BRPI0614695A2 - proteção de proteìna krp mutante negativa dominante de inibição de complexo ciclina-cdk ativo por krp do tipo silvestre - Google Patents

Abstract

PROTEçãO DE PROTEìNA KRP MUTANTE NEGATIVA DOMINANTE DE INIBIçãO DE COMPLEXO CICLINA-CDK ATIVO POR KRP DO TIPO SILVESTRE. A presente invenção refere-se aos polipeptídeos inibidores de de CDK mutante (CKI) tendo atividade antagonista negativa dominante contra as proteínas de CKI do tipo silvestre, bem como composições relacionadas, incluindo ácidos nucléicos e vetores codificando os polipeptídeos de CKI mutantes e células hospedeiras transformadas e plantas transgênicas compreendendo tais ácidos nucléicos e vetores. São também descritos métodos relacionados para usar as proteínas mutantes para modular a divisão celular nas células, particularmente células de planta.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROTEÇÃODE PROTEÍNA KRP MUTANTE NEGATIVA DOMINANTE DE INIBIÇÃODE COMPLEXO CICLINA-CDK ATIVO POR KRP DO TIPO SILVESTRE".

PEDIDOS DE PATENTE RELACIONADOS

Este pedido de Patente reivindica prioridade para o Pedido dePatente dos Estados Unidos Ne 60/703.999, depositado em 29 de julho de2005, incorporado aqui por referência em sua totalidade.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se às plantas que têm o mesmo ciclocelular básico como eucariotas. Não surpreendente, elas também têm emcomum com eucariotas, as cinases chamadas cinases dependentes de cicli-na (CDK) que regulam as transições entre as diferentes fases do ciclo celu-lar. Arabidopsis, um sistema de planta modelo empregado para estudar ociclo celular tem vários subgrupos de CDK. CDKA é muito similar ao cdc2(CDK1) de mamíferos e contém a seqüência de aminoácido Ser Thr Ala lieArg Glu (PSTAIRE) altamente conservada (SEQ ID NO:1) em uma regiãoque media a interação com o seu par de ciclina. Arabidopsis também tem umgrupo específico de planta de CDK chamado CDKB que não é conservadoem animais mais altos. As plantas entretanto necessitam da contraparte demamífero para o Gi CDKs-CDK4 e CDK6. CDKA foi proposto ser o G1 CDK(que é ativado pelas ciclinas tipo de planta D), ao mesmo tèmpo em queCDKB foi demonstrado ser expresso predominantemente na S-fase e poste-rior, portanto, provavelmente identificado como o CDK específico de G2/M.

A ativação/inativação destes CDKs direciona células pelo ciclocelular e também dita quando as células devem sair do ciclo celular. Arabi-dopsis contém até 49 ciclinas agrupadas em 10 subclasses (vide Wang eoutros, Plant Physiol. 135:1084-1099, 2004). Somente as classes A, B e D,parecem desempenhar um papel no ciclo celular e ativam CDKs (Wang eoutros, Plant Physiol. 135:1084-1099, 2004). CDKA é ativado pelas ciclinastipo D, ao mesmo tempo em que CDKB é ativado pelas ciclinas tipo AeB.

Em animais, os CDKs são negativamente regulados por duasfamílias de inibidores de CDK (CKIs). Uma classe, chamada inibidor deCDK4 (ΙΝΚ4) é compreendida de 4 membros (p15, p16, p18 e ρ 19) que seliga a e inibe o Gi CDKs, isto é CDK4 e CDK6, de ligar a ciclina. O outrogrupo de inibidores é chamado Proteínas Inibidoras de Cinase (Kips) ou pro-teínas CIP (Proteína de Interação de CDK) e eles são altamente conserva-dos em todos os animais. A família de CIP/KIP predominantemente inibe aatividade de ciclina A- e E-CDK2 cinase. Nas plantas, CKIs putativos foramidentificados (Wang e outros, Nature 386:451-452, 1997; Wang e outros,Plant J, 15:501-510, 1998; De Veylder e outros, Plant Cell 13:1653-1667,2001; Jasinski e outro, Plant Physiol 130: 1871-1882, 2002) e mostraraminibir a atividade de ciclina/CDK cinase purificada in vitro (Wang e outros,1997, supra; Wang e outros, Plant J. 24:613-623, 2000; Lui e outro, Plant J.21 :379-385, 2000). A expressão de CKIs de planta mostrou crescimentoreduzido com órgãos menores que contêm células maiores (vide Wang eoutros, 2000, supra; Jasinski e outros, J. Cell Sd. 115:973-982, 2001; DeVeylder e outros, supra; Zhou e outros, Plant CeIIRep. 20:967-975, 2002;Zhou e outros, Plant J. 35:476-489, 2003; Schnittger e outros, Plant Cell15:303-315, 2003). Em Arabidopsis, estes CKIs, são chamados Inibidores deCDK (ICKs) ou proteínas relacionadas com KIP (KRPs). Sete membros dafamília de ICK foram identificados os quais mais intimamente se assemelhaà família de CIP/KIP de CKIs. Cada um destes membros da família deICK/KRP tem identidade de seqüência de aminoácido elevada a p27KIP1 po-rém a identidade é limitada à maioria dos 30 aminoácidos C-terminais. Atéhoje, nenhum CKIs relacionado com INK foi identificado em qualquer planta.

A superexpressão de ciclinas ou nocautes de CKI ilustra que aconstrução de ciclo celular bem-equilibrada pode ser perturbada facilmenteem mamíferos. Este desequilíbrio pode definitivamente levar a ciclos celula-res acelerados, tamanho de animal aumentado e/ou desenvolvimento detumor. Reduzir ou eliminar completamente a "atividade" de CKI resulta ematividade de ciclina/CDK cinase aumentada. Esta atividade aumentada resul-ta na fosforilação de alvos a jusante necessários para progressão de ciclocelular, e os animais finalmente produzem hiperproliferação de célula (Cobree outros, Science-272:877-880, 1996). A deleção do gene p27WPI em ca-mundongos resulta em camundongos maiores devido a atividade de cicli-na/cdk excessiva que leva proliferação de célula excessiva (Fero e outros,Cell 85:733-744, 1996; Kiyokawa e outros, Cell 85:721-732, 1996; Nakaya-ma e outros, Cell 85:707 - 720,1996).

Os mecanismos existem para suprimir a expressão de váriosmembros da família de KRP. O silenciamento de gene pós-transcricional(PTGS) em plantas é um mecanismo de degradação de RNA similar à inter-ferência de RNA (RNAi) em animais. RNAi resulta na degradação específicade RNA de filamento duplo (dsRNA) em fragmentos de dsRNA de 21-23 bpcurtos que finalmente desempenham um papel na degradação de uma popu-lação de RNAs homólogos. Nas plantas, PTGS usa uma estratégia de repe-tições invertidas (IR) para suprimir a expressão de gene em muitas espéciesde plantas incluindo plantas de colheita tal como milho, soja e colza paradesignar algumas. Entretanto, a tecnologia de IR tem várias desvantagenstal como a eficiência da seqüência de IR, regulamento de gene alvo distante(Jackson e outros, Nature Biotech. 21:635-637, 2003), silenciamento transi-tório, estabilidade de IR completa, e similares. Estas desvantagens são com-postas no caso presente pela necessidade de silenciar mais de um gene decada vez.

A reprodução de planta convencional foi a força motriz de princí-pio para produções de colheita aumentada durante os últimos 75 anos (J.Fernandez-Cornejo, Agriculture Information Bulletin NQ. (AIB786) 81 pp, Fe-vereito de 2004). Mais recentemente, as colheitas transgênicas ficaram dis-poníveis as quais, por exemplo, têm resistência a pestes de inseto herbici-das. Entretanto, estas colheitas transgênicas vêm com uma penalidade deprodução (Elmore e outros, Agron. J. 93:408-412, 2001; Elmore e outros,Agron. J. 93:404-407, 2001). Até hoje, nenhuma colheita transgênica conhe-cida está comercialmente disponível a qual tenha um aumento no tamanhode semente ou um aumento na produção de colheita.

Há uma necessidade na técnica para métodos melhorados demodificação das características de certas colheitas comercialmente valiosas,incluindo, por exemplo, porém sem limitação, aumento das produções decolheita, aumento do tamanho de semente, aumento da taxa de germinação,aumento da massa da raiz, e similares. A presente invenção como descritoaqui, atende a estas e outras necessidades.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um polipeptídeo inibidor de ci-nase dependente de ciclina (CKI) de planta variante tendo pelo menos umamodificação com relação ã um polipeptídeo de CKI do tipo silvestre. Em cer-tas modalidades, as modificações estão dentro da região de ligação de CDKde modo a conferir, com relação à proteína de CKI tipo silvestre, afinidademodificada de ligação para proteína de CDK, ao mesmo tempo em quesubstancialmente mantendo afinidade de ligação a uma proteína de ciclina.

Os polipetpídeos de CKI variantes da presente invenção têm atividade anta-gonista negativa dominante contra função de CKI tipo silvestre. Quando avariante é expressa dentro de uma célula expressando a proteína de CKItipo silvestre correspondente, ou uma célula expressando um heterólogo deCKI tipo silvestre a proteína tipo silvestre correspondente porém substanci-almente tendo função tipo silvestre equivalente com respeito à, inter alia,ligação de ciclina e CDK, a atividade biológica de CKI tipo silvestre é inibida,levando a progressão acelerada pelo ciclo celular e proliferação de célulaaumentada.

Em outros aspectos, a presente invenção provê Ácido nucléicorecombinante codificando um polipeptídeo de CKI variante, ou um vetorcompreendendo e o ácido nucléico recombinante. O vetor ou ácido nucléicocodificando CKI variante podem ser introduzidos em Célula hospedeira paraamplificação ou expressão do ácido nucléico. As células hospedeiras podemser empregadas, por exemplo, em métodos da invenção para produzir ospolipeptídeos de CKI variante, Além disso, a expressão do polipeptídeo deCKI variante em uma célula pode ser empregada em métodos da invençãopara modular a divisão de célula. Por exemplo, a expressão de polipeptídeode CKI variante em uma célula pode levar a progressão acelerada pelo ciclocelular e proliferação de célula aumentada.

Em ainda outros aspectos, a planta transgênica compreendendoum transgene codificando o polipeptídeo de CKI variante é fornecida. Ex-pressão do polipeptídeo de CKI variante em plantas transgênicas pode serempregada em métodos da invenção para, por exemplo, aumentar o vigorda planta, aumentar a massa da raiz, aumentar o tamanho da planta, ouaumentar a germinação precoce e similares.

DEFINIÇÕES

A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos ecientíficos empregados aqui têm o mesmo significado como geralmente en-tendido por alguém versada na técnica a qual esta invenção pertence. Em-bora qualquer método e material similar àquele descrito aqui possa ser em-pregado na prática ou teste da presente invenção, somente métodos e mate-riais exemplares são descritos. Para propósitos da presente invenção, osseguintes termos são definidos abaixo.

Os termos "um", "uma" e "o", "a" como empregados aqui incluemreferentes plurais, a menos que o contexto indique claramente de outro modo.

Como empregado aqui, o termo "inibidor de cinase dependentede ciclina" (também referido aqui como "inibidor de CDK" ou "CKI") refere-sea uma classe de proteínas que negativamente regula as cinases dependen-tes de ciclina (CDKs). Os CKIs tratáveis pela presente invenção são aquelestendo regiões de polipeptídeo separadas capazes de independentementeligar um ciclina e um CDK. Tais CKIs incluem, por exemplo, as famílias iden-tificadas de CKIs de planta (os sete CKIs de Arabidopsis identificados), ten-do homologia às Proteínas Inibidoras de Cinase (KJPs) em animais, referi-das como proteínas relacionadas com KIP (KRPs) (também conhecido comoInibidores de "CDKs, ou "TCKs").

Os termos "polipeptídeo" e "proteína" são empregado aqui alter-nadamente para se referir a um polímero de resíduos de aminoácido.

O termo "ácido nucléico" se refere a deoxirribonucleotídeos ouribonucleotídeos e polímeros destes na forma de filamento único ou duplo. Amenos que especificamente limitado, o termo abrange ácidos nucléicos quecontêm análogos conhecidos de nucleotídeos naturais que têm propriedadesde ligação similares como o ácido nucléico de referência e são metaboliza-dos de uma maneira similar aos nucleotídeos de ocorrência natural. A me-nos que de outra maneira indicado, uma seqüência de ácido nucléico parti-cular também implicitamente abrange variante modificada de modo conser-vador destes (por exemplo, substituições de códon degeneradas). Especifi-camente, as substituições de códon degeneradas podem ser obtidas geran-do seqüências nas quais a terceira posição de um ou mais códons selecio-nados (ou todos) é substituída com resíduos de deoxiinosina e/ou base mis-turada (vide, por exemplo, Batzer e outros, Nucleic Acid. Res 19:5081, 1991;Ohtsuka e outros, J. Biol. Chem. 260:2605-2608, 1985; Rossolini e outros,Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994). O termo ácido nucléico é alternadamenteempregado com gene, cDNA, e mRNA codificado por um gene.

O termo "de ocorrência natural", no contexto de polipeptídeos deCKI e ácidos nucléicos, significa um polipeptídeo ou ácido nucléico que temuma seqüência de aminoácido ou nucleotídeo que é encontrada em natura,isto é, uma seqüência de aminoácido ou nucleotídeo que possa ser isoladasde uma fonte em natura (um organismo) e que não tenha sido modificadointencionalmente através de intervenção humana. Como empregado aqui, aslinhagens de laboratório de plantas que podem ter sido seletivamente cria-das de acordo com genéticas clássicas são consideradas plantas de ocor-rência natural.

Como empregado aqui, "gene de CKI tipo silvestre" ou "ácidonucléico de CKI tipo silvestre" se refere a uma seqüência de ácido nucléico,correspondendo a um loco genético de CKI no genoma de um organismo,que codifica um produto de gene que realiza a função normal da proteína deCKI codificada por uma seqüência de nucleotídeo de ocorrência natural quecorresponda ao loco genético. Um loco genético pode ter mais de uma se-qüência ou alelo em uma população de indivíduos, e o termo "tipo silvestre"abrange todos tais alelos de ocorrência natural que codificam um produto degene que realiza a função normal. "Tipo silvestre" também abrange seqüên-cias de gene que não são necessariamente de ocorrência natural, porémque ainda codificam um produto de gene com função normal (por exemplo,genes tendo mutações silenciosas ou codificando proteínas com substitui-ções conservadoras).

O termo "polipeptídeo de CKI tipo silvestre" ou "proteína de CKItipo silvestre" se refere a um polipeptídeo de CKI codificado por um gene detipo silvestre. Um loco genético pode ter mais de uma seqüência ou alelo emuma população de indivíduos, e o termo "tipo silvestre" abrange todos taisalelos de ocorrência natural que codificam um produto de gene que realiza afunção normal.

O termo "mutante" ou "variante", no contexto de ácidos nucléicoe polipeptídeos de CKI da presente invenção, significa um polipeptídeo ouácido nucléico que é modificado com relação a um polipeptídeo ou ácidonucléico tipo silvestre correspondente.

O termo "polipeptídeo de CKI referência" é um termo empregadoaqui para propósitos de definir um polipeptídeo de CKI mutante ou variante:o termo se refere a um polipeptídeo de CKI ao qual um de de polipeptídeode CKI mutante é comparado para propósitos de definir modificações emseqüência de aminoácido. Desse modo, um polipeptídeo de CKI mutante"compreendendo uma seqüência de aminoácido CKI tendo pelo menos umamodificação com relação a um polipeptídeo de CKI de referência" significaque, com exceção da uma ou mais modificações de aminoácido, polipeptí-deo de CKI mutante de outro modo compreende a seqüência de aminoácidodo polipeptídeo de referência. Ao realizar a presente invenção como descritoaqui, os polipeptídeos de CKI de referência são predeterminados. Um poli-peptídeo de CKI de referência pode ser, por exemplo, um polipeptídeo deCKI de ocorrência natural e/ou tipo silvestre, ou um polipeptídeo de CKI quetenha sido intencionalmente modificado.

O termo "ligação modificada" ou "ligação alterada" se refere aum polipeptídeo de CKI mutante codificado por um gene de tipo silvestrecujo polipeptídeo de CKI de referência liga um complexo de ciclina/CDK. Pe-lo termo "ligação modificada" ou "ligação alterada" aqui se refere à ligaçãodo CKI mutante ao complexo de ciclina/CDK cinase. O termo "ligação modi-ficada" ou "ligação alterada" se refere ao Polipeptídeo de ligação relativo deCKI mutante comparado ao polipeptídeo de CKI de referência. "Ligação mo-dificada" ou "ligação alterada" pode se referir a um polipeptídeo de CKI mu-tante que tem ligação igual, ligação reduzida, ou ligação equivalente aocomplexo de ciclina/CDK comparado ao polipeptídeo de CKI de referência.

"Recombinante" como empregado aqui se refere a uma seqüên-cia de aminoácido ou uma seqüência de nucleotídeo que tenha sido modifi-cada intencionalmente através de métodos recombinantes. Pelo termo "áci-do nucléico recombinante" aqui é entendido um ácido nucléico, originalmen-te formou in vitro, em geral, pela manipulação de um ácido nucléico atravésde endonucleases, em uma forma não normalmente encontrada em natura.Desse modo, um ácido nucléico de CKI variante ou mutante isolado, em umaforma linear, ou um vetor de expressão formado in vitro através de molécu-las de DNA de ligação que não são normalmente unidas, são ambos consi-derados recombinantes para os propósitos desta invenção. É entendido queuma vez que um ácido nucléico recombinante é feito e reintroduzido no or-ganismo ou célula hospedeira, ele replicará não recombinantemente, isto é,empregando a maquinaria celular in vivo da célula hospedeira no lugar demanipulações in vitro·, entretanto, tais ácidos nucléicos, uma vez produzidosrecombinantemente, embora subseqüentemente replicados não recombinan-temente, ainda são considerados recombinantes para o propósitos da inven-ção. Uma "proteína-recombinante" é uma proteína feita empregando técni-cas recombinantes, isto é, pela expressão de um ácido nucléico recombinan-te como descrito acima. Uma proteína recombinante é distinta de proteína deocorrência natural através de pelo menos uma ou mais características.

Com respeito aos aminoácidos, uma modificação "não conser-vadora" significa uma modificação na qual o resíduo tipo silvestre e o resí-duo mutante diferem significantemente em uma ou mais propriedades físi-cas, incluindo hidrofobicidade, carga, tamanho e forma. Por exemplo, asmodificações de um resíduo polar para um resíduo não polar ou vice-versa,as modificações de resíduos positivamente carregados para resíduos nega-tivamente carregados ou vice-versa, as modificações de resíduos grandespara resíduos pequenos ou vice-versa são modificações não conservadoras.Por exemplo, as substituições podem ser feitas as quais significantementeafetam: a estrutura da cadeia principal de polipeptídeo na área da alteração,por exemplo, a estrutura alfa-helicoidal ou beta-folha; a carga ou hidrofobici-dade da molécula no sítio-alvo; ou o volume da cadeia lateral. As substitui-ções que em geral são esperadas produzir as maiores alterações nas pro-priedades do polipeptídeo são aquelas nas quais (a) um resíduo hidrofílico,por exemplo, serila ou treonila, é substituído por um resíduo hidrofóbico, porexemplo, leucila, isoleucila, fenilalanila, valila ou alanila; (b) uma cisteína ouprolina é substituída por qualquer outro resíduo; (c) um resíduo tendo umacadeia lateral eletropositiva, por exemplo, lisila, arginila, ou histidila, é substi-tuída por um resíduo eletronegativo, por exemplo, glutamila ou aspartila; ou(d) um resíduo tendo uma cadeia lateral volumosa, por exemplo, fenilalanina,é substituída por um não tendo uma cadeia lateral, por exemplo, glicina.tradas abaixo, entretanto, como é conhecido na técnica, outras substituiçõespodem ser consideradas conservadoras.

As modificações conservadoras geralmente são aquelas mos-

Ala: Ser

Arg: Lys

Asn: Gln, His,

Asp: Glu

Cys: Ser

Gln: Asn

Glu: Asp

Gly: Pro

His: Asn, Gln,

He: Leu, Vai,

Leu: He, Vai,

Lys: Arg, Gln, Glu

Met: Leu, He,

Phe: Met, Leu, Tyr,

Ser: Thr

Thr: SerTip: TyrTyr: Trp1 Phe,Vai: He, Leu1

O termo "dominante negativo", no contexto de mecanismo deproteína de fenótipo de ação ou gene, se refere a uma proteína mutante ouvariante, ou o gene codificando a proteína mutante ou variante, que subs-tancialmente previne uma proteína correspondente tendo função tipo silves-tre de realizar a função tipo silvestre.

A frase "antagonista de um CKI tipo silvestre" como empregadoaqui significa que um polipeptídeo de CKI mutante significantemente diminui(inibe) a capacidade de um polipeptídeo CKI de tipo silvestre inibir a ativida-de de cinase de complexos de CDK/ciclina quando comparado com a inibi-ção de atividade de cinase pelo polipeptídeo de CKJ tipo silvestre na ausên-cia do antagonista.

Um ácido nucléico é "operavelmente ligado" quando é colocadoem uma relação funcional com outra seqüência de ácido nucléico. Por e-xemplo, um promotor ou realçador é operavelmente ligado a uma seqüênciade codificação se afetar a transcrição da seqüência; ou um sítio de ligaçãode ribossoma é operavelmente ligado a uma seqüência de codificação séposicionado para facilitar a translação.

O termo "planta" inclui plantas inteiras, órgãos de planta (porexemplo, folhas, troncos, flores, raízes, e similares), sementes e células deplanta (incluindo células de cultura de tecido) e progênie destes. A classe deplantas que pode ser empregada nos métodos da invenção geralmente é tãoampla quanto à classe de plantas mais altas tratáveis para técnicas de trans-formação, incluindo gimnospermas e angiospermas, ambas plantas monoco-tiledôneas e dicotiledòneas, bem como certas plantas mais baixas tal comoalgas. São incluídas plantas de uma variedade de níveis de ploidia, incluindopoliplóide, diplóide e haplóide. Os exemplos de angiospermas monocotiledô-neos incluem, por exemplo, aspargo, campo e milho verde, cevada, trigo,arroz, sorgo, cana de açúcar, cebola, milho miúdo, centeio e aveias e outrogrãos de cereal. Os exemplos de angiospermas dicotiledòneas incluem, po-rém não estão limitados, tomate, tabaco, algodão, semente de colza (Cano-la), camelina, fava, soja, pimentas, alface, e similares. Os exemplos de es-pécies lenhosas incluem álamo, anseie, cedro, carvalho, abeto, e similares.

Uma "seqüência de heteróloga" é uma que se origina de umaespécie diferente, ou, se da mesma espécie, é substancialmente modificadade sua forma original. Por exemplo, um promotor heterólogo operavelmenteunido a um gene estrutural é de uma espécie diferente daquela da qual ogene estrutural foi derivado, ou, se da mesma espécie, é substancialmentemodificado de sua forma original.

O termo "vetor" se refere a um pedaço de DNA, tipicamente defilamento duplo, que pode ter inserido nele um pedaço de DNA estrangeiro.O vetor ou réplicon pode ser, por exemplo, de origem de plasmídeo ou viral.Vetores contêm seqüências de polinucleotídeo de "réplicon" que facilitam areplicação autônoma do vetor em uma célula hospedeira. O termo "réplicon"no contexto desta descrição também inclui regiões de seqüência de polinu-cleotídeo que miram ou de outro modo facilitam a recombinação de seqüên-cias de vetor em um cromossomo hospedeiro. Além disso, ao mesmo tempoem que o DNA estrangeiro pode ser inserido inicialmente em, por exemplo,um vetor de vírus de DNA, a transformação do DNA de vetor viral em célulahospedeira pode resultar na conversão do DNA viral em uma molécula devetor de RNA viral. O DNA estrangeiro está definido como DNA heterólogo,que é o DNA não naturalmente encontrado na célula hospedeira que, porexemplo, replica a molécula de vetor, codifica um transgene ou marcadorselecionável ou avaliável. O vetor é empregado para transportar o DNA es-trangeiro ou heterólogo em uma célula hospedeira adequada. Uma vez nacélula hospedeira, o vetor pode replicar independentemente de ou coinciden-te com o DNA cromossômico hospedeiro, e várias cópias do vetor e seuDNA inserido podem ser gerados. Alternativamente, vetor do podem alvejara inserção do DNA estrangeiro ou heterólogo em um cromossomo hospedei-το. Além disso, o vetor também pode conter os elementos necessários quepermitem a transcrição do DNA inserido em uma molécula de mRNA ou deoutro modo causar a replicação do DNA inserido em cópias múltiplas deRNA. Alguns vetores de expressão adicionalmente contêm elementos deseqüência adjacentes ao DNA inserido que permite a translação do mRNAem uma molécula de proteína. Muitas moléculas de mRNA e polipeptídeocodificados pelo DNA inserido podem desse modo ser rapidamente sinteti-zados.

O termo "vetor de transgene" se refere a um vetor que contémum segmento inserido de DNA, o "transgene", que é transcrito em mRNA oureplicado como um RNA dentro de uma célula hospedeira. O termo "trans-gene" se refere não somente àquela porção de DNA inserido que é converti-do em RNA, porém também aquelas porções de vetor que são necessáriaspara a transcrição ou replicação do RNA. Além disso, um transgene neces-sariamente não precisa compreender uma seqüência de polinucleotídeo quecontém uma estrutura de leitura aberta capaz de produzir uma proteína.

Os termos "célula hospedeira transformada", "transformado", e"transformação" se referem à introdução de DNA em uma célula. A célula échamada uma "célula hospedeira", e pode ser uma célula procariótica ouuma célula eucariótica. As células hospedeiras procarióticas típicas incluemvárias linhagens de E. coli. As células hospedeiras eucarióticas típicas, sãocélulas de planta (por exemplo, células de semente de colza, soja, arroz, oumilho e similares), células de levedura, células de inseto, ou células de ani-mais. O DNA introduzido está normalmente nà forma de um vetor que con-tém um pedaço inserto de DNA. A seqüência de DNA introduzida pode serda mesma espécie como a célula hospedeira ou de uma espécie diferenteda célula hospedeira, ou pode ser uma seqüência de DNA híbrida, contendoalguns DNA estrangeiros e alguns DNA derivados das espécies hospedeiras.

No contexto de polipeptídeos de CKI e ácidos nucléicos e, "cor-respondência" a outra seqüência (por exemplo, posições de regiões, frag-mentos, nucleotídeos ou aminoácido, ou similares) é com base na conven-ção da numeração de acordo com a posição de nucleotídeo ou aminoácido,e em seguida alinhando as seqüências de uma maneira que maximize onúmero de nucleotídeos ou aminoácido que se igualam em cada posição,isto é, de uma maneira que maximize o percentual de identidade de seqüên-cia. Uma vez que nem todas as posições com uma determinada "região cor-respondente" necessitam ser idêntica, as posições não combinantes dentrode uma região correspondente podem ser consideradas como "posições cor-respondentes". Conseqüentemente, como empregado aqui, a indicação auma "posição de aminoácido que corresponde a posição de aminoácido X"de um polipeptídeo CKI especificado representa indicação a uma coleção deposições equivalentes em outros polipeptídeos de CKI reconhecidos e famí-lias e homólogos estruturais.

Em uma modalidade típica da presente invenção, relativa a su-perfamília de KRP de polipeptídeos de CKI e ácidos nucléico, "correspon-dência" de posições de aminoácido ou nucleotídeo é tipicamente determina-da com respeito aos aminoácidos dentro da região de ligação de CDK, ounucleotídeos codificando a região de ligação de CDK. Geralmente, quandocomparado com outras regiões de polipeptídeos de KRP, a região de ligaçãode CDKs de KRP CKIs compartilham similaridade ou identidade de seqüên-cia substancial. Desse modo, uma técnica adequada para determinar a regi-ão de ligação de CDK de um polipeptídeo de CKI de KRP é identificar umaregião de aminoácido que compartilha similaridade ou identidade de se-qüência substancial com uma região de ligação de CDK conhecida de umsegundo CKI de KRP (por exemplo, de cerca de 145-168 posições de ami-noácido de Brassica napus Krpl (Bn Krpl)). (Vide, por exemplo, figura 1,mostrando um alinhamento de seqüência de aminoácido de vários membrosda família de CKI com BnKrpI). Uma vez que uma seqüência que corres-ponde a uma região de ligação de CDK foi determinada por alinhamento deseqüência, posições de nucleotídeo ou aminoácido correspondentes podemser determinadas adequadamente.

Como empregado aqui, "porcentagem de identidade de seqüên-cia" é determinada comparando-se duas seqüências idealmente alinhadassobre uma janela de comparação, onde a porção da seqüência na janela decomparação pode compreender adições ou deleções (isto é, intervalos)quando comparada à seqüência de referência (que não compreende adiçõesou deleções) para alinhamento ideal das duas seqüências. A porcentagem écalculada determinando-se o número de posições nas quais a base de ácidonucléico idêntica ou resíduo de aminoácido ocorre em ambas as seqüênciaspara produzir o número de posições emparelhadas, dividindo o número deposições emparelhadas pelo número total de posições na janela de compa-ração e multiplicando o resultado por 100 para produzir a porcentagem deidentidade de seqüência.

Os termos "idêntico" ou percentual de "identidade", no contextode dois ou mais ácidos nucléico ou seqüências de polipeptídeo, se refere aduas ou mais seqüências ou subseqüências que são iguais ou têm uma por-centagem especificada de nucleotídeos ou resíduos de aminoácido que sãoas mesmas (por exemplo, 60% de identidade, opcionalmente 65%, 70%,75%, 80%, 85%, 90%, ou 95% de identidade sobre uma região especifica-da), quando comparada e alinhada para correspondência máxima sobre umajanela de comparação, ou uma região designada, quando medida empre-gando um dos seguintes algoritmos de comparação de seqüência, ou poralinhamento manual e inspeção visual. As seqüências são "substancialmen-te idênticas" a cada outra se elas são pelo menos cerca de 25%, pelo menos30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos50%, ou pelo menos 55% idênticas. Estas definições também se referem ao- complemento de uma seqüência de teste. Opcionalmente, a identidade exis-te sobre uma região de polipeptídeo que é pelo menos cerca de 6 resíduosde aminoácidos em comprimento, pelo menos cerca de 15 resíduos de ami-noácido em comprimento, pelo menos cerca de 25 resíduos de aminoácidoem comprimento, pelo menos cerca de 35 resíduos de aminoácido em com-primento, pelo menos cerca de 50 resíduos de aminoácido em comprimento,ou pelo menos cerca de 100 ou mais aminoácidos em comprimento, ou so-bre uma região de ácido nucléico codificando uma tal região de polipeptídeo.Em certos aspectos preferidos da presente invenção, uma região designadapara comparação é uma região de ligação de CDK de um polipeptídeo deCKI, uma região de polipeptídeo compreendendo uma porção de uma talregião de ligação de CDK, ou üma região de polipeptídeo compreendendouma tal região de ligação de CDK.

Os termos "similaridade" ou "percentual de similaridade", no con-texto de duas ou mais seqüências de polipeptídeo, se referem a duas oumais seqüências ou subseqüências que têm uma porcentagem especificadade resíduos de aminoácido que são ou iguais ou similares como definido poruma substituição de aminoácido conservadora (por exemplo, 60% de simila-ridade, opcionalmente 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95% similar so-bre uma região especificada), quando comparadas e alinhadas para corres-pondência máxima sobre uma janela de comparação, ou região designadaquando medida empregando um dos seguintes algoritmos de comparaçãode seqüência ou por alinhamento manual e inspeção visual. As seqüênciassão "substancialmente similares" a uma outra se elas são pelo menos 20%,pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelomenos 45%, pelo menos 50%, ou pelo menos 55% similares a uma outra.

Opcionalmente, esta similaridade existe sobre uma região que é pelo menoscerca de 6 resíduos de aminoácido em comprimento, pelo menos cerca de15 resíduos de aminoácido em comprimento, pelo menos cerca de 25 resí-duos de aminoácido em comprimento, pelo menos cerca de 35 resíduos deaminoácido em comprimento, pelo menos cerca de 50 resíduos de aminoá-cido em comprimento, ou pelo menos cerca de 100 ou mais aminoácidos emcomprimento.

Em certos aspectos da presente invenção, para determinação deidentidade ou similaridade de seqüência, uma região designada para compa-ração é a região de ligação de CDK de um polipeptídeo CK-I, uma região depolipeptídeo compreendendo uma porção de uma tal região de ligação deCDK, ou uma região de polipeptídeo compreendendo uma tal região de liga-ção de CDK.

Para comparação de seqüência, tipicamente uma seqüência a-tua como uma seqüência de referência, para que as seqüências de testesejam comparadas. Ao usar um algoritmo de comparação de seqüência, se-qüências de teste e referência são entradas em um computador, são desig-nadas coordenadas de subseqüência, se necessário, e os parâmetros deprograma de algoritmo de seqüência são designados. Os parâmetros deprograma de default podem ser empregados, ou parâmetros alternativos po-dem ser designados. O algoritmo de comparação de seqüência então calcu-la a porcentagem de similaridade ou identidade de seqüência para as se-qüências de teste com relação à seqüência de referência, com base nos pa-râmetros do programa.

Uma "janela de comparação", como empregado aqui, inclui refe-rência a um segmento de posições de aminoácido ou nucleotídeo contíguasnas quais uma seqüência pode ser comparada a uma seqüência de referên-cia do mesmo número de posições contíguas após as duas seqüências sè-rem idealmente alinhadas. Com respeito à comparação de polipeptídeos deCKI de acordo com a presente invenção, uma janela de comparação é tipi-camente de cerca de 6 a cerca de 200 ou mais aminoácidos contíguos, tipi-camente cerca de 6 a cerca de 50, cerca de 6 a cerca de 25, cerca de 15 acerca de 100, cerca de 15 a cerca de 50, cerca de 15 a cerca de 30, cercade 20 a cerca de 50, ou cerca de 25 a cerca de 50 aminoácidos contíguos.Os métodos de alinhamento de seqüências para comparação são bem-conhecidos na técnica. O alinhamento ideal de seqüências para comparaçãopode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smi-the Waterman (Adv. Appl Math. 2:482, 1970), pelo algoritmo de alinhamentode homologia de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970), pelapesquisa para método de similaridade de Pearson e Lipman (Proc. Natl. A-cad. Sd. USA 85:2444,1988), por implementações computadorizadas destesalgoritmos (por exemplo, GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no WisconsinGenetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr.,Madison, W.s.), ou por alinhamento manual e inspeção visual (vide, por e-xemplo, Ausubel e outro, Current Protocols in Molecular Biology (1995 sup-plement)).

Um exemplo de um algoritmo útil é PILEUP. PILEUP cria umalinhamento de seqüência múltiplo de um grupo de seqüências relacionadasque usam alinhamentos progressivos, em pares para mostrar a relação eporcentagem de identidade de seqüência. Também plota uma árvore oudendograma que mostra a relação de agrupamento empregada para criar oalinhamento. PILEUP usa uma simplificação do método de alinhamento pro-gressivo de Feng e Doolittle (J Mol. Evol. 35:351-360, 1987). O método em-pregado é similar ao método descrito por Higgins e Sharp (CABIOS 5:151-153, 1989). O programa pode alinhar até 300 seqüências, cada um de umcomprimento máximo de 5.000 nucleotídeos ou aminoácidos. O procedimen-to de alinhamento múltiplo começa com o alinhamento em par das duas se-qüências mais similares, produzindo um agrupamento de duas seqüênciasalinhadas. Este agrupamento é então alinhado à próxima seqüência maisrelacionada ou agrupamento de seqüências alinhadas. Dois agrupamentosde seqüência são alinhados por uma extensão simples do alinhamento empar de duas seqüências individuais. O alinhamento final é obtido por umasérie alinhamentos progressivos, em pares. O programa é executado desig-nando seqüências específicas e as suas coordenadas de aminoácido ou nu-cleotídeo para regiões de comparação de seqüência e designando os parâ-metros de programa. Ao empregar PILEUP, uma seqüência de referência écomparada a outras seqüências de teste para determinar a porcentagem derelação de identidade de seqüência que usa os seguintes parâmetros: pesode abertura de default (3,00), peso de comprimento de abertura de default(0,10), e aberturas de extremidades pesadas. PILEUP pode ser obtido dopacote de software de análise de seqüência GCG (por exemplo, versão 7.0(Devereaux e outros, Nucl. Adds. Res. 12:387-395,1984).

Outro exemplo de um algoritmo que é adequado para determinara porcentagem de identidade de seqüência e similaridade de seqüência, sãoos algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que são descritos em Altschul e outros(Nucl. Acids Res. 25:3389-3402, 1977), e Altschul e outro (J. Mol. Biol.215:403-410, 1990), respectivamente. O software para realizar análises deBLAST está publicamente disponível pelo Centro Nacional para Informaçãode Biotecnologia. Este algoritmo envolve primeiro identificar pares de se-qüência de classificação elevada (HSPs) identificando-se as palavras de ta-manho curto W na seqüência de questão, que ou comparam ou satisfazemmais escore T de limiar de valor mais positivo T quando alinhado com umapalavra do mesmo tamanho em uma seqüência de banco de dados. T é refe-rido como o limiar de classificação de palavra vizinha (Altschul e outros, su-pra). Estas buscas de palavras vizinhas iniciais atuam como sementes parainiciar as pesquisas para encontrar HSPs mais longos contendo-as. As bus-cas de palavra são estendidas em ambas as direções ao longo de cada se-qüência contanto que o escore de alinhamento cumulativo possa ser aumen-tado. Os escores cumulativos são calculados empregando, para seqüênciasde nucleotídeo, os parâmetros M (escore de recompensa para um par deresíduos em par; sempre > 0) e N (escore de penalidade para resíduos demá combinação; sempre < 0). Para seqüências de aminoácido, uma matrizde classificação é empregada para calcular o escore cumulativa. A extensãoda busca de palavra em cada direção é parada quando: o escore de alinha-mento cumulativo cai pela quantidade X de seu valor máximo obtido; o esco-re cumulativo vai para zero ou abaixo, devido à acumulação de um ou maisalinhamentos de resíduo de classificação negativa; ou o final de qualquerseqüência é alcançado. Os parâmetros de algoritmo de BLAST W5 T, e Xdeterminam a sensibilidade e velocidade do alinhamento. O programamBLASTN (para seqüências de nucleotídeo) usa como default um tamanho depalavra (W) de 11, uma expectativa (E) ou 10, M = 5, N = -4 e uma compa-ração de ambas linhagens. Para seqüências de aminoácido, o programamBLASTP usa como defaults um tamanho de palavra de 3, e expectativa (E)de 10, e a matriz de classificação BLOSUM62 (vide, Henikoff e Henikoff,Proc. Natl. Acad. ScL USA 89:10915-10919, 1992) alinhamentos (B) de 50,expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4, e uma comparação de ambas linhagens.

O algoritmo de BLAST também realiza uma análise estatísticada similaridade entre duas seqüências (vide, por exemplo, Karlin e Altschul,Proc. Natl. Acad. ScL USA 90:5873-5887, 1993). Uma medição de similari-dade fornecida pelo algoritmo de BLAST é a menor probabilidade de soma(P(N)) que fornece uma indicação da probabilidade pela qual uma combina-ção entre duas seqüências de nucleotídeo ou aminoácido ocorreria por ca-sualidade. Por exemplo, um ácido nucléico é considerado similar a uma se-qüência de referência se a menor probabilidade de soma em uma compara-ção do ácido nucléico de teste com o ácido nucléico de referência for menordo que cerca de 0,2, tipicamente menor do que cerca de 0,01, e mais tipica-mente menor do que cerca de 0,001.

Os homólogos ou ortólogos de gene podem também ser identifi-cados empregando o recurso de HomoIoGene do Centro Nacional para In-formação de Biotecnologia (NCBI). Um homólogo ou ortólogo de um primeirogene pode codificar um produto de gene que tem a mesma função ou umafunção similar como o produto de gene codificado pelo primeiro gene. Outraindicação que duas seqüências de ácido nucléico ou poiipeptídeos são ortó-logas é que o gene heterólogo pode complementar (por exemplo, auxiliar)um alelo nulo do gene endógeno em um sistema de expressão de célula eu-cariótica.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A figura 1 mostra um alinhamento de seqüência de aminoácidodos membros da família de KRP de Arabidopsis com os membros da famíliade Brassica Krp. As seqüências foram obtidas do Arabidopsis KRPs do ban-co de dados público: AtKrpI (Genbank N5. U94772) (SEQ ID NO:2); AtKrp2(Genbank Ns. CAB76424) (SEQ ID NO:3); AtKrp3 (Genbank No.CAC41617)(SEQ ID NO:4); AtKip4 (Genbank Ne. CAC41618) (SEQ ID NO:5); AtKrp5(Genbank Ns. CAC41619) (SEQ ID NO:6); AtKrp. (Genbank Ns. CAC41620)(SEQ ID NO:7); e AtKrp7 (Genbank No. CAC41621) (SEQ ID NO:8). As se-qüências para os KRPs de Brassica (BnKrpI (SEQ ID NO:68), BnKrp3 (SEQID NO:69), BnK.4 (SEQ ID N0:70), BnKrp5 (SEQ ID NO:71), e BnKrp. (SEQID NO:72)) foram obtidas como descrito no Exemplo 1, infra. Também mos-trada é a seqüência de aminoácido para p27 (SEQ ID NO:73).

A figura 2 mostra um alinhamento de seqüência de aminoácidode domínios de ligação de CDK e ciclina de milho (SEQ ID NO:9), canola,soja (SEQ ID NO:11), álamo (SEQ ID NO:12), tabaco (SEQ ID NO:13), trigo,arroz (SEQ ID NO:15), e batata (SEQ ID NO:16), ilustrando o grau elevadode identidade de seqüência dentro do domínio de ligação de CDK.

A figura 3 mostra as seqüências de ácido nucléico de BnKrpImutante que foram códon otimizado para expressão em milho, codificandopara ou BnKrpI F151 A;153A (SEQ ID NO:74) ou BnKrpI Y149A; F151A;F153A (SEQ ID NO:75).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção compreende composições e métodos paramodular a divisão de célula de planta. Em particular, são fornecidos polipep-tídeos que antagonizam a função da proteína de CKI tipo silvestre por ummecanismo negativo dominante, como também polinucleotídeos relaciona-dos, células hospedeiras, plantas transgênicas, e métodos para uso destes.Uma ampla variedade de vetores transgênicos, contendo um polinucleotídeocodificando uma variante, polipeptídeo de CKI negativo dominante, pode serempregada para praticar a presente invenção. Quando os transgenes de CKIda presente invenção são introduzidos em plantas e expressados, a divisãode célula de planta é modulada. A modulação de divisão de célula pode o-correr em toda a planta ou em um tecido ou órgão de maneira específicadependendo do tipo de seqüência promotora operavelmente ligada ao trans-gene de CKI variante. Em particular, as composições e métodos fornecidosaqui podem ser empregados para acelerar a progressão de células de plantapelo ciclo celular, com um aumento concomitante na proliferação celular.Usar as composições e métodos desta maneira permite, por exemplo, a ge-ração de produções de colheita e/ou tamanho de semente aumentados emquaisquer de uma ampla variedade de plantas. Um aumento na produção decolheita pode incluir, por exemplo, tecido de folha aumentado, fruto aumen-tado, produção de flor aumentada, massa de raiz aumentada, e similares.

Em modalidades particulares da invenção, o polipeptídeo de CKIvariante é um membro da família de KRP. Este aspecto da presente inven-ção é com base, pelo menos em parte, na descoberta que a região de liga-ção de CDK de membros da família de KRP, é principalmente responsáveispela inibição de complexos de ciclina-CDK. Desse modo, alvejar a região deligação de CDK em membros da família de KRP (quando oposto à região deligação de ciclina) permite a geração de proteínas mutante que são antago-nistas negativos dominantes particularmente eficazes de função de CKI tiposilvestre.

Polipeptídeos de CKI Mutantes, Ácidos Nucléicos, e Vetores

Os polipeptídeos de CKI da presente invenção são proteínasmutantes ou variantes distinguíveis de CKIs de ocorrência natural ou tiposilvestre. Os polipeptídeos de CKI variantes compreendem pelo menos umamodificação, com relação a um polipeptídeo de CKI de referência (por e-xemplo, uma proteína de CKI tipo silvestre), na região de ligação de ciclinaou CDK da proteína. As modificações típicas incluem substituições, inser-ções, e/ou deleções de aminoácido quando comparado à seqüência tipo sil-vestre correspondente. As modificações particularmente adequadas sãosubstituições de aminoácido. Em certas modalidades, o polipeptídeo de CKIvariante compreende pelo menos uma modificação não conservadora (porexemplo, uma substituição).

Os polipeptídeos de CKI mutante da presente invenção são pro-teínas negativas dominantes. A abordagem negativa dominante é particu-larmente tratável por polipeptídeos de CKI que tem duas regiões de polipep-tídeo separadamente envolvidas em ligação de CDK e ciclina. A abordagemgeral para criar os mutantes negativos dominantes da presente invençãoinclui modificar uma das regiões de ligação de ciclina e CDK individuais paramodificar a ligação de ciclina ou CDK "tipo silvestre". Esta região de ligaçãode CDK ou ciclina modificada pode resultar em ligação equivalente, reduzidaou eliminada a ciclina ou CDK comparado com polipeptídeo tipo silvestre.Em qualquer caso, a mutação reduziria ou eliminaria a atividade inibidora deCKIs cinase, além de designar um polipeptídeo de CKI negativo dominanteque pode interferir com a função tipo silvestre, o polipeptídeo mutante deve(1) substancialmente se ligar aos complexos de ciclina/CDK; (2) não subs-tancialmente inibir o complexo de CDK ciclina até mesmo em concentraçõeselevadas; e (3) competir com polipeptídeo de CKI do tipo silvestre para seligar ao complexo de ciclina/CDK. Em vivo, os polipeptídeos de CKI mutanteque cumprem todas estas exigências resultam em atividade de ciclina/CDKcinase elevada na célula, que sucessivamente leva a proliferação de célulaaumentada e um índice mitótico mais elevado que no final das contas levaàs plantas com produção aumentada, sementes maiores, e/ou algumas ou-tras características associadas com uma atividade de ciclina/CDK cinaseelevada em uma ou mais regiões da planta.

No caso particular de polipeptídeos de KRP, a região de ligaçãode CDK, que é principalmente responsável pela inibição de ciclina/CDK ci-nase nesta família de polipeptídeos de CKI1 é alvejada para modificação.

As modificações particularmente adequadas incluem substitui-ções, inserções, ou deleções de aminoácido. Por exemplo, as substituiçõesde aminoácido podem ser geradas como modificações no CDK ou na regiãode ligação de ciclina que reduz ou elimina a ligação. Similarmente, as substi-tuições de aminoácido podem ser geradas como modificações no CDK ou naregião ligação de ciclina que reduzem ou eliminam a atividade inibidora deCKI. Em modalidades típicas, pelo menos uma substituição, inserção, oudeleção de aminoácido não conservador no CDK ou na região de ligação déciclina é feita para romper ou modificar a ligação do polipeptídeo de CKI auma proteína de ciclina ou CDK.

Os polipeptídeos de CKI mutantes substitucionais são aquelesque têm pelo menos um resíduo de aminoácido em uma seqüência de prote-ína de CKI de referência removida e um aminoácido diferente inserido emseu lugar na mesma posição. As substituições podem ser únicas, onde so-mente um aminoácido na molécula foi substituído, ou elas podem ser múlti-plas, onde dois ou mais aminoácidos foram substituídos na mesma molécu-la. As alterações significativas na atividade das moléculas de proteína deCKI da presente invenção podem ser obtidas substituindo-se um aminoácidocom outro cuja cadeia lateral seja significantemente diferente na carga e/ouestrutura daquela do aminoácido nativo, um aminoácido com uma carga o-posta daquela do aminoácido nativo, ou um aminoácido com a hidrofobicida-de oposta daquela do aminoácido nativo, e outro. Estes tipos de substitui-ções seriam esperados afetar a estrutura da cadeia principal de polipeptídeoe/ou da carga ou hidrofobicidade da molécula na área da substituição. Emcertas, modalidades exemplares da presente invenção, um CKI mutantesubstitucional inclui a substituição de um resíduo de não alanina com alani-na. Em outras variações, o CKI substitucional inclui substituição de um resí-duo de aminoácido com, por exemplo, um aminoácido opostamente carre-gado, um resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral maior, um aminoá-cido com a hidrofilicidade oposta, um aminoácido não polar pequeno (porexemplo, Cys, Thr, Ser, Ala, ou Gly), ou um aminoácido polar (por exemplo,Pro, Glu, Asp, Asn1 ou Gln).

Os polipeptídeo de CKI mutantes insercionais são aqueles comum ou mais aminoácidos inseridos imediatamente adjacente a um aminoáci-do em uma posição particular na molécula de proteína de CKI de referência.Imediatamente adjacente a um aminoácido, significa conectado a grupo a-cárbóxi ou α-amino funcional do aminoácido. A inserção pode ser um oumais aminoácidos. A inserção pode consistir, por exemplo, em um ou doisaminoácidos conservadores. Os aminoácidos similares na carga e/ou estru-tura aos aminoácidos adjacentes ao sítio de inserção são definidos comoconservadores. Alternativamente, CKI mutante inclui a inserção de um ami-noácido com uma carga e/ou estrutura que seja substancialmente diferentedos aminoácidos adjacentes ao sítio de inserção.

Os polipeptídeos de CKI mutantes delecionais são aqueles ondeum ou mais aminoácidos nas moléculas de proteína de CKI de referênciaforam removidos, em algumas modalidades, os mutantes delecionais terãoum, dois ou mais aminoácidos deletados em uma região particular da molé-cula de proteína de CKI. Os mutantes delecionais podem incluir, por exem-plo, mutantes tendo uma truncação da amino ou carbóxi terminação.

Os métodos da presente invenção podem ser aplicados a qual-quer membro reconhecido da família de CKI de proteínas nas quais regiõesindividuais são envolvidas na ligação de proteínas de ciçlina e CDK para ini-bir a função de CDK. Em uma modalidade, as proteínas de CKI mutantessão mutações ou variantes de proteínas que pertencem à família de KRP deCKIs. Como notado acima, a região de ligação de CDK de membros da famí-lia de KRP é principalmente responsável pela inibição de cinase. Conse-qüentemente, a região de ligação de CDK é preferivelmente alvejada paramodificação no desígnio de polipeptídeos de CKI de KRP variante. A regiãode ligação de CDK de proteínas de KRP geralmente corresponde aos ami-noácidos 145-168 de Krpl de Brassica napus (BnKrpI) (SEQ ID NO: 17).Em certas modalidades, a modificação da região de ligação de CDK de ummembro da família de KRP compreende modificação de pelo menos umaposição de aminoácido, duas posições de aminoácido, ou mais dentro daregião que corresponde às posições 145-168 de BnKRPI. (A região corres-pondente em Krpl de Arabidopsis thaüana compreende aminoácidos 167-190). As posições de aminoácido particularmente adequadas para modifica-ção incluem aquelas posições que correspondem aos aminoácidos 145, 148,149, 151, 153, 155, 163, 164, 165, e/ou 167 de Krpl de Brassica napus (Bn-Krpl). Os resíduos de aminoácido correspondentes em outro polipeptídeo deCKI são facilmente determinados por alinhamento de seqüência que usamétodos conhecidos e como também descrito aqui.

Em cada caso, os aminoácidos mencionados acima são conser-vados em p27 de mamífero e todos contatam o CDK na estrutura cristalinade p27complexo com Ciclina A e CDK2. Em uma modalidade, a modificaçãoda região de ligação de CDK de KRP compreende modificação de aminoáci-dos que corresponde à posição de aminoácido 151 e 153 de BnKRPI (porexemplo, uma substituição de aminoácido, tal como, por exemplo, por alani-na ou um aminoácido de modo oposto carregado, em cada destes sítios).Em outras variações exemplares, além de modificação de aminoácidos quecorrespondem às posições 151 e 153 de BnKRPI, a modificação da regiãode ligação de que CDK de KRP também inclui modificação(s) na posição (s)correspondendo ao aminoácido(s) 149, 164, e/ou 165 de BnKRPI (por e-xemplo, uma substituição de aminoácido adicional em uma posição que cor-responde ao aminoácido 149 de BnKRPI; ou duas substituições de aminoá-cido adicionais nas posições que correspondem a ambos aminoácido 164 eaminoácido 165 de BnKRPI). Tal modificação(s) para o polipeptídeo de CKIde KRP modifica a afinidade de ligação a uma proteína de CDK, ao mesmotempo em que substancialmente preservando a capacidade da proteína va-riante de ligar uma proteína de ciclina.

A modificação da região de ligação de CDK de Krp de interesseparticular inclui, porém não está limitado, às modificações que correspondema quaisquer das seguintes substituições de aminoácido:BnKrpI F145A;Y149ABnKrpI F145A;Y149A;F151ABnKrpI F145A;Y149A;F151A;F153A

BnKrpI Y149A;F151ABnKrpI Y149A;F153ABnKrpI F151A;F153ABnKrpI F151A;F153A;Y149ABnKrpI F151A;F153A;E164A

BnKrpI F151A;F153A;W165ABnKrpI F151 A;F153A;E164A;W165ABnKrpI F151A;F153A;Y149A;E164ABnKrpI F151A;F153A;Y149A;W165ABnKrpI F151A;F153A;Y149A;E164A;W165A

BnKrpI E164A;W165A

Em certas modalidades, o polipeptídeo de CKI modificado comoacima é BnKrpI. Em outras variações, o CKI modificado como acima não éBnKrpI (por exemplo, Arabidopsis thaliana), com os aminoácidos substituí-dos correspondendo àqueles apresentados acima.

Outras modificações (por exemplo, substituições, inserções, de-leções) que afetam a ligação de CDK ou ciclina, incluindo modificações adi-cionais nos membros da família de KRP, podem ser identificadas empregan-do uma variedade de técnicas, incluindo métodos de alinhamento estrutural,métodos de alinhamento de seqüência e similares. As proteínas mutantes ouvariantes podem ser geradas, por exemplo, empregando um sistema PDA®previamente descrito nas Patentes dos Estados Unidos Nss. 6.188.965;6.296.312; e 6.403.312; varredura de alanina (vide, Patente dos EstadosUnidos Ns. 5.506.107), varredura de gene (WO 01/25277), mutagênese desaturação de sítio, campo médio, homologia de seqüência, ou outros méto-dos conhecidos por aqueles versados na técnica que guiam a seleção detipos e sítios de mutação de ponto, como descrito também descrito aqui pos-teriormente.

As variantes de polipeptídeo de CKI da presente invenção po-dem ser construídas mutando-se as seqüências de DNA que codificam oCKI tipo silvestre correspondente, ou outro CKI correspondente do qual avariante seja derivada, tal como empregando técnicas geralmente referidascomo mutagênese direcionada ao sítio. As moléculas de ácido nucléico codi-ficando as proteínas de CKI podem ser mutadas por uma variedade de téc-nicas de reação em cadeia de polimerase (PCR) bem-conhecidas por al-guém versado na técnica. (Vide, por exemplo, PCR Strategies (M. A. Innis,D. H. Gelfand1-e J. J. Sninsky eds., 1995, Academic Press, San Diego, CA)no Capítulo 14); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (M. A.Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky, e T. J. White eds., Academic Press, NY,1990). Além disso, os métodos de mutagênese químicos e/ou de radiaçãobem-conhecidos são bem-conhecidos na técnica e podem ser empregadospara induzir mutações nas regiões de codificação de proteínas do membrofamiliar de KRP. A avaliação pode ser realizada para localizar aquelas plan-tas que poderiam compreender uma seqüência de nucleotídeo desejada co-dificando um Krp mutante ou variante da presente invenção. As plantas po-dem ser avaliadas quanto às alterações na seqüência de aminoácido doCKI, alterações na atividade de cinase ou as alterações esperadas no fenó-tipo seguido por análise de seqüência.

Como forma de exèmplo não limitante, os dois sistemas iniciado-res utilizados no kit de Mutagênese Direcionada ao Sítio Transformadora deClontech, podem ser empregados para introduzir mutantes direcionados aosítio em um gene codificando uma proteína de CKI. Seguinte a desnaturaçãodo plasmídeo-alvo neste sistema, dois iniciadores são simultaneamente ane-Iados ao plasmídeo; um destes iniciadores contém a mutação direcionada aosítio desejada, o outro contém uma mutação em outro ponto no plasmídeoque resulta na eliminação de um sítio de restrição. A segunda síntese delinhagem é realizada então, firmemente ligando estas duas mutações, e osplasmídeos resultantes são transformados em uma linhagem mutS de E.coli. O DNA de plasmídeo é isolado das bactérias transformadas, restritocom a enzima de restrição relevante (desse modo Iinearizando os plasmí-deos não mutados), e em seguida retransformado em E. coli. Este sistemapermite a geração de mutações diretamente em um plasmídeo de expres-são, sem a necessidade de subclonagem ou geração de fagemídeos de fi-lamento único. A ligação estrita das duas mutações e a linearização subse-qüente de plasmídeos não mutados, resultam na eficiência de mutação ele-vada e permite avaliação mínima. Seguinte a síntese do iniciador de sítio derestrição inicial, este método requer o uso de somente um novo tipo de inici-ador por sítio de mutação. Em vez de preparar cada mutante posicionai se-paradamente, um grupo de iniciadores de oligonucleotídeo "degeneradosdesignados" pode ser sintetizado para introduzir todas as mutações deseja-das em um determinado sítio simultaneamente. Os transformantes podemser avaliados sequenciando-se o DNA de plasmídeo pela região mutageni-zada para identificar e classificar os clones mutantes. Cada DNA de mutantepode então ser restrito e analisado por eletroforese, tal como, por exemplo,em um gel de Realce de Detecção de Mutação (J. T. Baker) para confirmarque nenhuma outra alteração na seqüência tenha ocorrido (por comparaçãode deslocamento de faixa para o controle não mutagenizado). Alternativa-mente, a região de DNA total pode ser seqüenciada para confirmar que ne-nhum evento mutacional adicional ocorreu fora da região-alvo.

Os dúplices mutantes verificados no vetor de super expressãode pET (ou outro) podem ser empregados para transformar E. coli tal comolinhagem de pLysS de E. coli BL21 (DE3), para produção de nível elevadoda proteína de mutante, purificação por protocolos padrões. O método demapeamento de FAB-MS pode ser empregado para rapidamente verificar afidelidade de expressão de mutante. Esta técnica fornece segmentos de se-qüenciamento em toda a proteína inteira e fornece a confiança necessáriana designação da seqüência, em uma experiência de mapeamento destetipo, a proteína é digerida com uma protease (a escolha dependerá da regi-ão específica a ser modificada desde que este segmento seja de interesseprincipal e que o mapa restante deva ser idêntico ao mapa de proteína napmutagenizada). O grupo de fragmentos de clivagem é fracionado por, porexemplo, HPLC de microboro (fase reversa ou permuta de íon, dependendonovamente da região específica a ser modificada) para fornecer vários pep-tídeos em cada fração, e os pesos moleculares dos peptídeos são determi-nados através de métodos padrões, tal como FAB-MS. A massa determina-da de cada fragmento é então comparada aos pesos moleculares de peptí-deos esperados da digestão da seqüência predita, e a correção da seqüên-cia rapidamente averiguada. Considerando que esta abordagem de mutagê-nese para modificação de proteína é direcionada, o seqüenciamento do pep-tídeo alterado não deveria ser necessário se os dados de MS concordaremcom a predição. Se necessário verificar um resíduo alterado, CAD-tandemMS/MS pode ser empregado para seqüenciar os peptídeos da mistura emquestão, ou o peptídeo-alvo pode ser purificado para degradação de Edmansubtrativa ou digestão de carboxipeptidase Y que depende do local da modi-ficação.

No desígnio de uma mutagênese direcionada ao sítio particular,é geralmente desejável primeiro tornar uma substituição não conservadora edeterminar (a) se a atividade de ligação de CDK ou ciclina alvejada é preju-dicada e (b) se qualquer atividade não alvejada (por exemplo, ligação deciclina se a região de ligação de CDK for alvejada) é grandemente prejudi-cada como uma conseqüência. Se o resíduo é por este meio demonstradoser importante para uma atividade biológica não alvejada, então substitui-ções conservadoras podem ser feitas.

Outras técnicas de mutagênese direcionada ao sítio tambémpodem ser empregadas com seqüências de nucleotídeo de CKI. Por exem-pio, a digestão de endonuclease de restrição de DNA seguida por ligaçãopode ser empregada para gerar variantes de deleção de CKIs, como geral-mente descrito na seção 15.3 de Sambrook e outros, Molecular Cloning: ALaboratory Manual (2- Ed., 1989 Cold Spring Harbor Laboratory Press, NovaIorque, NY). Uma estratégia similar pode ser empregada para construir vari-antes de inserção, como descrito na seção 15.3 de Sambrook e outros, su-pra. Mais recentemente Zhu e outros (Proc. Natl. Acad. ScL USA 96:8768-8773,1999) legaram um método de alvejamento de mutações para genes deplanta in vivo empregando oligonucleotídeos de RNA/DNA quiméricos.

Os polipeptídeos mutantes, com mais do que um aminoácidosubstituído, podem ser gerados em um dos vários modos. Se os aminoáci-dos estão localizados próximos uns aos outros na cadeia de polipeptídeo,eles podem ser mutados simultaneamente empregando um oligonucleotídeoque codifica para todas as substituições de aminoácido desejadas. Se entre-tanto, os aminoácidos estão localizados um pouco distantes um do outro(separados por mais do que dez aminoácidos, por exemplo), é mais difícil degerar um único oligonucleotídeo que codifique todas as alterações deseja-das. Ao contrário, um dos dois métodos alternativos pode ser empregado.

No primeiro método, um oligonucleotídeo separado é gerado para cada ami-noácido a ser substituído. Os oligonucleotídeos são então anelados ao DNAmodelo de filamento único simultaneamente, e o segundo filamento de DNAque é sintetizado do modelo codificará todas as substituições de aminoácidodesejadas. Um método alternativo envolve dois ou mais ciclos de mutagêne-se para produzir o mutante desejado. O primeiro ciclo é como descrito paraos mutantes únicos: DNA de CKI tipo silvestre é empregado para o modelo,um oligonucleotídeo codificando a primeira substituição(s) de aminoácidodesejada é anelado a este modelo, e a molécula de DNA de heterodúplex éentão gerada. O segundo ciclo de mutagênese utiliza o DNA mutado produ-ziu no primeiro ciclo de mutagênese como o modelo. Desse modo, este mo-delo já contém uma ou mais mutações. O oligonucleotídeo codificando assubstituições de aminoácido desejadas adicionais é então reanelado a estemodelo, e o filamento resultante de DNA agora codifica mutações de amboso primeiro e segundo ciclo de mutagênese. Este DNA resultante pode serempregado como um modelo em um terceiro ciclo de mutagênese, e assimpor diante.

Uma técnica particularmente adequada para guiar identificaçãode modificações adequadas, inclui alinhar proteínas de CKI por alinhamentode seqüência.. Há várias metodologias de alinhamento de seqüência descri-tas acima que podem ser empregadas. Os programas de alinhamento combase em seqüência, por exemplo, incluem pesquisas de Smith-Waterman,Needleman-Wunsch, Double Affine Smith-Waterman, pesquisa de estrutura,pesquisa de perfil Gribskov/GCG, varredura de perfil Gribskov/GCG, pesqui-sa de estrutura de perfil, perfis generalizados de Bucher, modelos de HiddenMarkov, Hframe, Estrutura Dupla, BLAST, Psi-BLAST, Clustal, e GeneWise.(Vide, por exemplo, Altschul e outros, J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990; Alts-chul e outros, Nucleic Aeids Res. 25:3389-3402, 1997, ambos incorporadospor referência).

As seqüências de aminoácido de polipeptídeos de CKI relacio-nados podem ser alinhadas, por exemplo, em um alinhamento de seqüênciamúltiplo (MSA). (Vide, por exemplo, figura 1). O MSA também pode ser em-pregado para estender informação estrutural conhecida por um ou mais poli-peptídeos de CKI aos polipeptídeos de CKI adicionais (tipicamente para po-lipeptídeos de CKI que compartilham identidade de seqüência substancial)que possam ainda não ter sido identificado. Devido à extensão elevada dehomologia estrutural entre polipeptídeos de CKI diferentes, o MSA pode serempregado como um preditor seguro dos efeitos de modificações em váriasposições no alinhamento. Conseqüentemente, no caso de membros familia-res de KRP, por exemplo, a numeração e seqüência de CKI mostradas nafigura 1 podem ser empregadas como um ponto de referência de MSA paraqualquer outra seqüência de proteína de membro familiar de KRP. Comopreviamente notado, as posições de aminoácido particularmente adequadasincluem aquelas correspondendo às posições de aminoácido 145, 148, 149,151, 153, 155, 163, 164, 165 e/ou 167 de KRP1 de Brassica napus (BnKrpI).Ao empregar o alinhamento descrito na figura 1, e/ou empregar os progra-mas de alinhamento conhecidos na técnica como aqueles descritos aqui,alguém pode usar como um ponto de referência o sistema de numeração doprograma de alinhamento e pode correlacionar as posições relevantes dopolipeptídeo de CKI com posições equivalentes em outros membros reco-nhecidos de CKIs ou homólogos estruturais e famílias. Métodos similarespodem ser empregados ou o alinhamento da seqüência (s) de aminoácidode polipeptídeo de CKI que já tenha sido seqüenciado.

Em -certos casos, os aminoácidos no polipeptídeo de CKI queinteragem com uma proteína de ciclina ou CDK podem ser identificados dire-tamente de uma estrutura tridimensional de um complexo de CKI/CDK ouCKI/ciclina. Informação equivalente pode ser derivada por análise do com-plexo de CKI/CDK ou CKI/ciclina de um polipeptídeo de CKI relacionado.Desse modo, os alinhamentos estruturais podem ser empregados para geraro polipeptídeos de CKI variantes da invenção. Há uma ampla variedade deprogramas de alinhamento estrutural conhecida na técnica. Vide, por exem-plo, VAST do site da Web NCBI; SSAP (Orengo e Taylor, Methods Enzymol.266:617-635, 1996); SARF2 (Alexandrov, Protein, Eng. 9:727-732, 1996) CE(Shinydyalov e Bourne, Protein Eng. 11:739-747, 1998); (Orengo e outros,Structure 5:1093-108, 1997; Dali (Holm e outros, Nucl. Acid Res. 26:316-9,1998 todos dos quais estão incorporados por referência)).

Conseqüentemente, modificações úteis em interfaces deCKI/CDK ou CKI/ciclina podem ser selecionadas empregando os algoritmosde modelagem ou desígnio de proteína tal como tecnologia PDA® (vide, Pa-tentes dos Estados Unidos Nss. 6.188.965; 6.269.312; e 6.403.312, dessemodo incorporadas por referência). Os algoritmos nesta classe geralmenteusam funções de classificação de nível de aminoácido òu nível atômico paraavaliar a compatibilidade de seqüências de aminoácido com a estrutura ter-ciária ou quaternária total de uma proteína. Desse modo, os algoritmos destaclasse podem ser empregados para seiecionar rompimentos e/ou modifica-ções de ligação de CDK ou ciclina que substancialmente não perturbam acapacidade de proteínas de CKI variantes de corretamente dobrar e interagircom alvos de ocorrência natural que correspondem às regiões não modifica-das da proteína. Estas tecnologias tipicamente usam informação estruturalde alta resolução da proteína-alvo como entrada. Em uma modalidade, umaestrutura experimentalmente determinada da proteína de CKI apropriada éempregada como entrada. Em modalidades alternativas, um MSA pode serempregado para guiar a construção de modelos de homologia de nível atô-mico para membros de CKI com base no subgrupo da família cujas estrutu-ras tridimensionais tenham sido determinadas empregando métodos relacio-nados ou cristalográficos. Em ainda outra modalidade, o modelo estruturalde interface de p27/ciclina de mamífero pode ser empregado para predizer oresíduo de aminoácido de contato para CKI de planta.

Os polipeptídeos de CKI mutantes que têm ligação modificada,por exemplo, reduzida para uma proteína de CDK ou ciclina também podemser identificados por uma grande variedade de outro métodos, incluindo, porexemplo, evolução direcionada (por exemplo, PCR propenso a erro, emara-nhamento de DNA, e similares), a mutagênese de saturação de sítio único, emutagênese de varredura de alanina. No caso de CKIs KRP, por exemplo, ouso destes e/ou outros métodos pode permitir para a identificação de modifi-cações adicionais que reduzem a atividade de ligação de CDK e que se en-contra fora da região de ligação de CDK descrita aqui.

Além disso, cálculos dinâmicos moleculares podem ser empre-gados para computacionalmente avaliar as seqüências calculando-se indivi-dualmente as classificações de seqüência mutante e compilando uma lista.Além disso, potenciais de par de resíduo podem ser empregados para clas-sificar as seqüências (Miyazawa e outros, Macromolecules 18: 534-552,1985, incorporados aqui por referência) durante avaliação computacional.

Alternativamente, as bibliotecas de proteínas de CKI variantespodem ser feitas para testar. Por exemplo, uma biblioteca de seqüências deaminoácido de CKI variantes pode ser empregada para designar os ácidosnucléicos codificando as seqüências de CKI variantes e que pode então serclonada em células hospedeiras, expressadas, e analisadas. A escolha decódons, vetores de expressão adequados, e células hospedeiras adequa-das, tipicamente variarão dependendo de vários fatores, e pode ser facil-mente otimizada quando necessário.

Em um método particularmente adequado para avaliar bibliote-cas de mutantes testando quanto à atividade antagonista negativa dominan-te e/ou outras atividades desejadas como descrito aqui, reações de PCRmúltiplas com oligonucleotídeos agrupados são realizadas. Os oligonucleotí-deos de sobreposição são sintetizados os. quais correspondem ao gene detamanho natural. Estes oligonucleotídeos podem representar todos os ami-noácidos diferentes em cada posição variante ou subgrupos. Estes oligonu-cleotídeos podem ser agrupados em proporções iguais e reações de PCRmúltiplas realizadas para criar seqüências de tamanho natural que contêmas combinações de mutações definidas pela biblioteca. Além disso, isto podeser feito empregando métodos de PCR propensos ao erro.

Tipicamente, cada oligonucleotídeo de sobreposição compreen-de somente uma posição a ser variada. Alternativamente, as posições vari-antes estão muito próximas uma a outra, para permitir que esta e variantesmúltiplas por oligonucleotídeo sejam empregadas para permitir a recombina-ção completa de todas as possibilidades (isto é, cada oligo pode conter ocódon para uma única posição sendo mutada, ou para mais do que uma po-sição sendo mutada). As múltiplas posições sendo mutadas estão preferi-velmente próximas da seqüência para impedir o comprimento de oligo nu-cleotídeo de ser não prático. Para mutar posições múltiplas em um oligonu-cleotídeo, combinações particulares de mutações podem ser incluídas oupodem ser excluídas na biblioteca incluindo-se ou excluindo-se o oligonucle-otídeo codificando aquela combinação. Por exemplo, como descrito aqui,pode haver correlações entre regiões variáveis; isto é, quando a posição X éum certo resíduo, posição Y deve (ou não deve) ser um resíduo particular.Estes grupos de posições variáveis às vezes são referidos aqui como um"agrupamento". Quando os agrupamentos são compreendidos de resíduospróximos uns dos outros, e desse modo pode residir em um iniciador de oli-gonucleotídeo, os agrupamentos podem ser ajustados às "boas" correla-ções, e eliminam as combinações ruins que podem diminuir a efetividade dabiblioteca. Porém, se os resíduos do agrupamento distantes da seqüência, edesse modo residirá em oligonucleotídeos diferentes para síntese, eles po-dem ser desejáveis para ajustar os resíduos à correlação "boa", ou os elimi-na completamente como resíduos variáveis. Alternativamente, a bibliotecapode ser gerada em várias etapas, de forma que as mutações de agrupa-mento somente apareçam juntas. Este procedimento, isto é, o procedimentode identificar os agrupamentos de mutação e colocá-los no mesmo oligonu-cleotídeo ou eliminá-los da biblioteca ou geração de biblioteca em váriospassos preservando os agrupamentos, pode consideravelmente enriquecera biblioteca com proteína corretamente dobrada. A identificação dos agru-pamentos pode ser realizada por vários modos, por exemplo, empregando-se métodos de reconhecimento padrão conhecidos, comparações de fre-qüências de ocorrência de mutações ou empregando-se análise de energiadas seqüências a serem experimentalmente geradas (por exemplo, se a e-nergia de interação for alta, as posições são correlacionadas). Estas correla-ções podem ser correlações posicionais (por exemplo, posições variáveis 1e 2 sempre alteram juntas ou nunca alteram juntas) ou correlações de se-qüência (por exemplo, se há resíduo A na posição 1, há sempre resíduo Bna posição 2). (Vide, Pattern Discovery in Biomolecular Date: Tools, Techni-ques, e Applications; (Jason T. L. Wang, Bruce A. Shapiro, Dennis Shashaeds., New York, Oxford University, 1999); e rews, Introduction to Mathemati-cal Techniques in Pattern Recognition (New York, Wiley-lnterscience, 1972);Applications of Pattern Recognition (K. S. Fu ed., Boca Raton, FL, CRCPress, 1982); Genetic Algorithms for Pattern Recognition (Sankar K. Pal ePaul P. Wang eds., Boca Raton, FL1 CRC Press, 1996); Pandya, Pattern Re-cognition with Neural Networks in C++ (Boca Raton, FL, CRC Press, 1996;Handbook of Pattern Recognition & Computer Vision (C. H. Chen, L. F. Pau,amd P. S. P. Wang, eds., 2a ed. Singapore; River Edge, N. J., World Scienti-fie, 1999); Friedman, Introduction to Pattern Recognition: Statistical, Structu-ral, Neural, e Fuzzy Logic Approaches (River Edge; NJ., World Scientific,1999, Series title: Series in machine perception e artificial intelligence; vol.32); todos dos quais estão expressamente incorporados por referência. Alémdisso, os programas empregados para pesquisar quanto aos motivos deconsensos podem ser empregados também.

Os oligonucleotídeos com inserções ou deleções de códons po-dem ser empregados para criar uma biblioteca expressando proteínas decomprimento diferente. Em particular, a avaliação de seqüência computacio-nal quanto às inserções ou deleções pode resultar em bibliotecas secundá-rias que definem proteínas de comprimento diferentes, que podem ser ex-pressas por uma biblioteca de oligonucleotídeo agrupado de comprimentosdiferentes.Em outra modalidade, os polipeptídeos de CKI mutantes da in-venção são criados embaralhando-se uma família (por exemplo, um grupode mutantes); isto é, alguns grupos das seqüências de topo (se uma listaclassificada-ordenada for empregada) podem ser embaralhados, com ousem PCR propenso ao erro. "Emaranhamento" neste contexto significa umarecombinação de seqüências relacionadas, geralmente de um modo aleató-rio. Pode incluir "embaralhar" como e definido exemplificado nas Patentesdos Estados Unidos Nes. 5.830.721; 5.811.238; 5.605.793; 5.837.458 e PCTUS/19256 todas das quais estão aqui incorporadas por referência.

Este grupo de seqüências também pode ser um grupo artificial;por exemplo, de uma tabela de probabilidade (por exemplo, gerada empre-gando SCMF) ou um grupo de Monte Cario. Similarmente, a "família" podeser as 10 seqüências de topo e as 10 seqüências de base, as 100 seqüên-cias de topo, e similares. Isto também pode ser feito empregando PCR pro-penso ao erro.

Desse modo, em ambiente virtual o emaranhamento pode serrealizado empregando os métodos computacionais descritos aqui (por e-xemplo, iniciando com duas bibliotecas ou duas seqüências, recombinaçõesaleatórias das seqüências podem ser gerada e avaliada).

PCR propenso ao erro pode ser realizado para gerar uma biblio-teca de polipeptídeos de CKI variante. Vide a Patente dos Estados UnidosNss. 5.605.793, 5.811.238, e 5.830.721, que estão desse modo incorporadaspor referência. Isto pode ser feito na seqüência ideal ou nos membros detopo da biblioteca, ou algum outro grupo artificial ou família. Neste método, ogene para a seqüência ideal encontrada na avaliação computacional da bi-blioteca primária pode ser sintetizado. PCR propenso ao erro é então reali-zado no gene de seqüência ideal na presença de oligonucleotídeos que co-dificam para as mutações nas posições variantes da biblioteca (oligonucleo-tídeos de influência). A adição dos oligonucleotídeos criará uma influênciaque favorece a incorporação das mutações na biblioteca. Alternativamente,somente os oligonucleotídeos para certas mutações podem ser empregadospara influenciar a biblioteca.O emaranhamento de gene pode ser realizado com PCR pro-penso ao erro no gene para a seqüência ideal, na presença de oligonucleo-tídeos de influência, para criar uma biblioteca de seqüência de DNA que re-flete a proporção das mutações encontradas na biblioteca de CKI. A escolhados oligonucleotídeos de influência pode ser feita em uma variedade de mo-dos; eles podem ser escolhidos com base em sua freqüência, por exemplo,oligonucleotídeos codificando posições de freqüência mutacional elevadapodem ser empregados; alternativamente, oligonucleotídeos que contêm asposições mais variáveis podem ser empregados, tal que a diversidade sejaaumentada; se a biblioteca secundária é classificada, alguns números deposições de classificação de topo podem ser empregados para gerar oligo-nucleotídeos de influência; posições aleatórias podem ser escolhidas; algu-mas classificações de topo e algumas classificações baixas podem ser esco-lhidas; e os similares. O que é importante é gerar seqüências novas combase nas seqüências e posições variáveis preferidas.

Em outra variação, PCR empregando um gene tipo silvestre ououtro gene pode ser empregado. Nesta modalidade, um gene de partida éempregado (por exemplo, o gene tipo silvestre, o gene codificando a se-qüência otimizada total, ou uma seqüência de consenso obtida, por exemplo,de seqüências homólogas de alinhamento de organismos diferentes). Nestamodalidade, os oligonucleotídeos são empregados os quais correspondemàs posições variantes e contêm os aminoácidos diferentes da biblioteca.PCR é feito empregando iniciadores de PCR na terminação. Isto fornecedois benefícios. Primeiro, isto geralmente requer menos oligonucleotídeos epode resultar em menos erro. Segundo, tem vantagens experimentais pelofato de que se o gene tipo silvestre for empregado, ele não precisa ser sinte-tizado.

Os polipeptídeos de CKI mutantes podem ser de qualquer núme-ro de organismos, com polipeptídeos de CKI de plantas sendo particular-mente preferido. As plantas adequadas incluem, por exemplo, a classe deplantas altas tratáveis por técnicas de transformação, incluindo ambas plan-tas monocotiledôneas e dicotiledôneas, bem como certas plantas mais bai-xas tal como algas. São incluídas as plantas de uma variedade de níveisploidia, incluindo poliplóide, diplóide e haplóide. Em modalidades específi-cas, a planta é Brassica napus, Arabidopsis thaliana, Glicina max, milho, ar-roz, trigo, alfaia, algodão, álamo, e similares.

Como descrito acima, os polipeptídeos de CKI mutantes da in-venção são antagonistas negativos dominantes de polipeptídeo de CKI dotipo silvestre. Em certas modalidades, os Polipeptídeos de CKI mutantesfisicamente interagem com somente uma ou ambas de suas proteínas deciclina ou CDK correspondentes (isto é, a proteína de ciclina ou CDK endó-gena, de ocorrência natural das espécies das quais o CKI mutante foi deri-vado) tal que um complexo de CDK/ciclina compreendendo o CKI mutanteseja protegido para inibição de CDK/ciclina cinase pela proteína de CKI tiposilvestre.

Em uma modalidade alternativa, não mutuamente exclusiva, osPolipeptídeos de CKI mutantes interagem fisicamente com somente uma ouambas as proteínas de ciclina ou CDK heterólogas (isto é, uma proteína deciclina ou CDK de ocorrência natural de uma espécie que é diferente da es-pécie da qual o CKI mutante foi derivado), tal que um complexo doCDK/ciclina heterólogo compreendendo o CKI mutante seja protegido deinibição de CDK/ciclina cinase por uma proteína de CKI tipo silvestre quecorresponde às proteínas de CDK e ciclina no complexo (isto é, por uma pro-teína de CKI tipo silvestre endógena às proteínas de CDK e ciclina).

Em algumas modalidades, os polipeptídeos de CKI mutantes dainvenção são os antagonistas altamente específicos para a proteína de CKItipo silvestre correspondente. Em modalidades alternativas, os polipeptídeosde CKI mutantes da invenção são os antagonistas específicos para mais doque um polipeptídeo de CKI do tipo silvestre. Por exemplo, um polipeptídeode CKI de Arabidopsis mutante pode ser um antagonista específico de umpolipeptídeo de CKI de Arabidopsis tipo silvestre somente, ou específico pa-ra polipeptídeos de CKI tipo silvestre de Arabidopsis, Brassica napus, Glieinamax, milho, arroz, algodão, e/ou álamo. Além disso, um polipeptídeo de CKIde Brassiea mutante pode ser antagonista específico de um polipeptídeo deCKI de Brassica tipo silvestre somente, ou é um antagonista específico parapolipeptídeo de CKI mutante tipo silvestre de Arabidopsis, Brassica napus,Giicina max, milho, arroz, trigo, alfafa, algodão, e/ou álamo.

Os polipeptídeos de CKI mutantes exibem atividade biológicasubstancialmente diminuída quando comparado com o polipeptídeo de CKItipo silvestre, incluindo, por exemplo, ligação modificada a uma de uma pro-teína de CDK ou ciclina é inibição diminuída de complexos de CDK/ciclinacinase. Tal atividade biológica diminuída pode ser testada e validada empre-gando ensaios in vivo e/ou in vitro. Os ensaios adequados incluem, porémnão estão limitados, ensaios de atividade de CDK/ciclina cinase; ensaios deligação de CDK ou ciclina; e ensaios de proliferação celular. Uma diminuiçãosubstancial na atividade biológica quando comparado com polipeptídeo deCKI do tipo silvestre significa que a atividade biológica do polipeptídeo deCKI variante é menor do que 80% ou menor do que 70%, tipicamente menordo que 60% ou menor do que 50%, mais tipicamente menor do que 40% oumenor do que 30%, e preferivelmente menor do que 20% ou menor do que10% que de um polipeptídeo de CKI correspondente do tipo silvestre de.

Em algumas modalidades, o Polipeptídeo de CKI mutante incluiuma modificação, quando comparado com um polipeptídeo de CKI do tiposilvestre, além daqueles descritos aqui (isto é, as proteínas de CKI mutantespodem conter modificações adicionais quando comparadas a uma proteínade CKI do tipo silvestre correspondente exceto aquelas empregadas paragerar proteínas negativas dominantes). Os exemplos incluem, porém nãoestão limitados, às substituições de aminoácido introduzidas para permitirexpressão solúvel em E. coli e substituições de aminoácido introduzidas pa-ra otimizar o comportamento da solução. Além disso, como descrito aqui,quaisquer das mutações descritas aqui podem ser combinadas de qualquermodo para formar polipeptídeos de CKI variantes adicionais. Além disso, ospolipeptídeos de CKI mutantes podem ser feitos os quais sejam mais longosdo que a proteína do tipo silvestre correspondente, por exemplo, pela adiçãode rótulos de purificação ou epitopo, a adição de outras seqüências de fu-são, e similares ou eles podem ser mais curtos.Os polipeptídeos de CKI mutantes também podem ser identifica-dos como sendo codificados por ácidos nucléico de CKI mutantes. No casodo ácido nucléico, a identidade de seqüência total da seqüência de ácidonucléico é comensurável com a identidade de seqüência de aminoácido po-rém leva em conta a degeneração no código genético e influência de códonde organismos diferentes. Conseqüentemente, a identidade de seqüência deácido nucléico pode ser mais baixa ou mais elevada do que aquela da se-qüência de proteína, identidade de seqüência com mais baixa sendo típica.

Como será apreciado por aqueles na técnica, devido à degene-ração do código genético, um número extremamente grande de ácidos nu-cléico pode ser feito, todos dos quais codifica o polipeptídeo de CKI mutanteda presente invenção. Desse modo, tendo identificado uma seqüência deaminoácido particular, qualquer número de ácidos nucléico diferentes codifi-cando a proteína mutante pode ser feito simplesmente se modificando a se-qüência de um ou mais códons de modo que não altere a seqüência de ami-noácido do polipeptídeo de CKI mutante.

Os polipeptídeos de CKI mutantes e ácidos nucléicos da presen-te invenção são preferivelmente recombinantes (a menos que feito sinteti-camente). Como notado supra, os mutantes são tipicamente preparados pormutagênese específica de sítio de nucleotídeos no DNA codificando umaproteína de CKI correspondente, empregando mutagênese de PCR ou cas-sete ou outra técnica bem-conhecida na técnica, para produzir DNA codifi-cando o mutante, e por conseguinte expressando o DNA em cultura de célu-la de recombinante. Os mutantes de seqüência de aminoácido são caracteri-zados pela natureza predeterminada da mutação, uma característica que oscoloca à parte de variação interespécies ou alélilcas de ocorrência natural daseqüência de aminoácido de proteína CKJ mutante. Como descrito acima,as variantes tipicamente exibem ligação similar de uma proteína de ciclinaou CDK (conseqüentemente, quando comparado a uma proteína de CKI dotipo silvestre correspondente, o mutante exibe uma diminuição substancialem sua atividade inibidora; embora as variantes também podem ser selecio-nadas as quais tenham características variantes adicionais).Ao mesmo tempo em que o local ou região para introduzir umavariação de seqüência de aminoácido é predeterminado, a mutação per senão precisa ser predeterminada. Por exemplo, para otimizar o desempenhode uma mutação em um determinado sítio, a mutagênese aleatória pode serconduzida no códon ou região alvo e as proteínas de CKI variantes expres-sas avaliadas quanto à combinação ideal de atividade desejada. As técnicaspara produzir mutações de substituição em sítios predeterminados em DNAque tem uma seqüência conhecida são bem-conhecidas, por exemplo, mu-tagênese de iniciador M13 e mutagênese de PCR. A avaliação dos mutantesé feita empregando ensaios de atividades de proteína CKI mutante para ca-racterísticas ótimas.

Em algumas modalidades, as substituições de aminoácido sãode resíduos únicos. Em outras modalidades, os resíduos de aminoácido múl-tiplos são substituídos (por exemplo, 2, 3, 4, ou mais aminoácidos podem sersubstituídos). As inserções são tipicamente na ordem de cerca de 1 a cercade 20 aminoácidos, embora inserções consideravelmente maiores possamser toleradas. As deleções variam de cerca de 1 a cerca de 20 resíduos, oude cerca de 1 a cerca de 30 resíduos, embora em alguns casos as deleçõespossam ser muito maiores. Em certas modalidades, os polipeptídeos de CKImutantes são quimeras derivadas de duas ou mais proteínas de CKI do tiposilvestre, com pelo menos uma modificação ha região de ligação de CDK ouciclina como descrito aqui.

As substituições, deleções, inserções, ou qualquer combinaçãodestes, são empregadas para chegar a um mutante final. Geralmente, a mo-25 dificação(s) é feita com respeito a relativamente poucos aminoácidos paraminimizar a alteração da molécula. Porém, alterações maiores podem sertoleradas em certas circunstâncias.

Ao usar um ácido nucléico da presente invenção codificando umpolipeptídeo de CKI mutante, uma variedade de vetores pode ser feita.Qualquer vetor que contém seqüências de réplicon e controle que seja deri-vada de uma espécie compatível com a célula hospedeira pode ser empre-gado na prática da invenção. Os vetores podem ser vetores extracromossô-micos de auto-replicação ou vetores que integram em um genoma hospedei-ro. Geralmente, os vetores de expressão incluem regiões de ácido nucléicoreguladoras transcricionais e translacionais operavelmente ligadas ao ácidonucléico codificando o polipeptídeo de CKI mutante. O termo "seqüências decontrole" se refere às seqüências de DNA necessárias para a expressão deuma seqüência de codificação operavelmente ligada em um organismo hos-pedeiro particular. As seqüências de controle que são adequado para proca-riotas, por exemplo, incluem um promotor, opcionalmente uma seqüênciaoperadora, e um sítio de ligação de ribossoma. As regiões reguladoras deácido nucléico transcricionais e translacionais geralmente serão apropriadaspara a célula hospedeira empregada para expressar o polipeptídeo.

Em certas modalidades, os ácidos nucléicos de CKI são modifi-cados para realçar a expressão de gene em célula hospedeira empregandoa otimização de códon, que envolve substituir uma seqüência de códon comum códon de translação (correspondendo ao mesmo aminoácido) que sejaaltamente empregado nas espécies de célula na qual a molécula de DNAdeve ser expressa. Os exemplos de seqüências de codificação de mutanteBnKRPI (BnKrpI F151A; F153A e Y149A; F151A; F153A) que foram otimi-zadas para expressão em milho é mostrado na figura 3. Os procedimentosde otimização de códon são geralmente bem-conhecidos na técnica e po-dem ser empregados por aqueles versados na técnica para obter outras se-qüências de Krpl mutante otimizadas de códon de acordo com a presenteinvenção.

Numerosos tipos de vetores de expressão apropriados, e se-qüências reguladoras adequadas são conhecidos na técnica para uma vari-edade de células hospedeiras. Em geral, as seqüências reguladoras trans-cricionais e translacionais podem incluir, por exemplo, seqüências promoto-ras, sítios de ligação ribossômica, seqüências de partida e interrupção trans-cricionais, seqüências de partida e interrupção translacionais, e seqüênciasrealçadoras e ativadoras. Em modalidades típicas, as seqüências regulado-ras incluem seqüências de partida e interrupção promotoras transcricionais.Os vetores também tipicamente incluem uma região poliligadora que contémvários sítios de restrição para inserção de DNA estrangeiro. A construção devetores adequados que contêm DNA codificando seqüências de replicação,seqüências reguladoras, genes de seleção fenotípicos, e o DNA de CKI vari-ante de interesse, é preparada empregando procedimentos de DNA recom-binante padrão. Os plasmídeos isolados, vetores virais e fragmentos de DNAsão clivados, talhados, e ligados juntos em uma ordem específica para geraros vetores desejados, conrio é bem-conhecido na técnica (vide, por exemplo,Maniatis, supra, e Sambrook e outros, supra).

As seqüências promotoras codificam promotores constitutivos ouinduzíveis. Os promotores podem ser promotores de ocorrência natural oupromotores híbridos. Os promotores híbridos, que combinam elementos demais de um promotor, também são conhecidos na técnica, e são úteis napresente invenção. Em uma modalidade típica, os promotores são promoto-res fortes, permitindo a expressão elevada em células, particularmente célu-Ias de planta. Os promotores particularmente adequados para uso de acordocom a presente invenção são descritos também infra.

Além disso, o vetor de expressão pode compreender elementosadicionais. Por exemplo, o vetor de expressão pode ter dois siistemas de re-plicação, desse modo permitindo ser mantido em dois organismos, por e-xemplo, em células de planta ou inseto para expressão em um hospedeiroprocariótíco para clonagem e amplificação. Além disso, para vetores de ex-~pressão de interação, o vetor de expressão contém pelo menos uma se-qüência homólogo ao genoma de célula hospedeira, e preferivelmente duasseqüências homólogas que flanqueiam o constructo de expressão. O vetorde integrando pode ser direcionado para um loco específico na célula hos-pedeira selecionando-se a seqüência homóloga apropriada para inclusão novetor. Os constructos para vetores de integração são bem-conhecidas natécnica.

Em certas modalidades, o vetor de expressão contém um genemarcador selecionável para permitir a seleção de células hospedeiras trans-formadas. Os genes de seleção são bem-conhecidos na técnica e variarãocom a célula hospedeira empregada. Os genes de seleção adequados, porexemplo, podem incluir genes codificando para resistência a ampicilina e/outetraciclina, que permite que células transformadas com estes vetores cres-çam na presença destes antibióticos.

Em um aspecto da presente invenção, um ácido nucléico de CKImutante é introduzido em uma célula, ou sozinho ou em combinação comum vetor. Por "introduzido em" ou equivalentes gramaticais é entendido queos ácidos nucléicos entram nas células de uma maneira adequada para in-tegração, amplificação, e/ou expressão subseqüente do ácido nucléico. Ométodo de introdução é amplamente ditado pelo tipo de célula alvejado. Osmétodos exemplares incluem precipitação de CaPO4, fusão de lipossoma,lipofectin®, eletroporação, infecção viral, e similares. Os métodos particular-mente adequados para introdução em células de planta são conhecidos natécnica e também são descritos infra (vide Seção II, "Transgenic Plants").Tais métodos incluem, por exemplo, bombardeio de células com microprojé-teis carregados de DNA. Os ácidos nucléicos de CKI mutantes podem esta-velmente integrar no genoma da célula hospedeira, ou podem existir transi-toriamente ou estavelmente no citoplasma (por exemplo, através do uso deplasmídeos tradicionais, utilizando seqüências reguladoras padrão, marca-dores de seleção, e similares).

Os procariotas podem ser empregados como células hospedei-ras para as etapas iniciais de clonagem da presente invenção. Eles são par-ticularmente úteis para produção rápida de quantidades grandes de DNA,para produção de modelos de DNA de filamento único empregados para mu-tagênese direcionada ao sítio, para avaliar muitos mutantes simultaneamen-te, e para seqüenciamento de DNA dos mutantes gerados. As células hos-pedeiras procarióticas adequadas incluem linhagem de E. coli Kl 2 94 (ATCCNs. 31.446), linhagem de E. coli W3110 (ATCC Ns. 27.325) E. coli Xl 776(ATCC Ns. 31.537), e E. coli B; porém muitas outras linhagens de E. coli, talcomo HBIOI, JMIOI, NM522, NM538, NM539, e muitas outras espécies egêneros de procariotas incluindo bacilos tal como Bacillus subtilis, outrasenterobacteriáceas tal como Salmonela typhimurium ou Serratia marcesans,e várias espécies de Pseudomonas podem todas ser empregadas comohospedeiros. As células hospedeiras procarióticas são ou outras célulashospedeiras com paredes celulares rígidas são tipicamente transformadasempregando o método de cloreto de cálcio como descrito na seção 1.82 deSambrook e outros, supra. Alternativamente, a eletroporação pode ser em-pregada para transformação destas células. As técnicas de transformaçãode procariota são apresentadas, por exemplo, em Dower, em Genetic Engi-neering, Principies and Methods 12:275-296 (Plenum Publishing Corp.,1990); Hanahan e outros, Meth. Enymol., 204:63, 1991. Os plasmídeos tipi-camente empregados para transformação de E. coli incluem pBR322, pU-CI8, pUCI9, pUCI18, pUCI 19, e Bluescript Ml 3, todos dos quais estão des-critos em seções 1.12-1.20 de Sambrook e outros, supra. Porém, muitos ou-tros vetores adequados estão disponíveis também.

Os polipeptídeos de CKI mutantes da presente invenção sãoproduzidos tipicamente cultivando-se células hospedeiras transformadascom um vetor de expressão que contém um ácido nucléico codificando opolipeptídeo de CKI mutante, sob as condições apropriadas para induzir oucausar expressão do polipeptídeo de CKI mutante. Para modulação de divi-são de célula, a proteína de CKI é expressa em sua forma intracelular nor-mal. Para aplicações da presente invenção que incluem colheita ou isola-mento de um polipeptídeo de CKI mutante, o CKI mutante pode ser expressocomo uma proteína intracelular ou, alternativamente, em uma forma que ésegregada da célula hospedeira. Muitas proteínas eucarióticas normalmentesegregadas da célula contêm uma seqüência de sinal de secreção endóge-na como parte da seqüência de aminoácido. Desse modo, as proteínas nor-malmente achadas no citoplasma podem ser alvejadas para secreção ligan-do-se uma seqüência de sinal à proteína. Isto é facilmente realizado ligando-se o DNA codificando uma seqüência de sinal a extremidade 5' do DNA co-dificando a proteína e então expressando esta proteína de fusão em umacélula hospedeira apropriada. O DNA codificando a seqüência de sinal podeser obtido como um fragmento de restrição de qualquer gene codificandouma proteína com uma seqüência de sinal. Desse modo, as seqüências desinal procarióticas, de levedura, e eucarióticas podem ser empregadas aqui,dependendo do tipo de célula hospedeira utilizada para praticar a invenção.

As seqüências de DNA e aminoácido codificando a porção de seqüência desinal de vários genes eucarióticos incluindo, por exemplo, hormônio de cres-cimento humano, pró-insulina, e pré-albumina, são conhecidas (vide, Stryer,Biochemistry (W.H. Freeman and Company, Nova Iorque, NY, 1988, p.769)),e podem ser empregadas como seqüências de sinal em células hospedeiraseucarióticas apropriadas. As seqüências de sinal de levedura, tal como, porexemplo, ácido fosfatase (Arima e outros, Nuc. Acids Res. 11:1657, 1983),α-fator, alcalino fosfatase e invertase podem ser empregados para direcionara secreção de células hospedeiras de levedura. As seqüências de sinal pro-carióticas de genes codificando, por exemplo, LamB ou OmpF (Wong e ou-tros, Gene 68:193, 1988), MaIE, PhoA, ou beta-lactamase, como tambémoutros genes, podem ser empregadas para alvejar proteínas expressas emcélulas procarióticas no meio de cultura.

As condições apropriadas para a expressão de polipeptídeo deCKI mutante variarão com a escolha do vetor de expressão e da célula hos-pedeira, e serão facilmente averiguadas por alguém versado na técnica porexperimentação rotineira. Por exemplo, o uso de promotores constitutivos novetor de expressão requererá otimização do crescimento e proliferação dacélula hospedeira, ao mesmo tempo em que o uso de um promotor induzívelrequer as condições de crescimento apropriadas para indução. Além disso,em algumas modalidades, o tempo da colheita é importante. Por exemplo,os sistemas baculovirais empregados em expressão de célula de inseto sãovírus líticos, e desse modo a seleção de tempo de colheita pode ser impor-tante para produção do produto.

Os promotores mais geralmente empregados em vetores proca-rióticos incluem os sistemas promotores de p-lactamase (penicillinase) e Iac-tose (Chang e outros, Nature 375:615, 1978; Itakura e outros, Science198:1056, 1977; Goeddel e outros, Nature 281 :544, 1979) e um sistemapromotor de triptofano (trp) (Goeddel e outros, Nucl. Acids Res. 8:4057,1980; Publicação de Pedido EPO No. 36.776), e os sistemas de alcalino fos-fatase. Ao mesmo tempo em que estes são os mais geralmente emprega-dos, outros promotores microbianos foram utilizados, e detalhes com respei-to às suas seqüências de nucleotídeo foram publicados, permitindo um tra-balhador versado funcionalmente ligá-los em vetores de plasmídeo (vide Si-ebenlist e outros, Cell 20:269, 1980).

Um exemplo ilustrativo de um sistema promotor responsivo quepode ser empregado na prática desta invenção é o sistema de glutationa-S-transferase (GST) no milho. GSTs são uma família de enzimas que podedesintoxicar vários compostos eletrofílicos hidrofóbicos que freqüentementesão empregados como herbicidas pré-emergentes (Weigand e outros, PlantMolecular Biology 7:235-243, 1986). Estudos mostraram que os GSTs èstãodiretamente envolvidos na causa desta tolerância a herbicida realçada. Estaação principalmente é mediada por um produto de transcrição de mRNA de1,1 kb específico. Em resumo, o milho tem um gene inativo de ocorrêncianatural já presente que pode responder aos estímulos externos e que podeser induzido para produzir um produto de gene. Este gene foi previamenteidentificado e clonado. Desse modo, em uma modalidade desta invenção, opromotor é removido do gene responsivo de GST e unido a uma seqüênciade codificação de CKI mutante. Se o gene de CKI mutante é derivado deuma fonte de DNA genômica que é necessário para remover o promotor na-tivo durante construção do gene quimérico. Este gene construído é a combi-nação de um promotor que responde a um estímulo químico externo e umgene responsável pela produção bem-sucedida de uma proteína de CKI mu-tante.

Um promotor induzível é um promotor que é capaz de direta ouindiretamente ativar a transcrição de um ou mais genes ou seqüências deDNA com respeito a um indutor. Na ausência de um indutor os genes ou se-qüências de DNA não serão transcritos. Tipicamente o fator de proteína, quese liga especificamente a um promotor induzível para ativar a transcrição,está presente em uma forma inativa que é então direta ou indiretamenteconvertida para forma ativa pelo indutor. O indutor pode ser um agente quí-mico tal como uma proteína, metabolito, um regulador de crescimento, her-bicida ou um composto fenólico ou uma tensão fisiológica imposta direta-mente por calor, frio, sal, ou elementos tóxicos ou indiretamente pela açãode um agente de doença ou patógeno tal como um vírus. Uma célula deplanta que contém um promotor induzível pode ser exposta a um indutor ex-ternamente aplicando-se o indutor à célula ou planta tal como por pulveriza-ção, irrigação, aquecimento ou métodos similares. Se for desejável ativar aexpressão do gene-alvo para um tempo particular durante o desenvolvimen-to da planta, o indutor pôde ser então aplicado neste momento.

Os exemplos de tais promotores induzíveis incluem os promoto-res de choque térmico, tal como o promotor de choque térmico de 70KD in-duzível de Drosphilia melanogaster (Freeling e outros, Ann. Rev. Of Genetics19:297-323); um promotor induzível por frio, tal como o promotor induzívelpor frio de B. napus (White e outros, Plant Physiol. 106, 1994); e o promotorde álcool desidrogenase que é induzido por etanol (Nagao e outros, Surveysof Plant Molecular e Cell Biology Vol. 3, ρ 384-438 (BJ. Miflin ed., Oxford U-niversity Press, Oxford, 1986).

Um promotor constituitivo é um promotor que é capaz de ativardireta ou indiretamente a transcrição de um ou mais genes ou seqüências deDNA em todos os tecidos de uma planta transgêica. Tipicamente, um promo-tor constituitivo tal como o promotor 35 S de CaMC (Odell, Nature 313:810-812, 1985) é empregado. Outros exemplos de promotores de promotoresconstituitivos úteis em plantas incluem o promotor de actina de arroz (Elroy eoutro, Plant Cell 2:163-171, 1990), histona HE de milho (Lepetit e outros, MolGen. Genet. 231:276-285,1992) e similares.

Os transgenes de CKI da presente invenção podem ser expres-sos empregando um promotor tal como é o promotor BCEA (embrião de B.campestris) que foi mostrado direcionar níveis elevados de expressão emdesenvolvimento de semente muito precoce (isto é, é transcrito antes dopromotor de napin). Este é um período antes de acumulação de produto dearmazenamento porém de biossíntese de pigmento rápida na semente deBrassica (derivada de Johnson-Flanagan e outros, J. Plant Physiol. 136:180,1989; Johnson-Flanagan e outros, Physiol. Plant 81:301, 1991). Os promoto-res de proteína de armazenamento de semente também foram mostradosdirecionar um nível elevado de expressão de uma maneira específica dasemente (Voelker e outros., Plant Cell 1:95, 1989; Altenbach e outros., PlantMol. Biol. 13:513, 1989; Lee e outros, Proc. Natl. Acad. ScL USA 99:6181,1991; Russell e outros, Transgenic Res. 6:157-68, 1997). O promotor de na-pin foi mostrado direcionar a expressão de gene de oleosina em Brassieatransgênica, tal que a oleosina se acumule em cerca de 1% da proteína desemente total (Lee e outros, Proc. Natl. Acad. Sd. USA 99:6181, 1991). Naescolha de um promotor, pode ser desejável usar um promotor regulado demaneira desenvolvida ou específico de tecido que permita a supressão ousuperexpressão em certos tecidos sem afetar a expressão em outros teci-dos. "Promotores específicos de tecido" se referem às regiões de codifica-ção que direcionam a expressão de gene principalmente em tecidos especí-ficos tal como, por exemplo, raiz, folhas, troncos, pistilo, antera, pétalas deflores, tegumento, nucellus de semente, ou camadas epidérmicas. Os esti-muladores, realçadores ou ativadores de transcrição podem ser integradosem promotores específicos de tecido para criar um promotor com um nívelelevado de atividade que retém especificidade de tecido. Por exemplo, ospromotores utilizados na superexpressão serão preferivelmente específicosde tecido. A superexpressão no tecido errado como folhas, ao tentar super-expressar em áreas de armazenamento de semente, poderia ser danoso. Ospromotores particularmente adequados são aqueles" que permitem, por e-xemplo, a expressão específica de semente, específica de raiz, específicade folha, específica de fruta, e similares. Isto pode ser especialmente útiluma vez que as sementes, raízes, folhas, e frutos são de interesse particu-lar. Alguns promotores específicos para tipos de tecido diferentes já estãodisponíveis ou podem ser isolados por técnicas bem-conhecidas (vide, porexemplo, Patentes dos Estados Unidos Nes. 5.792.925; 5.783.393;5.859.336; 5.866.793; 5.898.096; e 5.929.302) e como também descrito a-baixo. A Tabela 1 lista outros promotores específicos de embrião que podemser empregados para praticar a presente invenção.<table>table see original document page 50</column></row><table>Em modalidades particulares da presente invenção, um promo-tor específico de semente que é particularmente ativo durante o desenvolvi-mento da planta embrionária de uma semente imatura é de interesse. A ex-pressão de um mutante negativo dominante da presente invenção precoce-mente em desenvolvimento de semente pode ser desejável para aumentaras divisões de célula precocemente em desenvolvimento de semente. Maisdivisões de célula neste estágio podem levar a embriões maiores. A compo-sição de embrião é aproximadamente 33% de óleo, então um embrião maiorlevará a aumentos no conteúdo de óleo. Um promotor adequado para ex-pressão da presente invenção em embrião e nenhuma expressão ou ex-pressão menor em outros tecidos de planta é de interesse para aumentar oconteúdo de óleo da semente. De interesse particular são aquelas seqüên-cias promotoras que iniciam expressão em desenvolvimento de embrião defase específica precoce. Um promotor de fase específica precoce é um pro-motor que inicia a expressão de uma proteína antes do dia 7 após a polini-zação bengala em Arabidopsis ou uma fase equivalente em outras espéciesde planta. Os exemplos de seqüências promotoras de interesse particularincluem um promotor para o gene de permease de aminoácildo (AAP1) (porexemplo, o promotor AAP1 de Arabidopsis thaliana), um promotor para ogene de oleato 12-hidroxilase:desaturase (por exemplo, o promotor designa-do LFAH12 de Lesquerellafendleri), um promotor para o gene de albumina2S2 (por exemplo, o promotor 2S2 de Arabidopsis thaliana), um promotor degene de elongase de ácido graxo (FAEI) (por exemplo, o promotor de FAEIde Arabidopsis thaliana), e o promotor de gene de cotilédone folhoso (LEC2)(por exemplo, o promotor LEC2 de Arabidopsis thaliana). Os promotoresAAP1, LFAH12, 2S2, e FAE1 são inativo no estágio precoce de desenvolvi-mento de embrião. Eles se tornam transcricionalmente ativos em estágiosprogressivamente posteriores em desenvolvimento que começam com AAP1seguido por LFAH12, 2S2, e então FAE. Todos os quatro promotores entãopermanecem ativos por estágios de desenvolvimento embrionário posterio-res. O promotor de LEC2 tem um perfil de expressão inverso. É ativo emdesenvolvimento de embrião muito precoce e então sua atividade declinagradualmente por estágios posteriores. Outros promotores específicos deembrião de interesse incluem os promotores dos seguintes genes: os promo-tores de Seedstick (Pinvopich e outros, Nature 424:85-88, 2003), Fbp7 e Fb-p11 (Petúnia Seedstick) (Colombo e outros, Plant Cell. 9:703-715, 1997),Banyuls (Devic, Plant J., 19:387-398, 1999), ABI3 (Ng e outros, Plant. Mol.Biol. 54:25-38, 2004), agl-15, Agll8 (Lehti-Shiu e outros, Plant Mol. Biol.58:89-107, 2005), Phel (Kohler, Genes Develop. 17:1540-1553, 2003), em-bl75 (Cushing e outros, Planta. 221:424-436, 2005), Lll (Kwong e outros,Plant Cell 15:5-18, 2003), Led (Lotan, Cell 93:1195-1205, 1998), Fusca3(Kroj e outros, Development 130:6065-6073, 2003), TT12 (Debeaüjon e ou-tros, Plant Cell 13:853-871, 2001), TT16 (Nesi e outros, Plant Cell 14:2463-2479, 2002), A-RZf (Zou e Tatlor, Gene 196:291-295, 1997), TTGI (Walker eoutros, Plant Cell 11:1337-1350, 1999), TT1 (Sagasser e outros, Genes Dev.16:138-149, 2002), TT8 (Nesi e outros, Plant Cell 12:1863-1878, 2000), eGea-8 (cenoura) (Lin e outros, J. Exp. Botany 50:1139-1147, 1999). Os pro-motores específicos de embrião de monocotilédones incluem Globulina,Knox (arroz) (Postma-Haarsma, Plant Mol Biol 39:257-271, 1999), Oleosina(Plant, Plant Mol Biol. 25:193-205, 1994), Keddie1 Plant. Biol. 24:327-340,1994), Peroxiredoxin (Perl) (Haslekas e outros, Plant Mol. Biol. 36:833-845,1998), Haslekas e outros, Plant Mol Biol. 53:313-326, 2003), HvGAMYB (Di-az e outros, Plant J. 29:453-464, 2002) e SAD1 (IsabeI-LaMoneda e outros,Plant J. 33:329-340, 1999) de Cevada, e promotores de proteína ricos emprolina híbridos de Zea Milho (Jose-Estanyol e outros, Plant Cell 4:413-423,1992; Jose-Estanyol e outros, Gene 356:146-152, 2005).

Os promotores de proteínas de armazenamento de sementetambém são de interesse particular uma vez que as proteínas de armaze-namento de semente podem representar até 90% da proteína de sementetotal em muitas plantas. As proteínas de armazenamento de semente sãoestritamente reguladas, sendo expressas quase exclusivamente em semen-tes de uma maneira altamente específica de tecido e específica de estágio(Higgins e outros, Ann. Rev. Plant Physiol 35:191-221, 1984; Goldberg e ou-tro, Cell 56:149-160, 1989). Além disso, diferentes proteínas de armazena-mento de semente podem ser expressas em estágios diferentes de desen-volvimento de semente. A expressão de genes específicos de semente foiestudada em grandes detalhes (vide, revisões por Goidberg e outros, supra,e Higgins e outros, supra). Os exemplos de promotores específicos de se-mente incluem LFAHI 2 de Arabidopsis e outras plantas, e as regiões regu-ladoras 5' de um gene de oleosina de Arabidopsis como descrito na Patentedos Estados Unidos №. 5.977.436 por Thomas e outros (incorporado em suatotalidade por referência), o qual quando operavelmente ligado à seqüênciade codificação de um gene heterólogo ou seqüência complementar a umgene de planta nativo, direcionam expressão dó gene heterólogo ou seqüên-cia complementar em uma semente de planta.

Os promotores de proteína de armazenamento de semente ade-quados para plantas dicotiledôneas incluem, por exemplo, feijão β-faseolina,lectina, e promotores de fitoemaglutinina (Sengupta-Gopalan, e outros, Proc.Natl. Acad. Sci U.S.A. 82:3320-3324, 1985; Hoffinan e outro., Plant MoL Biol.11 :171 -129, 1988; Voelker e outros, EMBO J. 6:3571-3577, 1987); promotorde napin de semente de colza (canola) (Radke e outros, Theor. Appl. Genet.75:685-694, 1988); promotores de conglicinina e glicinina de soja (Chen eoutros, EMBO J. 7:297-302, 1988; Nielson e outros, Plant Cell -1:313-328,1989, Harada e outros, Plant Cell 1:415-425, 1989; Beachy e outros, EMBOJ. 4:3047 - 3053, 1985); o promotor de Iecitina de soja (Okamurõ, Proc.Natl.Acad. ScL USA 83:8240 - 8244, 1986); promotor inibidor de tripsina Kunitzde soja (Perez-Grau e outros, Plant Cell 1:1095 -1109, 1989; Jofuku e ou-tros, Plant Cell 1:1079-1093, 1989); promotor de patatina de batata (Rocha -Sosa e outros, EMBO J. 8:23-29, 1989); promotores de convicilina, vicilina, eIegumina de ervilha (Rerie e outros OLi MoL Gen. Genet. 259:148-157,1991; Newbigin e outros . Plant 180:461-470, 1990; Higgins e outro, PlantMol. Biol. 11:683-695, 1988; Shirsat e outros, Mol Gen. Genetics 215:326 -331, 1989); e promotor de esporamina de batata-doce (Hattori e outros,Plant Mol.Biol 14:595-604, 1990).

Para plantas monocotiledôneas, os promotores de proteína dearmazenamento de semente úteis na prática da invenção incluem, por e-xemplo, promotores de zeína milho (Schernthaner e outro, EMBO J. 7:1249-1255, 1988; Hoffman e outros, EMBO J. 6:3213-3221, 1987 (zeína de milhode 15 kD)); promotor de oleosina de milho de 18 kD (Lee e outros, Proc. NatlAcad. ScL U.S.A. 888:6181-6185, 1991); promotor de cera; promotor contra-ído-1; promotor globulina 1; promotor contraído-2; promotor de glutelina dearroz; promotor de hordeína de cevada (Marris e outros, Plant Mol. Biol.10:359-366, 1988); RP5 (Su e outros, J. Plant Physioj. 158:247-254, 2001);promotores de 2 milho e EBE1 (Magnard e outro, Plant Mol Biol. 53:821-836,2003) e promotores de glutenina e gliadina de trigo (Patente dos EstadosUnidos Ne. 5.650.558; Colot e outros, EMBO J. 6:3559-3564, 1987).

Também adequado para prática da presente invenção são ospromotores de genes para isocitrateliase e malato sintase de B. napus (Co-rnai e outros, Plant Cell 1 :293-300, 1989); delta-9 desaturase de açafroa(Thompson e outros, Proc. Natl. Acad. ScL USA 88:2578-2582, 1991) e ríci-no (Shanklin e outros, Proc. Natl Acad. ScL USA 88:2510-2514, 1991); pro-teína de portador de acila (ACP) de Arabidopsis (Poste-Beittenmiller e ou-tros, Acids Res., 1989), B. napus (Safford e outros, Eur. J. Biochem.174:287-295, 1988), e B. campestris (Rosa e outros, Nucl. Acids Res.15:7197, 1987); β-cetoacil-ACP sintetase de cevada (Siggaard-Andersen eoutros, Proc. Natl. Acad. ScL USA 88:4114-4118, 1991); oleosina de milho(Lee e outro, Proc. Natl. Acad. Sd. USA 88:6181-6185, 1991), soja (Ns. deAcessão Genbank X60773) e B. napus (Lee e outros, Plant Physiol.96:1395-1397, 1991).

Outros promotores úteis na prática da invenção são conhecidospor aqueles de experiência na técnica. Além disso, os métodos conhecidospodem ser empregados para isolar os promotores adicionais adequado parauso de acordo com a presente invenção. Por exemplo, técnicas de avaliaçãodiferenciais podem ser empregadas para isolar promotores expressos emtempos específicos (desenvolvente), tal como durante o desenvolvimento dafruta.

Os promotores dé genes específicos de semente operavelmenteligados às seqüências de codificação heterólogas em constructos de genequiméricas também mantêm seus padrões de expressão espacial e temporalem plantas transgênicas. Tais exemplos incluem o uso de promotor de genede proteína de armazenamento de semente Arabidopsis thaliana 2S paraexpressar peptídeos de encefalina em sementes de Arabidopsis e B. napus(Vandekerckhove e outros, Bio/Technology 7:929-932, 1989), promotores delectina de feijão e β-faseolina de feijão para expressar Iuciferase (Riggs eoutros, Piant Sci 63:47-57, 1989), e promotores de glutenina de trigo paraexpressar cloranfenicol acetila transferase (Colot e outros, supra).

Atingir o nível apropriado de expressão dos fragmentos de ácidonucléico da invenção pode requerer o uso de genes quiméricos diferentesque utilizam promotores diferentes. Tais genes quiméricos podem ser trans-feridos em plantas hospedeiras ou juntos em um único vetor de expressãoou consecutivamente empregando mais de um vetor.

Além disso, os realçadores são freqüentemente requeridos ouúteis para aumentar a expressão do gene da invenção. É necessário queestes elementos sejam operavelmente ligados à seqüência que codifica asproteínas desejadas e que os elementos reguladores sejam operáveis. Osrealçadores ou elementos tipo realçadores podem ser fragmentos de ácidonucléico nativos ou quiméricos. Isto incluiria realçadores virais tal como a-queles encontrados no promotor 35S (Odell e outros, Plant Mol Biol 10:263-272, 1988), realçadores dos~genes de opina (Fromm e outros, Plant Cell1:977 - 984, 1989), ou realçadores de qualquer outra fonte que resulte natranscrição aumentada quando colocado em um promotor operavelmenteligado ao fragmento de ácido nucléico da invenção. Por exemplo, um cons-tructo pode incluir o promotor CaMV 35S com realçador transcricional dualligado ao indutor não transladado 5' de vírus de Tabaco Etch (TEV). O indu-tor de TEV atua como um realçador translacional para aumentar a quantida-de de proteína feita.

Os elementos de promotor adequados, tal como aqueles descri-tos aqui, podem ser fundidos às seqüências de ácido nucléico de CKI mutan-te e ao terminador adequado (região de poliadenilação) de acordo com pro-cedimentos bem-estabelecidos.Plantas Transgênicas

Em outro aspecto da presente invenção, as plantas transgênicascompreendendo um transgene de CKI mutante são fornecidas. As plantastransgênicas expressando um polipeptídeo de CKI mutante podem ser obti-das, por exemplo, transferindo-se um vetor transgênico (por exemplo, umvetor de plasmídeo ou viral) codificando o polipeptídeo mutante em umaplanta. Tipicamente, quando o vetor for um plasmídeo, o vetor também incluium gene marcador selecionável tal como, por exemplo, o gene de neomicinafosfotransferase Il (nptll) codificando resistência a canamicina. O métodomais comum de transformação de planta é realizado por clonagem de umtransgene-alvo em um vetor de transformação de planta que é então trans-formado em Agrobacterium tumifaciens que contém um Ti-plasmídeo auxiliarcomo descrito em Hoeckema e outros (Nature 303:179-181, 1983). As célu-las de Agrobacterium que contêm o vetor de transgene são incubadas comfatias de folha da planta a ser transformada como descrito por An e outros(Plant Physiology 81 :301-305, 1986). (Também vide, Hooykaas, Plant Mol.Biol. 13:327-336, 1989). A transformação de células hospedeiras de plantacultivada normalmente é realizada por Agrobacterium tumifaciens, comodescrito acima. As culturas de células hospedeiras que não têm barreiras demembrana de célula rígidas são normalmente transformadas empregando ométodo de fosfato de cálcio como originalmente descrito por Graham e ou-tros (Virology 52:546, 1978) e modificadas como descrito nas seções 16.32-16.37 de Sambrook e outros, supra. Porém, outros métodos para introduzir oDNA em células, tal como PoIibreno (Kawai e outros, Mol. Cell. Biol 4:1172,1984), fusão de protoplasto (Schafmer, Proc. Natl. Acad. Sd. USA 77:2163,1980), eletroporação (Neumann e outro, 1982 EMBO J. 1:841, 1982), e mi-croinjeção direta em núcleos (Capecchi, Cell 22:479, 1980) também podemser empregados. Os calos de planta transformados podem ser selecionadospelo marcador selecionável desenvolvendo-se as células em um meio con-tendo, por exemplo, canamicina e quantidades apropriadas de um fito-hormônio tal como ácido acético de naftaleno e benziladenina para induçãode broto e calo. As células de planta podem ser então regeneradas e asplantas resultantes transferidas para o solo empregando técnicas bem-conhecidas por aqueles versados na técnica.

Além dos métodos descritos acima, um grande número de mé-todos é conhecido na técnica para transferir o DNA clonado em uma amplavariedade de espécies de planta, incluindo, gimnosperma, angiospermas,monocotilédones e dicotilédones (vide, por exemplo, Methods in Plant Mole-cular Biology (Glick e Thompson eds., CRC Press, Boca Raton, FL5 1993);Vasil, Planta Mol. Biol. 25:925-937, 1994; e Komari e outros, Current Opini-ons Plant Biol. 1:161-165, 1998 (revisões gerais); Loopstra e outros, PlantMol. Biol. 15:1-9, 1990; e Brasileiro e outros, Plant Mol. Biol. 17:441-452,1991 (transformação de árvores); Eimert e outros., Plant Mol. Biol. 19:485 -490, 1992 (transformação de Brassica); Hiei e outros, Plant J. 6:271-282,1994; Hiei e outros, Plant Mol Biol. 35:205-218, 1997; Chan e outros, PlantMol Biol 22:491-506, 1993; Patentes dos Estados Unidos Nss. 5.516.668 e5.824.857 (transformação de arroz); Patente dos Estados Unidos Ns.5.955.362 (transformação de trigo); 5.969.213 (transformação de monocoti-lédone); 5.780.798 (transformação de milho); 5.959.179 e 5.914.451 (trans-formação de soja). Os exemplos representativos incluem captação de DNAfacilitada por eletroporação através de protoplastos (Rhodes e outros, Scien-ce 240:204-207, 1988; Bates, Methods Mol. Biol. 111:359-366, 1999; DHaIIu-in e outros, Methods Mol Biol 111:367-373, 1999; Patente dos Estados Uni-dos Ne. 5.914.451); tratamento de protoplastos com polietileno glicol (Lyznike outros, Plant Molecular Biology 13:151-161, 1989; Datta e outros, MethodsMol Biol, 111 :335-334, 1999); bombardeio de e de células com microprojé-teis carregados de DNA (Klein e outros, Plant Physiol. 91:440-444, 1989;Boynton e outros, Science 240:1534-1538, 1988; Register e outros, PlantMol. Biol. 25:951 -961, 1994; Barcelo e outros, Plant J. 5:583-592, 1994; Vasile outros, Methods Mol Biol. 111:349-358, 1999; Christou, Plant Mol. Biol35:197-203, 1997; Finer e outros, Curr. Top. Microbiol Immunol. 240:59-80,1999). Adicionalmente, as técnicas e estratégias de transformação de plantasão revisadas em Birch, Ann Rev Plant Phys Plant Mol Biol 48:297, 1997;Forester e outros, Exp. Agric. 33:15-33, 1997. Variações menores tornamestas tecnologias aplicáveis a ampla faixa de espécies de planta.

No caso de transformação de monocotilédone, o bombardeio departícula é tipicamente o método de escolha. Porém, os monocotilédones, talcomo milho, também podem ser transformados empregando-se métodos detransformação de Agrobacterium como descrito na Patente dos Estados U-nidos 5.591.616 por Hiei e outros. Outro método para realizar a transforma-ção de monocotilédone, por exemplo, milho, mistura células de culturas desuspensões embriogências com uma suspensão de fibras (5% em pe-so/volume, Silar SC-9 whiskers) e DNA de plasmídeo (1 μg/ul) que é entãocolocado ou verticalmente em uma cabeça de amostra múltipla em um mis-turador de vórtice Vortex Genie Il (Scientific Industries, Inc., Bohemia, NY,USA) ou horizontalmente no cabo de um misturador de amálgama dentalMixomat (Degussa Canadá Ltd., Burlington, Ontário, Canadá). A transforma-ção é então realizada por mistura em velocidade máxima durante 60 segun-dos (por exemplo com um Vortex Genie II) ou agitando-se em velocidadefixa durante 1 segundo (Mixomat). Este processo resulta na produção depopulações de célula através das quais transformantes estáveis podem serselecionados. As plantas são regeneradas dos calos estavelmente transfor-mados e estas plantas e suas progênies podem ser mostradas por análisede hibridação do Sul serem transgênicas. As vantagens principais da abor-dagem são sua simplicidade e baixo custo. Ao contrário dõ bombardeio departícula, equipamento dispendioso e abastecimento não são requeridos. Ouso de pêlos para transformação de células de planta, particularmente demilho, é descrito, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos 5.464.765por Coffee e outros.

A Patente dos Estados Unidos 5.968.830 por Dan e outros, des-creve métodos para transformar e regenerar a soja. A Patente dos EstadosUnidos 5.969.215 por Hall e outros, descreve as técnicas de transformaçãopara produzir plantas Beta vulgaris transformadas, tal como a beterraba açu-careira.

Cada uma das técnicas de transformação acima tem vantagense desvantagens. Em cada uma das técnicas, DNA de um plasmídeo é criadogeneticamente tal que contenha não somente o gene de interesse, porémtambém genes marcadores avaliáveis e selecionávéis. Um gene marcadorselecionável é empregado para selecionar somente aquelas células que têmcópias integradas do plasmídeo (a construção é tal que o gene de interessee os genes avaliáveis e selecionávéis sejam transferidos como uma unida-de). O gene avaliável fornece outra verificação para o cultivo bem sucedidode somente aquelas células que carregam os genes de interesse.

A transformação de Agrobacterium tradicional com marcadoresselecionávéis de resistência antibiótica é problemática por causa de oposi-ção pública que tais plantas apresentam um risco impróprio de propagaçãode tolerância anibiótica para animais e seres humanos. Tais marcadores an-tibióticos podem ser eliminados de plantas transformando-se as plantas em-pregando as técnicas de Agrobacterium similares àquelas descritas na Pa-tente dos Estados Unidos 5.731.179 por Komari e outros. As questões deresistência antibiótica também podem ser eficazmente evitadas pelo uso deseqüências de codificação bar ou pat, tal como é descrito na Patente dosEstados Unidos Número 5.712.135. Estes DNAs marcadores preferidos codi-ficam segundas proteínas ou polipeptídeos inibindo ou neutralizando a açãode herbicidas inibidores de glutamina sintetase, fosfinotricina (glufosinato) esal de amônio de glufosinato (Basta, Ignite).

O plasmídeo contendo um ou mais destes genes é introduzidonos protoplasto de planta ou células calosas por quaisquer das técnicas pre-viamente mencionadas. Se o gene marcador for um gene selecionável, so-mente aquelas células que incorporaram o pacote de DNA sobrevivem sobseleção com o agente fitotóxico apropriado. Uma vez que as células apropri-adas são identificadas e propagadas, as plantas são regeneradas. A progê-nie das plantas transformadas deve ser testada para assegurar que o pacotede DNA foi de modo bem sucedido integrado no genoma de planta.

Há numerosos fatores que influenciam o sucesso de transforma-ção. O desígnio e construção da construção do gene exógeno e seus ele-mentos reguladores influenciam a integração da seqüência exógena no DNAcromossômico do núcleo de planta e a capacidade do transgene ser expres-so pela célula. Um método adequado para introduzir a construção de geneexógeno no núcleo de célula de planta de uma maneira não letal é essencial.De modo importante, o tipo de célula no qual a construção é introduzida de-ve, se plantas inteiras serão recuperadas, ser de um tipo que seja amenopara regeneração, determinado um protocolo de regeneração apropriado.

Métodos de Uso

De acordo com outro aspecto da presente invenção, a divisãocélula em uma célula de planta é modulada, por exemplo, aumentada. Ascélulas de planta tratáveis por modulação, tal como um aumento de divisãode célula que usa os métodos descritos aqui, são células de planta que ex-pressam um polipeptídeo de CKI do tipo silvestre que tem regiões de ligaçãode CDK e ciclina separadas. Geralmente, os métodos incluem expressardentro da célula de planta um polipeptídeo de CKI mutante como descritoaqui, e permitir o polipeptídeo de CKI mutante inibir a atividade biológica deCKI do tipo silvestre dentro da célula de planta. O polipeptídeo de CKI mu-tante é expresso de ácido nucléico recombinante codificando a proteína mu-tante. Além disso, em certas modalidades, o método também inclui introduzirna célula de planta o ácido nucléico recombinante codificando o polipeptídeode CKI mutante. Os ácidos nucléicos recombinantes codificando o polipeptí-deo de CKI mutante, incluindo a construção de tais moléculas recombinantese sua introdução nas células de planta, geralmente são descritos supra, esão também exemplificados nos Exemplos, infra. A modulação de divisão decélula pode ser realizada em uma planta célula in vivo, tal como descrito a-qui anteriormente com respeito às plantas transgênicas. Alternativamente, ométodo pode ser realizado em uma célula de planta in vitro.

Como descrito aqui anteriormente, o polipeptídeo de CKI mutan-te inclui uma seqüência de aminoácido de CKI tendo pelo menos uma modi-ficação com relação a um polipeptídeo de CKI de referência. Com respeitoao método para modulação de divisão de célula, o polipeptídeo de CKI dereferência pode ser qualquer polipeptídeo de CKI de planta tipo silvestre ex-presso dentro da célula de planta na qual a modulação de divisão de célulaserá realizada (tipicamente o CKI tipo silvestre endógeno). Alternativamente,porque o uso de uma proteína de CKI mutante como descrito aqui podepermitir a atividade antagonista negativa dominante contra homólogos estru-turais ou membros da família do CKI tipo silvestre do qual o mutante é deri-vado, o polipeptídeo de CKI referência pode ser um polipeptídeo de CKI tiposilvestre heterólogo ao polipeptídeo de CKI do tipo silvestre expresso com acélula de planta que é capaz de fornecer função do tipo silvestre substanci-almente equivalente. Desse modo, em alguns casos, uma proteína de CKImutante, não derivada da proteína de CKI endógena, é expressa em umacélula de planta para inibir a função endógena de CKI tipo silvestre (por e-xemplo, um polipeptídeo de CKI mutante derivado de uma proteína de KRPtipo silvestre de Arabidopsis thaliana pode ser emprgado para inibir a funçãode KRP tipo silvestre em células de planta não heterólogas tal como, porexemplo, células de Brassica napus, Glycine max, milho e outro). Outrospolipeptídeos de CKI mutantes heterólogos derivados de outras plantas, talcomo Brassica napus, e similares, também podem ser empregados.

Além disso, em certas modalidades do método, uma pluralidadede CKIs relacionados é simultaneamente inibida em uma planta célula queusa um CKI mutante da presente invenção. Por exemplo, em algumas moda-lidades, todos os CKIs endógenos dentro de uma família (por exemplo,membros da família de KRP) são simultaneamente inibidos. Como notadoacima:, uma proteína de CKI mutante, como descrito aqui, permite a ativida-de antagonista negativa dominante dentro de membros de família ou homó-logos estruturais do CKI tipo silvestre do qual a variante é derivada, dessemodo permitindo tal inibição simultânea de homólogos múltiplos ou membrosde família. Desse modo, em modalidades típicas, uma pluralidade de (e pre-ferivelmente todos) CKIs que tem similaridade ou identidade de seqüênciasubstancial dentro da região de ligação de CDK ou ciclina-alvo é inibida emuma célula de planta. Por exemplo, em certas modalidades, quando osmembros familiares de KRP compartilham identidade de seqüência substan-ciai dentro da região de ligação de CDK, que é principalmente responsávelpela inibição de atividade de ciclina-CDK cinase, uma pluralidade de, e pre-ferivelmente todos, membros da família de KRP endógena em uma célula deplanta é inibida por expressão de um CKI de KRP mutante para modular adivisão de célula.

Como descrito acima, eficazmente ao bloquear as proteínas deCKI endógenas de inibir as atividades de ciclina/CDK, a divisão de célula emuma célula de planta é modulada. Tal modulação inclui aceleração de pro-gressão pelo ciclo celular e, finalmente, proliferação celular aumentada.Consequentemente, ao usar os métodos apresentados aqui in vivo (por e-xemplo, plantas transgências, vide supra), um aumento nas produções decolheita e/ou tamanho de semente, vigor de planta aumentado, massa deraiz aumentada, tamanho de fruto aumentado, e similares podem ser obtidos.

A produção de colheita aumentada pode se manifestar em umavariedade de forma que dependem do tecido de planta e espécies de plantaespecíficos nos quais o ciclo celular de planta foi modulado bloqueando-seas proteínas de CKI endógenas de inibir as atividades de ciclina/CDK.

Em colheitas de semente tal como milho, arroz, trigo, cevada,soja, canola, a produção aumentada pode tomar a forma de número de se-mente total aumentado, tamanho de semente aumentado, ou ambos númerode semente e tamanho de semente aumentados. Em uma modalidade, aprodução aumentada é obtida em variedades transgênicas de quaisquer dascolheitas de semente através de expressão de um transgene codificandouma proteína de CKI mutante que resulta em divisão de célula aumentada enúmero de semente total aumentado, sementes maiores, ou tanto o númerode semente quanto o tamanho de semente aumentado. Em uma modalida-de, a expressão do transgene de proteína de CKI mutante é controlada porum promotor constitutivo. Em outra modalidade exemplar, a expressão dotransgene de proteína de CKI mutante é controlada por um promotor especí-fico de semente alvejando o efeito da proteína de CKI mutante para a se-mente que é o componente agronomicamente importante de uma colheita desemente.

Para colheitas de semente oleaginosa, tal como soja, canola,camelina, linho, milho, açafroa, ou girassol, e outro, onde o produto desejadoé óleo, a produção aumentada toma a forma de produção de óleo maior porplanta. O óleo é derivado do embrião na semente. Em uma modalidade, aprodução de óleo aumentada é obtida em variedades transgênicas de quais-quer das colheitas de semente oleaginosa através de expressão de umtransgene codificando uma proteína de CKI mutante que causa a divisão decélula aumentada levando ao número de semente total aumentado, tamanhode embrião aumentado, ou tanto número de semente quanto tamanho deembrião aumentado. O número de semente total aumentado por planta re-sulta em produção de óleo total aumentada por planta. O tamanho de embri-ão aumentado resulta em maior conteúdo de óleo por semente e produçãode óleo total aumentada por planta. Em uma modalidade preferida, a ex-pressão do transgene de proteína de CKI mutante é controlada por um pro-motor específico de embrião determinando a divisão de célula aumentadaem desenvolvimento de embrião precoce que resulta em um embrião maior,uma quantidade de óleo aumentada por semente, e um aumento correspon-dente na produção de óleo total por planta.

A produção de biomassa de não semente é o componente deprodução principal de colheitas tal como alfafa, alface, tabaco, eucalipto, eálamo. A produção aumentada em tais colheitas seria vista no crescimentototal aumentado da planta que resulta em acumulação aumentada de bio-massa. Em uma modalidade, a biomassa aumentada é obtida em varieda-des transgênicas de quaisquer das colheitas de biomassa através de ex-pressão de um transgene codificando uma proteína de CKI mutante quecausa divisão de célula aumentada que leva a biomassa e crescimento au-mentado. Em uma modalidade, a expressão do transgene de proteína deCKI mutante é controlada por um promotor determinando expressão consti-tutiva da proteína de CKI mutante codificando transgene na maioria ou todosos tecidos da planta. Em uma modalidade preferida, a expressão do trans-gene de proteína de CKI mutante é controlada por um promotor específicode tecido que alveja a expressão de um transgene ao componente agrono-micamente importante da planta como a folha em alface ou tabaco ou otronco em eucalipto ou álamo pára aumentar a acumulação de biomassa notecido-alvo.

O açúcar ou celulose é o componente de produção principal decolheitas desenvolvidas para produção de etanol incluindo cana-de-açúcar,beterraba açúcareira, milho, e Panicum virgarum. Em uma modalidade, açú-car aumentado é obtido em variedades transgênicas de quaisquer das co-lheitas de produção de açúcar tal como cana-de-açúcar ou beterraba açúca-reira através de expressão de um transgene codificando uma proteína deCKI mutante que causa divisão de célula aumentada, crescimento aumenta-do do tecido de acumulação de açúcar da planta, e conteúdo de açúcar totalaumentado por planta. Em uma modalidade, a expressão do transgene deproteína de CKI mutante em colheitas produtoras de açúcar é controlada porum promotor determinando a expressão constitutiva da proteína de CKI mu-tante codificando transgene na maioria ou todos os tecidos da planta. Emuma modalidade preferida, a expressão do transgene de proteína de CKImutante é controlada por um promotor específico de tecido alvejando a ex-pressão de transgene para o tecido de acumulação de açúcar da planta talcomo a cana em cana-de-açúcar ou a raiz em beterraba açúcareira dessemodo aumentando a proliferação de célula e crescimento do tecido de arma-zenamento e acumulação de açúcar da planta que resulta no conteúdo deaçúcar total aumentado. Em outra modalidade, a celulose aumentada é obti-da em variedades transgênicas de~ quaisquer das colheitas produtoras decelulose, tal como milho ou switchgrass através de expressão de um trans-gene codificando uma proteína de CKI mutante, que causa divisão de célulaaumentada e síntese de parede de célula desse modo aumentando o conte-údo de celulose que é um componente da parede de célula. Em uma moda-lidade, a expressão do transgene de proteína de CKI mutante é controladapor um promotor determinando a expressão constitutiva da proteína de CKImutante codificando transgene na maioria ou todos os tecidos da planta. Oaumento geral conseqüente na proliferação de célula resulta na deposiçãode parede de célula aumentada e portanto conteúdo de celulose total au-mentado da planta.

EXEMPLOSOs seguintes exemplos são oferecidos para ilustrar, porém nãolimitar, a invenção reivindicada.

Exemplo 1. Produção/purificação de um complexo de cicli-na:CDK ativo e a produção/purificação de moléculas de Krp.

Células de inseto e meios

O sistema de expressão de baculovírus é um sistema eucarióticoversátil para expressão de gene heteróloga. Este sistema fornece duplicaçãode proteína correta, formação de ligação de dissulfeto e outras modificaçõespós-translacionais importantes. Todos os métodos foram tomados do siste-ma de vetor de expressão de Baculovírus: Procedimentos e métodos manu-ais. (BD Biosciences1 Pharmingen, San Diego, CA. 6â ed.). As células deinseto Sf9 foram desenvolvidas a 27°C em meio de célula de inseto TNM-FH(BD Biosciences) para os estudos reportados. Deveria ser notado que meiosalternativos são bem-conhecidos pelo técnico versado e são também úteis.Similarmente, as linhagens de célula de inseto alternativas tal como célulasde Sf21 e High Five TM também trabalharão para produção de vírus e pro-dução de proteína.

Mancha do Oeste e Imunoprecipitações.

A proteína recombinante expressa em células de inseto foi moni-torada através de mancha do oeste. Os extratos de proteína (35,0 g) foramfervidos na presença de tampão de Laemmli, executados em 10% ou 12%de géis SDS-PAGE e transferidos para uma membrana de PVDF empregan-do um aparato de transferência submergido (BioRad). Seguinte a transferên-cia, a membrana foi bloqueada em TBS-T (25 mM de Tris pH 7,5; 75 mM deNaCl; 0,05% de Tween) contendo 5% de pó de leite seco sem gordura. Anti-corpo primário foi empregado em diluição de 1: 1000 durante a noite emtampão de bloqueio de TBS-T. As manchas foram lavadas três vezes 15 mi-nutos em temperatura ambiente. Um anticorpo secundário apropriado conju-gado para peroxidase de raiz forte (HRP) foi empregado a diluição de1:10.000 em tampão de bloqueio de TBS-T. As manchas foram incubadasem anticorpo secundário durante 1 hora e então lavadas três vezes em TBS-T, 15 minutos cada. As manchas foram então processadas como descrito noprotocolo de sistema ECL (Amersham Biosciences). Os anticorpos geral-mente empregados foram: anticorpo monoclonal anti-flag M2 (Sigma), anti-corpo monoclonal ou policlonal anti-HA (Babco), anticorpo anti-PSTAIR(Sigma - Aldrich), monoclonal ou policlonal anti-myc (A-14) (Santa Cruz Bio-technology). Os anticorpos secundários empregados foram IG-HRP antica-mundongo, e IG-HRP anticoelho (GE Healthcare).

As imunoprêcipitações foram realizadas habitualmente para mo-nitorar a formação de complexo entre moléculas de AtciclinaD2;1, AtCDKA eKrp. Os extratos de proteína (14,0 μg) foram diluídos em 0,5 ml de tampãode ligação (100 mM de tampão de fosfato de sódio pH 7,0, 150 mM de NaCI,1% de Triton 100 mais inibidores de protease). A mistura de Proteí-na/anticorpo foi chacoalhada suavemente a 4°C durante cerca de duas ho-ras e em seguida o anticorpo apropriado foi adicionado. (2 μg de anticorpoanti-flag M2; 5 μΙ de anticorpo anti-HA; 5 μ de anti-myc policlonal). A proteínaA sefarose de foi adicionada para produzir um volume de leito de 10 μΙ. Osimunoprecipitados foram então suavemente misturados durante 1 hora a 4°Ce lavados 3 vezes com 1 ml de tampão de ligação. Os complexos de proteí-na ligados às contas de proteína-A sefarose foram então fervidos na presen-ça de tampão de Laemmli. Os complexos de proteína foram resolvidos em10% ou 12% de géis de SDS-PAGE e transferidos para membrana dePVDF. As membranas foram manchadas como descrito acima.

Construção de Vetor de Baculovírus

As seqüências de cDNA de ciclina de Arabidopsis D2; 1 (Atcicli-naD2; 1) e CDKA de Arabidopsis (AtCDKA) foram epitopos rotulados e clo-nados em um vetor de transferência de baculovírus (BD Biosciences). Ou-tros sistemas de vetor de transferência conhecidos pelo técnico também po-dem ser empregados. AtCiclinaD2; 1 foi rotulado com o epitopo FLAG (Sig-ma - Aldrich) na N-terminação adicionando-se as seqüência de aminoácidoMet Asp Tyr Lys Ala Phe Asp Asn Leu (MDYKAFDNL) (SEQ ID NO.: 18) porPCR e então clonadas no vetor de transferência ρ AcHLT (BD Biosciences).

Outros sistemas de vetor de transferência de Baculovírus tal como Baculodi-rect (Invitrogen), também podem ser empregados para este propósito. A se-qüência de aminoácido de epitopo de hemaglutinina (HA) Tyr Pro Tyr AspVal Pro Asp Tyr Ala (YPYDVPDYA; SEQ ID NO: 19) foi colocada na estrutu-ra com as terminações 5' de AtCDKA por PCR e então clonada no vetor detransferência VL1393 (AB Vector.CA). A ciclina e CDK foram epitopos alve-jados para permitir a identificação através de mancha do Oeste e para expe-riências de imunoprecipitação. A ciclina e/ou CDK também podem ser em-pregados sem rótulo. Outros sistemas de vetor de transferência compatíveistambém podem ser empregados.

Produção de Vírus Recombinante

O genoma de Baculovírus empregado é Baculovirus BaculogoldBright (BD Biosciences). Os genomas de Baculovírus alternativos tambémpodem ser empregados. A versão rotulada de Flag de AtciclinaD2;1 foi intro-duzida em uma região dispensável do genoma viral de baculovírus empre-gando recombinação homóloga. A recombinação homóloga ocorreu quandoo vetor de transferência que contém ciclina D2; 1 foi co-transfectado com oDNA de Baculovírus Baculogold Bright BD Iinearizado em células de insetoSf9. As células de SfP foram semeadas em 2 χ 106 células em discos de 60mm e transitoriamente co-transfectadãs com 2 μg de vetor de transferênciaciclina D2;1 (pAcHLT-ciclinaD2;l) mais 0,5 μg de DNA de Baculovírus Bacu-logold Bright BD Iinearizadoempregando reagente de transfecção Fugene 6de acordo com o protocolo do fabricante (RocRe Diagnostics). Após 4 horasde transfecção a solução de Fugene/DNA foi removida e substituída com 3ml de meio de TNM-FH. Quatro (4) dias depois, o sobrenadante foi coletadoe subseqüentemente empregado para infectar mais células para amplifica-ção do vírus. Esta amplificação foi repetida até que o título de vírus fossepelo menos 109 de partículas de vírus/ml. O vírus foi amplificado infectando-se células de Sf9 a uma multiplicidade de infecção (moi) de < 1. O título devírus foi monitorado empregando microscopia de fluorescência e luz.

A versão rotulada de HA de AtCDKA 1 foi introduzida em umaregião dispensável do genoma viral de baculovírus empregando recombina-ção homóloga. A recombinação homóloga ocorreu quando o vetor de trans-ferência que contém ciclina D2;l foi co-transfectado com o DNA de Baculovi-rus Baculogold Bright BD Iinearizado em células de inseto Sf9. As células deSf9 foram semeadas a 2 χ 106 células em discos de 60 mm e transitoriamen-te co-transfectadas com 2 μg de vetor de transferência AtCDKA (pVL1393-AtCDKA) mais 0,5 μg de DNA de Baculovirus Baculogold Bright BD Iineari-zado empregando reagente de transfecção Fugene 6 de acordo com proto-colo do fabricante (Roche Diagnostics). Após 4 horas de transfecção a solu-ção de Fugene/DNA foi removida e substituída com 3 ml de meio de TNM-FH. Quatro (4) dias depois, o sobrenadante foi coletado e subseqüentemen-te empregado para infectar mais células para amplificação de vírus. Estaamplificação foi repetida até que o título de vírus fosse pelo menos 109 partí-culas de vírus/ml. O vírus foi amplificado infectando-se células de Sf9 a umamultiplicidade de infecção (MOI) de < 1. O título de vírus foi monitorado em-pregando microscopia de fluorescência e luz.

Produção de Proteína Recombinante em Células de Inseto.

A produção de proteína de AtciclinaD2;1 rotulada com Flag: At-ciclinaD2; I Rotulado foi obtida infectando-se células de Sf9 frugiperda combaculovírus de AtciclinaD2;1. Para este fim, as células de Sf9 que foramcrescidas em suspensão a 2 χ 106AnI foram infectadas com baculovírus re-combinante a um MOI > 5 (porém outros MOIs mais elevados ou Iigeiramen-te mais baixos também funcionarão) durante cerca de 4 a 5 dias e em segui-da colhidas. As células foram coletadas e centrifugadas a 3000 rpm a 4°C. Opélete de célula foi lavado com meio fresco e em seguida centrifugado a3000 rpm a 4°C. O pélete foi congelado a -80°C ou imediatamente lisado. Otampão de Lise consistiu em 20 mM de Hepes pH 7,5, 20 nM de NaCI, 1 mMde EDTA, 20% de glicerol, 20 mM de MgCI2 mais inibidores de protease(Complet Mini, EDTA free, Boehringer Mannheim), 1 comprimido por 10 mlde tampão de lise. O lisado de célula foi sonicado em gelo 2 vezes durante15 segundos. O lisado de proteína foi então centrifugado a 40.000 rpm emum rotor Beckman TLA 100.2 durante 2 horas. O sobrenadante que contémo AtCiclinaD2;1 rotulado foi aliquotado e congelado a -20°C. A expressão foimonitorada por mancha do Oeste empregando anticorpo monoclonal anti-Flag M2 (Sigma - Aldrich).A produção AtCDKA rotulado foi obtida por infecção de célulasde Sf9 de S.frugiperda com baculovírus AtCDKA e processada da mesmamaneira como descrito acima. A expressão foi monitorada por mancha doOeste empregando anticorpo monoclonal ou policlonal anti-HA (Babco). Aexpressão também pode ser monitorada por mancha do Oeste empregandoanticorpo anti-PSTAIR (Sigma-AIdrich).

Um complexo de cinase ativo de AtciclinaD2; 1/AtCDKA foi pre-parado por co-infecção de células de S. frugiperda de S& com baculovírusde AtciclinaD2;1 (MOI > 5) mais AtCDKA (MOI > 5). O complexo ativo foipurificado como descrito acima. A expressão de proteína foi monitorada pormancha do Oeste de extratos de célula de inseto empregando anticorpo anti-Flag M2 ou anticorpo anti-HA. A interação de AtciclinaD2;1 e AtCDKA foimonitorada através de co-imunoprecipitação como descrito infra.

Ensaio de Cinase

Um ensaio in vitro foi desenvolvido para testar várias moléculasde KRP/ICK quanto à capacidade de inibir os complexos de ciclina/CDK.

A atividade de cinase em extratos de proteína de células de in-seto infectadas com baculovírus individual ou uma co-infecção com os doisbaculovírus foi monitorada com um ensaio de cinase padrão. Histona Hl(HHI) foi o substrato de princípio empregado porém a proteína de retinoblas-toma de tabaco recombinante (Nt Rb) também pode ser empregada como osubstrato (vide Koroleva e outros, Plant Cell 16, 2346-79, 2004). Os ensaiosde cinase foram realizados como segue: 7 μg de extrato de proteína de célu-Ia de inseto foram adicionados a um coquetel de tampão de cinase (KAB: 50mM de Tris pH 8,0, 10 mM de MgCI2, 10 uM de ATP mais 0,5 μα/ml32PyATP e 2 μg de HHI) para um volume final de 30 μΙ. As reações foramincubadas a 27°C durante 30 minutos. A reação de cinase foi interrompidacom um volume igual (30 μΙ) de 2X de tampão Laemmli. A incorporação de[32P] fosfato foi monitorada por auto-radiografia e/ou Molecular DynamicsPhosphorlmager seguinte SDS-PAGE em 12% de géis. As condições detampão alternativas para realizar ensaios de CDK cinase também podem serempregadas. (Vide, por exemplo, Wang e Fowke, Nature 386:451-452, 1997;Azzi e outros, Eur. J. Biochem. 203:353-360, \992; Sirpo e outros, Mol CellBiol. 14:4889-4901, 1994.)

Resultados: Extrato de proteína de células de inseto infectadascom AtciclinaD2;1 sozinho ou AtCDKA sozinho mostrou nenhuma atividadede cinase empregando HHI como o substrato. As células de inseto co-infectadas com vírus AtciclinaD2;1 e vírus de AtCDKA contiveram uma ativi-dade de cinase robusta. As cinases tipo CDK ativo (tipo cdc2) também po-dem ser purificadas de extratos de tecido de proteína de planta ou de extra-tos de célula de cultura de tecido de planta empregando-se contas de agaro-se de pl3sucl (Vide, Wang e Fowke, Nature 386:451-452, 1997; Azzi e ou-tros, Eur. J. Biochem. 203:353-360, 1992) e empregadas em um ensaio simi-lar descrito acima e em experiências de competição descritas abaixo nosExemplos 2 até 8.

Clonagem de CDNAs de Krp em vetor de expressão bacteriano.

Clonagem de AtKrp1

O cDNA de AtKrpI foi clonado de cDNA de Arabidopsis por PCRempregando os seguintes oligonucleotídeos:

(começo) 51 ATGGTGAGAAAATATAGAAAAGCT-S (SEQ ID N0:20); (fim)S'-Tcactctaactttacccattcgta-S (seq Id no:21).

O fragmento de PCR resultante foi subclonado em vetor de p-CRII-TOPO (Invitrogen). O vetor resultante AtKrpI № 359 foi seqüenciadõpara verificar a seqüência correta para GenBank № U94772.5' RACE de clonagem de Krpl de Brassica napus

Blastn foi empregado no Centro Nacional para site da Internet deInformação de Biotecnologia para encontrar seqüências de Brassica homó-logas aos cds de AtKRPI. A pesquisa produziu dois candidatos de EST,CD820320 e CD829052 que se mostraram ser seqüências idênticas.CD820320 foi levado pelo blastx de Jorja para verificar que a seqüência denucleotídeo transladada do EST significantemente se equiparou a seqüênciade proteína de At KRPI.

CD829052 é 646 bp e inclui os últimos 106 aminoácidos de umaseqüência de KRPI de Brassica oleracea e 321 bp do 3' UTR. Um iniciadorde 5' RACE (GSPIbrasskrpl_5'RACE: 51-CTCTGATAATTTAACCCACTCGTAGCGTCCTTCTAATGGCTTCTC -3'; SEQ ID NO: 22) foi designado pararestaurar um KRP1 de Bn de tamanho natural. O iniciador de RACE conteveos últimos 45 nucleotídeos da seqüência de codificação de CD820320.

cDNA 5' RACE pronto foi feito de folha de DH12075 de Brassicanapus empregando o Kit de Amplificação de cDNA SMART RACE (Clonte-ch). 5'RACE foi realizado neste cDNA de acordo com as instruções do kit,exceto que tampão e enzima de pfu (Stratagene) foram empregados em vezde Klentaq. As condições de PCR foram: uma desnaturação inicial a 94°Cdurante 5 minutos, seguido por 35 ciclos de 94°C durante 5 segundos, 68°Cdurante 10 segundos, 72°C durante 3 minutos. O produto de PCR resultantefoi uma faixa muito lânguida de cerca de 600 bp. 2,5. μΙ deste produto dePCR foram então reamplificados empregando as condições de PCR acima.

0 produto de PCR resultante foi clonado no vetor TOPO Blunt (Invitrogen) ètransformado em células alfa ouro (Bioline). O DNA de plasmídeo de doistransformantes foi recuperado e as inserções seqüenciadas com iniciadoresdianteiro e inversos M13. A seqüência de uma inserção candidata foi idênti-ca a CD820320 e foi designada Bn KRP1-II (nenhuma seqüência nova adi-cional veio de RACE). A seqüência da outra inserção candidata, Bn desig-nada KRP1-I, foi 94% idêntica a Bn KRPI-II no nível de nucleotídeo na regiãode codificação, e 86% idêntica no nível de aminoácido pára os últimos 106resíduos. A RACE recobrou a seqüência de codificação total de Bn KRP1-Icom um 108 bp adicional de 5' UTR em vetor TOPO Blunt (pTG313). A se-qüência de codificação BnKrpI (SEQ ID NO:23) é mostrada abaixo:

1 atggtgagaaaatgcagaaaaactaaagggacggtgggagcttcgtctacgtatatgcagcttcgcagccggagaatcgt 8081 ttacagatcggaaaaagctagctcgtcgtcgtcgtcttgttgcgcgagtaacaacaatggagttatagatcttgaggagg 160161 aaagagatggtgagactgaaacgtcgtcgtgtcgacggagtagtaagaggaagctatttgaaaaccttagagaaaaagaa 240241 tctatggagaattcacagcaaatcgtagctggttttgattccgccgtgaaagaatcatcggattgttgttgcagccggag 320321 aacatctttgtcaacgacggaggagaaggggaaatcagcgacggagcaaccaccaacggcagtggagattgaagattttt 400401 tcgtggaagctgagaaacagctccatgataatttcaagaagaagtataactttgatttcgaaaaggagaagccattagaa 480481 ggacgctacgagtgggttaaattatcagagtaa 513

O vetor de expressão bacteriano pETI 6b contém a seqüência decodificação de 6 Histidinas (6XHis, ou (His)6 ou hexaHis) em série parapermitir a purificação de proteína por cromatografia por afinidade de metalimobilizado (Novagen). Este vetor foi modificado de um tal modo para tam-bém incluir um epitopo de poli-Myc imediatamente a jusante e na estruturacom a seqüência de codificação de 6XHis (pET16b-5MYC). O cDNA de At-Krp 1 de tamanho natural foi amplificado de cds de pTG N3 359 TopoIIAtKrpIempregando dois oligonucleotídeos que flanqueiam a seqüência de codifica-ção inteira. Estes oligonucleotídeos contiveram sítios de enzima de restriçãoque facilitam a clonagem no vetor de pET16B-5MYC (5'AtKrp1 Bam Hl/Ndel:ACGGATCCCATATGGTGAGAAAATATAG (SEQ ID NO:24) e 3'AtKrp1 Xhò I:ATCGCTCGAGTCACTCTAACTTTAC (SEQ ID NO:25). O fragmento dePCR resultante foi subclonado no sítio de BamHI e Xho I de pET16b-5myc.

O vetor resultante AtKrp Nq 385 conteve o cDNA tipo silvestre AtKrpI na es-trutura com os rótulos 6XHis e myc.

Os seguintes dois oligonucleotídeos foram empregados paraamplificar o cDNA de BnKrpI que adiciona um sítio de 5' BamHI/Ndel e sítiode restrição XhoI na terminação 3' de BnKRPI (5' BnKrpI BamHINdeI ACG-GATCCCATATGGTGAGAAAATGC (SEQ ID NO:26) e 3' BnKrp 1 XhoI;ATCGCTCGAGTCACTCTGATAATTTAAC (SEQ ID NO:27). O fragmento dePCR foi amplificado de pTG N9 313 (Topoll BnKrpI ) e subclonado no sítio deBamHI e XhoI de pET16b-5myc e seqüènciado. O vetor resultante BnKrp Ns461 conteve o cDNA tipo silvestre BnKrpI na estrutura com os rótulos de6XHis e myc.

Purificação e expressão de proteína Krp recombinant em bactérias.

Todos os plasmídeos de expressão bacterianos pET1 6b e pET16b-5MYC carregando inserções foram transformados em BL21 Star (DE3)(Invitrogen). As colônias bacterianas desta transformação fresca foram em-pregadas para inocular 400 ml de LB que contém 100 μg/ml de ampicilina ecrescidas a 37°C. Quando a cultura alcançou um OD6oo entre 0,6 e 0,8 deproteína recombinante, a expressão foi induzida com 0,5 mM de isopropil-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG). As células foram então crescidas a 30°C du-rante três horas. As células foram coletadas por centrifugação em um rotorJLA 10.500 Beckman. Pélete de célula bacteriana foi armazenado a -80°Cou lisado imediatamente. As bactérias foram Iisadas em 10 ml de tampão delise de fosfato (100 mM de tampão de fosfato pH 7,0, 150 mM de NaCI, 1%de Triton X100) contendo inibidores de protease e necessitando de EDTA. Acultura bacteriana ressuspensa foi sonicada 4X 20 segundos em gelo úmidoa 40% de força. As células Iisadas foram centrifugadas a 14.000 rpm em ro-tor Beckman JA 20.1 durante 15 minutos a 4°C. O pélete de célula foi lavadocom 10 mis de tampão de Iise de fosfato e o pélete de célula foi coletadonovamente através de centrifugação. As moléculas de KRP rotuladas foramprincipalmente insolúveis. KRP rotulados insolúveis foram solubilizados emtampão de Uréia (8M de uréia, 100 mM de Tris pH 7,5). O pélete de célularessuspenso foi brevemente sonicado 3X 15 segundos em gelo úmido a40% de força. As proteínas insolúveis em uréia foram eliminadas por centri-fugação a 14.000 rpm em rotor Beckman JA20.1 durante 15 minutos a 4°C.

Os KRPs rotulados foram purificados em batelada empregando resina deafinidade de metal de Co2+ BD Talon equilibrada em tampão de Uréia. A pu-rificação em batelada foi incubada a 4°C 3 horas durante a noite sob rotaçãolenta. A suspensão foi carregada em uma coluna e resina foi lavada com 36volumes de cama de leito de tampão de uréia seguido por um leito de 12volumes de tampão de uréia que contém 5 mM de Imidazol pH 7,5. A proteí-na de KRP rotulada ligada foi eluída empregando tampão de uréia que con-tém 300 mM de Imidazol pH 7,5. As frações foram monitoradas para KRProtulado por SDS-page e/ou por ensaio de proteína Bradford (BioRad). Areduplicação do KRP1 rotulado desnaturado foi realizada empregando diáli-se de diluição em etapas. As frações que contêm a maioria de proteína deKRP rotulada foram combinadas e dialisadas em uma Uréia IM, 100 mM deTris pH7,5,150 mM de NaCI e 5mM de β-mercaptoetanol mais 5mM de ben-zamidina durante 20 horas a 4°C. O tampão de diálise foi então alterado pa-ra 0,5 M de Uréia, 100 mM de Tris pH 7,5, 150 mM de NaCI e 5 mM de β-mercaptoetanol mais 5mM de benzamidina e continuou durante um adicionalde 12 horas. A proteína recombinante foi coletada, quantificada por ensaiode Bradford e armazenada a 4°C.Mutagênese de Krps.

As versões do tipo silvestre de membros da família de AtKRP emembros da família de BnKRP foram subclonadas no vetor de pCRII-TOPObásico (Invitrogen) para propósitos de seqüenciamento e mutagênese.

O mesmo fragmento de PCR de cDNA do tipo silvestre de At-KRPI contendo o sítio 5'-BamHp construído e o sítio 3' Xhop (vide "Clona-gem de cDNAs de Krp ém vetor de expressão bacteriano", supra) foi subclo-nado no vetor de pCRIl-TOPO (Invitrogen) para mutagênese. O vetor resul-tante Topo-AtKrp Ns 385B conteve o cDNA tipo silvestre de AtKRPI e foi veri-ficado corrigir a seqüência empregando seqüenciamento automatizado pa-drão. O mesmo fragmento de cDNA tipo silvestre de BnKRPI de acima foisubclonado em vetor pCRIl-TOPO (Invitrogen) para mutagênese. O vetorresultante Topo-BnKrp Ns 539 conteve o cDNA tipo silvestre BnKRPI que efoi verificado corrigir seqüência empregando análise de seqüenciamento au-tomatizada padrão.

A mutagênese direcionada ao sítio foi realizada de acordo com oprotocolo para o kit de mutagênese direcionada ao sítio Stratagene's QuikChange.

Para construir BnKrpI Ns 462 com substituições de aminoácidosmúltiplas na região de ligação de ciclina putativa (E129A, E130A, 1131 A,D132A) o BnKrpIDbIeMutNe I de sentido (GGAGCAACCACCAACGGCAGTGGCTGCTGCTGCI I I Il ICGTG; SEQ ID NO:28) e BnKrpIDbIeMutNe 1bde anti-sentido (CACGAAAAAAGCAGCAGCAGCCACTGCCGTTGGTGGTTGCTCC; SEQ ID NO:29) foram empregados para mutagênese direcionada aosítio QuikChange com TopoBnKrpNe 539 como o modelo. O produto de mu-tagênese foi seqüenciado para verificar a presença de mutações desejadas.O produto de mutante foi em seguida subclonado no sítio de BamHIIXhoI depET16b-5MYC para finalmente produzir BnKrpINs 462.

Para construir BnKrpI N2 512 com duas substituições de amino-ácidos nos resíduos altamente conservados da região de ligação de CDK(F151A, F153A) o oligonucleotídeo de BnKrpIDbIeMutNs 2 de sentido (CCTTCTAATGGCTTCTCCTTTTCAGCATCAGCGTTATACTTCTTCTTGAA; SEQID N0:30) e oligonucleotídeo de BnKrpIDbIeMutNe 2b de anti-sentido (TTCAAGAAGAAGTATAACGCTGATGCTGAAAAGGAGAAGCCATTAGAAGG;SEQ ID NO:31) foram empregados para mutagênese direcionada ao sítioQuikChange com TopoBnKrpN9 539 como o modelo. O produto de mutagê-nese foi seqüenciado para verificar a presença de mutações desejadas eentão e subclonado no sítio de BamHI/Xhol de pET16b-5MYC. As mesmassubstituições de aminoácido também foram introduzidas em AtKRPI empre-gando AtKrpI -Topo N9 385B como o modelo empregando os seguintes oli-gonucleotídeos QC ICK1 cds F173A, F175A-codificação" 5'-TTCAAGAAGAAGTACAATGCCGATGCCGAGAAGGAGAAGCCATTA-S; (SEQ ID NO:32)e nQC ICKIcds F173 A1 F175A-noncod" 5'-TTATGGCTTCTCCTTCTGGGCATCGGCATTGTACTTCTTCTTGAA-3 (SEQ ID NO:33).

Para BnKrpIN9 463 com substituições de aminoácidos da regiãode ligação de ciclina putativa e resíduos altamente conservados na região deligação de CDK (E 129 A, E 130A, 1131 A, D132A,+ F151A.F153A) o oligo-nucleotídeo de BnKrpIDbIeMutN9 2 de sentido ((CCTTCTAATGGCTTCTCCTTTTCAGCATCAGCGTTATACTTCTTCTTGAA; SEQ ID N0:30) e oligonu-cleotídeo de BnKrpI DbIeMutN9 2b de anti-sentido (TTCAAGAAGAAGTATAACGCTGATGCTGAAAAGGAGAAGCCATTAGAAGG; SEQ ID NO:32) foramempregados para mutagênese direcionada ao sítio QuikChange com Bn-KrpN9 462 como o modelo. O produto de mutagênese foi seqüenciado paraverificar a presença de mutações desejadas e em seguida subclonado nosítio de BamHI/Xhol de pET16b-5MYC.

Para construir BnKrpI N9 586 com uma única substituição deaminoácidos na região de ligação de CDK (K148A) o oligonucleotídeo deBnKrpI K148A de sentido (GATAATTTCAAGAAGGCGTATAACTTTGATTTC; SEQ ID NO:34) e oligonucleotídeo de BnKrpI K148A de anti-sentido(GAAATCAAAGTTATACGCCTTCTTGAAATTATC; SEQ ID NO:35) foramempregados para mutagênese direcionada ao sítio QuikChange com To-poBnKrpN9 539 como o modelo. O produto de mutagênese foi seqüenciadopara verificar a presença de mutações desejadas e então subclonado nosítio de BamHI/Xhol de pET16b-5MYC.Para construir BnKrpI Ns 587 com uma única substituição deaminoácidos na região de ligação de CDK (Y149A) o oligonucleotídeo deBnKrpIY149A de sentido (AATTTCAAGAAGAAGGCTAACTTTGATTTCGAA;SEQ ID NO:36) e oligonucleotídeo de BnKrpI Y149A de anti-sentido (TTCGAAATCAAAGTTAGCCTTCTTCTTGAAATT; SEQ ID NO:37) foram empre-gados para mutagênese direcionada ao sítio QuikChange com TopoBnKrpN9539 como o modelo. O produto de mutagênese foi seqüenciado para verifi-car a presença de mutações desejadas e então subclonado no sítio de Ba-mHI / XhoI de pET16b-5MYC.

Para construir BnKrpI Ne 588 com uma única substituição deaminoácidos na região de ligação de CDK (N150A) o oligonucleotídeo deBnKrpI N150A de sentido (TTCAAGAAGAAGTATGCCTTTGATTTCGAAAAG;SEQ ID NO:38) e oligonucleotídeo de BnKrpI N150A de anti-sentido (CTTTTCGAAATCAAAGGCATACTTCTTCTTGAA; SEQ ID NO:39) foram empre-gados para mutagênese direcionada ao sítio QuikChange com TopoBnKrpN9539 como o modelo. O produto de mutagênese foi seqüenciado para verifi-car presença de mutações desejadas e então subclonado no local depET16b-5MYC BamHI/Xhol.

Para construir BnKrpI N9 572 com uma única substituição deaminoácidos na região de ligação de CDK (F151A) o oligonucleotídeo deBnKrpI F151A de sentido (AGAAGAAGTATAACGCTGATTTCGGAAAGGA;SEQ ID N0:40) e oligonucleotídeo de BnKrpI F151A de anti-sentido (TCCTTTTCGAAATCAGCGTTATACTTCTTCT; SEQ ID N0:41) foram empregadospara mutagênese direcionada ao sítio QuikChange com TopoBnKrpN9 539como o modelo. O produto de mutagênese foi seqüenciado para verificar apresença de mutações desejadas e então subclonado no sítio de pET16b-5MYC BamHI/Xhol.

Para construir BnKrpI N9 573 com uma única substituição deaminoácidos no região de ligação de CDK (F153A) o oligonucleotídeo deBnKrpI F153A de sentido (AGTATAACTTTGATGCCGAAAAGGAGAAGCC;SEQ ID NO:42) e oligonucleotídeo de BnKrpI F153A de anti-sentido (GGCTTCTC CTTTTCGGCATCAAAGTTATACT; SEQ ID NO:43) foram empre-gados para mutagênese direcionada ao sítio QuikChange com TopoBnKrpNe539 como o modelo. O produto de mutagênese foi seqüenciado para verifi-car a presença de mutações desejadas e então subclonado no sítio de pETI6b-5MYC BamHl/Xhol.

Para construir BnKrpI Ne 553 com duas substituições de amino-ácidos na região de ligação de CDK (K157A; P 158A) o oligonucleotídeo deBnKrpI KP->AA de sentido (GATTTCGAAAAGGA GGCGGCATTAGAAG-GACGCT; SEQ ID NO:44) e o oligonucleotídeo de BnKrpI KP->AA de anti-sentido (AGCGTCCTTCTAATGCCGCCTCCTTTTCGAAATC)(SEQ ID NO:45)foram empregados para mutagênese direcionada ao sítio QuikChange comTopoBnKrpNe 539 como o modelo. O produto de mutagênese foi seqüencia-do para verificar a presença de mutações desejadas e em seguida subclo-nado no sítio de pET16b-5MYC BamHI/Xhol.

Para construir BnKrpI N8 554 com duas substituições de amino-ácidos na região de ligação de CDK (R162A; Y163A) o oligonucleotídeo deBnKrpI RY->AA de sentido (GCCATTAGAAGGA GCCGCCGAGTGGGTTA-AATT; SEQ ID NO:46) e o oligonucleotídeo de BnKrpIRY^AA de anti-sentido (AATTTAACCCACTCGGCGGCTCCTTCTAATGGC; SEQ ID NO:47)foram empregados para mutagênese direcionada ao sítio QuikChange comTopoBnKrpNe 539 como o modelo. O produto de mutagênese foi seqüencia-do para verificar a presença de mútações desejadas e em seguida subclo-nado no sítio de pET16b-5MYC BamHI/Xhol.

Para construir BnKrpI N9 555 com duas substituições de amino-ácidos na região de ligação de CDK (E164A; W165A) o oligonucleotídeo deBnKrpI EW->AA de sentido (AGAAGGACGCTAC GCGGCGGTTAAATTATCAGA; SEQ ID NO: 48) e o oligonucleotídeo de BnKrpIEW-^AA de anti-sentido (TCTGATAATTTAACCGCCGCGTAGCGTCCTTCT; SEQ ID NO: 49)foram empregados para mutagênese direcionada ao sítio QuikChange comTopoBnKrpN9 539 como o modelo. O produto de mutagênese foi seqüencia-do para verificar a presença de mutações desejadas e seguida subclonadono sítio de pET16b-5MYC BamHI/Xhol.

Para construir BnKrpI N9 556 com duas substituições de amino-ácidos na região de ligação de CDK (K167 A; L168A) o oligonucleotídeo deBnKrpIKL^AA de sentido (CGCTACGAGTGGGTTGCAGCATCAGAGTGAGAGC; SEQ ID NO: 50) e o oligonucleotídeo de BnKrpI KL->AA de anti-sen-tido (GCTCTCACTCTGATGCTGCAACCCACTCGTAGCG; SEQ ID NO:51)foram empregados para mutagênese direcionada ao sítio QuikChange comTopoBnKrpNe 539 como o modelo. O produto de mutagênese foi seqüencia-do para verificar a presença de mutações desejadas e em seguida subclo-nado no local de pET16b-5MYC BamHVXhoI.

Para construir BnKrpI Nq 574 com substituições de aminoácidomúltiplas na região de ligação de CDK (F151A; F153A; E164A; W165A) ooligonucleotídeo BnKrpI F151 A, F153A (CCTTCTAATGGCTTCTCCTTTTCAGCATCAGCGTTATACTTCTTCTTGAA; SEQ ID NO: 52) de anti-sentidoF151A, oligonucleotídeo de F153A (TTCAAGAAGAAGTATAACGCTGATGCTGAAAAGGAGAAGCCATTAGAAGG; SEQ ID NO:53) foram empregadospara mutagênese direcionada ao sítio QuikChange com BnKrpI Ns 555 co-mo o modelo. O produto de mutagênese foi seqüenciado para verificar a pre-sença de mutações desejadas e em seguida subclonado no sítio de pET16b-5MYC BamHI/XhoI.

Para construir BnKrpI Ns 598 com substituição de aminoácidosmúltipla na região de ligação de CDK (Y149A;F151A;F153A) o oligonucleotí-deo de BnKrptYI 49A de sentido (AATTTCAAGAAGAAGGCTAACGCT-GATGCTGAA; SEQ ID NO:54) e o oligonucleotídeo de BnKrpIY149A deanti-sentido (TTCAGCATCAGCGTTAGCCTTCTTCTTGAAATT; SEQ ID NO:55) foram empregados para mutagênese direcionada ao sítio QuikChangecom TopoBnKrpNs 512 como o modelo. O produto de mutagênese foi se-qüenciado para verificar a presença de mutações desejadas e em seguidasubclonado no sítio de pET16b-5MYC BamHI/XhoI.

Para construir BnKrpI Ns 547, os dois seguintes oligonucleotí-deos foram empregados para amplificar o cDNA de BnKrpI sem no máximodois aminoácidos C-terminais, isto é, Ser e Glu que adicionam um sítio de 5'BamHI/Ndel e sítio de restrição XhoI na terminação 3' de BnKRPI (5' Bn-Krpl BamHI/Ndel: ACGGATCCCATATGGTGAGAAAATGC (SEQ ID NO:26)e 3' BnKrpI SE>stop XhoI: CTCGAGTCAAGCAGCTAATTTAACCCACTCGTA (SEQ ID NO:56). O fragmento de PCR foi amplificado de pTG N2 313 (To-poll BnKrpI) e subclonado no sítio de BamHI e XhoI de pET1 6b-5myc eseqüenciado. O vetor resultante BnKrp Ns 547 conteve o cDNA de BnKrpIna estrutura com os rótulos de 6XHis e myc.

Para construir BnKrp 1 Ns 614, os dois seguintes oligonucleotí-deos foram empregados para amplificar o cDNA de BnKrpI sem o domíniode ligação de CDK total. 5' BnKrpI BamHI/Ndel: ACGGATCCCATATGGTGAGAAAATGC (SEQ ID NO: 26) e o 31 BnKrpIAcdk: CTCGAGTCACTTCTTGAAATTATC (SEQ ID NO: 57) que contém um sítio a XhoI. O fragmento dePCR foi amplificado de pTG N2 420 (Topoll BnKrpI) e subclonado em Topoll(Invitrogen) e seqüenciado. O fragmento de BamHI/Xhol foi em seguida sub-clonado em pET16b- 5myc. O vetor resultante BnKrp Ns 614 conteve o cD-NA de BnKrpI sem a seqüência de codificação para a região de ligação deCDK na estrutura com os rótulos de 6XHis e myc.

Exemplo 2. Homologia de aminoácido entre p27KIP1 de mamífe-ro e KRPs de planta.

A família de CIP1/KIP1 de CKIs utiliza duas regiões de contatopara ligar e inibir o complexo de cinase. Com base neste modo de ligação einibição, a alteração das capacidades de ligação destas duas regiões pode-ria resultar potencialmente em uma proteína negativa dominante que aindapudesse interagir com o complexo (pelo domínio intacto), não mais inibir aatividade de cinase e interferir com o CKI tipo silvestre de inibir um complexode ciclina/CDK ativo. Por exemplo, se a região de ligação de ciclina foi tor-nada não funcional, a proteína mutante ainda interagiria através da região deligação de CDK com o complexo de cinase através do domínio intacto. Simi-larmente, se a região de ligação de CDK foi tornada não funcional, a proteí-na mutante ainda interagiria através da região de ligação de ciclina com ocomplexo de cinase.

A família AtKrp de CKI's compartilha homologia em toda a prote-ína total com ã maior homologia residente na maioria dos 40 a 45 aminoáci-dos de terminal C (vide Wang é outros, Nature 386:451-452, 1997; Wang eoutros, Plant J. 15:501-510, 1998; Lui e outros, Plant J. 21 :379-385, 2000;De Veylder e outros, Plant Cell 13:1653-1667, 2001; Jasinski e outros, PlantPhysiol 130:1871-1882, 2002; Zhou e outros, Plant Cell Rep. 20:967-975,2002; Zhou e outros, Plant J. 35:476-489, 2003). Entretanto, somente apro-ximadamente os últimos 23 aminoácidos da familiar de Krp mostram homo-logia ao p27Kipl mamífero (vide figura 1).

As experiências de ligação in vitro foram realizadas para ajudara elucidar as interações de ligação entre um KRP representativo, isto é Bn-Krpl, e o AtciclinaD2;1 e o AtCDKA. As interações de ligação de outro mem-bros da família de KRP podem ser elucidadas empregando as mesmas ex-periências de ligação in vitro descritas abaixo. As experiências de ligação invitro empregando versões de mutante BnKRPI contendo substituições deaminoácido de aminoácidos altamente conservados na região de ligação deCDK revelaram que esta região somente foi necessária para a ligação aoCDK, ao mesmo tempo em que a ligação a Atciclina ainda estava intacta. Demodo mais importante um domínio de ligação de CDK intacto é requeridoabsolutamente para inibição do complexo de AtCyclinaD2/CDKA. Os amino-ácidos se situando imediatamente a montante da região de ligação de CDK,em uma região que os presentes inventores sugerem ser a região de ligaçãode ciclina, são conservados entre os membros de família de KRP (vide figura1) porém não em p27KIP1. A mutação de vários resíduos conservados nestedomínio de ligação de ciclina sugerido ab-roga a interação com Atcycli-naD2;l, ao mesmo tempo em que a interação com AtCDKA permanece intac-ta. De modo interessante, este mutante de região de ligação de ciclina puta-tivo ainda inibe o complexo de AtciclinaD2/CDKA cinase contudo não tãoeficazmente quanto o KRPI tipo silvestre. A concentração inibidora que reduza atividade de cinase em 50% (IC50) foi 0,035 μg para o KRP1 tipo silvestre(BnKrp Ne 461) ao mesmo tempo em que o IC5o para o mutante de ligaçãode ciclina (BnKrpNs 462) foi 1,25 μg.

Observações similares foram vistas com a contraparte de p27KIP1de mamífero (vide Vlach e outros, EMBO J. 16:5334-44, 1997). O IC50 domutante de ligação de ciclina p27KIP1 foi aumentado em comparação aop27KIP1 tipo silvestre. Em contraste entretanto, as concentrações elevadas domutante de ligação de p27 KIP1 CDK foram ainda capazes de inibir o comple-xo de cinase. Isto é explicado provavelmente pela presença da hélice 310em p27 K,P1 de mamífero que está ausente na planta Krps (vide exemplo 3para uma explicação).

Estes dados indicam que duas regiões em KRPs existem quesão similares à contraparte de p27KIP1 de mamífero responsável pela intera-ção com o complexo de cinase ativo. De modo interessante, o mutante dedomínio de ciclina ainda poderia inibir o complexo de cinase, sugerindo quea região de ligação de CDK fosse principalmente responsável pela inibiçãode cinase de ciclina/CDK. Similarmente a região de ligação de ciclina dep27KIP1 desempenhou um papel aditivo na inibição de complexos de CDKativos. Ainda estes resultados ilustram que em contraste com p27KSP1, a re-gião de ligação de CDK de KRP1 desempenha um papel mais significantena inibição de cinase.

Então ao focar na homologia elevada entre a família de KRP ep27KIP1 na região de ligação de CDK os resíduos serão alterados para final-mente criar uma molécula de BnKrpI negativa dominante que ainda podeligar o complexo, interferir com BnKrpI tipo silvestre de inibir o complexo decinase, contudo não inibir o próprio complexo.

Exemplo 3. Estrutura de proteína: de p27 KIP1 dè mamífero emcomplexo com ciclina/CDK empregada para identificar os aminoácidos prin-cipais que contatam CDK que são conservados em KRPs de planta.

Para facilitar o desígnio das moléculas de Krp negativas domi-nantes que interfeririam finalmente com a função de KRP tipo silvestre a es-trutura previamente publicada de p27KIP1 de mamífero em complexo comcomplexo de ciclina A-CDK2 cinase foi empregada (vide Russo e outros,Nature 382:325-331, 1996). As informações estruturais junto com a informa-ção de alinhamento foram combinadas para identificar os aminoácidos prin-cipais que quando alterados para alanina ou outros resíduos de aminoácidoresultaram em uma proteína com características negativas dominantes. Es-tas características dominantes são como segue: 1) Krp mutante se liga aoscomplexos de ciclina/CDK, 2) proteína mutante substancialmente não inibe aformação de complexo de ciclina/CDK até mesmo a concentrações elevadase 3) proteína mutante deveria competir substancialmente com a molécula deKRP tipo silvestre para ligar a complexos de ciclina/CDK. Os Krps mutantesin vivo, que cumprem estas características resultariam em atividade de cicli-na/CDK cinase elevada na célula que finalmente levaria à proliferação decélula aumentada e um índice mitótico mais elevado.

A atividade de ciclina A/CDK2 cinase de mamífero pode sercompletamente interrompida pela ligação de p27KIP1. O mecanismo pelo qualp27KIP11 jnibe complexo de ciclina A/CDK2 cinase foi mostrado ser um pro-cesso complexo (vide Russo e outros, supra). p27KIP1 utiliza dois meios parainibir o complexo de cinase ativo. O primeiro componente para a inibiçãoenvolve a hélice 310 de p27KJP1 que é aparentemente não conservada emquaisquer das famílias de KRP de planta de CKIs. A hélice 310 se insere nafenda catalítica da cinase para imitar o substrato de ATP. A ocupação destaregião de fenda pela hélice 310 eficazmente bloqueia a ligação de ATP eatividade de cinase. Porém até mesmo na ausência da hélice 310, p27 KIP1ainda foi capaz de inibir o complexo de cinase (vide Polyak e outros, Cell78:59-66, 1994).

A comparação da estrutura cristalina de p27 KIP1 ligado a ciclinaA/CDK2 e o complexo Idnase sozinho ilustrou que o lóbulo N-terminal deCDK2 sofre alterações conformacionais significantes em p27 p27KIP1 de liga-ção (vide Russo e outros, supra). Na realidade, as β-folhas específicas nolóbulo N-terminal da cinase que normalmente ajudam a coordenar o ATP nosítio ativo são perdidas na ligação de p27KIP1. A ligação de p27KIP1 induz umareduplicação que envolve resíduos de β-grampo, β-filamento e uma hélice310 de p27KIP1 e aminoácidos de β-folha do lóbulo N-terminal de CDK2 quereduplica para formar um β-sanduíche intermolecular (vide id.). Esta confor-mação de alteração sozinha é capaz de significantemente inibir a atividadede ciclina A/CDK2 cinase. Os resíduos no p27KIP1 que formam este β-san-duíche são altamente conservados em todos os membros de família dep27KIP1 de mamífero e também bem conservados em todos os membros defamília de KRP. Com baseado nos resultados apresentados no Exemplo I5 ea falta de uma hélice 310 conservadora, a região de ligação de CDK conser-vada nos membros de família de KRP provavelmente se liga ao complexo decinase ativo e inibe a atividade de cinase induzindo-se alterações conforma-cionais no lóbulo N-terminal da AtCDKA cinase. Porém, outra região de KRPnão pode ser excluída como de fato imitando a ligação de ATP inserindo-sena fenda catalítica da mesma maneira que a hélice 310 faz em p27 KIP1 demamífero.

A maioria dos 23 aminoácidos carbóxi-terminais da família deKRP mostra a maior identidade de aminoácido para o p27 KIP1 de mamífero(vide figura 1). Vários resíduos conservados em BnKrpI foram sistemica-mente alterados com base na identidade de seqüência com p27KIP1 de ma-mífero, desempenhando um papel na formação do β-sanduíche entre o CKIe o complexo de cinase. Cada mutante foi comparado com o BnKrpI tiposilvestre (BnKrpNs 461) quanto a sua capacidade de inibir o complexo decinase. Em alguns casos o mutante que BnKrpI também foi monitorado parase ligar a AtciclinaD2;1 ou ao AtCDKA. Os resultados para estas experiên-cias estão resumidos abaixo na Tabela 2.

As mutações foram introduzidas como descrito em detalhes noExemplo 4, "Polipeptídeos de CKI de KRP Mutantes".

"No máximo ria extremidade N-terminal da região de ligação deCDK reside o motivo Lys Tyr Asn Phe Asp Phe (KYNFDF) (SEQ ID NO:58).

Este motivo é altamente conservado nos membros da família de KRP deambas espécies de Arabidopsis e Brassica napus. Estes resíduos são para amaior parte conservada em ρ271Λ1. Em p27KIP1 eles formam uma porção deuma volta de β-grampo que no final forma o β-sanduíche com de CDK2 nocomplexo de ciclina Á-CDK2. Cada destes resíduos conservados, foi altera-do para alanina e testado quanto à sua capacidade de inibir o complexo decinase (vide Tabela 2). Muitas únicas mutações de substituição de aminoá-cido não afetaram a capacidade de inibir o complexo de cinase in vitro. Po-rém, BnKrpI Ns 587 e BnKrpI N9 572, mostraram resultados interessantes.

Em cada caso, a inibição de cinase foi atenuada comparada à proteína tiposilvestre sugerindo que esta região de KRP1 desempenha um papel na inibi-ção de cinase.

As cadeias laterais de ambas fenilalaninas 62 e 64 em p27KIP1contatam CDK2, desempenham um papel integral na formação do β-san-duíche e são conservados em KRP1. (Vide figura 1). Uma vez que a ativida-de inibidora de Krp 1 F151 A (BnKrpI Ns 572) foi parcialmente comprometi-da, ambas as fenilalaninas 151 e 153 foram alteradas para alanina. Este mu-tante duplo, BnKrpI Ne 512 não mais inibiu o complexo de cinase apesar desua capacidade de ainda ligar o complexo de cinase por ciclinaD2; 1. Podeainda haver alguma ligação residual deste mutante à porção de CDK docomplexo.

A tirosina 149 de KRP1 não é conservada em p27KIP1; porém, sesitua na posição N-terminal do β-grampo que contata CDK2 e forma parte doβ-sanduíche. A tirosina 149 é altamente conservada em membros de famíliade KRPs de Arabidopsis e Brassica. Quando Tirosina 149 foi alterada paraalanina (BnKrpI Ns 587), a atividade inibidora foi parcialmente comprometi-da, sugerindo que a tirosina desempenha um papel importante na ligaçãoe/ou inibição de CDKA. Então, a mutação desta posição (Y149A) pode sercombinada com o mutante duplo Krpl F151A; F153 A. Este mutante triplo foiesperado reter sua ligação ao complexo de cinase ao mesmo tempo em queperdendo sua capacidade de inibir a atividade de cinase.

A região C-terminal para o motivo de KYNFDF (SEQ ID NO:58)em KRP1 também contém vários aminoácidos que são conservados emp27KIP1. (Vide figura 1). Muitos destes resíduos são conservados no β-fila-mento de p27KIP1 que forma uma porção do β-sanduíche. Vários destes ami-noácidos conservados foram alterados em pares para alanina (vide Tabela 2para sumário). Em todos menos um caso, a função de inibidora não foi signi-ficantemente prejudicada. A exceção foi o Krpl Nq 545 (E164A;W165A) mu-tante que foi um inibidor muito mais fraco do que o KRPI tipo silvestre. O trip-tofano 165 estende sua cadeia lateral no β-sanduíche. As fenilalaninas 151,153 e E164 e W165 foram todas alteradas para alanina (Krp1 Ns 574). EsteBnKrpI mutante^composto também não inibiu o complexo de cinase atémesmo quando empregado em concentrações elevadas.

A truncação da região de ligação de CDK completa de KRP1 foitambém incapaz de inibir o complexo de cinase. Isto não foi surpreendenteuma vez que a região inteira responsável pela ligação do CDK foi deletada.

Porém acredita-se que provavelmente uma tal truncação resultará em umaproteína instável.

Exemplo 4. Polipeptídeos de KRP CKI Mutante.

Como uma melhora sobre as técnicas anteriores empregadaspara silenciar a expressão de gene no nível de RNA pós-transcricional, asupressão dos membros da família de KRP em plantas foi realizada ao nívelde proteína empregando uma estratégia dominante-negativa. O princípiobásico da estratégia negativa dominante é construir um gene para produziruma proteína mutante que impede as cópias normais da mesma proteína derealizar sua função. Neste caso, a proteína dè KRP normal forma um com-plexo de multi-subunidade com complexo de ciclina/CDK para inativar a ati-vidade de cinase. Então, expressando uma versão de mutante de KRP1 tiposilvestre interferirá com as cópias normais de KRP1 de inibição da atividadede ciclina/CDK cinase. Além disso, determinado o grau elevado de homolo-gia entre os 7 membros da família de KRP de Brassica, o mutante KRP1 secomportará como um negativo dominante para outros membros da família oupossivelmente todos os membros da família. Finalmente, ás regiões de liga-ção de CDK e ciclina de KRPs são bem-conservadas em outras espécies deplanta. Então, este KRP1 negativo dominante protegerá os complexos deciclina/CDK cinase de inibição por KRPs endógeno em outras plantas talcomo, por exemplo, milho, trigo, Canola, soja, arroz, algodão, álamo e simi-lares.

Previamente, os mutantes negativos dominantes foram empre-gados para ajudar a elucidar várias vias de transdução de sinal. Em particu-lar, Ras negativo dominante, um GTPase é a proteína negativa dominantemais geralmente empregada até hoje e desempenhou um papel principal naestratégia empregada para estudar outros GTPases (Feig e Cooper, Mol.Cell. Biol. 8:3235-3243, 1988). Similarmente, as versões negativas dominan-tes de CDKs foram empregadas para identificar funções para CDKs em con-trole de ciclo celular (van den Heuvel e Harlow, Science 262:2050-2054,1993).

A família de KIP/CIP de CKIs difere da família de INK de inibido-res no mecanismo que eles usam para inibir o complexo de cinase. Aomesmo tempo e que a família de INK somente se liga ao CDK, a família deClP/KlP tem duas regiões conservadas que independentemente se ligam aciclina e CDK. O fato que a família de CIP 1/KIP 1 de CKIs e a família deKRP de CKIs utilizam duas regiões de contato para ligar o complexo, lhestornam um candidato ideal para a estratégia negativo dominante. Isto é por-que a região de ligação de CDK pode ser alvejada para mutantes que abo-lem a interação com o CDK ao mesmo tempo em que mantendo a região deKRP1 que liga a ciclina intacta.

Na presente invenção, a canola, Brassica napus (Bn), KRPs emoléculas KRP de Arabidopsis thaíiana (At) de agrião de orelha de camun-dongos, foram clonadas e sua capacidade de inibir a atividade de cicli-na/CDK foi confirmada. Para este fim, um ensaio in vitro foi desenvolvidopara testar várias capacidades de KRPS de inibir os complexos de cicli-na/CDK. A ciclina de Arabidopsis D2;1 (AtciclinaD2;1) e Arabidopsis CDKA(AtCDKA) foram epitopos rotulados e clonados em um sistema de vetor deexpressão de baculovírus (BD Biosciences). AtCiclinaD2;1 foi rotulado com oepitopo de FLAG (Sigma-AIdrich) na N-terminação. O epitopo de hemagluti-nina (HA) foi colocado na estrutura com a extremidade 5' de AtCDKA. A pro-dução de proteína de AtciclinaD2;1 foi obtida infectando-se células de Sf9 deS. frugiperda com baculovírus de AtciclinaD2;1. A produção de AtCDKA foiobtida por infecção de células de Sf9 de S. frugiperda com baculovírus deCDKA. Um complexo ativo de ciclina D2;1/CDKA foi realizado por co-infec-ção de Sf9 de S. frugiperda com AtciclinaD2;1 mais Baculovírus de AtCDKA.

A ciclina, CDK e o complexo ativo foram purificados e analisados quanto àatividade de cinase. A atividade de cinase monitorada empregando um en-saio de cinase padrão com Histona Hl (HHI) como o substrato ou empregan-do-se NtRb recombinante (Nakagami e outros, Plant Cell 14:1847-1857,2002). As células de inseto infectadas de Ciclina D2; 1 não produziram ne-nhum complexo ativo. Similarmente, as células infectadas de CDKA nãoproduziram nenhuma cinase ativa. Quando células foram infectadas comambos o Atciclina D2;1 e AtCDKA1 a atividade de cinase foi facilmente detec-tada. Os complexos de CDK de ciclina ativos também podem ser purificadosde extratos de tecido de proteína de planta ou de extratos de célula de cultu-ra de tecido de planta empregando-se contas de agarose de p13suc1 (Wange outros, Plant J. 15:501 -510, 1998).

Os Krps foram designados para conter um rótulo de epitopo depolihistidina N-terminal (rótulo HIS) por subclonagem da estrutura de cDNAde Krp com a seqüência de codificação para o rótulo HIS no vetor depET16b (Novagen). A expressão de proteína Krp mutante e tipo silvestre foiinduzida em bactérias e subseqüentemente purificada como uma proteína defusão de rótulo HIS empregando Ni-agarose.

Todo (Bn)Krps de Brassica napus tipo silvestre testado (BnKRP1, BnKRP4, BnKRP5) foi extremamente eficaz na inibição do complexo deciclina D2;1/CDKA. Em todos os casos a inibição também foi responsiva adose. Vários outros AtKrps (AtKRP 1, AtKRP2) de Arabidopsis também fo-ram inibidores eficazes.

A família de CIP 1/KIP1 de CKIs utiliza duas regiões de contatopara ligar e iniba o complexo de cinase. Baseado neste modo de ligação einibição, a alteração das capacidades de ligação de uma destas duas regi-ões poderia resultar potencialmente em uma proteína mutante com caracte-rísticas negativas dominantes. Por exemplo, se a região de ligação de ciclinaé feita não funcional, a proteína mutante ainda interagiria pela região de liga-ção de CDK com o complexo de cinase pelo domínio intacto. Similarmente,se a região de ligação de CDK é feita não funcional, a proteína mutante ain-da interagiria pela região de ligação de ciclina com o complexo de cinase.

Os membros da família de ICK/KRP limitaram a identidade deaminoácido à família de p27KIP1 de mamífero. Esta identidade é limitada amaioria dos 24 a 30 aminoácidos C-terminais. Na realidade o local do domí-nio de ligação de ciclina/CDK de p27KIP1 de mamífero fica situado na N-terminação da proteína ao mesmo tempo em que a região homóloga nosKrps de planta é encontrada na maioria da porção C-terminal da proteína.(Vide, figura 1, mostrando alinhamento de p27 KIP1 e vários membros da fa-mília de Krp). A região de ligação de ciclina em p27KIP1 de mamífero não éconservada em KRPs de planta. Ainda a região imediatamente a montanteda região de ligação de CDK putativa é conservada em todos os KRPs deplanta. Esta região conservada embora não homóloga a p27 KIP1 poderia serresponsável pela interação com a ciclina. As substituições de aminoácido devários resíduos nesta região de ligação de ciclina proposta de BnKRPI (a-minoácidos 125-138) abole a ligação a ciclina porém não afeta a ligação aoCDK. Estes dados sugerem que duas regiões existam em KRPs similares acontraparte de p27K1P1 de mamífero que media a interação com o complexode cinase ativo. De modo interessante, a mutação da região de ligação deciclina não aboliu completamente a inibição do complexo de cinase, sugerin-do que a região de ligação de CDK é principalmente responsável pela inibi-ção de ciclina/CDK cinase.

Determinado o grau elevado de homologia entre as regiões deligação de CDK de CKIs de planta e mamífero, a estrutura cristalina dep27KIP1 ligada ao complexo de ciclina A/CDK2 foi empregada para ajudar aidentificar os resíduos de contato de p27KIP1 que ligam a ciclina e CDK (Rus-so e~outros, Naturé 382:325-331, 1996). Os resíduos de contato foram com-parados com várias seqüências de KRP para determinar se ou não elas sãoconservadas na região que carrega a homologia mais elevada para p27KIP1.

Na maioria da extremidade N-terminal da região de ligação de CDK se situano motivo LysTyrAsnPheAspPhe (KYNFDF) (SEQ ID NO:588). Estes resí-duos são na maior parte conservados em p27. Elas formam uma β-folha quecontata CDK2 no complexo de ciclina A-CDK2.

Cada um destes resíduos conservados, foi alterado para alaninae testado quanto à sua capacidade de inibir o complexo de cinase. De modointeressante, muitas destas únicas mutações de substituição de aminoácidonão afetaram a capacidade de inibir o complexo de cinase in vitro. Entretan-to, os mutantesjde KRP1 F151 A e KRP1 Y149A reduziram a atividade deCKI sem afetar a ligação ao complexo de cinase.

Uma vez que as cadeias laterais de ambas as fenilalaninas 151e 153 contatam a atividade inibidora de CDK e KRP1 F151A foram parcial-mente comprometidas, ambas as fenilalaninas 151 e 153 foram substituídaspor alanina. Este mutante duplo BnKrp 1 (BnKrpI F151A; F153A) não maisinibe o complexo de cinase apesar de sua capacidade de ligar o complexode cinase por ciclinaD2;1. Não pode ser desconsiderado que ainda podehaver algumas ligações residuais deste mutante à porção de CDK do com-plexo.

A tirosina 149 em KRP1 não é conservada em p27 KIP1, porém nomodelo estrutural de p27 mamífero um resíduo de aminòácido similar se si-tua na posição da β-folha que contata CDK2. Quando alterada para alanina(KRP1 Y149A) a atividade inibidora foi parcialmente comprometida, sugerin-do que este resíduo de aminoácido desempenha um papel importante nainibição e/ou ligação de CDKA. Então, a mutação desta posição (Y149A)combinada com o mutante duplo KRP1 F151 A; F153A produziu uma proteí-na variante que não mais inibiu o complexo de cinase. É esperado que estemutante triplo (BnKrpI Y149A; F151A; F153A) ainda retenha a ligação aocomplexo de cinase ao mesmo tempo em que incapaz de inibir a atividadede cinase.

Como acima, as únicas substituições de aminoácido de Y149A eF151A ambos individualmente reduziram a capacidade do polipeptídeo deBnKrpI mutante de inibir o complexo de cinase. O BnKRPI Y149A; F151Aduplo mutante é esperado produzir uma proteína mutante que não mais inibeo complexo de cinasa.

A região C-terminal para o motivo de KYNFDF (SEQ ID NO:58)em KRP1 também contém vários aminoácidos que são conservados emp27KIP1. Estes aminoácidos conservados foram alterados, em pares paraalanina. Em todos menos um caso, a função inibidora não foi significante-mente prejudicada. A exceção foi KRP1 E164A;W165A mutante que foi uminibidor muito mais fraco do que o KRP1 tipo silvestre. Em uma proteína de-rivada separada, as Fenilalaninas 151, 153 e E164 e W165 foram todassubstituídas por alanina. Este mutante múltiplo de BnKRPI também não ini-biu o complexo de cinase.

A truncação da região de ligação de CDK completa de KRP1também foi incapaz de inibir o complexo de cinase. Isto não foi surpreenden-te uma vez que a região inteira responsável pela ligação do CDK foi deletada.

Os resultados da avaliação de vários mutantes de BnKrpI quan-to à atividade biológica são resumidos na Tabela 2.

Tabela 2. Atividade biológica de Mutantes de BnKRPI

<table>table see original document page 90</column></row><table>

1 Proteção do complexo de cinase da inibição por BnKrpI do tipo silvestre.

2 N/A significa meios não aplicáveis.

3 ND significa não determinado.

4 Candidato não inibiu a atividade de cinase nem sequer quando empregadoaté' 10 vezes a quantidade mínima de inibidor de tipo silvestre necessáriapara abolir a atividade de cinase.

Como anteriormente mencionado, o rompimento do domínio deligação de ciclina resultou em uma proteína de KRP1 mutante que ainda re-teve alguma atividade inibidora. Não obstante, provavelmente há outros a-minoácidos dentro da região de ligação de ciclina putativa (aminoácidos 125-138) que podem ser alterados para criar uma proteína mutante que cumpreas características negativas dominantes opcionais. Além disso, ao mesmotempo em que a alanina foi empregada em todas as substituições nestesestudos particulares, é esperado que a substituição dos resíduos de amino-ácido identificados com outro resíduo de aminoácido de não alanina sejadiferente significantemente em uma ou mais propriedades físicas (outrassubstituições não conservadoras) também produzirá uma proteína negativadominante. Em particular, é esperado que a substituição de um resíduo deaminoácido particular com um aminoácido de modq oposto carregado oucom um resíduo de aminoácido com uma característica de definição subs-tancialmente diferente, tal como um resíduo hidrofílico com um resíduo hi-drofóbico e vice-versa, e outro, produzirá um candidato negativo dominanteaté melhor.

O candidato de negativo dominante ideal não inibirá a atividadede cinase nem sequer quando empregada até 10 vezes, a quantidade míni-ma de inibidor tipo silvestre necessária para abolir a atividade de cinase. Vá-rios mutantes cumpriram esta exigência (vide Tabela 2). A importância destacaracterística se situa no fato que quando expressos in vivo, os níveis daproteína mutante podem estar em níveis de excesso comparado à proteínade tipo silvestre.

As moléculas de BnKrpI negativas dominantes identificadasneste estudo eficazmente protegem o complexo de ciclinaD2;1/CDKA deinibição de BnKrpI tipo silvestre. A mesma molécula de KRP1 derivada ne-gativa dominante também protege o complexo de cinase de inibição atravésde moléculas de KRP de outras espécies tal como milho, soja, arroz, algo-dão, álamo e alfafa (vide Exemplo 7).

Exemplo 5. Proteínas de BnKrpI mutantés competi%amentebloqueiam a proteína de CKI tipo silvestre de inibir o complexo de cinase.

Os candidatos negativos dominantes qüê são particularmenteúteis não inibirão a atividade de cinase nem sequer quando empregado até10 vezes, a quantidade mínima de inibidor de tipo silvestre necessária paraabolir a atividade de cinase. Vários mutantes cumpriram esta exigência (videTabela 2, figura 1, e Exemplo 2). A importância desta característica se situano fato que quando expressos in vivo, os níveis da proteína mutante podemestar em níveis de excesso comparados à proteína de tipo silvestre, e é im-portante que a proteína mutante substancialmente não iniba o complexo decinase em virtualmente qualquer concentração.

Vários candidatos negativos dominantes foram testados quantoà sua capacidade de proteger o complexo de ciclinaD2;1/CDKA de BnKrpItipo silvestre. As experiências de competição foram realizadas como segue.Complexo de ciclinaD2;1/CDKA Cinase de ativo ^g) foi pré-incubado cómmutantes de BnKrpI negativos dominantes candidatos ^g ou 1(^g) duran-te 20 minutos em tampão de IX cinase. O complexo foi então testado quantoà sua atividade de cinase na ausência ou após a adição de BnKrpI tipo sil-vestre (O^g, 1,0 μg ou 2μg) empregando HHI como o substrato. As rea-ções de cinase foram então resolvidas por SDS PAGE como descrito no E-xemplo 1, "Ensaio de Cinase". Os resultados foram quantificados por phos-phorlmager (Molecular Dinamics),

BnKrpI F151A; F153A (BnKrpI Ne 512) foi capaz de proteger ocomplexo de cinase de inibição pelo BnKrpI tipo silvestre. 5μg de BnKRPIF151 A; F153A restabeleceu até 40% da atividade de cinase na presença de0,6 μg de KRP Itipo silvestre. Este efeito negativo dominante foi dependentede dose, até 60% da atividade de cinase foi restabelecida quando 10^g deBnKRPI F151 A; F153A foi empregado.

O BnKrpI Ne 555 mutante (E164A; W165A) é um candidato denegativo dominante promissor porque também não inibiu a atividade de ci-nase até mesmo quando empregado em 10 μg por reação. Em experiênciascompetitivas, este mutante protegeu o complexo de cinase ativo de inibiçãopor KRP 1 tipo silvestre porém só reótaurou atividade em 14% quando 5 μgforam empregados e em 15% quando 10 μg foram empregados. As muta-ções de BnKrpI N9 512 e BnKrpI Ne 555 foram combinadas em uma proteí-na mutante chamada BnKrpI Nq 574 (F151A, F153A, E164A, W165A). Estemutante composto não inibiu a atividade de cinase em si próprio em quanti-dades de 5 μg e 10 μg. Este mutante composto foi capaz de proteger o com-plexo de cinase de inibição por BnKrpI tipo silvestre porém pôde somenterestaurar a atividade por até 35%. O BnKrpI Ne 598(Y149A; F151A; F153A)mutante foi capaz de proteger o complexo de cinase de inibição pelo BnKrpItipo silvestre. 5 μς de BnKRPI F151A; F153A restaurou até 55% da ativida-de de cinase na presença de 0,6 μρ de KRP1 tipo silvestre. Este efeito nega-tivo dominante foi dependente dose, até 80% da atividade de cinase foi res-taurada quando 10 μg de BnKRPI Y149A;F151A;F153A foram empregados.

Estes dados sugerem que a região ideal para alvejar um negati-vo dominante seja a região de β-grampo. Porém não só qualquer resíduopode ser alterado. Várias únicas substituições de aminoácido falharam aocriaram um Krp negativo dominante (vide Exemplo 3) porém na realidade, aalteração demasiada dos resíduos conservados também resultado em ummutante que cumpre a maioria das exigências do negativo dominante excetono final não se comportou como um negativo dominante. AtKrp2 é o maisintimamente relacionado com BnKrpI e AtKRPI. O AtKrp2 mutante onde omotivo de KYNFDF (SEQ IS NO:58) foi alterado para KAAAAA (SEQ IDNO:59) teve características promissoras de uma molécula de Krp negativadominante. Em concentrações elevadas, este BnKrp2 mutante não inibiu ocomplexo de cinase como esperado. De modo interessante, este mutantenão protegeu a cinase de inibição por BnKrpI tipo silvestre.

Em sumário: BnKrpI F151A; F153A bloqueou o KRP tipo silves-tre de inibir a cinase, KRP1 E164A; W165A não foi tão bem ao bloquear oKRP tipo silvestre ao mesmo tempo em que BnKrpI (Y149A;F151A;F153A)foi o melhor candidato negativo dominante nos ensaios de competição invtro. O BnKrpI mutante duplo (Y149A;F151A) também é provável ser capazde proteger o complexo de cinase de inibição.

Como mencionado íp/iteriorrnente, o rompimento do domínio deligação de ciclina resulta em uma proteína de KRP1 mutante que reteve al-guma atividade inibidora. Não obstante provavelmente há outros aminoáci-dos que podem ser alterados para criar uma proteína mutante que cumpratodas as características negativas dominantes. Além disso, a alanina foi oaminoácido de escolha para todas as substituições. Em muitos dos mutantespresentes, a substituição do resíduo com um aminoácido não conservadorpôde produzir um candidato negativo dominante até melhor.Exemplo 6. BnKrpI F151A: F153A e BnKrpI Y149A; F151A;F153A se comportam como um negativo dominante para outros membros dafamília de KRP de Brassica napus.

Um dos objetivos principais da estratégia negativa dominante foiintroduzir uma mutação em um único membro da família de KRP que secomporta como um negativo dominante não somente para sua contrapartètipo silvestre porém também para todos seus membros da família. O alinha-mento da família de KRP de CKIs em Brassica napus e em Arabidopsis ilus-tra a identidade de seqüência elevada que se situa na C-términação extremada proteína. Os dados foram apresentados acima demonstrando que a regi-ão conservada quase que N-terminal para o domínio de ligação de CDK éresponsável pelas ciclinas de ligação. Além disso, vários grupos apresenta-ram dados de avaliação 2-híbridos ilustrando que várias moléculas de KRPtêm especificidade de sobreposição para ligação de ciclina.

BnKRr4 difere de BnKrpI no β-grampo. Phe 151 é conservadoentre BnKrpI e BnKRP4, porém, BnKrpI F153 é uma prolina em BnKRP4.Isto não é necessariamente uma substituição de aminoácido conservadora esugere que BnKRP4 pode interagir com o complexo de ciclina/CDKA diferen-temente do que BnKrpI. Porém já foi mostrado que esta posição no domíniode ligação de CDK não parece desempenhar um papel significante na inibi-ção de ciclina/CDKA (BnKrpI N0 573 mutante, vide Exemplo 1).

BnKRP4 foi clonado empregado os dois seguintes oligonucleotí-deos para amplificar o cDNA de BnKrp4 adicionando um sítio de 5' Ba-mHl/Ndel e sítio de restrição XhoI na extremidade 3' de BnKrp4-1 (5' Bn-Krp4-1 Bam^I/Ndel: GGATCCCATATGGGA AAATACATAAAG (SEQ IDN0:60) e 3f BnKrp4-l Xhol: CTCGAGCTAATCATCTACCTTCTT (SEQ IDNO: 61). O fragmento de PCR foi amplificado de pTG Ns 315 (Topoll Bn-Krp4-1) e subclonado no sítio de BamHI e Xhol de pET16b-5myc e seqüen-ciado. O vetor resultante BnKrp Ne 605 conteve o cDNA tipo silvestre de Bn-KRJM na estrutura com os rótulos de 6XHis e myc. A proteína foi expressa epurificada como descrito no Exemplo 1.

BnKrp4 é um inibidor potente do complexo de AtciclinaD2;1/CDKA cinase com um IC5p muito similar àquele BnKrpI tipo silvestre. As ex-periências de competição foram realizadas como descrito no Exemplo 4.Neste caso, BnKrpI N9 512 (F151A; F153A) e BnKrpI N9 598 (Y149A;F151 A; F153A) foram ambos capazes de proteger o complexo de cinase deinibição por BnKRP4tipo silvestre. Com base nesta observação, é esperadoque BnKrpI N9 512 e BnKrpI N9 598 se comportem como um dominantenegativo para a maioria, se não todos, os membros da família de BnKRP.

Exemplo 7. BnKRPI F151A: F153A e BnKRPI Y149A: F151A:F153A se comportam como dominante negativo para Krps de outras espé-cies de planta.

O objetivo total da estratégia negativa dominante foi para intro-duzir uma ou mais mutações em um único membro da família de KRP quenão somente se comporta como um negativo dominante para seus membrosde família tipo silvestre porém também contra os membros de família deKRP através de espécies uiíerenies de plania. As pianías de colheita de inte-resse na presente invenção incluem, porém não estão limitadas, soja, cano-la, milho, trigo, alfafa, arroz, colheitas de vegetais tal como tomate, e aindaárvores, tal como álamo.

A seqüência de nucleotídeo de AtKRP 1 (GenBank N9 U94772)foi empregada para realizar uma pesquisa tBLASTn para seqüências deKRP de milho, soja, álamo, tabaco e arroz. Vários ESTs curtos mostraramhomologia elevada limitada aos domínios de ligação de ciclina/CDK. Váriasdestas seqüências curtas foram alinhadas e ilustram a conservação destaregião através de várias espécies de planta. (Vide figura 2)

No milho, uma entrada particular, acessão de Geribank N9AY986792 conteve uma estrutura de leitura aberta de 573 bp, codificandouma proteína de tamanho natural com identidade elevada para vários mem-bros de família de Bn KRP. Esta proteína foi chamada ZmKRP4 porém não énecessariamente o homólogo de milho de BnKRP4 ou AtKRP4. Como Bn-KRP45, ZmKRP4 difere de BnKRPI no β-grampo. Phe 151 foi conservadoentre BnKRPI e BnKRP4 e ZmKRP4. Porém, BnKRPI F153 foi uma prolinaem ambos BnKRP4 e ZmKRP4. ZmKRP4 foi amplificado de cDNA feito deRNA total isolado de pendões de milho maduros. A seqüência do oligonucle-otídeo foi acumulada do Genbank acessão Ng AY986792. ZmKRP45'BamHI/NdeI: GGATCCCATATGGGCAAGTACATGCGC (SEQ ID NO:62) eZmKRP4 VBamHi: GGATCCTCAGTCTAGCTTCACCCA (SEQ ID NO:63). Oproduto de PCR foi subclonado em TOPOII (Invitrogen) e seqüenciado. Paraproduto de proteína de ZmKRP4, o fragmento de BamHI de 573 bp foi clo-riado no sítio de BamHIde vetor de pET16b-5Myc e a orientação de inser-ção foi determinada por mapeamento de enzima de restrição. A proteína re-combinante foi produzida como descrito no Exemplo 4.

Similarmente na soja, uma entrada particular, Genbank acessãoNg AY439104 conteve uma estrutura de leitura aberta de 499 bp, codificandouma proteína de tamanho natural com identidade elevada para vários mem-bros de família de Bn KRP. Esta proteína chamada GmKRP2-2 é virtualmen-te idêntica a BnKRPI no β-grampo. GmKRP2-2 foi amplificado de cDNA feitode RNA total isolado de plantinhas de soja jovens em desenvolvimento. Ooligonucleotídeo foi designado da seqüência de Genbank acessão NsAY439104: GmKRP2-2 5'Xhol/Ndel: ctcgaggacatatggagatggctcaggttaaggca(SEQ ID NO:64) e GmKRP2-1 3'XhoI: ctcgagtcaactgaacccactcgtatcgtcc(SEQ ID NO:65). O produto de PCR foi subclonado em TOPOII (Invitrogen) eseqüenciado. Para expressão de proteína GmKRP2-2, o fragmento de XhoIde 499 bp foi clonado no sítio de XhoI de vetor de pET16b-5Myc e a orienta-ção de inserção foi determinada por restrição de mapeamento de enzima. Aproteína recombinante foi produzida como descrito no Exemplo 4.

Ambos ZmKRP4 e Gm Krp2-2 foram testados quanto à sua ca-pacidade para inibir complexo de ciclinaD2; I/CDKA cinas^ recombinante.ZmKRP4 foi um inibidor potente do complexo de cinase com um IC50 muitosimilar àquele de BnKRPI tipo silvestre, 0,035 μg. Similarmente, GmKrp2-2foi também um inibidor potente do complexo de cinase. Ambos BnKRPI ne-gativo dominante (BnKRPI Ne 512 e N9 598) foram capazes de bloquearZmKRP4 e GmKrp2-2 de inibir o complexo de cinase. Em cada caso, a pro-teção foi comparável à proteção que BnKRPI Ng 512 deu para inibição deBnKRPI. Este resultado ilustra o efeito de espécies cruzada do Krp negativodominante da presente invenção.

As experiências também sugerem que BnKrp N2 512 e BnKrp N9598 terão um efeito similar em outros membros de família de KRP de espé-cies cruzadas tal como aqueles de arroz, trigo, sorgo, cana-de-açúcar, beter-rabas açucareira, e outro. As moléculas de KRP destas espécies de planta,junto com outras, podem ser clonadas, expressas como proteínas recombi-nantes, e avaliadas em estudos similares para demonstrar que BnKrp 1 Ne512 e BnKrp 1 N9 598 têm um efeito similar naqueles membros de família.

Exemplo 8. Mutação paralela em outras moléculas de KRP deespécies de planta resulta em moléculas negativas dominantes.

Os resíduos alterados em BnKRPI para produzir o efeito negati-vo dominante são conservados em vários membros da família de KRPs emcanola, milho, soja, arroz, alfafa, álamo, tabaco, e outro. A substituição defenilalaninas conservadas para resíduos de alanina pode ser realizada emvários KRPs destas plantas de colheita e testada quanto à sua capacidadede se comportar como moléculas negativas dominantes.

F151 e F153 são conservados em alguns porém nem todosKRPs em canola, soja, milho. A mutação destes resíduos conservados emKRPs de soja e milho resultará em uma molécula de Krp negativo dominantesimilar.

Exemplo 9. Plantas de canola transgênicas expressando cons-truções de transgene designadas para conceder expressão constitutiva eespecífica de embrião de KRP1 (F151a;F153a).

Com base nos resultados in vitro presentes nos exemplos acima,a expressão da invenção em' células de ,,planta cultivada ou em plantastransgênicas é predita aumentar a atividade de CDK cinase endógena. Esteaumento na atividade de CDK cinase terá uma influência positiva durante ociclo celular. A invenção foi clonada em um vetor de expressão de planta.Um vetor de expressão de planta contém um promotor nativo ou normativounido à invenção descrita acima. Os promotores podem variar de forte, fra-co, induzível, específico de tecido, específico de órgão e específico desen-volvente.As mutações de BnKRPI (F151A; F153A) equivalentes foramintroduzidas em AtKRPI empregando os seguintes oligonucleotídeos: "QCAtKRPI cds F173A;F175A-codificação" 5" - TTCAAGAAGAAGTACAATGCCGATGCCGAGAAGGAGAAGCCATTA-S (SEQ ID NO:66) e "QC AtKRPI cdsF173A;F175A-noncod" 5'-TTATGGCTTCTCCTTCTGGGCA TCGGCATTG-TACTTCTTCTTGAA-3' (SEQ ID NO:67). AtKRPI N9 359 foi empregado co-mo o modelo empregando um Kit de Mutagênese Direcionada ao Sítio Stra-tagene Quikchange. AtKRPI F173A; F175A (pTG356) foi confirmado porseqüenciamento. O promotor de LFAH12 foi inserido na extremidade 5' doAtKRPI (F173 A; F175A) mutante em pTG 356 em duas etapas. Primeira, opromotor de LFAH12 de Sail e PstI de pCAMBIA 2381Z (pTG 254) foi sub-clonado em pBluescript Il (Stratagene) nos sítios SaII e PstI, resultando empTG 357. O promotor de LFAH12 foi então cortado de pTG 357 empregandoPstl e BamHI e inserido em pTG 356 resultando em pTG 361. FinalmentepTG 361 foi digerido com KpnI e NotI1 pl_AY112 foi digerido com NotI e BgIII(componente ,mas3' utr) e pCG 1547 foi digerido com Kpnl e BamHI e umaligação de 3 modos foi realizada. Isto resultou em um cassete de LFAH12-AtICK1 cds DN-mas 3' utr (pTG 369).

O vetor de expressão de planta contendo BnKRPI (F151 A;F153A) sob controle do promotor constitutivo 35S foi construído do seguintemodo. O fragmento de BamHI/Xhol contendo BnKRPI (F151 A; F153A) cdsfoi clonado em pTG 271 (35S/TOPO Blunt) empregando os mesmos sítios.Oconstructo resultante (pTG529) foi cortado com KpnI e XbaI. pLAY112 foicortado com ZIaciI e HMindIII e pCGN1547 foi cortado com KpnI e HindIII euma ligação'de 3 modos foi realizada. Isto resultou em um cassete de 35S-BnKRPI (F151 A;F153A)-mas3 utr (pTG533).

Transformação de Canola (Brassica napus)

A variedade de canola haplóide dupla DHI 2075 foi transformadacom os constructos de expressão de transgene LFAH -12 AtKRPI (F173A;F175A) e 35-S BnKRPI (F151A; F153A) (também referido coletivamenteneste Exemplo como "constructo de expressão de transgene de KRP1 mu-tante") empregando um método de transformação mediada por Agrobacteri-um com base naquele de Maloney e outros. (Maloney e outros, Plant CellReport 8:238, 1989).

As sementes esterilizadas foram germinadas em meios Vz MS(Murashige & Skoog) com 1% de sacarose em placas de Petri de 15 X 60mm durante 5 dias com aproximadamente 40 a cerca de 60 sementes porplaca. Um total de aproximadamente 1500 sementes foi germinado para ca-da constructo de transformação. As sementes não ficaram completamentesubmersas no meio de germinação; As mudas germinadas foram crescidasem um ambiente de cultura de tecido a 25°C, em um ciclo de 16 horas deluz/8 horas de escuridão.

Os cotilédones foram cortados exatamente acima do meristemaapical sem obter qualquer tecido de meristema. Isto foi feito agarrando-sesuavemente os dois pecíolos com fórceps imediatamente acima da região demeristema apical. Cuidado foi tomado para não esmagar os pecíolos com osfórceps.

Ao empregar as pontas dos fórceps como um guia, os pecíolosforam cortados empregando um escalpelo com uma lâmina afiada Ne. 12. Oscotilédones foram liberados em uma placa de 15mm X 100mm de meio deco-cultivo. Os cotilédones corretamente cortados se separam facilmente. Seeles não o fizerem, há uma chance muito boa que o tecido meristemáticotenha sido obtido e tais cotilédones não foram empregados. Cada placamanteve aproximadamente 20 cotilédones. As explantes de cotilédone foraminoculadas com Agrobacterium após cada placa que foi preparada evitarmurchar o que teria um impacto negativo nos seguintes estágios do protocolo.

Os constructos de expressão de transgene de KRP1 mutantesforam introduzidos em eletroporação de Agrobacterium tumefaciens. Agro-bacterium que abriga os constructos de expressão de transgene KRP1 mu-tante foi crescido em um meio AB com antibióticos apropriados durante doisdias em agitação a 28°C. Para inocular os explantes de cotilédone, um vo-lume pequeno de cultura de Agrobacterium foi adicionado a uma placa Petride 10 mm χ 35 mm. O pecíolo de cada explante foi imerso na cultura de A-grobacterium e a extremidade cortada colocada em meio de co-cultivo emuma placa de Petri. As placas foram seladas e colocadas em ambiente decultura de tecido a 25°C, 16 horas de luz/8 de horas de escuro durante 3dias.

Após 3 dias, as explantes foram transferidos freqüentemente emgrupos para placas de Petri frescas de 25 mm χ 100 mm contendo meio deindução de broto. Este médio continha um agente de seleção (20 mg/L deCanamicina) e hormônio (4,5 mg/L de BA). Somente ás explantes aparente-mente saudáveis foram transferidas. As explantes foram mantidas em meiode indução de broto durante 14 a 21 dias. Neste momento, calos verdes epossivelmente algum desenvolvimento de broto e alguns brotos não trans-formados puderam ser observados. Os brotos não transformados foram fa-cilmente reconhecidos por sua cor branca e roxa. Os brotos sensíveis a Ca-namicina foram removidos lhes cortando longe e todos calos aparentementesaudáveis foram transferidos para as placas frescas de meio de indução debroto. As explantes foram mantidas nestas placas durante outro 14 a 21 dias.

- Após 2 a 3 semanas, os brotos que ficaram verdes escuros nacor foram transferidos para placas que contêm meio de alongamento de bro-to. Este meio conteve um agente de seleção (20 mg/L de Canamicina) po-rém não conteve qualquer hormônio. Cinco brotos foram transferidos paracada placa. As placas foram seladas e retornadas para o ambiente de cultu-ra de tecido. Os brotos transformados que pareceram vítreos foram transfe-ridos para o meio de alongamento de broto que contém floroglucinol (150mg/L). Os brotos que se tornaram verdes e saudáveis foram devolvidos-,paraas placas de meio de alongamento de broto. As transferências repetidas debrotos vítreos para placas frescas do mesmo meio foram requeridas em al-guns casos para obter brotos de aparência normal.

Os brotos com morfologia normal foram transferidos para jarrosde alimentação de bebê de 4 oz. com meio de enraizamento contendo 0,5mg/L de ácido butírico de indol. Qualquer calo em excesso foi cortado longeao transferir os brotos para os jarros. Os brotos puderam ser mantidos inde-finidamente nos jarros os transferindo para jarros frescos contendo 0,2mg/Lde ácido butírico de indol aproximadamente a cada 6 semanas.

Uma vez que um bom sistema de raiz foi formado, os brotos degeração de T0 foram removidos dos jarros, e as plantinhas transferidas parao solo em lote. Cada plantinha T0 independente representa uma ocorrênciaindependente de inserção do transgene no genoma de canola e é referidocomo um evento. Um copo transparente foi colocadoj sobre a plantinha du-rante alguns dias, permitindo a planta aclimar ao novo ambiente. Uma vezque a planta endureceu, o copo foi removido. Os eventos transgênicos de T0foram então desenvolvidos para maturidade na estufa e as sementes de Ticoletadas.

Caracterização do Evento de TQ

O número de Iocos de sítio de inserção de transgene foi deter-minado em cada evento por análise do Sul. A expressão de transgene deKRP1 mutante nos eventos de T0 foi verificada por análise do Norte ou RT-PCR de extremidade. Os dados de expressão de transgene de KRP1 mutan-te foram obtidos para um único ponto de tempo no desenvolvimento de em-brião, 19 dias após a polinização (DAP). A partir destes dados foi concluídoque, neste ponto de tempo desenvolvente, o promotor de LFAH 12 levou aosníveis elevados de mRNA de AtKRPI (F173A; F175A). A expressão detransgene de 35S BnKRPI (F151A; F153A) foi monitorada em amostras defolha que tiveram expressão de nível moderado a elevado em muitos even-tos. Os dados de expressão demonstraram que ambos os promotores eramfuncionais condução de expressão de transgene de KRP1 mutante em plan-tas de canola transgênicas.

A atividade de cinase também pode ser medida para determinaro efeito de expressão de proteína de KRP1 mutante em atividade de Ciclina-CDK cinase endógena. As quantidades equivalentes de extratos de proteínade células ou tecido de planta transgênica ou não transgênica são enriqueci-das para CDK empregando resina p13Suc1 (Upstate, Chicago, IL) e os en-saios de Histona cinase são realizados como descrito no Exemplo 4 ou porWang e outros., Plant J. 15:501-510, 1998. As reações de cinase são resol-vidas por SDS-PAGE e fosforilação de HHI quantificada por Phosphorlmager.

As plantas de T0 foram geradas de modo bem sucedido paraambos constructos de expressão de transgene de KRP1 mutante. Os cons-tructos testadas incluíram (a) LFAH12/AtKRP1(F173A; F175A); (b) 35S Bn-KRP1(F151A; F153A).

Exemplo 10. Expressão in vivo acelera o crescimento/germinação precoce.

A expressão das proteínas mutantes da presente invenção emplantas transgênicas exercerá seus efeitos elevando-se a atividade de cicli-na-CDK cinase. Isto terá uma influência motriz positiva no ciclo celular quefinalmente resulta em tamanho de órgão aumentado. Em plantas, a reduçãodos níveis de expressão de KRP1 suprimindo-se a expressão de um genede Krp endógeno no embrião empregando uma abordagem repetida inverti-da resulta em tamanho de semente e produção de colheita aumentados. A-lém de um efeito na produção, o tamanho de semente aumentado pode re-sultar em vigor aumentado ou na semente. As sementes maiores contêmuma maior quantidade de proteína armazenada e reserva de amido paraserem utilizadas durante a germinação e crescimento da muda. Isto poderesultar em germinação precoce e crescimento precoce mais rápido. A ger-minação precoce e crescimento precoce rápido são características agrono-micamente valiosas uma vez que eles levam ao estabelecimento mais rápidoda colheita. Isto aumenta as chances de uma colheita bem-sucedida redu-zindo-se a janela de vulnerabilidade às condições ambientais severas e ou-tro que possam danificar ou arruinar uma colheita antes do estabelecimento.

O crescimento aumentado e passo desenvolvente foram obser-vados nas mudas germinadas em estufa de plantas de canola transgênicastransformadas com a construção de expressão negativa dominante de At-KRP1 (F173A; F175A) (pTG369) descrita no Exemplo 9. Vinte e quatro se-mentes de cada dos quinze eventos de transformação independentes doconstructo de expressão negativa dominante de AtKRPI (F173A;F175A)foram plantadas em péletes de turfa Jiffy em bandejas e germinadas emuma estufa. Vinte quatro sementes de cada dos quinze eventos independen-tes transformados com o gene de KRP1 tipo silvestre, também sob controledo promotor de LFAH12, foram plantadas em paralelo. Adicionalmente, avariedade de canola DH12075 parental não transformada e um total de 135eventos transgênicos transformados com quaisquer dos nóve constructos detransgene não relacionados foram plantados ao mesmo tempo.

Após três semanas de crescimento, tqdas as mudas foramtransplantadas para um campo para ser desenvolvida para semear. Cadagrupo de vinte quatro mudas para cada evento foi plantado como um loteindividual. Na transplantação, foram facilmente observadas diferenças nocrescimento entre as mudas entre os lotes. Pela população de muda totalpara todas os constructos de transgene, o tamanho variou de 2,54 cm (1polegada) de altura para cerca de 10,16 a 12,7 cm ( 4 a 5 polegadas) de al-tura. Progresso desenvolvente também variou, variando de algumas mudasque têm somente cotilédones presentes para mudas com várias folhas ver-dadeiras. Os lotes de variedade parentais não transformados se incluíram nomeio desta faixa. As diferenças nos lotes transgênicos foram construçõesespecíficas. A maioria dos lotes no campo que continham mudas na extre-midade de topo do tamanho e faixa de desenvolvimento era lotes contendoplantas transformadas com ao constructo de expressão negativo dominantede AtKRPI (F173A; F175A) (pTG369). Outros constructos não mostram estacaracterística com a maioria dos lotes mostrando crescimento e desenvolvi-mento comparáveis com ou menores do que a variedade parental transfor-mada. Estes resultados indicam que a expressão de um transgene de Krpmutante negativo .dominante confere uma taxa de crescimento precoce au-mentada e passo desenvolvente acelerado.

Outras características a serem monitoradas incluem, por exem-plo, pré-emersão/duração da germinação, tempo de aparecimento de cotilé-done, tamanho do cotilédone, tempo de primeira folha real exposta, e se-cunda exposição de folha verdadeira. O diâmetro de roseta também podeser monitorado em plantas transgênicas e não transgênicas. Outras caracte-rísticas também podem ser monitoradas entre as plantas transgênicas e nãotransgênicas e incluem, por exemplo, tempo de emersão do broto e tamanhoda projeção do broto, tamanho final de ramo principal, tempo da primeira florpara emergir, tempo do aparecimento da primeira vagem, e similares.

Exemplo 11. Expressão in vivo determina melhor enraizamento.

As sementes de canola são muito pequenas, requerem umidaderelativamente elevada para germinação e devem ser plantadas perto da su-perfície do solo para maximizar o vigor da muda. As sementes pequenas eplantação rasa tornam a colheita vulnerável às tensões abióticas tal comosolo seco, e inundação. A expressão ubíqua ou expressão precoce no de-senvolvimento da raiz dos polipeptídeos mutantes da presente invenção sobcontrole de vários promotores determinaria o desenvolvimento e crescimentode raiz acelerado. A divisão de célula aumentada durante o desenvolvimentode raiz beneficiará o vigor da muda estabelecendo-se uma base de raiz firmemais cedo e possivelmente uma base de raiz maior do que o controle deplanta não transgênica. O tamanho das plantas transgênicas do sistema deraiz pode ser comparado com as plantas não transgênicas.

Exemplo 12. Avaliação do Efeito de Expressão de Transgene deAtKroI (F173A:F175A) Durante o Desenvolvimento de Embrião ma Produçãode Canola em Experiências de Campo Replicadas.

Neste exemplo, as plantas de canola transgênicas compreen-dendo o transgene de KRP1(F173A;F175A) de Arabidopsis sob o controledo promotor específico de embrião LFAH 12 (pTG369) foram testadas emexperiências de campo.

Avanço de Eventos de AtKRPI (F173A:F175A) Transqênico para Experiên-cias de Campo.

Para os eventos T0 foram selecionadas para avanço, as experi-ências de campo com base em uma combinação de número de loco de in-serção de transgene e expressão de transgene. Os eventos com expressãotransgene verificada e um único loco de inserção de transgene foram desig-nados prioridade superior a ser levada adiante para o teste de campo. Emalguns exemplos, os eventos com Iocos de inserção múltiplos foram selecio-nados se a presença de genes múltiplos determinou um nível de expressãode transgene total elevado devido a dosagem de gene.

As sementes T1 de eventos selecionados foram crescidas comopopulações de Ti segregantes em plotagens de campo. Cada evento foiplantado como um lote de duas fileiras, vinte quatro plantas. Para eventoscom um único loco de inserção de transgene, a segregação de um transge-ne dentre as vinte quatro plantas de Ti produziria uma distribuição dè apro-ximadamente seis plantas nulas sem o transgene, doze plantas heterozigo-tas, e seis plantas homozigotas. Cada planta de Ti foi ensacada individual-mente antes de florescer para prevenir cruzamento externo. As sementes T2de cada das vinte quatro plantas de T1 foram colhidas separadamente.

Os estoques de sementes de T2 foram empregado para identifi-car qual das vinte quatro plantas Ti parentes era nula, heterozigota, ou ho-mozigota. Aproximadamente trinta sementes de T2 de cada planta de T1 fo-ram germinadas em papel de filtro em placas de Petri com uma solução quecontém o antibiótico G418, um análogo de canamicina. Considerando que asplantas foram co-transformadas com o gene de resistência nptll como ummarcador selecionável, somente aquelas sementes que carregam o transge-ne do germinariam e continuam crescendo. Se todas as sementes em umaplaca provassem ser sensíveis a G418, então o parente de T-i seria identifi-cado como uma linhagem nula. Se todas as sementes em uma placa fossemresistentes a G418, então o parente de T1 seria identificado como uma li-nhagem homozigota. Se aproximadamente um quarto das sementes emuma placa fosse sensível e o restante fosse resistente, o parente de T1 seriaidentificado como uma linhagem heterozigota. As sementes de T2 de paren-tes- de Ti homozigotos do mesmo evento de transformação fora/ji aumenta-das para gerar estoques de semente homozigotas para teste de experiênciade campo. As sementes de T2 de parentes de T1 nulos do mesmo evento detransformação foram aumentadas para gerar estoques de semente de ir-mãos nulas para teste de experiência de campo.Desígnio da Experiência de Campo

O efeito do transgene de AtKRPI (F173A;F175A) em caracterís-ticas de produção nas linhagens de canola transgênica foi avaliado compa-rando-se cada linhagem transgênica diretamente com seu irmão nulo nocampo em experiências replicadas de grande escala. Desde que o irmãonulo surja da segregação de transgene na geração de Ti, os irmãos nulos ehomozigotos são geneticamente quase idênticos. A única diferença signifi-cante é a presença ou ausência do transgene de AtKRPI (F173A;F175A).Esta quase identidade genética torna o irmão nulo o controle ideal para ava-liação do efeito do transgene de AtKRPI (F173A;F175A). Como o objetivoprincipal da experiência foi a comparação da linhagem transgênica de umevento com seu segregante nulo, um desígnio de lote dividido foi escolhido.Este desígnio determina um nível elevado de avaliação com a interação en-tre as subentradas transgênicas e não transgênicas e as diferenças entre ossub-lotes transgênicos entre os eventos (a interação de sub-lote e lote prin-cipal) e um nível mais baixo de avaliação com as diferenças entre eventostotais ou o lote principal.

As experiências de campo foram conduzidas em locais múltiplospelas províncias de pradaria para avaliar fenótipos de produção sob a faixade condições ambientais nas quais a canola é tipicamente desenvolvida. Emtodos os locais, cada evento transgênico foi fisicamente emparelhado comseu irmão nulo em lotes adjacentes. Cada par de lote irmãos nulos e homo-zigoto foi replicado quatro vezes em cada local da experiência. Os locais dosquatro pares de lote replicado em cada em cada experiência foram distribuí-dos aleatoriamente em cada local de experiência. Os lotes foram 1,6m por6m e plantados a uma densidade de aproximadamente 142 sementes pormetro quadrado. As plantas foram desenvolvidas para maturidade empre-gando práticas agronômicas padrão típicas pç/a produção comercial de ca-nola.

Exemplo 13. Produção Aumentada de Canola Transgênica Ex-pressando AtKrpI (F 173 A:F 175 A) Durante Desenvolvimento de EmbriãoEmpregando os Promotores Específicos de Embrião.

Todos os lotes em cada local de experiência do campo de pro-dução foram individualmente colhidos com uma máquina de ceifar. Todos osdados da produção de semente foram coletados como peso de semente to-tal ajustado ao conteúdo de umidade de cada lote. Para todo evento trans-gênico em cada experiência, a média da produção total dos quatro lotes re-plicados de cada linhagem de homozigoto foi comparada à média da produ-ção total dos quatro lotes replicados da linhagem de irmão nulo associada.

Esta comparação foi empregada para avaliar o efeito do transgene de At-KRP1 (F173A;F175A) na produção de semente total. Os resultados de cadaum dos locais de experiência múltiplos foram combinados para determinaruma análise de experiência cruzada do efeito do transgene de AtKRPI(F173A;F175A) na produção de semente total. A análise estatística de vari-ância em cada local de experiência permitiu o desígnio de um limiar parasignificância (P = 0,05) para diferenças na produção de semente total entrelinhagens transgênicas homozigotas e seus irmãos nulos.

As linhagens de canolá de AtKRPI (F173A;F175A) transgênicasque mostraram um aumento estatisticamente significante na produção desemente total são resumidas na Tabela 3. Estes resultados demonstram quea super-expressão de AtKRPI (F173A;F175A) empregando um promotor es-pecífico de embrião (LFAH 12) resulta em produção de semente aumentada.

Tabela 3. Alteração na produção de semente de total em plantas de At-KRP1(F173A;F175A) homozigoto com relação a seus irmãos nulos. Os valo-res de AU são estatisticamente significantes (P = 0,05)

<table>table see original document page 107</column></row><table>

É enjendido que os exemplos e modalidades descritos aqui se-jam para propósitos ilustrativos somente e que várias modificações ou alte-rações levando em consideração esta, sejam sugeridas pelas pessoas ver-sadas na técnica e devam ser incluídas dentro do espírito e competênciadeste pedido de patente e escopo das reivindicações anexas. Todas as pu-blicações, patentes, e pedidos de patente citados aqui estão desse modoincorporadas por referência em sua totalidade para todos os propósitos.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> TARGETED GROWTH, INC.

<120> PROTEÇÃO DE PROTEÍNA KRP MUTANTE NEGATIVA DOMINANTE DE INIBIÇÃO DECOMPLEXO CICLINA-CDK ATIVO POR KRP DO TIPO SILVESTRE

<130> 25941-1-1PC

<140> PCT/US06/29349

<141> 2006-07-28

<150> US 60/703,999

<151> 2005-07-29

<160> 101

<170> PatentIn versão 3.3

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 1

Pro Ser Thr Ala Ile Arg Glu1 5

<210> 2

<211> 191

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 2

Met Val Arg Lys Tyr Arg Lys Ala Lys Gly Ile Val Glu Ala Gly Val1 5 10 15

Ser Ser Thr Tyr Met Gln Leu Arg Ser Arg Arg Ile Val Tyr Val Arg20 25 30

Ser Glu Lys Ser Ser Ser Val Ser Val Val Gly Asp Asn Gly Val Ser35 40 45

' Ser Ser Cys Ser Gly Ser Asn Glu-Tyr Lys Lys Lys Glu Leu Ile His50 I" 55 60

Leu Glu Glu Glu Asp Lys Asp Gly Asp Thr Glu Thr Ser Thr Tyr Arg65 70 75 80

Arg Gly Thr Lys Arg Lys Leu Phe Glu Asn Leu Arg Glu Glu Glu Lys85 90 95

Glu Glu Leu Ser Lys Ser Met Glu Asn Tyr Ser Ser Glu Phe Glu Ser100 105 110Ala Val Lys Glu Ser Leu Asp Cys Cys Cys Ser Gly Arg Lys Thr Met115 120 125

Glu Glu Thr Val Thr Ala Glu Glu Glu Glu Lys Ala Lys Leu Met Thr130 135 140

Glu Met Pro Thr Glu Ser Glu Ue Glu Asp Phe Phe Val Glu Ala Glu145 150 155 160

Lys Gln Leu Lys Glu Lys Phe Lys Lys Lys Tyr Asn Phe Asp Phe Glu165 170 175

Lys Glu Lys Pro Leu Glu Gly Arg Tyr Glu Trp Val Lys Leu Glu180 185 190

<210> 3

<211> 209

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 3

Met Ala Ala Val Arg Arg Arg Glu Arg Asp Val Val Glu Glu Asn Gly1 5 10 15

Val Thr Thr Thr Thr Val Lys Arg Arg Lys Met Glu Glu Glu Val Asp20 25 30

Leu Val Glu Ser Arg Ile Ile Leu Ser Pro Cys Val Gln Ala Thr Asn35 40 45

Arg Gly Gly Ile Val Ala Arg Asn Ser Ala Gly Ala Ser Glu Thr Ser50 55 60

Val Val Ile Val Arg Arg Arg Asp Ser Pro Pro Val Glu Glu Gln Cys65 70 75 80

Gln Ile Glu Glu Glu Asp Ser Ser Val Ser Cys Cys Ser Thr Ser Glu85 90 95

Glu Lys Ser Lys Arg Arg Ile Glu Phe Val Asp Leu Glu Glu Asn Asn100 105 110

Gly Asp Asp Arg Glu Thr Glu Thr Ser Trp Ile Tyr Asp Asp Leu Asn115 120 125

Lys Ser Glu Glu Ser Met Asn Met Asp Ser Ser Ser Val Ala Val Glu130 135 140

Asp Val Glu Ser Arg Arg Arg Leu Arg Lys Ser Leu His Glu Thr Val145 150 155 160Lys Glu Ala Glu Leu Glu Asp Phe Phe Gln Val Ala Glu Lys Asp Leu165 170 175

Arg Asn Lys Leu Leu Glu Cys Ser Met Lys Tyr Asn Phe Asp Phe Glu180 185 190

Lys Asp Glu Pro Leu Gly Gly Gly Arg Tyr Glu Trp Val Lys Leu Asn195 200 205

Pro

<210> 4<211> 222<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana<400> 4

Met Gly Lys Tyr Met Lys Lys Ser Lys Ile Thr Gly Asp Ile Ser Val15 10 15

Met Glu Val Ser Lys Ala Thr Ala Pro Ser Pro Gly Val Arg Thr Arg20 25 30

Ala Ala Lys Thr Leu Ala Leu Lys Arg Leu Asn Ser Ser Ala Ala Asp35 40 45

Ser Ala Leu Pro Asn Asp Ser Ser Cys Tyr Leu Gln Leu Arg Ser Arg50 55 60

Arg Leu Glu Lys Pro Ser Ser Leu Ile Glu Pro Lys Gln Pro Pro Arg65 70 75 80

Val His Arg Ser Gly Ile Lys Glu Ser Gly Ser Arg Ser Arg Val Asp85 90 95

Ser Val Asn Ser Val Pro Val Ala Gln Ser Ser Asn Glu Asp Glu Cys100 ......105 110

Phe Asp Asn Phe Val Ser Val Gln Val Ser Cys Gly Glu Asn Ser Leu115 120 125

Gly Phe Glu Ser Arg His Ser Thr Arg Glu Ser Thr Pro Cys Asn Phe130 135 140

Val Glu Asp Met Glu Ile Met Val Thr Pro Gly Ser Ser Thr Arg Ser145 150 155 160

Met Cys Arg Ala Thr Lys Glu Tyr Thr Arg Glu Gln Asp Asn Val Ile165 170 175Pro Thr Thr Ser Glu Met Glu Glu Phe Phe Ala Tyr Ala Glu Gln Gln180 185 190

Gln Gln Arg Leu Phe Met Glu Lys Tyr' Asn Phe Asp Ile Val Asn Asp195 200 205

Ile Pro Leu Ser Gly Arg Tyr Glu Trp Val Gln Val Lys Pro210 215 220

<210> 5

<211> 289

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 5

Met Gly Lys Tyr Ile Arg Lys Ser Lys Ile Asp Gly Ala Gly Ala Gly1 5 10 15-

Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Ser Ser Ile Ala20 25 30

Leu Met Asp Val Val Ser Pro Ser Ser Ser Ser Ser Leu Gly Val Leu35 40 45

Thr Arg Ala Lys Ser Leu Ala Leu Gln Gln Gln Gln Gln Arg Cys Leu50 55 60

Leu Gln Lys Pro Ser Ser Pro Ser Ser Leu Pro Pro Thr Ser Ala Ser65 70 75 80

Pro Asn Pro Pro Ser Lys Gln Lys Met Lys Lys Lys Gln Gln Gln Met85 90 95

Asn Asp Cys Gly Ser Tyr Leu Gln Leu Arg Ser Arg Arg Leu Gln Lys100 105 110

Lys Pro Pro Ile Val Val Ile Arg Ser Thr Lys Arg Arg Lys Gln Gln115 120 125

Arg Arg Asn Glu Thr Cys Gly Arg Asn Pro'1'Asn Pro Arg Ser Asn Leu130 135 140

Asp Ser Ile Arg Gly Asp Gly Ser Arg Ser Asp Ser Val Ser Glu Ser145 150 155 160

Val Val Phe Gly Lys Asp Lys Asp Leu Ile Ser Glu Ile Asn Lys Asp165 170 175

Pro Thr Phe Gly Gln Asn Phe Phe Asp Leu Glu Glu Glu His Thr Gln180 185 190Ser Phe Asn Arg Thr Thr Arg Glu Ser Thr Pro Cys Ser Leu Ile Arg195 200 205

Arg Pro Glu Ile Met Thr Thr Pro Gly Ser Ser Thr Lys Leu Asn Ile210 215 220

Cys Val Ser Glu Ser Asn Gln Arg Glu Asp Ser Leu Ser Arg Ser His225 230 235 240

Arg Arg Arg Pro Thr Thr Pro Glu Met Asp Glu Phe Phe Ser Gly Ala245 250 255

Glu Glu Glu Gln Gln Lys Gln Phe Ile Glu Lys Tyr Asn Phe Asp Pro260 265 270

Val Asn Glu Gln Pro Leu Pro Gly Arg Phe Glu Trp Thr Lys Val Asp275 280 285

Asp

<210> 6

<211> 189

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 6

Met Gly Lys Tyr Ile Lys Lys Ser Lys Val Ala Gly Ala Val Ser Val1 5 10 15

Lys Asp Lys Ser His Pro Pro Ala Leu Gly Phe Arg Thr Arg Ala Ala20 25 30

Ala Ala Lys Asn Leu Ala Leu His Arg Leu Arg Ser His Ser Asp Glu35 40 45

Ala Asp Ser Phe Asn Tyr Leu Gln Leu Arg Ser Arg Arg Leu Val Lys50 55 60

Leu Pro Leu Leu Thr Âàn Thr Arg Lys Gln Gln Lys Gln Gln Leu Ile65 70 75 80

Pro Ser Val Asn Gln Cys Gln Thr Lys Asn Pro Arg Ala Ser Ser Gly85 90 95

Pro Ala Lys Lys Leu Glu Pro Asp Thr Thr Thr Glu Glu Ala Cys Gly100 105 110

Asp Asn Glu Arg Ile Ser Arg Ser Asp Cys Asn Phe Gly Asp Lys Gly115 120 125Phe Asp Leu Glu Ser Glu Asn Arg Ser Met Ile Ser Asp Ser Lys Ser130 135 140

Ile Gln Ser Glu Ile Glu Asp Phe Phe Ala Ser.Ala Glu Gln Gln Gln145 150 155 160

Gln Arg Phe Phe Ile Gln Lys Tyr Asn Phe Asp Ile Val Ser Asp Asn165 170 175

Pro Leu Pro Gly Arg Tyr Glu Trp Val Lys Val Met Pro180 185

<210> 7

<211> 196

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 7

Met Ser Glu Arg Lys Arg Glu Leu Ala Glu Glu Ala Ser Ser Thr Ser1 5 10 15

Phe Ser Pro Leu Lys Lys Thr Lys Leu Asn Asp Ser Ser. Asp Ser Ser20 25 30

Pro Asp Ser His Asp Val Ile Val Phe Ala Val Ser Ser Ser Ser Val35 40 45

Ala Ser Ser Ala Ala Leu Ala Ser Asp Glu Cys Ser Val Thr Ile Gly50 55 60

Gly Glu Glu Ser Asp Gln Ser Ser Ser Ile Ser Ser Gly Cys Phe Thr65 70 75 80

Ser Glu Ser Lys Glu Ile Ala Lys Asn Ser Ser Ser Phe Gly Val Asp85 90 95

Leu Glu Asp His Gln Ile Glu Thr Glu Thr Glu Thr Ser Thr Phe Ile100 105 110

Thr 'jSer Asn Phe Arg Lys Glu Thr Ser Pro Val Ser Glu Gly Leu Gly115 120 125

Glu Thr Thr Thr Glu Met Glu Ser Ser Ser Ala Thr Lys Arg Lys Gln130 135 140

Pro Gly Val Arg Lys Thr Pro Thr Ala Ala Glu Ile Glu Asp Leu Phe145 150 155 160

Ser Glu Leu Glu Ser Pro Asp Asp Lys Lys Lys Gln Phe Ile Glu Lys165 170 175Tyr Asn Phe Asp Ile Val Asn Asp Glu Pro Leu Glu Gly Arg Tyr Lys180 185 190

Trp Asp Arg Leu195

<210> 8<211> 195<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana<400> 8

Met Ser Glu Thr Lys Pro Lys Arg Asp Ser Glu Tyr Glu Gly Ser Asn15 10 15

Ile Lys Arg Met Arg Leu Asp Asp Asp Asp Asp Val Leu Arg Ser Pro20 25 30

Thr Arg Thr Leu Ser Ser Ser. Ser Ser.Ser Ser Leu Ala Tyr Ser Val35 40 45

Ser Asp Ser Gly Gly Phe Cys Ser Val Ala Leu Ser Glu Glu Glu Asp50 55 60

Asp His Leu Ser Ser Ser Ile Ser Ser Gly Cys Ser Ser Ser Glu Thr65 70 75 80

Asn Glu Ile Ala Thr Arg Leu Pro Phe Ser Asp Leu Glu Ala His Glu• - 85 90 95

Ile Ser Glu Thr Glu Ile Ser Thr Leu Leu Thr Asn Asn Phe Arg Lys100 105 110

Gln Gly Ile Ser Ser Ser Glu Asn Leu Gly Glu Thr Ala Glu Met Asp115 120 125

Ser Ala Thr Thr Glu Met Arg Asp Gln Arg Lys Thr Glu Lys Lys Lys130 135 140

Lys Met Glu Lys Ser Pro Thr Gln Ala Glu Leu Asp Asp Phe Phe Ser145. 150 155 160

Ala Ala Glu Arg Tyr Glu Gln Lys Arg Phe Thr Glu Lys Tyr Asn Tyr165 170 175

Asp Ile Val Asn Asp Thr Pro Leu Glu Gly Arg Tyr Gln Trp Val Ser180 185 190

Leu Lys Pro1959

49PRT

Zea mays<400> 9

Val Pro Pro Ala Gln Glu Ile Gln Glu Phe Phe Ala Ala Ala Glu Ala1.5 10 15

<210><211><212><213>

Ala His Ala Lys Arg Phe Ala Ser Lys Tyr Asn Phe Asp Phe Val Arg20 25 30

ι!

Gly Val Pro Leu Asp Ala Gly Arg Phe Glu Trp Thr Pro Gly Val Ser35 40 45

Ile

<210> 10

<211> 40

<212> PRT

<213> Gossypium

hirsutum

<22 0>

<221> característica - misc

<222> (4) . . (4)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido ocorrendo naturalmente<220>

<221> característica - misc

<222> (20)..(20)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido ocorrendo naturalmente<220>

<221> característica - misc

<222> (27)..(27)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido ocorrendo naturalmente<220>

<221> característica - misc

<222> (32).. (32)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido ocorrendo naturalmente

<400> 10

Ile Pro Ser Xaa Ala Glu Ile Asp Glu Phe Phe Ser VaÍ'Ala Glu Lys15 10 15

Tyr Glu Gln Xaa Arg Phe Ala Glu Lys Tyr Xaa Tyr Asp Ile Val Xaa20 25 30

Asp Val Pro Leu Asp Gly Arg Tyr35 40

<210> 11<211> ' 45<212> PRT<213> soja<400> 11

Val Pro Thr Glu Ser Glu Leu Glu Asp Phe Phe Ala Ala Ala Glu Lys1 5 10 15

Asp Ile Gln Lys Arg Phe Thr Asp Lys Tyr Asn Tyr Asp Phe Val Lys20 25 30

Asp Met Pro Leu Glu Gly Arg Tyr Glu Trp Val Gln Leu35 40 45

<210> 12<211> 45<212> PRT

<213> Populus tremula<400> 12

Ile Pro Thr Thr Cys Glu Met Asp Glu Phe Phe Ala Gly Val Glu Gln15 10 15

Gln Gln Gln Arg Leu Phe Ile Glu Lys Tyr Asn Phe Asp Ile Val Asn20 25 30

Asp Leu Pro Leu Ser Gly Arg Tyr Glu Trp Val Arg Val 35 40 45<210> 13 <211> 47 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <400> 13

Met Pro Ser Glu Lys Glu Ile Glu Glu Phe Phe Ala Ala Arg Gln Lys15 10 15

Ala Ile Leu Lys Arg Phe Arg Lys Lys Tyr Asn Phe Asp Phe Glu Lys20 25 30

Glu Glu Pro Leu Glu Gly Arg Tyr Glu Trp Val Arg Ile Gly Ser35 ,· 40 ■ 45 -

<210> 14<211> 47<212> PRT

<213> Triticum aestivum<400> 14

Ile Pro Cys Ser Ala Glu Met Asn Glu Phe Phe Ser Ala Ala Glu Gln15 10 15

Pro Gln Gln Gln Ala Phe Ile Asp Lys Tyr Asn Phe Asp Pro Val Asn20 25 30Asp Cys Pro Leu Pro Gly Arg Tyr Glu Trp Val Lys Leu 35 40 45<210> 15 <211> 47 <212> PRT <213> Tritictam aestivum <400> 15

Val Pro Ser Ser Leu Glu Met Asp Glu Phe Phe Ala Ala Ala Glu Gln1 5 10 ( 15

Gln Gln His Gln Thr Phe Arg Glu Lys Tyr Asn Phe Cys Pro Ala Ser20 25 30

Glu Arg Pro Leu Pro Gly Arg Tyr Glu Trp Thr Val Leu Asp Cys35 40 45

<210> 16

<211> 45

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 16

Ile Pro Ala Ser Ala Glu Leu Glu Ala Phe Phe Ala Ala Glu Glu Gln15 10 15

Arg Gln Arg Gln Ala Phe Ile Asp Lys Tyr Asn Phe Asp Pro Val Asn20 25 30

Asp Cys Pro Leu Pro Gly Arg Phe Glu Trp Val Lys Leu35 40 45

1742PRT

Solanum tuberosum<400> 17

Se:p Glu Ala Glu Leu Asp Glu Phe Phe -Ala Ala Ala Glu Lys Asp Leu1 · 7Z 5 10 15

His Lys His Phe Ala Glu Lys Tyr Asn Phe Asp Phe Ala Lys Glu Glu20 25 30

Pro Leu Glu Gly Arg Tyr Glu Trp Val Arg35 40

<210> 18

<211> 9

<212> PRT

<213> Epitopo FLAG

<210><211><212><213><400> 18

Met Asp Tyr Lys Ala Phe Asp Asn Leu1 5

<210> 19

<211> 9

<212> PRT

<213> epítopo hemeglutinina (HA)

<400> 19

Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala1 5

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> PCR

<400> 20

atggtgagaa aatatagaaa agct

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> PCR

<400> 21

tcactctaac tttacccatt cgta

<210> 22 <211> 45 <212> DNA <213> Seqüência artificial<220> <223> Iniciador RACE<400> 22.

ctctgataat ttaacccact cgtagcgtcc ttctaatggc ttctc

<210> 23<211> 513<212> DNA

<213> Brassica napus<400> 23

atggtgagaa aatgcagaaa aactaaaggg acggtgggag cttcgtctac gtatatgcagcttcgcagcc ggagaatcgt ttacagatcg gaaaaagcta gctcgtcgtc gtcgtcttgttgcgcgagta acaacaatgg agttatagat cttgaggagg aaagagatgg tgagactgaaacgtcgtcgt gtcgacggag tagtaagagg aagctatttg aaaaccttag agaaaaagaatctatggaga attcacagca aatcgtagct ggttttgatt ccgccgtgaa agaatcatcg 300

gattgttgtt gcagccggag aacatctttg tcaacgacgg aggagaaggg gaaatcagcg 360

acggagcaac caccaacggc agtggagatt gaagattttt tcgtggaagc tgagaaacag 420

ctccatgata atttcaagaa gaagtataac tttgatttcg aaaaggagaa gccattagaa 480

ggacgctacg agtgggttaa attatcagag taa 513

<210> 24

<211> 28

<212> DNA ,

<213> Seqüência artificial 1

<220>

<223> PCR

<400> 24

acggatccca tatggtgaga aaatatag 28

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> PCR

<400> 25

atcgctcgag tcactctaac tttac 25

<210> 26

<211> 26

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> PCR

<400> 26

acggatccca tatggtgaga aaatgc 26

<210> 27

<211> 28

<2.12> DNA

-<213> Seqüência artificial<220>

<223> PCR

<400> 27

atcgctcgag tcactctgat aatttaac 28

<210> 28

<211> 43

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> sentido da mutagênese no sítio direcionado<400> 28

ggagcaacca ccaacggcag tggctgctgc tgcttttttc gtg

2943

DNA . .

Seqüência artificial<220>

<223> anti-sentido da mutagênese no sítio direcionado<400> 29

cacgaaaaaa gcagcagcag ccactgccgt tggtggttgc tcc

<210> 30

<211> 50

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> sentido da mutagênese no sítio direcionado

<400> 30

ccttctaatg gcttctcctt ttcagcatca gcgttatact tcttcttgaa

<210> 31

<211> 50

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> anti-sentido da mutagênese no sítio direcionado

<400> 31

ttcaagaaga agtataacgc tgatgctgaa aaggagaagc cattagaagg

<210> 32

<211> 45

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> anti-sentido da mutagênese no sítio direcionado

<400> 32

ttcaagaaga agtacaatgc cgatgccgag aaggagaagc catta

s

<210> 33

<211> 45

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> mutagênese no sítio direcionado

<400> 33

ttatggcttc tccttctggg catcggcatt gtacttcttc ttgaa

<210> 34

<211> 33

<212> DNA

<210><211><212><213><213> Seqüência artificial<220>

<223> sentido da mutagênese no sítio direcionado<400> 34

gataatttca agaaggcgta taactttgat ttc

<210> 35

<211> 33

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

Γ

<220> '

<223> anti-sentido da mutagênese no sítio direcionado

<400> 35

gaaatcaaag ttatacgcct tcttgaaatt ate

<210> 36<211> 33<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> sentido da mutagênese no sítio direcionado

<400> 36

aatttcaaga agaaggctaa ctttgatttc gaa

<210> 37

<211> 33

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> anti-sentido da mutagênese no sítio direcionado

<400> 37

ttcgaaatca aagttagcct tcttcttgaa att

<210> 38

<211> 33

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> sentido da. mutagênese no sítio direcionado

<400> 38

ttcaagaaga agtatgcctt tgatttcgaa aag

<210> 39

<211> 33

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> anti-sentido da mutagênese no sítio direcionado

<400> 39

cttttcgaaa tcaaaggcat acttcttctt gaa<210> 40<211> 31

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> sentido da mutagênese no sítio direcionado

<400> 40

agaagaagta taacgctgat ttcggaaagg a

<210> 41

<211> 31

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> anti-sentido da mutagênese no sítio direcionado

<400> 41

tccttttcga aatcagcgtt atacttcttc t

<210> 42

<211> 31

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> sentido da mutagênese no sítio direcionado

<400> 42

agtataactt tgatgccgaa aaggagaagc c

<210> 43<211> 31<212> DNA<213> Seqüência artificial<220> <223> anti-sentido da mutagênese<400> 43

ggcttctcct tttcggcatc aaagttatac t

<210> 44

<211> 34

<212> DNA

<213> {Seqüência artificial<220>

<223> sentido da mutagênese no sítio direcionado

<400> 44

gatttcgaaa aggaggcggc attagaagga cgct

<210> 45

<211> 34

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> anti-sentido da mutagênese no sítio direcionado<400> 45

agcgtccttc taatgccgcc tccttttcga aatc

<210> 46

<211> 33

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> sentido da mutagênese no sítio direcionado

<400> 46

gccattagaa ggagccgccg agtgggttaa att y

. . I

<210> 47

<211> 33

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> anti-sentido da mutagênese no sítio direcionado

<400> 47

aatttaaccc actcggcggc tccttctaat ggc

<210> 48

<211> 33

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> sentido da mutagênese no sítio direcionado

<400> 48 .

agaaggacgc tacgcggcgg ttaaattatc aga

<210> 49

<211> 33

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> anti-sentido da mutagênese no sítio direcionado

<400> 49

tctgataatt taaccgccgc gtagcgtcct tct

<210> 50

<211> 34

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> sentido da mutagênese no sítio direcionado

<400> 50

cgctacgagt gggttgcagc atcagagtga gagc

<210> 51<211> 34<212> DNA<213> Seqüência artificial<220>

<223> anti-sentido da mutagênese no sítio direcionado<400> 51

gctctcactc tgatgctgca acccactcgt agcg

<210> 52

<211> 50

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> anti-sentido da mutagênese no sítio direcionado

<400> 52

ccttctaatg gcttctcctt ttcagcatcá gcgttatact tcttcttgaa

<210> 53

<211> 50

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> anti-sentido da mutagênese no sítio direcionado

<400> 53

ttcaagaaga agtataacgc tgatgctgaa aaggagaagc cattagaagg

<210> 54

<211> 33

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> sentido da mutagênese no sítio direcionado

<400> 54

aatttcaaga agaaggctaa cgctgatgct gaa

<210> 55

<211> 33

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> anti-sentido da mutagênese no sítio direcionadó*

<400> 55

ttcagcatca gcgttagcct tcttcttgaa att

<210> 56

<211> 33

<212> DNA

<213> Seqüência

artificial

<220>

<223> PCR<400> 56

ctcgagtcaa gcagctaatt taacccactc gta<210> 57

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> PCR

<400> 57

ctcgagtcac ttcttgaaat tatc

<210> 58

<211> 6

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 58

Lys Tyr Asn Phe Asp Phe1 5

<210> 59

<211> 6

<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> AtKrp2 mutante

<400> 59

Lys Ala Ala Ala Ala Ala1 5

<210> 60

<211> 27

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> PCR

<400> 60

ggatcccata tgggaaaata cataaag

<210> 61

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> PCR

<400> 61

ctcgagctaa tcatctacct tctt

<210> 62

<211> 27

<212> DNA

<213> Seqüência

artificial

<220><223> PCR<400> 62

ggatcccata tgggcaagta catgcgc 27

<210> 63

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> PCR

<400> 63

ggatcctcag tctagcttca ccca . 24

<210> 64

<211> 35

<212> DNA

<213> Seqüência

artificial

<220>

<223> PCR<400> 64

ctcgaggaca tatggagatg gctcaggtta aggca 3 5

<210> 65

<211> 31

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> PCR

<400> 65

ctcgagtcaa ctgaacccac tcgtatcgtc c 31

<210> 66<211> 45<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> mutagênese no sítio direcionado<400> <" 66

ttcaagaaga agtacaèrtgc cgatgccgag aaggagaagc catta 45

<210> 67<211> 45<212> DNA<213> Seqüência artificial<220> <223> mutagênese no sítio direcionado<400> 67

ttatggcttc tccttctggg catcggcatt gtacttcttc ttgaa 45

<210> 68<211> 168<212> PRT

<213> Brassica napus<400> 68

Met Val Arg Lys Cys Arg Lys Thr Lys Gly Thr Val Gly Ala Ser Ser1 5 10 15

Thr Tyr Met Gln Leu Arg Ser Arg Arg Ile Val Tyr Arg Ser Glu Lys20 25 30

Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Cys Cys Ala Ser Asn Asn Asn Gly Val35 40 45

Ile Asp Leu Glu Glu Glu Arg Asp Gly Glu Thr Glu Thr Ser Ser Cys50 55 60

Arg Arg Ser Ser Lys Arg Lys Leu Phe Glu Asn Leu Arg Glu Lys Glu65 70 75 80

Ser Met Glu Asn Ser Gln Gln Ile Val Ala Gly Phe Asp Ser Ala Val85 90 95

Lys Glu Ser Ser Asp Cys Cys Cys Ser Arg Arg Thr Ser Leu Ser Thr100 105 110

Thr Glu Glu Lys Gly Lys Ser Ala Thr Glu Gln Pro Pro Thr Ala Val115 120 125

Glu Ile Glu Asp Phe Phe Val Glu Ala Glu Lys Gln Leu His Asp Asn130 135 140

Phe Lys Lys Lys Tyr Asn Phe Asp Phe Glu Lys Glu Lys Pro Leu Glu145 150 155 160

Gly Arg Tyr Glu Trp Val Lys Leu165

<210> 69';ί211> 192<212> PRT

<213> Brassica napus<400> 69

Met Gly Lys Tyr Ile Lys Lys Ser Lys Ile Thr Gly Asp Ile Asp Ser15 10 15

Met Glu Ala Thr Glu Ala Thr Ser Leu Gly Val Arg Thr Arg Ala Ala20 25 30

Ala Lys Thr Leu Ala Leu Lys Arg Leu Asn Ser Ser Ser Ala Pro Asp35 40 45Ser Ser Cys Tyr Leu Gln Leu Arg Ser Arg Arg Leu Glu Lys Pro Pro50 55 60

Ser Leu Ala Glu Pro Arg Gln Val Lys Pro Gly Ile Lys Glu Ser Gly65 70 75 80

Ser Lys Ile Asp Ser Val Asn Ser Ser Val Ala Gly Ser Gly Asp Glu85 90 95

Cys Phe Cys Arg Glu Asn Ser Pro Glu Phe Gln Thr Arg Gln Ser Thr100 105 110

Arg Glu Ser Thr Pro Cys Asn Phe Val Glu Asp Leu Glu Thr Ile Val115 120 125

Thr Pro Gly Ser Ser Thr Arg Ser Met Arg Thr Pro Ala Arg Asp Ser130 135 140

Thr Val Pro Thr Ile Gly Glu Leu Glu Glu Phe Phe Ala Tyr Ala Glu145 150 155 160

Gln Gln Gln Gln Arg Leu Phe Met Glu Lys Tyr Asn Phe Asp Ile Val165 170 175

Asn Asp Val Pro Leu Pro Gly Gly Tyr Glu Trp Val Gln Val Ser Piro180 185 190

<210> 70 <211> 248<212> PRT

<213> Brassica napus<400> 70

Met Gly Lys Tyr Ile Lys Lys Lys Lys Leu Asp Gly Glu Ala Leu Ser1 5 10 15

Leu Ile Asp Val Ser Pro Ser Pro Leu Gly Val Leu Thr Arg Ala Lys20 25 -30

Ser Leu Ala Leu Gln Arg Arg Leu Gln Lys Pro Pro Ser Ser Pro Ser35 40 45

Pro Asn Pro Pro Pro Ser Lys Gln Glu Ile Thr Asp Cys Ser Gly Gly50 55 60

Ser Tyr Leu Gln Leu Arg Ser Arg Arg Leu Gln Lys Lys Pro Pro Pro65 70 75 80

Ile Val Val Ile Arg Ser Ser Lys Arg Arg Lys Gln Arg Arg -Glu Glu85 90 95Glu Gly Arg Asn Pro Asn Pro Asn Pro Gln Asn His Asp Ser Ile Arg100 105 110

Gly Ser Gly Gly Asp Gly Ser Ser Arg Ser Asp Ser Val Ala Glu Ser115 120 125

Val Val Phe Gly Lys Glu Lys Asp Phe Asn Gly Gly Ile Asn Arg Glu130 135 140

Leu Asp Gly Ser Glu Ser Phe Asn Trp Thr Thr Ser Arg GÍu Ser Thr145 150 155 160

Pro Cys Ser Leu Ile Arg Lys His Glu Thr Ile Thr Ser Pro Gly Ser165 170 175

Ser Thr Lys Leu Ser Asn Gly Ile Ser Asp Asn Ser Asn Gln Arg Glu180 185 190

Asp Ser Phe Ser Gly Ser His Arg His Leu Pro Thr Thr Pro Glu Met195 200 205

Asp Glu Phe Phe Ser Ala Ala Glu Glu Glu Gln Gln Lys Gln Phe Ile210 215 220

Glu Lys Tyr Asn Phe Asp Pro Val Asn Glu Gln Pro Leu Pro Gly Arg225 230 235 240

Phe Glu Trp Lys Lys Val Asp Asp245

<210> 71

<211> 199

<212> PRT

<213> Brassica napus

<400> 71

Met Gly Arg Tyr Ile Lys Lys Ser Lys Ile Ala Gly Gly Ala Leu Ser1 5 -· 10 15

Ala Lys Asp Ile Ser His Gln Thr Ala Ser Gly Phe Arg Thr Arg Ala20 25 30

Ala Lys Asn Leu Ala Leu Gln Arg Leu Arg Ser His Ser Thr Pro Pro35 40 45

Phe Val Asp Ala Asp Ser Phe Arg Tyr Leu Gln Leu Arg Ser Arg Arg50 55 60

Leu Val Lys Leu Pro Leu Leu Ala Asp Thr Arg Lys Gln Gln Gln Arg65 70 75 80Gln Leu Ala Asn Ser Val Gly Lys Arg Gln Thr Thr Asn Pro Arg Ala85 90 95

Asn Pro Val Leu Ser Ser Glu Pro Thr Asn Leu Glu Glu Asp Arg Gly100 105 110

Ser Asn Leu Val Lys Phe Glu Ser Gly Cys Ser Leu Gly Glu Lys Gly115 120 125

Leu Glu Phe Glu Ser Gly Asp Arg Glu Thr Thr Pro Cys Ser Leu Arg130 135 140

Arg Asp Ser Glu Glu Ala Thr Gln Ser Val Pro Ser His Glu Ile Glu145 150 155 160

Glu Phe Phe Ala Phe Ala Glu Gln Gln Gln Gln Arg Phe Phe Thr Glu165 170 175

Lys Tyr Asn.Phe Asp Ile Val Ser Glu Asn Pro Leu Pro Gly Arg Tyr180 185 190

Glu Trp Ile Lys Val Val Pro195

<210> 72

<211> 190

<212> PRT

<213> Brassica napus

<400> 72

Met Ser Glu Arg Asp Pro Asn Cys Lys Arg Asp Ala Arg Ser Leu Glu15 10 15

Ala Ser Ser Gln Asn Asp Ser Gln Leu Lys Lys Lys Lys Leu Asp Asp20 25 30

Asp Phe Val Phe Leu Ala Val Pro Ser Pro Ser Met Ala. Ser Ser Asp35 '· 40 45

Asp Ser Ser Arg Gly Gly Cys Ser Val Thr Ser Ala Gly Glu Asp Asp50 55 60

Asp Lys Ser Ser Ile Ile Cys Phe Ser Ser Glu Ser Asn Glu Ile Val65 70 75 80

Arg Lys Ser Pro Thr Val Ser Val Asp Leu Glu Thr His Gln Ile Ser85 90 95

Asp Asp Leu Ser Val Ser Gly Arg Ile Ala His Arg Asn Glu Ala Asn100 105 110Pro Glu Ser Glu Glu Ala Leu Gly Glu Thr Thr Glu Met Glu Ser Ser115 120 125

Ser Ala Asp Asp Arg Lys Ser Ser Pro Glu Val Ser Lys Ser Pro Thr-130 135 140

Pro Gly Glu Ile Asp Glu Phe Leu Ser Glu Leu Glu Ser Lys Asp Gln145 150 155 160

Lys Arg Phe Met Asp Lys Tyr Asn Phe Asp Ile Val Asn Asp Lys Pro165 170 175

.Leu Gln Gly Arg Tyr Lys Trp Asp Arg Val Lys Pro Leu Lys180 185 190

<210> 73<211> 70<212> PRT<213> humano<400> 73

Asn Leu Phe Gly Pro Val Asp His Glu Glu Leu Thr Arg Asp Leu Glu1 5 10 15

Lys His Cys Arg Asp Met Glu Glu Ala Ser Gln Arg Lys Trp Asn Phe20 25 30

Asp Phe Gln Asn His Lys Pro Leu Glu Gly Lys Tyr Glu Trp Gln Glu35 40 45

Val Glu Lys Gly Ser Leu Pro Glu Phe Tyr Tyr Arg Pro Pro Arg Pro50 55 60

Pro Lys Gly Ala Cys Lys65 70

<210> 74<211> 513<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Krpl F151A;F153A otimizado para expressão em milho<400> 74

atggtccgga agtgccggaa gacgaaaggc accgtggggg ctagtagcac ctatatgcaa 60cttaggtcaa gaaggatcgt ctaccgtagc gagaaggcta gttcctctag ttcgtcatgc 120tgtgcttcaa ataacaacgg cgtgatcgac cttgaggagg agcgggatgg agagacagag 180acctcttcgt gcaggcgctc cagcaaacgt aaactcttcg agaatcttag ggagaaggag 240agtatggaaa attctcagca aatcgtagcc ggatttgatt cggcggtgaa agagtctagc 300gactgctgct gttccagaag gacgagtctg tctactaccg aggagaaggg gaaaagcgcc 360

accgagcaac cgccgacggc tgtcgagatt gaggatttct ttgtcgaggc ggagaaacag 420

ctccacgaca attttaagaa gaaatataac gctgacgctg aaaaggagaa gccactggag 480

ggcaggtacg agtgggttaa attgtccgag tga 513

<210> 75<211> 513<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Krpl Υ149Α;F151A;F153A otimizado para expressão em milho<400> 75

atggtccgga agtgccggaa gacgaaaggc accgtggggg ctagtagcac ctatatgcaa 60cttaggtcaa gaaggatcgt ctaccgtagc gagaaggcta gttcctctag ttcgtcatgc 120tgtgcttcaa ataacaacgg cgtgatcgac cttgaggagg agcgggatgg agagacagag 180acctcttcgt gcaggcgctc cagcaaacgt aaactcttcg agaatcttag ggagaaggag 240agtatggaaa attctcagca aatcgtagcc ggatttgatt cggcggtgaa agagtctagc 300gactgctgct gttccagaag gacgagtctg tctactaccg aggagaaggg gaaaagcgcc 360accgagcaac cgccgacggc tgtcgagatt gaggatttct ttgtcgaggc ggagaaacag 420ctccacgaca attttaagaa gaaagcgaac gctgacgctg aaaaggagaa gccactggag 480ggcaggtacg agtgggttaa attgtccgag tga 513

<210> 76

<211> 46

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 76

Ile Pro Ser Ser Thr Glu Met Asn Glu Tyr Phe Ala Ala Glu Gln Arg1 5 10 15

Arg Gln Gln Gln Ala Phe Ile Asp Lys Tyr Asn Phe Asp Pro Val Asn20 25 30

Asp Cys Pro Leu Pro Gly Arg Phe Glu Trp Val Lys Leu Asp35 40 45

<210> 77

<211> 46

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 77

Val Pro Ser Ser Arg Glu Met Asn Glu Tyr Phe Ala Ala Glu Gln Arg1 5 10 15Arg Gln Gln Gln Asp Phe Ile Asp Lys Tyr Asn Phe Asp Pro Ala Asn20 25 30

Asp Cys Pro Leu Pro Gly Arg Phe Glu Trp Val Lys Leu Asp35 40 45

<210> 78<211> 47<212> PRT<213> Zea mays

<400> 78

Ile Pro Ser Ser Leu Glu Met Glu Glu Phe Phe Ser Ala Ala Glu Gln15 10 15

Gln Glu Gln His Asn Phe Arg Glu Lys Tyr Asn Phe Cys Pro Val Asn20 25 30

Asp Cys Pro Leu Pro Gly Arg Tyr Glu Trp Ala Arg Leu Asp Cys35 40 45

<210> 79<211> 47<212> PRT<213> Soja<400> 79

Met Pro Thr Glu Leu Glu Leu Glu Glu Phe Phe Ala Ala Ser Glu Lys1 5 10 15

Asp Ile Gln Lys Arg Phe Gln Asp Arg Tyr Asn Tyr Asp Ile Val Lys20 25 30

Asp Val Pro Leu Glu Gly Arg Tyr Glu Trp Val Gln Leu Lys Pro35 40 45

<210> 80

<211> 47

<212> PRT

<213> Soja

<220>

<221> característica - misc

<222> (7).. (7)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido ocorrendo naturalmente

<400> 80

Met Pro Thr Glu Leu Glu Xaa Glu Glu Phe Phe Val Ala Ala Glu Lys

1 5 10 15

Asp Ile Gln Lys Arg Phe Gln Asp Lys Tyr Asn Tyr Asp Ile Val Lys20 25 30Asp Val Pro Leu Glu Gly Arg Tyr -Glu Trp Val Gln Leu Lys Pro35 40 45

<210> 81

<211> 45

<212> PHT

<213> Soja

<400> 81

Met Pro Thr Glu Leu Glu Leu Asp Glu Phe Phe Ala Ala Ala Glu Lys1 5 10 15

Asp Ile Arg Lys Arg Phe Ser Asp-Lys Tyr Asn Tyr Asp Ile Val Lys20 25 30

Gly Val Ser Leu Glu Gly TVrg Tyr Glu Trp Val Lys Leu35 40 45

<210> 82

<211> 44

<212> PRT

<213> Soja

<400> 82

Pro Pro Lys Ala Glu Ile Glu Glu Phe Phe Ala Met Ala Glu Lys Tyr1 5 10 15

Glu Gln Lys Lys Phe Thr Glu Lys Tyr Asn Phe Asp Ile Val Arg Asp20 25 30

Leu Pro Leu Glu Gly Arg Tyr Gln Trp Val Arg Leu35 40

<210> 83

<211> 47

<212> PRT

<213> Soja

<400> 83

Ile Pro Thr Ser Arg Glu Met Asp Glu Phe Phe Ala Glu Ile Glu Glu1 5 10 15

Ala Gln Gln Lys Lys Phe Ile Glu Lys Tyr Asn Phe Asp Pro Val Asn20 25 30

Glu Lys Pro Leu Ser Gly Arg Tyr Glu Trp Glu Lys Leu Lys Pro35 40 45

<210> 84

<211> 45

<212> PRT

<213> Populus tremula

<400> 84Ile Pro Thr Thr Arg Glu Met. Asp Glu Phe Phe Gly Pro Ala Glu Glu15 10 15

Glu Gln Leu Arg Gln Phe Thr Glu Lys Tyr Asn Phe Asp Pro Val Ser20 25 30

Asp Lys Pro Leu Pro Gly Arg Tyr Glu Trp Glu Lys Leu35 40 45

<210> 85

<211> 43

<212> PRT

<213> Populus tremula

<400> 85

Thr Asp Glu Glu Ile Glu Lys Phe Phe Gly Glu Ile Gln Asn Asn Ile15 10 15

Pro Gln Cys Phe Lys Asp Lys Tyr Asn Phe Asp Phe Asp Lys Asp Glu20 25 30

Pro Leu Glu Gly Arg Tyr Glu Trp Ala Arg Leu35 40

<210> 86

<211> 45

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 86

Val Pro Ser Ser Leu Glu Met Glu Glu Phe Phe Ala Ala Ala Glu Gln15 10 15

Gln Gln His Gln Ala Phe Arg Glu Arg Tyr Asn Phe Cys Pro Val Asn20 25 30

Asp Cys Pro Leu Pro Gly Arg Tyr Glu Trp Thr Arg Leu35 40 45

<210> 87

<211> 46 ''

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 87

Pro Pro Glu Glu Glu Val Glu Ala Phe Leu Ala Ala Ala Glu Ser Ser15 10 15

Val Ala Arg Arg Phe Ala Ala Lys Tyr Asn Tyr Asp Ile Val Lys Asp20 25 30

Ala Pro Met Asp Gly Arg Tyr Glu Trp Val Arg Val Arg Pro35 40 45<210> 88

<211> 168

<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> BnKrpl F145A;Y149A

<400> 88

Met Val Arg Lys Cys Arg Lys Thr Lys Gly Thr Val Gly Ala Ser Ser1 5 ■ 10 15

Thr Tyr Met Gln Leu Arg Ser Arg Arg Ile Val Tyr Arg Ser Glu Lys20 25 30

Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Cys Cys Ala Ser Asn Asn Asn Gly Val35 40 ■ 45.

Ile Asp Leu Glu Glu Glu Arg Asp Gly Glu Thr Glu Thr Ser Ser Cys50 55 60

Arg Arg Ser Ser Lys Arg Lys Leu Phe Glu Asn Leu Arg Glu Lys Glu65 70 75 80

Ser Met Glu Asn Ser Gln Gln Ile Val Ala Gly Phe Asp Ser Ala Val85 90 95

Lys Glu Ser Ser Asp Cys Cys Cys Ser Arg Arg Thr Ser Leu Ser Thr100 105 110

Thr Glu Glu Lys Gly Lys Ser Ala Thr Glu Gln Pro Pro Thr Ala Val115 120 125

Glu Ile Glu Asp Phe Phe Val Glu Ala Glu Lys Gln Leu His Asp Asn130 135 140

Ala Lys Lys Lys Ala Asn Phe Asp Phe Glu Lys Glu Lys Pro Leu Glu145 150 155 160

Gly Arg Tyr Glu Trp Val Lys Leu165

<210> 89<211> 168<212> PRT<213> Seqüência artificial<220> <223> BnKRPl F145A;Υ149Α;Fl5IA<400> 89

Met Val Arg Lys Cys Arg Lys Thr Lys Gly Thr Val Gly Ala Ser Ser1 5 10 15Thr Tyr Met Gln Leu Arg Ser Arg Arg Ile Val Tyr Arg Ser Glu Lys20 25 30

Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Cys Cys Ala Ser Asn Asn Asn Gly Val35 40 45

Ile Asp Leu Glu Glu Glu Arg Asp Gly Glu Thr Glu Thr Ser Ser Cys50 55 60

Arg Arg Ser Ser Lys Arg Lys Leu Phe Glu Asn Leu Arg Glu Lys Glu65 70 75 80

Ser Met Glu Asn Ser Gln Gln Ile Val Ala Gly Phe Asp Ser Ala Val85 90 95

Lys Glu Ser Ser Asp Cys Cys Cys Ser Arg Arg Thr Ser Leu Ser Thr100 105 110

Thr Glu Glu Lys Gly Lys Ser Ala Thr Glu Gln Pro Pro Thr Ala Val115 120 125

Glu Ile Glu Asp Phe Phe Val Glu Ala Glu Lys Gln Leu His Asp Asn130 135 140

Ala Lys Lys Lys Ala Asn Ala Asp Phe Glu Lys Glu Lys Pro Leu Glu145 150 155 160

Gly Arg Tyr Glu Trp Val Lys Leu165

<210> 90

<211> 168

<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> BnKrpl F145A;Y149A; F151A

<400> 90

Met Val- Arg Lys Cys Arg Lys Thr1 5

Lys Gly Thr Val Gly Ala Ser Ser10 15

Thr Tyr Met Gln Leu Arg Ser Arg Arg Ile Val Tyr Arg Ser Glu Lys20 25 30

Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Cys Cys Ala Ser Asn Asn Asn Gly Val35 40 45

Ile Asp Leu Glu Glu Glu Arg Asp Gly Glu Thr Glu Thr Ser Ser Cys50 55 60Arg Arg Ser Ser Lys Arg Lys Leu Phe Glu Asn Leu Arg Glu Lys Glu65 70 75 80

Ser Met Glu Asn Ser Gln Gln Ile Val Ala Gly Phe Asp Ser Ala Val85 90 95

Lys Glu Ser Ser Asp Cys Cys Cys Ser Arg Arg Thr Ser Leu Ser Thr100 105 110

Thr Glu Glu Lys Gly Lys Ser Ala Thr Glu Gln Pro Pro Thr Ala Val115 120 125

Glu Ile Glu Asp Phe Phe Val Glu Ala Glu Lys Gln Leu His Asp Asn130 135 140

Ala Lys Lys Lys Ala Asn Ala Asp Ala Glu Lys Glu Lys Pro Leu Glu145 150 155 160

Gly Arg Tyr Glu Trp Val Lys Leu165

<210> 91

<211> 168

<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> BnKrpl Y149A;F151A

<400> 91

Met Val Arg Lys Cys Arg Lys Thr Lys Gly Thr Val Gly Ala Ser Ser15 10 15

Thr Tyr Met Gln Leu Arg Ser Arg Arg Ile Val Tyr Arg Ser Glu Lys20 25 30

Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Cys Cys Ala Ser Asn Asn Asn Gly Val35 40 45

Ile Asp Leu Glu Glu Glu Arg Asp Gly Giru Thr Glu Thr Ser Ser Cys50 55 60

Arg Arg Ser Ser Lys Arg Lys Leu Phe Glu Asn Leu Arg Glu Lys Glu65 70 75 80

Ser Met Glu Asn Ser Gln Gln Ile Val Ala Gly Phe Asp Ser Ala Vai.

85 90 95

Lys Glu Ser Ser Asp Cys Cys Cys Ser Arg Arg Thr Ser Leu Ser Thr100 105 110Thr Glu Glu Lys Gly Lys Ser Ala Thr Glu Gln Pro Pro Thr Ala Val115 120 125

Glu Ile Glu Asp Phe Phe Val Glu Ala Glu Lys Gln Leu His Asp Asn130 135 140

Phe Lys Lys Lys Ala Asn Ala Asp Phe Glu Lys Glu Lys Pro Leu Glu145 150 155 160

Gly Arg Tyr Glu Trp Val Lys Leu165

<210> 92<211> 168<212> PRT<213> Seqüência artificial<220> <223> BnKrpl Y149A;F153A<400> 92

Met Val Arg Lys Cys Arg Lys Thr Lys Gly Thr Val Gly Ala Ser Ser1 5 10 15

Thr Tyr Met Gln Leu Arg Ser Arg Arg Ile Val Tyr Arg Ser Glu Lys20 25 30

Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Cys Cys Ala Ser Asn Asn Asn Gly Val35 40 45

Ile Asp Leu Glu Glu Glu Arg Asp Gly Glu Thr Glu Thr Ser Ser Cys50 55 60

Arg Arg Ser Ser Lys Arg Lys Leu Phe Glu Asn Leu Arg Glu Lys Glu65 70 75 80

Ser Met Glu Asn Ser Gln Gln Ile Val Ala Gly Phe Asp Ser Ala Val85 90 95

Lys Glu Ser Ser Asp Cys Cys Cys Ser Arg Arg Thr Ser Leu Ser Thr100 1'o 5 110

Thr Glu Glu Lys Gly Lys Ser Ala Thr Glu Gln Pro Pro Thr Ala Val115 120 125

Glu Ile Glu Asp Phe Phe Val Glu Ala Glu Lys Gln Leu His Asp Asn130 135 140

Phe Lys Lys Lys Ala Asn Phe Asp Ala Glu Lys Glu Lys Pro Leu Glu145 150 155 160Gly Arg Tyr Glu Trp Val Lys Leu165

<210> 93<211> 168<212> PRT<213> Seqüência artificial<220> <223> BnKrpl F151A;F153A<400> 93

Met Val Arg Lys Cys Arg Lys Thr Lys Gly Thr Val Gly Ala Ser Ser1 5 10 15

Thr Tyr Met Gln Leu Arg Ser Arg Arg Ile Val Tyr Arg Ser Glu Lys20 25 30

Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Cys Cys Ala Ser Asn Asn Asn Gly Val35 40 45

Ile Asp Leu Glu Glu Glu Arg Asp Gly Glu Thr Glu Thr Ser Ser Cys50 55 60

Arg Arg Ser Ser Lys Arg Lys Leu Phe Glu Asn Leu Arg Glu Lys Glu65 70 75 80

Ser Met Glu Asn Ser Gln Gln Ile Val Ala Gly Phe Asp Ser Ala Val85 90 95

Lys Glu Ser Ser Asp Cys Cys Cys Ser Arg Arg Thr Ser Leu Ser Thr100 105 110

Thr Glu Glu Lys Gly Lys Ser Ala Thr Glu Gln Pro Pro Thr Ala Val115 120 125

Glu Ile Glu Asp Phe Phe Val Glu Ala Glu Lys Gln Leu His Asp Asn130 135 140

Plve I.ys Lys Lys Tyr Asn Ala Asp Ala- Glu Lys Glu Lys Pro Leu Glu145 ·'/ 150 155 160

Gly Arg Tyr Glu Trp Val Lys Leu165

<210> 94

<211> 168

<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> BnKrpl F151A;F153A;Y149A

<400> 94Met Val Arg Lys Cys Arg Lys Thr Lys Gly Thr Val Gly Ala Ser Ser1 5 10 15

Thr Tyr Met Gln Leu Arg Ser Arg Arg Ile Val Tyr Arg Ser Glu Lys20 25 30

Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Cys CysAla Ser Asn Asn Asn Gly Val35 40 45

Ile Asp Leu Glu Glu Glu Arg Asp Gly Glu Thr Glu Thr Ser Ser Cys50 55 60 -Arg Arg Ser Ser Lys Arg Lys Leu Phe Glu Asn Leu Arg Glu Lys Glu65 70 75 80

Ser Met Glu Asn Ser Gln Gln Ile Val Ala Gly Phe Asp Ser Ala Val85 90 95

Lys Glu Ser Ser Asp Cys Cys Cys Ser Arg Arg Thr Ser Leu Ser Thr100 105 110

Thr Glu Glu Lys Gly Lys Ser Ala Thr Glu Gln Pro Pro Thr Ala Val115 120 125

Glu Ile Glu Asp Phe Phe Val Glu Ala Glu Lys Gln Leu His Asp Asn130 135 140

Phe Lys Lys Lys Ala Asn Ala Asp Ala Glu Lys Glu Lys Pro Leu Glu145 150 155 160

Gly Arg Tyr Glu Trp Val Lys Leu165

<210> 95<211> 168<212> PRT<213> Seqüência artificial<220> <223> BnKrpl F151-A; F153A; E164A

<400> 95

Met Val Arg Lys Cys Arg Lys Thr Lys Gly Thr Val Gly Ala Ser Ser15 10 15

Thr Tyr Met Gln Leu Arg Ser Arg Arg Ile Val Tyr Arg Ser Glu Lys20 25 30

Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Cys Cys Ala Ser Asn Asn Asn Gly Val35 40 45Ile Asp Leu Glu Glu Glu Arg Asp Gly Glu Thr Glu Thr Ser Ser Cys50 55 60

Arg Arg Ser Ser Lys Arg Lys Leu Phe Glu Asn Leu Arg Glu Lys Glu65 70 75 80

Ser Met Glu Asn Ser Gln Gln Ile Val Ala Gly Phe Asp Ser Ala Val85 90 95

Lys Glu Ser Ser Asp Cys Cys Cys Ser Arg Arg Thr Ser Leu Ser Thr100 105 110

Thr Glu Glu Lys Gly Lys Ser Ala Thr Glu Gln Pro Pro Thr Ala Val115 120 125

Glu Ile Glu Asp Phe Phe Val Glu Ala Glu Lys Gln Leu His Asp Asn130 135 140

Phe Lys Lys Lys Tyr Asn Ala Asp Ala Glu Lys Glu Lys Pro Leu Glu145 150 155 160

Gly Arg Tyr Ala Trp Val Lys Leu165

<210> 96<211> 168<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> BnKrpl F151A;F153A;W165A .<400> 96

Met Val Arg Lys Cys Arg Lys Thr Lys Gly Thr Val Gly Ala Ser Ser15 10 15

Thr Tyr Met Gln Leu Airg Ser Airg Arg lie Val Tyr Arg Ser Glu Lys20 25 30

Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Cys Cys Alá Ser Asn Xsn Asn Gly yal35 40 45

Ile Asp Leu Glu Glu Glu Arg Asp Gly Glu Thr Glu Thr Ser Ser Cys50 55 60

Arg Arg Ser Ser Lys Arg Lys Leu Phe Glu Asn Leu Arg Glu Lys Glu65 70 75 80

Ser Met Glu Asn Ser Gln Gln Ile Val Ala Gly Phe Asp Ser Ala Val85 90 95Lys Glu Ser Ser Asp Cys- Cys Cys Ser Arg Arg Thr Ser Leu Ser Thr100 105 110

Thr Glu Glu Lys Gly Lys Ser Ala Thr Glu Gln Pro Pro Thr Ala Val115 120 125

Glu Ile Glu Asp Phe Phe Val Glu Ala Glu Lys Gln Leu His Asp Asn130 135 140

Phe Lys Lys Lys Tyr Asn Ala Asp Ala Glu Lys Glu Lys Pro Leu Glu145 150 155 160

Gly Arg Tyr Glu Ala Val Lys Leu165

<210> 97

<211> 168

<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> BnKrpl F151A;F153A;E164A;W165A

<400> 97

Met Val Arg Lys Cys Arg Lys Thr Lys Gly Thr Val Gly Ala Ser Ser1 5 10 15

Thr Tyr Met Gln Leu Arg Ser Arg Arg Ile Val Tyr Arg Ser Glu Lys20 25 30

Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Cys Cys Ala Ser Asn Asn Asn Gly Val35 40 45

Ile Asp Leu Glu Glu Glu Arg Asp Gly Glu Thr Glu Thr Ser Ser Cys50 55 60

Arg Arg Ser Ser Lys Arg Lys Leu Phe Glu Asn Leu Arg Glu Lys Glu65 70 75 80

Ser Met Glu Asn Ser Gln Gln Ile'Val Ala Gly,Phe Asp Ser Ala Val85 90 '·' 95

Lys Glu Ser Ser Asp Cys Cys Cys Ser Arg Arg Thr Ser Leu Ser Thr100 105 110

Thr Glu Glu Lys Gly Lys Ser Ala Thr Glu Gln Pro Pro Thr Ala Val115 120 125

Glu Ile Glu Asp Phe Phe Val Glu Ala Glu Lys Gln Leu His Asp Asn130 135 140Phe Lys Lys Lys Tyr Asn Ala Asp Ala Glu Lys Glu Lys Pro Leu Glu145 150 155 160

Gly Arg Tyr Ala Ala Val Lys Leu165

<210> 98<211> 168<212> PRT

<213> Seqüência artificial<22 0>

<223> BnKrpl F151A;F153A;Y149A;E164A<400> 98

Met Val Arg Lys Cys Arg Lys Thr Lys Gly Thr Val Gly Ala Ser Ser15 10 15

Thr Tyr Met Gln Leu Arg Ser Arg Arg Ile Val Tyr Arg Ser Glu Lys20 25 30

Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Cys Cys Ala Ser Asn Asn Asn Gly Val35 40 45

Ile Asp Leu Glu Glu Glu Arg Asp Gly Glu Thr Glu Thr Ser Ser Cys50 55 60

Arg Arg Ser Ser Lys Arg Lys Leu Phe Glu Asn Leu Arg Glu Lys Glu65 70 75 80

Ser Met Glu Asn Ser Gln Gln Ile Val Ala Gly Phe Asp Ser Ala Val85 90 95

Lys Glu Ser Ser Asp Cys Cys Cys Ser Arg Arg Thr Ser Leu Ser Thr100 105 110

Thr Glu Glu Lys Gly Lys Ser Ala Thr Glu Gln Pro Pro Thr Ala Val115 120 125

Glu Ile Glu Asp Phe Phe Val Glu Ala Glu Lys Gln Leu His Asp Asn130 t-3 5 140

Phe Lys Lys Lys Ala Asn Ala Asp Ala Glu Lys Glu Lys Pro Leu Glu145 150 155 160

Gly Arg Tyr Ala Trp Val Lys Leu165

<210> 99

<211> 168

<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> BnKrpl F151A;F153A;Y149A;W165A<400> 99

Met Val Arg Lys Cys Arg Lys Thr Lys Gly Thr Val Gly Ala Ser Ser1 5 10 15

Thr Tyr Met Gln Leu Arg Ser Arg Arg Ile Val Tyr Arg Ser Glu Lys20 25 30

Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Cys Cys Ala Ser Asn Asn Asri Gly Val35 40 45

Ile Asp Leu Glu Glu Glu Arg Asp Gly Glu Thr Glu Thr Ser Ser Cys50 55 60

Arg Arg Ser Ser Lys Arg Lys Leu Phe Glu Asn Leu Arg Glu Lys Glu65 70 75 . ·. - . 80

Ser Met Glu Asn Ser Gln Gln Ile Val Ala Gly Phe Asp Ser Ala Val85 90 95

Lys Glu Ser Ser Asp Cys Cys Cys Ser Arg Arg Thr Ser Leu Ser Thr100 105 110

Thr Glu Glu Lys Gly Lys Ser Ala Thr Glu Gln Pro Pro Thr Ala Val115 120 125

Glu Ile Glu Asp Phe Phe Val Glu Ala Glu Lys Gln Leu His Asp Asn130 135 140

Phe Lys Lys Lys Ala Asn Ala Asp Ala Glu Lys Glu Lys Pro Leu Glu145 150 155 160

Gly Arg Tyr Glu Ala Val Lys Leu165

<210> 100<211> 168 ,<212> φτ<213> Seqüência artificial<220> <223> BnKrpl F151A;F153A;Y149A;E164A;W165A<400> 100

Met Val Arg Lys Cys Arg Lys Thr Lys Gly Thr Val Gly Ala Ser Ser15 10 15

Thr Tyr Met Gln Leu Arg Ser Arg Arg Ile Val Tyr Arg Ser Glu Lys20 25 30Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Cys Cys Ala Ser Asn Asn Asn Gly Val35 40 45

Ile Asp Leu Glu Glu Glu Arg Asp Gly Glu Thr Glu Thr Ser Ser Cys50 55 60

Arg Arg Ser Ser Lys Arg Lys Leu Phe Glu Asn Leu Arg Glu Lys Glu65 70 75 80

Ser Met Glu Asn Ser Gln Gln Ile Val Ala Gly Phe Asp Ser Ala Val85 90 95

Lys Glu Ser Ser Asp Cys Cys Cys Ser Arg Arg Thr Ser Leu Ser Thr100 105 110

Thr Glu Glu Lys Gly Lys Ser Ala Thr Glu Gln Pro Pro Thr Ala Val115 120 125

Glu Ile Glu Asp Phe Phe Val Glu Ala Glu Lys Gln Leu His Asp Asn130 135 140

Phe Lys Lys Lys Ala Asn Ala Asp Ala Glu Lys Glu Lys Pro Leu Glu145 150 155 160

Gly Arg Tyr Ala Ala Val Lys Leu165

<210> 101<211> 168<212> PRT<213> Seqüência artificial<220> <22 3> BnKrpl E164A;W165A

<400> 101

Met Val Arg Lys Cys Arg Lys Thr Lys Gly Thr Val Gly Ala Ser Ser15 10 15

Thr Tyr Met Gln Leu Arg Ser Arg Arg Ile Val Tyr Arg Ser Glu-'Lys20 25 30

Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Cys Cys Ala Ser Asn Asn Asn Gly Val35 40 45

Ile Asp Leu Glu Glu Glu Arg Asp Gly Glu Thr Glu Thr Ser Ser Cys50 55 60

Arg Arg Ser Ser Lys Arg Lys Leu Phe Glu Asn Leu Arg Glu Lys Glu65 70 75 80Ser Met Glu Asn Ser Gln Gln Ile Val Ala Gly Phe Asp Ser Ala Val85 90 95

Lys Glu Ser Ser Asp Cys Cys Cys Ser Arg Arg Thr Ser Leu Ser Thr100 105 110

Thr Glu Glu Lys Gly Lys Ser Ala Thr Glu Gln Pro Pro Thr Ala Val115 120 125

Glu Ile Glu Asp Phe Phe Val Glu Ala Glu Lys Gln Leu His Asp Asn130 135 140

Phe Lys Lys Lys Tyr Asn Phe Asp Phe Glu Lys Glu Lys Pro Leu Glu145 150 155 160

Gly Arg Tyr Ala Ala Val Lys Leu165

Claims (62)

1. Polipeptídeo inibidor de quinase dependente de ciclina (CKI)de planta mutante, isolado, compreendendo:uma seqüência de aminoácido CKI tendo pelo menos uma modi-ficação com relação a um polipeptídeo CKI de planta do tipo silvestre, o refe-rido polipeptídeo CKI do tipo silvestre compreendendo (a) uma região deligação de ciclina que confere afinidade de ligação a uma ciclina e (b) umaregião de ligação de quinase dependente de ciclina (CKI) que confere afini-dade de ligação a uma CDK;em que a referida pelo menos uma modificação está dentro daregião de ligação de CDK de modo a conferir, com relação ao polipeptídeoCKI do tipo silvestre, uma afinidade de ligação modificada do polipeptídeo deCKI mutante para a CDK;em que o polipeptídeo de CKI mutante substancialmente man-tém, com relação ao polipeptídeo CKI do tipo silvestre, afinidade de ligação àciclina; eem que o polipeptídeo de CKI mutante pode competir com a re-ferida CKI do tipo silvestre para ligação à região de ligação de CDK.

2. Polipeptídeo CKI de planta mutante de acordo com a reivindi-cação 1, em que o referido polipeptídeo de CKI de planta do tipo silvestre éum membro da família de proteína relacionada com KIP (KRP).

3. Polipeptídeo CKI de planta mutante de acordo com a reivindi-cação 2, em que o referido membro da família KRP é um polipeptídeo deCKI de Brassica napus, Arabidopsis thaliana, Glycine max, milho, trigo, ar-roz, alfafa, algodão, ou álamo.

4. Polipeptídeo CKI de planta mutante de acordo com a reivindi-cação 2, em que o referido membro da família KRP é um polipeptídeo KRP1de Arabidopsis ou Brassica.

5. Polipeptídeo CKI de planta mutante de acordo com a reivindi-cação 2, em que a referida pelo menos uma modificação é dentro de umaregião que correspondem aos aminoácidos 145-168 de KRP1 de Brassica(BnKRPI).

6. Polipeptídeo CKI de planta mutante de acordo com a reivindi-cação 5, que compreende pelo menos duas modificações dentro da regiãoque correspondem aos aminoácidos 145-168 de KRP1 de Brassica (BnKRPI).

7. Polipeptídeo CKI de planta mutante de acordo com a reivindi-cação 5, em que a referida pelo menos uma modificação compreende umasubstituição de aminoácido.

8. Polipeptídeo CKI de planta mutante de acordo com a reivindi-cação 7, em que a substituição de aminoácido é uma substituição de não-alanina por alanina ou uma substituição não-conservativa.

9. Polipeptídeo CKI de planta mutante de acordo com a reivindi-cação 7, que compreende pelo menos duas substituições de aminoácido,cada substituição de aminoácido estando em uma posição independente-mente selecionada do grupo consistindo em:(a) uma posição que corresponde ao aminoácido 145 de Bn-KRPI;(b) uma posição que corresponde ao aminoácido 149 de Bn-KRPI;(c) uma posição que corresponde ao aminoácido 151 de Bn-KRPI;(d) uma posição que corresponde ao aminoácido 153 de Bn-KRPI;(e) uma posição que corresponde ao aminoácido 164 de Bn-KRPI; e(f) uma posição que corresponde ao aminoácido 165 de Bn-KRPI.

10. Polipeptídeo CKI de planta mutante de acordo com a reivin-dicação 9, em que uma ou mais, e opcionalmente todas, das pelo menosduas substituições de aminoácido são substituição(ões) de não-alanina poralanina ou são substituição(ões) de aminoácido não-conservativas.

11. Polipeptídeo CKI de planta mutante de acordo com a reivin-dicação 5, em que a referida pelo menos uma modificação, ou as pelo me-nos duas modificações, é {são) dentro do motivo KYNFDF.

12. Polipeptideo CKI de planta mutante de acordo com a reivin-dicação 11, em que a referida pelo menos duas modificações dentro do mo-tivo KYNFDF compreendem substituições de aminoácido em posições quecorrespondem aos aminoácidos 151 e 153 de BnKRPI.

13. Polipeptídeo CKI de planta mutante de acordo com a reivin-dicação 12, em que pelo menos uma das substituições de aminoácido nasposições que correspondem aos aminoácidos 151 e 1,53 de BnKRPI é umasubstituição de não-alanina por alanina ou é uma substituição de um amino-ácido com um aminoácido opostamente carregado.

14. Polipeptídeo CKI de planta mutante de acordo com a reivin-dicação 12, em que cada uma das substituições de aminoácido nas posiçõesque correspondem aos aminoácidos 151 e 153 de BnKRPI é uma substitui-ção de não-alanina por alanina ou é uma substituição de um aminoácidocom um aminoácido opostamente carregado.

15. Polipeptídeo CKI de planta mutante de acordo com qualqueruma das reivindicações 12 a 14, também compreendendo uma substituiçãode aminoácido em uma posição que corresponde ao aminoácido 149 de Bn-KRP1.

16. Polipeptídeo CKI de planta mutante de acordo com a reivin-dicação 15, em que a substituição de aminoácido na posição que correspon-de ao aminoácido 149 de BnKRPI é uma substituição de não-alanina poralanina ou é uma substituição não-conservativa.

17. Polipeptídeo CKI de planta mutante de acordo com qualqueruma das reivindicações 12 a 16, também compreendendo uma substituiçãode aminoácido em pelo menos uma de, ou em cada uma de:(a) uma posição que corresponde ao aminoácido 164 de Bn-KRP1, e(b) uma posição que corresponde ao aminoácido 165 de Bn-KRP1.

18. Polipeptídeo CKI de planta mutante de acordo com a reivin-dicação 17, em que a substituição de aminoácido em pelo menos uma de (a)e (b), ou em cada uma de (a) e <b), é uma substituição de não-alanina poralanina, ou uma substituição não-conservativa.

19. Polipeptídeo CKI de planta mutante de acordo com qualqueruma das reivindicações 4 a 18, que é um polipeptídeo BnKRPI mutante.

20. Polipeptídeo BnKRPI mutante de acordo com a reivindica-ção 19, que é(i) BnKRPI F151A; F153A;(ii) BnKRPI Y149A; F151A; F153A;(iii) BnKRPI E164A; W165A; ou(iv) BnKRPI F151A; F153A; E164A; W165A.

21. Polipeptídeo de CKI mutante de acordo com qualquer umadas reivindicações 1 a 5, em que a referida pelo menos uma modificaçãocompreende a truncação da região de ligação de CDK.

22. Polipeptídeo de CKI mutante de acordo com a reivindicação-21, que é um polipeptídeo BnKRPI mutante.

23. Ácido nucléico recombinante codificando o polipeptídeo deCKI mutante como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 22.

24. Vetor compreendendo um réplicon e o ácido nucléico recom-binante como definido na reivindicação 23.

25. Vetor de acordo com a reivindicação 24, que é um vetor deexpressão que também compreende uma região promotora operacionalmen-te ligada ao ácido nucléico recombinante.

26. Vetor de expressão de acordo com a reivindicação 25, emque a região promotora é operacional em uma célula de planta.

27. Vetor de expressão de acordo com a reivindicação 26, emque a região promotora compreende um promotor CaMV 35S ou urri promo-tor LFAH12.

28. Vetor de expressão de acordo com a reivindicação 25, emque a região promotora é transcricionalmente ativa de um modo específicoem um tecido e/ou órgão.

29. Célula hospedeira compreendendo o ácido nucléico recom-binante como definido na reivindicação 33.

30. Célula hospedeira compreendendo o vetor como definido emqualquer uma das reivindicações 24 a 28.

31. Método de produzir um polipeptídeo de CKI mutante, o refe-rido método compreendendo:cultivar a célula hospedeira como definido na reivindicação 29 ousob condições adequadas para a expressão do ácido nucléico codifican-do o polipeptídeo de CKI mutante.

32. Método de acordo com a reivindicação 31, também compre-endendo recuperar o referido polipeptídeo de CKI mutante.

33. Planta transgênica compreendendo um transgene codifican-do um polipeptídeo de CKI mutante, a referida planta transgênica expres-sando um polipeptídeo de CKI do tipo silvestre, o referido polipeptídeo CKIdo tipo silvestre compreendendo (a) uma região de ligação de ciclina queconfere afinidade de ligação a uma ciclina e (b) uma região de ligação deCDK que confere afinidade de ligação a uma CDK, em que o referido poli-peptídeo de CKI mutante compreende uma seqüência de aminoácido CKItendo pelo menos uma modificação com relação a um polipeptídeo de CKIde referência, o referido polipeptídeo de CKI de referência selecionado dogrupo que consiste em(i) o polipeptídeo de CKI de planta do tipo silvestre expressopela planta transgênica, e(ii) um polipeptídeo CKI do tipo silvestre heterólogo a (i) e ca-paz de fornecer função de CKI do tipo silvestre dentro deuma célula da planta transgênica substancialmente equiva-lente à função de CKI do tipo silvestre de (i);em que a referida pelo menos uma modificação está dentro daregião de ligação de CDK de modo a conferir, com relação ao polipeptídeode CKI de referência, uma afinidade de ligação modificada de polipeptídeode CKI mutante para a CDK, e em que o polipeptídeo de CKI mutante subs-tancialmente mantém, com relação ao polipeptídeo de CKI de referência,afinidade de ligação à ciclina.

34. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 33, que éuma planta monocotiledônea ou uma planta dicotiledônea.

35. Planta transgênica de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 34 e 35, em que o dito polipeptídeo de CKI de referência é ummembro da família de proteína relacionada com KIP (KRP).

36. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 35, emque o referido membro da família KRP é um polipeptídeo de CKI de Brassicanapus, Arabidopsis thaiiana, Glycine max, milho, trigo, arroz, alfafa, algodão,ou álamo.

37. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 36, emque o referido membro da família KRP é um polipeptídeo de KRP1.

38. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 35, emque a referida pelo menos uma modificação, ou as pelo menos duas modifi-cações, é (são) dentro de uma região que corresponde aos aminoácidos-145-168 de Brassica KRP1 (BnKRPI).

39. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 38, emque a referida pelo menos uma modificação, ou as pelo menos duas modifi-cações, compreende(m) uma substituição de aminoácido.

40. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 39, emque a substituição de aminoácido é uma substituição de não-alanina por ala-nina, ou é uma substituição de um aminoácido com um aminoácido oposta-mente carregado.

41. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 39, emque a pelo menos uma modificação, ou as pelo menos duas modificações, é(são) dentro do motivo KYNFDF.

42. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 41, emque a pelo menos uma modificação, ou as pelo menos duas modificações,dentro do motivo KYNFDF compreende(m) substituições de aminoácido emposições que correspondem aos aminoácidos 151 e 153 de BnKRPI.

43. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 42, emque pelo menos uma das substituições de aminoácido, ou cada uma substi-tuição nas posições que correspondem aos aminoácidos 151 e 153 de Bn-KRP1 é uma substituição de não-alanina por alanina, ou é uma substituiçãode um aminoácido com um aminoácido opostamente carregado.

44. Planta transgênica de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 42 e 43, em que o polipeptídeo de CKI mutante também compre-ende uma substituição de aminoácido em uma posição que corresponde aoaminoácido 149 de BnKRPI.

45. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 44, emque a substituição de aminoácido na posição que corresponde ao aminoáci-do 149 de BnKRPI é uma substituição de não-alaninai por alanina, ou é umasubstituição não-conservativa.

46. Planta transgênica de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 44 e 45, em que o polipeptídeo de CKI mutante também compre-ende uma substituição de aminoácido em pelo menos uma de, ou em cadauma de:(a) uma posição que corresponde ao aminoácido 164 de Bn-KRP1, e(b) uma posição que corresponde ao aminoácido 165 de Bn-KRP1.

47. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 46, emque a substituição de aminoácido em pelo menos uma de, ou em pelo me-nos em cada uma de, (a) e (b) é uma substituição de não-alanina por alani-na, ou é uma substituição não-conservativa.

48. Planta transgênica de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 38 a 47, em que o polipeptídeo de CKI de referência é um polipep-tídeo BnKRPI.

49. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 48, emque o polipeptídeo de CKI mutante é(i) BnKRPI F151A; F153A;(ii) BnKRPI Y149A; F151A; F153A;(iii) BnKRPI Ε164A; W165A; ou(iv) BnKRPI F151 A; F153A; Ε164A; W165A.

50. Planta transgênica de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 43 a 49, em que a referida pelo menos uma modificação compre-ende a truncação da região de ligação de CDK.

51. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 50, emque o polipeptídeo de CKI de referência é um polipeptídeo BnKRPI.

52. Planta transgênica de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 38 a 51, que é selecionada do grupo que consiste em Brassica na-pus, Arabidopsis thaliana, Giycine max, milho, trigo, arroz, alfaia, algodão,álamo, e camelina.

53. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 52, emque o polipeptídeo de CKI de referência é um polipeptídeo de CKI de Arabi-dopsis thaliana.

54. Método de produzir planta transgênica como definida emqualquer uma das reivindicações 38 a 53, compreendendo:introduzir em uma planta um vetor compreendendo o transgenecodificando o polipeptídeo de CKI mutante.

55. Método de modular divisão celular em uma célula de plantaexpressando um polipeptídeo de CKI do tipo silvestre, o referido polipeptídeoCKI do tipo silvestre compreendendo (a) uma região de ligação de ciclinaque confere afinidade de ligação a uma ciclina e (b) uma região de ligaçãode CDK que confere afinidade de ligação a uma CDK, o método compreen-dendo:expressar dentro da célula um polipeptídeo de CKI mutante co-mo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 22.

56. Método de acordo com a reivindicação 55, também compre-endendo introduzir na célula de planta um ácido nucléico recombinante codi-ficando o polipeptídeo de CKI mutante.

57. Método de acordo com a reivindicação 56, em que o ácidonucléico recombinante é um vetor de expressão.

58. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 55a 57, em que a célula de planta é de uma planta selecionada do grupo queconsiste em Brassica napus, Arabidopsis thaliana, Glycine max, e milho.

59. Método para aumentar o vigor da planta, compreendendo:expressar dentro da planta um polipeptídeo de CKI mutantecompreendendo um CKI como definido em qualquer uma das reivindicações-1 a 22; epermitir que o referido polipeptídeo de CKI mutante iniba a ativi-dade biológica de CKI do tipo silvestre dentro da planta a fim de aumentar ovigor da planta.

60. Método para aumentar a massa de raiz em uma planta,compreendendo:expressar dentro da planta um polipeptídeo de CKI mutantecompreendendo um CKI como definido em qualquer uma das reivindicações-1 a 22; epermitir que o referido polipeptídeo de CKI mutante iniba a ativi-dade biológica de CKI do tipo silvestre dentro da planta a fim de aumentar amassa de raiz na planta.

61. Método para aumentar o tamanho de semente da planta,compreendendo:expressar dentro da planta um polipeptídeo de CKI mutantecompreendendo um CKI como definido em qualquer uma das reivindicações-1 a 22; epermitir que o referido polipeptídeo de CKI mutante iniba a ativi-dade biológica de CKI do tipo silvestre dentro da planta a fim de aumentar otamanho de semente da planta.

62. Método para aumentar a germinação precoce em uma plan-ta, compreendendo:expressar dentro da planta um polipeptídeo de CKI mutantecompreendendo um CKI como definido em qualquer uma das reivindicações-1 a 22; epermitir que o referido polipeptídeo de CKI mutante iniba a ativi-dade biológica de CKI do tipo silvestre dentro da planta a fim de aumentar agerminação precoce na planta.