためのロタマー基に疎水性アミノ酸を許容することのみによって 、ＨＰパターンが実施された。該疎水性基は位置当たり２３８ロタマーの合計に つきＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐよ りなるものであった。配列対称を侵す１００ｋｃａｌ／モルのロタマーにペナル ティーを課すことによってホモダイマー対称が実施された。同一アミノ酸の異な るロタマーが対称関連位置で許容された。残基１６でａ位置を占めるアスパラギ ンが最適化されていない鋳型に残された。10⁶工程のモンテカルロサーチを１０ ００Ｋの温度で行って、これらのスコアによってランク付けされた候補配列のリ ストを生じた。再現性をテストするために、異なるランダム数のシードで該サー チ を３回反復し、および全てのトライアルは実質的に同一の結果を供した。該モン テカルロサーチは約９０分を要した。この仕事における全ての計算はSilicon Gr aphics 200MHz R4400プロセッサーで行った。 各々が２３８の可能な疎水性ロタマーを持つ１６のａおよびｄ位置を最適化し た結果、238¹⁶または10³⁸個のロタマー配列が得られた。ＤＥＥアルゴリズムは ３分以内に、ロタマーエネルギー計算時間を含めた全体最適を見出した。ＤＥＥ 解決は１６位置の全てについてのａおよびｄ残基の天然に生じるＧＣＮ４−ｐ１ 配列にマッチした。１０００Ｋの温度で実行した１００万の工程のモンテカルロ サーチは、それらのスコアによってランク付けされた配列のリストを生じた。再 現性をテストするために、該サーチは異なるランク数シードで３回反復し、全て のトライアルは実質的に同一の結果を生じた。第２の最良の配列はＶａｌ３０な いしＡｌａ突然変異体であり、基底状態配列の３ｋｃａｌ／モル上にある。頂部 の１５配列ないし基底状態配列からの６つの突然変異体が許容され、種々のパッ キング配置が小さなコイルドコイルでさえ利用できることを示す。頂部１５およ びさらに２つの約１５ｋｃａｌ／モルエネルギーが高いものからの６つを含めた （リスト中５６番目および７０番目）（表１）、一定の安定性の範囲を持つ８つ の配列が実験的テストで選択された。 表１ Ｆｍｏｃ化学、ＨＢＴＵ活性化およびNovanbiochemからの修正されたアミド樹 脂を用い、３３残基のペプチドがApplied Biosystemsモデル４３３Ａペプチド 合成器で合成された。標準０．１ミリモルのカップリングサイクルを使用し、ア ミノ末端をアセチル化した。スカベンジャーとしてほぼ２００ｍｇの樹脂を２ｍ Ｌのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）および１００μＬの水、１００μＬのチオアニ ソール、５０μＬのエタンジオールおよび１５０ｍｇのフェノールで処理するこ とによって、ペプチドを樹脂から切断した。ペプチドを単離し、沈殿によって精 製し、冷メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルで反復洗浄し、続いて、０．１％ＴＦ Ａを含有する直線アセトニトリル−水グラジエントを用いるＶｙｄａｃ Ｃ８カ ラム（２５ｃｍ×２２ｍｍ）上で逆相ＨＰＬＣを行った。次いで、ペプチドを凍 結乾燥し、使用するまで−２０℃で保存した。血漿脱着マススペクトロスコピー は全ての分子量が予測された質量の１単位内であることを見出した。 円二色性ＣＤスペクトルは、５０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび４ ０μＭペプチド中にて、ｐＨ７．０で、Ａｖｉｖ ６２ＤＳスペクトロメーター で測定した。１ｍｍ路長のセルを使用し、熱電対によって温度を制御した。１０ 秒の平均時間および９０秒の平衡時間にての２度温度増分を用い、同一緩衝液中 で熱融解を行った。d[θ]₂₂₂/dT^-1対Ｔプロットの最小を評価することによって 、T_m値を222nm([θ]₂₂₂)における楕円率から求めた（CantorおよびSchimmel，Bi ophysical Chemistry，New York:W．H．Freemant and Company，1980）。T_mは１ 度以内で再現性であった。ペプチド濃度を２７５ｎｍにおけるチロシン吸光度か ら決定した（Huyghues-Despointesら、前掲）。 サイズ排除クロマトグラフィー：サイズ排除クロマトグラフィーは、０℃にて ５０ｍＭリン酸および１５０ｍＭ ＮａＣｌ中、ｐＨ７．０でSynchropak ＧＰ Ｃ１００カラム（２５ｃｍ×４．６ｍｍ）で行った。ＧＣＮ４−ｐ１およびｐ− Ｌ１(Harburyら、Science 262:1401(1993))をサイズ標準として使用した。１ｍ Ｍペプチド溶液の１０μｌ注入を０．２０ｍｌ／分でクロマトグラフィーに付し 、２７５ｎｍでモニターした。ペプチド濃度はピーク高から見積もってほぼ６０ μＭであった。試料は三連で行った。 指名されたａおよびｄ配列を、ｂ・ｃおよびｅ・ｆ・ｇ位置についてのＧＣＮ４ −ｐ１配列を用い、前記したごとくに合成した。標準的な固相技術を用い、ＨＰ ＬＣ精製に続き、ペプチドの同一性を質量分析によって確認した。円二色スペク トロスコピー（ＣＤ）を用いて、二次構造および指名されたペプチドの熱安定性 をアッセイした。１℃における全てのペプチドのＣＤスペクトルおよび４０ｍＭ の濃度は２０８および２２２ｎｍにおいて最小を呈し、１９５ｎｍで最大を呈し 、これはαラセンについての診断となる（データは示さず）。２２２ｎｍにおけ る楕円率は、ペプチドの全てが＞８５％ラセンであり（ほぼ−２８０００度cm² ／ｄモル）であることを示し、４０ｍＭで７５％ラセンであるが、１７０ｎＭで ９０％まで増加するＰＤＡ−３Ｃが例外である（表２）。 表２ ＰＤＡペプチドのＣＤデータおよび計算された構造特性* E_MCはモンテカルロエネルギーである；ΔA_npおよびΔA_pは、各々、折り畳み に際しての溶媒接近可能非極性および極性表面積の変化である；E_CQは平衡化さ れた電荷を用いる静電エネルギーである；E_CGはGasteiger電荷を用いる静電エネ ルギーである；E_vdwはファンデルワールスエネルギーである；Volは側鎖ファン デルワールス容量である；回転結合は側鎖回転可能結合の数である（メチル回転 子を除く）；NpbおよびPbは、各々、埋もれた非極性および極性原子の数である 。 溶融温度（T_m）は広い範囲の値を示し（データは示さず）、８つのペプチドの うち６つは生理学的温度よりも高い温度で溶融する。また、T_mはＧＣＮ４−ｐ１ からの配列差異の数に関係付けられなかった。単一アミノ酸変化の結果、最も安 定なおよび最も安定性の低いペプチドのいくつかが得られ、これは、配列選択に おける特異性の重要性を示す。 サイズ排除クロマトグラフィーは、これらの指名されたペプチドのダイマー性 質を確認した。標準として既知のオリゴマー化状態のコイルドコイルペプチドを 用い、ＰＤＡペプチドはダイマーとして移動した。この結果は、ａ位置における β−分子残基およびｄ位置におけるロイシンの出現と一致し、これは、他の可能 なオリゴマー化状態にわたっての二量体化に好都合であることが以前に示されて いる(Harburyら、前掲)。 ＰＤＡペプチドの特徴付けは、いくつかの安定なダイマーラセンコイルドコイ ルの成功したデザインを示す。配列は、蛋白質構造のＨＰパターン化および立体 的特異性を明示的に考慮するよく規定されたインプットを用いるシミュレーショ ンモジュールによってデザイン凡例の意味で自動的に生じた。三次パッキングの 特異性をプローブすることを狙った２つの二次元核磁気共鳴実験は、これらのペ プチドに対するさらなる研究の焦点である。最初の実験は、ＧＣＮ４−ｐ１に匹 敵する化学的交換および化学シフト分散からのアミドプロトンの有意な保護を示 30:11615(1991))。 データ分析およびデザインフィードバック：理論的および実験的な可能な表面 の間の対応性の詳細な分析、および従って、シミュレーションコスト機能の正確 性の見積もりは、実験データの収集によって可能となった。デザイン効率の尺度 として熱安定性を用い、ＰＤＡペプチドの溶融温度を、モンテカルロサーチで見 出された配列スコアに対してプロットした（図６）。該プロットにおける適度の 修正０．６７は、専らファンデルワールススコアリング機能が安定な配列につき スクリーニングできる一方で、それは相対的安定性を正確には予測しないことを 示す。この論点に向かうために、計算された構造特性およびT_mの間の修正を、構 造ベースの薬物デザインで通常は使用される統計学である定量的構造活性相関を 用いて系統的に調べた(Hopfinger，J．Med．Chem.，28:1133(1985))。 表２は、ファンデルワールスベースのモンテカルロスコアおよび実験的に決定 されたT_mに加えて、ＰＤＡペプチドの種々の分子特性をリストする。静電エネル ギーのごとき分子メカニックス成分、および容量のごとき幾何学的尺度を含めた 広い範囲の特性を調べた。ＱＳＡＲの目標は、実験的性質、この場合は計算され た特性の関数としてのT_mを密接に近似する方程式の生成である。かかる方程式は 、 改良されたコスト機能でいずれの特性を使用することができるかを示唆する。Ｐ ＤＡ分析モジュールは遺伝子機能近似（ＧＦＡ）(RogersおよびHopfinger，J．C hem．Inf．Comput．Scie，34:854(1994))、いずれの特性を含めるべきかを選択 するＱＳＡＲ方程式および遺伝アルゴリズムを用いる特性の相対的重み付けを最 適化する新規の方法を使用する。ＧＦＡは可能な方程式のスペースの効果的なサ ーチを達成し、データに対するそれらの修正によってランク付けされた方程式の リストを精力的に生成させる。 方程式はフィットの欠如（ＬＯＦ）、方程式により多い項を課すことによって 過剰フィッティングに抵抗する重み付けした最小二乗誤差によってスコアリング する（RogersおよびHopfinger，前掲）。ＧＦＡは方程式の長さおよび成分双方 を最適化し、ＱＳＡＲ方程式のセットを生じさせることによって、よくフィット する特性および多くの方程式で繰り返される特性の組合せを明瞭とする。シミュ レーションエネルギー（E_MC）を修正する頂部の５つの方程式の全ては、非極性 表面積の埋もれΔA_npを含有する（表３）。 表３ ＬＯＦでのＧＦＡによって生成した頂部５つのＱＳＡＲ方程式、修正 計数および交差有効化スコア ΔA_npおよびΔA_pは、各々、折り畳みに際して埋もれた非極性および極性表面 である。Ｖｏｌは側鎖容量であり、Npbは埋もれた非極性原子の数であり、Ｒｏ ｔは埋もれた回転可能結合の数である。 E_MCおよびΔA_npのみを含有するＱＳＡＲの低いＬＯＦに加えて、頂部方程式の 全てにおけるΔA_npの存在は、ペプチド安定性を予測するための臨界的特性とし ての非極性表面埋もれを強力に意味する。この結論は、蛋白質エネルギーにおけ る疎水性効果の役割を仮定すれば驚くべきことではない（Dill，Biochem， 29:7133(1990)）。 特性はＢＩＯＧＲＡＦおよびドライディングカ場を用いて計算された。溶媒接 近可能表面積は、１．４Åのプローブ半径および１０Å^-2のドット密度を用いる 、Connollyアルゴリズム(Connolly，（1983）（前掲))で計算した。容量は最適 化された側鎖のファンデルワールス容量の合計として計算した。埋もれた極性お よび非極性の重い原子の数は、表面積計算において５Ų未満露出される、それ らの結合水素を持つ原子として定義される。静電エネルギーは、１つの誘電体を 用いて計算し、カットオフは非極性エネルギーの計算で設定しなかった。電荷平 衡電荷(RappeおよびGoddard III，J．Phys．Chem．95:3358(1991))およびGastei ger(GasteigerおよびMarsili，Tetrahedron 36:3219(1980))電荷を用いて、静電 エネルギーを生成させた。電荷平衡電荷は手動的に調整して、中性骨格および中 性側鎖を供し、偽の単極効果を防止した。特性の選択は、特性を高度に修正する ことができない要件によって制限された。修正された特性はＱＳＡＲ技術によっ て区別することができず、誘導された関係における豊富さを生じるに過ぎない。 遺伝機能近似（ＧＦＡ）はＣＥＲＩＵＳ２シミュレーションパッケージバージ ョン１．６（Biosym/Molecular Simulations，San Diego，CA）で行った。３つ の特性のランダム組合せよりなる３００方程式の最初の集団を生成させた。直線 項のみを使用し、特性の各セットにつき最小二乗回帰によって最初の係数を決定 した。冗長な方程式を排除し、ランダムな交差突然変異の１０００生成を行った 。もし子供が集団において最悪の方程式よりも良好なスコアを有するならば、最 悪方程式を当該子供に置き換えた。また、項を付加しまたは除去する突然変異操 作者は、各生成が適用される５０％確率を有するが、これらの突然変異は、スコ アが改良された場合にのみ、許容される。３項を超える方程式は許容されなかっ た。フィットの欠如（ＬＯＦ）パラメーター、方程式により多くの項を課し、従 って、過剰フィッティングに抵抗するスケーリングした最小二乗誤差（ＬＳＥ） 尺度を用い、進化の間方程式をスコアリングした。ＬＯＦは以下のごとくに定義 される： ここに、ｃは方程式における項の数であって、Ｍはデータ点の数である。５つの 異なるランダム化された実行を行い、最終方程式集団をプールした。シミュレー ションエネルギーE_MCを含有する方程式のみを考慮し、その結果、それらのＬＯ Ｆによってランク付けされた１０８の方程式が得られた。 これらのＱＳＡＲ方程式の予測されるパワー、ならびにそれらの粗野性を評価 するために、交差有効化を行った。各ペプチドを順次データセットから除去し、 問題の方程式の係数を再度フィットさせた。次いで、この新しい方程式を用いて 、許されないデータ点を予測した。データ点の全てがこのようにして予測された ならば、測定されたT_mに対するそれらの修正を計算した（表３）。E_MC／ΔA_np ＱＳＡＲおよびE_MC／ΔA_np／ΔA_p ＱＳＡＲのみが交差有効化で実行された。該 E_MC／ΔA_np方程式は、データを３つの項を持つＱＳＡＲに出来る限りスムーズに フィットさせるとは予測できず、よって、より低い交差有効化r²を有した。しか しながら、全ての他の２つの項ＱＳＡＲは４８を超えるＬＯＦスコアを有し、交 差有効化相関は０．５５未満であった（データは示さず）。該ＱＳＡＲ解析は、 非極性および極性表面積埋もれがシミュレーションを改良するのに必要であるこ とを実質的偏りなくして独立して予測した。この結果は原子溶媒和ポテンシャル についての以前の研究と合致する（Eisenbergら、（1986）(前掲);Wessonら、Pr otein Sci．1:227(1992)）。さらに、疎水性溶媒和のごとき基礎となる原理を反 映する、埋もれた原子の数のごとき、より単純な構造尺度(Chanら、Science 267 :1463(1995))はＱＳＡＲ解析によって有意とはみなされなかった。これらの結果 は現実の表面積のコストを調整するが、ある研究では、より単純なポテンシャル がよく実行されることが示されている（van Gunsterenら、J．Mol．Biol．227:3 89（1992））。 Δa_npおよびΔA_pをシミュレーションモジュールに導入して、コスト機能を修 正した。ロタマー／鋳型およびロタマー／ロタマー接触らの表面埋もれに対する 寄与を計算し、相互作用ポテンシャルで使用した。ＤＥＥで必要な、異なるロタ マー対からの独立計数埋もれ表面は、溶媒接近可能表面の半径がファンデルワー ル ス接触半径よりもかなり大きく、よって、密にパックされた蛋白質コアにおいて 重複できるゆえに埋もれの過剰評価に導く。この矛盾を説明するために、ＱＳＡ Ｒで使用した面積を、対の面積方法を用いて再度計算し、新しいE_MC／ΔA_np／Δ A_pＱＳＡＲ方程式を生成させた。ΔA_npおよびΔA_p係数に対するE_MC係数の比率は 、埋もれた表面積をエネルギーに変換するためにシミュレーションモジュールで 使用されるスケール因子、すなわち、原子溶媒和パラメーターである。熱安定性 はこのコスト機能によってよく予測される（図６Ｂ）。加えて、改良されたコス ト機能は、基底状態としての天然に生じるＧＣＮ４−ｐ１配列を依然として予測 する。エネルギースケール因子に対する表面積、１６ｃａｌ／モル／Ų好都合 非極性面積埋もれおよび８６ｃａｌ／モル／Ų対向極性面積埋もれは小さな分 子移動データに山来する溶媒和ポテンシャルパラメーターに対する徴候、スケー ルおよび相対的大きさにおいて同様である(WessonおよびEisenberg，前掲)。 λリプレッサー突然変異体：コスト機能の一般性を証明するために、シミュレ ーションモジュールを用いて他の蛋白質を調べた。ＤＮＡ結合蛋白質λリプレッ サーのコア突然変異体のライブラリーは、Sauerおよび共同研究者によって広く 特徴付けられている(LimおよびSauer，J．Mol．Biol．219:358(1991))。鋳型の 座標はＰＤＢファイル１ＬＭＢから採用した（BeamerおよびPabo，J．Mol．Biol ．227:177(1992)）。該ＰＤＢファイルにおけるサブセット指名鎖４は（サブユ ニットおよびＤＮＡを伴う）構造の残りから除去され、ＢＩＯＧＲＡＦを用い、 明示的水素が付加された。３つの突然変異体部位（Ｖ３６ Ｍ４０ Ｖ４７）の ５Å内の側鎖を持つ疎水性残基はＹ２２、Ｌ３１、Ａ３７、Ｍ４２、Ｌ５０、Ｆ ５１、Ｌ６４、Ｌ６５、１６８およびＬ６９である。これらの残基の全ては、６ ５％埋もれであるＭ４２および４５％埋もれであるＬ６４を除き、８０％を超え る埋もれである。Ａ３７のみが１つの可能なロタマーを有し、よって、最適化さ れなかった。５Å球中の他の９つの残基は、それらのアミノ酸（「浮いたもの」 ）のいずれかのロタマー立体配座を採ることを可能とした。突然変異部位は、問 題のアミノ酸配列のいずれかのロタマーを可能とした。突然変異体配列に応じて 、５×10¹⁶ないし７×10¹⁸立体配座が可能であった。ロタマーエネルギーおよび ＤＥＥ計算時間は２ないし４分であった。組み合わせた活性スコアは HellingaおよびRichards(Hellingaら、（1994）(前掲))のものである。１２５個 の可能な組み合わせのうち７８個が生成された。また、このデータセットを用い て、いくつかの計算されたスキームがテストされており、異なる力場を比較する ための基礎として働くことができる(LeeおよびLevitt，Nature 352:448(1991)； van GunsterenおよびMark，前掲;Hellingaら、(1994)(前掲))。ＱＳＡＲによっ て見出されたコスト機能を用い、シミュレーションモジュールを用いて、各突然 変異体配列についての最適立体配座およびエネルギーを見出した。３つの突然変 異体部位の５Å内の全ての疎水性残基もまた、自由にされて、該アルゴリズムに よって緩和された。この５Å球は１２の残基を含有し、以前の努力よりもかなり 大きな問題であり(LeeおよびLevitt，前掲，Hellinga(1994)(前掲))、これはシ ミュレーションモジュールのＤＥＥ成分によって迅速に最適化された。Hellinga およびRichardsによって提案された組み合わせた活性スコアに対する予測された エネルギーのランク修正は図７に示す。野生型は１２５の可能な配列の最低エネ ルギーを有し、修正は、ＱＳＡＲ修正したコスト機能がコイルドコイルに特異的 ではなく、他の特性を適当に作成できることを示す以前に公表された結果と実質 的に同等である。 実施例２ 蛋白質ラセンの表面位置の自動デザイン ＧＣＮ４−ｐ１、ホモダイマーコイルドコイルは、固相技術によって容易に合 成することができ、そのラセン二次構造およびダイマーの三次組織は容易に特徴 付けられるので、モデル系として再度選択した。ホモダイマーコイルドコイルの 配列は、ヘプタド反復と呼ばれる７つの残基周期的疎水性および極性パターン（ ａ・ｂ・ｃ・ｄ・ｅ・ｆ・ｇ）を呈する(CohenおよびParry、前掲)。ａおよびｄ位置は ダイマー界面に埋もれ、通常は疎水性であるが、ｂ、ｃ、ｅ、ｆおよびｇ位置は 溶媒に暴露され、通常は極性である（図５）。ＧＣＮ４−ｐ１の結晶構造の調査 (O'Sheaら、前掲)は、ｂ、ｃおよびｆ側鎖が溶媒まで拡張され、それらの表面積 の少なくとも５５％露出されることを示す。対照的に、ｅおよびｇ残基は、対向 するラセンのａおよびｂ残基に対してパッキングすることによって、そされ らの表面積の５０ないし６０％埋もれる。我々は、表面配列デザインのために１ ２のｂ、ｃおよびｆ残基を選択した：ＰＤＢエントリー２ｚｔａを用い位置３、 ４、７、１０、１１、１４、１７、１８、２１、２４、２５および２８（Bernst einら、J．Mol．Biol．112:535（1977））。全ての他の側鎖および骨格を含めた 蛋白質構造の残りを、配列選択計算のために鋳型として使用した。ダイマーの対 称およびサブユニット間の表面残基の相互作用の欠如は各サブユニットの独立し たデザインを可能とし、それにより、配列最適化蛋白質のサイズをかなり減少さ せる。 １２の表面位置のための疎水性アミノ酸（Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、Ｋ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、 ＡおよびＨ）の全ての可能な配列は、我々のデザインアルゴリズムによってスク リーニングした。アミノ酸側鎖のトーション柔軟性は、ロタマーと呼ばれる、各 側鎖の許容されたコンフォーマーの区別されるセットを考慮することによって説 明された(Ponderら、1987，(前掲);Dunbrackら、Struc．Biol．Vol．1(5):334-3 40(1994))。各々１０個の可能なアミノ酸を持つ１２のｂ、ｃおよびｆ位置を最 適化する結果、DunbrackおよびKarplus骨格-依存性ロタマーライブラリーを用い る場合、〜10²⁸ロタマー配列に対応する10¹²の可能な配列が得られる。ロタマー 配列最適化によって提示される巨大なサーチ問題はデッドエンド排除（ＤＥＥ） 理論（Desmetら、(1992)(前掲);Desmetら、（1994）(前掲);Goldstein(1994)(前 掲)）の適用によって克服される。ＤＥＥ理論の我々の実行は配列デザインのそ の利用性まで拡大され、その最適立体配座における全体最適配列を迅速に見出す 。 我々は、表面配列をスコアリングするにおけるそれらの有効性のためにポテン シャルエネルギー機能を調べた。各候補スコアリング機能を用いて、モデルコイ ルドコイルのｂ、ｃおよびｆ位置をデザインし、得られたペプチドを合成し、特 徴付けて、デサイン効率を評価した。水素結合ポテンシャルを用いて、蛋白質お よびペプチドにおける水素結合の実験から予測されるように(Stickleら、前掲;H uyghues-Despointesら、前掲)，予測された水素結合がデザインされた蛋白質安 定性に寄与できるかをチェックした。しかしながら、水素結合についての配列の 最適化は、水素結合に関与しない極性ドナーをしばしば埋もれさせる。この補償 されない、水に対する可能な水素結合ポテンシャルの喪失は、極性プロトンの埋 もれに対するペナルティーと組み合わせた水素結合ポテンシャルよりなる第２ス コアリングスキームの調査を促進した(Eisenberg，（1986）（前掲))。Baldwin および共同研究者の経験的に誘導されたラセン特性を持つ水素結合ポテンシャル を増加させる第３のスコアリングスキームをテストした(Chakrabarttyら、前掲) 。ラセン特性の物理的基礎は不明瞭であるが、それらは蛋白質安定性に対して有 意な効果を有することができ、蛋白質デザインを改良するために潜在的に使用す ることができる（O’NeilおよびDeGrado，1990;Zhangら、Biochem，30:2012(199 1);Blaberら、Science 260:1637(1993);O'sheaら、1993;Villegasら、Folding a nd Design 1:29（1996））。ファナデルワールスポテンシャルを全ての場合に使 用してパッキング相互作用および排除された容量を説明した。 また、ｂ、ｃおよびｆ位置に対するいくつかの他の配列を合成し、特徴付けて 、水素結合およびラセン特性ポテンシャルの相対的重要性を認識するのを助力し た。水素結合ポテンシャルでデザインした配列をランダムに掻き混ぜ、それによ り、デザインした相互作用を破壊するが、配列のラセン特性は変化させない。ま た、最大可能ラセン特性、アラニンに対して設定された全ての位置を持つ配列を 作成した。最後に、デザインされていない対照として供するために、天然に生じ るＧＣＮ４−ｐ１配列および疎水性アミノ酸セットからランダムに選択された配 列を合成し、実験した。 配列デザイン：スコアリング機能およびＤＥＥ：ＧＣＮ４−ｐ１、ＰＤＢ記録 ２ｚｔａの骨格座標に対して蛋白質構造を作成した（Bernsteinら、前掲;O'Shea ら、前掲)）。最適化されなかった全ての側鎖の原子は、それらの結晶学的に決 定された位置に残した。プログラムＢＩＯＧＲＡＦ（Molecular Simulations In corporated，San Diego，CA）を用いて、構造上に明示的水素を生じさせ、次い で、これを、ドレイディング力場を用いる５０工程につきコンジュゲート勾配最 小化した（Mayoら、1990，前掲）。ダイマーの対称およびサブユニット間の表面 残基の相互作用の欠如は、各サブユニットの独立したデザインを可能とした。全 ての計算は、２ｚｔａに出現する最初のモノマーを用いて行った（鎖Ａ）。骨格 −依存性ロタマーライブラリーを用いた(Dunbrackら、 (1993)(前掲))。データベース統計学から決定されないｃ3角は以下の値を割り当 てた；Ａｒｇ、−６０°、６０°および１８０°；Ｇｌｎ、−１２０°、−６０ °、０°、６０°、１２０°、および１８０°；Ｇｌｕ、０°、６０°および１ ２０°；Ｌｙｓ、−６０°、６０°および１８０°。データベース統計学から決 定されないＣ4角は以下の値を割り当てた：Ａｒｇ、−１２０°、−６０°、６ ０°、１２０°および１８０°；Ｌｙｓ、−６０°、６０°および１８０°。逐 次ｇ⁺／ｇ^-角またはｇ^-／ｇ⁺の結果となるc₃およびc₄の組合せを持つロタマーを 排除した。未荷電Ｈｉｓロタマーを使用した。０．９のスケールとしたファンデ ルワールス半径でのLennard-Jones １２−６ポテンシャル（Dahiyatら、First f ully automatic design of a protein achieved by Caltech scientists，new p ress release（1997））をファンデルワールス相互作用で使用した。水素結合ポ テンシャルは、前記方程式９に示されるごとく、距離−依存性項および角度−依 存性項よりなるものであった。この水素結合ポテンシャルはドレイディングで使 用されるポテンシャルに基づくものであり、不都合な水素結合幾何学の発生を制 限するより制限的角度−依存性項を持つ。該角度項は、前記方程式１０に示すよ うに、ドナーおよびアクセプターの混成状態に応じて変化する。 方程式１０〜１３において、θはドナー−水素−アクセプター角であり、φは 水素−アクセプター−ベース角（該ベースはアクセプターに結合した原子である 、例えば、カルボニル原子はカルボニル酸素アクセプターについてのベースであ る）であり、ψはsp²中心に結合した６つの原始によって規定される平面の法線 間の角度である（ψが９０°未満である場合、ψの補角を用いる）。水素結合機 能は、sp³ドナー−sp³アクセプターの場合に２．６Å＜Ｒ＜３．２Å、φ＞９０ °、f−１０９．５°＜９０°であって、sp³ドナー−sp²アクセプターの場合に φ＞９０°であれば評価するに過ぎない；スイッチング機能は使用しなかった。 鋳型−鋳型水素結合に関与する鋳型ドナーおよびアクセプターはドナーおよびア クセプターのリストに含めなかった。排除の目的では、鋳型−鋳型水素結合は、 ２．５Å≧Ｒ≧３．３Åであってθ≧１３５°である場合に存在するとみなした 。使用する場合、極性水素埋もれについての２ｋｃａｌ／モルのペナルティーを 水素結合に関与しない埋もれた極性水素に適用したに過ぎず、ここに、水素結合 は E_HBは−２ｋｃａｌ／モル未満である場合に存在するとみなした。このペナルテ ィーは鋳型水素には適用しなかった。水素結合ポテンシャルには４０Ｒの距離− 依存性誘電定数を含んだ弱いクーロン項を補足し、ここに、Ｒは原子間距離であ る。部分的原子電荷は極性官能基のみに適用した。＋１の正味の形式電荷をＡｒ ｇおよびＬｙｓで使用し、−１の正味の形式電荷をＡｓｐおよびＧｌｕで使用し た。α−ラセン特性に関するエネルギーは前記方程式１４を用いて計算した。方 程式１４において、Ｅαはα−ラセン特性のエネルギーであり、ΔG⁰ _aaはアミノ 酸のラセン成長の標準自由エネルギーであって、N_ssは３．０に設定した特性ス ケール因子である。このポテンシャルは、特性エネルギーをスコアリング機能に おける他の項と同様の範囲までのスケールとするために選択した。該ＤＥＥ最適 化は我々の以前の方法に従った（Dahiyatら、（1996）(前掲)）。計算は１２プ ロセッサー、Ｒ１００００−ベースのSilicon Graphics Power Challengeまたは 512 node Intel Deltaいずれかで行った。 ペプチドの合成および精製ならびにＣＤ解析は実施例１におけるものと同様で あった。ＮＭＲスペクトルは90/10H₂O/D₂OおよびｐＨ７．０の５０ｍＭリン酸ナ トリウム緩衝液中で調製した。スペクトルは２５℃においてVarian Unityplus ６００ＭＨｚスペクトロメーターで獲得した。３２の過渡電流は水抑止で使用さ れる溶媒プレ飽和の１．５秒で獲得した。試料は〜１ｍＭであった。サイズ排除 クロマトグラフィーは０℃にて５０ｍＭリン酸および１５０ｍＭ ＮａＣｌ中、 ｐＨ７．０にて、PolyＬＣヒドロキシエチルＡカラム（２０ｃｍ×９ｍｍ）で行 った。ＧＣＮ４−ｐ１およびｐ−Ｌ１（Harburyら、前掲）は、各々、ダイマー およびテトラマー用のサイズ標準として使用した。〜１ｍＭペプチド溶液の５μ ｌ注入を０．５０ｍｌ／分でクロマトグラフィーに付し、２１４ｎｍにてモニタ ーした。試料は三連で実行した。 この実験で調べたペプチドの全ての表面配列を表４に示す。 表４ 合成されたペプチドの配列および特性明瞭性のため、デザインされた表面残基のみを示し、それらを位置（ｂ、ｃおよ びｆ）によってグループ分けした。デザインされた位置の配列数は３、４、７、 １０、１１、１４、１７、１８、２１、２４、２５および２８である。融点（T_m ）は円二色性によって測定し、オリゴマー化状態（Ｎ）はサイズ排除クロマトグ ラフィーによって決定した。ΣΔＧ°は１２ｂ、ｃおよびｆ位置のラセン成長の 標準自由エネルギーの合計である（Chakrabarttyら、1994）。デザイン方法の略 語は：水素結合（ＨＢ）、極性水素埋もれペナルティー（ＰＢ）、およびラセン 特性（ＨＰ）である。 水素結合ポテンシャルでデザインした配列６Åは、相互に多数の水素結合を形 成することが予測されるＡｒｇおよびＧｌｕ残基を有する。これらの長鎖アミノ 酸は、相互と、および骨格と相互作用するラセンのターンを横切って伸びること ができるので好都合である。掻き混ぜた６Ａ配列の６Ｄの最適幾何学がＤＥＥで 見い出されたならば、非常に少ない水素結合相互作用しか存在せず、そのスコア は６Ａよりもかなり悪い。水素結合ポテンシャルに加えて極性水素埋もれペナル ティーでデザインした６Ｂは、Ｌｙｓ、ＧｌｕおよびＧｌｎのごとき長い残基に よって依然として支配されているが、Ａｒｇはより少ない。Ａｒｇは他のアミノ 酸よりも極性の水素を有しているゆえに、それは非水素結合プロトンをよりしば しば埋もれさせ、従って、このポテンシャル機能を使用する場合不都合である。 ６Ｃは水素結合ポテンシャルおよびスコアリング機能におけるラセン特性でデザ インし、全部がＡｌａおよびＡｒｇ残基（最高のラセン特性を持つアミノ酸）よ りなる(Chakrabarttyら、前掲)。Ａｒｇ残基は近くのｅおよびｇ位置のＧｌｕ残 基とで水素結合を形成する。ランダム親水性配列６Ｅは水素結合を保有せず、使 用するポテンシャル機能の全てで非常に貧弱なスコアである。 ペプチドの二次構造および熱安定性は円二色性（ＣＤ）スペクトロスコピーに よって評価した。１℃および４０μＭにおけるペプチドのＣＤスペクトルは、ラ ンダム表面配列ペプチド６Ｅを除いてαラセンに特徴的であり、２０８ｎｍおよ び２２２ｎｍで最小である。６Ｅは、−１２０００度cm²／ｄモルの[θ]₂₂₂を持 つαラセンおよびランダムコイルの混合物を示唆するスペクトルを有する。デザ インされたペプチドの融点（T_m）は、１５℃のT_mを有する６Ｅを除いて、ＧＣＮ ４−ｐ１のT_mよりも１２〜１６℃高い。溶融の前および後に取ったＣＤスペクト ルは同一であり、これは、可逆的熱変性を示す。このコイルドコイルの表面位置 のデザインは野生型ＧＣＮ４−ｐ１よりもかなり安定した構造を生じる一方で、 ランダム親水性配列はペプチド安定性を大いに破壊する。 サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、全てのペプチドが６Ｆを除いて ダイマーであり（全てのＡｌａ表面配列）、これはテトラマーとして移動したこ とを示した。これらのデータは、表面デザインが、いくつかのコア再デザインと は対照的に、これらのペプチドの三次構造を変化させなかったことを示す（Harb uryら、前掲）。加えて、〜１ｍＭにおけるペプチドの核磁気共鳴（ＮＭＲ）ス ペクトルは、ＧＣＮ４−ｐ１と同様の化学シフト分散を示した（データは示さず ）。 水素結合ポテンシャルでデザインしたペプチド６ＡはＧＣＮ４−ｐ１について の５７℃に対して７１℃で溶融し、これは、表面残基の合理的デザインが天然に 生じるコイルドコイルよりも顕著に安定した構造を生じ得ることを示す。安定性 のこの獲得は、恐らくは、改良された水素結合によるものではない。というのは 、掻き混ぜた配列を除いて６Ａと同一の表面アミノ酸組成を有し、予測された水 素結合を有しない６Ｄもまた７１℃で溶融するからである。さらに、６Ｂは異な るスコアリング機能でデザインし、予測される水素結合のセットを有するが、７ ２℃の非常に似たT_mを有する。 ＧＣＮ４−ｐ１に対するこれらの配列の増大した安定性についての別の説明は これらのより高いラセン特性である。水素結合ポテンシャルによって選択された 長い極性残基Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、ＡｒｇおよびＧｌｎもまた最良のラセンフォーマ ーの中にある（Chakrabarttyら、前掲）。ラセン特性の効果は、特にラセン末端 から離れれば、水素結合のそれと同程度には配列位置に依存しないので、６Ａの 配列の掻き混ぜからはほとんど効果が予測されないであろう。表面配列のラセン 特性の粗い尺度である、ラセン成長の標準自由エネルギー（ΣΔＧ°）（Chakra bartyら、前掲）は、ペプチドの熱安定性に対応する（表４）。ΣΔＧ°はペプ チド安定性における傾向にマッチするが、それはこれらのコイルドコイルの増大 した安定性に定量的には相関しない。 ペプチド６Ｃはスコアリング機能の一部としてのラセン特性でデザインし、そ れは−２．０４１ｋｃａｌ／モルのΣΔＧ°を有する。６ＣはＧＣＮ４−ｐ１よ りも安定であるが、６９℃のＴｍは、６Ｃのより高いラセン特性にも拘わらず、 ６Ａおよび６Ｂよりもわずかに低い。同様に、６Ｆは全てのＡｌａ配列および− ３．０９６ｋｃａｌ／モルで可能な最高のラセン特性を有するが、７３℃のT_mは 6Aまたは6Bのそれよりもわずかに高いに過ぎない。また、6Fは、恐らくはそのポ リ（Ala）表面が会合を媒介し得る大きな疎水性パッチを露出しているため、SEC の間、ダイマーとしではなくテトラマーとして移動する。6Cおよび6Fについての 結果は、ラセン特性が表面デザインに重要であるという結論を支持するが、それ は専ら特性を使用するにおいて可能な制限を指摘する。増大する特性は、恐らく は、他の因子が不都合に影響されているゆえに、構造に対して最大の安定性を必 ずしも付与しない。また、6Fから明らかなように、蛋白質の三次構造の変化が起 こり得る。 これらのペプチドの特徴は、表面残基がα−ラセンコイルドコイルの安定性に 対して劇的なインパクトを有することを明瞭に示す。異なる表面デザインによっ て呈される安定性の広い範囲が顕著であり、ランダム親水性配列（T_m １５℃） およびデザインされた配列（T_m ６９〜７２℃）の間に５０℃を超えて広がる。 この結果は、溶媒暴露残基の重要性を証明する他の蛋白質についての研究(O'Nei l & DeGrado，1990;Zhangら、1991;Minorら（1994）(前掲)；Smithら、Science 270:980-982(1995))と合致する。さらに、これらのデザインは野生型 ＧＣＮ４−ｐ１配列よりもかなり高いT_mを有し、これは、表面残基が蛋白質デザ インにおいて安定性を改良するのに使用できることを示す（O'sheaら、前掲）。 ラセン特性はデザインされたコイルドコイルを安定化するにおいて水素結合より も重要であるようであるが、水素結合は他のタイプの二次構造のデザインおよび 安定化で重要であり得る。 実施例３ ファンデルワールス、Ｈ−結合、二次構造および溶媒和スコアリング機能を 用いるコア、表面および境界残基を含有する蛋白質のデザイン 本実施例では、コア、境界および表面残基の仕事を組み合わせた。我々のデザ イン方法の統合をテストするためのモチーフを選択するにおいて、我々は、計算 上および実験上取り扱いやすいのに十分な位小さいが、ジスルフィド結合または 金属結合部位の不存在下で独立して折り畳まれた構造を形成するのに十分な位大 きい蛋白質折り畳みを求めた。我々は、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合モジュールに よって典型化されたββαモチーフを選択した（Pavletichら、（1991）(前掲) ）。それは３０未満の残基よりなるが、このモチーフはシート、ラセン、および ターン構造を含む。さらに、この構造を採る、異常アミノ酸（Ｄ−プロリン）お よび非天然アミノ酸（３−（１，１０−フェナントロール−２−イル）−Ｌ−ア ラニン）を含有する、２３残基ペプチドをデザインしたImperialおよび共同研究 者による最近の仕事は、金属イオンの不存在下で形成されるこの折り畳みの能力 を証明した(Struthersら、1996a)。Brookhaven Protein Data Bank（ＰＤＢ）(B ernsteinら、1977)は、ββαモチーフの高い分解構造について調べ、ＤＮＡ結 合蛋白質Ｚｉｆ２６８（ＰＤＢコード１ｚａａ）の第２亜鉛フィンガーモチーフ が我々のデザイン鋳型として選択された（Pavletichら、（1991）(前掲)）。第 ２のモジュールの骨格は、Ｚｉｆ２６８中の他の２つの亜鉛フィンガーと、およ び他の蛋白質中の亜鉛フィンガーと密接に整列し、従って、この折り畳みクラス の代表的なものである。我々の位置１に対応するＰＤＢエントリー１ｚａａのナ ンバリングにおいて、リシン３３で開始する結晶構造から２８の残基が採られた 。第１の１２残基は第６および第７位置におけるきついターンを持つ βシートを含む。２つの残基は該シートをラセンに結合させ、これは、位置２６ を通って伸び、最後の２つの残基によってキャップを付されている。 コア、表面または境界クラスに鋳型構造における残基位置を割り当てるために 、Ｚｉｆ２６８における側鎖埋もれの程度およびＣα−Ｃβベクトルの方向を調 べた。小さいサイズのこのモチーフはコアに明瞭に割り当てることができる残基 の数を１つに制限し（位置５）、他方、６つの残基（位置３、１２、１８、２１ 、２２および２５）を境界として分類した。これらの残基のうちの３つはシート （位置３、５および１２）からのものであり、４つはラセン（位置１８、２１、 ２２および２５）からのものである。Ｚｉｆ２６８の亜鉛結合残基のうちの１つ はコアにあり、２つは境界にあるが、第４の位置８は蛋白質の幾何学的中心から 離れた方向のＣα−Ｃβベクトルを有し、従って、表面位置として分類される。 デザインアルゴリズムによって考慮された他の表面位置はシートからの４、９お よび１１、ラセンからの１５、１６、１７、１９、２０および２３であり、ラセ ン末端をキャップする１４、２７および２８である。ターンにある残りの露出位 置は不規則な骨格二面を有するか、あるいは部分的に埋もれ、この最初の研究の ためには配列選択に含めなかった。我々の以前の研究におけるごとく、配列選択 の間にコア位置において考慮されたアミノ酸はＡ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、ＹおよびＷ であり；表面位置で考慮されたアミノ酸はＡ、Ｓ、Ｔ、Ｈ、Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ、Ｋ およびＲであり；組み合わせたコアおよび表面アミノ酸（１６アミノ酸）は境界 位置で考慮された。 全体として、鋳型の２８位置うちの２０は配列選択の間に最適化された。アル ゴリズムは、まず、０°を超えるφ角を持つ全ての位置につきＧｌｙを選択して 骨格歪みを最小化する（残基９および２７）。１８の残りの残基は２つのセット に分け、別途に最適化して計算を速めた。１つのセットは１のコア、６の境界位 置および位置８を含み、この結果、４．３×10¹⁹ロタマー配列に対応する１．２ ×10⁹の可能なアミノ酸配列となる。他のセットは、10¹⁰の可能なアミノ酸配列 および４．１×10²³のロタマー配列を有する残りの１０表面残基を含んだ。各群 内には強い相互作用があるものの、２つの群は相互に強くは相互作用せず、配列 最適化を相互に独立したものとする。各最適化は、結晶学的座標に当てられた鋳 型中の非最適化位置で行った。 ２つの計算から見出された最適配列を組合せ、Ｚｉｆ２６８の第２亜鉛フィン ガーからの配列と整列させて図８に示す。親水性アミノ酸の全ては境界位置にお いて考慮されたが、非極性アミノ酸のみが選択された。計算された７つのコアお よび境界位置は十分にパッキングされた埋もれたクラスターを形成する。亜鉛結 合Ｈｉｓ位置、２１および２５においてアルゴリズムによって選択されたＰｈｅ 側鎖は８０％埋もれ、５におけるＡｌａは１００％埋もれ、他方、８におけるＬ ｙｓは溶媒に対して６０％暴露されている。他の境界位置は、Ｚｉｆ２６８と同 様の配置中に同様な側鎖をパッキングすることによる埋もれた残基に対する強力 な立体的拘束を示す。計算された最適立体配座は非極性表面に〜８３０Ų埋も れ、Ｐｈｅ１２（９６％埋もれ）およびＬｅｕ１８（８３％埋もれ）が該クラス ターに係留されている。ラセン表面では、アルゴリズムは、その側鎖カルボニル 酸素および残基１６の骨格アミドプロトンの間の水素結合を持つラセンＮ−キャ ップとしてＡｓｎ１４を位置させる。該ラセン上の６つの荷電残基は３対の水素 結合を形成するが、我々のコイルドコイルデザインでは、ラセン表面水素結合は 配列の総じてのラセン特性よりも重要性は低いようである。露出されたシート表 面の位置４および１１はＴｈｒ（最良β−シート形成残基のうちの１つ）（Kim & Berg，1993;Minorら、（1994）(前掲);Smithら、（1995）(前掲)）であるよう に選択される。 ２０のデザインされた位置を残りの８部位におけるＺｉｆ２６８アミノ酸と組 み合わせた結果、Ｚｉｆ２６８に対して総じて３９％（１１／２８）相同性を持 つペプチドが得られ、これは、デザインされた位置のみが考慮される場合、１５ ％（３／２０）相同性まで低下する。National Center for Biotechnology Info rmationの非豊富蛋白質配列データベースのＢＬＡＳＴ(Altschulら、1990)サー チは、いくつかの亜鉛フィンガー蛋白質および他の関係しない蛋白質の断片に対 して４０％未満の弱い相同性を見いだす。０．２６未満の有意性値を有するアル ゴリズムはない。Ｚｉｆ２６８鋳型上の２８残基のうちの２０を目的的に選択す ることによって、公知の蛋白質に対してほとんど相同性を持たず、亜鉛結合部位 を持たないペプチドがデザインされた。 実験的特徴付け：デザインされたモジュールの遠紫外円二色性（ＣＤ）スペク トルｐｄａ８ｄは、折り畳まれた構造の指標である、１９５ｎｍにおける極大お よび２１８ｎｍおよび２０８ｎｍにおける極小を示す。熱溶融は３９℃における 屈曲点とは弱く協働し、完全に可逆的である。ブロードな溶融は、小さな疎水性 コアを持つモチーフに予測される折り畳みのエントロピーと合致する。この挙動 は他の短いペプチドで観察された非協働的転移とは対照的である（Weiss & Keut mann，1990;Scholtzら、PNAS USA 88:2854(1991);Struthersら、J．Am．Chem．S oc．118:3073（1996b））。 １００μＭおよび７℃および２５℃における沈降平衡は、３４９０の分子質量 を与え、これは３３６２の計算された質量と良好に一致し、該ペプチドはモノマ ーであることを示す。しかしながら、５００μＭを超える濃度では、データは、 理想的な単一種モデルと良好にはフィットしない。データがモノマーダイマーテ トラマーに良好にフィットする場合、モノマー対ダイマーにつき０．５〜１．５ ｍＭの、ダイマー対テトラマーにつき４ｍＭを超える解離定数が見いだされたが 、相互作用は余りにも低くてこれらの値を正確には測定できなかった。水−ｓＬ ＥＤプラス配列（Altieriら、1995）を用いる拡散係数測定は沈降結果と一致し ；１００μＭにおいて、ｐｄａ８ｄはモノマー亜鉛フィンガー対照のそれに近い 拡散係数を有し、他方、１．５ｍＭにおいては、拡散係数は蛋白質Ｇβ１、５６ 残基蛋白質と同様である。ｐｄａ８ｄのＣＤスペクトルは、１０μＭないし２． ６ｍＭでは濃度非依存的である。２．１ｍＭおよび１００μＭで採られたＮＭＲ ＣＯＳＹスペクトルは、０．１ｐｐｍ未満シフトしたＨα−ＨＮクロスピークの ５とほとんど同一であり、クロスピークの残りは変化しないままである。これら のデータは、ｐｄａ８ｄが高濃度では弱い会合を受けるが、この会合はペプチド 構造に対しては実質的に効果を有しないことを示す。 ｐｄａ８ｄのＮＭＲ化学シフトはよく分散しており、当該蛋白質が折り畳まれ 、より配向していることを示唆する。ＴＯＣＳＹスペクトルのＨα−ＨＮフィン ガープリント領域はよく分解され、重複する共鳴はなく（図（９ａ））、Ｈαお よびＨＮ共鳴の全ては帰属決定された。ＮＭＲデータは、自己シールドｚ−グラ ジエントでのＮａｌｏｒａｃ逆相を備えたVarian Unityplus ６００ＭＨｚスペ ク トロメーターで収集した。ＮＭＲ試料はｐＨ５．０の５０ｍＭリン酸ナトリウム を含む90/10H₂O/D₂Oまたは９９．９％D₂O中で調製した。試料のｐＨはガラス電 極を用いて調整し、測定されたｐＨに対するD₂Oの効果については修正しなかっ た。帰属決定のための全てのスペクトルは７℃で収集した。試料濃度はほぼ２ｍ Ｍであった。ＮＭＲ帰属決定は、ＤＱＦ−ＣＯＳＹ、ＮＯＥＳＹおよびＴＯＣＳ Ｙスペクトルを用い、標準的等核方法に基づいた（Wuthrich，NMR of Proteins and Nucleic Acids（John Wiley & Sons，New York，1986））。ＮＯＥＳＹおよ びＴＯＣＳＹスペクトルはＦ１における２Ｋ点およびＦ１における５１２増分で 獲得し、ＤＱＦ−ＣＯＳＹスペクトルはＦ２における４Ｋ点およびＦ１における １０２４増分で獲得した。全てのスペクトルは７５００Ｈｚのスペクトル幅およ び３２過渡電流で獲得した。ＮＯＥＳＹスペクトルは１００および２００ミリ秒 のミキシング時間で記録し、ＤＱＦ−ＣＯＳＹスペクトルは８０ミリ秒の等方性 ミキシング時間で記録した。ＴＯＣＳＹおよびＤＡＦ−ＣＯＳＹスペクトルにお いては、水抑止は、各々、１．５および２．０秒の緩和遅れの間にプレ飽和によ って達成された。ＮＯＥＳＹスペクトルにおける水抑止は、ＷＡＴＥＲＧＡＴＥ プラス配列（Piottoら、1992）で達成された。化学シフトはＨＯＤ共鳴に対して 参照した。スペクトルはＦ２およびＦ１双方においてゼロを満たし、Ｆ２におけ るシフトしたガウスおよびＦ１における余弦ベル（ＮＯＥＳＹおよびＴＯＣＳＹ ）またはＦ２における３０°シフトした正弦ベルおよびＦ１におけるシフトした ガウス（ＤＱＦ−ＣＯＳＹ）でアポダイズ(apodize)した。 Ｗａｔｅｒ−ｓＬＥＤ実験(Altieriら、1995)はｐＨ５．０の５０ｍＭリン酸 ナトリウムを含む９９．９％Ｄ２Ｏ中、１．５ｍＭ、４００μＭおよび１００μ Ｍにて２５℃で実行した。軸方向勾配場強度は３．２６ないし５３．１Ｇ／ｃｍ で変化し、５０ミリ秒の拡散時間を使用した。スペクトルは２Ｈｚ直線ブロード ニングおよび芳香族の積分で処理し、高場脂肪族プロトンを計算し、共鳴増幅を 勾配強度に関連付ける方程式にフィットさせて、拡散係数を抽出した（Altieri ら、1995）。拡散係数は、各々、１．５ｍＭ、４００μＭおよび１００μＭにお いて１．４８×１０^-7、１．６２×１０^-7および１．７３×１０^-7cm²／ｓであ った。亜鉛フィンガーモノマー対照についての拡散定数は１．７２×１０^-7cm² ／ｓ であり、蛋白質Ｇｂ１については１．４９×１０^-7cm²／ｓであった。 全ての明瞭な配列および中程度−範囲ＮＯＥを図９Ａに示す。Ｈα−ＨＮおよ び／またはＨＮ−ＨＮ ＮＯＥはＲ６−１７およびＫ１６−Ｅ１７（共に、縮重 ＨＮ化学シフトを有する）、および縮重Ｈα化学シフトを有するＰ２−Ｙ３を除 いて、残基の全ての対について見いだされた。しかしながら、ＮＯＥが、逐次Ｈ ｐｄａ８ｄの構造は共有結合構造が豊富でない３５４ＮＯＥ拘束（残基当たり １２．６拘束）を用いて決定された。３２構造のアンサンブル（データは示さず ）は、混成距離幾何学でシミュレートしたアニーリングのための標準的プロトコ ルにて、Ｘ−ＰＬＯＲ（Brunger，1992）を用いて得られた。該アンサンブルに おける構造は良好な共有結合幾何学を有し、０．３Åを超えるＮＯＥ拘束侵害は なかった。表５に示すごとく、骨格は、無秩序末端（残基１、２、２７および２ ８）を排除した場合、０．５５Åの平均からの根平均二乗（ｒｍｓ）偏差でよく 規定された。骨格（３−２６）＋埋もれた側鎖（残基３、５、７、１２、２１、 ２２および２５）のためのｒｍｓ偏差は１．０５Åであった。 表５ ｐｄａ８ｄのＮＭＲ構造決定：距離拘束、構造拘束、原子の根平均二乗（ ｒｍｓ）偏差、およびデザイン標的との比較。＜ＳＡ＞は３２のシミュレートし たアニーリング構造であり、ＳＡは平均構造であり、ＳＤは標準偏差である。デ ザイン標的はＺｉｆ２６８の骨格である。*原子ｒｍｓ偏差は、包括的に、残基３ないし２６である。末端、残基１、２、 ２７および２８は高度に乱れ、非逐次または非残基内接触は非常に少なかった。 ｐｄａ８ｄのＮＭＲ解決構造は、それが、デザイン標的にマッチするよく規定 された二次構造要素および三次組織化を持つｂｂａモチーフへ折り畳まれること を示す。ｐｄａ８ｄ解決構造に対するデザイン鋳型、Ｚｉｆ２６８の第２亜鉛フ ィンガーの骨格に対する直接的比較は、それらの類似性を強調する（データは示 さず）。デザイン標的に対するｐｄａ８ｄ骨格の整列は優れており、原子ｒｍｓ 偏差は１．０４Åである（表５）。ｐｄａ８ｄおよびデザイン標的は、二次構造 要素を結合させるターンを含めた、それらの全構造を通して対応する。 結論において、ｐｄａ８ｄの実験的特徴付けは、それが折り畳まれ、よく秩序 だっており、弱く協働する熱転移であり、およびその構造がデザイン標的に対す るすぐれたマッチであることを示す。我々の知識では、ｐｄａ８ｄは、金属結合 、オリゴマー化またはジスルフィド結合形成なくしてユニークな構造に折り畳ま れる天然に生じるアミノ酸の最も短い配列である(McKnightら、Nature Struc．B iol．4:180(1996))。ｐｄａ８ｄの成功したデザインは、蛋白質デザインのため の目的的定量的配列選択アルゴリズムの使用を支持する。この粗野性は、当該プ ログラムがドオノボ（de novo）骨格についての配列をデザインするのに使用で きることを示唆する。 実施例４ コア領域におけるスケーリングしたファンデルワールス スコアリング機能を用いる蛋白質のデザイン コアパッキングを実験するための理想的なモデル系はストレプトコッカス蛋白 質Ｇ（Ｇβ１）のβ１免疫グロブリン−結合ドメインである(Gronenbornら、Sci ence 253:657(1991);Alexanderら、Biochem．31:3597(1992);Barchiら、Protein Sci．3:15(1994);Gallagherら、1994;Kuszewskiら、1994;Orbanら、1995)。そ の小さいサイズ５６残基は計算および実験を取り扱いやすくする。恐らくは、コ アパッキング研究で最も臨界的なものは、Ｇβ１がジスルフィド結合を含まず、 折り畳みに対して共因子または金属イオンを必要としないことである。さらに、 Ｇβ１はシート、ラセンおよびターン構造を含み、コイルドコイルまたはいくつ かのラセン束で見いだされる反復側鎖パッキングパターンがないことである。周 期性のこの欠如は特定の二次または三次構造からの偏りを減少させ、パッキング 効果を調べるために目的的側鎖選択プログラムの使用を必要とする。 コアを構成する配列位置は、Ｇβ１の側鎖溶媒接近可能表面領域を調べること によって選択した。その表面の１０％未満のいずれかの側鎖露出は埋もれたとみ なした。１１の残基がこの基準に適合し、７つはβシートからのものであり（位 置３、５、７、２０、４３、５２および５４）、３つはラセンからのものであり （位置２６、３０および３４）、および１つは不規則二次構造からのものである （位置３９）。これらの位置は連続的コアを形成する。全ての他の側鎖および骨 格を含めた、蛋白質構造の残りは、１１のコア位置における配列選択計算のため の鋳型として用いた。 アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシンま たはトリプトファン（Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、ＹまたはＷ）よりなる全ての可能な コア配列を考慮した。我々のロタマーライブラリーはDesmetおよび共同研究者に よって使用されたものと同様であった（Desmetら、（1992）(前掲)）。全ての１ １位置における２１７の可能な疎水性ロタマーを持つＧｂ１のコアの配列を最適 化する結果、２１７¹¹または５×１０²⁵のロタマー配列が得られる。我々のスコ アリング機能は２つの成分：ファンデルワールスエネルギー項および疎水性表面 積の埋もれを好都合とする原子溶媒和項よりなるものであった。シミュレーショ ンにおける全ての原子のファンデルワールス半径は因子αを掛けて（方程式３） パッキング効果の重要性を変化させた。半径は埋もれた表面積計算では掛けなか った。種々の半径スケーリングでコア配列を予測し、次いで、得られた蛋白質を 実験的に特徴付けることによって、蛋白質デザインに対するパッキング効果の重 要性の厳格な研究が可能である。 Ｇβ１、ＰＤＢ記録１ｐｇａの骨格座標上に蛋白質構造を作成した(Bernstein ら、前掲;Gallagherら、1994)。最適化されていない全ての側鎖の原子をそれら の結晶学的に決定された位置に残した。プログラムＢＩＯＧＲＡＦ(Molecular S imulations Incorporated，San Diego，CA)を用いて、構造上に明示的水素を生 成させ、次いで、ドライディング力場を用い、５０工程のためにこれをコンジュ ゲート勾配最小化した(Mayoら、1990，前掲)。ロタマーライブラリー、ＤＥＥ最 適化およびモンテカルロサーチは前記で概説した通りであった。Lennard-Jones １２−６ポテンシャルをファンデルワールス相互作用で用い、原子半径は本明細 書に記載したごとくに種々の場合にスケーリングした。溶媒接近可能表面積のRi chards定義(LeeおよびRichards，前掲)を用い、Connollyアルゴリズム(Conolly ，（1983）(前掲))で計算した。２３ｃａｌ／モル／Ųの、我々の以前の仕事か ら得られた原子溶媒和パラメーターを用いて、疎水性埋もれを好 都合とし、溶媒暴露にペナルティーを課した。我々の最適化仕事における側鎖非 極性露出を計算するために、我々はまずロタマーによって露出された全疎水性領 域を単離において考慮する。この露出はロタマー／鋳型接触で埋もれた領域、お よび対のロタマー／ロタマー接触で埋もれた領域の合計によって減少する。 半径スケーリング因子αの種々の値についての全体最適配列は、デッドエンド 排除理論を用いて見いだされた（表６）。最適配列およびそれらの対応する蛋白 質は、それらのデザインで使用された半径スケール因子によって命名される。例 えば、α＝０．９０の半径スケール因子で命名された配列はα９０と呼ばれる。 表６ Ｇβ１配列 表６において、Ｇβ１配列および位置番号は頂部で示される。ｖｏｌはＧβ１ 配列に対するコア側鎖容量である。垂直棒線はＧβ１配列との同一性を示す。 α１００はα＝１．０で命名され、よって、立体効果の十分な取り込みのため のベースラインとして働く。たとえ天然に生じる配列についての情報が側鎖選択 アルゴリズムで使用されなかったとしても、α１００配列はＧｂ１のコア配列に 非常に似ている（表６）。０．９０ないし１．０５のαの変動は最適配列の変化 をほとんど引き起こさず、これは従たるパラメーターの摂動に対するアルゴリズ ムの粗野性を示す。さらに、α＝０．９０−１．０５で予測されたパッキング配 置は、結晶構造から４°のみ平均χ角が相違してＧβ１に密接にマッチする。Ｇ β１に対する高い同一性および立体配座同様性は、パッキング拘束が使用された 場合、骨格立体配座がよくパッキングされたコアデザインの単一ファミリーを強 く決定する。それにも拘わらず、コアパッキングに対する拘束は、他の低いエネ ルギー配列のためのモンテカルロサーチによって示されるごとくαによって変調 されつつある。いくつかの別の配列およびパッキング配置は、α＝０．９０であ る場合、モンテカルロ手法によって見いだされた２０の最良配列にある。これら の別の配列はα＝０．９５である場合、悪くスコアリングされ、α＝１．０また は１．０５である場合、厳格に保存的なパッキング幾何学のみが低いエネルギー を有する。従って、α＝１．０５およびα＝０．９０は、パッキング特異性が配 列デザインを支配する範囲の、各々、高および低末端を規定する。 α＜０．９０については、パッキングの役割は、疎水性表面ポテンシセルが支 配を始めるのに十分な位低下し、それにより、コアに選択された残基のサイズを 減少させる（表６）。最適配列における有意な変化は、ａ＝０．９０および０． ８５の間で出現し、ａ８５およびａ８０は共にａ９０に対して３つのさらなる突 然変異を含む。また、ａ８５およびａ８０はＧｂ１にたいして全側鎖容量の１５ ％増加を有する。０．８０未満に降下するにつれて、側鎖容量はさらに１０％増 加し、多数の突然変異が起こり、これはパッキング拘束が非極性表面を埋もれさ せる駆動によって圧倒させることを示す。容量におけるジャンプおよびパッキン グ配置におけるシフトは最適配列では突然に起こるようであるが、モンテカルロ サンプリングによる最適化エネルギー配列の調査は、変化は突然ではないこと を証明する。例えば、α＝０．９０である場合、ａ８５最適配列は１１番目の最 良の配列であり、α＝０．８５である場合、ａ９０最適配列は９番目の最良配列 である。 ａ＞１．０５では、原子ファンデルワールス反発が余りにもひどくて、ほとん どのアミノ酸はいずれかの許容されたパッキング配置を見いだすことができず、 その結果、多くの蛋白質につきアラニンが選択される。この厳格性は大きな原子 半径の人工物のようであり、増大したパッキング特異性を正確には反映しない。 むしろ、ａ＝１．０５は我々のモデリング仕事内のファンデルワールススケール の使用できない範囲についての上方限界である。 コアデザインの実験的特徴付け。ファンデルワールススケール因子ａの変動の 結果、パッキング特異性の４つの方法がもたらされる：方法１、ここでは０．９ ≦α≦１．０５であって、パッキング拘束は配列選択を支配し；方法２、ここで は、０．８≦α＜０．９であって、疎水性溶媒和ポテンシャルはパッキング力と 競合し始める；方法３、ここではα＜０．８であって疎水性溶媒和がデザインを 支配し；方法４、ここではα＞１．０５であって、ファンデルワールス反発は余 りにもひどくて意味のある配列選択ができない。最適デザインである配列は合成 および特徴付けのための方法の各々から選択した。それらは、方法１からのα９ ０、方法２からのα８５、方法３からのα７０、および方法４からのα１０７で ある。これらの配列の各々につき、１１のコア位置の計算されたアミノ酸同一性 が表６に示される；蛋白質配列の残りはＧβ１にマッチする。目標は、コアデザ インで使用されるパッキング特異性の程度および得られた蛋白質における天然様 特徴の程度の間の関係を研究することであった。 ペプチド合成および精製。配列選択アルゴリズムによってデザインされた１１ のコア位置を例外として、合成された配列はProtein Data Bankエントリー１ｐ ｇａにマッチする。標準的なＦｍｏｃ化学を用いてペプチドを合成し、逆相ＨＰ ＬＣによって精製した。マトリックス助力レーザー脱着質量分析は全ての分子量 が予測された質量の１単位内にあることを見いだした。 ＣＤおよび蛍光スペクトロスコピーおよびサイズ排除クロマトグラフィー。全 ての実験についての溶液条件は、特記しない限り、ｐＨ５．５および２５℃にお ける５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液であった。円二色性スペクトルは、熱電対 を備えたＡｖｉｖ６２ＤＳスペクトロメーターで獲得した。ペプチド濃度はほぼ ２０μＭであった。熱溶融は１２０秒の平衡時間で２°の増分を用いて２１８ｎ ｍでモニターした。T_mは融解曲線の微分の極大として定義される。各蛋白質の可 逆性は、加熱の前後からの室温ＣＤスペクトルを比較することによって確認した 。公表されている方法に従って塩化グアニジニウム変性を測定する（Pace，Meth ods Enzymol．131:266（1986））。蛋白質濃度はＵＶ分光によって測定した。蛍 光実験は１ｃｍ路長セル中で日立Ｆ−４５００で行った。ペプチドおよびＡＮＳ 濃度は５０μＭであった。励起波長は３７０ｎｍであり、発光は４００ないし６ ００ｎｍでモニターした。サイズ排除クロマトグラフィーは、０℃にて、５０ｍ Ｍリン酸ナトリウム中、ｐＨ５．５でPo1yLC ヒドロキシエチルＡカラムで行っ た。リボヌクレアーゼＡ、カルボニックアンヒドラーゼおよびＧβ１を分子量標 準として使用した。分離の間のペプチド濃度は、２７５ｎｍでモニターしたピー ク高さから見積もって〜１５μＭであった。 核磁気共鳴スペクトロスコピー。試料はｐＨ５．５の90/10H₂O/D₂Oおよび５０ ｍＭリン酸緩衝液中で調製した。スペクトルは２５℃においてVarian Unityplus ６００ＭＨｚスペクトロメーターで獲得した。限定された溶解度（１００μＭ ）を有するα７０を除き、試料はほぼ１ｍＭであった。水素交換実験では、ＮＭ Ｒ試料を調製し、ｐＨを５．５に調整し、スペクトルは未交換参照として働かせ るために獲得した。この試料を凍結乾燥し、D₂O中で復元し、スペクトルの反復 獲得をスペクトル当たり７５秒の速度で直ちに開始した。データ獲得は〜２０時 間継続し、次いで、試料を３分間で９９℃まで加熱して、全てのプロトンを十分 に交換した。２５℃まで冷却した後、最終スペクトルを獲得して、十分交換され た参照として供した。全ての交換可能なアミドピークの面積は非交換脂肪族ピー クのセットによって正規化した。同位体効果については修正していないｐＨ値は 、データ獲得後に全ての試料について測定し、時間軸はｐＨにおける微小差異に つき修正するように正規化した（Rohlら、Biochem．31:1263(1992)）。 α９０およびα８５はＧｂ１と非常に似た楕円率およびスペクトルを有し（示 さず）、これは、これらの二次構造含有量がＧｂ１のそれと匹敵することを示唆 する（図１０）。逆に、α７０はかなり弱い楕円率および乱れたスペクトルを有 し、これは、Ｇｂ１に対する二次構造の喪失を意味する。α１０７はランダムコ イルに特徴的なスペクトルを有する。ＣＤによってモニターした熱溶融を図１０ Ｂに示す。α８５およびα９０は共に、各々、８３℃および９２℃の溶融温度（ T_m）にて協働的転移を有する。α１０７は熱転移、すなわち、十分に折り畳みが 解除されたポリペプチドから予測される挙動を示さず、α７０は、部分的に折り 畳まれた構造に特徴的な、〜４０℃で生じるブロードで狭い転移を有する。８７ ℃のT_mを有するＧｂ１に対して（Alexanderら、前掲）、α８５はわずかに熱安 定性が低く、α９０はより安定である。２５℃における折り畳み解除の自由エネ ルギー（ΔG_u）の化学変性測定はT_mにおける傾向にマッチする。 α９０はＧβ１で報告されたもの（Alexanderら、前掲）よりも大きなΔG_uを 有し、他方、α８５はわずかに安定性が低い。α７０およびα１０７は認識可能 な転移を欠如するゆえに、それらにつきΔG_uを測定することは可能ではなかった 。 各蛋白質のプロトンＮＭＲスペクトルにおける化学シフト分散の程度を評価し て、天然−様特徴の各蛋白質の程度を判断した（データは示さず）。α９０は高 度に分散したスペクトル（よく配向した天然蛋白質のホールマーク）を保有する 。α８５はα９０に対して幾分ブロードとなった化学シフト分散およびピークを 減少し、これは、それにも拘わらず区別される折り畳みを維持する中程度に動き 得る構造を示唆する。α７０のＮＭＲスペクトルはほとんど分散を有しなかった 。ブロードなピークは崩壊したが秩序を乱しかつ動揺する構造の指標である。α １０７は鋭い直線を持つスペクトルを有するが分散を有さず、これは折り畳み解 除された蛋白質の指標である。 アミド水素交換速度論は、プロトンＮＭＲスペクトルの調査から到達した結論 と合致する。デザインした蛋白質の各々についての時間の関数としての未交換ア ミドプロトンの平均数を測定するのは、以下の結果となる（データは示さず）： α９０はｐＨ５．５および２５℃における交換の２０時間にわたり〜１３プロト ンを保護する。α９０交換曲線はＧβ１のものから区別できない（示さず）。ま た、α８５はアミドプロトンのよく保護されたセット（秩序だった天然様蛋白質 の区別される特徴）を維持する。しかしながら、保護されたプロトンの数はα９ ０の約半分に過ぎない。相違はα８５構造のいくつかの部分におけるより高い柔 軟性によるようである。対照的に、α７０およびα１０７は実験の３分の死時間 内に十分に交換され、これは高度に動的な構造を示す。 近紫外線ＣＤスペクトルおよび８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸（Ａ ＮＳ）結合を用いて、蛋白質の構造秩序立てを評価した。α８５およびα９０の 近紫外線スペクトルは、ユニークな三次構造に固定された芳香族残基を持つ蛋白 質で予測されるように強いピークを有し、他方、α７０およびα１０７は、非天 然の崩壊した状態または折り畳み解除された蛋白質のごとき、動的芳香族残基を 持つ蛋白質の指標である特徴的スペクトルを有する。ＡＮＳ発光スペクトルの３ 倍の強度増加および青色シフトによって示されるごとく、α７０はＡＮＳに結合 する。この強い結合は、α７０が、ＡＮＳに接近可能な疎水性残基のゆるくパッ キングされたまたは部分的に露出されたクラスターを保有することを示唆する。 ＡＮＳは、いくつかの天然蛋白質で観察される会合と同様に、α８５に弱く結合 し、発光強度は２５％増加するに過ぎない（Semisotnovら、Biopolymers 31:119 （1991））。α９０およびα１０７はＡＮＳ蛍光において変化を引き起こさない 。蛋白質の全てはサイズ排除クロマトグラフィーの間モノマーとして移動した。 要約すると、α９０は全ての基準によるとよくパッキングされた天然様蛋白質 であり、それは、恐らくは、増大した疎水性表面埋もれのために、天然に生じる Ｇｂ１配列よりも安定である。また、α８５は、そのＮＭＲスペクトルおよび水 素交換挙動によって示されるごとく、α９０よりも大きな移動柔軟性を持つにも 拘わらず、安定で、秩序だった蛋白質である。α７０は無秩序の崩壊した球状蛋 白質の特徴の全てを有する：非協働的熱転移、ＮＭＲスペクトル分散またはアミ ドプロトン保護無し、減少した二次構造含有量および強いＡＮＳ結合。α１０７ は、恐らくはコアを一緒に保持する大きな疎水性残基の欠如のため、完全に折り 畳み解除された鎖である。明瞭な傾向は、αが０．９０未満に減少するにつれて の蛋白質秩序の喪失である。 蛋白質デザインについての異なるパッキング方法を実験データに徴して評価す ることができる。方法１においては、０．９≦α≦１．０５であり、該デザイン はよく秩序立った蛋白質の結果となるパッキング特異性によって支配されている 。 方法２においては、０．８≦α＜０．９であり、パッキング力は、疎水性力がよ り大きな残基をコアに駆動させるのに十分な位弱くなっており、これは、幾分増 大した構造の動きを持つ安定なよくパッキングされた蛋白質を生じる。方法３に おいては、α＜０．８であり、パッキング力は疎水性力が支配する程度まで低下 しており、その結果、安定なコアパッキングを持たない動揺する、部分的に折り 畳まれた構造が得られる。方法４において、α＞１．０５であり、パッキング特 異性を実行するのに使用される立体力が余りにも高くスケーリングされていて、 合理的な配列選択ができず、よって、折り畳み解除された蛋白質を生じる。これ らの結果は、効果的な蛋白質デザインがパッキング効果の考慮を有することを示 す。蛋白質デザインアルゴリズムの意味内で、我々は、成功したデザインに必要 なパッキング力の範囲を定量的に規定した。また、我々は、低下した特異性を用 いて、別のパッキングを持つ蛋白質コアをデザインできることを証明した。 減少したパッキング拘束の利点を利用するために、蛋白質コアは、その結果依 然として構造的に秩序立った蛋白質となる最小のαでデザインされるべきである 。方法２からの最適蛋白質配列α８５は安定であってよくパッキングされており 、これは、良好な範囲として０．８≦α＜０．９を示唆する。しかしながら、Ｎ ＭＲスペクトルおよび水素交換速度論は、α８５がα９０程は構造的に秩序立っ ていないことを明瞭に示す。α８５およびα９０におけるＷ４３のための我々の プログラムによって予測されるパッキング配置は可能な説明を提示する。α９０ については、Ｗ４３はＧβ１の結晶構造におけると同一の立体配座を持つコアに パッキングされることが予測される。α８５においては、α９０におけるアラニ ンおよびバリンと比較して、位置３４および５４、各々、ロイシンおよびフェニ ルアラニンにおける大きな側鎖がＷ４３をしてα９０における１９Ųと比較し て非極性表面の９１Ųを露出させる。この露出を駆動する疎水性力はＷ４３を 埋もれさせる別の立体配座を安定化させるようであり、それにより、α８５の立 体配座柔軟性に寄与し得る（Dill，1985;Onuchiら、1966）。他のコア位置とは 対照的に、位置４３における残基は、側鎖立体配座に応じて、ほとんど露出され 、またはほとんど埋もれる。我々は、この特徴を持つ位置を境界位置と命名し、 これは、蛋白質のコアとまたは溶媒と強く相互作用するそれらのポリペプチドの た め、蛋白質デザインについての困難な問題を持ち出す。 疎水性表面領域の露出にペナルティーを課すスコアリング機能は、境界残基の デザインで助力するかも知れない。Dillおよび共同研究者は露出ペナルティーを 用いて、理論的研究において蛋白質デザインを改良した(Sunら、Protein Eng．8 (12)1205-1213(1995))。 非極性露出ペナルティーは、コアに大きな側鎖を埋めるか、または露出された アミノ酸をより小さいまたはより極性のものと置換するパッキング配置に好都合 であろう。我々は、我々の最適化仕事において側鎖非極性露出ペナルティーを実 施し、疎水性埋もれパラメーターと同程度の大きさのペナルティング溶媒和パラ メーターを使用した。 我々のスコアリング機能に疎水性表面露出ペナルティーを付加する結果を表７ に示す。 表７ α＝0.85 表７は、露出ペナルティーなくしてα＝０．８５を用いるコア位置についての １５の最良配列を示す。A_npはŲで表した露出された非極性表面積である。 α＝０．８５である場合、非極性露出ペナルティーは低エネルギー配列の秩序 を劇的に変える。α８５配列、前者の基底状態は、７番目に降下し、１５の最良 の配列露出の残りは疎水性領域をほとんど露出させない。何故ならば、それらは α９０におけると同様の立体配座にＷ４３を埋もれさせるからである（モデルは 示さず）。例外は８番目および１４番目の配列であり、これは、Ｗ４３をイソロ イシンで置き換えることによって露出された境界残基のサイズを低下させ、また 、１３番目の最良配列であり、これはＷ４３をバリンで置き換える。新しい基底 状態配列は、単一のバリンからイソロイシンへの突然変異を持ち、α９０に非常 に似ており、α９０の安定性および構造的突如を有するはずである。対照的に、 α＝０．９０である場合、最適配列は変化せず、モンテカルロサンプリングによ って見出された次の１４の最良配列はほとんど変化しない。この小さい効果は驚 くべきことではない。というのは、α＝０．９０では立体力が依然として支配し ており、これらの構造のほとんどは表面領域をほとんど露出させないからである 。Ｗ４３を埋もれさせるのは、コアにおける配列選択を幾分制限するが、α＝０ ．８５につき減少したパッキング力はα０．９０よりも配列多様性を依然として 生じる。露出ペナルティーは、コアの境界が破壊された場合に生じる正味の過剰 パッキングおよび溶媒暴露を制限することによって、減少したパッキング特異性 の使用を補足する。この拘束を付加することは、より低いパッキング力が蛋白質 デザインで使用されることを可能とし、その結果、より広い範囲の高いスコアリ ング配列ならびに固定された骨格および区別されるロタマーからの低下した偏り がもたらされる。 境界位置におけるより小さい残基を置換する効果を調べるために、我々は、露 出ペナルティーでのα＝０．８５最適化の１３番目の最良配列を合成し、特徴付 けた（表８）。 表８ α＝0.85露出ペナルティー 表８は露出ペナルティーにてα＝０．８５を用いてＧβ１のコア位置の１５の 最良配列を示す。A_npはŲで表した露出された非極性表面積である。 この配列α８５Ｗ４３ＶはＷ４３をバリンで置き換えるが、そうでなければα ８５と同一である。また、８番目および１４番目の配列は位置４３におけるより 小さな側鎖を有するが、α８５に対するそれらの配列のさらなる変化が境界位置 変化の効果の解釈を複雑にするであろう。また、α８５Ｗ４３Ｖは、１１位置の うち７つが改変され、Ｇβ１と比較して有意に異なるパッキング配置を有するが 、側鎖容量は８％増加に過ぎない。よって、α８５Ｗ４３Ｖは異なるがほとんど 容量が保存されるコアに対するこの折り畳みの許容性のテストである。α８５Ｗ ４３Ｖの遠紫外線ＣＤスペクトルはＧβ１のそれと非常に似ており、２１８ｎｍ における楕円率は−１４０００度cm²／ｄモルである。α８５Ｗ４３Ｖの二次構 造含有量は天然様であるが、そのT_mは６５℃であり、α８５よりもほとんど２０ ℃低い。α８５Ｗ４３Ｖの減少した安定性とは対照的に、そのＮＭＲスペクトル はα８５よりも大きい化学シフト分散を有する（データは示さず）。アミド水素 交換速度論は２０時間後において約４つのプロトンのよく保護されたセットを示 す（データは示さず）。α８５に対するこのより速い交換は、α８５Ｗ４３Ｖの 有意に低い安定性によって説明される（Mayo & Baldwin，1993）。α８５Ｗ４３ Ｖは安定性を犠牲にして改良された構造特異性を有するようであり、これはコイ ルドコイルで以前に観察された現象である(Harburyら、1993)。露出ペナルティ ーを用いることによって、デザインアルゴリズムはより大きな天然様特性を持つ 蛋白質を生じさせた。 我々は、蛋白質デザインにおけるパッキング特異性の役割を定量的に規定し、 我々のデザインプログラムにおける立体力の役割についての現実的境界を供した 。この研究は、デザインの間にパッキング力を変化させるための目的的定量的プ ログラムの使用のため、以前の仕事とは異なっており、これは我々が我々の結論 を異なる蛋白質系に適用することを可能とした。さらに、立体力の最小の効果的 レベルを用いることによって、我々は所与の折り畳みと適合する種々のパッキン グ配置をデザインすることができた。最後に、我々は、蛋白質のコアおよび表面 の間の境界にある側鎖のデザインで困難性を認め、我々は、この問題に立ち向か う我々の配列デザインスコアリング機能において非極性表面露出ペナルティーを 実行した。 実施例５ 十分な蛋白質のデザイン 蛋白質モチーフの全アミノ酸配列は計算されている。実施例４におけるごとく 、ＤＮＡ結合蛋白質Ｚｉｆ２６８の第２亜鉛フィンガーモジュールをデザイン標 的として選択した。鋳型構造における残基位置をコア、表面または境界クラスに 割り当てるために、鋳型Ｃα原子のみを用いて計算された溶媒接近可能表面に対 して、Ｃα−Ｃβベクトルの向きを評価した。標的折り畳みのＣα原子のみにつ いての溶媒接近可能表面は、８．０Åのプローブ半径、１０Ųのドット密度、 および１．９５ÅのＣα半径にてConnollyアルゴリズムを用いて生成させた。も しそのＣα−Ｃβベクトルに沿って、そのＣαから溶媒接近可能表面への距離が ５Åより大であり、およびそのＣβから最も近い表面点までの距離が２．０Åよ り大であれば、残基はコア位置として分類された。もしそれらのＣα−Ｃβベク トルに沿ったそれらのＣαから溶媒接近可能表面までの距離＋それらのＣβから 最も近い表面点までの距離の合計が２．７Å未満であると、残りの残基は表面位 置として分類された。すべての残りの残基は境界位置として分類された。Ｚｉｆ ２６８についての分類は、位置１、１７および２３が境界クラスから表面クラス 変換された以外は計算されたものとして使用して、三次構造における鎖末端の近 接からこれらの残基への末端効果および帰属決定における不正確性を説明した。 このモチーフの小さなサイズは、コアに明瞭に割り当てることができる残基の 下図を１つ（位置５）に制限し、他方、７つの残基（位置３、７、１２、１８、 ２１、２２および２５）は境界として分類され、残りの２０の残基は表面に帰属 された。興味深いことには、Ｚｉｆ２６８の亜鉛結合位置の３つは境界またはコ アにあり、１つの残基位置８は蛋白質の幾何学的中心から離れて向いたＣα−Ｃ βベクトルを有し、表面位置として分類される。我々の以前の研究におけるごと く、配列選択の間にコア位置にあると考えられたアミノ酸はＡ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ 、ＹおよびＷであり；表面位置にあると考えられたアミノ酸はＡ、Ｓ、Ｔ、Ｈ、 Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ、ＫおよびＲであり；組み合わせたコアおよび表面アミノ酸セッ ト（１６アミノ酸）は境界位置にあると考えられた。残基位置の２つ（９および ２７）は０°を超えるφ角を有し、骨格歪みを最小化するための配列選択アルゴ リズムによってＧｌｙに設定された。 デザインアルゴリズムによって考慮されなければならないアミノ酸配列の合計 数は、各残基位置における可能なアミノ酸タイプの数の生成物である。前記した ββαモチーフ残基分類の結果、１．９×１０²⁷の実質的組合せライブラリーが 得られる（７つの可能なアミノ酸を持つ１つのコア位置、１６の可能なアミノ酸 を持つ７つの境界位置、１０の可能なアミノ酸を持つ１８の表面位置および０° より大のφ角を持ち１つの可能なアミノ酸を各々が持つ２つの位置）。各２８残 基配列についての単一分子のみからなる対応するペプチドライブラリーは１１． ６メトリックトンの質量を有するであろう。側鎖置換の幾何学的特異性を正確に 作成するために、我々は、ロタマーと呼ばれる、許容される立体配座の区別され るセットを持つ各アミノ酸を表すことによって、我々の配列スコアリングにおい てアミノ酸側鎖のトーション柔軟性を明示的に考慮する。前記したごとく、骨格 依存性ロタマーライブラリーを使用し（DunbrackおよびKarplus，前掲）、疎水 性残基のχ₁およびχ₂角を調整した。その結果、デザインアルゴリズムは各残基 位置における各可能なアミノ酸についての全てのロタマーを考慮しなければなら ない。ββαモチーフについてのサーチスペースの合計サイズは、従って、１． １×１０⁶²の可能なロタマー配列である。ββαモチーフについてのロタマー最 適化問題は最適配列を見出すのに９０ＣＰＵ時間を要した。 図１１に示された最適配列はFull Sequence Design-1（ＦＳＤ−１）と呼ばれ る。たとえ親水性アミノ酸の全てが境界位置の各々で考慮されても、該アルゴリ ズムは非極性アミノ酸のみを選択した。８つのコアおよび境界位置はよくパッキ ングされた埋もれたクラスターを形成すると予測された。Ｚｉｆ２６８の亜鉛結 合Ｈｉｓ位置、位置２１および２５におけるアルゴリズムによって選択されたＰ ｈｅ側鎖は８０％以上埋もれており、位置５におけるＡｌａは１００％埋もれて おり、他方、位置８におけるＬｙｓは６０％を超えて溶媒に暴露されている。他 の境界位置は、Ｚｉｆ２６８のそれと同様の配置に同様の側鎖をパッキングする ことによって、埋もれた残基に対する強力な立体的拘束を証明した。コアおよび 境界残基についての計算された最適立体配座は非極性表面積を〜１１５０Ų埋 もれさせた。ラセン表面については、水素結合を持つラセンＮ−キャップとして のＡｓｎ１４を、その側鎖カルボニル酸素および残基１６の骨格アミドプロトン の間に位置させる。ラセン上の８つの荷電した残基は水素結合の３対を形成する が、我々のコイルドコイルデザインにおいては、ラセン表面水素結合は配列の総 じてのラセン特性よりも重要ではないようである（Dahiyatら、Science（1997） 。露出されたシート表面上の位置４および１１はＴｈｒ（最良のβ−シート形成 性残基のうちの１つ）であるように選択された（Kimら、1993）。 図１１はＦＳＤ−１およびＺｉｆ２６８についての配列の整列を示す。２８残 基のうち６のみ（２１％）が同一であって、１１のみ（３９％）が同様である。 同一のうち４つが埋もれたクラスターにあり、これは、埋もれた残基は所与のモ チーフにつての溶媒暴露残基よりも保存されているという例外と合致する（Bowi eら、Science 247:1306-1310（1990））。National Center for Biotechnology Informationの非豊富蛋白質配列データベースに対するＦＳＤ−１配列のＢＬＡ ＳＴ（Altschulら、前掲）サーチは、いずれの亜鉛フィンガー蛋白質配列も見出 さなかった。さらに、該ＢＬＡＳＴサーチは種々の関係しない蛋白質の断片に対 する弱い統計学的有意性の低い同一性マッチを見出したに過ぎなかった。最高の 同一性マッチは１０残基（３６％）であり、ｐ値は０．６３〜１．０の範囲であ る。前記したββα位置分類で許容されたアミノ酸よりなるランダムな２８残基 配列は同様のＢＬＡＳＴサーチ結果を生じ、１０または１１の残基同一性であり （３６〜３９％）、ｐ値は０．３５〜１．０の範囲であり、さらに、ＦＳＤ−１ で見出されたマッチは統計学的に有意であることを示唆する。いずれかの公知の 蛋白質配列に対する非常に低い同一性はＦＳＤ−１の新規性を証明し、いずれか の蛋白質モチーフからの配列情報は我々の配列スコアリング機能でされなかった ことを過小スコアリングする。 計算された配列の粗野性を調べるために、ＦＳＤ−１の配列をモンテカルロシ ミュレートしたアニーリング実行の出発点として使用した。モンテカルロサーチ は、最適解決の隣において高スコアリング最適下配列を見出す（Dahiyatら（199 6）（前掲））。１０００番目の最も安定な配列への基底状態解決からのエネル ギー拡大は約５ｋｃａｌ／モルであり、状態の密度が高いことを示す。位置７を 例外として、分子のコアを含むアミノ酸は実質的に非変異体である（図１１）。 ほとんど全ての配列変異は表面位置で起こり、典型的には、保存的変化を含む。 ラセンＮ−キャップを形成すると予測されるＡｓｎ１４は、最も保存され た表面位置の内にある。分子の臨界的領域で観察された強力な配列保存は、もし 代表的な配列がデザイン標的構造に折り畳まれたならば、恐らくは、その変異が 臨界的相互作用を破壊しない数千の配列が同等の能力であり得ることを示唆する 。たとえ１０億の配列が成功して標的折り畳みを達成しても、それらは10²⁷の可 能な配列の極めて僅かな部分を表すに過ぎない。 実験的有効化。ＦＳＤ−１を合成してその構造を特徴付け、デザインアルゴリ ズムの効率を評価した。ＦＳＤ−１の遠紫外線円二色性（ＣＤ）スペクトルは２ ２０ｎｍおよび２０７ｎｍで極小を示し、これは折り畳まれた構造の指標である （データは示さず）。熱融解は弱く協働的であり、３９℃に屈曲点であり、完全 に可逆的である（データは示さず）。ブロードな融解は、小さな疎水性コアを持 つモチーフで予測される折り畳みの低エントロピーに合致する。この挙動は他の 折り畳まれた短いペプチドで観察された非協働的熱折り畳み解除転移とは対照的 である（Scholtzら、1991）。ＦＳＤ−１は高度に可溶性であり（３ｍＭより大 ）、１００μＭ、５００μＭおよび１ｍＭにおける平衡沈降研究は蛋白質がモノ マーであることを示す。沈降データは単一種（１ｍＭで３６３０の分子量を持つ モノマーモデル）によくフィットし、３４８８の計算されたモノマー質量と良好 に一致する。また、遠紫外線スペクトルは５０μＭないし２ｍＭで濃度依存性を 示さず、１００μＭおよび２ｍＭで採られた核磁気共鳴（ＮＭＲ）ＣＯＳＹスペ クトルは実質的に同一であった。 ＦＳＤ−１の解決構造は、等核2D ¹H ＮＭＲスペクトロスコピーを用いて解 かれた（Piantiniら、1982）。ＮＭＲスペクトルはよく分散し、秩序立った蛋白 質構造および容易な共鳴帰属決定を示す。プロトン化学シフト帰属決定は、標準 的に等核方法で決定された（Wuthrich，1986）。明瞭な順次の短い範囲のＮＯＥ は、デザイン標的と合致する残基１５ないし２６のラセン二次構造を示す。 ＦＳＤ−１の構造は、アミドプロトンをゆっくりと交換することに関与する２ ７４のＮＯＥ距離拘束および１０の水素結合拘束を含めた共有結合構造が豊富で ない２８４の実験的拘束（残基当たり１０．１の拘束）を用いて決定した。構造 計算は、混成距離幾何学でシミュレートしたアニーリング(Nilgesら、FEBS Lett ．229:317(1988))用の標準的プロトコルでのＸ−ＰＬＯＲ（Brunger， 1992）を用いて実行した。４１構造のアンサンブルは良好な共有結合幾何学をも って、０．３Åより大の距離拘束侵害なくして収束した（表９）。 表９ ＮＭＲ構造決定：距離拘束、構造拘束および原子根平均二乗（ｒｍｓ）偏 差。＜ＳＡ＞は４１のシミュレートしたアニーリング構造である。ＳＡはエネル ギー最小化前の平均構造であり、（ＳＡ）ｒは拘束されたエネルギー最小化平均 構造であり、ＳＤは標準偏差である。 *原子ｒｍｓ偏差は、包括的に、残基３ないし２６のためである。残基１、２、 ２７および２８は乱雑化され（φ、ψ角秩序パラメーター（３４）＜０．７８） 、逐次および ｜i-j｜＝２のＮＯＥを有するに過ぎなかった。^†非極性側鎖は残基３、５、７ 、１２、１８、２１、２２および２５からのものであり、これは蛋白質のコアを 形 成する。 ＦＳＤ−１の骨格は０．５４Åの平均からの根平均二乗（ｒｍｓ）でよく規定 される（残基３〜２６）。骨格に加えて埋もれた側鎖（残基３、５、７、１２、 １８、２１、２２および２５）を考慮すると、０．９９Åのｒｍｓが与えられ、 これは分子のコアがよく秩序だっていることを示す。構造のアンサンブルの立体 化学的性質をＰＲＯＣＨＥＣＫ（Laskowskiら、J．Appl．Crystallogr．26:283 （1993））を用いて調べた。無秩序末端およびグリシン残基を含めないと、残基 の８７％が最も好都合の領域に入り、残りはφ、ψスペースの許容された領域に 入る。中程度の不均一性が、＜Ｓ＞＝０．９８±０．０２を持つ第２鎖（残基９ 〜１２）および＜Ｓ＞＝０．９９±０．０１を持つラセン（残基１５〜２６）と 比較して＜Ｓ＞＝０．９６±０．０４の平均骨格角度秩序パラメーター（Hybert sら、1992）を有する第１鎖（残基３〜６）に存在する。総じて、ＦＳＤ−１は 顕著によく秩序だっており、我々の知識では、金属結合、オリゴマー化またはジ スルフィド結合形成(McKnightら、1997)なくしてユニークな構造に折り畳まれる 天然に生じるアミノ酸より実質的により最も短い配列である。 ＦＳＤ−１のＮＭＲ構造アンサンブルの疎水性コアのパッキングパターン（Ｔ ｙｒ３、Ｉｌｅ７、Ｐｈｅ１２、Ｌｅｕ１８、Ｐｈｅ２１、Ｉｌｅ２２、および Ｐｈｅ２５）は計算されたパッキング配置と同様である。７つの残基のうちの５ つはデザイン標的としての同一のゴーシュ⁺、ゴーシュ^-またはトランス範疇にあ るχ1角を有し、３つの残基はχ₁およびχ₂角にマッチする。それらの計算され たχ₁角にマッチしない２つの残基はＩｌｅ７およびＰｈｅ２５であり、これは 分子の拘束が低い開放された末端のそれらの位置と合致する。Ａｌａ５はその予 測される高価なパッキング相互作用に関与せず、替わりに、デザイン鋳型に対し て鎖１骨格の置換のためその表面の約４５％を露出する。逆に、Ｌｙｓ８はその 溶媒暴露（６０％）にてアルゴリズムによって予測されるように挙動し、χ₁お よびχ₂角は計算された構造にマッチする。溶媒暴露残基のほとんどは無秩序で あり、これは予測される表面残基水素結合の調査を排除する。しかしながら、Ａ ｓｎ１４は予測されるごとくその側鎖カルボニル酸素からラセンＮ−キャップを 形成するが、デザインから予測されるようにＧｌｕ１７のアミドに対してであり 、Ｌｙｓ１６に対してではない。この水素結合は構造アンサンブルの９５％に存 在し、２．６±０．０６Åのドナーアクセプター距離を有する。一般に、ＦＳＤ −１の側鎖はデザインプログラムの予測によく対応する。 ＦＳＤ−１の平均拘束化最小化構造およびデザイン標的の比較を行った（デー タは示さず）。デザイン標的からのＦＳＤ−１の総じての骨格ｒｍｓ偏差は残基 ３〜２６につき１．９８Åであり、残基８〜２６については０．９８Åに過ぎな い（表１０）。 表１０ ＦＳＤ−１の実験的に決定された構造およびデザイン標的構造の比較。 ＦＳＤ−１構造はＮＭＲ構造決定からの拘束されたエネルギー最小化平均である 。デザイン標的構造は亜鉛フィンガ−Ｚｉｆ２６８（９）の第２のＤＮＡ結合モ ジュールである。 *ｈ、θおよびΩは、以前に記載されているごとくに計算される（３６、３７） 。ｈはラセンＣα座標（残基１５〜２６）の中心およびシート（残基３〜１２） のＣα座標にフィットする最小二乗面の間の距離である。θはシートの平面に関 するラセンＣα原子の主要モーメントの指標である。Ωは、シートへのラセンの 主要モーメントの投影およびシートへの鎖Ｃα座標（残基３〜６および９〜１２ ）に立てする平均最小二乗フィット直線の間の角度である。 ＦＳＤ−１および標的構造の間の最大の差異は残基４〜７で起こり、鎖１の骨 格原子位置が３．０〜３．５Å変位している。鎖２、ラセンターンに対する鎖、 およびラセンについての一致が顕著であり、差異は構造決定のほとんど精度内に ある。構造のこの領域では、ＦＳＤ−１およびデザイン標的の間のφ、ψ角のｒ ｍｓ差異は１４±９°に過ぎない。標的の全体折り畳みに対するＦＳＤ−１の同 様性を定量的に評価するために、我々は、蛋白質における二次構造ユニットの相 対的配向を記載する、それらの超二次構造パラメーターを計算した（表９）（Ja nin & Chothia，J．Mol．Biol．143:95(1980);Su & Mayo，Protein Sci．in pre ss，1997）。θの値（シートに対するラセンの傾き）、およびΩ（ラセン軸およ び鎖軸の間の二面角）はほとんど同一である。シート上のラセンの高さｈはＦＳ Ｄ−１では１Å大きいに過ぎない。Ｇｂ１変異体についてのラセン高さの関数と しての蛋白質コアデザインの研究は、ラセン高さにおける１．５Åまでの変動は 配列選択に対してほとんど効果を有しないことを示した（Su & Mayo，前掲，199 7）。二次構造パラメーター値および骨格座標の比較は、ＦＳＤ−１の実験的に 決定された構造およびデザイン標的の間の優れた一致を強調し、このββαモチ ーフについての配列を計算するにおける我々のアルゴリズムの成功を証明する。 ＦＳＤ−１およびデザイン標的の間のマッチの質は、蛋白質の３つの主要に二 次構造：シート、ラセンおよびターンを含有する折り畳みについての配列をデザ インする我々のプログラムの能力を証明する。ββα折り畳みは配列選択方法を 開発するのに使用されたものとは異なるので、ＦＳＤ−１のデザインは我々のプ ログラムの新しいモチーフへの成功した移動を表す。 実施例６ 溶媒接近可能表面積スケーリング因子の計算 以前の仕事とは対照的に、骨格原子は表面積の計算に含まれる。かくして、ス ケーリング因子の計算は以下のごとくに行われる。 プログラムＢＩＯＧＲＡＦ(Molecular Simulations Incorporated，San Diego ，California)を用いて、構造上に明示的水素を生成させ、次いで、これを、Ｄ ＲＥＩＤＩＮＧ力場を用いる５０工程のためにコナジュゲート勾配最小化した。 表面積は、ゼロのプローブ半径および１．４Åのアッド−オン半径およびＤＲＥ ＩＤＩＮＧ力場からの原子半径を用い、１０Å−２のドット密度でのConnollyア ルゴリズムを用いて計算した。疎水性表面積に寄与する原子は炭素、硫黄および 炭素および硫黄に結合した水素原子である。 局所トリ−ペプチド骨格t3を持つ残基位置ｉにおける各側鎖ロタマーｒについ ては、我々は、局所トリ−ペプチド骨格の存在下におけるロタマーおよびその骨 についての鋳型によって埋もれた全面積である。残基位置ｉおよびｊおよび、各 々、ｉおよびｊ上のロタマーｒおよびｓの各対については、全鋳型の存在下に の間の差異は残基ｉおよびｊの間の埋もれた面積であり、鋳型によるその面積を 排除する。全埋もれた表面積に対する対の近似は： である。 図１３に示すごとく、方程式２９における第２の合計は埋もれた面積を過剰計 数する。我々は、従って、第２の合計に、その値が経験的に決定されるべきであ るスケール因子ｆを掛けた。ｆの予測される値は後記する。 埋もれたおよび露出された面積は全面積に加えるべきことに注意されたし。溶 である。 方程式３０の最初の合計は、他のロタマーとの相互作用を無視する蛋白質鋳型 の意味において各ロタマーの全露出面積を表す。方程式３０の第２の合計はロタ マー間の埋もれた面積を差し引き、方程式２９におけるのと同一パラメーターｆ を掛ける。 ｆの予測される値へのいくつかの洞察が、球または半径ｒの最密充填面心立方 格子の考慮から得ることができる。半径がｒからＲに増加すると、隣の球によっ て埋もれた１つの球上の表面積は2nR(R-r)である。我々はｒが炭素半径（１．９ ５Å）であって、Ｒが１．４Å大であるように採用した。次いで、 を用い、各球が１２の隣接物を有することに注意し、結果は以下のようになる。 これによりｆ＝０．４０が得られる。最密充填面心立方格子は７４％の充填率 を有する。蛋白質内部は同様の充填率を有するが、多くの原子が共有結合するの で、密な充填は過大視される。従って、ｆのこの値は現実の蛋白質コアではより 低いはずである。充填率がより低い非コア残基では、ｆの幾分大きな値が予測さ れる。 我々は、５４ないし２８９残基のサイズ範囲の１０の蛋白質から残基を以下の ようにコアまたは非コアに分類した。我々は、１．９５Åの炭素半径、８Åのプ ローブ半径を持つがアッド−オン半径は持たない鋳型Ｃα原子のみを用いて計算 された表面に対する各側鎖のＣα−Ｃβベクトルの方向を考慮するアルゴリズム を用いて残基をコアおよび非コアに分類した。もし表面に対する（そのＣα−Ｃ βベクトルに沿った）そのＣα原子からの距離が５．０Åより大であり、かつそ のＣβ原子から最も近い表面上の点までの距離が２．０Åより大であると、残基 はコア位置と分類した。かかるアルゴリズムの利点は、各残基位置に現実に存在 するアミノ酸タイプの知識が必要ないということである。蛋白質は表１に示され 、これは、選択された蛋白質、残基の合計数および各蛋白質のコアおよび非コア における残基の数を示す（ＧｌｙおよびＰｒｏは考慮しなかった）。 コア残基は非コア残基よりも相互に強く相互作用するゆえにコアおよび非コア への分類をなした。これは、コア残基についての埋もれた表面積のより大きな過 剰計数に導く。 コアおよび非コアの場合を別々に考慮し、真のLeeおよびRichards表面積を最 も密接に再現するｆの値を１０個の蛋白質から計算した。対の近似は真の埋もれ た表面積に非常に密接にマッチする（データは示さず）。また、それは非コア残 基の露出された疎水性表面積で非常によく実行される（データは示さず）。蛋白 質の全コアの露出された表面積の計算は、２つの大きいおよびほとんど等しい面 積の差異を含む；しかしながら、示されるように、コアおよび非コア残基の混合 物がある場合、高い精度が依然として達成できる。これらの計算は、コア残基に ついては、ｆは０．４２であり、非コア残基についてはｆは０．７９であること を示す。 残基をコアおよび非コアに分類するのが十分であるか否かをテストするために 、我々は、コアおよび非コア位置における相互作用性残基のサブセットを調べ、 各サブセットの真の埋もれた面積を計算されたそれと比較した（ｆの前記の値を 使用）。コアおよび非コアの両サブセットでは、修正が高いままであり（R²＝１ ．００）、さらなる分類が必要でないことを示す（データは示さず）。（サブセ ットは以下のごとくに生じさせた：シード残基が与えられれば、最も近い残基を 付加することによって、サイズ２のサブセットを生じさせた：次の最も近い残基 はサイズ３のサブセットのために付加した、そしてこれを蛋白質のサイズまで反 復 した。さらなるサブセットは異なるシード残基を選択することによって生じさせ た）。 蛋白質中の相互作用性コアおよび非コア残基の任意の選択の埋もれたまたは露 出された表面積を計算にこのアプローチが依然として適用される。コア残基およ び非コア残基が相互作用する場合、我々は、方程式２９を： で置き換え、方程式３０を方程式３２： で置き換える。ここに、f_iおよびf_jは、各々、残基ｉおよびｊに適当なｆの値で あり、f_{ij}は中間の値を取る。１pgaの全体からのサブセットを用い、ｆ_ijの最 適値は０．７４であることが判明した。次いで、この値は他のテスト蛋白質に適 当であることが示された（データは示さず）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｇ０６Ｆ 17/50 ６３８ 5/00 Ａ (31)優先権主張番号 ６０／０６１，０９７ (32)優先日 平成９年10月３日(1997．10．3) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ダハイヤット，バシル・アイ アメリカ合衆国90024カリフォルニア州ロ サンゼルス、ナンバー409、ロチェスタ ー・アベニュー10933番 (72)発明者 ゴードン，ディ・ベンジャミン アメリカ合衆国91106カリフォルニア州パ サディナ、ナンバー103、サウス・カタリ ーナ442番 (72)発明者 ストリート，アーサー アメリカ合衆国90027カリフォルニア州ロ サンゼルス、ナンバー７、グリーンウッ ド・プレイス4602番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．プログラムの制御下でコンピューターによって実行される方法であって、 該コンピューターは該プログラムを保存するためのメモリーを含み、該方法は、 （Ａ）可変残基位置を持つ蛋白質骨格構造を受領し； （Ｂ）該可変残基位置の各々について可能なロタマーの群を確立し、ここに、 少なくとも１つの可変残基位置は少なくとも２つの異なるアミノ酸側鎖からのロ タマーを有し；次いで、 （Ｃ）該ロタマーの各々と該蛋白質骨格構造の残りの全てまたは一部との相互 作用を解析して、最適化蛋白質配列のセットを生成させ、ここに、該分析工程は デッドエンド排除（ＤＥＥ）計算を含む； 工程を含むことを特徴とする該方法。 ２．プログラムの制御下でコンピューターによって実行される方法であって、 該コンピューターは該プログラムを保存するためのメモリーを含み、該方法は、 （Ａ）可変残基位置を持つ蛋白質骨格構造を受領し； （Ｂ）各可変残基位置をコア、表面または境界残基に分類し、 （Ｃ）該可変残基位置の各々について可能なロタマーの群を確立し、ここに、 少なくとも１つの可変残基位置は少なくとも２つの異なるアミノ酸側鎖からのロ タマーを有し；次いで、 （Ｄ）該ロタマーの各々と該蛋白質骨格構造の残りの全てまたは一部との相互 作用を解析して、最適化蛋白質配列のセットを生成させる； 工程を含むことを特徴とする該方法。 ３．該解析工程がＤＥＥ計算を含む請求項２記載の方法。 ４．最適化蛋白質配列の該セットが全体最適蛋白質配列を含む請求項１または ２記載の方法。 ５．該ＤＥＥ計算がオリジナルのＤＥＥおよびゴールドシュティン（Goldstei n）ＤＥＥよりなる群から選択される請求項１または３記載の方法。 ６．該解析工程が少なくとも１つのスコアリング機能の使用を含む請求項１ま たは２記載の方法。 ７．該スコアリング機能がファンデルワールスポテンシャルスコアリング機能 、水素結合ポテンシャルスコアリング機能、原子溶媒和スコアリング機能、静電 スコアリング機能および二次構造特性スコアリング機能よりなる群から選択され る請求項６記載の方法。 ８．該解析工程が少なくとも２つのスコアリング機能を含む請求項６記載の方 法。 ９．該解析工程が少なくとも３つのスコアリング機能を含む請求項６記載の方 法。 １０．該解析工程が少なくとも４つのスコアリング機能を含む請求項６記載の 方法。 １１．さらに、少なくとも１つの数の該セットをテストして、実験結果を生じ させることを含む請求項１または２記載の方法。 １２．さらに、（Ｄ）該全体最適蛋白質配列からさらなる最適配列のランク付 けされたリストを生成させることを含む請求項４記載の方法。 １３．該生成がモンテカルロサーチの使用を含む請求項１２記載の方法。 １４．該解析工程がモンテカルロ計算を含む請求項２記載の方法。 １５．さらに、（Ｅ）該ランク付けリストからの該蛋白質配列のいくつかまた は全てをテストして、ポテンシャルエネルギーテスト結果を得ることを含む請求 項１２記載の方法。 １６．さらに、（Ｆ）該ポテンシャルエネルギーテスト結果および理論的ポテ ンシャルエネルギーデータの間の対応性を解析することを含む請求項１５記載の 方法。 １７．請求項１または２の方法によって生成した最適化蛋白質。 １８．請求項１７記載の蛋白質配列をコードする核酸配列。 １９．請求項１８記載の核酸を含む発現ベクトル。 ２０．請求項１８記載の核酸を含む宿主細胞。 ２１．公知の蛋白質配列から少なくとも約５％異なり、公知の蛋白質配列より も少なくとも２０％安定である配列を有する蛋白質。 ２２．蛋白質骨格モデルの残基位置についての潜在的ロタマーの群を修正する ための側鎖モジュール； 該ロタマーの各々と該蛋白質の残りの全てまたは一部との相互作用を解析して 最適化蛋白質配列のランキングモジュール； を含むコンピューターを指令して特異的に機能させるコンピューター解読可能な メモリー。 ２３．該ランキングモジュールがファンデルワールススコアリング機能成分を 含む請求項２２記載のコンピューター解読可能メモリー。 ２４．該ランキングモジュールが原子溶媒和スコアリング機能成分を含む請求 項２２記載のコンピューター解読可能メモリー。 ２５．該ランキングモジュールが水素結合スコアリング機能成分を含む請求項 ２２記載のコンピューター解読可能メモリー。 ２６．該ランキングモジュールが二次構造スコアリング機能成分を含む請求項 ２２記載のコンピューター解読可能メモリー。 ２７．さらに、ポテンシャルエネルギーテスト結果および理論的ポテンシャル エネルギーデータの間の対応性を評価するための接近可能モジュールを含む請求 項２２記載のコンピューター解読可能メモリー。