KR101559128B1 - 환경내성을 증진시키는 비생물 스트레스-유도성 ＯｓＡＴＬ５ 유전자, 단백질 및 OsATL5 발현이 증진된 내재해성 돌연변이체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 서열목록 제 2 서열의 아미노산 서열을 포함하며 식물체에서 과발현되는 경우 상기 식물체에 비생물(abiotic) 스트레스에 대한 내성을 증진시키는 비생물 스트레스-유도성 OsATL5 단백질 및 상기 OsATL5 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산분자, 상기 핵산분자를 포함하는 벡터, 상기 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체, 비생물 스트레스 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 제조된 비생물 스트레스에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체에 관한 것이다. 본 발명에서 이용되는 뉴클레오타이드 서열은 비생물 스트레스(예컨대, 건조 스트레스 및 저온 스트레스)에 대한 식물체의 저항성 증대에 관여를 하며, 이를 이용하여 식물체를 형질전환 하면 상술한 스트레스에 대한 식물체의 저항성이 증가하여 식물체 재배 지역의 한계 극복할 수 있으며, 벼에 적용될 경우 비생물 스트레스에 강한 벼의 생산이 가능하여 생산력을 극대화시킬 수 있다.

Description

환경내성을 증진시키는 비생물 스트레스-유도성 ＯｓＡＴＬ５ 유전자, 단백질 및 OsATL5 발현이 증진된 내재해성 돌연변이체{Abiotic Stress-Inducible ＯｓＡＴＬ５ Gene, Protein and Mutant Enhancing Tolerance to Environment}

본 발명은 환경내성을 증진시키는 비생물 스트레스-유도성 ＯｓＡＴＬ５ 유전자 및 단백질 및 OsATL5 발현이 증진된 내재해성 돌연변이체에 관한 것이다.

식물은 다양한 비생물적 스트레스에 노출되어 생할 주기의 모든 과정에 대해 외부 환경과 계속적으로 상호작용한다. 주요 작물(예컨대, 밀, 옥수수 및 쌀)의 평균 생산량은 저온, 가뭄 및 염분과 같은 다양한 비생물적 스트레스에 의해 절반 이하로 감소되었다. 비생물적 스트레스로 유도된 작물 효율의 감소는 50% 이상으로 보고된다(Bray et al., 2000). 또한, 최근 전세계적 기후 변화는 작물의 생산을 서서히 위협하고 있다.

저온 스트레스는 작물의 생산성을 결정하는 비생물적 스트레스 중 하나이다. 식물은 최적 온도에서 최고의 성장 및 발생을 나타내며, 저온 스트레스는 생식생장에 영향을 미치기 때문에 생산량에 큰 영향을 준다(Jiang et al., 2002). 그러므로, 식물이 어떻게 저온 스트레스에 적응하는가를 이해하는 것이 중요하다.

많은 식물은 비생물적 스트레스와 관련된 유전자의 조절을 통해 비생물적 스트레스에 적응한다. 이러한 식물의 적응반응은 저온 스트레스를 포함하는 다양한 비생물적 스트레스와 공통된다. 분자 수준에서, 후생적 조절뿐 아니라 유전자 발현의 변경은 스트레스에 저항하는 중요한 반응이다.

최근에, E3 유비퀴틴 리가아제가 비생물 및 생물 스트레스에 대한 스트레스 반응에 관련이 있음이 보고되었다(Craig et al., 2009; Ryu et al., 2010). 유비퀴틴화는 식물에서 다양한 생물 반응을 조절하는 중요한 조절 기작이다. 유비퀴틴화는 E1 유비퀴틴-활성 효소, E2 유비퀴틴-접합 효소 및 E3 유비퀴틴 리가아제의 3가지 효소에 의한 연속 효소 기능에 의해 발생한다. 유비퀴틴화는 비생물적 스트레스 내성 식물의 음성 또는 양성 조절자로 알려져 있다. 비생물적 스트레스에 대한 음성 조절자로 HOS1(Dong et al., 2008), DRIP1, DRIP2(Qin et a., 2008), OsDIS1(Ninget al., 2011), AtPUB22 및 AtPUB23(Cho et al., 2008)가 보고되었고, 비생물적 스트레스의 양성 조절자로 XERICO(Ko et al., 2006), SDIRI(Zhang et al., 2007), Rma1H1(Lee et al., 2009) 및 OsPUB15(Park et al., 2011)이 보고되었다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 비생물(abiotic) 스트레스에 대하여 내성을 증진시킬 수 있는 유전자를 발굴하고자 예의 노력한 결과, 벼(Oryza sativa)로부터 스트레스에 의해 유도되는 OsATL5 유전자를 발굴하고 상기 유전자에 의해 형질전환된 식물체가 비생물 스트레스(예컨대, 저온 스트레스 및 건조 스트레스)에 대하여 증진된 내성을 나타낸다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 비생물 스트레스-유도성 OsATL5 단백질을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 비생물 스트레스-유도성 OsATL5 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산분자를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 비생물 스트레스-유도성 OsATL5 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산분자를 포함하는 벡터를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명의 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 비생물 스트레스 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 비생물 스트레스에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제 2 서열의 아미노산 서열을 포함하며 식물체에서 과발현되는 경우 상기 식물체에 비생물(abiotic) 스트레스에 대한 내성을 증진시키는 비생물 스트레스-유도성 OsATL5 단백질을 제공한다.

본 발명자들은 비생물(abiotic) 스트레스에 대하여 내성을 증진시킬 수 있는 유전자를 발굴하고자 예의 노력한 결과, 벼(Oryza sativa)로부터 스트레스에 의해 유도되는 OsATL5 유전자를 발굴하고 상기 유전자에 의해 형질전환된 식물체가 비생물 스트레스(예컨대, 저온 스트레스 및 건조 스트레스)에 대하여 증진된 내성을 나타낸다는 것을 확인하였다.

본 발명의 비생물 스트레스-유도성 OsATL5 단백질은 상기한 아미노산 서열에 대하여 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내며, 동시에 비생물 스트레스에 대한 내성 증진을 할 수 있는 범위 내에서의 아미노산 서열을 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 프로그램(예: ClustalX 및 PROSIS)을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 의미한다.

본 명세서에서 용어 “비생물 스트레스”는 특정 환경에서 생물에 대한 미생물 요소의 부정적 영향으로 정의되며, 건조(drought) 스트레스, 저온(cold) 스트레스, 염(salt) 스트레스 및 삼투(osmotic) 스트레스를 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 비생물 스트레스는 건조 스트레스 또는 저온 스트레스이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 비생물 스트레스-유도성 OsATL5 단백질은 야생형과 비교하여 건조 스트레스에 대하여 1.0-2.0, 1.2-1.7 또는 1.2-1.6배의 내성을 나타내고, 저온 스트레스에 대하여 1.0-2.0, 1.2-1.7 또는 1.2-1.6배의 내성을 나타낸다.

본 발명의 비생물 스트레스-유도성 OsATL5 단백질은 유비퀴틴 활성을 갖는다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 비생물 스트레스-유도성 OsATL5 단백질은 E3 유비퀴틴 리가아제(E3 ubiquitin ligase) 활성을 갖는다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 비생물 스트레스-유도성 OsATL5 단백질은 유비퀴틴 활성을 갖는 RING 핑거 도메인(Really Interesting New Gene finger domain)을 포함한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 비생물 스트레스-유도성 OsATL5 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산분자를 제공한다.

본 명세서에서 용어 “핵산 분자”는 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, NewYork(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제 1 서열인 것을 특징으로 하는 핵산분자이다. 비생물 스트레스-유도성 OsATL5 단백질을 코딩하는 본 발명의 핵산 분자는 상기한 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 프로그램 (예: ClustalX 및 DNASIS)을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.

서열목록 제3서열은 상기 비생물 스트레스-유도성 OsATL5 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 게놈 서열이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 비생물 스트레스-유도성 OsATL5 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터는 (a) 저온-유도성 OsATL5 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 (b) 상기 뉴클레오타이드에 작동적으로 결합된 (operably linked) 프로모터를 포함하는 벡터를 제공한다.

본 명세서에서 용어 “작동적으로 결합된”은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 트랜스레이션을 조절하게 된다.

본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pLλ 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위 (Yanofsky, C., J. Bacteriol., 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ 프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드[예: pGA 시리즈(Kim et al., 2009), ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등], 파지 (예: λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 비생물 스트레스-유도성 OsATL5 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 말토스 결합 단백질 (NEB, USA), 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (Pharmacia, USA), FLAG (IBI, USA) 및 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다. 상기 정제를 위한 추가적인 서열 때문에, 숙주에서 발현된 단백질은 친화성 크로마토그래피를 통하여 신속하고, 용이하게 정제된다.

본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명의 유전자는 식물에서 분리되었고, 비생물 스트레스에 대한 식물체의 내성을 증진하는 작용을 할 수 있으므로, 식물에 대하여 가장 바람직한 유용성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 벡터는 (ⅰ) 저온-유도성 OsATL5 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; (ⅱ) 상기 (ⅰ)의 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결되며 식물세포에서 작용하여 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (ⅲ) 식물세포에서 작용하여 상기 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-비-해독화 부위를 포함하는 식물발현용 벡터를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에 적합한 프로모터는, 식물체의 유전자 도입을 위해 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 것도 이용될 수 있으며, 예를 들어, 옥수수의 유비퀴틴 프로모터, 콜리플라우어 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터, 노팔린 씬타아제 (nos) 프로모터, 피그워트 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 수가크레인 바실리폼 바이러스 프로모터, 콤멜리나 엘로우 모틀 바이러러스 프로모터, 리불로오스-1,5-비스-포스페이트 카르복실라아제 스몰 서브유티트 (ssRUBISCO)의 광유도성 프로모터, 벼 사이토졸 트리오스 포스페이트 이소머라아제 (TPI) 프로모터, 아라비돕시스의 아데닌 포스포리보실트 랜스퍼라아제 (APRT) 프로모터 및 옥토파인 신타아제 프로모터를 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에 적합한 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-비-해독화 부위는 아그로박테리움 튜머페이션스의 팔린 신타아제 유전자로부터 유래된 것 (nos 3' end) (Bevan et al., Nucleic Acids Research, 11(2):369-385(1983)), 아그로박테리움 튜머페이션스의 옥토파인 신타아제 유전자로부터 유래된 것, 토마토 또는 감자의 프로테아제 억제자 I 또는 Ⅱ 유전자의 3' 말단 부분 및 CaMV 35S 터미네이터를 포함한다.

선택적으로, 상기 벡터는 리포터 분자[예: GFP(Green Fluorescence Protein)]를 코딩하는 유전자를 추가적으로 운반한다. 또한, 본 발명의 벡터는 선택 표지로서 항생제 (예: 네오마이신, 카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신, 하이그로마이신 등) 내성 유전자 (예: 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제(nptⅡ), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 (hpt), 등)를 포함한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 이스트 (Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 사람 세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA,9:2110-2114(1973)), 하나한 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci.USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법 (Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988))등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법 (Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham, F.L.et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J.,1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주 세포 내로 주입할 수 있다.

숙주 세포 내로 주입된 벡터는 숙주 세포 내에서 발현되며, 이러한 경우에는 다량의 비생물 스트레스-유도성 OsATL5 단백질을 얻게 된다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 식물 세포 또는 식물조직을 상기 본 발명의 벡터로 형질전환하는 단계; (b) 형질전환된 식물세포 또는 식물조직을 선별하는 단계; 및 (c) 상기 형질전환된 식물세포 또는 식물조직으로부터 식물체를 재분화시켜 형질전환 식물체를 수득하는 단계를 포함하는 저온 스트레스 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 저온 스트레스 내성을 갖는 형질전환 식물체를 제공한다.

본 발명에서 이용되는 익스플랜트로는 식물 세포 또는 식물 조직이며, 식물 조직을 이용하는 경우에는 캘러스를 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법에 있어서, 식물세포의 형질전환은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있으며, 이는 전기천공(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 입자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci.,87:9568-9572(1990)) 및 아그로박테리움-중재 형질전환 (미합중국 특허 제5,004,863, 5,349,124 및 5,416,011 호)을 포함한다. 이 중에서, 아그로박테리움-중재 형질전환이 가장 바람직하다.

형질전환된 식물세포의 선별은 형질전환 배양물을 선택제 (예: 대사억제제, 항생제 및 제초제)에 노출시켜 실시될 수 있다. 형질전환되고 선택제 내성을 부여하는 표지 유전자를 안정되게 포함하고 있는 식물 세포는 상기한 배양물에서 성장하고 분할한다. 예시적인 표지는, 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자, 글리코포스페이트 내성 유전자 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제(nptII) 시스템을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

식물 원형질 또는 다양한 익스플랜드로부터 식물체의 발달 또는 재분화시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 아그로박테리움에 의해 도입된 외래 유전자를 포함하는 식물체의 발달 또는 재분화는 당업계에 공지된 방법에 따라 달성될 수 있다 (미합중국 특허 제 5,004,863, 5,349,124 및 5,416,011 호).

본 발명의 방법은 다양한 식물체에 적용되지만, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 벼, 보리, 밀 및 옥수수와 같은 곡류의 식물체 적용되며, 보다 바람직하게는 벼에 적용된다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 서열목록 제 2 서열의 아미노산 서열을 포함하며 식물체에서 과발현되는 경우 상기 식물체에 비생물(abiotic) 스트레스에 대한 내성을 증진시키는 비생물 스트레스-유도성 OsATL5 단백질 및 상기 OsATL5 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산분자, 상기 핵산분자를 포함하는 벡터, 상기 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체, 비생물 스트레스 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 제조된 비생물 스트레스에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체를 제공한다.

(b) 본 발명에서 이용되는 뉴클레오타이드 서열은 비생물 스트레스(예컨대, 건조 스트레스 및 저온 스트레스)에 대한 식물체의 저항성 증대에 관여를 하며, 이를 이용하여 식물체를 형질전환 하면 상술한 스트레스에 대한 식물체의 저항성이 증가하여 식물체 재배 지역의 한계 극복할 수 있으며, 벼에 적용될 경우 비생물 스트레스에 강한 벼의 생산이 가능하여 생산력을 극대화시킬 수 있다.

도 1은 저온 스트레스 처리 후 E3A126 계통의 저온 스트레스 내성을 나타낸다. 도 1a는 10일된 묘목에 70 μMm^-2sec^-1 빛 세기로 40시간 동안 2℃에서 저온 스트레스를 처리한 후 잎 생존율을 나타낸다. ‘*’은 p<0.05의 통계학적으로 유의한 값을 의미한다. 도 1b는 저온 스트레스 후 6일 동안 회복된 E3A126 및 동진벼(DJ, 야생형)의 대표 사진을 보여준다. 도 1c는 저온 스트레스 후 6일 동안 회복된 E3A126 및 동진벼의 생중량 및 건조중량을 나타낸다. ‘*’은 p<0.05의 통계학적으로 유의한 값을 의미한다.
도 2는 건조 스트레스 처리 후 E3A126 계통의 건조 스트레스 내성을 나타낸다. 도 2a는 10일된 묘목에 36시간동안 물을 주지 않는 건조 스트레스를 처리한 후 잎 생존율을 나타낸다. ‘*’은 p<0.05의 통계학적으로 유의한 값을 의미한다. 도 2b는 건조 스트레스 후 6일 동안 회복된 E3A126 및 동진벼(DJ, 야생형)의 대표 사진을 보여준다. 도 2c는 건조 스트레스 후 6일 동안 회복된 E3A126 및 동진벼의 생중량 및 건조중량을 나타낸다. ‘*’은 p<0.05의 통계학적으로 유의한 값을 의미한다.
도 3은 E3A126 계통의 분자적 특징 및 OsATL5의 발현을 보여준다. 도 3a는 E3A126 계통 내 T-DNA 삽입의 구성도를 나타낸다. 빨간 박스(1 내지 714)는 추측 엑손을 나타내고, 노랑 박스(-285 내지 1 및 714 내지 957)는 각각 5’ 및 3’UTR을 나타내며, ATG 및 TGA는 각각 개시 코돈 및 종결 코돈을 가리킨다. 도 3b는 RT-PCR로 OsATL5의 발현을 분석한 결과이다. E3A126 계통으로부터 추출한 총 RNA를 RT-PCR에 사용하였다. 도 3c는 E3A126 유전자의 실-시간 PCR에 의한 발현 분석 결과를 나타낸다. E3A126 계통으로부터 추출한 총 RNA를 실-시간 PCR에 사용하였다.
도 4는 OsATL5의 발현을 분석한 결과를 보여준다. 도 4a는 비생물성 스트레스 및 외인성 ABA 처리 하의 OsATL5 발현을 나타낸다. 저온(5℃), 염(300 mM) 및 탈수(생중량의 최대 50%) 스트레스를 처리한 7일된 묘목의 30 ㎍ 총 RNA를 아가로즈 겔 상에서 분리하고 OsATL5 프로브로 혼성화하였다. RNA 로딩양의 대조군으로 rRNA를 사용하였다. 도 4b는 발생단계에서 OsATL5의 발현을 나타낸다. Ca는 칼러스(callus), Ss는 발아 7일 째의 새순(shoots), Sr은 발아 7일째의 뿌리, Lf는 성숙한 잎, Ls는 지엽, Ih는 전-출수기(pre-heading stage)의 최상(最上)의 절간(internode), P1은 1-2 ㎝의 이삭(panicle), P2는 3-8 ㎝의 이삭을 의미한다.
도 5는 인 비트로 자가-유비퀴틴화 분석 결과를 나타낸다. MBP-OsALT5 및 MBP-OsATL5^H153A 단백질을 유비퀴틴, E1(Arabidopsis His-UBA1) 및 E2(Arabidopsis His-UBC8)의 포함 또는 불포함 조건에서 30 ℃로 항온반응하였다. 반응 산물을 항-MBP 항체로 단백질 젤-블롯 분석을 하였다. 점선은 자가-유비퀴틴화를 나타낸다.
도 6은 E3A126이 ER 막에 위치함은 보여준다. 도 6a는 양파 세포 내 PUbi-OsATL5-sGFP의 일시발현을 보여준다. 바는 50 ㎛를 나타낸다. 도 6b는 옥수수 내 PUbi-OsATL5-sGFP의 위치를 나타낸다. 야생형 원형질체에 PUbi-E3A26-GFP 또는 P35S-BiP-mRFP를 형질전환하여 PUbi-OsATL5-GFP의 녹색 형광 신호를 측정하였다. PUbi-OsATL5-sGFP의 형광 신호는 P35S-BiP-mRFP의 빨간색 신호와 겹쳐짐을 나타낸다. 바는 10 ㎛를 나타낸다.
도 7은 OsATL5 유전자의 서열 분석 결과를 나타낸다. 도 7a는 추정 아미노산 서열에 기반한 벼 및 아라비돕시스 내 OsATL5 동족체의 계통 발생적 분석 결과를 나타낸다. 1000 동형체를 MEGA 4.0 프로그램 및 근린결합법을 이용하여 분석하였다. 숫자는 부트스트랩(bootstrap) 값을 나타낸다. 도 7b는 OsATL5 및 AT2G4236의 얼라인 결과를 나타낸다. 파란색 밑줄 표시는 막통과(transmembrane) 부분으로 예상되는 부분이다. 빨간색 밑줄은 GLD 부위를, 화살표는 RING 핑거 도메인을, 별표는 ATLs 내 보존된 잔기를 가리킨다.
도 8은 E3A126 내 식물의 방어-관련 유전자의 발현(도 8a) 및 E3A126의 스트레스 내성에 대한 신호 전달 경로(도 8b)를 제시한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험 재료 및 실험 방법

저온 스트레스 내성의 스크리닝 시험

총 320 가지의 E3 유비퀴틴 리가아제 유전자에 삽입된 T-DNA 삽입변이체 종자 15립(총 320×15=4800 개체)씩을 포장에서 분리 증식하여 유전자형을 결정하였다. 이로부터 320 유전자에 대한 T-DNA 동형접합체를 얻어내고 이들 동형접합체의 종자로부터 발아된 유식물을 사용하여 저온 스트레스 내성 벼를 스크리닝 하였다. 10일된 벼를 40시간 동안 저온 챔버(2℃, 빛 세기 70 μMm^-2sec^-1)에 두어 나타내는 생존율로 스크리닝하였다. 저온 스트레스 내성은 세번째 잎 및 네번째 잎의 시든 비율로부터 잎 생존율로 측정하였다. 저온 처리 후 회복시킨 다음, E3A126 및 동진 벼(야생형, 대조군)의 생중량 및 건조중량을 확인하였다. 56℃에서 24시간동안 건조한 후 건조중량을 확인하였다.

E3A126 유전자의 발현

10일된 묘목으로부터 총 RNA를 추출하고, 역전사 효소를 이용하여 cDNA를 합성하였다. RT-PCR 및 실-시간 PCR로 OsATL5의 발현을 확인하였다. RT-PCR에 사용된 프라이머는 다음과 같다:

OsATL5 정방향 프라이머, 5`-CCCAAGCTTGGGTCAATTCCTTGCAGCC-3`; 역방향 프라이머 5`-GGGGTACCCCATGTCGGATACAGCCTTG-3`; 유전자 발현을 보정하기 위해 사용된 유비퀴틴 및 액틴 유전자, UBI 정방향 프라이머, 5`-GACGGGGAAGACGATCACGCT-3`; 역방향 프라이머, 5`-GAGCCTACGCCTAAGCCTGCTG-3`; 액틴 정방향 프라이머 5`-CATGCTATC CCTCGTCTCGACCT-3`; 역방향 프라이머, 5`-CGCACTTCATGATGGAGTTGTAT-3`.

실-시간 PCR에 사용된 프라이머는 다음과 같다:

OsATL5 정방향 프라이머, 5`-CGTGGAGTCAGCAGCAGAGC -3`; 역방향 프라이머, 5`- ACAGCAAGACGCGGGTGACG-3`; 유전자 발현을 보정하기 위한 유비퀴틴 정방향 프라이머, 5`-CAGGACAAGGAG GGAATCCCGCC-3`; 역방향 프라이머, 5`-GATACCGCCACGGAGCCTGAG-3`.

인 비트로 E3 유비퀴틴 리가아제 활성 분석

인 비트로 자가 유비퀴틴화를 위해, OsATL5의 전장 CDS를 pMAL C2 벡터(New England Biolabs)에 삽입하였다. MBP-OsATL5 및 MBP-OsATL5^H153A 재조합 단백질을 E. coli BL21에서 발현하였다. 아밀로즈 레진(New England Biolabs)을 사용하여, 재조합 단백질을 정제하였다. 각 재조합 단백질 500 ng을 유비퀴틴 E1(Arabidopsis His-UBA1) 및 E2(Arabidopsis His-UBC8)과 1시간동안 30℃에서 항온반응하였다. 공지된 방법에 따라 유비퀴틴화 반응을 실시하였다(Rye et al., 2011). 항-MBP 항체로 단백질 면역 블롯 분석을 실시하였다.

비생물적 스트레스 내성에 대한 E3A126 계통의 분석

염 및 건조 내성 시험을 위해 10일된 동형의 형질전환 벼를 사용하였다. 250 mM NaCl을 10일된 벼에 48시간동안 처리하여 염 스트레스를 주었다. 10일된 벼에 36시간동안 물을 공급하지 않음으로 건조 스트레스를 주었다. 세번째 및 네번째 잎의 생존율을 비교하여 스트레스 내성을 확인하였다. 건조 및 염 스트레스 후 회복한 E3A126 계통 및 동진 벼의 생중량 및 건조중량을 확인하였다.

OsATL5 의 세포 내 위치

E3A126 코팅 부분을 정지 코돈 없이 두 프라이머(5’- CCCGGGATGTCGGATACAGC-3’ 및 5’- ACTAGTATTCCTTGCAGCCTCGC -3’, 밑줄은 제한효소 부위)를 이용하여 증폭하였다. 증폭된 분절을 SmaⅠ 및 SpeⅠ으로 제한효소 처리하고, OsATL5:sGFP 재조합 분자를 생성하기 위해 pGA3452 벡터에 삽입하였다(Kim et al., 2009). AtBiP와 융합된 mRFP로 구성된 벡터는 이전에 보고되었다(Kim et al., 2001). 다음의 방법으로 옥수수 잎살 세포로부터 원형질체을 제조하였다:

발아 7일된 묘목의 잎을 면도날로 잘라 1.5% 셀룰로오스 RS 및 0.3% 마세로자임(macerozyme)을 포함하는 세포벽-소화 효소 용액으로 상온에서 4시간동안 교반(75 rpm)하며 반응시켰다(Moonet al. 2008). 양파 세포에서 일시적인 발현을 위해 biolistic 입자 전달 시스템(PDS-1,000, Dupont)을 통해 각 플라스미드 DNA 약 2 ㎍/발사로 코팅된 금 비드를 0.4 ㎎/발사 및 1100 psi 압력의 한도로 표피에 충격을 주었다. 원형질체 및 양파 표피 세포를 올림푸스 현미경 BX61(올림푸스, http://www.olympus.com)으로 관찰하였다.

계통 발생적 분석

Clustal W로 단백질 서열의 얼라인을 실시하고, 근린결합법(neighbor joining method, Saitou and Nei, 1987) 및 MEGA 4.0 프로그램(Tamura et al., 2007)을 이용하여 분석을 수행하였다.

OsATL5 의 RT - PCR 분석에 사용된 프라이머

실험 결과

E3A126 의 개선된 저온 스트레스 내성의 확인

저온 스트레스 내성에 대한 E3 유비퀴틴 리가아제(E3UL) 유전자의 T-DNA 태깅 계통을 스크리닝 하였다. E3UL T-DNA 동형의 320 계통 가운데, 개선된 저온 스트레스 내성을 갖는 E3A126 계통을 최종적으로 선별하였다. E3A126 계통은 잎 시듬(leaf wiling)에 의해 판단한 결과, 야생형과 비교하여 증가된 생존율을 보여주었다(도 1a). 또한, 저온 스트레스 후 회복한 계통의 생중량 및 건조중량을 측정하여 저온 내성을 평가하였다. E3A126 계통 묘목의 생중량 및 건조중량은 각각 171 ㎎ 및 51 ㎎인 반면, 야생형의 생중량 및 건조중량은 각각 130 ㎎ 및 41 ㎎이였다(도 1b). E3A126의 생중량 및 건조중량의 평균은 야생형보다 높게 나타났다(도 2b). E3A126 계통을 대상으로 건조 스트레스 및 염 스트레스 내성 시험을 실시하였다. E1A126 계통은 건조 스트레스 처리 후 56.4% 생존율을 나타낸 반면, 야생형은 40.0%의 생존율을 나타내었다. 염 스트레스 내성 시험 결과, E3A126 계통 및 야생형 사이의 유의한 차이점이 발견되지 않았다.

E3A126 계통의 분자적 특징

E1A126 계통 내 T-DNA 태깅 부위를 확인하기 위해, 역 PCR을 실시하였다. 최종적으로 단일 밴드을 증폭하고 시퀀싱하였다. DNA 서열 분석 결과는 T-DNA가 추정 RING 핑거 도메인을 포함하는 E3 유비퀴틴 리가아제 유전자인 OsATL5의 3'UTR의 237 bp 다운스트림(downstream)에 삽입됨을 보여주었다(도 3a). E3A126 계통에서 OsATL5는 야생형과 비교하여 높게 발현되었다(도 3b). 실-시간 PCR에 의한 정량적 PCR을 통해 E3A126 계통의 OsATL5의 발현이 야생형보다 8배 이상 높은 것을 확인하였고 이는 OsATL5가 활성화된 것을 의미한다.

OsATL5 의 발현 분석

E3A126 계통은 개선된 스트레스 내성을 나타내므로, OsATL5 유전자가 스트레스에 의해 유도되는지 조사하였다. 저온 스트레스 및 ABA 처리에 의해 OsATL5 전사체의 발현 정도가 증가되며, 12시간에 최대치에 이르는 것을 역-전사효소 PCR 실험을 통해 확인하였다(도 4a). 반면, 염 또는 건조 스트레스의 처리는 유전자 발현에 영향을 미치지 못했다. 다양한 조직 내에서 다른 발생단계의 OsATL5의 발현 패턴을 측정하였다. 3 ㎝에서 8 ㎝ 길이로의 발생단계의 이삭(panicle)에서 전사체의 고발현이 확인되었다(도 4b). 그러나, 최상위 절간(internode) 및 1-2 ㎝의 어린 이삭에서는 거의 검출되지 않았다.

E3 유비퀴틴 라이가제를 코딩하는 OsATL5

RING 도메인-함유 단백질은 E3 유비퀴틴 리가아제처럼 기능하는 것이 보고되었다(Azevedo et al., 2001; Gao T et al., 2011; Mudgil et al., 2004; Ryu et al., 2010). OsATL5는 C-말단에 징크 핑거-H2-형 RING 도메인을 갖기 때문에, OsATL5가 E3 리가아제로서 기능할 것이라고 추측하였다. E3A126이 E3 리가아제로 기능하는지 조사하기 위해, 인 비트로 자가-유비퀴틴화 분석을 실시하였다. OsATL5를 MBP를 갖는 E.coli에서 발현하고 재조합 OsATL5를 정제하였다. MBP-OsATL5 단백질을 ATP, E1(AtUBA1), B2(AtUBC8) 및 유비퀴틴과 30℃에서 반응시켰다. 항-MBP 항체로 고분자 질량 래더(ladder)를 검출하였다(도 4). 반면, RING 도메인 내 히스티딘 잔기에 포인트 돌연변이를 갖는 MBP-E3A126^H153A는 어떠한 분자량 변화를 나타내지 않았다. 따라서, 이러한 결과는 E3A126이 인 비트로 E3 유비퀴틴 리가아제 활성을 가짐을 의미한다.

ER 에 위치하는 OsATL5 단백질

OsATL5 단백질의 세포 내 위치를 구하기 위해, 형광 마커로 sGFP-태깅된 OsATL5을 제조하였다. sGFP 유전자를 Ubi 프로모터의 조절 하에 OsATL5의 3’말단 인-프래임에 재조합하였다. 재조합 단백질의 위치는 올림푸스 현미경 BX61을 사용하여 가시화하였다. 도 6에서 확인할 수 있듯이, OsATL5와 관련된 형광은 ER(Endoplasmic reticulum) 막에 위치하였다.

OsATL5 의 계통발생적 분석

OsATL5의 세포내 기능을 구하기 위해, 아라비돕시스(arabidopsis) 및 벼의 높은 상동성을 갖는 유전자를 계통분석하였다. 그 결과, 아라비돕시스의 ATL41(AT2G42360)은 OsATL5와 밀접하게 관련이 있었다(도 6a). OsATL5는 ATL41과 41% 아미도산 일치를 나타내었다(도 6b). ATL41은 ATL(Arabidopsis Toxicos en Levadura) 패밀리로, E3 리가아제의 하나의 군으로 정의되며, N-말단 부위, GLD 부위 및 RING-H2 도메인에 막통과 도메인을 갖는다. OsATL5(Os01g11520)는 ATL 패밀리의 정의에 부합하여 Serrano et al.(2006)이 OsATL5라고 명명하였다(도 6b).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> SOGANG UNIVERSITY RESEARCH FOUNDATION <120> Abiotic Stress-Inducible OsATL5 Gene, Protein and Mutant Enhancing Tolerance to Environment <130> PN130611 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 714 <212> DNA <213> CDS for OsATL5 <400> 1 atgtcggata cagccttgtc gggcgcgccg ccggcggcga ggtcggagga ttcgtggagt 60 cagcagcaga gctacaactt cagcgggcgc gtgctgctca cggccgtcgt gatcctgttc 120 gtgatcgccg tcgtcttcgc cgtcacccgc gtcttgctgt actacctcgt ggtgcggccc 180 ggcggtggcg gcggaggccg tcgtcgtggc ggcctggcag gggggatctt gcggtcgttg 240 aactcgctcg gcgtgagcgg tcgccgcggg ctggacgcgt ccgcgctcgc cgcgctgccg 300 gtcaccgcgt accggaagaa cggcggcggg ggcggtggtg gggagggctc caaccgcggc 360 gggcctggcg ccaccgccgc cgactgcgcc gtgtgtctgt cggagctcgc cgacggcgag 420 aaggtgcggg agctgcccaa ctgccggcac gtcttccacg tggagtgcgt cgacgcgtgg 480 ctgcgctcca ggaccacgtg cccgctctgc cgggccgagg cggaagtacc caaggcgagg 540 gcttcggcgg cggcgacggc gacggcgcag tcgtcgtcgt cgctcggtga cggaggaatt 600 accgtggtcg tgaccataca cggcggctct gacgaagccg gtggcaggtc aacggcgttg 660 actggtcaac cgggatcctc gaactctcct agctgcgagg ctgcaaggaa ttga 714 <210> 2 <211> 237 <212> PRT <213> Protein for OsATL5 <400> 2 Met Ser Asp Thr Ala Leu Ser Gly Ala Pro Pro Ala Ala Arg Ser Glu 1 5 10 15 Asp Ser Trp Ser Gln Gln Gln Ser Tyr Asn Phe Ser Gly Arg Val Leu 20 25 30 Leu Thr Ala Val Val Ile Leu Phe Val Ile Ala Val Val Phe Ala Val 35 40 45 Thr Arg Val Leu Leu Tyr Tyr Leu Val Val Arg Pro Gly Gly Gly Gly 50 55 60 Gly Gly Arg Arg Arg Gly Gly Leu Ala Gly Gly Ile Leu Arg Ser Leu 65 70 75 80 Asn Ser Leu Gly Val Ser Gly Arg Arg Gly Leu Asp Ala Ser Ala Leu 85 90 95 Ala Ala Leu Pro Val Thr Ala Tyr Arg Lys Asn Gly Gly Gly Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Glu Gly Ser Asn Arg Gly Gly Pro Gly Ala Thr Ala Ala Asp 115 120 125 Cys Ala Val Cys Leu Ser Glu Leu Ala Asp Gly Glu Lys Val Arg Glu 130 135 140 Leu Pro Asn Cys Arg His Val Phe His Val Glu Cys Val Asp Ala Trp 145 150 155 160 Leu Arg Ser Arg Thr Thr Cys Pro Leu Cys Arg Ala Glu Ala Glu Val 165 170 175 Pro Lys Ala Arg Ala Ser Ala Ala Ala Thr Ala Thr Ala Gln Ser Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Asp Gly Gly Ile Thr Val Val Val Thr Ile His Gly 195 200 205 Gly Ser Asp Glu Ala Gly Gly Arg Ser Thr Ala Leu Thr Gly Gln Pro 210 215 220 Gly Ser Ser Asn Ser Pro Ser Cys Glu Ala Ala Arg Asn 225 230 235 <210> 3 <211> 1242 <212> DNA <213> Genome sequence for OsATL5 <400> 3 ggcagacaga gaccggacga ccattctcga ggctaaaaac gtctaacgtt gaacaaagca 60 aagcaagtaa ttgccatgta cagatgtact cgttggtgat gacagtgacg gaatccccat 120 gttgacctgc tcgtctacta acccaaggtt agcttatccg gtgttgatta aaccggcggc 180 gaggtagtag tagtagtagg gctttgctct ggtcttgcaa gttaggttag tgattagtag 240 cagcagaaag agtggaagat ttagaggata agggatagtt tggtcatgtc ggatacagcc 300 ttgtcgggcg cgccgccggc ggcgaggtcg gaggattcgt ggagtcagca gcagagctac 360 aacttcagcg ggcgcgtgct gctcacggcc gtcgtgatcc tgttcgtgat cgccgtcgtc 420 ttcgccgtca cccgcgtctt gctgtactac ctcgtggtgc ggcccggcgg tggcggcgga 480 ggccgtcgtc gtggcggcct ggcagggggg atcttgcggt cgttgaactc gctcggcgtg 540 agcggtcgcc gcgggctgga cgcgtccgcg ctcgccgcgc tgccggtcac cgcgtaccgg 600 aagaacggcg gcgggggcgg tggtggggag ggctccaacc gcggcgggcc tggcgccacc 660 gccgccgact gcgccgtgtg tctgtcggag ctcgccgacg gcgagaaggt gcgggagctg 720 cccaactgcc ggcacgtctt ccacgtggag tgcgtcgacg cgtggctgcg ctccaggacc 780 acgtgcccgc tctgccgggc cgaggcggaa gtacccaagg cgagggcttc ggcggcggcg 840 acggcgacgg cgcagtcgtc gtcgtcgctc ggtgacggag gaattaccgt ggtcgtgacc 900 atacacggcg gctctgacga agccggtggc aggtcaacgg cgttgactgg tcaaccggga 960 tcctcgaact ctcctagctg cgaggctgca aggaattgag gatcgacgat gacgacgaac 1020 ttcagagttg tgatgtgatt ctttattttg ctataggagc tctatcaagt gtagattgtg 1080 aaacgcattt gtgatgtgat tctttatttc tttcccatat atagctaaga aacaactgca 1140 taatacattc cccgcaaaag aaaaaaaagc aaaagtaaag tgcttctgtg gtaattgtta 1200 cgagttttgt tccattgaat atagtcaaga cgattgcata gc 1242

Claims (11)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 서열목록 제 2 서열의 아미노산 서열을 포함하며 식물체에서 과발현되는 경우 상기 식물체에 건조 스트레스 또는 저온 스트레스에 대한 내성을 증진시키는 비생물 스트레스-유도성 OsATL5 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터.
   
7. 제 6 항의 벡터에 의해 형질전환된 형질전환 식물체.
   
8. 다음의 단계를 포함하는 건조 스트레스 또는 저온 스트레스 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법:
   (a) 식물 세포 또는 식물 조직을 상기 제 6 항의 벡터로 형질전환하는 단계;
   (b) 형질전환된 식물세포 또는 식물조직을 선별하는 단계; 및
   (c) 상기 형질전환된 식물세포 또는 식물조직으로부터 식물체를 재분화시켜 형질전환 식물체를 수득하는 단계.
   
9. 제 8 항에서 있어서, 상기 식물체는 벼, 보리, 밀 또는 옥수수인 것을 특징으로 하는 제조방법.
   
10. 제 8 항 또는 제 9 항의 제조방법에 의해 제조된 건조 스트레스 또는 저온 스트레스에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체.
11. 삭제

Images