EA010501B1 - Конъюгаты гидроксиалкилкрахмала и белка, полученные восстановительным аминированием - Google Patents

Конъюгаты гидроксиалкилкрахмала и белка, полученные восстановительным аминированием Download PDF

Info

Publication number
EA010501B1
EA010501B1 EA200601672A EA200601672A EA010501B1 EA 010501 B1 EA010501 B1 EA 010501B1 EA 200601672 A EA200601672 A EA 200601672A EA 200601672 A EA200601672 A EA 200601672A EA 010501 B1 EA010501 B1 EA 010501B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
group
polymer
protein
conjugate
groups
Prior art date
Application number
EA200601672A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200601672A1 (ru
Inventor
Норберт Цандер
Вольфрам Айхнер
Харальд Конрадт
Франк Хаккет
Клаус Лангер
Микеле Орландо
Рональд Франк
Original Assignee
Фрезениус Каби Дойчланд Гмбх
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Фрезениус Каби Дойчланд Гмбх filed Critical Фрезениус Каби Дойчланд Гмбх
Publication of EA200601672A1 publication Critical patent/EA200601672A1/ru
Publication of EA010501B1 publication Critical patent/EA010501B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1816—Erythropoietin [EPO]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/193—Colony stimulating factors [CSF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2013—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/202—IL-3
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/212—IFN-alpha
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/215—IFN-beta
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • A61K38/37—Factors VIII
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/41—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • A61K38/42—Haemoglobins; Myoglobins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/44—Oxidoreductases (1)
    • A61K38/446—Superoxide dismutase (1.15)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • A61K38/4846—Factor VII (3.4.21.21); Factor IX (3.4.21.22); Factor Xa (3.4.21.6); Factor XI (3.4.21.27); Factor XII (3.4.21.38)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • A61K38/4866—Protein C (3.4.21.69)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/55—Protease inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/06—Macromolecular compounds, carriers being organic macromolecular compounds, i.e. organic oligomeric, polymeric, dendrimeric molecules
    • A61K51/065—Macromolecular compounds, carriers being organic macromolecular compounds, i.e. organic oligomeric, polymeric, dendrimeric molecules conjugates with carriers being macromolecules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P41/00—Drugs used in surgical methods, e.g. surgery adjuvants for preventing adhesion or for vitreum substitution
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B31/00—Preparation of derivatives of starch
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B31/00—Preparation of derivatives of starch
    • C08B31/003—Crosslinking of starch
    • C08B31/006—Crosslinking of derivatives of starch
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B31/00—Preparation of derivatives of starch
    • C08B31/08—Ethers
    • C08B31/12—Ethers having alkyl or cycloalkyl radicals substituted by heteroatoms, e.g. hydroxyalkyl or carboxyalkyl starch
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B31/00—Preparation of derivatives of starch
    • C08B31/18—Oxidised starch
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B31/00—Preparation of derivatives of starch
    • C08B31/18—Oxidised starch
    • C08B31/185—Derivatives of oxidised starch, e.g. crosslinked oxidised starch

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к конъюгатам гидроксиалкилкрахмала, предпочтительно гидроксиэтилкрахмала, и белка, где данные конъюгаты образуются при реакции восстановительного аминирования между по меньшей мере одной альдегидной группой или кетогруппой, или группой полуацеталя гидроксиалкилкрахмала или производного гидроксиалкилкрахмала и по меньшей мере одной аминогруппой белка таким образом, что гидроксиалкилкрахмал или его производное являются ковалентно связанными с белком посредством азометиновой связи или аминной связи. Настоящее изобретение также относится к способу получения данных конъюгатов и конкретному применению конъюгатов.

Description

Настоящее изобретение относится к конъюгатам гидроксиалкилкрахмала, предпочтительно гидроксиэтилкрахмала, и белка, где данные конъюгаты образованы реакцией восстановительного аминирования между по меньшей мере одной альдегидной группой гидроксиалкилкрахмала или производного гидроксиалкилкрахмала и по меньшей мере одной аминогруппой белка, таким образом, что гидроксиалкилкрахмал или его производное являются ковалентно связанными с белком посредством азометиновой связи или аминометиленовой связи. Настоящее изобретение также относится к способу получения данных конъюгатов и к определенным применениям конъюгатов.
Общепринято, что стабильность белков может быть улучшена, а иммунный ответ на данные белки снижен, когда данные белки связаны с полимерными молекулами. В νθ 94/28024 описано, что физиологически активные белки, модифицированные полиэтиленгликолем (ПЭГ) проявляют пониженную иммуногенность и антигенность, а также циркулируют в системе кровообращения существенно дольше, чем неконъюгированные белки, т. е. имеют более длинный период полураспада в плазме крови.
\УО 03/074087 относится к способу связывания белков с модифицированными полисахаридами, являющимися производными крахмала. Связывание между белком и полисахаридом, гидроксиалкилкрахмалом, осуществляется посредством ковалентной связи, которая образуется между концевой альдегидной группой или функциональной группой, образующейся в результате химической модификации указанной концевой альдегидной группы молекулы гидроксиалкилкрахмала, и функциональной группой белка. В качестве реакционноспособной группы белка рассматриваются аминогруппы, тиогруппы и карбоксильные группы. Более того, хотя в виде многочисленных списков приведено широкое множество возможностей различных связей, включающих различные функциональные группы, теоретически подходящие разнообразные линкерные молекулы и различные химические способы, в действующих примерах описаны только две альтернативы:
во-первых, используется окисленный гидроксиэтилкрахмал, который связывают непосредственно с белками с использованием активации с помощью этилдиметиламинопропилкарбодиимида (БОС), или используется не окисленный гидроксиэтилкрахмал, который связывается непосредственно, т.е. в отсутствие связывающего соединения, с белком с образованием основания Шиффа, которое впоследствии восстанавливают до соответствующего амина. Таким образом, в иллюстративных примерах XVО 03/074087 не описан единственный конъюгат, включающий гидроксиэтилкрахмал, белок и одну или несколько линкерных молекул. Кроме того, поскольку рассматриваются конъюгаты, образованные при восстановительном аминировании, в νθ 03/074087 не содержится какой-либо информации, касающейся предпочтительной аминогруппы белка, для которой проводится восстановительное аминирование.
Следовательно, задача настоящего изобретения заключалась в разработке нового конъюгата гидроксиалкилкрахмала, предпочтительно гидроксиэтилкрахмала, и белка, где конъюгат обладал бы выигрышным терапевтическим действием при введении нуждающемуся в этом субъекту.
Следующая задача настоящего изобретения заключается в разработке нового конъюгата гидроксиалкилкрахмала, предпочтительно гидроксиэтилкрахмала, и белка, который образуется посредством восстановительного аминирования при взаимодействии аминогруппы олигопептида или полипептида, содержащего альдегидную группу, или кетогруппу, или группу полуацеталя гидроксиалкилкрахмала, предпочтительно гидроксиэтилкрахмала, или его производного, функционализированного альдегидными группами.
Еще одна задача настоящего изобретения заключается в разработке способа получения указанного нового конъюгата, где указанный способ применяется с использованием специфических и селективных условий реакции.
Таким образом, настоящее изобретение относится к способу получения конъюгата, включающего белок и полимер или производное полимера, где полимер представляет собой гидроксиалкилкрахмал, где указанный способ включает ковалентное связывание по меньшей мере одной альдегидной группы или кетогруппы, или группы полуацеталя полимера или производного полимера с по меньшей мере одной аминогруппой белка путем восстановительного аминирования; указанный способ дополнительно включает введение по меньшей мере двух альдегидных групп в полимер путем реакции окисления с раскрытием цикла, и взаимодействие по меньшей мере одной из указанных альдегидных групп полимера с аминогруппой белка или взаимодействие полимера с по меньшей мере бифункциональным соединением, где указанное соединение включает две функциональные группы М и О. при этом одна функциональная группа М взаимодействует с полимером, и одну функциональную группу О модифицируют химически с получением производного полимера, функционализированного альдегидной группой или кетогруппой, или группой полуацеталя, которая взаимодействует с аминогруппой белка при восстановительном аминировании.
Соответственно, настоящее изобретение также относится к конъюгату, включающему белок и полимер или производное полимера, где полимер представляет собой гидроксиалкилкрахмал, который может быть получен с использованием способа получения конъюгата, где указанный способ включает ковалентное связывание по меньшей мере одной альдегидной группы или кетогруппы, или группы полуацеталя полимера или производного полимера по меньшей мере с одной аминогруппой белка путем восстановительного аминирования; указанный способ дополнительно включает введение по меньшей мере
- 1 010501 двух альдегидных групп в полимер путем реакции окисления с раскрытием цикла, и взаимодействие по меньшей мере одной из указанных альдегидных групп полимера с аминогруппой белка или взаимодействие полимера по меньшей мере с бифункциональным соединением, где указанное соединение включает две функциональные группы М и О. при этом одна функциональная группа М взаимодействует с полимером, и одну функциональную группу О модифицируют химически с получением производного полимера, функционализированного альдегидной группой или кетогруппой, или группой полуацеталя, которая взаимодействует с аминогруппой белка при восстановительном аминировании.
Термин «белок», как он используется в контексте настоящего изобретения, относится к любой последовательности аминокислот, содержащей по меньшей мере 2, предпочтительно по меньшей мере 5, более предпочтительно по меньшей мере 10, более предпочтительно по меньшей мере 15, более предпочтительно по меньшей мере 20, более предпочтительно по меньшей мере 25, более предпочтительно по меньшей мере 30, более предпочтительно по меньшей мере 35, более предпочтительно по меньшей мере 40, более предпочтительно по меньшей мере 45, более предпочтительно по меньшей мере 50 и еще более предпочтительно по меньшей мере 100 аминокислот.
Белок может быть получен химическими синтетическими способами или получен из любого источника, относящегося к человеку или другому млекопитающему, или он может быть получен очисткой белка, полученного из природных источников.
В соответствии с настоящим изобретением белок может представлять собой фактор роста, цитокин, активатор, ингибитор, фермент, антитело, антиген, транспортный белок, биоадгезивный белок, гормон, рецептор, суппрессор, или его функциональное производное или фрагмент. Термин «функциональное производное или фрагмент», как он использован в контексте настоящего изобретения, относится к производному или фрагменту, который полностью или частично сохраняет желаемое биологическое свойство или активность первоначальной молекулы, например, по меньшей мере на 10%, более предпочтительно по меньшей мере на 20%, более предпочтительно по меньшей мере на 30%, более предпочтительно по меньшей мере на 40%, более предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно по меньшей мере на 60%, более предпочтительно по меньшей мере на 70%, более предпочтительно по меньшей мере на 80% и особенно предпочтительно по меньшей мере на 90% относительно желаемого биологического свойства или активности первоначальной молекулы. Особенно предпочтительными примерами таких фрагментов являются, например, фрагменты антител.
Примерами белков являются эритропоэтин (ЕРО), такой как рекомбинантный ЕРО человека (тйЕРО), колониестимулирующие факторы (С8Е), такие как О-С8Е, например, рекомбинантный О-С8Е (ТЙО-С8Е) человека, альфа-интерферон (ΙΕΝ альфа), бета-интерферон (ΙΕΝ бета) или гамма-интерферон (ΙΕΝ гамма), такие как ΙΕΝ альфа и ΙΕΝ бета, например, рекомбинантные ΙΕΝ альфа и ΙΕΝ бета человека (τΜΕΝ альфа или τΜΕΝ бета), интерлейкины, например, от 1Ь-1 до ΙΟ-18, такие как 1Ь-2 или 1Ь-3, как, например, рекомбинантные 1Ь-2 или 1Ь-3 человека (тЫЬ-2 или тЫЬ-3), белки сыворотки крови, такие как факторы коагуляции П-ХШ, такие как факторы VII, УШ, IX, альфа1-антитрипсин (А1АТ), активированный белок С (АРС), плазминогенные активаторы, такие как плазминогенный активатор тканевого типа (1РА), такой как плазминогенный активатор тканей человека (ЙТРА), АТ III, такой как рекомбинантный АТ III человека (ЛАТ III), миоглобин, альбумин, такой как альбумин бычьей сыворотки (В8А), факторы роста, такие как эпидермальный фактор роста (ЕОЕ), фактор роста тромбоцитов (ΡΌΟΕ), фактор роста фибробластов (ЕОЕ), фактор роста мозгового происхождения (ΒΌΟΕ), фактор роста нервов (ΝΟΕ), фактор роста В-клеток (ВСОЕ), нейротропический фактор роста мозгового происхождения (ΒΌΝΤ), мерцательный-нейротрофический фактор (СИТЕ), трансформирующие факторы роста, такие как ТОЕ альфа или ТОЕ бета, ВМР (костные морфогенные белки), гормоны роста, такие как гормон роста человека, факторы некроза опухолей, такие как ТКЕ альфа или ТКЕ бета, соматостатин, соматотропин, соматомедины, гемоглобин, гормоны или прогормоны, такие как инсулин, гонадотропин, меланоцитстимулирующий гормон (альфа-М8Н), трипторелин, гипоталамические гормоны, такие как антидиуретические гормоны (АЭН и окситоцин, а также высвобождающие гормоны и ингибирующие высвобождение гормоны), паратироидный гормон, тироидные гормоны, такие как тироксин, тиротропин, тиролиберин, пролактин, кальцитонин, глюкагон, глюкагоно-подобные пептиды (ОЬР-1, ОЬР-2 и т.д.), эксендины, такие как эксендин-4, лептин, вазопрессин, гастрин, секретин, интегрины, глюкопротеиновые гормоны (например, ЬН, Е8Н и т.д.), меланозид-стимулирующие гормоны, липобелки и апо-липобелки, такие как апо-В, апо-Е, аио-О, иммуноглобулины, такие как ЦС, ЦЕ, ЦМ, !дО и их фрагменты, гирудин, ингибитор тканевого пути, растительные белки, такие как лектин и рицин, пчелиный яд, змеиный яд, иммунотоксины, антиген Е, ингибитор альфа-протеиназы, аллерген амброзии, меланин, олиголизиновые белки, белки Κ.ΟΌ или необязательно соответствующие рецепторы для одного из данных белков; или функциональные производные или фрагмент любого из данных белков или рецепторов.
Предпочтительными ферментами являются, например, углевод-специфические ферменты, протеолитические ферменты, оксидазы, оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, киназы и лигазы. Конкретными неорганичивающими примерами являются аспарагиназа, аргиназа, аргининдеаминаза, аденозиндеаминаза, глутаминаза, глутаминаза-аспарагиназа, фенилаланин, триптофаназа, тирозиназа, супероксиддисмутаза (8ΟΌ), эндотоксиназа, каталаза, пероксидаза, калликреин, трипсин, химотрип
- 2 010501 син, эластаза, термолизин, липаза, уриказа, аденозиндифосфотаза, пуриннуклеозидфосфорилаза, билирубиноксидаза, глюкозооксидаза, глюкоза, глюконатоксидаза, галактозидаза, глюкоцереброзидаза, глюкуронидаза, гиалуронидаза, тканевый фактор, стрептокиназа, урокиназа, МАР-киназы, ДНКазы, РНКазы, лактоферрин и их функциональные производные или фрагменты.
В соответствии с предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения белок выбирают из группы, состоящей из ЕРО, С-С8Е, ΙΕΝ альфа, ΙΕΝ бета, ΑΤΙΙΙ, 1Ь-2, 1Ь-3, миоглобина, 8ΘΌ, Α1ΑΤ и Β8Α.
В соответствии с особенно предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения белок выбирают из группы, состоящей из гЬЕРО. гйС-С8Е, 1Ί1ΙΕΝ альфа, 1Ί1ΙΕΝ бета, ιΊιΑΤ ΙΙΙ, гЫЬ-2, гЫЬ-3, миоглобина, 8ΟΌ, Α1ΑΤ и Β8Α.
Эритропоэтин (ЕРО) представляет собой гликопротеиновый белок, необходимый для созревания эритроидных предшественников клеток в эритроциты. У взрослых людей он продуцируется в почках. ЕРО необходим для регулирования уровня красных кровяных клеток в системе кровообращения. Состояния, для которых характерны низкие уровни кислорода в тканях, вызывают повышенный биосинтез ЕРО, который в свою очередь стимулирует эритроцитопоэз. Утрата функции почек, как это, например, видно при хронической почечной недостаточности, обычно приводит к сниженному биосинтезу ЕРО и сопутствующему снижению числа красных кровяных клеток. Эритропоэтин представляет собой кислый гликопротеиновый гормон массой приблизительно 34000 Да. Эритропоэтин человека представляет собой полипептид из 166 аминокислот, который в природе существует в виде мономера (Ьт е! а1., 1985, ΡΝΑ882, 7580-7584, ЕР 148 605 В2, ЕР 411 678 В2). Идентификация, клонирование и экспрессия генов, кодирующих эритропоэтин, описаны, например, в патенте США 4703008. Очистка рекомбинантного эритропоэтина от клеточной культуральной среды, которая поддерживает рост клеток млекопитающих, содержащих рекомбинантные плазмиды эритропоэтина, описана, например, в патенте США 4667016. В данной области техники обычно полагают, что биологическая активность ЕРО ίη νίνο главным образом зависит от степени связывания сиалиловых кислот с ЕРО (см., например, ЕР 428267В1). Теоретически, 14 молекул сиалиловой кислоты может связываться с одной молекулой ЕРО по терминальным концам углеводных боковых цепей, связанных с Ν- и О-сайтами гликозирования. Для получения высоко сиалилированных препаратов ЕРО необходимы высоко усовершенствованные стадии очистки. Подробную дополнительную информацию, касающуюся эритропоэтина, смотри в публикациях Кгапй, Егу1йгоро1е11п, 1991, В1ооб, 77 (3): 419-34 (обзор) и Сегат1, Веуопб егу1йгоро1ек1к: ηονе1 аррЬсайопк Гог гесотЬтап! йитап егу1йгоро1е11п, 2001, 8етт Нета!о1., (3 8ирр1 7): 33-9 (обзор).
С-С8Е представляет собой гликопротеин в 21 кДа, стабилизированный двумя внутрицепочечными дисульфидными связями и содержащий единственный О-связанный углеводный фрагмент. Зрелый СС8Е содержит 174 аминокислоты. В организме животного С-С8Е синтезируется стромальными клетками костного мозга, макрофагами и фибробластами. Его основная функция заключается в том, что он является фактором роста и дифференциации для нейтрофилов и их клеток предшественников. Однако в данной области также известно, что С-С8Е активирует зрелые нейтрофилы. Кроме того, он стимулирует рост/дифференциацию других различных гемопоэтических клеток-предшественников (совместно с дополнительными гемопоэтическими факторами роста) и промотирует пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток. Клинически С-С8Е вводят для лечения дефектов на уровне нейтрофилов (вызываемых, например, апластической анемией, миелодисплазией, СПИДом или химиотерапией).
С-С8Е можно получать химическими методами синтеза или происходить из любого человеческого источника (см., например, Вигдекк, Α. V. е! а1. 1977, 8йти1а1юп Ьу йитап р1асеп1а1 сопбйюпеб тебшт οί йеторо1ейс со1опу йгтайоп Ьу йитап таггоч се11к, В1ооб 49 (1977), 573-583; 8йа11, В. С. е! а1. 1977, СйагасЮпхабоп οί со1опу-кбтпкШпд асбуйу ргобисеб Ьу йитап топосуЮк апб рйу1ойетадд1и!тт-кйти1а!еб 1утрйосу!ек, В1ооб 50 (1977), 811) или иметь происхождение от других млекопитающих и может быть получен очисткой из таких природных источников как плацента человека, человеческая кровь или человеческая моча. Кроме того, множество эпителиальных карцином, клетки острой миелоидной лейкемии и различные опухолевые линии клеток (карциномы мочевого пузыря, меддулобластомы) способны экспрессировать данный фактор.
Кроме того, экспрессия С-С8Е включает также вариант С-С8Е, в котором одна или более аминокислот (например, от 1 до 25, предпочтительно от 1 до 10, более предпочтительно от 1 до 5, наиболее предпочтительно 1 или 2) были заменены на другие аминокислоты, и который проявляет активность СС8Е (см., например, Ктебйааг-О1коп, ί. Е. е! а1., 1996, Иепййсайоп οί гек1биек сгШса1 ίο 1йе асбуйу οί йитап дгапи1осу!е со1опу-кйти1айпд фактор, Вюсйет1к!гу 35: 9034-9041 1996; патенты США №№ 5581476; 5214132; 5362853; 4904584). В данной области описано измерение активности С-С8Е (измерение активности С-С8Е 1п νίίτο смотри, например, 8ЫгаЬцр, Ν. е! а1., 1989, Α печ Ьюаккау ίοτ йитап дгапи1осу!е со1опу-кйти1а!шд ГасЮг (йС-С8Е) иктд тигте туе1оЬ1акйс ΝΕ8-60 се11к ак 1агде1к апб екбтабоп οί йк ^ек ш кега йот погта1 йеаЬйу регкопк апб райепГк чйЬ шВсДот апб 11ета1о1одюа1 бкогбегк, Ехр. Нета!о1. 1989, 17, 116-119; измерение активности С-С8Е т νίνο смотри, например, Τаηа1са, Н. е! а1., 1991, Рйагтасокшейск οί гесотЫпап! йитап дгапи1осу!е со1опу-кйти1айпд ГзсЮг соп)пда1еб ίο ро1уе!йу1епе д1усо1 т га!к, Сапсег Векеагсй 51, 3710-3714, 1991). Дополнительные публикации, касающиеся измерения активно
- 3 010501 сти С-С8Е приведены в патенте США Νο. 6555660; и №11упск. С. 1. е! а1.. 1997, Сотрапкоп οί 1ке ро!епсу οί д1усоку1а1ей апй попд1усоку1а1ей гесотЬшап! китап дгапи1осу1е со1опу-кйти1а!1пд ГасЮгк ίη пеийорешс апй поппеийорешс СО га1з, Сапсег Скето1йег Ркагтасо1 (1997) 39; 259-266.
Предпочтительно С-С8Е продуцируют рекомбинантным образом. Это включает экспрессию прокариотическими и эукариотическими клетками-хозяевами экзогенных последовательностей ДНК. полученных геномным или кДНК клонированием или путем синтеза ДНК. Подходящие прокариотические хозяева включают различные бактерии. такие как Е. сой. Подходящие эукариотические хозяева включают дрожжи. такие как 8. сегеуыае и клетки млекопитающих. такие как клетки яичников китайского хомячка и клетки обезьян.
Рекомбинантное продуцирование белка известно в технике. Обычно. он включает трансфекцию клеток-хозяев подходящим вектором экспрессии. культивирование клеток-хозяев в условиях. которые дают возможность продуцирования белка и очистку белка от клеток-хозяев. Подробная информация приведена в 8оиха. Ь. М. е! а1. 1986. КесотЫпап! китап дгапи1осу!е со1опу-кйти1а!1пд Гас!ог: еГГес1к оп погта1 апй 1еикет1с туе1о1й се11к. 8с1епсе 1986. 232: 61-65. 1986; №1да1а. 8. е!. а1.. 1986. Мо1еси1аг с1ошпд апй ехргеккюп оГ с^NΑ Гог китап дгапи1осу!е со1опу-кйти1айпд Гас!ог. №1Шге 319: 415-418. 1986; Кота!ки. Υ. е! а1.. 1987. С1ошпд оГ дгапи1осу!е со1опу-кйти1а!тд Гас!ог с^NΑ Ггот китап тасгоркадек апй 1!к ехргеккюп ш ЕкскейсЫа сой. 1рп 1 Сапсег Кек.1987. 78 (11): 1179-1181.
В предпочтительном варианте осуществления. С-С8Е имеет последовательность аминокислот зрелого С-С8Е человека (см.. например. №да!а. 8. е!. а1.. 1986. Мо1еси1аг с1ошпд апй ехргеккюп оГ с^NΑ Гог китап дгапи1осу!е со1опу-кйти1а!тд Гас!ог. №1Шге 319: 415-418. 1986). и может дополнительно содержать метионин в качестве аминного конца. что приводит к белку из 175 аминокислот. Кроме того. С-С8Е может содержать остаток серина или треонина вместо метионина.
С-С8Е. используемый в способах настоящего изобретения и конъюгаты согласно настоящему изобретению могут включать одну углеводную боковую цепь. присоединенную к С-С8Е посредством Огликозилирования в положение Ткг 133. т.е. С-С8Е является гликозилированным (V. Септик е! а1.. Еиг. 1. Вюскет.. 1997. 247. 386-395). Структура углеводной боковой цепи может быть NеиNΑс(альфа2-3) Са1(бета1-3) [NеиNΑс(альфа2-6)]Са1NΑс и (альфа2-3)Са1(бета1-3)СаШАс (NеиNΑс = Ν-ацетилнейраминовая кислота. СаШАс = Ν-ацетилгалактозамин).
Предлагались модификации С-С8Е и других полипептидов для того. чтобы ввести по меньшей мере одну дополнительную углеводную цепь по сравнению с природным полипетидом (патент США 5218092). В зависимости от используемого хозяина. продукт экспрессии С-С8Е может быть гликозилированным углеводами млекопитающих или других эукариотов. Обычно. когда С-С8Е продуцируется в эукариотических клетках. белок гликозилируют посттрансляционно. В результате. углеводная боковая цепь может быть присоединена к С-С8Е во время биосинтеза в клетках млекопитающих. особенно человека. насекомых или дрожжей.
Рекомбинантный С-С8Е человека (ткС-С8Е) обычно используется для лечения различных форм лейкопении. Таким образом. коммерческие препараты ткС-С8Е доступны под названиями филграстим (Сгап® и №иродеп®). ленограстим (№и1тодщ® и Сгапосу!е®) и нартограстим (№и-ир®). Сгап® и №иродеп® являются негликозилированными и продуцируются в рекомбинантных клетках СНО. и №и-ир© является негликозилированным и содержит пять замещающих аминокислот в Ν-концевой области целого ткС-С8Е. продуцируемого рекомбинантными клетками Е. сой.
Интерфероны представляют собой цитокины. которые опосредуют противовирусную. антипролиферативную и имммуномодулирующую активность в ответ на вирусную инфекцию и другие биологические индукторы. В противоположность ΙΕΝ альфа. ΙΕΝ бета является высоко специфическим в отношении различных разновидностей. Существует два подтипа ΙΕΝ бета. ΙΕΝ бета 1а и ΙΕΝ бета 1Ь. При промышленном получении основная разница между ΙΕΝ бета 1а и ΙΕΝ бета 1Ь заключается в соответствующих клеточных системах. используемых для их получения.
ΙΕΝ бета 1а получают с использованием клеток млекопитающих и получают обозначенный 1а поскольку его последовательность аминокислот идентична последовательности природно существующего интерферона бета. ΙΕΝ бета 1Ь получают с использованием бактерий. Интерфероны. как большинство других белков млекопитающих модифицируют посттрансляционно путем гликозилирования. Бактрии. однако. не обладают способностью гликозилировать белки. и поэтому ΙΕΝ бета 1Ь не включает углеводные боковые цепи. выявленные в природном материале. ΙΕΝ бета 1а содержит 166 аминокислот и имеет молекулярную массу примерно 22500 Да. ΙΕΝ бета 1Ь содержит 165 аминокислот и имеет молекулярную массу примерно 18500 Да. поскольку в нем отсутствуют Ν-концевой метионин и гликозилирование вследствие способа получения на основе бактерий. Последовательность аминокислот интерферона бета человека приведена. например. в ЕР 0218 825 А1. О кристаллической структуре интерферона бета сообщалось в публикациях: Ргос. ИаИ. Асай. 8с1. И8А 94 (1997) рр. 11813-11818. Вюскетщйу. Кагрикак М.. №11е М.. Веп!оп С.В.. Ме1ет ^.. ЫрксотЬ ^.Ν.. Сое1х 8. Коммерческими препаратами интерферона бета являются Ве!акегоп® (ΙΕΝ бета 1Ь). Ауопех® и КеЬ1Г® (ΙΕΝ бета 1а). Интерферон бета 1Ь производят путем бактериального ферментирования штамма Е. сок. который содержит генетически сконструиро
- 4 010501 ванную плазмиду, содержащую ген интерферона бета ке|-г человека. Природный ген был получен из фибробластов человека и изменен таким образом, чтобы он содержал остаток серина вместо остатка цистеина, найденного в положении 17. Интерферон бета 1а получают методами рекомбинантной ДНК технологии с использованием генетически сконструированных клеток яичника китайского хомячка (СНО), в которые был введен ген интерферона бета человека.
Последовательность аминокислот ΙΕΝ бета 1а идентична последовательности природного интерферона бета, полученного из фибробластов человека. Природный интерферон бета и интерферон бета 1а являются гликозилированными, где каждый из них содержит Ν-связанный сложный углеводный фрагмент у Акп80. Лекарственные средства интерферона бета предназначены для лечения возвратного ослабленного рассеянного склероза. Однако существует множество побочных действий, связанных с введением лекарственных продуктов интерферона бета. Кроме того, их вводят путем инъекции (внутримышечной или подкожно), что приводит к дополнительному риску. Сниженные побочные действия и более легкое (например, менее частое) введение являются причиной, почему проводится множество работ для усовершенствования свойств белков. Применяемый главным образом способ заключается в модификации интерферона полиэтиленгликолем, известный как ПЭГилирование.
Формы ΙΕΝ альфа в природе продуцируются моноцитами/макрофагами, лимфобластоидными клетками, фибробластами и рядом различных типов клеток после индукции вирусами, нуклеиновыми кислотами, глюкокортикоидными гормонами и другими индукторами. Известно по меньшей мере 23 различных варианта ΙΕΝ альфа. Индивидуальные белки имеют молекулярные массы между 19-26 кДа и состоят из белков длиной в 156-166 и 172 аминокислоты. Все подтипы ΙΡΝ альфа обладают общей консервативной областью последовательности между положениями аминокислот 115-151, тогда как концевые аминосодержащие фрагменты являются переменными. Множество подтипов ΙΡΝ альфа отличается в своих последовательностях только по одному или двум положениям. Дисульфидные мостики образуются между цистеинами в положениях 1/98 и 29/138. Дисульфидная связь 29/138 является незаменимой для биологической активности, тогда как связь 1/98 может быть восстановлена, не оказывая влияния на биологическую активность. Все формы ΙΡΝ альфа содержат потенциальный сайт гликозилирования, но большинство подтипов не являются гликозилированными. В противоположность ΙΡΝ гамма, белки ΙΡΝ альфа стабильны при рН 2.
Промышленное получение ΙΡΝ альфа проводят с использованием генетически модифицированной Е. сой. Поскольку бактерии не обладают способностью гликозилировать белок, два варианта ΙΕΝ альфа (ΙΕΝ альфа 2а, и ΙΕΝ альфа 2Ь), которые используются в разрешенных лекарственных продуктах, оба являются негликозированными. Основным недостатком коммерческого ΙΕΝ альфа являются побочные действия. По усовершенствованию лекарственных средств интерферона альфа, которые предназначены для лечения гепатита С, проводилась большая работа. Полимерная модификация белка представляет собой способ, который используется для улучшения свойств белка. Применяемый главным образом способ заключается в модификации интерферона полиэтиленгликолем, известный как ПЭГилирование. Два коммерчески доступных ПЭГилированых варианта ΙΕΝ альфа известны как ΡΕΟΙπΙγοπ® (8Р) и Редакук® (Росйе).
Антитромбин ΙΙΙ (АТ ΙΙΙ) представляет собой ингибитор серинтротеазы, который ингибирует тромбин и фактор Ха (Тгахчк, Аппи. Реу. Вюсйет. 52: 655, 1983). В меньшей степени он также ингибирует факторы БХа, ΧΙα, ХПа, 1РА, урокиназу, трипсин, плазмин и калликреин (Мепасйе, 8ет1п. Нета!о1. 28: 1, 1991; Мепасйе, ТгапкГикюп 32: 580, 1992; Байт, Агсй. Вюсйет. Вюрйук. 175: 737, 1976). АТ ΙΙΙ человека синтезируется в печени в виде одноцепочечного гликопротеина из 432 аминокислот с молекулярной массой приблизительно 58000 Да. Его концентрация в плазме крови находится в диапазоне 14-20 мг/дл (РокепЬегд, Реу. Нета!о1. 2: 351, 1986; Мигапо, ТйготЬ. Рек. 18: 259, 1 980). Белок содержит три дисульфидных мостика (Сук 8-128, Сук 21-95, Сук 247-430) и четыре Ν-связанных углеводных цепи (Акп 96,135,-155,-192), что составляет 15% от общей массы (Ега^еп, 1. Вю1. Сйет. 255: 5090, 1980; Ре!егкоп, Тйе Рйукю1од1са1 ИйиЬйюпк о£ В1оой Соади1а!юп апй Е1Ьгшо1ук1к, Е1кеу1ег/Ыог1й-Но11апй Вютейюа1 Ргекк 1979, р. 43). Антитромбин представляет собой ингибитор серинпротеазы серпинового типа, что является особенно важным для контроля за свертываемостью крови. АТ ΙΙΙ представляет собой эндогенный антикоагулянт, циркулирующий в плазме крови человека в наибольшей концентрации. Данный ингибитор серинпротеазы участвует в регуляции свертывания при физиологическом и патологическом состояниях (Ора1, Сгй. Саге Мей. 2002, 30: 325). Он циркулирует в двух формах с низкой способностью ингибирования тромбина (Р1ке, 1. Вю1. Сйет. 272: 19562, 1997; Егкйа1-Вайщ, Еей. Ргос. 44: 404, 1985) (85-95% альфа изоформы с 4 биантеннальными, моно- и дисиалилированными олигосахаридными цепями, 5-15% представляет собой бета-изоформу с высокой аффинностью к гепарину, не имеющую гликозилирования в Акп 135, 2-6 концевой связи сиалиловой кислоты). Небольшая фракция циркулирующего АТ ΙΙΙ обычным образом связывается с протеогликанами на поверхности эндотелиальных клеток сосудов. Данные протеогликаны главным образом представляют собой гепаран сульфат, молекулу, структурно подобную гепарину, которая способна катализировать ингибирование тромбина таким же образом, что и гепарин. Связывание АТ ΙΙΙ с хорошо определенными пентасахаридными звеньями гепарина вызывает конформационное изменение этого белка (Сйоау, Апп. ΝΥ Асай. 8сй 370: 644, 1981; Сйоау, Вюсйет. Вюрйук. Рек.
- 5 010501
Соттип. 116: 492, 1983; Окоп, 1. Βΐοΐ. Скет. 266: 6353, 1991; Ваиег, Бетт. Нета!о1. 28: 10, 1991; Саге11, ТкготЬ. Наеток!. 78: 516, 1997). Такое связывание катализирует 1000-кратное увеличение ингибирующей активности АТ III по отношению к тромбину и фактору Ха (ВокепЬетд, Реб.. Ргос. 44: 404, 1985; В_)отк, АпЙктотЫп апб ге1а!еб шкЬйотк о! соади1абоп рто!ешакек ίη Вате!!, 8а1уекеп (ебк.): Рто!ешаке 1пкЬйотк, уо1 17, АтЧегбат. Тке №!кет1апбк Е1кеу1ет 8с1епсе РиЫккетк (Вютебка1 Эеукюп) 1986, р. 489; Окоп, 1. Вю1. Скет. 267: 12528, 1992). Такая локализация фракции АТ III на эндотелиальной поверхности, где обычно генерируются ферменты внутреннего каскада коагуляции, дает возможность АТ III быстро нейтрализовать данные гемостатические ферменты и защитить естественные поверхности от образования тромбов. Таким образом, ключевыми свойствами АТ III для предотвращения тромботических случаев являются его способности связывать катализатор гепарин, подвергаться конформационному изменению, которое изменяет его ингибирующие свойства, и необратимо связывать тромбин или фактор Ха, ингибируя таким образом их активность. АТ III также обладает превосходными противовоспалительными свойствами, некоторые из которых являются результатом его действия в коагуляционном каскаде (Клеткск, В1ооб Соади1 Р1Ьтшо1укк. 2002, 13: 657). Активированные коагуляционные протеазы, такие как активированный фактор X и тромбин, вносят свой вклад в воспаление; например, путем высвобождения провоспалительных медиаторов. Ингибирование АТ III данных протеаз предотвращает такие специфические взаимодействия с клетками и последующие реакции (Воеткск, В1ооб Соади1 Р1Ьтшо1укк. 2002, 13: 657). Противовоспалительные свойства АТ III независимо от коагуляции включают непосредственные взаимодействия с клетками, приводящие к высвобождению, например, простациклина. Связывание АТ III с недавно идентифицированным клеточным рецептором, синдеканом-4, приводит к вмешательству во внутриклеточный сигнал, индуцированный медиаторами, такими как липополисахариды и, как следствие, к понижению модуляции воспалительной ответной реакции (Воеткск, В1ооб Соади1 Р1Ьппо1укк. 2002, 13: 657). Помимо анализа свободной структуры АТ III, были проведены многочисленные исследования, оценивающие сайты комплексообразования для олигосахаридных звеньев гепарина вследствие важности комплекса гепарин- АТ III для физиологической функции АТ III (Скоау, Апп. ΝΥ Асаб. 8с1. 370: 644, 1981; Скоау, Вюскет. Вюркук. Век. Соттип. 116: 492, 1983; Окоп, 1. Вю1. Скет. 266: 6353, 1991; Ваиег, 8етш. Нета!о1. 28: 10, 1991; Саге11, ТкготЬ. Наеток!. 78: 516, 1997). АТ III можно получать в соответствии с классическими методами фракционирования плазмы крови человека. Аффинная хроматография (гепарин-сефароза) с использованием высокой аффинности гепарина в качестве лиганда для АТ III с последующей термической обработкой для дезактивации вируса используется для отделения от плазмы крови. Помимо фракционирования из плазмы для получения АТ III доступны более современные альтернативы в соответствии с рекомбинантными методами получения, которые обеспечивают более безопасный доступ к такому важному терапевтическому белку (Ьеу1, 8е1шп ТкготЬ Неток! 27: 405, 2001). АТгуп™ представляет собой рекомбинантный АТ III человека (гкАТ III), продуцируемый СТС Вю1кетареи!1ск с использованием трансгенных коз. Были проведены подробные исследования по сравнению структурных и функциональных свойств АТ III, полученного из плазмы крови (рк АТ III) и гк АТ III (Ебтипбк, В1ооб, 91: 4561, 1998). На основании данных экспериментов, гк АТ III структурно идентичен гк АТ III за исключением гликозилирования. Олигоманнозные структуры связаны с Акп 155 в трансгенно продуцируемом веществе, тогда как сложные структуры идентифицируются в случае белка, полученного из плазмы. Некоторые из галактозных звеньев АТ III в гк АТ III заменены на звенья СаШас. Высокая степень фукозилирования в гк АТ III является другим отличием. Наконец, характер сиалилирования обоих белков отличается по двум направлениям: гк АТ III является менее сиалилированным и содержит Νацетил-, а также Ν-гликолилнейраминовые кислоты, такое структурное различие между двумя углеводными частями обоих молекул также приводит к различным биохимическим свойствам. На европейском больничном рынке доступны следующие лекарственные средства АТ III (источник: [М8-АТС группа 2001): КуЬетпш® (Ауеп1к Вектшд), АТ III (Вах!ег, СпГок), А!епаку® (Ркаттааа), Ас1о!ше® (ЬРВ), АпЬш® (СпГок).
Фактор VIII принимает участие во внутреннем каскаде свертывания крови протеиназами и служит в качестве кофактора в реакции фактора ЕХа, превращающей фактор X в его активную форму Ха, что, в конечном счете, приводит к образованию фибринового тромба. Отсутствие или нестабильность фактора VIII ведет к гемофилии А, обычному рецессивному х-связанному нарушению свертываемости крови. Частота гемофилии А в каждой этнической группе составляет 1-2 случая на 10000 рождений особей мужского пола. У пациентов либо действительно фактор VIII экспрессируется на уровне ниже нормального, либо они принадлежат к так называемой группе сгт-положительных пациентов (кросс-положительный материал) (примерно 5% пациентов), которые имеют достаточное количество фактора VIII в плазме крови (по меньшей мере 30% от нормального уровня), но у которых белок является нефункциональным. Примерно 50% всех пациентов страдает тяжелой гемофилией с активностью фактора VIII менее 1% от нормальной; у них часто происходят спонтанные кровотечения в суставы, мышцы и внутренние органы. Умеренная гемофилия А, которая наблюдается у 30-40% пациентов, связана с активностью в 5-30% от нормального уровня. Кровотечения происходят только после значительной травмы или хирургического вмешательства. Гемофилия средней тяжести наблюдается примерно у 10% пациентов. В дан
- 6 010501 ном случае активность фактора VIII составляет 2-5% от нормального уровня, и кровотечение происходит уже после незначительной травмы. Период полураспада фактора VIII ίη-νίνο у человека составляет обычно 10-15 ч, но следует отметить, что на кинетику высвобождения, стабильности и разложения также оказывает влияние другой фактор, фактор ван Виллебранда (тап \УП1еЬгапб). Фактор VIII получают или обычной экстракцией из плазмы донорской крови человека, или, в более недавнее время, с использованием рекомбинантных систем. Например, клетки почки детенышей хомяка (ВНК) используют для продуцирования Кодепа!е® (Вауег), тогда как клетки яичника китайского хомяка используют для получения другого продукта, РекотЬша1е® (Вах!ег) в виде полного одноцепочечного белка из 2351 аминокислоты с номинальной молекулярной массой 267 кДа (Тоо1е е! а1., 1984, №Ш1ге 312: 342) или в виде различных вариантов, где полный В-домен или его часть удалены для того, чтобы получать продукт, обладающий большей стабильностью, и с более высокими выходами при продуцировании (ВЬайасЬатууа е! а1. 2003, СК1Р8 4/3: 2-8). Продукт-предшественник перерабатывается в две полипептидные цепи по 200 и 80 кДа в аппарате Гольджи, и две цепи, которые удерживаются вместе ионом(ами) металла(ов), экспрессируются в крови (КаиТтап е! а1., 1988, I. Вю1. СЬет., 263: 6352). Прокоагулирующая активность требует дальнейшего расщепления тромбина с получением фрагментов тяжелой цепи в 54 кДа и 44 кДа плюс фрагмент легкой цепи в 72 кДа (А1у е! а1., 1992, Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А: 4933). Таким образом, в концентратах фактора VIII, полученных из плазмы крови человека, было описано присутствие нескольких фрагментированных полностью активных форм фактора VIII (Апбегзоп е! а1., 1986, Ргос. №111. Асаб, 8сг 83: 2979). Наиболее общее побочное действие при введении плазматического или рекомбинантного фактора VIII заключается в иммунологических реакциях у большого числа пациентов (до 30%), что лишает его терапевтической ценности. В прошлом, были предприняты разнообразные попытки облегчить переносимость для пациентов с помощью пероральной индукции переносимости, но результаты оказались не слишком обнадеживающими. Были предположены новые генетические способы индуцирования переносимости, которые пока еще не нашли широкого распространения. Авторами настоящего изобретения предполагается, что хезилированный (модифицированный гидроксиксиэтилкрахмалом) белок будет обладать пониженной степенью иммуногенности и таким образом сможет снизить данное осложнение. Фактор VIII очень богат лизиновыми остатками (более 220 в общем количестве 2350 аминокислот), что можно использовать для подхода на основе восстановительного аминирования.
Альфа1-Антитрипсин (А1 АТ, также упоминаемый как ингибитор альфа1-протеиназы) представляет собой ингибитор протеиназы, который, как было показано, виртуально ингибирует все серинпротеиназы млекопитающих (Тгатзз Апп. Кет. ВюсЬет. 52 (1983) р. 655), включая нейтрофилэластазу, тромбин, факторы Ха и ХИ. А1АТ представляет собой синтезируемый в печени одноцепочечный гликопротеин из 394 аминокислот и имеющий молекулярную массу 53 кДа. Концентрация его в плазме крови находится в диапазоне 1-1,3 г/л. Присутствие только одного цистеина в целом белке не дает возможность образования внутримолекулярных дисульфидных мостиков. Молекула содержит три углеводных боковых цепи (Азп 46, 83, 24 7) (Меда I Вю1. СЬет. 255 (1980) р. 4057; Меда I. Вю1. СЬет. 255 (1980) р. 4053; Саге11 ЕЕВ8 Ьейегз 135 (1981) р. 301; Нобдез ВюсЬетэзку 21(1982) р. 2805), что составляет 12% его молекулярной массы. Были обнаружены два типа углеводных цепей, имеющие би- и триантеннальную структуру, соответственно (Нобдез I: Вю1. СЬет. 254 (1979) р. 8208). А1АТ человека существует по меньшей мере в двадцати различных формах в общей популяции. Микрогетерогенность является результатом различных количеств двух типов углеводных цепей. Ключевой функцией является контроль активности нейтрофилэластазы (Тгатзз Апп. Рет. ВюсЬет. 52 (1983) р. 655). Неконтролируемая активность эластазы приводит к атаке по эпителиальным тканям, что приводит к непоправимому повреждению. Во время процесса дезактивации А1 АТ выступает в качестве субстрата для эластазы, связываясь с активным центром протеазы, которая впоследствии дезактивируется за счет образования данного комплекса. Дефицит А1 АТ вызывает, например, эмфизему легких, которая связана с повреждением легочного эпителия. Распределение двух типов углеводных боковых цепей А1АТ по трем сайтам Ν-гликозилирования А1АТ отличается для каждого изотипа А1 АТ. Классическое получение А1 АТ проводят в соответствии с методами фракционирования плазмы крови с использованием различных стадий аффинной хроматографии плазмы крови человека. Однако более современным способом продуцирования А1АТ являются рекомбинантные технологии. Компания РРЬ ТЬетареийсз разработала способ, который позволяет выделять рекомбинантный А1АТ человека (гНА1АТ) из молока трансгенных овец (О1тап ВюсЬет. 8ос. 8утр. 63 (1998) р. 141; ТеЬЬий Сигг. Орш. Мо1. СЬег. 2 (2000) р. 199; Сагтег С.’уЮ1ес1шо1оду 9 (1992) р. 77; ХУпдИ Вю1ес1шо1оду (ΝΥ) 9(1991) р.830). Что касается белковой части молекулы гЬА1АТ, она имеет структуру, идентичную структуре рбЬА1АТ. Но, как и в случае других рекомбинантно продуцируемых белков человека, различие проявляется в углеводных боковых цепях, особенно в числе остатков сиалиловых кислот.
Активатор плазминогена тканевого типа (!РА) представляет собой трипсиноподобную серинпротеазу, существенную для лизиса тромбов. В присутствии фибринового тромба, !РА превращает плазминоген в плазмин, который разрушает фибрин. !РА проявляет повышенную активность в присутствии фибрина и в результате вызывает фибрин-специфическую активацию плазминогена (М. 8ре11тап, Ь. I. Ваза, С. К. Ьеопатб, I. А. СЬаке1, I. V. О'Соппог, ТЬе 1оитпа1 о£ Вю1одюа1 СЬетэзку 264 (1989) р. 14100). Плазмин
- 7 010501 растворяет фибрин, приводя к продуктам разложения фибрина. За счет положительного механизма обратной связи фибрин усиливает свое собственное разрушение путем стимуляции 1РА-опосредованной активации плазминогена (В. 1. 81е\\'аг1 с1. а1. Тйе 1оитпа1 οί Вю1одюа1 Сйетшйу 275 (2000) рр.1011210120). й1РА является физиологическим активатором фибринолиза, который присутствуют в различных типах тканей. Он представляет собой гликопротеин с молекулярной массой приблизительно 68 кДа. В природном виде 1РА существует в одноцепочечной форме (одноцепочечный активатор плазминогена тканевого типа, КС1РА), которая может быть преобразована путем расщепления плазмина по пептидной связи Агд 275-11е 276 в двухцепочечную структуру (двухцепочечный активатор плазминогена тканевого типа, !с1РА). Для лечения фибринолиза его продуцируют рекомбинантными методами в виде т1РА (рекомбинантный активатор плазминогена тканевого типа). Существуют различные типы 1РА, проявляющие структурные отличия в углеводной структуре. 1РА типа I имеет Ν-связанные олигосахариды у аминокислот Акп117, Акп184 и Аки448. 1РА типа II является гликозилированным по Аки117 и Аки448. Оба типа содержат О-связанный остаток фукозы у Тйг61 (К. Μοτί е1 а1. Тйе 1оитпа1 οί Вю1одюа1 СйетЩту 270 (1995) рр. 3261-3267). При исследовании углеводной структуры 1РА, экспрессированного в СНО-клетках, показано большое разнообразие ди-, три- и тетра-антеннальных структур в цепях Сахаров (М. А. 8ре11тап, Ь. 1. Вака, С.К. Ьеопатй, 1. А. Сйаке1, 1. V. О'Соппог, Тйе 1оитпа1 οί Вю1одка1 СйетЩту 264 (1989) р. 14100). Первичная структура 1РА содержит несколько цистеинов, которые, как предполагается, являются сшитыми, в дополнение к свободному цистеиновому остатку в положении 83, который может взаимодействовать с другим 1РА, образуя димер. Несколько результатов показывают, что на выведение 1РА шУ1уо оказывает влияние углеводная структура, особенно за счет высокоманнозного олигосахарида, присоединенного в положении Акп117. Другой предполагаемый механизм выведения включает распознавание О-связанного остатка фукозы в положении Тйг61 высокоаффинными рецепторами на гепатоцитах. Данный остаток расположен поблизости от Сук83. Биосконструированный 1РА (ТNК-ίРА) был разработан для увеличения продолжительности периода полураспада. Сайт гликозилирования в положении 117 был смещен в положение 103. аспарагин в положении 117 был заменен на Глутамин, а Треонин в положении 103 был заменен на аспарагин. ТNК-ίРА является устойчивым к дезактивации под действием ингибитора 1 активатора плазминогена вследствие тетра-аланинового замещения в домене протеазы (В. 1. 81е\уаг1 е1. а1. Тйе 1оитпа1 οί Вю1одка1 СйетЩту 275 (2000) рр. 10112-10120). ТNК-ίрА представлен на рынке в виде Теиес!ер1аке® (Воейппдет 1пде1йе1т). ТNК-ίРА можно вводить пациенту в виде одного внутривенного болюса, тогда как 1РА нужно вводит в виде болюса с последующей инфузией.
Активированный белок С (АРС) представляет собой модулятор свертываемости крови и воспаления, связанного с тяжелым сепсисом. Активированный белок С возникает из его неактивного предшественника (белка С) под действием тромбина, связанного с тромбомодулином. Данный комплекс отщепляет короткий Ν-концевой активированный пептид от тяжелой цепи белка С, приводя к активированному белку С. Дротрекогин (Эгойесодт) альфа (активированный) представляет собой рекомбинантный активированный белок С (гйАРС). Его последовательность аминокислот идентична последовательности полученного из плазмы крови белка С, и он обладает аналогичными свойствами. Активированный белок С поставляется на рынок Ей ЬШу как Х|дпк®. Он продуцируется клеточной линией человека (НЕК293), в которую введены векторы экспрессии белка С. Данную клеточную линию использовали благодаря ее способности осуществлять корректную серию комплекса пост-трансляционных модификаций, которые требуются для функциональной активности. Рекомбинантный активированный белок С человека представляет собой 2-цепочеченый гликопротеин, содержащий 4 сайта Ν-гликозилирования и 12 дисульфидных связей. Тяжелая цепь содержит 250 аминокислот. В данной цепи семь остатков представляют собой цистеин и имеется три сайта Ν-гликозилирования (Акп-248, Акп-313 и Акп-329). Семь цистеиновых остатков образуют три дисульфидных связи внутри тяжелой цепи и одну дисульфидную связь между цепями. Легкая цепь содержит Ν-связанный сайт гликозилирования (Акп-97) и 17 цистеиновых остатков, которые образуют восемь дисульфидных связей внутри легкой цепи и одну дисульфидную связь между цепями. Первые девять глутаминовых кислот легкой цепи являются гамма-карбоксилированными (С1а), а аспарагиновая кислота 71 является бета-гидроксилированной. ВйАРС имеет идентичную последовательность аминокислот, что и полученный из плазмы крови активированный белок С, но отличается от последнего характером гликозилирования. Активированный белок С представляет собой протеазу, принадлежащую к семейству серинпротеаз. Он играет важную роль в регулировании свертываемости крови. Благодаря своему антитромботическому действию активированный белок С обладает способностью ингибировать функцию тромбина. Кроме того, активированный белок С представляет собой важный модулятор воспаления, связанного с тяжелым сепсисом. Эндогенные ингибиторы серинпротеазы представляют собой природные ингибиторы активированного белка С, приводя к очень короткому (менее 30 мин) периоду полураспада активированного белка С в системе кровообращения ш у1уо. Выведение активированного белка С из системы кровообращения опосредовано сочетанием по меньшей мере трех процессов, включая ингибирование ферментативной активности активированного белка С с помощью эндогенных ингибиторов протеаз, выведение активированного белка С и/или комплексов активированный белок Сингибитор серинпротеазы такими органами, как печень и почки, и разложение активированного белка С
- 8 010501 и/или комплексов активированный белок С-ингибитор серинпротеазы с помощью протеаз кровообращения или тканевых протеаз. Фаза I клинических исследований при 24-часовой инфузии в дозе 24 мкг/кг/ч приводила к устойчивому состоянию концентрации в плазме крови на уровне 70 нг/мл. Период полураспада ФАРС, измеренный в конце инфузии, составлял 0,5-1,9 ч. Концентрации гБЛРС в плазме крови падали ниже уровня обнаружения, составляющего 10 нг/мл, через 2 ч после окончания инфузии. Вследствие его короткого физиологического и фармакокинетического периода полураспада при клиническом использовании для лечения сепсиса активированный белок С непрерывно вводят путем инфузии с определенной скоростью для поддержания желаемой концентрации в плазме крови. Были предприняты попытки для улучшения фармакокинетического профиля активированного белка С. Например, Ό. Т. Ветд с1. а1. Ргос. №111. Асай. 8с1. И8А 100 (2003) рр. 442 3-4428, описали сконструированный вариант активированного белка С с пролонгированным периодом полураспада в плазме крови.
Фактор VII участвует во внутреннем каскаде коагуляции протеиназ и промотирует гемостаз путем активации внешнего пути каскада коагуляции. Р VII превращается в фактор VIII с помощью фактора Ха, фактора ХПа, фактора БХа или тромбина за счет незначительного протеолиза. В присутствии тканевого фактора и ионов кальция фактор УПа затем превращает фактор X в фактор Ха за счет ограниченного протеолиза. Фактор УПа будет также превращать фактор IX в фактор БХа в присутствии тканевого фактора и ионов кальция. Фактор VII представляет собой витамин К-зависимый гликопротеин, состоящий из 406 остатков аминокислот (Μ\ν 50 кДа). Фактор VII получают или обычной экстракцией из плазмы донорской крови человека, или, в более недавнее время, с использование рекомбинантных систем. Νονο Хотйщк использует клетки почки детенышей хомяка (ВНК) для продуцирования Nονο8еνеη®, экспрессируемый в виде одноцепочечного белка из 406 аминокислот с номинальной молекулярной массой 55 кДа (ТЫш, Ь. е! а1., ВюсБешЩту 27:7785-7793 (1988). Молекула содержит четыре углеводных боковых цепи. Две О-связанные углеводные боковые цепи расположены у 8ет52, 60 и две Ν-связанные углеводные боковые цепи расположены при Аки 145, 322 (ТЫш, Ь. е! а1., ВюсБешЩту 27: 7785-7793 (1988).
Фактор VII предназначен для лечения случаев кровотечения у пациентов с гемофилией А или В, имеющих ингибиторы фактора VIII или фактора IX. Следовательно, настоящее изобретение также относится к применению конъюгата НА8-Фактор VII для получения лекарственного средства для лечения случаев гемофилии А или В у пациентов, обладающих ингибиторами фактора VIII или фактора IX.
Фактор IX витамин К-зависимый белок плазмы крови, который участвует во внутреннем пути свертывания крови с помощью фактора X, превращающего его в активную форму в присутствии ионов Са (2+), фосфолипидов и фактора МШа. Фактор IX представляет собой гликопротеин с примерной молекулярной массой 55000 Да, состоящий из 415 аминокислот в виде единственной цепи УокНйаке 8. е! а1., ВюсБетЩгу 24: 3736-3750 (1985)). Фактор IX получают или обычной экстракцией из плазмы донорской крови человека, или, в более недавнее время, с использованием рекомбинантных систем. \ν\Όΐ1ι использует клетки яичников китайского хомяка (СНО) для продуцирования ВеηеРIX®. Он имеет первичную последовательность аминокислот идентичную А1а148 аллельной форме полученного из плазмы крови фактора IX, и обладает структурными и функциональными характеристиками, аналогичными таковым для эндогенного фактора IX. Белок содержит восемь углеводных боковых цепей. Шесть О-связанных углеводных боковых цепей расположены при 8ег 53, 61 и у треонина 159, 169, 172, 179 и две Νсвязанных углеводных боковых цепи расположены при Акп 157, 167 (УокБйаке 8. е! а1., ВюсБетЩту 24: 3736-3750 (1985); Ва11апй А. е! а1., Еиг Б ВюсНет. 1988; 172 (3): 565-72).
Фактор IX предназначен для борьбы и профилактики геморрагических случаев у пациентов с гемофилией В (например, при врожденном дефиците фактора IX или болезни Кристмаса), включая контроль и профилактику кровотечения при хирургических вмешательствах. Следовательно, настоящее изобретение также относится к применению конъюгата НА8-Фактор IX для получения лекарственного средства для борьбы и профилактики геморрагических случаев у пациентов с гемофилией В (например, при врожденном дефиците фактора IX или болезни Кристмаса), включая контроль и профилактику кровотечения при хирургических вмешательствах.
В контексте настоящего изобретения, термин «гидроксиалкилкрахмал» (НА8) относится к производному крахмала, который является замещенным по меньшей мере одной гидроксиалкильной группой. Предпочтительный гидроксиалкилкрахмал по настоящему изобретению имеет строение, соответствующее формуле (I)
где восстановительный конец молекулы крахмала показан в его неокисленной форме и концевое сахаридное звено показано в виде его полуацеталя, который, в зависимости, например, от растворителя, может существовать в равновесии с его альдегидной формой.
Термин «гидроксиалкилкрахмал», как он использован в настоящем изобретении, не ограничен со
- 9 010501 единениями, в которых концевые углеводные фрагменты включают гидроксиалкильные группы К.1, Я2 и/или Я3, как показано для краткости в формуле (I), но также относится к соединениям, в которых гделибо присутствует по меньшей мере одна гидроксиалкильная группа; либо концевой углеводный фрагмент и/или оставшаяся часть молекулы крахмала НА8', замещена гидроксиалкильными группами Κ,μ Я2 или Я3.
Также допустим гидроксиалкилкрахмал, включающий две или более различные гидроксиалкильные группы.
По меньшей мере одна гидроксиалкильная группа, имеющаяся в НА8, может содержать две или более гидроксильных групп. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, по меньшей мере одна гидроксиалкильная группа, имеющаяся в НА8, содержит одну гидроксильную группу.
Выражение «гидроксиалкилкрахмал» также включает производные, в которых алкильная группа является моно- или полизамещенной. В данном контексте является предпочтительным, чтобы алкильная группа была замещена галогеном, особенно фтором или арильной группой. Кроме того, гидроксильная группа в гидроксиалкильной группе может быть этерифицирована с образованием сложного или простого эфира.
Помимо этого, вместо алкила можно использовать линейные или разветвленные замещенные или незамещенные алкеновые группы.
Гидроксиалкилкрахмал является производным, представляющим собой простой эфир крахмала. Помимо указанных простых эфиров в контексте настоящего изобретения также можно использовать другие производные крахмала. Например, можно использовать производные, которые включают этерифицированные с образованием сложного эфира гидроксильные группы. Данные производные могут, например, представлять собой производные незамещенных моно или дикарбоновых кислот, имеющих 2-12 атомов углерода или их замещенные производные. В частности, можно использовать производные незамещенных монокарбоновых кислот с 2-6 атомами углерода, в частности производные уксусной кислоты. В данном контексте предпочтительными являются ацетилкрахмал, бутирилкрахмал и пропионилкрахмал.
Кроме того, предпочтительными являются производные незамещенных дикарбоновых кислот, имеющих 2-6 атомов углерода.
В случае производных дикарбоновых кислот, полезно, чтобы вторая карбоксильная группа дикарбоновой кислоты также была этерифицирована. Кроме того, в контексте настоящего изобретения также можно использовать моноалкиловые эфиры дикарбоновых кислот. Для замещенных моно- или дикарбоновых кислот замещающие группы предпочтительно могут быть такими же, как отмечалось для замещенных алкильных остатков.
Методы этерификации крахмала с образованием сложноэфирных производных известны в данной области (см., например, К1егот Ό. с! а1., Сотргсйспыус Сс11и1о5с Сйстщйу Уо1. 2, 1998, А1п1су-УСН. Асшйспп. Ысте Уогк, особенно часть 4.4, Ейспйеайоп оГ Сс11и1о8с (Ι8ΒΝ3-527-29489-9).
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, используется гидроксиалкилкрахмал, соответствующий вышеуказанной формуле (I). В формуле (I) подробно показанное сахаридное кольцо и остатки, обозначенные как НА8', представляют вместе предпочтительную молекулу гидроксиалкилкрахмала. Другие сахаридные кольцевые структуры, включенные в НА8', могут быть такими же или могут отличаться от подробно показанного сахаридного кольца.
Что касается остатков К.1, Я2 и Я3 в соответствии с формулой (I), то здесь нет особых ограничений. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления К.1, Я2 и Я3 независимо представляют собой водород или гидроксиалкильную группу, гидроксиарильную группу, гидроксиаралкильную группу или гидроксиалкарильную группу, имеющую от 2 до 10 атомов углерода в соответствующем алкильном остатке, или группу формулы (СН2СН2О)п-Н, где п представляет собой целое число, предпочтительно 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Водород и гидроксиалкильные группы, имеющие от 2 до 10 атомов углерода являются предпочтительными. Более предпочтительно гидроксиалкильная группа имеет от 2 до 6 атомов углерода, более предпочтительно от 2 до 4 атомов углерода и еще более предпочтительно от 2 до 3 атомов углерода. Таким образом «гидроксиалкилкрахмал» предпочтительно включает гидроксиэтилкрахмал, гидроксипропилкрахмал и гидроксибутилкрахмал, где гидроксиэтилкрахмал и гидроксипропилкрахмал являются особенно предпочтительными и гидроксиэтилкрахмал является наиболее предпочтительным.
Алкильная, арильная, аралкильная и/или алкарильная группа может быть линейной или разветвленной и замещенной подходящим образом.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, где К.1, Я3 и Я3 независимо представляют собой водород или линейную или разветвленную гидроксиалкильную группу, имеющую 2-6 атомов углерода.
Таким образом, К.1, Я2 и Я3 предпочтительно могут представлять собой гидроксигексил, гидроксипентил, гидроксибутил, гидроксипропил, такой как 2-гидроксипропил, 3-гидроксипропил, 2-гидроксиизопропил, гидроксиэтил, такой как 2-гидроксиэтил, водород, и 2-гидроксиэтильная группа является особенно предпочтительной.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше,
- 10 010501 где Κι, К2 и К3 независимо представляют собой водород или 2-гидроксиэтильную группу, особенно предпочтительным является вариант осуществления, где по меньшей мере один остаток К!, К2 и К3 представляет собой 2-гидроксиэтильную группу.
Гидроксиэтилкрахмал (НЕБ) является наиболее предпочтительным для всех вариантов осуществления настоящего изобретения.
Следовательно, настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, где полимер представляет собой гидроксиэтилкрахмал и производное полимера представляет собой производное гидроксиэтилкрахмала.
Гидроксиэтилкрахмал (НЕБ) представляет собой производное существующего амилопектина в природе, и в организме он разлагается альфа-амилазой. НЕБ представляет собой замещенное производное углеводного полимера амилопектина, которое присутствует в кукурузном крахмале в концентрации до 95% по массе. НЕБ проявляет благоприятные биологические свойства и используется в качестве агента для объемной замены крови и при гемодилюционной терапии в клиниках (Боттегтеуег с1 а1., 1987, 1<гапксп11аи5р11агта/1с. 8 (8), 271-278; и №е1б1ег е1 а1., 1991, Агхпепп.- Боткскиид/Птид Кек., 41, 494-498).
Амилопектин состоит из фрагментов глюкозы, где в основной цепи присутствуют альфа-1,4гликозидные связи, а в местах разветвления выявлены альфа-1,6-гликозидные связи. Физико-химические свойства данной молекулы главным образом определяются типом гликозидных связей. Благодаря гибридной альфа-1,4-гликозидной связи образуются спиральные структуры, содержащие примерно шесть мономеров глюкозы на один виток спирали. Физико-химические, а также биохимические свойства полимера могут быть модифицированы путем замещения. Введение гидроксиэтильной группы можно осуществить посредством щелочного гидроксиэтилирования. Приспосабливая соответствующим образом реакционные условия, можно использовать различную реакционную способность соответствующей гидроксильной группы в незамещенном мономере глюкозы применительно к гидроксиэтилированию. Благодаря этому, специалист в определенной степени способен влиять на характер замещения.
НЕБ характеризуется главным образом молекулярно-массовым распределением и степенью замещения. Существует две возможности описания степени замещения:
1. Степень замещения может быть описана как часть замещенных мономеров глюкозы по отношению ко всем фрагментам глюкозы.
2. Степень замещения может быть описана как молярное замещение, где указывается число гидроксиэтильных групп на фрагмент глюкозы.
В контексте настоящего изобретения степень замещения, обозначенная как Ό8, относится к молярному замещению, как описано выше, см., также Боттегтеуег е1 а1., 1987, Кгапкепкаикркагта71е, 8 (8), 271-278, как процитировано выше, в частности на стр. 273).
Растворы НЕБ присутствуют в полидисперсных композициях, где каждая молекула отличается от другой в отношении степени полимеризации, числа и характера сайтов разветвления и характера замещения. Следовательно, НЕБ представляет собой смесь соединений с различной молекулярной массой. Поэтому, конкретный раствор НЕБ определяется с использованием средней молекулярной массы с помощью статистических способов. В данном контексте, Ми рассчитывается как среднее арифметическое в зависимости от числа молекул. Альтернативно, М„ (или М№), средняя масса, представляет собой единицу, которая зависит от массы НЕБ.
В контексте настоящего изобретения гидроксиэтилкрахмал предпочтительно имеет среднюю молекулярную массу (среднюю массу) от 1 до 300 кДа. Гидроксиэтилкрахмал может далее обладать предпочтительной молярной степенью замещения от 0,1 до 3, предпочтительно 0,1 до 2, более предпочтительно от 0,1 до 0,9, предпочтительно 0,1 до 0,8, и предпочтительным соотношением между С2:С6 замещением в диапазоне от 2 до 20 в отношении гидроксиэтильных групп.
Термин «средняя молекулярная масса», как он использован в контексте настоящего изобретения, относится к массе, определенной в соответствии со способом ЕАЕЬБ-(рассеяние света лазера под малым углом)-6РС, как описано в Боттегтеуег е1 а1., 1987, Кгаикепкаикркагта71е, 8 (8), 271-278; и №е1б1ег е1 а1, 1991, Аггиет.- Боткскиид/Эгид Кек., 41, 494-498. Для средней молекулярной массы 10 кДа и меньше, дополнительно проводят калибрование по стандарту, масса которого предварительно была определена с использованием ЕАЕЬБ-СРС.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, средняя молекулярная масса используемого гидроксиэтилкрахмала составляет от 1 до 300 кДа, более предпочтительно от 2 до 200 кДа, более предпочтительно от 4 до 130 кДа, более предпочтительно от 4 до 70 кДа.
Примером НЕБ, имеющим среднюю молекулярную массу примерно 130 кДа, является НЕБ со степенью замещения от 0,1 до 0,9, предпочтительно от 0,2 до 0,8, как например, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 или 0,8, предпочтительно от 0,4 до 0,7, как например, 0,4, 0,5, 0,6 или 0,7.
Примером НЕБ, имеющим среднюю молекулярную массу примерно 130 кДа, является Уо1иуеи® от Бгекешик. Уо1иуеи® представляет собой искусственный коллоид, используемый, например, для объемного замещения, применяемого по терапевтическим показаниям для лечения и профилактики гиповолемии. Уо1иуеи® характеризуется средней молекулярной массой 130 кДа +/-20000 Да, молярным замещением,
- 11 010501 составляющим 0,4, и соотношением С2:С6, равным приблизительно 9:1.
Следовательно, настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, где гидроксиалкилкрахмал представляет собой гидроксиэтилкрахмал, имеющий среднюю молекулярную массу от 4 до 100 кДа, предпочтительно от 4 до 70 кДа.
Предпочтительными диапазонами средней молекулярной массы являются, например, 4-70 кДа, или 10-70 кДа, или 12-70 кДа, или 18-70 кДа, или 50-70 кДа, или 4-50 кДа, или 10-50 кДа, или 12-50 кДа, или 18-50 кДа, или 4-18 кДа, или 10-18 кДа, или 12-18 кДа, или 4-12 кДа, или 10-121 кДа, или 4-10 кДа.
В соответствии с особенно предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения средняя молекулярная масса используемого гидроксиэтилкрахмала находится в диапазоне более 4 кДа и менее 70 кДа, как например примерно 10 кДа, или в диапазоне от 9 до 10 кДа, или от 10 до 11 кДа, или от 9 до 11 кДа, или примерно 12 кДа, или в диапазоне от 11 до 12 кДа, или от 12 до 13 кДа, или от 11 до 13 кДа, или примерно 18 кДа, или в диапазоне от 17 до 18 кДа, или от 18 до 19 кДа, или от 17 до 19 кДа, или примерно 50 кДа, или в диапазоне от 49 до 50 кДа, или от 50 до 51 кДа, или от 49 до 51 кДа.
Что касается более высокого предела молярной степени замещения (Ό8), то также возможны значения вплоть до 3,0, такие как 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 или 2,0, значения ниже 2,0 являются предпочтительными, значения ниже 1,5 являются более предпочительными, значения ниже 1,0, такие как 0,7, 0,8 или 0,9 являются еще более предпочтительными.
Следовательно, предпочтительные диапазоны молярной степени замещения составляют от 0,1 до 2, или от 0,1 до 1,5, или 0,1 до 1,0, или от 0,1 до 0,9, или от 0,1 до 0,8. Более предпочтительные диапазоны молярной степени замещения составляют от 0,2 до 2, или от 0,2 до 1,5, или от 0,2 до 1,0, или от 0,2 до 0,9, или 0,2 до 0,8. Еще более предпочтительные диапазоны молярной степени замещения составляют от 0,3 до 2 или от 0,3 до 1,5, или от 0,3 до 1,0, или от 0,3 до 0,9, или от 0,3 до 0,8. Еще более предпочтительные диапазоны молярной степени замещения составляют от 0,4 до 2 или от 0,4 до 1,5, или от 0,4 до 1,0, или от 0,4 до 0,9, или от 0,4 до 0,8.
Поскольку рассматривается степень замещения (Ό8). Ό8 предпочтительно составляет по меньшей мере 0,1, более предпочтительно по меньшей мере 0,2, более предпочтительно по меньшей мере 0,4 и более предпочтительно по меньшей мере 0,4. Предпочтительные диапазоны Ό8 составляют от 0,1 до 3, предпочтительно от 0,1 до 2, более предпочтительно от 0,1 до 0,9, более предпочтительно от 0,1 до 0,8, более предпочтительно от 0,2 до 0,8, более предпочтительно от 0,3 до 0,8 и даже более предпочтительно от 0,4 до 0,8, еще более предпочтительно от 0,1 до 0,7, более предпочтительно от 0,2 до 0,7, более предпочтительно от 0,3 до 0,7 и более предпочтительно от 0,4 до 0,7. Особенно предпочтительными значениями Ό8 являются, например, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 или 0,9, где значения 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 или 0,8 являются более предпочтительными, значения 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 или 0,8 являются даже более предпочтительными, значения 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 или 0,8 являются еще более предпочтительными, и, например, 0,4 и 0,7 являются особенно предпочтительными.
В контексте настоящего изобретения данное значение молярной степени замещения, такое как 0,9, может представлять собой точное значение, или можно понимать, что значение находится в диапазоне от 0,85 до 0,94 или 0,8 может представлять собой точное значение, или можно понимать, что значение находится в диапазоне от 0,75 до 0,84. Следовательно, например, данное значение 0,1 может представлять собой точное значение, равное 0,1, или находиться в диапазоне от 0,05 до 0,14, данное значение 0,4 может представлять собой точное значение, равное 0,4, или находиться в диапазоне от 0,35 до 0,44, или данное значение 0,7 может представлять собой точное значение, равное 0,7, или находиться в диапазоне от 0,65 до 0,74.
Особенно предпочтительными сочетаниями молекулярной массы гидроксиалкилкрахмала, предпочтительно гидроксиэтилкрахмала, и его степени замещения Ό8 являются, например, 10 кДа и 0,4, или 10 кДа и 0,7, или 12 кДа и 0,4, или 12 кДа и 0,7, или 13 кДа и 0,4, или 18 кДа и 0,7, или 50 кДа и 0,4, или 50 кДа и 0,7, или 100 кДа и 0,7.
Что касается рассматриваемого соотношения С2:С6 замещения, указанное замещение находится в диапапзоне от 2 до 20, более предпочтительно в диапапзоне от 2 до 15 и еще более предпочтительно в диапазоне от 3 до 12.
В соответствии со следующим вариантом осуществления настоящего изобретения, также можно использовать смеси гидроксиэтилкархмалов, имеющих различные средние молекулярные массы и/или различные степени замещения и/или различные соотношения С2:С6 замещения. Следовательно, можно использовать смеси гидроксиэтилкархмалов, имеющих различные средние молекулярные массы и различные степени замещения и различные соотношения С2:С6 замещения, или имеющих различные средние молекулярные массы и различные степени замещения и одинаковые или примерно одинаковые соотношения С2:С6 замещения, или имеющих различные средние молекулярные массы и одинаковые или примерно одинаковые степени замещения и различные соотношения С2:С6 замещения, или имеющих одинаковые или примерно одинаковые средние молекулярные массы и различные степени замещения и различные соотношения С2:С6 замещения, или имеющих различные средние молекулярные массы и одинаковые или примерно одинаковые степени замещения и одинаковые или примерно одинаковые соотношения С2:С6 замещения, или имеющих одинаковые или примерно одинаковые средние молекуляр
- 12 010501 ные массы и одинаковые или примерно одинаковые степени замещения и одинаковые или примерно одинаковые соотношения С2:С6 замещения, или одинаковые или примерно одинаковые средние молекулярные массы и одинаковые или примерно одинаковые степени замещения и различные соотношения С2:С6 замещения, или имеющих примерно одинаковые средние молекулярные массы и примерно одинаковые степени замещения и примерно одинаковые соотношения С2:С6 замещения.
В различных конъюгатах и/или различных способах согласно настоящему изобретению можно использовать различные гидроксиалкилкрахмалы, предпочтительно различные гидроксиэтилкрахмалы и/или смеси различных гидроксиалкилкрахмалов, предпочтительно смеси различных гидроксиэтилкрахмалов.
Реакцию восстановительного аминирования согласно изобретению, где полимер или производное полимера ковалентно связывают через по меньшей мере одну альдегидную группу по меньшей мере с одной аминогруппой белка посредством восстановительного аминирования предпочтительно проводят при температуре от 0 до 40°С, более предпочтительно от 0 до 37°С, более предпочтительно от 0 до 25°С, в частности от 4 до 21°С, но особенно предпочтительно от 0 до 21 °С. Время реакции предпочтительно колеблется от 0,5 до 72 ч, более предпочтительно от 2 до 48 ч и особенно предпочтительно от 4 до 7 ч. В качестве растворителя для реакции предпочтительной является водная среда.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, где восстановительное аминирование проводят при температуре от 4 до 21°С, но особенно предпочтительно от 0 до 21°С.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, где восстановительное аминирование проводят в водной среде.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, где восстановительное аминирование проводят при температуре от 4 до 21°С, но особенно предпочтительно от 0 до 21°С, в водной среде.
Термин «водная среда», как он использован в контексте настоящего изобретения, относится к растворителю или смеси растворителей, включающих воду в диапазоне по меньшей мере от 10% по весу, более предпочтительно по меньшей мере от 20% по весу, более предпочтительно по меньшей мере от 30% по весу, более предпочтительно по меньшей мере от 40% по весу, более предпочтительно по меньшей мере от 50% по весу, более предпочтительно по меньшей мере от 60% по весу, более предпочтительно по меньшей мере от 70% по весу, более предпочтительно по меньшей мере от 80% по весу, еще более предпочтительно по меньшей мере от 90% по весу до 100% по весу из расчета на вес использованных растворителей. Предпочтительной реакционной средой является вода.
Значение рН реакционной среды обычно находится в диапазоне от 4 до 9, или от 4 до 8, или от 4 до 7,5, или от 4 до 7,3.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, рН, при котором проводят реакцию восстановительного аминирования, составляет ниже 10, предпочтительно ниже 7,5, предпочтительно 7,3, более предпочтительно меньше или равное 7, и наиболее предпочтительно ниже 7, т. е. в кислотном диапазоне. Предпочтительные диапазоны следовательно составляют от 3 до ниже 7, более предпочтительно от 3,5 до 6,5, еще более предпочтительно от 4 до 6, еще более предпочтительно от 4,5 до 5,5 и особенно предпочтительно примерно 5,0, т.е. 4,6, или 4,7, или 4,8, или 4,9, или 5,0, или 5,1, или 5,2, или 5,3, или 5,4.
Предпочтительными диапазонами, наряду с прочими являются 3-6,9, или 3-6,5, или 3-6, или 3-5,5, или 3-5, или 3-4,5, или 3-4, или 3-3,5, или 3,5-6,9, или 3,5-6,5, или 3,5-6, или 3,5-5,5, или 3,5-5, или 3,5-4,5, или 3,5-4, или 4-6,9, или 4-6,5, или 4-6, или 4-5,5, или 4-5, или 4-4,5, или 4,5-6,9 или 4,5-6,5, или 4,5-6, или 4,5-5,5, или 4,5-5, или 5-6,9, или 5-6,5, или 5-6, или 5-5,5, или 5,5-6,9, или 5,5-6,5, или 5,5-6, или 6-6,9, или 6-6,5, или 6,5-6,9.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, где восстановительное аминирование проводят при рН 7 или менее, более предпочтительно при рН 6 или менее.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, где восстановительное аминирование проводят при температуре от 0 до 21°С, предпочтительно от 4 до 21°С, при рН 7,5 или менее, предпочтительно 7 или менее, предпочтительно 6 или менее.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, где восстановительное аминирование проводят в водной среде при рН 7 или менее, более предпочтительно при рН 6 или менее.
Соответственно, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, где восстановительное аминирование проводят при температуре от 4 до 21°С, в водной среде при рН 7 или менее, более предпочтительно при рН 6 или менее.
Молярное соотношение производное полимера:белок, используемое в реакции, предпочтительно находится в диапазоне от 200:1 до 5:1, более предпочтительно от 100:1 до 10:1 и особенно предпочти
- 13 010501 тельно от 75:1 до 20:1.
Неожиданно было установлено, что возможно, особенно в приведенных выше предпочтительных диапазонах рН, в частности при рН ниже 7 и больше или равном 4, проводить взаимодействие производного полимера главным образом по аминогруппе, расположенной на Ν-конце белка. Термин «главным образом», как он использован в контексте настоящего изобретения, относится к варианту осуществления, где по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85% доступных Ν-концевых аминогрупп взаимодействует в реакции восстановительного аминирования. Также возможно осуществить взаимодействие по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99% доступных Ν-концевых аминогрупп. Хотя связывание аминогрупп, отличающихся от Ν-концевых аминогрупп нельзя полностью регулировать, предполагается, что связывание посредством восстановительного аминирования согласно настоящему изобретению при рН ниже 7, предпочтительно ниже 6, происходит селективно по Ν-концевым аминогруппам. В частности, данные условия реакции являются предпочтительными для белков, которые являются стабильными при данных условиях. Если белок, например, является лабильным к действию кислот, такой как альфа 1-антитрипсин, то является предпочтительным выбирать подходящие условия реакции, в частности от рН ниже чем 7,5 до значения, превышающего 5.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, где белок включает Ν-концевую аминогруппу и по меньшей мере одну дополнительную аминогруппу; указанный конъюгат включает полимер, который главным образом связан с Ν-концевой аминогруппой.
В соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществления настоящее изобретение относится к способу связывания гидроксиалкилкрахмала, функционализированного альдегидной, кето или полуацетальной группой, или производного гидроксиалкилкрахмала, функционализированного альдегидной, кето или полуацетальной группой, с Ν-концевой аминогруппой белка, при этом указанный способ включает введение указанного гидроксиалкилкрахмала или его производного в реакцию восстановительного аминирования при рН 7 или менее, предпочтительно при рН 6 или менее, указанную реакцию восстановительного аминирования предпочтительно проводят в водной среде.
В соответствии с настоящим изобретением гидроксиалкилкрахмал, функционализированный альдегидными группами, или производное гидроксиалкилкрахмала, функционализированное альдегидными группами, являются предпочтительными.
В соответствии с еще одним предпочтительным вариантом осуществления настоящее изобретение относится к способу связывания гидроксиэтилкрахмала, функционализированного альдегидной, кето или полуацетальной группой, или производного гидроксиэтилкрахмала, функционализированного альдегидной, кето или полуацетальной группой, селективно с Ν-концевой аминогруппой белка, при этом указанный способ включает введение указанного гидроксиалкилкрахмала или его производного в реакцию восстановительного аминирования при рН 7 или менее, предпочтительно при рН 6 или менее, указанную реакцию восстановительного аминирования предпочтительно проводят в водной среде; используемый гидроксиэтилкрахмал предпочтительно представляет собой гидроксиэтилкрахмал, имеющий среднюю молекулярную массу примерно 10 кДа и Ό8 примерно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий среднюю молекулярную массу примерно 10 кДа и Ό8 примерно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий среднюю молекулярную массу примерно 12 кДа и Ό8 примерно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий среднюю молекулярную массу примерно 12 кДа и Ό8 примерно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий среднюю молекулярную массу примерно 18 кДа и Ό8 примерно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий среднюю молекулярную массу примерно 18 кДа и Ό8 примерно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий среднюю молекулярную массу примерно 50 кДа и Ό8 примерно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий среднюю молекулярную массу примерно 50 кДа и Ό8 примерно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий среднюю молекулярную массу примерно 100 кДа и Ό8 примерно 0,7.
Взаимодействие производного полимера и белка, которое протекает между альдегидной группой или кетогруппой, или группой полуацеталя и аминогруппой, представляет собой восстановительное аминирование, при котором образуется основание Шиффа. Впоследствии после взаимодействия данное основание может быть восстановлено с использованием по меньшей мере одного восстановительного агента, с образованием стабильной связи между производным полимера и белком. Также возможно проводить реакцию в присутствии по меньшей мере одного восстановительного агента. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления реакцию восстановительного аминирования проводят в присутствии по меньшей мере одного восстановительного агента.
Предпочтительные восстановительные агенты представляют собой боргидрид натрия, цианоборгидрид натрия, органические комплексные соединения бора, такие как 4-(диметиламино)пиридинборановый комплекс, Ν-метилморфолин-борановый комплекс, Ν-фенилморфолин-борановый комплекс, лутидин-борановый комплекс, триэтиламин-борановый комплекс или триметиламин-борановый комплекс. Особенно предпочтительным является цианоборгидрид натрия.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, где восстановительное аминирование проводят в присутствии Ναί.'ΝΒΗ3.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше,
- 14 010501 где восстановительное аминирование проводят в водной среде при рН 7 или менее, предпочтительно 6 или менее, в присутствии восстановительного агента, предпочтительно ΝαΟΝΒΗ3.
Соответственно, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, где восстановительное аминирование проводят при температуре от 4 до 21°С в водной среде при рН 7 или менее, предпочтительно 6 или менее, в присутствии восстановительного агента, предпочтительно ЫаСМВН3.
Молярное соотношение производное полимера:белок, используемое в реакции, составляет предпочтительно в диапазоне от 200:1 до 10:1, более предпочтительно от 100:1 до 10:1 и особенно предпочтительно от 75:1 до 20:1.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу получения конъюгата, где указанный способ включает взаимодействие полимера или производного полимера, включающего альдегидную группу в водной среде с аминогруппой белка в присутствии восстановительного агента, при этом восстановительный агент предпочтительно представляет собой ΝαΟΝΒΗ3.
В соответствии с первым предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, согласно которому полимер содержит по меньшей мере две альдегидные группы, которые вводят в полимер путем реакции окисления с раскрытием цикла, полимер предпочтительно включает по меньшей мере одну структуру, соответствующую формуле:
В соответствии с данным вариантом осуществления настоящего изобретения, можно использовать отдельный окислитель или комбинацию окислителей, которые способны окислять по меньшей мере одно сахаридное кольцо полимера с образованием открытого сахаридного кольца, содержащего по меньшей мере одну, предпочтительно по меньшей мере две альдегидные группы. Данная реакция проиллюстрирована следующей реакционной схемой, на которой показано сахаридное кольцо полимера, которое окисляют с получением раскрытого кольца, имеющего две альдегидные группы:
Подходящими окислителями, наряду с другими, являются периодаты, такие как периодаты щелочного металла или смеси двух или более из них, где периодат натрия и периодат калия являются предпочтительными.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, где полимер подвергают реакции окисления с раскрытием цикла с использованием периодата, с образованием производного полимера, имеющего по меньшей мере одну, предпочтительно по меньшей мере две альдегидные группы.
Для такой реакции окисления можно использовать полимер, содержащий восстановительный конец или в окисленном или в неокисленном виде, где неокисленная форма является предпочтительной.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, где используют полимер, восстановительный конец которого находится в неокисленном виде.
Температура реакции предпочтительно находится в диапазоне от 0 до 40°С, более предпочтительно от 0 до 25°С и особенно предпочтительно от 0 до 5°С. Время реакции предпочтительно колеблется от 1 мин до 5 ч и особенно предпочтительно от 10 мин до 4 ч. В зависимости от желаемой степени окисления молярное соотношение периодат: полимер может быть выбрано подходящим образом.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, где реакцию окисления с раскрытием цикла проводят при температуре от 0 до 5°С.
Реакцию окисления полимера периодатом предпочтительно проводят в водной среде, наиболее предпочтительно в воде.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, где реакцию окисления с раскрытием цикла проводят в водной среде. Подходящее значение рН реакционной смеси можно регулировать путем доабвления по меньшей мере одного подходящего буфера. Среди предпочтительных буферов можно отметить натрийацетатный буфер, фосфатный или боратный буферы.
Гидроксиэтилкрахмал, подвергаемый указанной реакции окисления с раскрытием цикла, предпочтительно представляет собой гидроксиэтилкрахмал, имеющий среднюю молекулярную массу примерно
- 15 010501 кДа и Όδ примерно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий среднюю молекулярную массу примерно 10 кДа и Ό8 примерно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий среднюю молекулярную массу примерно 12 кДа и Ό8 примерно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий среднюю молекулярную массу примерно 12 кДа и Ό8 примерно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий среднюю молекулярную массу примерно 18 кДа и Ό8 примерно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий среднюю молекулярную массу примерно 18 кДа и Ό8 примерно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий среднюю молекулярную массу примерно 50 кДа и Ό8 примерно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий среднюю молекулярную массу примерно 50 кДа и Ό8 примерно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий среднюю молекулярную массу примерно 100 кДа и Ό8 примерно 0,7.
Полученное производное полимера может быть очищено от реакционной смеси с использованием по меньшей мере одного подходящего способа. При необходимости, производное полимера может быть осаждено перед выделением с использованием по меньшей мере одного подходящего способа.
Если производное полимера первоначально осаждают, это возможно, например, при контакте реакционной смеси по меньшей мере с одним растворителем, или смесью растворителей, отличающихся от растворителя или смеси растворителей, присутствующих в реакционной смеси, при подходящей температуре. В соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, где в качестве растворителя используют водную среду, предпочтительно воду, реакционную смесь приводят в контакт с 2-пропанолом или со смесью ацетона и этанола, предпочтительно смесью в соотношении 1:1 (об./об.), указывающем на равные объемы указанных соединений, при температуре предпочтительно в диапазоне от -20 до +50°С и особенно предпочтительно в диапазоне от -20 до 25°С.
Выделение производного полимера можно проводить с использованием подходящего способа, который может включать одну или более стадий. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, производное полимера первоначально отделяют от реакционной смеси или от смеси реакционной смеси с, например, водным 2-пропанолом, с использованием подходящего способа, такого как центрифугирование или фильтрование. На второй стадии, отделенное производное полимера может быть подвергнуто дополнительной обработке, такой как последующая обработка, как например, диализ, центрифужное фильтрование или фильтрование под давлением, ионообменная хроматография, хроматография с обращенной фазой, ВЭЖХ, МЭЖХ, гель-фильтрование и/или лиофилизация. В соответствии с еще более предпочтительным вариантом осуществления, отделенное производное полимера первоначально подвергают диализу, предпочтительно против воды, а затем лиофилизуют до тех пор, пока содержание растворителя в реакционном продукте не станет достаточно низким в соответствии с желательными характеристиками продукта. Лиофилизацию можно проводить при температуре от 20 до 35°С, предпочтительно от 20 до 30°С.
В соответствии с предпочтительным вариантом окисления окисленный полимер, образующийся в результате реакции окисления, очищают с использованием по меньшей мере одного подходящего способа, такого как ультрафильтрование и/или диализ для того, чтобы, например, удалить нежелательные соли и полимерные компоненты с низкой молекулярной массой, что также дает возможность контролирования диапазона молекулярной массы окисленного полимера.
Окисленный полимер можно использовать непосредственно для взаимодействия с белком или его выделяют подходящим способом на первой стадии, например, путем лиофилизации, и повторно растворяют в воде для конъюгации с белком на второй стадии. Что касается конденсации по меньшей мере одной аминогруппы белка по меньшей мере с одной альдегидной группой полимера путем восстановительного аминирования, здесь можно сделать ссылку на приведенное выше подробное описание, касающееся конкретных реакционных параметров реакции восстановительного аминирования, таких как рН и температура. В соответствии с особенно предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения, в соответствии с которыми в качестве белков используют гЫЬ 2, гЫЬ 3, гЫЕЫ альфа, Γ11ΙΕΝ бета, γΙιΕΡΘ. γΙιΛΤ III, гйС-СЗЕ. ΒδΑ, миоглобин и 8ΘΌ, восстановительное аминирование предпочтительно проводят при температуре от 0 до 5°С, например, примерно при 4°С и рН примерно от 4,5 до 5,5, например, примерно 5,0, при этом, время реакции составляет примерно от 20 до 30 ч, например, примерно 24 ч.
В соответствии со вторым предпочтительным вариантом осуществления полимер подвергают взаимодействию, по меньшей мере, с бифункциональным соединением, включающим по меньшей мере одну функциональную группу М, способную взаимодействовать с полимером, и по меньшей мере одну функциональную группу О. которая представляет собой альдегидную группу или кетогруппу, или группу полуацеталя, которая взаимодействует с белком при восстановительном аминировании.
Предпочтительным является использование соединения, содержащего не считая альдегидной группы или кетогруппы, или группы полуацеталя, по меньшей мере одну карбоксильную группу или по меньшей мере одну реакционноспособную карбоксильную группу, предпочтительно одну карбоксильную группу или одну реакционноспособную карбоксильную группу. Альдегидная группа или кетогруппа, или группа полуацеталя и карбоксильная группа или реакционноспособная карбоксильная группа могут быть разделены любым подходящим спейсером. Среди других, спейсер может представлять собой необязательно замещенный, линейный, разветвленный и/или циклический углеводородный остаток. Обычно углеводородный остаток содержит от 1 до 60, предпочтительно от 1 до 40, более предпочти
- 16 010501 тельно от 1 до 20, более предпочтительно от 2 до 10, более предпочтительно от 2 до 6 и особенно предпочтительно от 2 до 4 атомов углерода. Если присутствуют гетероатомы, разделяющая группа включает обычно от 1 до 20, предпочтительно от 1 до 8 и особенно предпочтительно от 1 до 4 гетероатомов. Углеводородный остаток может включать необязательно разветвленную алкильную цепь, или арильную группу, или циклоалкильную группу, содержащую от 5 до 7 атомов углерода, или представлять собой аралкильную группу, алкарильную группу, где алкильная часть может представлять собой линейную и/или циклическую алкильную группу. В соответствии с еще более предпочтительным вариантом осуществления, углеводородный остаток представляет собой арильный остаток, имеющий от 5 до 7 и предпочтительно 6 атомов углерода. Наиболее предпочтительно углеводородный остаток представляет собой остаток бензола. В соответствии с данным предпочтительным вариантом осуществления карбоксильная группа и альдегидная группа могут быть расположены в бензольном кольце в 1,4-положении, 1,3положении или 1,2-положении, где положение 1,4 является предпочтительным.
В качестве реакционноспособной карбоксильной группы можно отметить реакционноспособный сложный эфир, изотиоцианаты и изоцианат. Предпочтительные реакционноспособные сложные эфиры являются производными Ν-гидроксисукцинимидов, таких как Ν-гидроксисукцинимид или сульфо-Νгидроксисукцинимид, подходящим образом замещенных фенолов, таких как п-нитрофенол, о,п-динитрофенол, о,о'-динитрофенол, трихлорфенол, такой как 2,4,6-трихлорфенол или 2,4,5-трихлорфенол, трифторфенол, такой как 2,4,6-трифторфенол или 2,4,5-трифторфенол, пентахлорфенол, пентафторфенол, или гидроксиазолов, таких как гидроксибензотриазол. Особенно предпочтительными являются Ν-гидроксисукцинимиды, где Ν-гидроксисукцинимид или сульфо-Ы-гидроксисукцинимид являются особенно предпочтительными. Все спирты можно использовать по отдельности или в виде подходящей комбинации двух или более из них. В качестве реакционноспособных сложных эфиров пентафторфениловый сложный эфир и сложный эфир Ν-гидроксисукцинимида являются особенно предпочтительными.
Таким образом, в соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, где полимер подвергают взаимодействию с формилбензойной кислотой.
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления, настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, где полимер подвергают взаимодействию с пентафторфениловым эфиром формилбензойной кислоты.
В соответствии с еще одним предпочтительным вариантом осуществления настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, где полимер подвергают взаимодействию с Νгидроксисукцинимидным сложным эфиром формилбензойной кислоты.
В соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, где полимер подвергают взаимодействию с 4-(4-формил-3,5-диметоксифенокси)бутановой кислотой.
В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, где полимер подвергают взаимодействию с бифункциональным соединением, которое представляет собой биосовместимое соединение, выбранное из группы, состоящей из альфа-кетокарбоновых кислот, сиалиловых кислот или их производных и пиридоксальфосфата.
Что касается альфа-кетокарбоновых кислот, то предпочтительно они представляют собой альфакетокарбоновые кислоты, полученные из аминокислот, и в большинстве случаев они также могут быть выявлены в организме человека. Предпочтительные альфа-кетокарбоновые кислоты, полученные из аминокислот, выбирают из группы, состоящей из кето-валина, кето-лейцина, кето-изолейцина и кетоаланина. Карбоксильная группа альфа-кетокарбоновых кислот ваимодействует с группой О полимера, представляющей собой аминогруппу. При этом образуется амидная группа. Оставшаяся свободная кетогруппа альфа-кетокарбоновой кислоты затем может быть подвергнута взаимодействию с функциональной группой белка, в частности с аминогруппой. Таким образом, образуется иминогруппа, которая может быть прогидрирована.
Соответственно, настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, где полимер взаимодействует с альфа-кетокарбоновой кислотой.
Что касается сиалиловых кислот или их производных, они предпочтительно являются биосовместимыми, в частности, они представляют собой сахара, найденные в организме человека, которые являются Ν- и/или О-ацетилированными. В предпочтительном варианте осуществления, сиалиловые кислоты представляют собой Ν-ацетилированные нейраминовые кислоты. Данные соединения обладают желательной жесткостью для выполнения функции в качестве спейсера благодаря структуре пиранозы. С другой стороны, в данные соединения посредством селективного окисления можно ввести альдегидную группу. Сиалиловые кислоты выявлены в организме человека, например, в качестве концевых моносахаридов в гликановых цепях гликозилированных белков.
В предпочтительном варианте осуществления, сиалиловая кислота может быть селективно окислена с образованием альдегидной группы.
Способы селективного окисления сиалиловых кислот известны в данной области, смотри, напри
- 17 010501 мер, Ь. ^. блсщек, В. Р. Ктезсо, ^. +с11псг. СатЬоЬубтаГе ЯезеатсЬ, 83 (1980), 21-32 и Т. Мазиба, 8. 8Ь1Ьиуа, М. Лга1, 8. УозЫба, Т. Тошо/ахта, А. О1ео,М. УашазЬба, Т. Нопба, Вюотдапю8 Мебюта1 СЬешШгу Ьебегз, 13 (2003), 669-673. Предпочтительно окисление сиалиловой кислоты может быть проведено перед взаимодействием с аминогруппой полимера.
Необязательно окисленная сиалиловая кислота затем может быть подвергнута взаимодействию по группе карбоновой кислоты с аминогруппой полимера.
Полученные соединения будут содержать альдегидную группу, которая далее может быть подвергнута восстановительному аминированию с аминогруппой белка.
Соответственно, настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, где полимер взаимодействует с необязательно окисленной сиалиловой кислотой.
Что касается пиридоксальфосфата (РуР), он представляет собой высоко биосовместимое бифункциональное соединение и также называется витамин В6. РуР представляет собой кофермент, который участвует в реакциях трансаминирования, декарбоксилирования, рацемизации и многочисленных модификациях боковых цепей аминокислот. Все требующие присутствия РуР ферменты действуют через образование оснований Шиффа между аминокислотой и коферментом.
Фосфатная группа РуР может быть подвергнута взаимодействию с аминогруппой полимера, предпочтительно гидроксиалкилкрахмала, в частности гидроксиэтилкрахмала, с образованием фосфорамида. Альдегидная группа РуР затем может быть подвергнута взаимодействию с аминогруппой белка с образованием основания Шиффа, которое затем может быть восстановлено. В предпочтительном варианте осуществления, структура конъюгата представляет собой НЕ8-№Н-Р(О)2-О-(пиридоксаль)-СН-№Н-белок.
В случае РуР, функциональную группу полимера предпочтительно вводят в полимер с использованием диаминосоединения, как описано выше.
Соответственно, настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, где полимер взаимодействует с пиридоксальфосфатом.
Гидроксиэтилкрахмал, подвергаемый взаимодействию с соединением, включающим М, где М предпочтительно представляет собой карбоксильную группу или реакционнноспособную карбоксильную группу, а О представляет собой альдегидную группу или кетогруппу или группу полуацеталя; наиболее предпочтительно представляет собой гидроксиэтилкрахмал, имеющий среднюю молекулярную массу примерно 10 кДа и Ό8 примерно 0,7. Также возможно использование гидроксиэтилкрахмалов, имеющих среднюю молекулярную массу примерно 10 кДа и Ό8 примерно 0,4 или гидроксиэтилкрахмала, имеющего среднюю молекулярную массу примерно 12 кДа и Ό8 примерно 0,4, или гидроксиэтилкрахмала, имеющего среднюю молекулярную массу примерно 12 кДа и Ό8 примерно 0,7, или гидроксиэтилкрахмала, имеющего среднюю молекулярную массу примерно 18 кДа и Ό8 примерно 0,4, или гидроксиэтилкрахмала, имеющего среднюю молекулярную массу примерно 18 кДа и Ό8 примерно 0,7, или гидроксиэтилкрахмала, имеющего среднюю молекулярную массу примерно 50 кДа и Ό8 примерно 0,4, или гидроксиэтилкрахмала, имеющего среднюю молекулярную массу примерно 50 кДа и Ό8 примерно 0,7, или гидроксиэтилкрахмала, имеющего среднюю молекулярную массу примерно 100 кДа и Ό8 примерно 0,7. Особенно предпочтительно применение гидроксиалкилкрахмала и еще более предпочтительно гидроксиэтилкрахмала, имеющего восстановительный конец в виде его окисленной формы.
Полученное производное полимера, содержащее альдегидную группу или кетогруппу, или группу полуацеталя, впоследствии подвергают взаимодействию с аминогруппой белка посредством восстановительного аминирования. Что касается конденсации по меньшей мере одной аминогруппы белка с по меньшей мере одной альдегидной группой или кетогруппой, или группой полуацеталя полимера при восстановительном аминировании, то здесь следует сослаться на приведенное выше подробное описание, касающееся конкретных реакционных параметров реакции восстановительного аминирования, таких как рН и температура. В соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, в соответствии с которым в качестве белка используется С-С8Р, взаимодействие с аминогруппой белка предпочтительно проводят при температуре от от 0 до 40°С, более предпочтительно от 0 до 25°С и особенно предпочтительно от 4 до 21°С. Время реакции предпочтительно колеблется в диапазоне от 30 мин до 72 ч, более предпочтительно от 2 до 48 ч и особенно предпочтительно от 4 ч до 17 ч. В качестве растворителя для реакции предпочтительной является водная среда. Значение рН реакционной среды предпочтительно находится в диапазоне от 4 до 9, более предпочтительно от 4 до 8 и особенно предпочтительно от 4,5 до 5,5.
В соответствии с третьим предпочтительным вариантом осуществления, полимер подвергают взаимодействию по его необязательно окисленному восстановительному концу по меньшей мере с бифункциональным соединением, включающим аминогруппу М и функциональную группу Ц, где указанная аминогруппа М взаимодействует с необязательно окисленным восстановительным концом полимера, и где функциональную группу О модифицируют химически для получения производного полимера, функционализированного альдегидными группами, которое подвергают взаимодействию с аминогруппой белка путем восстановительного аминирования.
Термин «полимер подвергают взаимодействию по его восстановительному концу» или «полимер подвергают взаимодействию по его окисленному восстановительному концу», как он использован в кон
- 18 010501 тексте настоящего изобретения, может относиться к способу, в соответствии с которым гидроксиалкилкрахмал реагирует главным образом за счет его (селективно окисленного) восстановительного конца. Полимер представляет собой гидроксиалкилкрахмал, в частности гидроксиэтилкрахмал.
Термин «главным образом за счет его (селективно окисленного) восстановительного конца» относится к способам, в соответствии с которыми статистически более чем 50%, предпочтительно по меньшей мере 55%, более предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 65%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, и еще более предпочтительно по меньшей мере 95%, как например 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% молекул полимера, используемого для данной реакции взаимодействует за счет по меньшей мере одного (селективно окисленного) восстановительного конца на молекулу полимера, при этом данная молекула полимера, которая взаимодействует посредством по меньшей мере одного восстановительного конца, может в той же самой реакции реагировать по меньшей мере по одной дополнительной функциональной группе, которая содержится в указанной молекуле полимера, и которая не является восстановительным концом. Если одна или несколько молекул полимера реагируют по меньшей мере по одному восстановительному концу и одновременно по меньшей мере по одной дополнительной подходящей функциональной группе, которая содержится в данной(ых) молекуле(ах) полимера и которая не является его восстановительным концом, статистически предпочтительно, чтобы более чем 50%, предпочтительно по меньшей мере 55%, более предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 65%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, и еще более предпочтительно по меньшей мере 95%, например, 95, 96, 97, 98 или 99% всех взаимодействующих функциональных групп, где указанные функциональные группы включают восстановительные концы, представляли бы собой восстановительные концы.
Термин «восстановительный конец», как он использован в контексте настоящего изобретения, относится к концевой альдегидной группе молекулы полимера, которая может присутствовать в виде альдегидной группы и/или в виде соответствующего ацеталя. В случае, когда восстановительный конец является окисленным, альдегидная и ацетальная группа находятся в виде карбоксильной группы и/или в виде соответствующего лактона.
Что касается функциональной группы О, наряду с прочими можно отметить следующие функциональные группы:
двойные С-С-связи или тройные С-С-связи, или ароматические С-С-связи;
тиогруппу или гидроксильные группы; гидразидалкилсульфоновой кислоты; гидразидаарилсульфоновой кислоты;
1.2- диолы;
1.2- аминотиоспирты;
азиды;
1.2- аминоспирты;
аминогруппу -ΝΗ; или производные аминогрупп, включающие структурное звено -ΝΗ-, таких как аминоалкильные группы, аминоарильная группа, аминоаралкильные группы или алкариламино группы;
гидроксиламиногруппу -Ο-ΝΗ2 или производные гидроксиаминогруппы, включающие структурное звено -О-ΝΗ-, такие как гидроксилалкиламиногруппы, гидроксилариламиногруппы, гидроксиларалкиламиногруппы или гидроксилалкариламиногруппы;
алкоксиаминогруппы, арилоксиаминогруппы, аралкилоксиаминогруппы или алкарилоксиамино группы, каждая из которых включает структурное звено -ΝΗ-О-;
остатки, имеющие карбонильную группу, -О-С(=С)-М, где С представляет собой О или 8, и М представляет собой, например,
-ОН или -8Н;
алкоксильную группу, арилоксигруппу, аралкилоксигруппу или алкарилоксигруппу; алкилтиогруппу, арилтиогруппу, аралкилтиогруппу или алкарилтиогруппу;
алкилкарбонилоксигруппу, арилкарбонилоксигруппу, аралкилкарбонилоксигруппу, алкарилкарбонилоксигруппу;
активированные сложные эфиры, такие как сложные эфиры гидроксиламинов, имеющие имидную структуру, такую как Ν-гидроксисукцинимид, или имеющие структурное звено О-Ν, где Ν представляет собой часть гетероарильного соединения, или когда С = О и О отсутствует, такие арилокси соединения с замещенным арильным остатком как пентафторфенил, паранитрофенил или трихлорфенил;
где О отсутствует или представляет собой ΝΗ или гетероатом, такой как 8 или О;
-ΝΗ-ΝΗ2 или -ΝΗ-ΝΗ-;
-ЫО2;
нитрильную группу;
- 19 010501 карбонильные группы, такие как альдегидная группа или кетогруппа; карбоксильную группу;
группы -Ы=С=О или группы -Ы=С=8;
винилгалогенидные группы, такие как винилиодидная или винилбромидная группа или трифлат; -С=С-Н;
-(С-ПН2С1)-О алкил;
-группы -(С=О)-СН2-На1, где На1 представляет собой С1, Вг или I;
-СН=СН-8О2-;
дисульфидную группу, включающую структуру -8-8-;
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения термин «функциональная группа Э» относится к функциональной группе О, которая включает химическую структуру -ΝΗ-, например -ΝΗ2, или производное аминогруппы, включающее структурное звено -ΝΗ-, такое как аминоалкильная группа, аминоаралкильные группы или алкариламиногруппы.
В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения функциональная группа М представляет собой группу, имеющую структуру Β'-ΝΗ-, где В' представляет собой водород или алкильный, циклоалкильный, арильный, аралкильный, арилциклоалкильный, алкарильный или циклоалкиларильный остаток, где циклоалкильный, арильный, аралкильный, арилциклоалкильный, алкарильный или циклоалкиларильный остаток могут быть непосредственно связаны с группой ΝΗ или, в соответствии с другим вариантом осуществления, могут быть связаны посредством кислородного мостика с группой ΝΗ. Алкильный, циклоалкильный, арильный, аралкильный, арилциклоалкильный, алкарильный или циклоалкиларильный остатки могут быть подходящим образом замещенными. Что касается предпочтительных заместителей, то здесь можно отметить галогены, такие как Р, С1 или Вг. Особенно предпочтительные остатки В' представляют собой водород, алкильную и алкоксильную группы, и еще более предпочтительно представляют собой водород и незамещенную алкильную и алкоксильную группы.
Среди алкильных и алкоксильных групп, группы, содержащие 1, 2, 3, 4, 5, или 6 атомов С, являются предпочтительными. Более предпочтительными являются метильная, этильная, пропильная, изопропильная, метоксильная, этоксильная, пропоксильная и изопропоксильная группы. Особенно предпочтительными являются метил, этил, метокси, этокси, и особое предпочтение отдается метилу или метокси.
В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения, функциональная группа М имеет структуру Β'-ΝΗ-Β-, где В предпочтительно включает структурное звено -ΝΗ- и/или структурное звено -(С=С)-, где С представляет собой О или 8, и/или структурное звено -8О2;-. Конкретными примерами функциональной группы В являются
НН ,ν/γ.
<3<3 и
о и Ν-δ— Н II
О
где если С присутствует дважды, то он независимо представляет собой О или 8.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгатам, как отмечено выше, где функциональную группу М выбирают из группы, состоящей из η2Ν-
где С представляет собой О или 8, и, если присутствует дважды, независимо представляет собой О или 8, и Β' представляет собой метил.
В соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения функциональная группа М представляет собой аминогруппу -ΝΗ2.
В соответствии с первой альтернативой, функциональная группа М, представляющая собой аминогруппу -ΝΗ2, взаимодействует с окисленным восстановительным концом полимера, приводя к связыва- 20 010501 нию полимера и соединения, включающего группы М и О посредством амидной связи.
В соответствии со второй альтернативой, функциональная группа М, представляющая собой аминогруппу -ΝΗ2, взаимодействует с окисленным восстановительным концом полимера посредством восстановительного аминирования, приводя к образованию иминогруппы, которую впоследствии предпочтительно гидрируют с получением аминогруппы, иминогруппа и аминогруппа, соответственно, связывают полимер и соединение, включающее группы М и О. В данном случае возможно, чтобы функциональная группа О представляла собой аминогруппу. В том случае, если полученное производное полимера будет подвергнуто последующей реакции по меньшей мере с бифункцональным соединением с участием карбоксильной группы или реакционноспособной карбоксильной группы, как описано далее, или другой группы по меньшей мере бифункционального соединения, которую нужно подвергнуть взаимодействию с аминогруппой, является предпочтительным, чтобы соединение, включающее М и О, представляло собой первичный амин, который содержит в качестве функциональной группы только одну аминогруппу. В данном конкретном случае, хотя соединение содержит только одну функциональную группу, оно рассматривается как бифункциональное соединение, включающее М и О, где М представляет собой аминогруппу, содержащуюся в соединении, которое подвергли восстановительному аминированию по восстановительному концу полимера, и где О представляет собой вторичную аминогруппу, возникающую в результате восстановительного аминирования и последующего гидрирования.
В соответствии с третьей альтернативой, неокисленный восстановительный конец полимера подвергают взаимодействию с аммиаком посредством восстановительного аминирования, приводящего к образованию концевой аминигруппы полимера, которую впоследствии предпочтительно гидрируют с получением терминальной аминогруппы полимера и, таким образом, получают терминальную первичную аминогруппу. В данном конкретном случае аммиак рассматривают как бифункциональное соединение, включающее М и О, где М представляет собой ΝΗ2, содержащуюся в используемом аммиаке, и где О представляет собой первичную аминогруппу, возникающую в результате восстановительного аминирования и последующего гидрирования.
Термин «аминогруппа р» относится к функциональной группе О, которая включает химическую структуру ΝΗ-, например -ΝΗ2, или к производному аминогруппу, включающему структурное звено -ΝΗ-, такому как аминоалкильные группы, аминоарильная группа, аминоаралкильная группа или алкариламино группы.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, функциональная группа О представляет собой группу, имеющую структуру Р'-ΝΗ-, где Р' представляет собой водород или алкильный, циклоалкильный, арильный, аралкильный, арилциклоалкильный, алкарильный или циклоалкиларильный остаток, где циклоалкильный, арильный, аралкильный, арилциклоалкильный, алкарильный или циклоалкиларильный остаток может быть связан непосредственно с группой ΝΗ или, в соответствии с другим вариантом осуществления, могут быть связаны посредством кислородного мостика с группой ΝΗ. Алкильный, циклоалкильный, арильный, аралкильный, арилциклоалкильный, алкарильный или циклоалкиларильный остатки могут быть подходящим образом замещенными. Что касается предпочтительных заместителей, то здесь можно отметить галогены, такие как Е, С1 или Вг. Особенно предпочтительные остатки Р' представляют собой водород, алкильную и алкоксильную группы, и еще более предпочтительно представляют собой водород и незамещенную алкильную и алкоксильную группы.
Среди алкильных и алкоксильных групп, группы, содержащие 1, 2, 3, 4, 5, или 6 атомов С, являются предпочтительными. Более предпочтительными являются метильная, этильная, пропильная, изопропильная, метоксильная, этоксильная, пропоксильная и изопропоксильная группы. Особенно предпочтительными являются метил, этил, метокси, этокси, и особое предпочтение отдается метилу или метокси.
В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения, функциональная группа О имеет структуру Ρ'-ΝΗ-Ρ-, где Р предпочтительно включает структурное звено -ΝΗ- и/или структурное звено -(С=С)-, где С представляет собой О или 8, и/или структурное звено -8О2-. В соответствии с более предпочтительными вариантами осуществления, функциональную группу Р выбирают из группы, состоящей из
где если С присутствует дважды, то он независимо представляет собой О или 8.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как отмечено выше, где функциональную группу О выбирают из группы, состоящей из
С где С представляет собой О или 8, и, если присутствует дважды, независимо представляет собой О или 8, и Р' представляет собой метил.
- 21 010501
В соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, функциональная группа О представляет собой аминогруппу -ΝΉ2.
В соответствии со следующим предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, оба М и О включают аминогруппу -ΝΉ-. В соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществления, оба М и О представляют собой аминогруппу -ΝΉ2.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, соединение, включающее М и ф, представляет собой гомобифункциональное соединение, более предпочтительно гомобифункциональное соединение, включающее в качестве функциональных групп М и О наиболее предпочтительно аминогруппу -ΝΉ2, или в соответствии с другими вариантами осуществления, гидроксиламиногруппу Ό-Ν^ или группу
где С предпочтительно представляет собой О. Конкретными примерами данных соединений, включающих М и О являются
или или
Гидроксиэтилкрахмал, который подвергают взаимодействию с соединением, включающим М, где М предпочтительно представляет собой аминогруппу -ΝΉ-, и более предпочтительно представляет собой аминогруппу -ΝΉ2, еще более предпочтительно оба М и О включают аминогруппу -ΝΉ-, и особенно предпочтительно оба М и О включают аминогруппу -ΝΉ2, предпочтительно представляет собой гидроксиэтилкрахмал, имеющий среднюю молекулярную массу примерно 10 кДа и Ό8 примерно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий среднюю молекулярную массу примерно 10 кДа и Ό8 примерно 0,7. Также возможно использованием гидроксиэтилкрахмалов, имеющих среднюю молекулярную массу примерно 12 кДа и Ό8 примерно 0,4, или гидроксиэтилкрахмала, имеющего среднюю молекулярную массу примерно 12 кДа и Ό8 примерно 0,7, или гидроксиэтилкрахмала, имеющего среднюю молекулярную массу примерно 18 кДа и Ό8 примерно 0,4, или гидроксиэтилкрахмала, имеющего среднюю молекулярную массу примерно 18 кДа и Ό8 примерно 0,7, или гидроксиэтилкрахмала, имеющего среднюю молекулярную массу примерно 50 кДа и Ό8 примерно 0,4 или гидроксиэтилкрахмала, имеющего среднюю молекулярную массу примерно 50 кДа и Ό8 примерно 0,7, или гидроксиэтилкрахмала, имеющего среднюю молекулярную массу примерно 100 кДа и Ό8 примерно 0,7.
В том случае, когда оба М и О представляют собой аминогруппу -ΝΉ2, М и О могут быть разделены любым подходящим спейсером. Среди других, спейсер может представлять собой необязательно замещенный, линейный, разветвленный и/или циклический углеводородный остаток. Обычно углеводородный остаток содержит от 1 до 60, предпочтительно от 1 до 40, более предпочтительно от 1 до 20, более предпочтительно от 2 до 10, более предпочтительно от 2 до 6 и особенно предпочтительно от 2 до 4 атомов углерода. Если присутствуют гетероатомы, разделяющая группа включает обычно от 1 до 20, предпочтительно от 1 до 8 и особенно предпочтительно от 1 до 4 гетероатомов. Углеводородный остаток может включать необязательно разветвленную алкильную цепь, или арильную группу, или циклоалкильную группу, например, содержащую от 5 до 7 атомов углерода, или представлять собой аралкильную группу, алкарильную группу, где алкильная часть может представлять собой линейную и/или циклическую алкильную группу. В соответствии с еще более предпочтительным вариантом осуществления, уг
- 22 010501 леводородный остаток представляет собой алкильную цепь, содержащую от 1 до 20, предпочтительно от 2 до 10, более предпочтительно от 2 до 6 и особенно предпочтительно от 2 до 4 атомов углерода.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, где полимер взаимодействует с 1,4-диаминобутаном, 1,3-диаминопропаном или 1,2-диаминоэтаном, образуя производное полимера.
Взаимодействие по меньшей мере бифункционального соединения, включающего М и О. с полимером предпочтительно проводят при температуре от 0 до 100°С, более предпочтительно от 4 до 80°С и особенно предпочтительно от 20 до 80°С; время реакции предпочтительно колеблется от 4 ч до 7 дней, более предпочтительно от 10 ч до 5 дней и особенно предпочтительно от 17 до 4 ч. Молярное соотношение, по меньшей мере, бифункциональное соединение: полимер предпочтительно находится в диапазоне от 10 до 200, в частности от 50 до 100.
Растворитель для реакции, по меньшей мере, бифункционального соединения с полимером предпочтительно представляет собой по меньшей мере один апротонный растворитель, предпочтительно безводный апротонный растворитель, имеющий содержание воды не более чем 0,5 процента по весу, предпочтительным является содержание воды не более чем 0,1 процента по весу. Подходящими растворителями являются, наряду с прочими, диметилсульфоксид (ДМСО), Ν-метилпирролидон, диметилацетамид (ДМА), диметилформамид (ДМФ) и смеси двух или более из них.
В качестве растворителя для реакции, по меньшей мере, бифункционального соединения с полимером также можно использовать водную среду.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления производное полимера, включающее полимер и, по меньшей мере, бифункциональное соединение, химически модифицируют по свободной функциональной группе О с получением производного полимера, включающим альдегидную группу или кетогруппу, или группу полуацеталя. В соответствии с этим вариантом осуществления является предпочтительным подвергнуть производное полимера взаимодействию с по меньшей мере одним бифункциональным соединением, которое содержит функциональную группу, способную взаимодействовать с функциональной группой ф, и альдегидную группу или кетогруппу, или группу полуацеталя.
В качестве, по меньшей мере, бифункционального соединения подходящим является каждое соединение, которое содержит альдегидную группу или кетогруппу, или группу полуацеталя, и по меньшей мере одну функциональную группу, которая способна образовывать связь с функциональной группой О производного полимера. По меньшей мере одну функциональную группу выбирают из того же набора функциональных групп, что и ф, и выбирают так, чтобы она была способна взаимодействовать с О. В предпочтительном случае О представляет собой аминогруппу -ΝΗ2, или производное аминогруппы, включающее структурное звено -ΝΗ-, такое как аминоалкильные группы, аминоарильная группа, аминоаралкильные группы, или алкариламино группы.
Предпочтительным является использование соединения, содержащего, не считая альдегидной группы или кетогруппы, или группы полуацеталя, по меньшей мере одну карбоксильную группу или по меньшей мере одну реакционноспособную карбоксильную группу, предпочтительно одну карбоксильную группу или одну реакционноспособную карбоксильную группу. Альдегидная группа или кетогруппа, или группа полуацеталя и карбоксильная группа или реакционноспособная карбоксильная группа могут быть разделены любым подходящим спейсером. Среди других, спейсер может представлять собой необязательно замещенный, линейный, разветвленный и/или циклический углеводородный остаток. Обычно углеводородный остаток содержит от 1 до 60, предпочтительно от 1 до 40, более предпочтительно от 1 до 20, более предпочтительно от 2 до 10, более предпочтительно от 2 до 6 и особенно предпочтительно от 2 до 4 атомов углерода. Если присутствуют гетероатомы, разделяющая группа включает обычно от 1 до 20, предпочтительно от 1 до 8 и особенно предпочтительно от 1 до 4 гетероатомов. Углеводородный остаток может включать необязательно разветвленную алкильную цепь, или арильную группу, или циклоалкильную группу, содержащую от 5 до 7 атомов углерода, или представлять собой аралкильную группу, алкарильную группу, где алкильная часть может представлять собой линейную и/или циклическую алкильную группу.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, углеводородный остаток представляет собой алкильную группу, содержащую от 2 до 6 и предпочтительно от 2 до 4 атомов углерода. Также возможно, чтобы между альдегидной или кетогруппой и карбоксильной группой атома углерода не присутствовал. Альтернативно, углеводородный остаток может представлять собой замещенную или незамещенную циклическую углеводородную группу, содержащую от 3 до 11 атомов углерода, предпочтительно от 3 до 6 или от 3 до 5 атомов углерода. Когда циклическая углеводородняа группа является замещенной, заместитель может быть выбран из группы, состоящей из замещенных или незамещенных амино или алкоксильных групп. Число заместителей, если они присутствуют, предпочтительно составляет от 1 до 3. Кроме того, алкильная и/или циклическая углеводородная группа может содержать один или несколько гетероатомов, таких как О или 8, в частности О. В таком случае предпочтительно присутствует от 1 до 3, в частности 1 или 2 гетероатома. Предпочтительными соединениями в данном контексте являются те, которые выбраны из следующей группы соединений.
- 23 010501
3 О
11
В= Н, алкил, арил, ацил, 81В'3 В' = алкил, арил.
В соответствии с еще более предпочтительным вариантом осуществления, углеводородный остаток представляет собой арильный остаток, имеющий от 5 до 7 и предпочтительно 6 атомов углерода. Наиболее предпочтительно углеводородный остаток представляет собой остаток бензола. В соответствии с данным предпочтительным вариантом осуществления карбоксильная группа и альдегидная группа могут быть расположены в бензольном кольце в 1,4-положении, 1,3-положении или 1,2-положении, где положение 1,4 является предпочтительным.
В качестве реакционноспособной карбоксильной группы можно отметить реакционноспособный сложный эфир, изотиоцианаты и изоцианаты. Предпочтительные реакционноспособные сложные эфиры являются производными Ν-гидроксисукцинимидов, таких как Ν-гидроксисукцинимид или сульфо-Νгидроксисукцинимид, подходящим образом замещенных фенолов, таких как п-нитрофенол, о,пдинитрофенол, о,о'-динитрофенол, трихлорфенол, такой как 2,4,6-трихлорфенол или 2,4,5-трихлорфенол, трифторфенол, такой как 2,4,6-трифторфенол или 2,4,5-трифторфенол, пентахлорфенол, пентафторфенол, или гидроксиазолов, таких как гидроксибензотриазол. Особенно предпочтительными являются Νгидроксисукцинимиды, где Ν-гидроксисукцинимид или сульфо-И-гидроксисукцинимид являются особенно предпочтительными. Все спирты можно использовать по отдельности или в виде подходящей комбинации двух или более из них. В качестве реакционноспособных сложных эфиров пентафторфениловый сложный эфир и сложный эфир Ν-гидроксисукцинимида являются особенно предпочтительными.
В соответствии с конкретным вариантом осуществления функциональная группа, которая способна образовывать химическую связь с функциональной группой О, где О предпочтительно представляет собой Ν42 или производное аминогруппы, включающее структурное звено -ΝΉ-, такое как аминоалкильные группы, аминоарильная группа, аминоаралкильные группы или алкариламиногруппы, в частности представляет собой КН2, представляет собой реакционноспособную карбоксильную группу.
В данном случае функциональную группу, которая способна образовывать химическую связь с функциональной группой О, и которая представляет собой карбоксильную группу, подходящим образом подвергают взаимодействию с получением реакционноспособной карбоксильной группы. Следовательно, предпочтительным является подвергание взаимодействию по меньшей мере одного по меньшей мере бифункционального соединения, которое включает карбоксильную группу и альдегидную группу, или кетогруппу или группу полуацеталя, в котором карбоксильная группа преобразуется в реакционноспособную карбоксильную группу и полученное по меньшей мере бифункциональное соединение очищают и подвергают взаимодействию с функциональной группой О производного полимера.
Конкретными примерами по меньшей мере бифункционального соединения, включающего карбоксильную группу, которое может быть подвергнуто взаимодействию для получения реакционноспособной карбоксильной группы, являются соединения 1-11 из вышеуказанного списка. В данном контексте, термин «карбоксильная группа» также относится к лактону и внутреннему ангидриду дикарбоновой кислоты.
Таким образом, согласно предпочтительному варианту осуществления настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, где производное полимера, включающее О, где О представляет собой КН- или производное аминогруппы, включающее структурное звено -ΝΉ-, такое как аминоалкильные группы, аминоарильная группа, аминоаралкильные группы или алкариламино группы дополнительно подвергают взаимодействию с формилбензойной кислотой.
В соответствии с другим вариантом осуществления, настоящее изобретение относится к способу и
- 24 010501 конъюгату, как описано выше, где производное полимера, включающее О. где О представляет собой аминогруппу, дополнительно подвергают взаимодействию с пентафторфениловым эфиром формилбензойной кислоты.
В соответствии с другим вариантом осуществления, настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, где производное полимера, включающее О, где О представляет собой аминогруппу, дополнительно подвергают взаимодействию с Ν-гидроксисукцинимидным эфиром формилбензойной кислоты.
В соответствии с еще одним вариантом осуществления, настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, где производное полимера, включающее О, где О представляет собой аминогруппу, дополнительно подвергают взаимодействию с 4-(4-формил-3,5-диметоксифенокси) бутановой кислотой.
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления, настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, где полимер подвергают взаимодействию с бифункциональным соединением, которое представляет собой биосовместимое соединение, выбранное из группы, состоящей из альфа-кетокарбоновых кислот, сиалиловых кислот или их производных и пиридоксальфосфата.
Что касается альфа-кетокарбоновых кислот, то предпочтительно они представляют собой альфакетокарбоновые кислоты, полученные из аминокислот, и в большинстве случаев они также могут быть выявлены в организме человека.
Предпочтительные альфа-кетокарбоновые кислоты, полученные из аминокислот, выбирают из группы, состоящей из кето-валина, кето-лейцина, кето-изолейцина и кето-аланина. Карбоксильная группа альфа-кетокарбоновых кислот ваимодействует с группой О полимера, представляющей собой аминогруппу. При этом образуется амидная группа. Оставшаяся свободная кетогруппа альфа-кетокарбоновой кислоты затем может быть подвергнута взаимодействию с функциональной группой белка, в частности с аминогруппой. Таким образом, образуется иминогруппа, которая может быть подвергнута гидрированию.
Соответственно, настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, где полимер взаимодействует с альфа-кетокарбоновой кислотой.
Что касается сиалиловых кислот или их производных, они предпочтительно являются биосовместимыми, в частности, они представляют собой сахара, найденные в организме человека, которые являются Ν- и/или О-ацетилированными. В предпочтительном варианте осуществления, сиалиловые кислоты представляют собой Ν-ацетилированные нейраминовые кислоты. Данные соединения обладают желательной жесткостью для выполнения функции в качестве спейсера благодаря структуре пиранозы. С другой стороны, в данные соединения посредством селективного окисления можно ввести альдегидную группу. Сиалиловые кислоты выявлены в организме человека, например, в качестве концевых моносахаридов в гликановых цепях гликозилированных белков.
В предпочтительном варианте осуществления, сиаловая кислота может быть селективно окислена с образованием альдегидной группы.
Способы селективного окисления сиалиловых кислот известны в данной области, например, из публикаций Ь. ^. 1адиез, В. Р. Шезсо, ^. ^ейпег, СагЬоЬубга1е РезеагсЬ, 83 (1980), 21-32 и Т. Мазиба, 8. 8ЫЬиуа, М. Ага1, 8. ΥοзЫба, Т. Тотохама, А. ОЬпо, М. ΥатазЫίа, Т. Нопба, Вюогдапю & Мебюта1 СЬетзйу Ьейегз, 13 (2003), 669-673. Предпочтительно окисление сиалиловой кислоты может быть проведено перед взаимодействием с аминогруппой полимера.
Необязательно окисленная сиалиловая кислота затем может быть подвергнута взаимодействию по группе карбоновой кислоты с аминогруппой полимера.
Полученные соединения содержат альдегидную группу, которая далее может взаимодействовать с аминогруппой белка при восстановительном аминировании.
Соответственно, настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, где полимер взаимодействует с необязательно окисленной сиалиловой кислотой.
Что касается пиридоксальфосфата (РуР), он представляет собой высоко биосовместимое бифункциональное соединение и также называется витамин В6. РуР представляет собой кофермент, который участвует в реакциях трансаминирования, декарбоксилирования, рацемизации и многочисленных модификациях боковых цепей аминокислот. Все требующие присутствия РуР ферменты действуют через образование оснований Шиффа между аминокислотой и коферментом.
Фосфатная группа РуР может быть подвергнута взаимодействию с аминогруппой полимера, предпочтительно гидроксиалкилкрахмала, в частности гидроксиэтилкрахмала, с образованием фосфорамида. Альдегидная группа РуР затем может быть подвергнута взаимодействию с аминогруппой белка с образованием основания Шиффа, которое затем может быть восстановлено. В предпочтительном варианте осуществления, структура конъюгата представляет собой НЕ8-ХН-Р(О)2-О-(пиридоксаль)-СН-ХН-белок.
В случае РуР, функциональную группу полимера предпочтительно вводят в полимер с использованием диаминосоединения, как описано выше.
Соответственно, настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, где
- 25 010501 полимер взаимодействует с пиридоксальфосфатом.
В качестве растворителя для реакции производного полимера, включащего аминогруппу, например, с формилбензойной кислотой, предпочтительным является по меньшей мере один апротонный растворитель или по меньшей мере один полярный растворитель. Подходящими растворителями являются, наряду с прочими, диметилсульфоксид (ДМСО), Ν-метилпирролидон, диметилацетамид (ДМА), диметилформамид (ДМФ) и смеси двух или более из них.
В качестве растворителя для реакции производного полимера, включащего аминогруппу, по меньшей мере, с бифункциональным соединением, включающим карбоксильную группу, также можно использовать водную среду. Термин «водная среда», как он использован в контексте настоящего изобретения, относится к растворителю или к смеси растворителей, включающих воду в диапазоне от по меньшей мере 10% по весу, или по меньшей мере 20% по весу, или по меньшей мере 30% по массе, или по меньшей мере 40% по массе, или по меньшей мере 50% по массе, или по меньшей мере 60% по массе, или по меньшей мере 70% по массе, или по меньшей мере 80% по массе, или по меньшей мере 90% по массе, или до 100% по массе из расчета на массу включенных растворителей.
Реакцию предпочтительно проводят при температуре от 0 до 40°С, более предпочтительно от 0 до 25°С и особенно предпочтительно от 15 до 25°С в течение времени реакции предпочтительно от 0,5 до 24 ч и особенно предпочтительно от 1 до 17 ч.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления реакцию проводят в присутствии активирующего агента. Подходящими активирующими агентами, наряду с прочими, являются карбодиимиды, такие как диизопропилкарбодиимид (Э1С), дициклогексилкарбодиимид (ОСС), 1-этил-3-(3диметиламинопропил)карбодиимид (БОС), где диизопропилкарбодиимид (Э1С) является особенно предпочтительным.
Полученное производное полимера может быть очищено от реакционной смеси с использованием по меньшей мере одного подходящего способа. При необходимости, производное полимера может быть осаждено перед выделением с использованием по меньшей мере одного подходящего способа.
Если производное полимера первоначально осаждают, это возможно, например, при контакте реакционной смеси по меньшей мере с одним растворителем, или смесью растворителей, отличающихся от растворителя или смеси растворителей, присутствующих в реакционной смеси, при подходящей температуре. В соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, где в качестве растворителя используют водную среду, предпочтительно воду, реакционную смесь приводят в контакт с 2-пропанолом или со смесью ацетона и этанола, предпочтительно смесью в соотношении 1:1 (об./об.), указывающем на равные объемы указанных соединений, при температуре предпочтительно в диапазоне от -20 до +50°С и особенно предпочтительно в диапазоне от -20 до 25°С.
Выделение производного полимера можно проводить с использованием подходящего способа, который может включать одну или более стадий. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, производное полимера первоначально отделяют от реакционной смеси или от смеси реакционной смеси с, например, водным 2-пропанолом, с использованием подходящего способа, такого как центрифугирование или фильтрование. На второй стадии, отделенное производное полимера может быть подвергнуто дополнительной обработке, такой как последующая обработка, как, например, диализ, центрифужное фильтрование или фильтрование под давлением, ионообменная хроматография, хроматография с обращенной фазой, ВЭЖХ, МЭЖХ, гель-фильтрование и/или лиофилизация. В соответствии с еше более предпочтительным вариантом осуществления, отделенное производное полимера первоначально подвергают диализу, предпочтительно против воды, а затем лиофилизуют до тех пор, пока содержание растворителя в реакционном продукте не станет достаточно низким в соответствии с желательными характеристиками продукта. Лиофилизацию можно проводить при температуре от 20 до 35°С, предпочтительно от 20 до 30°С.
Полученное производное полимера с альдегидной группой или кетогруппой, или группой полуацеталя впоследствии подвергают взаимодействию с аминогруппой белка посредством восстановительного аминирования. Что касается связывания по меньшей мере одной аминогруппы белка с по меньшей мере одной альдегидной группой или кетогруппой, или группой полуацеталя полимера посредством восстановительного аминирования, здесь следует сослаться на приведенное выше подробное описание, касающееся специфических реакционных параметров реакции восстановительного аминирования, таких как рН и температура. В соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, в соответствии с которым в качестве белка используют С-СЗЕ. восстановительное аминирование проводят при температуре от 0 до 10°С, например от 1 до 8°С или от 2 до 6°С, например примерно при 4°С и при рН примерно от 4,5 до 5,5, например примерно при 5,0. Время реакции составляет примерно от 10 до 20 ч, например от 12 до 19 ч или от 14 до 18 ч, например примерно 17 ч, или примерно от 20 до 30 ч, например примерно 24 ч. В соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, в соответствии с которым в качестве белка используют гЫЬ 2, гЫЬ 3, 1Ί1ΙΕΝ альфа, гЫЕЫ бета, γΙιΕΡΘ. γΙιΑΤ III, ΒδΑ, миоглобин и δΘΌ, восстановительное аминирование предпочтительно проводят при температуре от 0 до 5°С, например примерно при 4°С и при рН примерно от 4,5 до 5,5, например примерно при 5,0, при времени реакции примерно от 20 до 30 ч, например при
- 26 010501 мерно 24 ч.
Таким образом, в соответствии с вышеуказанными предпочтительными вариантами осуществления настоящее изобретение также относится в том случае, когда полимер подвергают взаимодействию по его окисленному восстановительному концу, к конъюгату, соответствующему формуле
В соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществления полимер представляет собой гидроксиэтилкрахмал, т.е. НА8' представляет собой НЕ8', и п = 2, 3 или 4, наиболее предпочтительно 4, как описано выше. Следовательно, в том случае, когда полимер подвергали взаимодействию по его окисленному восстановительному концу, настоящее изобретение также относится к конъюгату, соответствующему формуле
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления, настоящее изобретение также относится, в том случае, когда полимер подвергали взаимодействию по его окисленному восстановительному концу, к конъюгату, соответствующему формуле
где п = 2, 3 или 4, Я4 независимо представляет собой водород или метоксильную группу, и т = 0 в том случае, когда Я4 представляет собой водород, и т = 1 в случае, когда В4 представляет собой метокси, НА8 предпочтительно представляет собой НЕ8'.
В каждой из вышеуказанных формул азот, связанный с белком, появляется из аминогруппы белка, с которым производное полимера связано через альдегидную группу.
Что касается вышеуказанных вариантов осуществления, в соответствии с которыми функциональные группы М и О включают аминогруппу -ΝΉ2, также возможно, что М представляет собой аминогруппу -ИН2, а О включает бета-гидрокси аминогруппу -СН(ОН)-СН2-NН2 и предпочтительно представляет собой бета-гидроксиаминогруппу.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, где аминогруппа О соединения, включающего две аминогруппы М и β, представляет собой бетагидрокси аминогруппу -СН(ОН)-СН2-NН2.
В таком случае М и О могут быть разделены любым подходящим спейсером. Среди других, спейсер может представлять собой необязательно замещенный, линейный, разветвленный и/или циклический углеводородный остаток. Обычно углеводородный остаток содержит от 1 до 60, предпочтительно от 1 до 40, более предпочтительно от 1 до 20, более предпочтительно от 2 до 10, более предпочтительно от 1 до 6 и особенно предпочтительно от 1 до 2 атомов углерода. Если присутствуют гетероатомы, разделяющая группа включает обычно от 1 до 20, предпочтительно от 1 до 8 и особенно предпочтительно от 1 до 4 гетероатомов. Углеводородный остаток может включать необязательно разветвленную алкильную цепь, или арильную группу, или циклоалкильную группу, содержащую от 5 до 7 атомов углерода, или представлять собой аралкильную группу, алкарильную группу, где алкильная часть может представлять собой линейную и/или циклическую алкильную группу. В соответствии с еще более предпочтительным вариантом осуществления, углеводородный остаток представляет собой алкильную цепь, содержащую от 1 до 20, предпочтительно от 1 до 10, более предпочтительно от 1 до 6, более предпочтительно от 1 до 4 атомов углерода и особенно предпочтительно от 1 до 2 атомов углерода. Еще более предпочтительно, М и О разделены метиленовой группой.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, где полимер взаимодействует с 1,3-диамино-2-гидроксипропаном.
В случае, когда полимер реагирует по его окисленному восстановительному концу, производное полимера соответствует формуле
- 27 010501
которая особенно предпочтительна при НАБ' = НЕБ'.
Взаимодействие по меньшей мере бифункционального соединения, включающего М и О, предпочтительно 1,3-диамино-2-гидроксипропана с полимером предпочтительно проводят при температуре от 40 до 120°С, более предпочтительно от 40 до 90°С и особенно предпочтительно от 60 до 80°С. Время реакции предпочтительно колеблется от 17 до 168 ч, более предпочтительно от 17 до 96 ч и особенно предпочтительно от 48 до 96 ч. Молярное соотношение по меньшей мере бифункциональное соединение : полимер предпочтительно находится в диапазоне от 200:1 до 10:1, в частности от 50:1 до 100:1.
Растворитель для реакции по меньшей мере бифункционального соединения с полимером предпочтительно представляет собой по меньшей мере один апротонный растворитель, предпочтительно безводный апротонный растворитель, имеющий содержание воды не более чем 0,5 процента по весу, предпочтительным является содержание воды не более чем 0,1 процента по весу. Подходящими растворителями являются, наряду с прочими, диметилсульфоксид (ДМСО), Ν-метилпирролидон, диметилацетамид (ДМА), диметилформамид (ДМФ) и смеси двух или более из них.
Бета-гидроксиаминогруппа О производного полимера может взаимодействовать, по меньшей мере, с бифункциональным соединением, включающим по меньшей мере одну функциональную группу, способную взаимодействовать с О, и дополнительно включающим по меньшей мере одну функциональную группу, представляющую собой альдегидную группу или кетогруппу, или группу полуацеталя, или функциональную группу, которую можно модифицировать с образованием альдегидной группы или кетогруппы, или группы полуацеталя. В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения бета-гидрокси аминогруппу непосредственно модифицируют химически с получением альдегидной группы посредством химического окисления.
Данное окисление может быть осуществлено с использованием всех подходящих окислителей, которые способны преобразовывать бета-гидрокси аминогруппу в альдегидную группу. Предпочтительные окислители представляют собой периодаты, такие как периодаты щелочных металлов. Особенно предпочтительным является периодат натрия, который предпочтительно используется в водном растворе. Данный раствор предпочтительно имеет концентрацию периодата от 1 до 50 мМ, более предпочтительно от 1 до 25 мМ и особенно предпочтительно от 1 до 10 мМ. Окисление проводят при температуре от 0 до 40°С, предпочтительно от 0 до 25°С и особенно предпочтительно от 4 до 20°С.
Полученное производное полимера может быть очищено от реакционной смеси с использованием по меньшей мере одного подходящего способа. При необходимости, производное полимера может быть осаждено перед выделением с использованием по меньшей мере одного подходящего способа.
Если производное полимера первоначально осаждают, это возможно, например, при контакте реакционной смеси по меньшей мере с одним растворителем или смесью растворителей, отличающихся от растворителя или смеси растворителей, присутствующих в реакционной смеси, при подходящей температуре. В соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, где в качестве растворителя используют водную среду, предпочтительно воду, реакционную смесь приводят в контакт с 2-пропанолом или со смесью ацетона и этанола, предпочтительно смесью в соотношении 1:1 (об./об.), указывающем на равные объемы указанных соединений, при температуре предпочтительно в диапазоне от -20 до +50°С и особенно предпочтительно в диапазоне от -20 до 25°С.
Выделение производного полимера можно проводить с использованием подходящего способа, который может включать одну или более стадий. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, производное полимера первоначально отделяют от реакционной смеси или от смеси реакционной смеси с, например, водным 2-пропанолом, с использованием подходящего способа, такого как центрифугирование или фильтрование. На второй стадии, отделенное производное полимера может быть подвергнуто дополнительной обработке, такой как последующая обработка, как например диализ, центрифужное фильтрование или фильтрование под давлением, ионообменная хроматография, хроматография с обращенной фазой, ВЭЖХ, МЭЖХ, гель-фильтрование и/или лиофилизация. В соответствии с еше более предпочтительным вариантом осуществления, отделенное производное полимера первоначально подвергают диализу, предпочтительно против воды, а затем лиофилизуют до тех пор, пока содержание растворителя в реакционном продукте не станет достаточно низким в соответствии с желательными характеристиками продукта. Лиофилизацию можно проводить при температуре от 20 до 35°С, предпочтительно от 20 до 30°С.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, где окисление бета-гидроксиаминогруппы О проводят с использованием периодата.
- 28 010501
Таким образом. настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату. как описано выше.
где при использовании полимера с окисленным восстановительным концом производное полимера.
имеющее бета-гидроксиаминогруппу. особенно предпочтительно
ОК,
н / 1
НА5< о х! л-он н он
* 1 -Ν-, ΝΗ.
н ОК3 II
н О
и особенно с НА8'=НЕ8'. окисляют. предпочтительно с использованием периодата с получением призводного полимера. содержащего альдегидную группу. особенно предпочтительно
и в частности с НА8'=НЕ8'.
В соответствии с настоящим изобретение также возможно проводить взаимодействие соединения. включающего указанную выше 1-амино-2-гидрокси структуру. по меньшей мере. с бифункциональным соединением. включающим карбоксильную группу или реакционноспособную карбоксильную группу и альдегидную. кето. или ацетальную группу. описанные выше. с получением производного полимера. который может быть подвергнут восстановительному аминированию с аминогруппой белка.
Полученное производное полимера с альдегидной группой А затем подвергают взаимодействию с белком. Следовательно. настоящее изобретение также относится к способу получения конъюгата. как описано выше. где указанный способ включает взаимодействие производного полимера. имеющего бета гидрокси аминогруппу. в случае. когда использовали полимер с окисленным восстановительным концом. особенно предпочтительно полимер. соответствующий формуле
и особенно с НА8'=НЕ8'. с аминогруппой белка.
Полученное производное полимера с альдегидной группой впоследствии подвергают взаимодействию с аминогруппой белка посредством восстановительного аминирования. Что касается связывания по меньшей мере одной аминогруппы белка с по меньшей мере одной альдегидной группой полимера посредством восстановительного аминирования. здесь следует сослаться на приведенное выше подробное описание.
Таким образом. в соответствии с вышеуказанным предпочтительным вариантом осуществления. настоящее изобретение также относится к конъюгату. соотвествующему формуле
и особенно с НА8'=НЕ8'. в том случае. когда используется полимер с окисленным восстановительным концом. В вышеуказанной формуле. азот. присоединенный к белку. имеет происхождение из аминогруппы белка. с которой полимер связан через альдегидную группу.
В соответствии со следующим вариантом осуществления. настоящего изобретения. полимер первоначально подвергают взаимодействию с подходящим соединением с получением первого производного полимера. включающего по меньшей мере одну реакционноспособную карбоксильную группу. Данное первое производное полимера затем подвергают взаимодействию с дополнительным. по меньшей мере. бифункциональным соединением. где по меньшей мере одна функциональная группа дополнительного соединения взаимодействует по меньшей мере с одной реакционной карбоксильной группой производного полимера и по меньшей мере одна другая функциональная группа дополнительного соединения представляет собой альдегидную группу или кетогруппу. или группу полуацеталя. или представляет со
- 29 010501 бой функциональную группу, которую химически модифицируют с получением альдегидной группы или кетогруппы, или группы полуацеталя, и где полученное производное полимера, включающее указанную альдегидную группу или кетогруппу, или группу полуацеталя, взаимодействует посредством восстановительного аминирования, как описано выше, с по меньшей мере одной аминогруппой белка. Также можно изменить последовательность взаимодействия соответствующих соединений друг с другом.
В соответствии с первой альтернативой указанного следующего варианта осуществления, полимер, включающий по меньшей мере одну реакционноспособную карбоксильную группу, получают селективным окислением полимера по его восстановительному концу и последующим взаимодействием окисленного полимера, представляющего собой лактон
и/или карбоновую кислоту
или подходящую соль карболовой кислоты, такую как соль щелочного металла, предпочтительно соль натрия и/или калия, и где НА8' предпочтительно представляет собой НЕ8', с подходящим соединением с получением полимера, включающего по меньшей мере одну реакционноспособную карбоксильную группу.
Окисление полимера, предпочтительно гидроксиэтилкрахмала, может быть осуществлено с использованием способа, или комбинации способов, которые приводят к соединениям, имеющим вышеуказанные структуры (Па) и/или (ПЬ).
Хотя окисление может быть осуществлено в соответствии с любым подходящим способом или способами, приводящими к окислению восстановительного конца гидроксиалкилкрахмала, его предпочтительно проводят с использованием щелочного раствора иода, как описано, например, в патенте Германии ΌΕ 1962 705 А1, соответствующее содержание которого (пример А, колонка 9, строки 6-24) включено в данное описание путем ссылки.
Введение реакционноспособной карбоксильной группы в полимер, который селективно окислен по его восстановительному концу, можно проводить с использованием любых возможных способов и всех возможных соединений.
В соответствии с конкретным способом по настоящему изобретению, полимер, который является селективно окисленным по его восстановительному концу, подвергают взаимодействию по его окисленному восстановительному концу с по меньшей мере одним спиртом, предпочтительно по меньшей мере с одним кислым спиртом, таким как кислые спирты, имеющие величину рКА в диапазоне от 6 до 12 или от 7 до 11 при 25°С. Молекулярная масса кислого спирта может колебаться в диапазоне от 80 до 500 г/моль, например от 90 до 300 г/моль или от 100 до 200 г/моль.
Подходящие кислые спирты представляют собой все спирты формулы Н-О-ВА, имеющие кислый протон и способные взаимодействовать с окисленным полимером с получением соответствующего реакционноспособного сложного эфира полимера, предпочтительно, соответствующего формуле
еще более предпочтительно, соответствующего формуле
Предпочтительные спирты представляют собой Ν-гидроксисукцинимиды или сульфо-Ν- 30 010501 гидроксисукцинимид, подходящим образом замещенные фенолы, таких как п-нитрофенол, о,пдинитрофенол, о,о'-динитрофенол, трихлорфенол, такой как 2,4,6-трихлорфенол или 2,4,5-трихлорфенол, трифторфенол, такой как 2,4,6-трифторфенол или 2,4,5-трифторфенол, пентахлорфенол, пентафторфенол, или гидроксиазолы, такие как гидроксибензотриазол. Особенно предпочтительными являются Νгидроксисукцинимиды, где Ν-гидроксисукцинимид или сульфо-И-гидроксисукцинимид являются особенно предпочтительными. Все спирты можно использовать по отдельности или в виде подходящей комбинации двух или более из них. В контексте настоящего изобретения также возможно использование соединения, которое высвобождает соответствующий спирт, например, при добавлении сложных диэфиров карбоновых кислот.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу, как описано выше, где полимер, который является селективно окисленным по его восстановительному концу, активируют посредством взаимодействия окисленного полимера с кислым спиртом, предпочтительно с Ν-гидроксисукцинимидом или сульфо-Ы-гидроксисукцинимидом.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, полимер, который является селективно окисленным по его восстановительному концу, подвергают взаимодействию по его окисленному восстановительному концу с по меньшей мере одним сложным карбоновым диэфиром Вв-О-(С=О)-О-Вс, где ВВ и ВС могут быть одинаковыми или различными. Предпочтительно данный способ приводит к реакционноспособным полимерам, соответствующим формуле
ОК.
н / 1
А-он
О \ |
ок, ||
н О
где НА8' предпочтительно представляет собой НЕ8'.
В качестве подходящих соединений сложных карбоновых диэфиров можно использовать соединения, спиртовые компоненты которых независимо представляют собой Ν-гидроксисукцинимиды, такие как Ν-гидроксисукцинимид или сульфо-Л-гидроксисукцинимид, подходящим образом замещенные фенолы, такие как п-нитрофенол, о,п-динитрофенол, о,о'-динитрофенол, трихлорфенол, такой как 2,4,6трихлорфенол или 2,4,5-трихлорфенол, трифторфенол, такой как 2,4,6-трифторфенол или 2,4,5трифторфенол, пентахлорфенол, пентафторфенол, или гидроксиазолы, такие как гидроксибензотриазол. Особенно предпочтительными являются Ν,Ν'-дисукцинимидилкарбонат и сульфо-№№-дисукцинимидилкарбонат, где Ν,Ν'-дисукцинимидилкарбонат является особенно предпочтительным.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу, как описано выше, где полимер, который является селективно окисленным по его восстановительному концу, активируют путем взаимодействия окисленного полимера с Ν,Ν'-дисукцинимидилкарбонатом.
Кислый спирт подвергают взаимодействию с окисленным полимером или солью окисленного полимера при молярном соотношении кислый спирт:полимер, составляющем предпочтительно от 5:1 до 50:1, более предпочтительно от 8:1 до 20:1, при предпочтительной температуре от 2 до 40°С, более предпочтительно от 10 до 30°С и особенно предпочтительно от 15 до 25°С. Время реакции предпочтительно колеблется от 1 до 10 ч, более предпочтительно от 2 до 5 ч, более предпочтительно от 2 до 4 ч и особенно от 2 до 3 ч.
Сложный карбоновый диэфир подвергают взаимодействию с окисленным полимером или солью окисленного полимера при молярном соотношении сложный карбоновый диэфир:полимер, обычно составляющем от 1:1 до 3:1, как например от 1:1 до 1,5:1. Время реакции предпочтительно колеблется от 0,1 до 12 ч, как например от 0,2 до 6 ч, или от 0,5 до 2 ч или от 0,75 до 1,25 ч.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения взаимодействие окисленного полимера с кислым спиртом и/или сложным карбоновым диэфиром проводят в по меньшей мере одном апротонном растворителе, таком как безводный апротонный растворитель, имеющий содержание воды не более чем 0,5 процента по весу, предпочтительно не более чем 0,1 процента по весу. Подходящими растворителями являются, наряду с прочими, диметилсульфоксид (ДМСО), Νметилпирролидон, диметилацетамид (ДМА), диметилформамид (ДМФ) и смеси двух или более из них. Температура реакции предпочтительно составляет от 2 до 40°С, более предпочтительно от 10 до 30°С.
Для взаимодействия окисленного полимера с по меньшей мере одним кислым спиртом используют по меньшей мере один дополнительный активирующий агент.
Подходящими активирующими агентами, наряду с прочими, являются карбонилдимидазол, карбодиимиды, такие как диизопропилкарбодиимид (Э1С), дициклогексилкарбодиимид (ОСС), 1-этил-3-(3диметиламинопропил)карбодиимид (ЕЭС), где дициклогексилкарбодиимид (ОСС) и 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (ЕЭС) являются особенно предпочтительными.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу, как описано выше, где полимер,
- 31 010501 который является окисленным по его восстановительному концу, подвергают взаимодействию с кислым спиртом в присутствии дополнительного активирующего агента с получение реакционноспособного сложного эфира полимера.
В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения взаимодействие окисленного полимера с карбоновым сложным диэфиром и/или кислым спиртом проводят при низкой основной активности, что может быть определено путем добавления реакционной смеси к воде в объемном соотношении воды к реакционной смеси, равном 10:1. Перед добавлением вода, которая, по существу, не содержит буфера, имеет значение рН, равное 7 при 25°С. После добавления реакционной смеси, измеряют значение рН и получают основную активность реакционной смеси, которая имеет значение предпочтительно не более чем 9,0, более предпочтительно не более чем 8,0 и особенно предпочтительно не более чем 7,5.
В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения, окисленный полимер взаимодействует с Ν-гидроксисукицинимидом в сухом БМА в отсутствие воды при использовании ЕБС, приводя селективно к полимеру сложного эфира N-гидроксисукцинимида. соответствующего формуле
более предпочтительно НА8' представляет собой НЕ8'.
Неожиданно оказалось, что реакция не приводит к побочным продуктам, возникающим в результате взаимодействия ЕБС с ОН-группами НЕ8, и реакция перегруппировки О-ацилизомочевины, образованной при реакции ЕБС и окисленного полимера, в соответствующую Ν-ацилмочевину неожиданно подавляется.
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, окисленный полимер взаимодействует с К^Ы'-дисукциннмидилкарбонатом в сухом ДМФ в отсутствие воды и в отсутствие активирующего агента, приводя селективно к N-гндрокснсукциннмнновому сложному эфиру полимера, соответствующему формуле
О более предпочтительно НА8' представляет собой НЕ8'.
В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения, полимер, который является селективно окисленным по его восстановительному концу, подвергают взаимодействию по его окисленному восстановительному концу с азолидом, таким как карбонилдиимидазол или карбонилдибензимидазол, с получением полимера, содержащего реакционноспособную карбоксильную группу. В случае карбонилдиимидазола реакция приводит к реакционноспособному имидазолидному производному полимера, соответствующему формуле
где НА8' предпочтительно представляет собой НЕ8'.
В соответствии со второй альтернативой указанного следующего варианта осуществления настоящего изобретения, касающегося введения по меньшей мере одной реакционноспособной карбоксильной группы в полимер, реакционноспособную карбоксильную группу вводят в полимер, восстановительный конец которого не является окисленным, посредством взаимодействия по меньшей мере одной гидроксильной группы полимера со сложным карбоновым диэфиром.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгатам, где реакционноспособную карбоксильную группу вводят в полимер, восстановительный конец которого является не окисленным, посредством взаимодействия по меньшей мере одной гидроксильной группы полимера с по меньшей мере одним сложным карбоновым диэфиром РВ-О-(С=О)-О-РС, где РВ и РС могут быть одинаковыми или различными.
- 32 010501
В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения, полимер, восстановительный конец которого является не окисленным, подвергают взаимодействию по меньшей мере по одной гидроксильной группе с азолидом, таким как карбонилимидазол, карбонил-ди-(1,2,4-триазол) или карбонилдибензилимидазол, с получением полимера, содержащего реакционноспособную карбоксильную группу.
В качестве подходящих соединений сложных карбоновых диэфиров можно использовать соединения, спиртовые компоненты которых независимо представляют собой Ν-гидроксисукцинимиды, такие как Ν-гидроксисукцинимид или сульфо-И-гидроксисукцинимид, подходящим образом замещенные фенолы, такие как п-нитрофенол, о,п-динитрофенол, о,о'-динитрофенол, трихлорфенол, такой как 2,4,6трихлорфенол или 2,4,5-трихлорфенол, трифторфенол, такой как 2,4,6-трифторфенол или 2,4,5трифторфенол, пентахлорфенол, пентафторфенол, или гидроксиазолы, такие как гидроксибензотриазол.
Особенно предпочтительными являются симметричные соединения сложных карбоновых диэфиров, таким образом КВ и КС являются одинаковыми. Спиртовую компоненту карбонового диэфира предпочтительно выбирают из группы, состоящей из Ν-гидроксисукцинимида, сульфонированного Νгидроксисукцинимида, Ν-гидроксибензотриазола, и нитро- или галогензамещенных фенолов. Среди прочих, нитрофенол, динитрофенол, трихлсрефнол, трифторфенол, пентахлорфенол и пентафторфенол являются предпочтительными. Особенно предпочтительными являются Ν,Ν'-дисукцинимидилкарбонат и сульфо-ЫД-дисукцинимидилкарбонат, где Ν,Ν'-дисукцинимидилкарбонат является особенно предпочтительным.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к производному гидроксиалкилкрахмала, предпочтительно производному гидроксиэтилкрахмала, где по меньшей мере одна гидроксильная группа, предпочтительно по меньшей мере две гидроксильные группы указанного крахмала были введены во взаимодействие с соединением сложного карбонового диэфира с получением соответствующего реакционноспособного сложного эфира.
В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения взаимодействие полимера, восстановительный конец которого является не окисленным по меньшей мере с одним соединением сложного карбонового диэфира проводят при температуре от 2 до 40°С, более предпочтительно от 10 до 30°С и особенно от 15 до 25°С. Предпочтительное время реакции колеблется от 0,5 до 5 ч, более предпочтительно от 1 до 3 ч и особенно предпочтительно от 2 до 3 ч.
Молярное соотношение соединение сложного карбонового диэфира:полимер зависит от степени замещения полимера, относящегося к числу гидроксильных групп, взаимодействующих с соединением сложного карбонового диэфира, относительно числа гидроксильных групп, присутствующих в не подвергавшемся реакции полимере.
В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения, молярное соотношение соединение сложного карбонового диэфира:звенья ангидроглюкозы полимера находится в диапазоне от 1:2 до 1:1000, более предпочтительно от 1:3 до 1:100 и особенно предпочтительно от 1:10 до 1:50, приводя к степени замещения в диапазоне от 0,5 до 0,001, предпочтительно от 0,33 до 0,01 и особенно предпочтительно от 0,1 до 0,02.
В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения, взаимодействие полимера, восстановительный конец которого является не окисленным, с соединением сложного карбонового диэфира проводят по меньшей мере в одном апротонном растворителе, особенно предпочтительно в безводном апротонном растворителе, имеющем содержание воды не более чем 0,5 вес.%, предпочтительно не более чем 0,1 вес.%. Подходящими растворителями являются, наряду с прочими, диметилсульфоксид (ДМСО), Ν-метилпирролидон, диметилацетамид (ДМА), диметилформамид (ДМФ) и смеси двух или более из них.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу, как описано выше, где реакцию по меньшей мере одной гидроксильной группы полимера, восстановительный конец которого является не окисленным, со сложным карбоновым диэфиром с получением реакционноспособной карбоксильной группы прозодят в безводном апротонном полярном растворителе, где растворитель предпочтительно представляет собой диметилацетамид, диметилформамид или их смесь.
Реакционноспособное производное полимера, включающее по меньшей мере одну реакционноспособную карбоксильную группу, предпочтительно возникающую в результате реакции полимера с кислым спиртом, карбонатом и/или азолидом, как описано выше, далее подвергают взаимодействию с дополнительным, по меньшей мере, бифункциональным соединением, где по меньшей мере одна функциональная группа Р1 данного дополнительного соединения взаимодействует по меньшей мере с одной реакционноспособной карбоксильной группой производного полимера. Что касается по меньшей одной функциональной группы Р1 дополнительного соединения, то здесь не существует каких-либо конкретных ограничений, при условии, что возможна реакция по меньшей мере с одной реакционноспособной карбоксильной группой полимера. Предпочтительными функциональными группами Р1 являются, например, аминогруппа, или гидроксильная группа, или тиогруппа, или карбоксильная группа.
Далее, по меньшей мере, бифункциональное соединение включает по меньшей мере одну другую
- 33 010501 функциональную группу Е2, которая представляет собой альдегидную группу, или функциональную группу Е2, которая может быть химически модифицирована с образованием альдегидной группы. Химическая модификация может представлять собой взаимодействие функциональной группы Е2 с функциональной группой Е3 следующего линкерного соединения или окисление или восстановление подходящей функциональной группы Е2.
В том случае, когда Е2 реагирует с функциональной группой Е3 следующего соединения, Е2 может быть выбран, помимо прочего, из двойных С-С-связей или тройных С-С-связей или ароматических С-Ссвязей;
тиогруппы или гидроксильных групп;
гидразида алкилсульфоновой кислоты; гидразида арилсульфоновой кислоты;
1.2- диолов;
1.2- аминотиоспиртов;
азидов;
1.2- аминоспиртов;
аминогрупп -ΝΗ- или производных аминогрупп, включающих структурное звено -ΝΗ-, таких как аминоалкильные группы, аминоарильная группа, аминоаралкильные группы или алкариламино группы;
гидроксиламиногрупп -О-ХН2 или производных гидроксиаминогруппы, включающих структурное звено -О-ΝΗ-, таких как гидроксилалкиламино группы, гидроксилариламино группы, гидроксиларалкиламино группы или гидроксилалкариламино группы;
алкоксиаминогрупп, арилоксиаминогрупп, аралкилоксиаминогрупп или алкарилоксиаминогрупп, каждая из которых включает структурное звено -ΝΗ-О-;
остатков, имеющих карбонильную группу, -О-С(=С)-М, где С представляет собой О или 8, и М представляет собой, например,
ОН или -8Н;
алкоксильную группу, арилоксигруппу, аралкилоксигруппу или алкарилоксигруппу; алкилтиогруппу, арилтиогруппу, аралкилтиогруппу или алкарилтиогруппу; алкилкарбонилоксигруппу, арилкарбонилоксигруппу, аралкилкарбонилоксигруппу, алкарилкарбонилоксигруппу;
активированные сложные эфиры, такие как сложные эфиры гидроксиламинов, имеющие имидную структуру, такую как Ν-гидроксисукцинимид, или имеющие структурное звено О-Ν, где Ν представляет собой часть гетероарильного соединения, или когда С = О и О отсутствует, такие арилокси соединения с замещенным арильным остатком как пентафторфенил, паранитрофенил или трихлорфенил;
где О отсутствует или представляет собой ИН или гетероатом, такой как 8 или О;
-ХН-ИН2 или ХН-ХН-;
-ЫО2;
нитрильной группы;
карбонильных групп, таких как альдегидная группа или кетогруппа; карбоксильной группы;
группы -Ы=С=О или группы -Ы=С=8;
винилгалогенидных групп, таких как винилиодидная или винилбромидная группа или трифлат; -С=С-Н;
-(С-НН2С1)-О-алкил;
-групп-(С=О)-СН2-На1, где На1 представляет собой С1, Вг или Ι;
-СН=СН-8О2-;
дисульфидной группы, включающей структуру -8-8-;
° -группы
где Е3 представляет собой группу, способную образовывать химическую связь с одной из вышеуказанных групп, и предпочтительно выбран из вышеуказанных групп. Кроме того, второе связывающее соединение предпочтительно содержит по меньшей мере одну альдегидную группу или кетогруппу, или группу полуацеталя, которая способна взаимодействовать с аминогруппой белка посредством восстановительного аминирования.
Функциональная группа Е1 и альдегидная группа, или кетогруппа, или группа полуацеталя по меньшей мере бифункционального связывающего соединения, которое взаимодействует с полимером, и/или функциональные группы Е1 и Е2, по меньшей мере, бифункционального связывающего соединения, которое взаимодействует с полимером, и/или функциональная группа Е3 и альдегидная группа, или кето- 34 010501 группа, или группа полуацеталя, по меньшей мере, бифункционального связывающего соединения могут быть независимо разделены любым подходящим спейсером. Среди других, спейсер может представлять собой необязательно замещенный, линейный, разветвленный и/или циклический, алифатический и/или ароматический углеводородный остаток. Обычно углеводородный остаток содержит до 60, предпочтительно до 40, более предпочтительно до 20, более предпочтительно до 10 атомов углерода. Если присутствуют гетероатомы, разделяющая группа включает обычно от 1 до 20, предпочтительно от 1 до 8, более предпочтительно от 1 до 6, более предпочтительно от 1 до 4 и особенно предпочтительно от 1 до 2 гетероатомов. В качестве гетероатома О является предпочтительным. Углеводородный остаток может включать необязательно разветвленную алкильную цепь, или арильную группу, или циклоалкильную группу, содержащую, например, от 5 до 7 атомов углерода, или представлять собой аралкильную группу, алкарильную группу, где алкильная часть может представлять собой линейную и/или циклическую алкильную группу.
Примерами соединения с функциональными группами ?! и Р2 являются, например, необязательно замещенный диаминоалкан, имеющий от 2 до 20 атомов углерода, особенно предпочтительно 1,2диаминоэтан, 1,3-диаминопропан и 1,4-диаминобутан.
Предпочтительными примерами соединения с функциональной группой Р3 и альдегидной группой или кетогруппой, или группой полуацеталя, являются, например, формилбензойная кислота, пентафторфениловый эфир 4-формилбензойной кислоты, Ν-гидроксисукцинимидный эфир 4-формилбензойной кислоты и 4-(4-формил-3,5-диметоксифенокси)бутановая кислота или биосовместимое соединение, выбранное из группы, состоящей из альфа-кетокарбоновых кислот, нейраминовых кислот или их производных и пиридоксальфосфата.
В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, где полимер подвергают взаимодействию с бифункциональным соединением, которое представляет собой биосовместимое соединение, выбранное из группы, состоящей из альфа-кетокарбоновых кислот, нейраминовых или сиалиловых кислот или их производных и пиридоксальфосфата.
Что касается альфа-кетокарбоновых кислот, то предпочтительно они представляют собой альфакетокарбоновые кислоты, полученные из аминокислот, и в большинстве случаев они также могут быть выявлены в организме человека. Предпочтительные альфа-кетокарбоновые кислоты, полученные из аминокислот, выбирают из группы, состоящей из кето-валина, кето-лейцина, кето-изолейцина и кетоаланина. Карбоксильная группа альфа-кетокарбоновых кислот ваимодействует с группой О полимера, представляющей собой аминогруппу. При этом образуется амидная группа. Оставшаяся свободная кетогруппа альфа-кетокарбоновой кислоты затем может быть подвергнута взаимодействию с функциональной группой белка, в частности с аминогруппой. Таким образом, образуется иминогруппа, которая может быть прогидрирована.
Соответственно, настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, где полимер взаимодействует с альфа-кетокарбоновой кислотой.
Что касается сиалиловых кислот или их производных, они предпочтительно являются биосовместимыми, в частности, они представляют собой сахара, найденные в организме человека, которые являются Ν- и/или О-ацетилированными. В предпочтительном варианте осуществления, сиалиловые кислоты представляют собой Ν-ацетилированные нейраминовые кислоты. Данные соединения обладают желательной жесткостью для выполнения функции в качестве спейсера благодаря структуре пиранозы. С другой стороны, в данные соединения посредством селективного окисления можно ввести альдегидную группу. Сиалиловые кислоты выявлены в организме человека, например, в качестве концевых моносахаридов в гликановых цепях гликозилированных белков.
В предпочтительном варианте осуществления, сиалиловая кислота может быть селективно окислена с образованием альдегидной группы.
Способы селективного окисления сиалиловых кислот известны в данной области, смотри, например, Ь. V. блсщек, В. Р. Кбексо, V. νβΙΐηβΓ, СагЬойубга1е Яекеагсй, 83 (1980), 21-32 и Т. Макиба, 8. 8ЫЬиуа, М. Лга1, 8. Уокй1ба, Т. Тошо/ахх-а, А. О1ео, М. Уатакййа, Т. Нопба, Вюогдатс & Меб1апа1 Сйет181гу Ьейегк, 13 (2003), 669-673. Предпочтительно окисление сиалиловой кислоты может быть проведено перед взаимодействием с аминогруппой полимера.
Необязательно окисленная сиалиловая кислота затем может быть подвергнута взаимодействию по группе карбоновой кислоты с аминогруппой полимера.
Полученные соединения будут содержать альдегидную группу, которая далее может быть подвергнута восстановительному аминированию с аминогруппой белка.
Соответственно, настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, где полимер взаимодействует с необязательно окисленной сиалиловой кислотой.
Что касается пиридоксальфосфата (РуР), он представляет собой высоко биосовместимое бифункциональное соединение и также называется витамин В6. РуР представляет собой кофермент, который участвует в реакциях трансаминирования, декарбоксилирования, рацемизации и многочисленных модификациях боковых цепей аминокислот. Все требующие присутствия РуР ферменты действуют через об- 35 010501 разование оснований Шиффа между аминокислотой и коферментом.
Фосфатная группа РуР может быть подвергнута взаимодействию с аминогруппой полимера, предпочтительно гидроксиалкилкрахмала, в частности гидроксиэтилкрахмала, с образованием фосфорамида. Альдегидная группа РуР затем может быть подвергнута взаимодействию с аминогруппой белка с образованием основания Шиффа, которое затем может быть восстановлено. В предпочтительном варианте осуществления, структура конъюгата представляет собой НЕ§-NН-Ρ(О)2-Ο-(пиридоксаль)-СН-NН-белок.
В случае РуР, функциональную группу полимера предпочтительно вводят в полимер с использованием диаминосоединения, как описано выше.
Соответственно, настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, где полимер взаимодействует с пиридоксальфосфатом.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу получения конъюгата, указанный способ включает взаимодействие полимера, предпочтительно гидроксиэтилкрахмала, по его необязательно окисленному восстановительному концу с соединением, выбранным из группы, состоящей из кислых спиртов, сложных карбоновых диэфиров и азолидов, с получением производного полимера, включающего по меньшей мере одну реакционноспособную карбоксильную группу, взаимодействие указанного производного полимера по меньшей мере с одним по меньшей мере бифункциональным соединением с получением производного полимера, содержащего альдегидную группу или кетогруппу, или группу полуацеталя или функциональную группу, которая может быть модифицирована химически с образованием альдегидной группы или кетогруппы, или группы полуацеталя, необязательно химическую модификацию указанной функциональной группы с получением производного полимера, включающего альдегидную группу или кетогруппу, или группу полуацеталя, и взаимодействие производного полимера, включающего альдегидную группу или кетогруппу, или группу полуацеталя, с аминогруппой белка посредством восстановительного аминирования.
Соответственно, настоящее изобретение также относится к конъюгату, включающему полимер, предпочтительно гидроксиэтилкрахмал, и белок, ковалентно связанные друг с другом, получаемый способом получения конъюгата, где указанный способ включает взаимодействие полимера по его необязательно окисленному восстановительному концу с соединением, выбранным из группы, состоящей из кислых спиртов, сложных карбоновых диэфиров и азолидов, с получением производного полимера, включающего по меньшей мере одну реакционноспособную карбоксильную группу, взаимодействие указанного производного полимера по меньшей мере с одним по меньшей мере бифункциональным соединением с получением производного полимера, содержащего альдегидную группу или кетогруппу, или группу полуацеталя или функциональную группу, которая может быть модифицирована химически с образованием альдегидной группы или кетогруппы, или группы полуацеталя, необязательно химическую модификацию указанной функциональной группы с получением производного полимера, включающего альдегидную группу или кетогруппу, или группу полуацеталя, и взаимодействие производного полимера, включающего альдегидную группу или кетогруппу, или группу полуацеталя, с аминогруппой белка посредством восстановительного аминирования.
Конкретным примером соединения, содержащего функциональную группу Е1 и функциональную группу Е2, которое при окислении дает альдегидную группу является, например, соединение, содержащее аминогруппу в качестве Е1 и бетагидроксиаминогруппу в качестве Е2. Особенно предпочтительным примером является 1,3-диамино-2-гидроксипропан. Такое окисление может быть проведено с использованием всех подходящих окислителей, которые способны превращать бетагидроксиаминогруппу в альдегидную группу. Предпочтительными окислительными реагентами являются периодаты, такие как периодаты щелочных металлов. Особенно предпочтительным является периодат натрия, который предпочтительно используют в виде его водного раствора. Данный раствор предпочтительно имеет концентрацию иодата от 1 до 50 мМ, более предпочтительно от 1 до 25 мМ и особенно предпочтительно от 1 до 10 мМ. Окисление проводят при температуре от 0 до 40°С, предпочтительно от 0 до 25°С и особенно предпочтительно от 4 до 20°С.
Полученное производное полимера может быть очищено от реакционной смеси с использованием по меньшей мере одного подходящего способа. При необходимости, производное полимера может быть осаждено перед выделением с использованием по меньшей мере одного подходящего способа.
Если производное полимера первоначально осаждают, это возможно, например, при контакте реакционной смеси по меньшей мере с одним растворителем, или смесью растворителей, отличающихся от растворителя или смеси растворителей, присутствующих в реакционной смеси, при подходящей температуре. В соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, где в качестве растворителя используют водную среду, предпочтительно воду, реакционную смесь приводят в контакт с 2-пропанолом или со смесью ацетона и этанола, предпочтительно смесью в соотношении 1:1 (об./об.), указывающем на равные объемы указанных соединений, при температуре предпочтительно в диапазоне от -20 до +50°С и особенно предпочтительно в диапазоне от -20 до 25°С.
Выделение производного полимера можно проводить с использованием подходящего способа, который может включать одну или более стадий. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, производное полимера первоначально отделяют от реакционной смеси
- 36 010501 или от смеси реакционной смеси с, например, водным 2-пропанолом, с использованием подходящего способа, такого как центрифугирование или фильтрование. На второй стадии отделенное производное полимера может быть подвергнуто дополнительной обработке, такой как последующая обработка, как, например, диализ, центрифужное фильтрование или фильтрование под давлением, ионообменная хроматография, хроматография с обращенной фазой, ВЭЖХ, МЭЖХ, гель-фильтрование и/или лиофилизация. В соответствии с еще более предпочтительным вариантом осуществления, отделенное производное полимера первоначально подвергают диализу, предпочтительно против воды, а затем лиофилизуют до тех пор, пока содержание растворителя в реакционном продукте не станет достаточно низким в соответствии с желательными характеристиками продукта. Лиофилизацию можно проводить при температуре от 20 до 35°С, предпочтительно от 20 до 30°С.
Настоящее изобретение также относится к конъюгату, включающему гидроксиалкилкрахмал и белок, где гидроксиалкилкрахмал связан с использованием его окисленного восстановительного конца с первым связывающим соединением посредством амидной связи, указанное связывающее соединение дополнительно связано амидной связью со вторым связывающим соединением, указанное второе связывающее соединение связано азометиновой и/или аминной связью с белком, где первое связывающее соединение предпочтительно используется в качестве диамино-функционализированного соединения, а второе связывающее соединение предпочтительно используется в качестве карбокси- и альдегидо- или кето-, или полуацеталь-, более предпочтительно в качестве карбокси- и альдегидо- функционализированного соединения.
Настоящее изобретение также относится к конъюгату, включающему белок и полимер или его производное, где полимер представляет собой гидроксиалкилкрахмал (НА8), имеющий структуру, соответствующую формуле:
где Βι, В2 и В3 независимо представляют собой водород или гидроксиалкильную группу, гидроксиарильную группу, гидроксиаралкильную группу или гидроксиалкарильную группу, имеющую от 1 до 10 атомов углерода, предпочтительно водород или гидроксиалкильную группу, более предпочтительно водород или гидроксиэтильную группу, и где Ь независимо представляет собой необязательно замещенный, линейный, разветвленный и/или циклический углеводородный остаток, необязательно включающий по меньшей мере один гетероатом, имеющий от 1 до 60, предпочтительно от 1 до 40, более предпочтительно от 1 до 20, более предпочтительно от 1 до 10, более предпочтительно от 1 до 6, более предпочтительно от 1 до 2 атомов углерода и особенно предпочтительно 1 атом углерода, в частности Ь представляет собой СН2.
Настоящее изобретение также относится к конъюгату, включающему белок и полимер или его производное, где полимер представляет собой гидроксиалкилкрахмал (НА8), имеющий структуру, соответствующую формуле
где В1, В2 и В3 независимо представляют собой водород или гидроксиалкильную группу, гидроксиарильную группу, гидроксиаралкильную группу, или гидроксиалкарильную группу, имеющую от 1 до 10 атомов углерода, предпочтительно водород или гидроксиалкильную группу, более предпочтительно водород или гидроксиэтильную группу, и где Ь1 и Ь2 независимо представляют собой необязательно замещенный, линейный, разветвленный и/или циклический углеводородный остаток, необязательно включающий по меньшей мере один гетероатом, включающий алкильный, арильный, аралкильный, гетероалкильный и/или гетероаралкильный фрагмент, при этом указанный остаток содержит от 1 до 60, предпочтительно от 1 до 40, более предпочтительно от 1 до 20, более предпочтительно от 1 до 10 атомов углерода, и где Ό представляет собой связь, предпочтительно ковалентную связь, которая образована подходящей функциональной группой Р2, связанной с Ь1 и подходящей функциональной группой Р3, связанной с Ь2.
Настоящее изобретение также относится к конъюгату, как описано выше, где Ь1 представляет собой -(СН2)П-, где η = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, предпочтительно 2, 3, 4, 5, 6, более предпочтительно 2, 3, 4, и особенно предпочтительно 4.
- 37 010501
Настоящее изобретение также относится к конъюгату, как описано выше, где Ь2 включает необязательно замещенный подходящим образом арильный фрагмент, предпочтительно арильный фрагмент, содержащий 6 атомов углерода, особенно предпочтительно Ь2 представляет собой С6Н4.
Настоящее изобретение также относится к конъюгату, как описано выше, где Ь2 выбирают из группы, включающей двойные С-С-связи или тройные С-С-связи, или ароматические С-С-связи;
тиогруппу или гидроксильные группы;
гидразид алкилсульфоновой кислоты; гидразид арилсульфоновой кислоты;
1.2- диолы;
1.2- аминотиоспирты;
азиды;
1.2- аминоспирты;
аминогруппу -ΝΉ2 или производные аминогрупп, включающие структурное звено -ΝΉ-, такие как аминоалкильные группы, аминоарильная группа, аминоаралкильные группы или алкариламино группы;
гидроксиламиногруппу -Ο-ΝΉ2 или производные гидроксиаминогруппы, включающие структурное звено -Ο-ΝΉ-, такие как гидроксилалкиламиногруппы, гидроксилариламиногруппы, гидроксиларалкиламиногруппы или гидроксилалкариламиногруппы;
алкоксиаминогруппы, арилоксиаминогруппы, аралкилоксиаминогруппы или алкарилоксиаминогруппы, каждая из которых включает структурное звено -ΝΉ-Ο-;
остатки, имеющие карбонильную группу, -Ц-С(=С)-М, где С представляет собой О или 8, и М представляет собой, например,
-ОН или -8Н;
алкоксильную группу, арилоксигруппу, аралкилоксигруппу или алкарилоксигруппу;
алкилтиогруппу, арилтиогруппу, аралкилтиогруппу или алкарилтиогруппу;
алкилкарбонилоксигруппу, арилкарбонилоксигруппу, аралкилкарбонилоксигруппу, алкарилкарбонилоксигруппу;
активированные сложные эфиры, такие как сложные эфиры гидроксиламинов, имеющие имидную структуру, такую как Ν-гидроксисукцинимид, или имеющие структурное звено О-Ν, где Ν представляет собой часть гетероарильного соединения, или когда С = О и О отсутствует, такие арилокси соединения с замещенным арильным остатком как пентафторфенил, паранитрофенил или трихлорфенил;
где О отсутствует или представляет собой ΝΉ или гетероатом, такой как 8 или О;
-ΝΉ-ΝΉ2 или -ΝΉ-ΝΉ-;
-ΝΟ2;
нитрильную группу;
карбонильные группы, такие как альдегидная группа или кетогруппа;
карбоксильную группу;
группу -Ы=С=О или группу -Ν=ί.’=8;
винилгалогенидные группы, такие как винилиодидная или винилбромидная группа или трифлат;
-С=С-Н;
-(С-МН2С1)-О алкил;
-группы -(С=О)-СН2-На1, где На1 представляет собой С1, Вг или I;
-СН=СН-8О2-;
дисульфидную группу, включающую структуру -8-8-;
О -группу
и где Е3 представляет собой функциональную группу, способную образовывать химическую связь с Р2 и предпочтительно выбран из вышеуказанной группы, Р2 предпочтительно включает фрагмент -ΝΉ-, более предпочтительно включает аминогруппу, Е3 предпочтительно включает фрагмент -(С=С)-, более предпочтительно -(С=О)-, более предпочтительно фрагмент -(С=С)-С-, еще более предпочтительно -(С=О)-С- и особенно предпочтительно -(С=О)-О, Ό предпочтительно представляет собой амидную связь.
Настоящее изобретение также относится к конъюгату, как описано выше, имеющему структуру, соответствующую формуле
- 38 010501
п = 2, 3 или 4, В4 независимо представляет собой водород или метоксигруппу, и т = 0 в случае, когда В4 представляет собой водород, и т = 1 в случае, когда В4 представляет собой метокси.
Настоящее изобретение также относится к конъюгату, включающему белок и полимер или его производное, где полимер представляет собой гидроксиалкилкрахмал (НА8), и белок представляет собой гранулоцит-колониестимулирующий фактор (С-С8Р), имеющему структуру, соответствующую формуле
НА5--С—N— белок’
Н2 Н где атом углерода фрагмента -СН2-Ы2- является производным альдегидной группы, которая была введена в полимер путем реакции окисления с раскрытием цикла, и где атом азота получен из аминогруппы белка.
Настоящее изобретение также относится к конъюгату, как описано выше, где гидроксиалкилкрахмал представляет собой гидроксиэтилкрахмал.
Настоящее изобретение также относится к любому из описанных конъюгатов, где гидроксиэтилкрахмал имеет молекулярную массу от 2 до 200 кДа, предпочтительно от 4 до 130 кДа, более предпочтительно от 4 до 70 кДа.
Настоящее изобретение также относится к конъюгату, как описано выше, где белок выбирают из группы, состоящей из ЕРО, С-С8Р, ΣΕΝ альфа, ΣΕΝ бета, АТ III, В-2, ^-3, миоглобина, 8ОЭ и В8А, предпочтительно из группы, состоящей из гкЕРО, ткС-С8Р, тЫРЫ альфа, ιΉΕΝ бета, гкАТ III, гНЕА, тЫЕ-3, миоглобина, 8ОЭ и В8А, и/или из группы, состоящей из А1АТ, фактора VII, фактора VIII, фактора IX, !РА и АРС.
В способах получения конъюгата по изобретению степень конверсии в вышеуказанных способах может составлять по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере 80% и в частности 95% или даже выше, как например, по меньшей мере 98 или 99%.
Конъюгаты согласно изобретению могут иметь по меньшей мере 50%, еще более предпочтительно по меньшей мере 70%-ную чистоту, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%-ную чистоту, в частности, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 99%-ную чистоту. В наиболее предпочтительном варианте осуществления конъюгат может иметь 100%-ную чистоту, т.е. в нем не присутствуют другие побочные продукты.
Следовательно, в соответствии с другим аспектом, настоящее изобретение также относится к композиции, которая может включать конъюгат(ы) по изобретению, где количество конъюгата(ов) может составлять по меньшей мере 50 вес.%, еще более предпочтительно по меньшей мере 70 вес.%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90 вес.%, в частности, по меньшей мере 95 вес.% или по меньшей мере 99 вес.%. В наиболее предпочтительном варианте осуществления композиция может состоять из конъюгата(ов), т.е. количество конъюгата(ов) составляет 100 вес.%.
В соответствии с другим аспектом, настоящее изобретение также относится к конъюгату, как описано выше, или к конъюгату, получаемому описанным выше способом, для применения в способе лечения человека или животного.
Соответственно, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей терапевтически эффективное количество конъюгата, как описано выше, или конъюгата, получаемого описанным выше способом.
Термин «терапевтически эффективное количество», как он использован в контексте настоящего изобретения относится к такому количеству, которое обеспечивает терапевтический эффект для данного состояния и режима введения.
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция дополнительно включает по меньшей мере один фармацевтически приемлемый разбавитель, адъювант и/или носитель. Предпочтительно данный фармацевтически приемлемый разбавитель, адъювант и/или носитель является особенно полезным для терапии с использованием ΒΝ альфа, ΒΝ бета, ЕРО, АТ III, С-С8Р, АРС, А1АТ, !РА, фактора VII, фактора VIII или фактора IX.
Все конъюгаты по настоящему изобретению белок-НА8 предпочтительно вводят внутривенно (ί.ν.), подкожно (к.с.) или внутримышечно (1.т.). Конкретные пути введения выбирают в зависимости от состояния подвергаемого лечению. Предпочтительно конъюгаты вводят вместе с подходящим носителем, таким как известные в данной области (например, как использованные в биофармацевтических препаратах первого поколения/не модифицированных, не содержащих альбумина или с использованием альбумина в качестве эксципиента), подходящим разбавителем, например, в виде стерильных растворов для
- 39 010501 внутривенного (ί.ν.), подкожного (з.с.) или внутримышечного (1.ш.) применения. Требуемая дозировка будет зависеть от серьезности состояния, подвергаемого лечению, индивидуальной ответной реакции пациента, способа введения и тому подобного. Специалист способен определить корректную дозировку на основании обычных знаний.
В соответствии с другим аспектом, настоящее изобретение также относится к применению конъюгата НА8-, предпочтительно конъюгата НЕ8-белок, как описано выше, или конъюгата НА8-, предпочтительно конъюгата НЕ8-белок, получаемого описанными выше способами, где белок представляет собой ЕРО, для получения лекарственного средства для лечения анемических нарушений, или гематопоэтической дисфункции, или связанных с этим заболеваний.
Введение изоформ эритропоэтина обычно проводят парентеральными путями. Конкретный выбранный путь будет зависеть от состояния, подвергаемого лечению. Введение изоформ эритропоэтина предпочтительно проводят в виде части препарата, содержащего подходящий носитель, такой как альбумин сыворотки человека, подходящий разбавитель, такой как забуференный физиологический раствор, и/или подходящий адъювант. Требуемая дозировка будет представлять собой количества, достаточные для повышения гематокритного числа пациента и будет изменяться в зависимости от тяжести состояния, подвергаемого лечению, способа введения и тому подобного. Задача лечения с использованием фармацевтической композиции по изобретению предпочтительно заключается в увеличении показателя для гемоглобина в крови до более чем 6,8 ммоль/л. С этой целью фармацевтическую композицию можно вводить таким образом, что показателя для гемоглобина будет увеличиваться в диапазоне от 0,6 ммоль/л до 1,6 ммоль/л в неделю. Если показатель для гемоглобина превышает 8,7 ммоль/л, терапию предпочтительно следует прервать до тех пор, пока показатель гемоглобина не снизится до значения ниже 8,1 ммоль/л. Композицию по изобретению предпочтительно используют в виде препарата, подходящего для подкожной или внутривенной, или парентеральной инъекции. Подходящие для этого эксципиенты представляют собой, например, дигидрофосфат натрия, гидрофосфат динатрия, хлорат натрия, полисорбат 80, НА8 и воду для инъекций. Композицию можно вводить три раза в неделю, предпочтительно два раза в неделю, более предпочтительно один раз в неделю и наиболее предпочтительно каждые две недели. Предпочтительно, фармацевтическую композицию вводят в количестве 0,01-10 мкг/кг веса тела пациента, более предпочтительно от 0,1 до 5 мкг/кг, от 0,1 до 1 мкг/кг или 0,2-0,9 мкг/кг, наиболее предпочтительно 0,3-0,7 мкг/кг и наиболее предпочтительно 0,4-0,6 мкг/кг. Обычно вводят в виде дозы предпочтительно между 10 мкг и 200 мкг, предпочтительно между 15 мкг и 100 мкг.
В соответствии с другим аспектом, настоящее изобретение также относится к применению конъюгата НА8-, предпочтительно конъюгата НЕ8-белок, как описано выше, или конъюгата НА8-, предпочтительно конъюгата НЕ8-белок, получаемого описанными выше способами, где белок представляет собой С-С8Р, для получения лекарственного средства для лечения нарушения, характеризуемого пониженной гематопоэтической или иммунной функцией; указанное нарушение предпочтительно возникает в результате химиотерапии, лучевой терапии, инфекционного заболевания, тяжелой хронической нейтропении или лейкоза.
В соответствии с другим аспектом, настоящее изобретение также относится к применению конъюгата НА8-, предпочтительно конъюгата НЕ8-белок, как описано выше, или конъюгата НА8-, предпочтительно конъюгата НЕ8-белок, получаемого описанными выше способами, где белок представляет собой Фактор VIII, для получения лекарственного средства для лечения гемофилии А.
В соответствии с другим аспектом, настоящее изобретение также относится к применению конъюгата НА8-АТ III, как описано выше, или конъюгата НА8-белок, получаемого описанными способами для получения лекарственного средства для лечения наследственного дефицита АТ III, венозного тромбоза, ожогов и устойчивости к гепарину при аорто-коронарном шунтировании (САВС), лечения перфорации кишечника в результате травмы и желудочно-кишечной хирургии, рассеянного внутрисосудистого свертывания крови (ΌΚ.') и/или сепсиса, а также для профилактики образования микросгустков, связанных с вентиляционной терапией. Следовательно, фармацевтическая композиция, включающая конъюгат НА8АТ III согласно изобретению, может использоваться для данных целей.
В соответствии с другим аспектом, настоящее изобретение также относится к применению конъюгата НА8-, предпочтительно конъюгата НЕ8-белок, как описано выше, или конъюгата НА8-, предпочтительно конъюгата НЕ8-белок, получаемого описанными выше способами, где белок представляет собой А1АТ, для получения лекарственного средства для лечения эмфиземы, цистозного фиброза, атопического дерматита, хронического обструктивного заболевания легких (ХОЗЛ) и/или бронхита. Фармацевтическая композиция по изобретению, включающая конъюгат НА8-АТ III согласно изобретению, может использоваться для данных целей.
В соответствии с другим аспектом, настоящее изобретение также относится к применению конъюгата НА8-, предпочтительно конъюгата НЕ8-белок, как описано выше, или конъюгата НА8-, предпочтительно конъюгата НЕ8-белок, получаемого описанными выше способами, где белок представляет собой
1РА, для получения лекарственного средства для лечения инфарктов миокарда (сердечных приступов), тромбоза, тромбоэмболии или окклюзионных заболеваний, особенно окклюзионных артериальных заболеваний.
- 40 010501
В соответствии с другим аспектом, настоящее изобретение также относится к применению конъюгата НАБ-, предпочтительно конъюгата НЕБ-белок, как описано выше, или конъюгата НАБ-, предпочтительно конъюгата НЕБ-белок, получаемого описанными выше способами, где белок представляет собой АРС, для получения лекарственного средства для лечения тяжелого сепсиса, тромбоза, тромбоэмболии или окклюзионных заболеваний, особенно окклюзионных артериальных заболеваний.
В соответствии с другим аспектом, настоящее изобретение также относится к применению конъюгата НАБ-, предпочтительно конъюгата НЕБ-белок, как описано выше, или конъюгата НАБ-, предпочтительно конъюгата НЕБ-белок, получаемого описанными выше способами, где белок представляет собой ΙΕΝ альфа, для получения лекарственного средства для лечения лейкоза, например лейкоза волосковых клеток, хронического миелогенного лейкоза, множественной миеломы, фоликулярной лимфомы, рака, например карциноидной опухоли, злокачественной меланомы, и гепатита, например хронического гепатита В и хронического гепатита С.
В соответствии с другим аспектом, настоящее изобретение также относится к применению конъюгата НАБ-, предпочтительно конъюгата НЕБ-белок, как описано выше, или конъюгата НАБ-, предпочтительно конъюгата НЕБ-белок, получаемого описанными выше способами, где белок представляет собой ^Ν бета, для получения лекарственного средства для лечения рассеянного склероза, предпочтительно рецидивирующих форм рассеянного склероза.
Настоящее изобретение также относится к применению конъюгата НАБ-фактор У11 конъюгат для получения лекарственного средства для лечения случаев гемофилии А или В у пациентов, обладающих ингибиторами фактора УШ или фактора IX.
Настоящее изобретение также относится к применению конъюгата НАБ-фактор IX для получения лекарственного средства для борьбы и профилактики геморрагических случаев у пациентов с гемофилией В (например, с врожденным дефицитом фактора IX или болезнью Кристмаса), включая контроль и профилактику кровотечения при хирургических вмешательствах.
Изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими фигурами, таблицами и примерами, которые не предназначены для ограничения объема изобретения.
Краткое описание фигур
Фиг. 1 а.
На фиг. 1а показан БИБ-РАСЕ (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия) анализ конъюгата НЕБ-О-СББ, полученного в соответствии с примером 2.1(а), №иродеи®. Для гель-электрофореза использовали мини-ячейку ХСе11 Биге Ьоск Μίηί Се11 Диуйгодеи ОтЬН, Каг1кгике, Германия) и источник энергоснабжения Соикой Е143 (СО^ОКТиу, Титкои!, В). Использовали 12% бис-трис гель вместе с подвижным буфером МОРБ БИБ при восстановительных условиях (оба от 1иуйгодеи ОтЬН, Каг1кгике, Германия) в соответствии с инструкциями производителя.
Полоса А. Протеиновый маркер БееВ1ие®Р1ик2 Диуйгодеи ОтЬН, Каг1кгике, Германия) 6. Маркер молекулярной массы сверху вниз: 188, 98, 62, 49, 38, 28, 17, 14, 6, 3 кДа.
Полоса В. Неочищенный продукт после конъюгации.
О-СББ(№иродеи®) с НЕБ, как описано в примере 2.1 (а).
Полоса С. Исходное вещество О-СББ.
Фиг. 1Ь.
На фиг. 1Ь показан БЭБ-РАСЕ анализ конъюгата НЕБ-О-СББ, полученного в соответствии с примером 2.1(а), Огаиосу!е®. Для гель-электрофореза использовали мини-ячейку ХСе11 Биге Ьоск М1ш Се11 Диуйгодеи ОтЬН, Каг1кгике, Германия) и источник энергоснабжения Соикой Е143 (СО^ОКТиу, Титкои!, В). Использовали 12% бис-трис гель вместе с подвижным буфером МОРБ БИБ при восстановительных условиях (оба от 1иукгодеи ОтЬН, Каг1кгике, Германия) в соответствии с инструкциями производителя.
Полоса А. Протеиновый маркер БееВ1ие®Р1ик2 Диуйгодеи ОтЬН, Каг1кгике, Германия) 6. Маркер молекулярной массы сверху вниз: 188, 98, 62, 49, 38, 28, 17, 14, 6, 3 кДа.
Полоса В. Неочищенный продукт после конъюгации О-СББ (Огаиосу!е®) с НЕБ, как описано в примере 2.1(а).
Полоса С. Исходное вещество О-СББ.
Фиг. 2.
На фиг. 2 показан БЭБ-РЛОЕ анализ конъюгата НЕБ-О-СББ, полученного в соответствии с примером 2.1(Ь), О-СББ представлял собой очищенный кО-СББ, имеющий по существу такие же характеристики, что и коммерческий продукт №иродеи®. Для гель-электрофореза использовали мини-ячейку ХСе11 Биге Ьоск М1ш Се11 Диуйгодеи ОтЬН, Каг1кгике, Германия) и источник энергоснабжения Соикой Е143 (СО^ОКТиу, Титкои!, В).
Использовали 12% бис-трис гель вместе с подвижным буфером МОРБ БИБ при восстановительных условиях (оба от 1иукгодеи ОтЬН, Каг1кгике, Германия) в соответствии с инструкциями производителя.
Полоса А. Протеиновый маркер БееВ1ие®Р1ик2 Диуйгодеи ОтЬН, Каг1кгике, Германия) 6. Маркер молекулярной массы сверху вниз: 188, 98 кДа, 62 кДа, 49 кДа, 38 кДа, 28 кДа, 17 кДа, 14 кДа, 6 кДа, 3
- 41 010501 кДа.
Полоса В. Неочищенный продукт после конъюгации 6-С8Е с ΗΕ810/0,4 в 0,1М ЫаОЛс буфере, рН 5,0.
Полоса С. Неочищенный продукт после конъюгации 6-С8Е с ΗΕ810/0,7 в 0,1М ЫаОЛс буфере, рН 5,0.
Полоса Ό. Неочищенный продукт после конъюгации 6-С8Е с ΗΕ850/0,4 в 0,1М ЫаОЛс буфере, рН 5,0.
Полоса Е. Неочищенный продукт после конъюгации 6-С8Е с ΗΕ850/0,7 в 0,1М ЫаОЛс буфере, рН 5,0.
Полоса Е: исходное вещество 6-С8Е.
Фиг. 3.
На фиг. 3 показан 8Ό8-ΡΆΟΕ анализ конъюгатов ^8-6-0^, полученных в соответствии с примером 2.2, С-С8Е представлял собой очищенный ЙС-С8Е, имеющий по существу такие же характеристики, что и коммерческий продукт Ыеиродеи®. Для гель-электрофореза использовали мини-ячейку ХСе11 8иге Ьоск Μίηί Се11 (1пуйгодеи 6тЬН, Каг1кгийе, Германия) и источник энергоснабжения Сойкой Ε143 (СОЫ8ΘΚΤην, Тигийои!, В). Использовали 12% бис-трис гель вместе с подвижным буфером МОР8 8Ό8 при восстановительных условиях (оба от 1п\з1годеп СтЬН, Каг1кгийе, Германия) в соответствии с инструкциями производителя.
Полоса А. Протеиновый маркер 8ееВ1ие®Р1ик2 (1№Йгодеп 6тЬН, Каг1кгийе, Германия) 6. Маркер молекулярной массы сверху вниз: 188, 98, 62, 49, 38, 28, 17, 14, 6, 3 кДа.
Полоса В. Неочищенный продукт после конъюгации 6-С8Е с окисленным ΗΕ810/0,7 в 0,1М ИаОЛс буфере, рН 5,0.
Полоса С. Неочищенный продукт после конъюгации 6-С8Е с окисленным ΗΕ850/0,4 в 0,1М ИаОЛс буфере, рН 5,0.
Полоса Ό. Неочищенный продукт после конъюгации 6-С8Е с окисленным ΗΕ850/0,7 0,1М ИаОЛс буфере, рН 5,0.
Полоса Е. Исходное вещество 6-С8Е.
Фиг. 4.
На фиг. 4 показан 8Ό8-ΡΆΟΕ анализ конъюгатов ΗΕ8-С-С8Ε. полученных в соответствии с примером 2.3, 6-С8Е представлял собой Ыеиродеи® или 6гаиосу1е®. Для гель-электрофореза использовали мини-ячейку ХСе11 8иге Ьоск Μίηί Се11 (1№Йгодеи 6тЬН, Каг1кгийе, Германия) и источник энергоснабжения Сопкой Е143 (СО^ОИТит, Тигийои!, В). Использовали 12% бис-трис гель вместе с подвижным буфером МОР8 8Ό8 при восстановительных условиях (оба от 1иу|(годеи 6тЬН, Каг1кгийе, Германия) в соответствии с инструкциями производителя.
Полоса А. Протеиновый маркер 8ееВ1ие®Р1ик2 (Ιπνί(годен 6тЬН, Каг1кгийе, Германия) 6. Маркер молекулярной массы сверху вниз: 188, 98, 62, 49, 38, 28, 17, 14, 6, 3 кДа.
Полоса В. Неочищенный продукт (ί-Ν) в соответствии с примером 2.3.
Полоса С. Неочищенный продукт (ίί-Ν) в соответствии с примером 2.3.
Полоса Ό. Неочищенный продукт (ίίί-Ν) в соответствии с примером 2.3.
Полоса Е. Неочищенный продукт (ίν-Ν) в соответствии с примером 2.3.
Полоса Е. Неочищенный продукт (ί-С) в соответствии с примером 2.3.
Полоса С. Неочищенный продукт (ίί-С) в соответствии с примером 2.3.
Полоса Н. Неочищенный продукт (ίίί-С) в соответствии с примером 2.3.
Полоса I. Неочищенный продукт (ίν-С) в соответствии с примером 2.3.
Полоса 1. Иеиродеи®.
Фиг. 5.
На фиг. 5 показан 8Ό8-ΡΆΟΕ анализ конъюгатов ΗΕ8-Ο-Ε8Ε, полученных в соответствии с примером 2.4, С-С8Е представлял собой очищенный ЙС-С8Е, имеющий по существу такие же характеристики, что и коммерческий продукт Иеиродеи®. Для гель-электрофореза использовали мини-ячейку ХСе11 8иге Ьоск М1ш Се11 (1ит1(годеи СтЬН, Каг1кгийе, Германия) и источник энергоснабжения Соикой Ε143 (СОИ8ОКТит, Тигийои!, В). Использовали 12% бис-трис гель вместе с подвижным буфером МОР8 8Ό8 при восстановительных условиях (оба от ШтЦгодеи СтЬН, Каг1кгийе, Германия) в соответствии с инструкциями производителя.
Полоса А. Протеиновый маркер 8ееВ1ие®Р1ик2 (1ит1(годеи СтЬН, Каг1кгийе, Германия) 6. Маркер молекулярной массы сверху вниз: 188, 98, 62, 49, 38, 28, 17, 14, 6, 3.
Полоса В. Неочищенный продукт (νί) в соответствии с примером 2.4.
Полоса С. Неочищенный продукт (ν) в соответствии с примером 2.4.
Полоса Ό. Исходное вещество С-С8Е.
Полоса Е. Протеиновый маркер 8ееВ1ие®Р1ик2 (1иу|(годеи СтЬН, Каг1кгийе, Германия) 6. Маркер молекулярной массы сверху вниз: 188, 98, 62, 49, 38, 28, 17, 14, 6, 3.
Полоса Е. Неочищенный продукт (ίχ) в соответствии с примером 2.4.
- 42 010501
Полоса С. Неочищенный продукт (νίίί) в соответствии с примером 2.4.
Полоса Н. Неочищенный продукт (νίί) в соответствии с примером 2.4.
Полоса I. Исходное вещество С-С8Р.
Фиг. 6.
На фиг. 5 показан 808-РАСЕ анализ конъюгатов НЕ8-С-С8Р, полученных в соответствии с примером 2.5, С-С8Р представлял собой очищенный ЬС-С8Р, имеющий по существу такие же характеристики, что и коммерческий продукт №иродеп®. Для гель-электрофореза использовали мини-ячейку ХСе11 8иге Ьоск М1ш Се11 (йгсЦгодеп СтЬН, КагкгиЬе, Германия) и источник энергоснабжения Сопзой Е143 (Έ.ΌΝ8ОРТпу, Титйои!, В). Использовали 10% бис-трис гель вместе с подвижным буфером МОР8 8Ό8 при восстановительных условиях (оба от Iην^ΐ^οдеη СтЬН, Каг1згиЬе, Германия) в соответствии с инструкциями производителя.
Полоса А. Протеиновый маркер 8ееВ1ие®Р1из2 (Iην^ΐ^οдеη СтЬН, Каг1згиЬе, Германия) 6. Маркер молекулярной массы сверху вниз: 188, 98, 62, 49, 38, 28, 17, 14, 6, 3 кДа.
Полоса В. Неочищенный продукт в соответствии с примером 2.5.
Полоса С. Исходное вещество С-С8Р.
Фиг. 7.
На фиг. 7 показан 808-РАСЕ анализ конъюгатов НЕ8-С-С8Р, полученных в соответствии с примером 2.6. Для гель-электрофореза использовали мини-ячейку ХСе11 8иге Ьоск М1ш Се11 (Iην^ΐ^οдеη СтЬН, Каг1згиЬе, Германия) и источник энергоснабжения Сопзой Е143 (СО^ОКТпу, ТитЬон!, В). Использовали 12% бис-трис гель вместе с подвижным буфером МОР8 8Ό8 при восстановительных условиях (оба от Iην^ΐ^οдеη СтЬН, Каг1згиЬе, Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Образцы, имеющие объем, превышающий 15 мкл, концентрировали в вакууме до указанного объема.
Полоса А. Протеиновый маркер 8ееВ1ие®Р1из2 (Iην^ΐ^οдеη СтЬН, Каг1згиЬе, Германия) 6. Маркер молекулярной массы сверху вниз: 188, 98, 62, 49, 38, 28, 17, 14, 6, 3 кДа.
Полоса В. Конъюгация ГЬ-2 с альдегидо-НЕ8, синтезированным, как описано в примере 1.9.
Полоса С. Конъюгация ГЬ-2 с альдегидо-НЕ8, синтезированным, как описано в примере 1.10.
Полоса Ό. Контроль: ΣΕ-2, обработанный боргидридом натрия в отсутствие альдегидо-НЕ8.
Полоса Е. Конъюгация ΣΕΝ-альфа с альдегидо-НЕ8, синтезированным, как описано в примере 1.9.
Полоса Р. Конъюгация ΓΕΝ-альфа с альдегидо-НЕ8, синтезированным, как описано в примере 1.10.
Полоса С. Контроль: ^Ν-альфа, обработанный боргидридом натрия в отсутствие альдегидо-НЕ8. Фиг. 8.
На фиг. 8 показан 808-РАСЕ анализ конъюгатов НЕ8-С-С8Р, полученных в соответствии с примером 2.6. Для гель-электрофореза использовали мини-ячейку ХСе11 8иге Ьоск М1ш Се11 (Iην^ΐ^οдеη СтЬН, Каг1згиЬе, Германия) и источник энергоснабжения Сопзой Е143 (СО^ОКТпу, ТитЬон!, В). Использовали 12% бис-трис гель вместе с подвижным буфером МОР8 8Ό8 при восстановительных условиях (оба от Iην^ΐ^οдеη СтЬН, Каг1згиЬе, Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Образцы, имеющие объем, превышающий 15 мкл, концентрировали в вакууме до указанного объема.
Полоса А. Протеиновый маркер 8ееВ1ие®Р1из2 (Iην^ΐ^οдеη СтЬН, Каг1згиЬе, Германия) 6. Маркер молекулярной массы сверху вниз: 188, 98, 62, 49, 38, 28, 17, 14, 6, 3 кДа.
Полоса В. Конъюгация ГЬ-3 с альдегидо-НЕ8, синтезированным, как описано в примере 1.9.
Полоса С. Конъюгация ГЬ-3 с альдегидо-НЕ8, синтезированным, как описано в примере 1.10.
Полоса Ό. Контроль: ΣΕ-3, обработанный боргидридом натрия в отсутствие альдегидо-НЕ8.
Полоса Е. Конъюгация миоглобина с альдегидо-НЕ8, синтезированным, как описано в примере 1.9.
Полоса Р. Конъюгация миоглобина с альдегидо-НЕ8, синтезированным, как описано в примере 1.10.
Полоса С. Контроль: миоглобин, обработанный боргидридом натрия в отсутствие альдегидо-НЕ8.
Фиг. 9.
На фиг. 8 показан 808-РАСЕ анализ конъюгатов НЕ8-С-С8Р, полученных в соответствии с примером 2.6. Для гель-электрофореза использовали мини-ячейку ХСе11 8иге Ьоск М1ш Се11 (Iην^ΐ^οдеη СтЬН, Каг1згиЬе, Германия) и источник энергоснабжения Сопзой Е143 (СО^ОКТпу, ТитЬон!, В). Использовали 3-8% трис-ацетатный гель вместе с подвижным буфером трис-ацетат 8Ό8 при восстановительных условиях (оба от Iην^ΐ^οдеη СтЬН, Каг1згиЬе, Германия) в соответствии с инструкциями производителя.
Полоса А. Протеиновый маркер 8ееВ1ие®Р1из2 (Iην^ΐ^οдеη СтЬН, Каг1згиЬе, Германия) 6. Маркер молекулярной массы сверху вниз: 188, 98, 62, 49, 38, 28, 17, 14, 6, 3 кДа.
Полоса В. Конъюгация В8А с альдегидо-НЕ8, синтезированным, как описано в примере 1.9.
Полоса С. Конъюгация В8А с альдегидо-НЕ8, синтезированным, как описано в примере 1.10.
Полоса Ό. Контроль: В8А, обработанный боргидридом натрия в отсутствие альдегидо-НЕ8.
Фиг. 10.
На фиг. 10 показан 808-РАСЕ анализ конъюгатов НЕ8-С-С8Р, полученных в соответствии с примером 2.6. Для гель-электрофореза использовали мини-ячейку ХСе11 8иге Ьоск М1ш Се11 (Iην^ΐ^οдеη СтЬН, Каг1згиЬе, Германия) и источник энергоснабжения С’опзоП Е143 (СО^ОКТпу, ТитЬонЕ В). Ис
- 43 010501 пользовали 12% бис-трис гель вместе с подвижным буфером МОРЗ ЗИЗ при восстановительных условиях (оба от Ыуйгодеп СтЬН. Кайкгийе, Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Образцы, имеющие объем, превышающий 15 мкл, концентрировали в вакууме до указанного объема.
Полоса А. Протеиновый маркер ЗееВ1ие®Р1ик2 Дпуйгодеп СтЬН, Кайкгийе, Германия) 6. Маркер молекулярной массы сверху вниз: 188, 98, 62, 49, 38, 28, 17, 14, 6, 3 кДа.
Полоса В. Конъюгация ЗОИ с альдегидо-ΗΕδ, синтезированным, как описано в примере 1.9.
Полоса С. Конъюгация ЗОИ с альдегидо-ΗΕδ, синтезированным, как описано в примере 1.10.
Полоса Ό. Контроль: ЗОИ, обработанный боргидридом натрия в отсутствие альдегидо-ΗΕδ.
Полоса Е. Контроль: ЕРО, обработанный боргидридом натрия в отсутствие альдегидо-ΗΕδ.
Полоса Е. Конъюгация ЕРО с альдегидо-ΗΕδ, синтезированным, как описано в примере 1.9.
Полоса С. Конъюгация ЕРО с альдегидо-ΗΕδ, синтезированным, как описано в примере 1.10.
Полоса Н. Конъюгация ΓΕΝ-бета с альдегидо-ΗΕδ, синтезированным, как описано в примере 1.9.
Полоса I. Конъюгация ΓΕΝ-бета с альдегидо-ΗΕδ, синтезированным, как описано в примере 1.10. Полоса Г Контроль: ΣΕΝ-бета, обработанный боргидридом натрия в отсутствие альдегидо-ΗΕδ. Фиг. 11.
На фиг. 11 показан 8Ό8-ΡΑΟΕ анализ конъюгатов ΗΕδ-С-СЗЕ. полученных в соответствии с примером 2.6. Для гель-электрофореза использовали мини-ячейку ХСе11 Зиге Боек Μίηί Се11 Дпуйгодеп СтЬК Каг1кгийе, Германия) и источник энергоснабжения Сопкой Е143 (ΓΌΝδΟΡΤην. Тигпйои!, В). Использовали 3-8% трис-ацетатный гель вместе с подвижным буфером трис-ацетат ЗЭЗ при восстановительных условиях (оба от Шуйгодеп СтЬК Каг1кгийе, Германия) в соответствии с инструкциями производителя.
Полоса А. протеиновый маркер ЗееВ1ие®Р1ик2 Дпуйгодеп СтЬИ Кагкгийе, Германия) 6. Маркер молекулярной массы сверху вниз: 188, 98, 62, 49, 38, 28, 17, 14, 6, 3 кДа.
Полоса В. Конъюгация АТ III с альдегидо-ΗΕδ, синтезированным, как описано в примере 1.9.
Полоса С. Конъюгация АТ III с альдегидо-ΗΕδ, синтезированным, как описано в примере 1.10.
Полоса Ό. Контроль: АТ III, обработанный боргидридом натрия в отсутствие альдегидо-ΗΕδ. Фиг. 12.
На фиг. 12 показаны результаты ш уйго примера 4.
На диаграмме на оси х показана концентрация в пг/мл, на оси у представлено число клеток/100000.
На диаграмме следующие сокращения относятся к С-СЗЕ/А32 Конъюгат С-СЗЕ. полученный в соответствии с примером 2.5.
С-СЗЕ/А33 Исходное вещество С-СЗЕ, использованное для получения конъюгата в примере 2.5.
С-СЗЕ/А57 Немодифицированный №и1акГа®
С-СЗЕ/А58 Немодифицированный №иродеп®
Фиг. 13.
ЗЭЗ-РАСй (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия): проходящий поток и элюат ΗΕЗ-модифицированного С-СЗЕ в соответствии с примером 2.5 после хроматографии (см. пример 3) на ОВАВ-Зерйагоке СБ-6В; 1,5% указанных фракций обессоливали ультрафильтрованием, сушили на ЗреебУас и наносили на 12,5% полиакриламидный гель.
Фиг. 14. Спектр МАЙШ/ТОЕ С-СЗЕ (см. пример 3).
Фиг. 15. Спектр МАЙШ/ТОЕ С-СЗЕ, модифицированного №З (см. пример 3).
Фиг. 16.
На фиг. 16 показаны результаты примера 5 (анализ неочищенных конъюгатов α1ΑТ-ΗΕЗ, полученных, как описано в примере 5.5, с помощью гель-электрофореза).
Для гель-электрофореза использовали мини-ячейку ХСе11 Зиге Ьоск М1ш Се11 Дпуйгодеп СтЬК Каг1кгийе, Германия) и источник энергоснабжения Ро\\'ег Рас 200 (Вю-Ваб, Мипсйеп, Ό). Использовали 38% трис-ацетатный гель вместе с трис-ацетатным подвижным буфером для ЗЭЗ в восстановительных условиях (оба от Шуйгодеп СтЬК Каг1кгийе, Германия) в соответствии с инструкциями производителя.
Полоса А. Неокрашенный ЗЭЗ Раде протеинового маркера 6,5-200 кДа (ЗΕВУΑ Й1ек1горйоге818 СтЬК ^Гбе^е^, Ό). Маркер молекулярной массы сверху вниз: 200, 116, 67, 45, 29, 21, 14,3, 6,5 кДа;
Полоса В. Конъюгирование с альдегидо-ЖЗ, как описано в примере 5.5;
Полоса С. Конъюгирование с ΗΕЗ, как описано в примере 5.6;
Фиг. 17.
На фиг. 17 представлены результаты примера 5 (анализ фракций В1-С6, собранных после ионообменной хроматографии (см. пример 5.7)
Условия гель-электрофореза см. на фиг. 16.
Полоса А. Неокрашенный ЗЭЗ Раде протеинового маркера 6,5-200 кДа (ЗΕВУΑ Й1ек1горйоге818 СтЬК ^Гбе^е^, Ό). Маркер молекулярной массы сверху вниз: 200 кДа, 116 кДа, 67 кДа, 45 кДа, 29 кДа, 21 кДа, 14,3 кДа, 6,5 кДа;
Полоса В. Фракция В1
Полоса С. Фракция С1
- 44 010501
Полоса Ό. Фракция С2
Полоса Е. Фракция С3
Полоса Р. Фракция С4
Полоса С. Фракция С5
Полоса Н. Фракция С6
Полоса Ι. А1 АТ (СТС ВюШегареийск Шс.. Ргаттдкат. МА. 1о! №. 080604А)
Фиг. 18.
На фиг. 18 показана остаточная ферментативная активность относительно концентрационной диаграммы Рго1акйп@ Н8 (Вауег νίΙη1 СтЬН. Ьеуегкикеп. Германия. Ьо! №. РК4НА43). А1АТ (СТС Вю1йегареийск Шс.. Ргаттдкат. МА. 1о! №. 080604А) и НЕ8-А1АТ-конъюгата. синтезированного. как описано в примере 5.5.
Фиг. 19. На фиг. 19 показан гель-электрофорез реакционных смесей примера 6.2 (Ь).
Для гель-электрофореза использовали мини-ячейку ХСе11 8иге Ьоск М1ш Се11 ([пуЦгодеп СтЬН. Каг1кгике. Германия) и источник энергоснабжения Сопкой Е143 (СОЖОКТпу. Тцгпйои!. В).
Использовали 12% Бис-Трис гель вместе с подвижным буфером МОР8 8Ό8 в восстановительных условиях (оба от Iην^!^οдеη СтЬН. Каг1кгике. Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Гель окрашивали с использованием Кой-синего (Саг1 Ко!к СтЬН + Со.КС. Каг1кгике. Германия) в соответствии с инструкциями производителя.
Полоса А. Протеиновый маркер Кой-Магк 8ТАХВАКЭ (Саг1 Ко!к СтЬН + Со.КС. Кайкгике. Германия). Маркер молекулярной массы сверху вниз: 200. 119. 66. 43. 29. 20. 14.3 кДа.
Полоса В. Неочищенный продукт после конъюгации С-С8Р с производным НЕ8. полученным в примере 6.1 (й).
Полоса С. Неочищенный продукт после конъюгации оГкС-С8Р с производным НЕ8. полученным в примере 6.1 (Ь).
Полоса Ό. Неочищенный продукт после конъюгации С-С8Р с производным НЕ8. полученным в примере 6.1 (]).
Полоса Е. Контроль реакции: НЕ8 50/0.7 (Мте 47000. Ό8 = 0.76).
Фиг. 20.
На фиг. 20 показан гель-электрофорез реакционных смесей примера 6.2 (й).
Для гель-электрофореза использовали мини-ячейку ХСе11 8иге Ьоск М1ш Се11 (Iην^!^οдеη СтЬН. Каг1кгике. Германия) и источник энергоснабжения Сопкой Е143 (СО^ОКТпу. Тцгпйои!. В). Использовали 12% Бис-Трис гель вместе с подвижным буфером МОР8 8Ό8 в восстановительных условиях (оба от й1уЦгодеп СтЬН. Кайкгике. Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Гель окрашивали с использованием Кой-синего (Саг1 Ко!к СтЬН + Со.КС. Кайкгике. Германия) в соответствии с инструкциями производителя.
Полоса А. Протеиновый маркер Кой-Магк 8ТАХВАКЭ (Саг1 Ко!к СтЬН + Со.КС. Кагкгике. Германия). Маркер молекулярной массы сверху вниз: 200. 119. 66. 43. 29. 20. 14.3 кДа.
Полоса В. кС-С8Р после замены буфера. как описано в примере 6.2 (с).
Полоса С. Неочищенный продукт после конъюгации С-С8Р с производным НЕ8. полученным. как описано в примере 6.1 (Г).
Полоса Ό. Неочищенный продукт после конъюгации кС-С8Р с производным НЕ8. полученным. как описано в примере 6.1 (к).
Фиг. 21. На фиг. 21 показаны результаты анализа митогенности в соответствии с примером 6.3. На оси Υ указано число клеток №8-60/мл. а на оси X - концентрация в пг/мл.
Фиг. 22. На фиг. 22 показаны результаты анализа ш у1уо в соответствии с примером 6.4.
Фиг. 23. На фиг. 23 показан анализ неочищенных конъюгатов ЕРО-НЕ8 примера 7 с использованием гель-электрофореза.
Для гель-электрофореза использовали мини-ячейку ХСе11 8иге Ьоск М1ш Се11 (Iην^!^οдеη СтЬН. Кайкгике. Германия) и источник энергоснабжения Сопкой Е143 (СО^ОКТпу. Тигпйои!. В). Использовали 10% Бис-Трис гель вместе с подвижным буфером МОР8 8Ό8 в восстановительных условиях (оба от й1уЦгодеп СтЬН. Кайкгике. Германия) в соответствии с инструкциями производителя.
Полоса А: Кой®-Магк 8ТАХОАКО (Саг1 Ко!к СтЬН + Со.КС. Кайкгике. Германия).
Маркер молекулярной массы сверху вниз: 200. 119. 66. 43. 29. 20. 14.3 кДа.
Полоса В. Конъюгация ЕРО к альдегидо-НЕ8. как описано в примере 7.3.
Полоса С. Реакция ЕРО и альдегидо-НЕ8 без использования цианоборгидрида натрия (контроль реакции А). как описано в примере 7.4.
Полоса Ό. Реакция ЕРО и цианоборгидрида натрия в отсутствие альдегидо-НЕ8 (контроль реакции В). как описано в примере 7.5.
Как это видно из фиг. 23. реакции не наблюдалось для контроля реакции А и В либо в отсутствие альдегидо-НЕ8. либо в отсутствие цианоборгидрида натрия.
Фиг. 24.
На фиг. 24 показан анализ конъюгатов ШЫ-альфа-НЕ8 примера 8.3.1 с использованием гель
- 45 010501 электрофореза.
Для гель-электрофореза использовали мини-ячейку ХСе11 8иге Ьоск М1ш Се11 Дпуйгодеп СтЬН, Каг1кгийе, Германия) и источник энергоснабжения Сопкой Е143 (СО^ОРТпу, Тигпйои!, В).
Использовали 10% Бис-Трис гель вместе с подвижным буфером МОР8 8Ό8 в восстановительных условиях (оба от Шуйгодеп СтЬН, Каг1кгийе, Германия) в соответствии с инструкциями производителя.
Полоса Х. Рой®-Магк 8ΤАN^АΡ^ (Саг1 Ро!й СтЬН +Со.КС, Каг1кгийе, Германия).
Маркер молекулярной массы сверху вниз: 200, 119, 66, 43, 29, 20, 14,3 кДа;
Полоса А. Конъюгация с альдегидо НЕ8 10/0,4, как описано в примере 8.3.1, опыт А.
Полоса В. Конъюгация с альдегидо НЕ8 10/0,7, как описано в примере 8.3.1, опыт В.
Полоса С. Конъюгация с альдегидо НЕ8 30/0,4, как описано в примере 8.3.1, опыт С.
Полоса Ό. Конъюгация с альдегидо НЕ8 30/0,7, как описано в примере 8.3.1, опыт Ό.
Полоса Е. Конъюгация с альдегидо НЕ8 50/0,4, как описано в примере 8.3.1, опыт Е.
Полоса Р. Конъюгация с альдегидо НЕ8 50/0,7, как описано в примере 8.3.1, опыт Р.
Полоса С. Реакционный контроль, без альдегидо НЕ8, как описано в примере 8.3.1, опыт С;
Полоса Ι. Реакционный контроль, без альдегидо НЕ8 и в отсутствие ^СМЕНз, как описано в примере 8.3.1, опыт Ι;
Полоса Б. Реакционный контроль, с использованием НЕ810/0,4 как описано в примере 8.3.1, опыт Б;
Полоса К. Реакционный контроль, с использованием НЕ810/0,4, но в отсутствие NаСNВΗ3, как описано в примере 8.3.1, опыт К.
Фиг. 25.
На фиг. 25 показан анализ конъюгатов БРN-альфа-ΗЕ8 примера 8.3.2 с использованием гельэлектрофореза.
Для гель-электрофореза использовали мини-ячейку ХСе11 8иге Ьоск М1ш Се11 (Шуйгодеп СтЬН, Каг1кгийе, Германия) и источник энергоснабжения Сопкой Е143 (СО^ОРТпу, Тигпйои!, В). Использовали 10% Бис-Трис гель вместе с подвижным буфером МОР8 8Ό8 в восстановительных условиях (оба от йкйгодеп СтЬН, Кайкгцйе, Германия) в соответствии с инструкциями производителя.
Полоса Х. Рой®-Магк 8ΤАN^АΡ^ (Саг1 Ро!й СтЬН + Со.КС, Каг1кгийе, Германия).
Маркер молекулярной массы сверху вниз: 200, 119, 66, 43, 29, 20, 14,3 кДа;
Полоса А. Конъюгация с альдегидо-НЕ8, как описано в пример 8.3.2, опыт А.
Полоса В. Конъюгация с альдегидо-НЕ8, как описано в пример 8.3.2, опыт В.
Полоса С. Конъюгация с альдегидо-НЕ8, как описано в пример 8.3.2, опыт С.
Полоса Ό. Конъюгация с альдегидо-НЕ8, как описано в пример 8.3.2, опыт Ό.
Полоса Е. Конъюгация с альдегидо-НЕ8, как описано в пример 8.3.2, опыт Е.
Полоса Р. Конъюгация с альдегидо-НЕ8, как описано в пример 8.3.2, опыт Р.
Полоса С. Реакционный контроль, с использованием НЕ8, как описано в пример 8.3.2, опыт С.
Как это видно на фиг. 25, в условиях реакционного контроля С реакции не наблюдалось.
Фиг. 26.
На фиг. 26 показан анализ конъюгатов БРN-альфа-ΗЕ8 примера 8.3.3 с использованием гельэлектрофореза.
Для гель-электрофореза использовали мини-ячейку ХСе11 8иге Ьоск М1ш Се11 (Шуйгодеп СтЬН, Каг1кгийе, Германия) и источник энергоснабжения Сопкой Е143 (СО^ОРТпу, Тигпйои!, В). Использовали 10% Бис-Трис гель вместе с подвижным буфером МОР8 8Ό8 в восстановительных условиях (оба от йкйгодеп СтЬН, Кайкгцйе, Германия) в соответствии с инструкциями производителя.
Анализ неочищенных конъюгатов ΙΡΝα-4Ε8 с помощью гель-электрофореза.
Полоса А. Рой®-Магк 8ΤАN^АΡ^ (Саг1 Ро!й СтЬН + Со.КС, Каг1кгийе, Германия). Маркер молекулярной массы сверху вниз: 200 кДа, 119 кДа, 66 кДа, 43 кДа, 29 кДа, 20 кДа, 14,3 кДа.
Полоса В. Конъюгация ΙΡΝα с альдегидо НЕ8, как описано в 8.3.3.1.
Полоса С. Конъюгация ΙΡΝα с альдегидо НЕ8, как описано в 8.3.3.2.
Полоса Ό. Конъюгация ΙΡΝα с НЕ810/0,4-натрий (реакционный контроль), как описано в 8.3.3.3. Фиг. 27.
На фиг. 27 показан анализ конъюгатов БΡN-альфа-ΗЕ8 примера 8.3.4 с использованием гельэлектрофореза.
Для гель-электрофореза использовали мини-ячейку ХСе11 8иге Ьоск М1ш Се11 (Шуйгодеп СтЬН, Кайкгцйе, Германия) и источник энергоснабжения Сопкой Е143 (СО^ОРТпу, Тцгпйои!, В). Использовали 10% Бис-Трис гель вместе с подвижным буфером МОР8 8Ό8 в восстановительных условиях (оба от йкйгодеп СтЬН, Кайкгцйе, Германия) в соответствии с инструкциями производителя.
Полоса Х. Рой®-Магк 8ΤАN^АΡ^ (Саг1 Ро!й СтЬН + Со.КС, Каг1кгийе, Германия).
Маркер молекулярной массы сверху вниз: 200, 119, 66, 43, 29, 20, 14,3 кДа;
Полоса А. Конъюгация с альдегидо-НЕ8, как описано в пример 8.3.4.
Полоса В. Контроль реакции; конъюгация с НЕ8 (М^ = 7,6 кДа, Ό8 = 0,41), как описано в примере 8.3.4.
- 46 010501
Как это видно из фиг. 27, для реакционного контроля В реакции не наблюдалось.
Фиг. 28.
На фиг. 28 показана пролиферативная активность Ιηίτοη А по сравнению со стандартом ΝΙΗ τΗΙΡΝальфа 2а в соответствии с примером 9.1.
Фиг. 29.
На фиг. 29 показана относительная активность ίη νίίτο имитационно инкубированного ΙΡΝ-альфаНЕ8 по сравнению с немодифицированным исходным веществом ΙΡΝ-альфа в соответствии с примером 9.2.
Фиг. 30.
На фиг. 30 показана относительная активность ίη νίίτο конъюгатов ШМ-альфа-НЕ8 по сравнению с немодифицированным исходным веществом ΙΡΝ-альфа, Ιηίτοη А и Редакук, соответственно, в соответствии с примером 9.3.
Фиг. 31.
На фиг. 31 показана относительная активность ίη νίίτο конъюгата ШН-альфа-НЕ8 по сравнению с Ιηίτοη А в соответствии с примером 9.4.
Фиг. 32.
На фиг. 32 показано разведение образцов сыворотки крови, требуемое для достижения 50% защиты клеток ΜΌΒΚ против вирусной инфекции, относительно времени после внутривеннного инфицирования мышей в дозе 30 мкг/кг. Сыворотка, полученная от мышей, обработанных немодифицированным исходным веществом, обладает очень низким противовирусным действием. Модификация ΙΡΝ-альфа с использованием НЕ8 в значительной степени продлевает противовирусное действие сыворотки. Период полураспада увеличивается с увеличением молекулярной массы НЕ8, использованного для модификации ΙΡΝ-альфа (см. пример 10).
Фиг. 33.
На фиг. 33 показаны данные РК-исследования на кроликах в соответствии с примером 11. ΙΡΝальфа-НЕ8 продемонстрировал отчетливое увеличение продолжительности периода полураспада по сравнению с исходным веществом ΙΡΝ-альфа. Для > 24 ч (приблизительно < 1000 пКи/мл) кривая для немодифицированного вещества выравнивается и почти не наблюдается дальнейшего снижения активности.
Фиг. 34.
На фиг. 34 показаны данные РК-исследования на кроликах в соответствии с примером 11. Оценку данных проводили в период времени от 4 до 24 часов. ШН-альфа-НЕ8 продемонстрировал отчетливое увеличение продолжительности периода полураспада по сравнению с немодифицированным исходных веществом ΙΡΝ-альфа.
Фиг. 35.
На фиг. 35 показана статистическая оценка РК-исследования (показан период до 12 ч) в соответствии с примером 11. В случае немодифицированного исходного вещества (см. фиг. 35(а)) концентрация падала почти до нуля во время первых двух часов, тогда как ШН-альфа-НЕ8 продемонстрировал отчетливое увеличение продолжительности периода полураспада (см. фиг. 35(Ь)).
Фиг. 36.
На фиг. 36 показаны результаты примера 6.5 (сравнение определения периода полураспада конъюгата Ηβδ-Ο-ΟδΡ согласно изобретению, Кеикйа® и Nеиροдеη®).
Фиг. 37.
На фиг. 37 показаны графически результаты примера 10,3 (противовирусная активность конъюгатов ШН-альфа-НЕ8).
Фиг. 38.
На фиг. 38 показаны графически результаты примера 9,5 (противовирусная активность конъюгатов IΡN-альфа-ΗЕ8).
Примеры.
Пример 1. Синтез функционализированного альдегидными группами гидроксиэтилкрахмала.
Пример 1.1(а): Синтез гидроксиэтилкрахмала, селективно окисленного по его восстановительному концу путем окисления периодатом и выдерживания при 0°С.
100 мг оксо-НЕ810/0,4 (Μν = 10 кДа, Ό8 = 0,4, получен с использованием 8ιιρπιιηο1 Раген1ега1 С.о11οίάκ СтЬН, Βο8Ьасй-Βοάйе^т, Германия; в соответствии с патентом Германии ЭЕ 19628705 А1) растворяли в 5 мл 20 мМ натрий фосфатного буфера, рН 7,2 и охлаждали до 0°С. 21,4 мг периодата натрия (ЕкАа, 81дта-А1бпск Океане СтЬН, Τаиίк^^сйеη, Германия) растворяли в 5 мл того же буфера и охлаждали до 0°С. Оба раствора смешивали и после выдерживания в течение 10 мин при 0°С добавляли 0,73 мл глицерина и реакционную смесь выдерживали при 21°С в течение 10 мин. Реакционную смесь подвергали диализу в течение 24 ч против воды 81'1аке8кт тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, РетЬю 8с1енсе8 ПеЩксЫаиб СтЬН, Βοηη, Германия) и лиофилизовали.
Молекулярная масса НЕ8 10/0,4, измеренная с использованием ЕАЕЕ8-СРС, составляла 10,5 кДа, и Ό8 составляла 0,41.
- 47 010501
Пример 1.1(Ь). Синтез гидроксиэтилкрахмала, селективно окисленного по его восстановительному концу путем окисления периодатом и выдерживания при 21°С.
100 мг оксо-НЕ810/0, 4 (М\У = 10 кДа, Ό8 = 0,4, получен с использованием 8иргато1 Рагеп!ега1 Со11о1бк СтЬН, ВокЬасй-Вобйе1т, Германия; в соответствии с патентом Германии ΌΕ 19628705 А1) растворяли в 5 мл 20 мМ натрий фосфатного буфера, рН 7,2. 21,4 мг периодата натрия (Е1ика, 8|дта-Л1бпс11 Сйете СтЬН, ΤаиГк^^сйеη, Германия) растворяли в 5 мл того же буфера. Оба раствора смешивали и после выдерживания в течение 10 мин при 21°С добавляли 0,73 мл глицерина и реакционную смесь выдерживали при 21°С в течение 10 мин. Реакционную смесь подвергали диализу в течение 24 ч против воды 8паке8кш тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, РегЫо 8с1епсек ЭеШксЫапб СтЬН, Вопп, Германия) и лиофилизовали.
Молекулярная масса НЕ8 10/0,4, измеренная с использованием ΓΑΓΓ8^ΡΧ составляла 10,5 кДа, и Ό8 составляла 0,41.
Пример 1.2(а). Синтез функционализированного альдегидными группами гидроксиэтилкрахмала, путем окисления периодатом гидроксиэтилкрахмала с неокисленным восстановительным концом и выдерживания при 0°С.
100 мг Оксо-НЕ810/0,4 (Μ\ν = 10 кДа, Ό8 = 0,4, 8иргато1 Рагеп!ега1 Со11о1бк СтЬН, ВокЬасйВобйе1т, Германия) растворяли в 5 мл 20 мМ натрий фосфатного буфера, рН 7,2 и охлаждали до 0°С.
21,4 мг периодата натрия (Е1ика, 8^дта-Α1б^^сй Сйет1е СтЬН, Τаиίк^^сйеη, Германия) растворяли в 5 мл того же буфера и охлаждали до 0°С. Оба раствора смешивали и после выдерживания в течение 10 мин при 0°С добавляли 0,73 мл глицерина и реакционную смесь выдерживали при 21°С в течение 10 мин. Реакционную смесь подвергали диализу в течение 24 ч против воды 8паке8кт тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, РегЫо 8с1епсек ЭеШксЫапб СтЬН, Вопп, Германия) и лиофилизовали.
Молекулярная масса НЕ8 10/0,4, измеренная с использованием ^Α^^8-СΡС, составляла 8,5 кДа, и Ό8 составляла 0,41.
Пример 1.2 (Ь). Синтез функционализированного альдегидными группами гидроксиэтилкрахмала, путем окисления периодатом гидроксиэтилкрахмала с неокисленным восстановительным концом и выдерживания при 21°С.
100 мг Оксо-НЕ810/0,4 (М\У = 10 кДа, Ό8 = 0,4, получен с использованием 8иргато1 Рагеп!ега1 Со11о1бк СтЬН, ВокЬасй-Кобйет, Германия) растворяли в 5 мл 20 мМ натрий фосфатного буфера, рН 7,2.
21,4 мг периодата натрия (Е1ика, 8^дта-Α1б^^сй Сйет1е СтЬН, Τаиίк^^сйеη, Германия) растворяли в 5 мл того же буфера. Оба раствора смешивали и после выдерживания в течение 10 мин при 21°С добавляли 0,73 мл глицерина и реакционную смесь выдерживали при 21°С в течение 10 мин. Реакционную смесь подвергали диализу в течение 24 ч против воды 8паке8кт тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, РегЫо 8с1епсек ЭеШксЫапб СтЬН, Вопп, Германия) и лиофилизовали.
Молекулярная масса НЕ8 10/0,4, измеренная с использованием ^Α^^8-СΡС, составляла 8,5 кДа, и Ό8 составляла 0,41.
Пример 1.3. Синтез функционализированного альдегидными группами гидроксиэтилкрахмала из аминофункционализированного гидроксиэтилкрахмала и 4-формилбензойной кислоты.
Оксо-НЕ8 10/0,4 (Μ\ν = 10 кДа, Ό8 = 0,4) получали с использованием 8иргато1 Рагеп!ега1 Со11о1бк СтЬН, КокЬасй-Вобйет, Германия; в соответствии с патентом Германии ОЕ 19628705 А1.
Молекулярная масса НЕ8 10/0,4, измеренная с использованием ^Α^^8-СΡС, составляла 14,5 кДа, и Ό8 составляла 0,41.
5,1 г (0,51 ммоль) оксо-НЕ810/0,4 растворяли в 15 мл безводного диметилсульфоксида (ДМСО, Е1ика, 8^дта-Α1б^^сй Сйет1е СтЬН, ΤаиГк^^сйеη, Германия) и добавляли по каплям в атмосфере азота к раствору 5,1 мл (51 ммоль) 1,4-диаминобутана в 10 мл безводного диметилсульфоксида и перемешивали при 40°С в течение 19 ч. Реакционную смесь добавляли к смеси 80 мл этанола и 80 мл ацетона. Полученный осадок отделяли центрифугированием, промывали смесью 20 мл этанола и 20 мл ацетона и повторно растворяли в 80 мл воды. Раствор подвергали диализу в течение 4 дней против воды 8паке8кш тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, РегЫо 8Ыепсек ЭеШксЫапб СтЬН, Вопп, Германия) и впоследствии лиофилизовали. Выход составлял 67% (3,4 г) амино-НЕ8 10/0,4.
150 мг 4-формилбензойной кислоты и 230 мг 1-гидрокси-1Н-бензотриазола (оба от Α16ιίΛ, 81дтаΑ16ιίΛ Сйет1еСтЬН, ΤаиΠс^^с1^еη. Ό) растворяли в 10 мл Ν,Ν-диметилформамида (качество для пептидного синтеза, ВюкоЫе, Уа1кепкчаагб, Нидерланды) и добавляли 204 мкл Ν,Ν'-диизопропилкарбодиимида.
После выдерживания при 21°С в течение 30 мин добавляли 1 г амино-НЕ8 10/0,4. После встряхивания в течение 19 ч при 22°С реакционную смесь добавляли к 84 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об./об.). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, повторно растворяли в 50 мл воды и подвергали диализу в течение 2 дней против воды (8паке8кш тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, РегЫо 8Ыепсек ЭеШксЫапб СтЬН, Вопп, Германия) и лиофилизовали.
Пример 1.4. Синтез функционализированного альдегидными группами гидроксиэтилкрахмала из гидроксиэтилкрахмала и формилбензойной кислоты.
- 48 010501
Оксо-НЕ8 10/0,7 (МА = 10 кДа, Ό8 = 0,7) получали с использованием 8иргато1 Рагеп!ега1 Со11о1б§ ОтЬН, КоЛасй-ВобЬет, Германия; в соответствии с патентом Германии ЭЕ 19628705 А1.
Молекулярная масса НЕ8 10/0,7, измеренная с использованием ГАГЬ8-ОРС, составляла 14,5 кДа, и Ό8 составляла 0,76.
мг 4-формилбензойной кислоты и 180 мг 1-гидрокси-1Н-бензотриазола (оба от А1бг1сй, 81дтаА1бпс11 СйешеОтЬН, Таи£1с1гс11еп, Ό) растворяли в 5 мл Ν,Ν-диметилформамида (ДМФ, качество для пептидного синтеза, ВюкоЫе, УаЫепктеаагб, Нидерланды) и добавляли 78 мкл Ν,Ν'диизопропилкарбодиимида. После выдерживания при 21°С в течение 30 мин добавляли 0,5 г амино-НЕ8 10/0,7. После встряхивания в течение 19 ч при 22°С реакционную смесь добавляли к 37,5 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об./об.). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, повторно растворяли в 2,5 мл воды и 2,5 мл ДМФ и опять осаждали, как описано выше. Продукт реакции собирали центрифугированием, как описано, растворяли в 10 мл воды, и подвергали диализу в течение 2 дней против воды (8паке8кт тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, РегЫо 8с1епсе§ ЭеийсЫапб ОтЬН, Вопп, Германия) и лиофилизовали.
Пример 1.5. Синтез функционализированного альдегидными группами гидроксиэтилкрахмала из гидроксиэтилкрахмала и формилбензойной кислоты.
Оксо-НЕ8 10/0,7 (МА = 10 кДа, Ό8 = 0,7) получали с использованием 8иргато1 Рагеп!ега1 Со11о1б§ ОтЬН, КоЛасй-ВобЬет, Германия.
Молекулярная масса НЕ8 10/0,7, измеренная с использованием ГАГЬ8-ОРС, составляла 10,5 кДа, и Ό8 составляла 0,76.
мг 4-формилбензойной кислоты и 108 мг 1-гидрокси-1Н-бензотриазола (оба от ЛИпсй 8ЦтаА1бпс11 Сйет1еОтЬН, ТаШЫгсНеп, Ό) растворяли в 3 мл Ν,Ν-диметилформамида (качество для пептидного синтеза, ВюкоЫе, Уа1кеп8теаагб, Нидерланды) и добавляли 47 мкл Ν,Ν'-диизопропилкарбодиимида. После выдерживания при 21°С в течение 30 минут добавляли 0,3 г амино-НЕ8 10/0,7. После встряхивания в течение 19 ч при 22°С реакционную смесь добавляли к 23 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об./об.). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, повторно растворяли в 1,5 мл воды и 1,5 мл ДМФ и опять осаждали, как описано выше. Продукт реакции собирали центрифугированием, как описано, растворяли в 10 мл воды, и подвергали диализу в течение 2 дней против воды (8паке8кш тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, РегЫо 8с1епсе§ ЭеийсЫапб ОтЬН, Вопп, Германия) и лиофилизовали.
Пример 1.6. Синтез функционализированного альдегидными группами гидроксиэтилкрахмала из аминофункционализированного гидроксиэтилкрахмала и пентафторфенилового эфира формилбензойной кислоты.
Оксо-НЕ8 10/0,7 (МА = 10 кДа, Ό8 = 0,7) получали с использованием 8иргато1 Рагеп!ега1 Со11о1б§ ОтЬН, КоЛасй-ВобЬет, Германия; в соответствии с патентом Германии ЭЕ 19628705 А1.
Молекулярная масса НЕ8 10/0,7, измеренная с использованием ЕАЕЬ8-ОРС составляла 14,5 кДа, и Ό8 составляла 0,76.
6,0 г (0,6 ммоль) оксо-НЕ810/0,7 растворяли в 20 мл безводного диметилсульфоксида (ДМСО, Е1ика, 81дта-А1бг1сй СИение ОтЬН, ТаЫкггсйеп, Германия) и добавляли по каплям в атмосфере азота к раствору 6 мл (60 ммоль) 1,4-диаминобутана в 11 мл безводного диметилсульфоксида и перемешивали при 40°С в течение 19 ч. Реакционную смесь добавляли к смеси 80 мл этанола и 80 мл ацетона. Полученный осадок отделяли центрифугированием, промывали смесью 20 мл этанола и 20 мл ацетона и повторно растворяли в 80 мл воды. Раствор подвергали диализу в течение 4 дней против воды (8паке8кш тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, РегЫо 8Ыепсе§ ЭеийсЫапб ОтЬН, Вопп, Германия) и впоследствии лиофилизовали. Выход составлял 52% (3,15 г) амино-НЕ8 10/0,7.
Пентафторфениловый эфир 4-формилбензойной кислоты синтезировали, как описано в публикации 1. 8. Ыпбкеу а! а1., Те!гайебгоп 50 (1994), стр. 8941-68, в частности на стр. 8956. 50 мг Оксо-НЕ8 10/0,7 растворяли в 0,5 мл Ν,Ν-диметилформамида (качество для пептидного синтеза, ВюкоЫе, Уа1кеп8теаагб, Нидерланды) и добавляли 15,3 мг пентафторфенилового эфира 4-формилбензойной кислоты. После встряхивания в течение 22 ч при 22°С реакционную смесь добавляли к 3,5 мл охлажденного на льду 2пропанола. Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, промывали 4 мл охлажденного на льду 2-пропанола, растворяли в 50 мл воды, и подвергали диализу в течение 2 дней против воды (8паке8кш тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, РегЫо 8с1епсе§ ЭеийсЫапб ОтЬН, Вопп, Германия) и лиофилизовали.
Пример 1.7. Синтез функционализированного альдегидными группами гидроксиэтилкрахмала из аминофункционализированного гидроксиэтилкрахмала и пентафторфенилового эфира формилбензойной кислоты.
Оксо-НЕ8 10/0,7 (МА = 10 кДа, Ό8 = 0,7) получали с использованием 8иргато1 Рагеп!ега1 Со11о«5
ОтЬН, КоЛасй-ВобЬет, Германия; в соответствии с патентом Германии ЭЕ 19628705 А1.
Молекулярная масса НЕ8 10/0,7, измеренная с использованием ЕАЕЬ8-ОРС составляла 14,5 кДа, и
Ό8 составляла 0,76.
Пентафторфениловый эфир 4-формилбензойной кислоты синтезировали, как описано в публикации
- 49 010501
1. 8. Ьшбксу а! а1., ТсЕаксбгоп 50 (1994), стр. 8941-68, в частности на стр. 8956. 200 мг Оксо-НЕ8 10/0,7 растворяли в 2 мл Ν,Ν-диметилформамида (качество для пептидного синтеза, ВюкоЫс, Уа1ксп8етаагб, Нидерланды) и добавляли 61,2 мг пентафторфенилового эфира 4-формилбензойной кислоты. После встряхивания в течение 22 ч при 22°С реакционную смесь добавляли к 15 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об./об.). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С и повторно растворяли в 1,4 мл воды и 0,7 мл ДМФ и опять осаждали, как описано выше. Продукт реакции собирали центрифугированием, как описано выше, растворяли в 10 мл воды, и подвергали диализу в течение 2 дней против воды (8пакс8кш тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, РсгЫо 8с1спес5 Оси^сЫапб СтЬН, Вопп, Германия) и лиофилизовали.
Пример 1.8. Синтез функционализированного альдегидными группами гидроксиэтилкрахмала из аминофункционализированного гидроксиэтилкрахмала и 4-(4-формил-3,5-диметоксифенокси)бутановой кислоты.
Оксо-НЕ8 10/0,4 (МА = 10 кДа, Ό8 = 0,4) получали с использованием 8иргато1 Рагсп1сга1 Со11о1б§ СтЬН, КокЬисЬ-ЯобЬст, Германия; в соответствии с патентом Германии ЭЕ 19628705 А1.
Молекулярная масса НЕ8 10/0,4, измеренная с использованием ЬАЬЬ8-6РС, составляла 14,5 кДа, и Ό8 составляла 0,41.
5,1 г (0,51 ммоль) оксо-НЕ810/0,4 растворяли в 15 мл безводного диметилсульфоксида (ДМСО, Ника, 8|дта-А1бпс11 СИсиис СтЬН, ТаиГИгсксп, Германия) и добавляли по каплям в атмосфере азота к раствору 5,1 мл (51 ммоль) 1,4-диаминобутана в 10 мл безводного диметилсульфоксида и перемешивали при 40°С в течение 19 ч. Реакционную смесь добавляли к смеси 80 мл этанола и 80 мл ацетона. Полученный осадок отделяли центрифугированием, промывали смесью 20 мл этанола и 20 мл ацетона и повторно растворяли в 80 мл воды. Раствор подвергали диализу в течение 4 дней против воды (8иакс8к^и тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, РсгЫо 80^^5 Оси^сЫапб СтЬН, Вопп, Германия) и впоследствии лиофилизовали. Выход составлял 67% (3,4 г) амино-НЕ8 10/0,4.
80,5 мг 4-(4-формил-3,5-диметоксифенокси)бутановой кислоты (Са1ЫосЬст-НоуаЫосИст, ЬаиГс1Гтдсп, СН) и 61 мг 1-гидрокси-1Н-бензотриазола (А1бпсИ, 81дта-А1бпсИ СЬст1с6тЬН, ТаиГ1с^^с1^си, Ό) растворяли в 3 мл Ν,Ν-диметилформамида (качество для пептидного синтеза, ВюкоЫс, УаПюг^гаагФ Нидерланды) и добавляли 45,4 мкл Ν,Ν'-диизопропилкарбодиимида.
После выдерживания при 21°С в течение 30 мин добавляли 0,3 г амино-НЕ8 10/0,4. После встряхивания в течение 22 ч при 22°С реакционную смесь добавляли к 23 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об./об.). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С и повторно растворяли в 2 мл воды и 1 мл ДМФ и опять осаждали, как описано выше. Продукт реакции собирали центрифугированием, как описано выше, растворяли в 10 мл воды, и подвергали диализу в течение 1 дня против воды (8пакс8кт тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, РсгЫо 8с1спсс5 ПсЫзсШапб СтЬН, Вопп, Германия) и лиофилизовали.
Пример 1.9. Синтез функционализированного альдегидными группами гидроксиэтилкрахмала из аминофункционализированного гидроксиэтилкрахмала и 4-формилбензойной кислоты.
Оксо-НЕ8 10/0,4 (МА = 10 кДа, Ό8 = 0,4) получали с использованием 8иргато1 Рагсп1сга1 Со11оЫ5 СтЬН, Ко8ЬасИ-К.обЬс1т, Германия; в соответствии с патентом Германии ЭЕ 19628705 А1.
Молекулярная масса НЕ8 10/0,4, измеренная с использованием ЬАЬЬ8-6РС, составляла 14,5 кДа, и Ό8 составляла 0,41.
5,1 г (0,51 ммоль) оксо-НЕ810/0,4 растворяли в 15 мл безводного диметилсульфоксида (ДМСО, Ийка, 8|дта-А1бпс11 СИсиис СтЬН, ТаиГЕхгсксп, Германия) и добавляли по каплям в атмосфере азота к раствору 5,1 мл (51 ммоль) 1,4-диаминобутана в 10 мл безводного диметилсульфоксида и перемешивали при 40°С в течение 19 ч. Реакционную смесь добавляли к смеси 80 мл этанола и 80 мл ацетона. Полученный осадок отделяли центрифугированием, промывали смесью 20 мл этанола и 20 мл ацетона и повторно растворяли в 80 мл воды. Раствор подвергали диализу в течение 4 дней против воды 8пакс8кт тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, РсгЫо 80^^5 ПсийсШапб СтЬН, Вопп, Германия) и впоследствии лиофилизовали. Выход составлял 67% (3,4 г) амино-НЕ8 10/0,4.
150 мг 4-формилбензойной кислоты и 230 мг 1-гидрскси-1Н-бензотриазола (оба от А1бпсИ, 81дтаА1бпс11 СЬст1с6тЬН, ТаиГ1с^^с1^си, Ό) растворяли в 10 мл Ν,Ν-диметилформамида (качество для пептидного синтеза, ВюкоЫс, УаЖспотаагб, Нидерланды) и добавляли 204 мкл Ν,Ν'-диизопропилкарбодиимида. После выдерживания при 21°С в течение 30 мин добавляли 1 г амино-НЕ8 10/0,4. После встряхивания в течение 19 ч при 22°С реакционную смесь добавляли к 84 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об./об.). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С и повторно растворяли в 50 мл воды и подвергали диализу в течение 2 дней против воды (8пакс8кш тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, РсгЫо 8с1спсс5 ОсиЦсЫапб СтЬН, Вопп, Германия) и лиофилизовали.
Пример 1.10. Синтез функционализированного альдегидными группами гидроксиэтилкрахмала путем окисления периодатом гидроксиэтилкрахмала, селективно окисленного по его восстановительному концу.
Оксо-НЕ8 10/0,4 (МА = 10 кДа, Ό8 = 0,4) получали с использованием 8иргато1 Рагсп1сга1 Со11оЫ5
- 50 010501
СтЬН, КокЬасБ-КойБет, Германия; в соответствии с патентом Германии ΌΕ 19628705 А1.
Молекулярная масса НЕ8 10/0,4, измеренная с использованием ЕАЬЬ8-6РС, составляла 10,5 кДа, и Ό8 составляла 0,41.
300 мг оксо-НЕ810/0,4 растворяли в 15 мл 20 мМ натрий фосфатного буфера, рН 7,2. 64,2 мг периодата натрия (Р1ика, 81дта-А1йлсБ СБение СтЬН, Таи!к1гсБеп, Германия) растворяли в 15 мл того же буфера. Оба раствора смешивали и после выдерживания в течение 30 минут при 21°С добавляли 2 мл глицерина и реакционную смесь выдерживали при 21°С в течение 10 мин. Реакционную смесь подвергали диализу в течение 24 ч против воды (8паке8кт тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, РегЫо 8с1епсе8 Эеи18сБ1апй СтЬН, Вопп, Германия) и лиофилизовали.
Пример 2. Синтез С-С8Р-конъюгатов путем восстановительного аминирования С-С8Р представлял собой очищенный С-С8Р, имеющий, по существу, такие же характеристики, что и коммерчески доступный продукт №иродеп® (Атдеп, Мюнхен, Германия (Ό)).
Пример 2.1(а). Синтез С-С8Р-конъюгатов путем восстановительного аминирования с использованием гидроксиэтилкрахмала с неокисленным восстановительным концом при рН = 7,4 (сравнительный пример).
В примере 2.1, для получения НЕ8-С-С8Р конъюгата предпринята попытка синтеза с использованием способа, описанного в \νϋ 03/074087 (пример 12, страницы 22-23).
К 3,33 мкл водного раствора С-С8Р (№иродеп® от Атдеп, Мюнхен, Германия, Ό, или Сгапосу1е® от Аνепΐ^8 РБагта АС, Цюрих, Швейцария, СН, соответственно, 3 мг/мл) в 0,1 М натрий фосфатном буфере с рН 7,4, добавляли 3,33 мкл раствора НЕ810/0,4 (Μν = 10 кДа, Ό8 = 0,4, 8иргато1 Рагеп!ега1 Со11о1йк СтЬН, КокЬасБ-КойБет, Германия, 79 мг/мл) в том же буфере. К данной смеси добавляли 3,33 мкл 60 мМ раствора цианоборгидрида натрия в том же буфере и полученную смесь выдерживали в течение 4 часов при 22°С. Затем добавляли другую порцию 3,33 мкл свежеприготовленного 60 мМ раствора цианоборгидрида натрия. Во время периода выдерживания смеси в течение 30 ч добавляли всего 5 порций по 3,33 мкл свежеприготовленного 60 мМ раствора цианоборгидрида натрия. Реакционную смесь анализировали с помощью гель-электрофореза. Реакции не наблюдалось.
Пример 2.1(Ь). Синтез С-С8Р-конъюгатов путем восстановительного аминирования с использованием гидроксиэтилкрахмала с неокисленным восстановительным концом при рН = 5,0-9,2 (сравнительный пример).
К 3,33 мкл водного раствора С-С8Р (3 мг/мл) в данном буфере добавляли 3,33 мкл раствора оксоНЕ8 (300 мг/мл) в том же буфере. Смесь охлаждали до 4°С и добавляли 3,33 мкл 60 мМ раствора цианоборгидрида натрия в том же буфере при 4°С, и смесь выдерживали в течение 20 ч при 4°С.
Использовали следующие препараты НЕ8 и буферы:
a) Буфер: 0,1 М натрий ацетатный буфер рН 5,0.
Не8 10/0,4 (Μν= 10 кДа, Ό8 = 0,4, 8иргато1 Рагеи!ега1 Со11о1йк СтЬН, КокЬасБ-КойБет, Германия). Молекулярная масса НЕ8 10/0,7, измеренная с использованием ЕАЕЕ8-СРС, составляла 8,5 кДа и Ό8 составляла 0,41.
НЕ8 10/0,7 (Μν = 10 кДа, Ό8 = 0,7, 8иргато1 Рагеп!ега1 Со11о1йк СтЬН, КокЬасБ-КойБет, Германия). Молекулярная масса НЕ8 10/0,7, измеренная с использованием ЕАЕЕ8-6РС, составляла 10,5 кДа и Ό8 составляла 0,76.
НЕ8 50/0,4 (Μν = 50 кДа, Ό8 = 0,4, 8иргато1 Рагеп!ега1 Со11о1йк СтЬН, КокЬасБ-КойБет, Германия). Молекулярная масса НЕ8 50/0,4, измеренная с использованием ЕАЕЬ8-6РС, составляла 57 кДа и Ό8 составляла 0,41.
НЕ8 50/0,7 (Μν = 50 кДа, Ό8 = 0,7, 8иргато1 Рагеп!ега1 Со11о1йк СтЬН, КокЬасБ-КойБет, Германия). Молекулярная масса НЕ8 50/0,7, измеренная с использованием ЕАЕЬ8-6РС, составляла 47 кДа и Ό8 составляла 0,76.
b) Буфер: 0,1 М натрий фосфатный буфер рН 7,2.
НЕ8 10/0,7 (Μν= 10 кДа, Ό8 = 0,7, 8иргато1 Рагеп1ега1 Со11о1йк СтЬН, КокЬасБ-КойБет, Германия). Молекулярная масса НЕ8 10/0,7, измеренная с использованием ЕАЕЕ8-6РС, составляла 10,5 кДа и Ό8 составляла 0,76.
c) Буфер: 0,1 М натрий боратный буфер рН 8,3.
Не8 10/0,7 (Μν= 10 кДа, Ό8 = 0,7, 8иргато1 Рагеп1ега1 Со11о1йк СтЬН, КокЬасБ-КойБет, Германия). Молекулярная масса НЕ8 10/0,7, измеренная с использованием ЕАЕЕ8-6РС, составляла 10,5 кДа и Ό8 составляла 0,76.
й) Буфер: 0,2 М калий боратный буфер рН 9,2.
НЕ8 10/0,7 (Μν= 10 кДа, Ό8 = 0,7, 8иргато1 Рагеп1ега1 Со11о1йк СтЬН, КокЬасБ-КойБет, Германия). Молекулярная масса НЕ8 10/0,7, измеренная с использованием ЕАЕЕ8-6РС, составляла 10,5 кДа и Ό8 составляла 0,76.
Каждую реакционную смесь анализировали с помощью гель-электрофореза. Наблюдалось отсутствие конъюгирования или незначительное конъюгирование (сканы гелей для реакций Ь)-й) не показаны).
Пример 2.2: Синтез С-С8Р-конъюгатов путем восстановительного аминирования с использованием
- 51 010501 гидроксиэтилкрахмала с окисленным восстановительным концом при рН = 5, 0-9,2 (сравнительный пример).
К 3,33 мкл водного раствора С-С8Р (3 мг/мл) в данном буфере добавляли 3,33 мкл раствора оксоНЕ8 (300 мг/мл) в том же буфере. Смесь охлаждали до 4°С и добавляли 3,33 мкл 60 мМ раствора цианоборгидрида натрия в том же буфере при 4°С, и смесь выдерживали в течение 17 часов при 4°С.
Использовали следующие препараты НЕ8 и буферы:
a) Буфер: 0,1 М натрий ацетатный буфер рН 5,0.
оксо-НЕ810/0,7 (М^ = 10 кДа, Ό8 = 0,7, 8иргашо1 Рагеп1ега1 Со11о1бз СшЬН, КозЬасЬ-КобЬет, Германия). Молекулярная масса НЕ810/0,7, измеренная с использованием ЬАЬЬ8-СРС, составляла 14,5 кДа, и Ό8 составляла 0,76.
оксо-НЕ850/0,4 (М^ = 50 кДа, Ό8 = 0,4, 8иргашо1 Рагеп1ега1 Со11о1бз СшЬН, КозЬасЬ-КобЬет, Германия). Молекулярная масса НЕ850/0,4, измеренная с использованием ЬАЬЬ8-СРС, составляла 42 кДа, и Ό8 составляла 0,41.
оксо-НЕ850/0,7 (М^= 50 кДа, Ό8= 0,7, 8иргашо1 Рагеп1ега1 Со11о1бз СшЬН, Ко8ЬасЬ-КобЬе1ш, Германия). Молекулярная масса НЕ850/0,7, измеренная с использованием ЬАЬЬ8-СРС, составляла 57 кДа, и Ό8 составляла 0,76.
b) Буфер: 0,1 М натрий фосфатный буфер рН 7,2.
НЕ810/0,7 (М^ = 10 кДа, Ό8 = 0,7, 8иргашо1 Рагеп1ега1 Со11о1бз СшЬН, КозЬасЬ-КобЬет, Германия). Молекулярная масса НЕ810/0,7, измеренная с использованием ЬАЬЬ8-СРС, составляла 10,5 кДа, и Ό8 составляла 0,76.
c) Буфер: 0,1 М натрий боратный буфер рН 8,3.
Не810/0,7 М\У = 10 кДа, Ό8 = 0,7, 8иргашо1 Рагеп1ега1 Со11о1бз СшЬН, КозЬасЬ-КобЬет, Германия). Молекулярная масса НЕ810/0,7, измеренная с использованием ЬАЬЬ8-СРС, составляла 10,5 кДа, и Ό8 составляла 0,76.
б) Буфер: 0,2 М калий боратный буфер рН 9,2.
НЕ810/0,7 (М^ = 10 кДа, Ό8 = 0,7, 8иргашо1 Рагеп1ега1 Со11о1бз СшЬН, КозЬасЬ-КобЬет, Германия). Молекулярная масса НЕ810/0,7, измеренная с использованием ЬАЬЬ8-СРС, составляла 10,5 кДа, и Ό8 составляла 0,76.
Каждую реакционную смесь анализировали с помощью гель-электрофореза. Наблюдалось отсутствие конъюгирования или незначительное конъюгирование (сканы гелей для реакций Ь)-б) не показаны).
Окисление НЕ8 10/0,4 (М^ = 8,4 кДа, Ό8 = 0,41 проводили с использованием 8иргашо1 Рагеп1ега1 Со11о1бз СшЬН, Ко8ЬасЬ-КобЬе1ш, Германия; в соответствии с патентом Германии ΌΕ 19628705 А1.
Пример 2.3. Синтез С-С8Р-конъюгатов путем восстановительного аминирования с использованием функционализированного альдегидными группами гидроксиэтилкрахмала, синтезированного окислением периодатом.
К 3,33 мкл водного раствора С-С8Р (Сгапосу1е® от АуепБз РЬагша АС, Цюрих, Швейцария (СН), и Ыеиродеп® от Ашдеп, Мюнхен, Германия (Ό), соответственно, 3 мг/мл) в 0,1 М натрий ацетатном буфере рН 5,0, добавляли 3,33 мкл раствора альдегидо-НЕ8 (79 мг/мл) в том же буфере. К смеси добавляли
23.33 мкл 60 мМ раствора цианоборгидрида натрия и смесь выдерживали в течение 25 ч при 21°С. Реакционную смесь анализировали с помощью гель-электрофореза.
Использовали следующие конъюгаты НЕ8, функционализированные альдегидными группами:
(ί-Ν) получен с использованием Ыеиродеп® в соответствии с примером 1.1 (а) выше;
(ίί-Ν) получен с использованием №иродеп® в соответствии с примером 1.1 (Ь) выше;
(ίίί-Ν) получен с использованием №иродеп® в соответствии с примером 1.2 (а) выше;
(ίν-Ν) получен с использованием №иродеп® в соответствии с примером 1.2 (Ь) выше;
(ι-С) получен с использованием СгапосуГе® в соответствии с примером 1.1 (а) выше;
(ίί-С) получен с использованием СгапосуГе® в соответствии с примером 1.1 (Ь) выше;
(ίίί-С) получен с использованием СгапосуГе® в соответствии с примером 1.2 (а) выше;
(ίν-С) получен с использованием СгапосуГе® в соответствии с примером 1.2 (Ь) выше;
Пример 2.4. Синтез С-С8Р-конъюгатов путем восстановительного аминирования с использованием функционализированного альдегидными группами гидроксиэтилкрахмала, синтезированного конъюгированием гидроксиэтилкрахмала с формилкарбоновой кислотой.
К 3,33 мкл водного раствора С-С8Р (3 мг/мл) в 0,1 М натрий ацетатном буфере рН 5,0, добавляли
3.33 мкл раствора альдегидо-НЕ8 (118,5 мг/мл) в том же буфере и раствор охлаждали до 4°С. К смеси добавляли 3,33 мкл 60 мМ раствора цианоборгидрида натрия в том же буфере при 4°С и смесь выдерживали в течение 17 ч при 4°С. Реакционную смесь анализировали с помощью гель-электрофореза.
Использовали следующие конъюгаты НЕ8, функционализированные альдегидными группами:
(ν) получен в соответствии с примером 1.4 выше;
(νί) получен в соответствии с примером 1.5 выше;
(νίί) получен в соответствии с примером 1.6 выше;
(νίίί) получен в соответствии с примером 1.7 выше;
- 52 010501 (ίχ) получен в соответствии с примером 1.8 выше.
Пример 2.5. Синтез С-С8Р-конъюгатов путем восстановительного аминирования с использованием функционализированного альдегидными группами гидроксиэтилкрахмала, синтезированного конъюгированием гидроксиэтилкрахмала с формилкарбоновой кислотой.
К 2,5 мл водного раствора С-С8Р (2,27 мг/мл) в 0,1 М натрий ацетатном буфере рН 5,0 добавляли 136 мг альдегидо-НЕ810/0,4, полученного, как описано выше в примере 1.3, и раствор охлаждали до 0°С. К смеси добавляли 2,5 мл охлажденного на льду 40 мМ раствора цианоборгидрида натрия в том же буфере и смесь выдерживали в течение 17 ч при 4°С. Реакционную смесь анализировали с помощью гельэлектрофореза.
Пример 2.6. Синтез различных конъюгатов белка путем восстановительного аминирования с использованием функционализированного альдегидными группами гидроксиэтилкрахмала, синтезированного в соответствии с примерами 1.9 и 1.10 соответственно
К мкл (см. далее табл. I) раствора белка Р (см. далее табл. I) в 0,1 М натрий ацетатном буфере рН 5,0 (х мг/мл; см. далее табл. I) добавляли у мкл (см. далее табл. I) раствора НЕ8-производного (синтезированного, как описано в примерах 1.9 или 1.10) в том же буфере (200 мг/мл). Смесь охлаждали до 4°С и добавляли ζ мкл 120 мМ раствора цианоборгидрида натрия в том же буфере при 4°С, и смесь инкубировали в течение 24 ч при 4°С. Неочищенную реакционную смесь анализировали с помощью гельэлектрофореза. Для всех белков наблюдали успешное конъюгирование, на что указывал переход полосы белка в сторону большей молекулярной массы (см. фиг. 7-11). Увеличенные молекулярные массы связаны с распределением молекулярных масс для производных НЕ8 и числом производных НЕ8, связанным с белком.
Таблица I. Эксперименты, проведенные в соответствии с примером 2.6
Опыт Белок Р X У Ζ
1 гЫЬ-2 (ЗЬгаЬИтапп ВЬоЬес, НатЬигд, Германия) 15 1 4, 41 3, 88
2 гЫШ-альфа (ЗкгаЫттапп ВЬоЕес, НатЬигд, Германия) 15 1 3,91 3, 78
3 гЫЬ-З (ЗЬгаЬЬтапп ВЬоЬес, НатЬигд, Германия) 10 1 3, 34 2, 67
4 Супероксиддисмутаза 5Οϋ (из бычьих эритроцитов, ЗФдта, 51дта-А1с1г1сЬ СЬет1е СтЬН, Таи£к1гсЬеп, Германия) 6, 67 3 3, 21 1,97
5 Миоглобин (из скелетных мышц лошади, Згдта, 81дта-А1с1г1сЬ СЬетЬе СтЬН, Таи£к1гсЬеп, Германия) 6, 67 3 5 2, 33
6 гЬЕРО 6, 67 3 3, 34 2
7 гЬАТ III (АТгуп® СТС ВЬокИегареиЫсз, Егат1пдЬат, МА, США 6, 67 3 1,73 1,68
8 гЫ ΓΝ-бета 40 0, 5 5 9
9 ВЗА (Ггакк. V, Саг1 ЕоНа СтЬН, Каг1згике, Германия) 6, 67 3 1,49 1, 63
Использованный ШЫ бета представлял собой ιΉΕΝ бета 1а, полученный в клетках СНО, содержащих ди- и триантеннальные углеводные цепи и Ν-ацетиллактозаминные повторяющиеся фрагменты.
Использованный ЕРО представлял собой рекомбинантно продуцированный ЕРО, имеющий последовательность аминокислот ЕРО человека и, по существу, такие же характреистики, что и коммерчески
- 53 010501 доступный Егуро® (ОЯТНО В1ОТЕСН, 1апкеп-Сйад) или №оЯесогшоп (Яосйе), см. ЕР 0148605, ЕР 0205564, ЕР 0411678.
Пример 3. Анализ конъюгата С-С8Р, полученного в примере 2.5.
A. Очистка.
Получали С-С8Р, представлявший собой ЙС-С8Р и имеющий, по существу, такие же характеристики, что и коммерческий продукт Ыеиродеп® и одну аликвоту сохраняли в немодифицированном виде в качестве контроля.
1. Замена буфера для образцов С-С8Р и С-С8Р-конъюгата перед очисткой методом анион-обменной хроматографии.
В образце НЕ8-модифицированного С-С8Р и немодифицированного С-С8Р (в качестве контроля) (0,5-5 мг белка) проводили замену буфера с использованием прибора концентратора Утоакрш 6 (10000 МVСΟРΕ8, У1уакс1епсе, кат. № У80602). Образцы концентрировали до объема 0,5-0,7 мл и разводили до 5 мл с использованием 10 мМ Ыа-фосфатного буфера с рН 7,2. Для каждого образца цикл концентрирование/замена буфера проводили 3 раза.
2. Анионобменная хроматография С-С8Р и его НЕ8-модифицированных форм на колонке с ΌΕΑΕ8ерйагоке.
Образцы С-С8Р после модификации с помощью НЕ8 и для сравнения образцы немодифицированного С-С8Р очищали и анализировали с помощью анион-обменной хроматографии при комнатной температуре с использованием исследовательской системы АКТА 10, как описано. Аликвоты С-С8Р или перед или после НЕ8-сиалилирования подвергали диализу с использованием ультрафильтрования против указанного буфера А (10 мМ №-фосфат, рН 7,2) или разводили примерно в 13 объемах буфера А. Колонку, содержащую 2 мл ОЕАЕ-8ерйагоке (ИЕАЕ-8ерйагоке СЬ-6В, Рйагшаша, каталожный № 17-071001) регенерировали с использованием 5,0 объемов колонки (ОК) раствора 6,5 М гуанидин/НС1, 5, 0 объемов колонки буфера А, 5,0 объемов колонки буфера С (1,5 М №1С1 в 10 мМ №-фосфате, рН 7,2), а затем 10 объемов колонки буфера А. Затем вводили образцы (0,8-4,5 мл в 10 мМ №-фосфатном буфере, рН 7,2) при скорости потока 0,6 мл/мин. После промывания цикла образца 10 мл (2 мл на цикл образца) или 20 мл (5 мл цикл образца) буфера А, в зависимости от используемого образца, колонку дополнительно промывали 0-22 ОК буфера А (скорость потока = 0,8 мл/мин). Элюирование проводили с использованием линейного градиента от 0 до 100% буфера В для используемого объема в 5 ОК и изократического прохода 2,5 ОК 100% буфера В при скорости потока 0,6 мл/мин. Колонку повторно уравновешивали 5 ОК буфера А и регенерировали, как описано подробно выше при скорости потока 1 мл/мин.
При необходимости образцы концентрировали с использованием концентратора Утоакрт и проводили замену буфера, как описано выше. Образцы хранили при 0-8°С в 10 мМ №-ацетатном буфере, рН 4,0 перед или после стерилизации фильтрованием с использованием 0,2 мкм фильтрационного элемента (Согшпд, кат. Но. 431215). Для ш-уйго биоанализов и для последующих аналитических анализов получали следующие образцы. Концентрацию белка определяли, как описано ниже в разделе В1:
I. 0401-15/А33, 0,44 мг/мл, объем = 500 мкл С-С8Р (Е. сой).
II. 0401-13/А32, 0,28 мг/мл, объем = 900 мкл С-С8Р (Е. сой) НЕ8-модифицированный.
III. 0401-28/А58, 0,60 мг/мл, объем = 350 мкл №иродеп.
IV. 0401-28/А57, 0,50 мг/мл, объем = 400 мкл №и1ак1а.
B. Анализ.
Аликвоты образца анализировали для определения содержания белка и модификации.
1. Количественная оценка белка С-С8Р с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой (ЯР-ВЭЖХ).
Содержание белка С-С8Р в образце оценивали количественно с использованием препарата немодифицированного белка (концентрация: 0,453 мг/мл) в качестве стандарта.
Использовали систему ВЭЖХ Июпех, включающую насос Р 680 А НРС, дегазирующий элемент Иедакук ИС 1210, автоматический пробоотборник и инжектор А8Ы00, замкнутую систему для образца в 250 мкл и термостатируемый отдел колонок ТСС 100 вместе с детектором УФ/У1К иУЭ170и, оборудованную программным обеспечением для управления хроматографией.
Использовали предварительную колонку СС 8/4 Хис1еокй 120-5 С4, Масйегеу-Иаде1, кат. Ио. 7218 89, и колонку разделения 40 С-4 №.1с1еокП МРХ, 5 мкм, 125 х 4 мм ЯР-колонка (Масйегеу - №деР кат. Ко. 7200 45.40). Растворитель А представлял собой Н2О плюс 0,06% (об./об.) трифторуксусной кислоты, и растворитель В состоял из 90% ацетонитрила в Н2О, содержащего 0,06% (об./об.) трифторуксусной кислоты; скорость потока составляла 1 мл/мин.
УФ-детектирование проводили при длине волны 214, 221, 260 и 280 нм.
Образцы приблизительно 10-20 мкг вводили через инжектор в колонку ЯР-ВЭЖХ. Использовали следующий градиент:
0-5 мин: 0-10% В;
мин: 10-45% В;
мин: 45-80% В;
мин: 80-100% В;
- 54 010501 мин: 100% В;
мин: 10% В;
мин: 10 % В.
Использовали полученную площадь пика в момент элюирования стандартного препарата С-С8Р с сравнивали со ссылочным стандартом путем сравнения пика, появляющегося примерно в момент времени 29 минут при длине волны 280 нм.
2. Редуцирование + карбоксамидометилирование белка С-С8Р.
Проводили редуцирование (уменьшение в размере) и карбоксамидометилирование аликвот образцов белка С-С8Р, как описано в литературе (Сш11егтта Гото, Мапе1а Во11аИ Родо1ш, Магсок Оддего, В1сагйо Кга!)е, Мапиа Е!сйеуетдагау, Нага1й 8. Сопгай!, МапГгей ΝίιηΙζ (2004); Ν-апй О-йпкей сагЬойуйга!ек апй д1усоку1а!1оп кйе оссирапсу т гесотЬтап! йитап дгапи1осу!е-тасгорйаде со1опу-кйти1а!1пд Гас1ог кесге!ей Ьу а СЫпеке йатк!ег оуагу се11 1те; Еигореап I. Вюсйет, 273 (5), 907-919). Карбоксамидометилирование приводит к модифицированным остаткам цистеина. Расщепление эндопротеиназой С1и-С' карбоксамидометилированного белка проводили в 25 мМ ХН4НСО3, содержащем 1 М мочевины, при рН 7,8 с использованием соотношения фермент/субстрат 0,2:10 в течение 18-24 ч.
3. Отделение пептидов Епйо-С1и-С с помощью ВР-ВЭЖХ.
Пептиды, полученные при расщеплении Епйо-С1и-С отделяли с использованием системы ВЭЖХ Пюпех, включающей насос Р 680 А НРС, дегазирующий элемент Иедакук ΌΟ 1210, автоматический пробоотборник и инжектор А81-100, замкнутую систему для образца в 250 мкл и термостатируемый отдел колонок ТСС 100 вместе с детектором УФА1к υνθ170υ, оборудованную программным обеспечением для управлением хроматографией.
Использовали предварительную колонку СС 8/4 №с1еокй 120-5 С4, Масйегеу-Наде1, кат. №. 721889, и колонку разделения 40 С-4 №с1еокй МР№ 5 мкм, 125 х 4 мм ВР-колонка (Масйегеу - №де1, кат. №. 7200 45.40). Растворитель А представлял собой Н2О плюс 0,06% (об./об.) трифторуксусной кислоты, и растворитель В состоял из 90% ацетонитрила в Н2О, содержащего 0,06% (об./об.) трифторуксусной кислоты; скорость потока составляла 1 мл/мин. Использовали следующий градиент:
0-5 мин: 10% В;
мин: 45% В;
мин: 100% В;
мин: 100% В;
мин: 10% В;
мин: 10% В.
УФ-детектирование проводили при длине волны 214, 221, 260 и 280 нм. Пептиды, полученные при Епйо-С1и-С расщеплении оказались разделяемыми (данные не показаны).
4. Анализ протеолитических пептидов с использованием матрикс-вспомогательной с лазерной десорбцией/ионизацией время пролетной масс-спектроскопии (МАЬП1/ТОР/ТОР-М8).
Масс-спектроскопию использовали для обнаружения незатронутого Ν-конца С-С8Р в различных полученных образцах белка. Образцы (3-5 мкг), редуцированных и карбоксамидометилированных образцов белка, полученные при расщеплении эндонуклеазой С1и-С использовали непосредственно для массспектрометрического анализа (без ВР-ВЭЖХ на стадии 3) и очищали с использованием кончиков пипеток 21рТ1р, содержащих С18 материал с обращенной фазой в соответствии с инструкциями производителя. После промывания 0,1% (об./об.) муравьиной кислотой элюирование пептидов проводили 10 мкл 0,1% (об./об.) муравьиной кислоты в 60% (об./об.) ацетонитриле.
Протеолитические фрагменты (Епйо-С1и-С) анализировали с использованием время-пролетного прибора Вгикег иЬТВАЕЬЕХ (ТОР/ТОР) в линейном режиме положительного иона с использованием в качестве матрицы 22,4 мг 3,5-диметокси-4-гидроксициннамовой кислоты в 400 мкл ацетонитрила и 600 мкл 0,1% (об./об.) трифторуксусной кислоты в Н2О; массу (глико)пептидов измеряли с использованием в качестве матрицы 19 мг а-циано-4-гидроксициннамовой кислоты в той же смеси растворителей с использованием рефлектрона для усиленного разрешения. Растворы образцов объемом в 1 мкл с приблизительной концентрацией 1-10 пмоль/мкл-1 смешивали с равными объемами соответствующей матрицы. Данную смесь наносили в виде пятна на стальную мишень из нержавеющей стали и высушивали при комнатной температуре перед анализом. Спектр регистрировали в диапазоне масс 900-500 Да. В таблице ниже приведена корреляция между ожидаемыми массами с полученными для соответствующих пептидов С-С8Р.
- 55 010501
Таблица. Теоретические (моноизотопные) массы пептидов Еибо-О1и-С, полученных из О-СББ
Масса (Дальтон) Наблюдалась в данном исследовании Положение аа Искусствен. Модификация(и! Последовательность пептида
2132,11 + 1-20 суз_сдм: пол.18 т/ζ 2189,13 МТРЬСРАЗЗЬРОЗГЬЪКСЪЕ
1512,81 + 21-34 ОУККЮББСААЬОЕ
1534,74 + 35-47 Суз_САМ: пол.37,43 щ/ζ 1648,78 КЬСАТУКЬСНРЕЕ
4942,63 - 48-94 Суз САМ: пол.65,75 т/ζ 5056,68 ЬУЬЫЗНЗЬС1РКАРЬ$$СРЗ оаьоьассьзоьнзсъеьуо ЗЪЬОАЬЕ
502,25 - 95-99 3Ι5ΡΕ
2835,37 - 100-124 ОСРТЬОТЬОЪОУАОГАТТ1И 2ОМЕЕ
4026, 08 + 125-163 ЬСМАРАЪОРТОСАМРАРАЗА ГОККАСЭТЪУАЗНЬОЗ ЕЬЕ
1438,83 + 164-175 УЗУР.УЗВНЬАО?
Цистеиновые остатки были карбоксамидометилированными; пептиды, отмеченные как жир, обнаружены в МАЬП1/ТОБ спектре ^модифицированного О-СББ.
Ν-концевой пептид Еибо-О1и-С (МТРЕОРАББЕРОББЕЕКСЕЕ; т/ζ 2189,1), включающий положение 1-20 белка обнаруживался в масс-спектре МАБ-ЭРТОЕ-МБ образца после протеолитической обработки О-СББ эндопротеиназой О1и-С, как описано выше.
Результаты.
I. Очистка О-СББ и НЕБ модифицированного варианта.
НЕБ-модифицированный О-СББ и немодифицированный О-СББ были подвергнуты очистке с использованием колонки СБ-6В с ПЕАЕ-Беркагоке, как описано в разделе А4.
В случае немодифицированного образца 0401-15/А33, значительного поглощения при 280 нм не обнаруживалось в протекающем потоке, и белок был элюирован при 40-50% концентрации буфера В (0,16-0,20 М №1С1) в объеме 6 мл, при конкретной площади пика 600 мАИ х мл х мг - при 280 нм.
Образец (НЕБ-модифицированный О-СББ) элюировался при большем диапазоне градиента при концентрации буфера В от 20 до 80% (0,08-0,32 М №1С1) в объеме 12 мл. Примерно 90% общего пика обнаруживалось при 280 нм в протекающем потоке, содержащем примерно 50% от общего белка, с очевидно несколько более высокой массой при сравнении с элюированным белком, как обнаружено по анализу БПБ-РАОЕ, показанному на фиг. 13.
Выделение белков рассчитывали на основании площади пика (А280 нм) для элюированных фракций по сравнению с немодифицированным белком О-СББ.
Таблица 1. Сравнение площадей пиков при детектировании при 280 нм
ΟΕΆΕ- ЗерНагозе Опыт № Описание Рассчитаны ое количество белка для впрыскивания Элюат Площадь[280нм] (мАи х мл) Выход в элюате по сравнению с элюатом из опыта Π50λ АЗЗ**
0301 АЗЗ 0-С5Г 0,5 мг 330 (0,50 мг)
ЭЗОЗ А32 НЕЗмодифицированный С-СЗЕ 4,0 мг 1560 2,36 мг
** КР-ВЭЖХ количественная оценка белка подтвердила данные результаты
II. Анализ белков с помощью пептидного отображения и МАЬПШ'ОБ МБ после обработки эндопротеиназой О1и-С.
- 56 010501
Ν-концевой пептид. полученный при расщеплении эндопротеиназой С1и-С как карбоксамидометилированного ^модифицированного С-С8Р (фиг. 14). так и продажного продукта №иродеп (данные не показаны). четко определялся с помощью масс-спектроскопии МАЬЭШ’ОР-МЗ (МТРЬСРА88ЬРР8РЬЬКС*ЬЕ. т/ζ 2189.1; цистеин карбаксамидометилированный). Данный сигнал отсутствовал в образцах. подвергнутых модификации с использованием НЕ8 (фиг. 15) и в образце №и1ак!а (данные не показаны). указывая на модификацию пептида.
Ν-концевое секвенирование НЕ8-модифицированного С-С8Р выявило блокированный Ν-конец. что позволяет предположить тот факт. что Ν-концевой остаток метионина данного производного белка является модифицированным производным НА8
СиШегтта Рогпо. Мапе1а Во11ай Родойп. Магсок Оддего. Кюагйо Кга1)е. Маппа Е!скеуетдагау. Нага1й 8. Сопгай!. МапГгей Νίιηΐζ (2004) Ν-апй О-йпкей сагЬокуйга!ек апй д1усоку1айоп кйе оссирапсу т гесотЬтап! китап дгапи1осу!етасгоркаде со1опу-кйти1айпд фактор кесге!ей Ьу а СЫпеке катк!ег оуагу се11 йпе.
Еиг 1. Вюскет. 271 (5). 907-919.
Νίιηΐζ. М.. СгаЬепкогк!. Е.. Сопгай!. Н. 8.. 8а^. Ь. & Са1уе!е. 1. 1. (1999) 8йис!ига1 ска^ас!е^^ζа!^οη оГ 1ке ойдокасскапйе скатк оГ пайуе апй с^укΐа1йζей Ьоаг кетта1 р1акта крегтайкект Р8РЧ апй Р8Р-П д1усоГогтк. Еиг. 1. Вюскет. 265. 703-718.
Νίικζ. М.. Магйп. ^.. ^гау. V.. Корре1. К.-Ό.. Адикйп. 1. & Сопгай!. Н. 8. (1993) 8!гис!игек оГ к1а1у1а!ей ойдокасскалйек оГ китап сгу!йгоро1сйп ехргеккей т гесотЬтап! ВНК-21 се11к. Еиг 1. Вюскет. 213. 39-56.
ΝίαΙζ. М.. №11 С.. Рациек. Е. & Сопгай!. Н. 8. (1990) СагЬокуйга!е кйис!игек оГ китап йккие р1акт1подеп асйуа!ог уапап! ехргеккей т гесотЬтап! СЫпеке катк!ег оуагу се11к. РЕВ8 Ье!!. 271. 14-18.
8сйго!сг. 8.. Оегг. Р.. Сопгай!. Н. 8.. ΝίαΙζ. М.. На1е. С. & КйсЫюГР С. (1999) Ма1е-кресШс тойШсайоп оГ китап СО52. 1. Вю1.С1!ет. 274. 29862-29873.
Е. СгаЬепкогк! апй Н. 8. Сопгай! (1999) Тке Су!ор1актю. ТгапктетЬгапе апй !ке 8!ет Кедюпк оГ С1усокуЙгапкГегакек кресГу !кей т у1уо Гипсйопа1 киЬ1οсайζа!^οη апй к1аЫ1йу т !ке Со1д1.
1. Вю1. Скет.. 274. 36107-36116.
Е.СгаЬепкогк!. А. Нойтапп. М. ΝίαΙζ. С. 2е!Йте1в 1 апй Н. 8. Сопгай! (1995) Сопкйисйоп оГ таблица ВНК-21 се11к соехргекктд китап кесге!огу д1усорго!етк апй китап Саф 1-4С1сМАс-К #2.6-к1а1у1!гапкГегаке: 2.6-йпкей ЫеиАс 1к ргеГегаЬ1у айаскей !о 1ке Са1в1-4С1сМАсв1-2Мапв1-3-Ьгапск оГ Ь1ап!еппагу ойдокасскапйек Ггот кесге!ей гесотЬтап!-йасе рго!ет.
Еиг. ЕВюскет.. 232. 718-725
Пример 4. Результаты ш νίΙΐΌ для С-С8Р-конъюгата. полученного в примере 2.5 и очищенного в соответствии с примером 3. Митогенность вариантов С-С8Р для мышиных клеток ΝΒ8-60.
Известно специфическое действие С-С8Р на пролиферацию. дифференциацию и активацию гематопоэтических клеток нейтрофильного гранулоцитного происхождения. Митогенная способность вариантов С-С8Р была протестирована с использованием мышиных клеток ΝΒ8-60 (Ν. 8В1гаГи_|1 е! а1.. Ехр. Нета!о1. 1989. 17. 116-119). Клетки. выращенные в среде КРМР дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки (С1Ьсо КУПКОСЕМ СтЬН. Каг1кгике. Германия). содержащей 5-10% кондиционированной среды ^ЕНЙ3В (О8М2. В^аиηксй^е^д. Германия; культивированы. как описано Э8М2) как источника экзогенного ΙΕ-3. собирали центрифугированием. промывали и делили на аликвоты по 100000 клеток на лунку в 24-луночном планшете. Клеткам давали возможность адаптироваться в течение 1 ч при 37°С в среде КР^Ш без кондиционированной среды ^ЕНЕ3В. после чего добавляли образцы факторов роста СС8Р. разведенные в той же среде. Клетки ΝΕ8-60 подвергали действию очищенных вариантов С-С8Р в течение 3 дней при 37°С и затем клетки электронным образом подсчитывали (счетчик для клеток Саку ТТ Се11 Соип!ег. 8скагГе 8ук!ет. Кеи!йпдеп. Ό). Результаты суммированы на фиг. 12. Как видно на фиг.
12. различные варианты С-С8Р (0.5-50 пг/мл) были способны стимулировать число клеток после 3дневного воздействия по сравнению со средой. которая не содержала факторов роста.
Немодифицированные контрольные белки С-С8Р/А33 и С-С8Р/А58 стимулировали клетки очень похожим образом (ΈΩ50 = 5-10 пг/мл). в то время как конъюгаты С-С8Р С-С8Р/А32 и С-С8Р/А57 пока- 57 010501 зали лишь минимальное снижение активности по сравнению с немодифицированным образцом (ΈΌ50 = 10-25 пг/мл).
Пример 5. Конъюгаты А1АТ (а1АТ, альфа1аТ), синтезированные посредством восстановительного аминирования.
Пример 5.1. Синтез амино-НЕ8 (А) из окисленного НЕ8.
6,09 г оксо-НЕ8 (Μν = 57000 Да, Ό8 = 0,76, 8ιιρηιηο1 Раген1ега1 ^Πο^κ СтЬН, ΒοкЬасй-Βοάйе^т, Германия, получен в соответствии с патентом Германии ЭЕ 19628705 А1) нагревали в течение ночи при 80°С в вакууме, растворяли в токе азота в 32 мл сухого диметилсульфоксида (Пика, 8|дта-А1бпск Скет1е СтЬН, Таи^гс^е^ Германия) и добавляли 1,22 мл 1,4-диаминобутана (ТкАа, 8|дта-А1бпск Скепке СтЬН, ТаиΓк^^скеη. Германия). После перемешивания при 40°С в течение 17 ч реакционную смесь добавляли к 150 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об./об.). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, промывали 40 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об./об.) и собирали центрифугированием. Неочищенный продукт растворяли в 80 мл воды и проводили диализ в течение 4 дней против воды (8ηη1^81<ίη тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, РегЬю 8с1енсек ОегПксккшб СтЬН, Βοηη, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 82%.
Пример 5.2. Синтез альдегидо-НЕ8 (А) из амино-НЕ8(А) примера 5.1
125 мг 4-формилбензойной кислоты и 174 мг 1-гидрокси-1Н-бензотриазола (оба от А1бпск 81дтаА1бпск Скепие СтЬН, Таи^гс^е^ Германия) растворяли в 38 мл Ν,Ν-диметилформамида (качество для пептидного синтеза, Βίοκο^, УаАеютаагб, Нидерланды) и добавляли 155 мкл Ν,Ν'-диизопропилкарбодиимида (ТкАа, 8|§та-А1бпск Скеике СтЬН, Таи^гс^е^ Германия). После выдерживания при 21°С в течение 30 минут добавляли 3,8 г амино-НЕ8 (А) (получен, как описано в примере 5.1). После встряхивания в течение 19 ч при 22°С реакционную смесь добавляли к 160 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об./об.). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, повторно растворяли в 20 мл Ν,Ν-диметилформамида и осаждали 80 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об./об.), как описано выше в примере 5.1. После центрифугирования осадок растворяли в 50 мл воды и подвергали диализу в течение 2 дней против воды (8ηη1^81<ίη тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, РегЬю 8с1енсек ОегПксккшб СтЬН, Βοηη, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 77%.
Пример 5.3. Синтез амино-НЕ8 (В) из окисленного НЕ8.
г оксо-НЕ8 (Μν = 57000 Да, Ό8 = 0,76, 8ιιρπιιιιο1 Раген1ега1 ^Πο^κ СтЬН, ΒοкЬасй-Βοάйе^т, Германия, получен в соответствии с патентом Германии ЭЕ 19628705 А1) нагревали в течение ночи при 80°С в вакууме, растворяли в токе азота в 52 мл сухого диметилсульфоксида (ТкАа, 8|§та-А1бпск Скет1е СтЬН, Таи^гс^е^ Германия) и добавляли 2 мл 1,4-диаминобутана (АкАа, 8|дта-А1бпск Скет1е СтЬН, ТаиΓк^^скеη. Германия). После перемешивания при 40°С в течение 17 ч реакционную смесь добавляли к 350 мл охлажденного на льду 2-пропанола (Саг1 Βοίй СтЬН + СоКС, Каг1кгцйе, Германия). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, промывали 80 мл охлажденного на льду 2-пропанола и собирали центрифугированием. Неочищенный продукт растворяли в 80 мл воды и проводили диализ в течение 2 дней против воды (81'1аке8кк1 тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, РегЬю 8с1енсек ОегПксккшб СтЬН, Βοηη, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 85%.
Пример 5.4. Синтез альдегидо-НЕ8 (В) из амино-НЕ8 (В) примера 5.3.
153 мг 4-формилбензойной кислоты и 241 мг 1-гидрокси-1Н-бензотриазола (оба от А1бпск 81дтаА1бпск Скет1е СтЬН, Тац^тке^ Германия) растворяли в 51 мл Ν,Ν-диметилформамида (качество для пептидного синтеза, Βίοκο^, Уа1кеютаагб, Нидерланды) и добавляли 170 мкл Ν,Ν'-диизопропилкарбодиимида (ТкАа, 8|§та-А1бпск Скет1е СтЬН, Тац^тке^ Германия). После выдерживания при 21°С в течение 30 мин добавляли 5,1 г амино-НЕ8 (В) (получен, как описано в примере 5.3). После встряхивания в течение 16 ч при 22°С реакционную смесь добавляли к 360 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об./об.). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, повторно растворяли в 50 мл воды и осаждали 360 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об./об.), как описано выше в примере 5.1. После центрифугирования осадок растворяли в 50 мл воды и подвергали диализу в течение 2 дней против воды (81'1аке8кт тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, РегЬю 8с1енсек ОегПксккшб СтЬН, Βοηη, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 87%.
Пример 5.5. Конъюгация альдегидо-НЕ8 (А) и (В) с А1АТ путем восстановительного аминирования.
Смесь 189 мг альдегидо-НЕ8 (В) (получен, как описано в пример 5.4) и 172 мг альдегидо-НЕ8 (А) (получен, как описано в пример 5.2) растворяли в 2,88 мл реакционного буфера (0,1 М натрий фосфатный буфер, 150 мМ хлорида натрия, рН 7,2). При 20°С добавляли 1,67 мл 60 мМ раствора цианоборгидрида натрия в том же буфере с последующим добавлением 0,455 раствора А1АТ (с(А1АТ) = 11,0 мг/мл в мМ натрий фосфатном буфере, 150 мМ хлорида натрия, рН 7,2, А1АТ - гкА1АТ, полученный от СТС
Β^οιке^аρеиι^ск Шс., Ρ^ат^ηдкат, МА, лот Νο.080604Ά). Смесь инкубировали при 20°С. Через 17 ч допол- 58 010501 нительно добавляли 6,7 мг цианоборгидрида натрия, растворенного в 200 мкл реакционного буфера, и смесь выдерживали дополнительно в течение 24 ч при той же температуре. 10 мкл данного раствора анализировали после общего периода инкубации, равного 25 ч, с помощью гель-электрофореза (см. фиг. 16).
Пример 5.6. Конъюгация НЕ8 с А1АТ путем восстановительного аминирования (контроль реакции).
362 мг НЕ8 (М^ = 56000 Да, Ό8 = 0,41, 8иргато1 Рагеп1ега1 Со11о1йк СтЬН, РокЬасй-Роййе1т, Германия) растворяли в 2,88 мл реакционного буфера (0,1 М натрий фосфатный буфер, 150 мМ хлорида натрия, рН 7,2). При 20°С добавляли 1,67 мл 60 мМ раствора цианоборгидрида натрия в том же буфере с последующим добавлением 0,455 мл раствора А1АТ (с(А1АТ) = 11,0 мг/мл в 20 мМ натрий фосфатном буфере, 150 мМ хлорида натрия, рН 7,2, а1АТ = гй а1АТ, полученный от СТС Вю!йегареийск Шс., Ргаттдйат, МА, лот Νο.080604Λ). Смесь инкубировали при 20°С. Через 17 ч дополнительно добавляли 6,7 мг цианоборгидрида натрия, растворенного в 200 мкл реакционного буфера, и смесь выдерживали дополнительно в течение 24 ч при той же температуре. 10 мкл данного раствора анализировали после общего периода инкубации, равного 25 ч, с помощью гель-электрофореза (см. фиг. 17).
Пример 5.7. Очистка конъюгата НЕ8-А1АТ с омощью ионобменной хроматографии (ШС).
Конъюгаты А1АТ очищали с помощью ионообменной хроматографии на колонке Н1Тгар О НР с использованием хроматографической системы ЛКТА-Ехр1огег (оба от Атегкйат Вюкаепсек). Очистку проводили в соотвествии с выделением А1АТ из плазмы крови человека, как описано в «Сйеп, НатМопй, Ьапдапй ЬеЬшд, РипДсайоп о£ ИйнЬЦог от Нитап Р1акта фракция Ιν-1 Ιοη Ехсйапде Сйгота!одгарйу, Vоx8аηди^η^к 1998, 74, 232-241».
Получение образцов: замена буфера на обессоленной колонке Н1Ргер 26110 (Атегкйат Вюкаепсек) в сочетании с хроматографической системой ЛКТА-Ехр1огег с использованием 20 мМ фосфата натрия, 20 мМ хлорида натрия, рН 8 в качестве элюента.
Замену буфера проводили после разбавления неочищенной реакционной смеси (получена, как описано в примере 5.5, приблизительно 5 мл) обессоленной водой до конечного объема 10 мл с использованием следующих параметров:
Колонка:
Скорость потока:
Элюент:
Объем образца: Разделение фракций: Уравновешивание:
Длина элюирования:
Н1Ргер 26/10 рН обессоленная мл/мин мМ фосфат мМ хлорид мл
2,5 мл натрия натрия объемов колонки объема колонки
Собирали первые 14 мл элюента и добавляли связывающий буфер, получая конечный объем 20 мл. Данный раствор, содержащий приблизительно 5 мг белка, очищали с помощью БЕС с использованием следующих параметров:
Колонка:
Скорость потока:
Связывающий буфер (ВВ)
Элюирующий буфер (ЕВ)
Объем образца:
Фракционирование потока:
Фракционирование элюата: Начальная концентрация ЕВ: Уравновешивание:
НБТгарО НР 1 мл мл/мин мМ фосфат натрия, мМ хлорид натрия рН 8 мМ фосфат натрия,
И хлорид натрия рН 8 мл мл мл
0% объемов колонки
Промывка несвязанного образца: 15 мл
Целевая концентрация ЕВ: 15%
Продолжительность градиента: 20 мл
Собранные после хроматографии фракции анализировали с помощью 8Э8-Раде. Фракции, содержащие конъюгат НЕ8-А1АТ, были объединены (элюированный объем от 40 до 47 мл, соответствующий фракциям В1-С6, см. фиг. 17). В некоторых из объединенных фракций обнаруживалось незначительное количество не вступившего в реакцию А1 АТ. Первоначальная концентрация объединенных фракций
- 59 010501 после хроматографии, определенная с помощью ВСА (Р1егсе, кат-.Νο. 23225) с использованием А1АТ (предоставленного ОТС Вю!йегареийск Ыс., Егаттдйат, ΜΑ, лот Νο.080604Α) в качестве ссылочного стандарта, составляла 170 пг/мл. После разведения и замены буфера на буфер 20 мМ фосфата натрия, 150 мМ хлорида натрия, рН 7,2, концентрация полученного белка составляла 54,5 пг/мл (ВСА (проход с А1АТ от ОТС ВюЫеагреийск Ыс., Егаттдйат, ΜΑ, лот Νο. 080604Α (в качестве ссылочного стандарта)). Данный конечный раствор использовали для определения ингибирующей активности конъюгата.
Пример 5.8. Определение ингибирующей способности ш νίίτο конъюгата ΗΕ8-Α1ΑΤ конъюгат в отношении гранулоцитэластазы человека.
Исследования ингибирующей активности конъюгатов в отношении эластазы Е1ак!аке проводили в соответствии с Сак!111о е! а1., Αηа1.Β^οсйет. 1979, 99, 53-64 с использованием модели планшетного ридера Τесаη иУ-У[8-Р1а!егеабег Мобе1 8иппке.
Данный анализ основан на высвобождении п-нитроанилина из N-Μеί-Ο-сукцинил-Α1а-Α1а-Ρ^ο-Vа1р-ЫО2- анилина, катализируемого эластазой. За ходом данного гидролиза можно следить по увеличению поглощения при 405 нм. Первоначальная скорость гидролиза близко коррелирует с активностью фермента. Анализ проводят в отсутствие и в присутствии различных концентраций тестируемого ингибитора. Снижение активности фермента в соответствии с ингибирующей активностью тестируемых веществ представлено по уменьшению наклона графика А405 относительно времени. Остаточная активность эластазы в присутствии некоторой концентрации ингибитора приведена по наклону кривой ингибирования, деленной на наклон кривой без ингибирования. Имеется линейная корреляция между остаточной активностью фермента и концентрацией ингибитора. При использовании линейной регрессии можно достичь гладкой линейной прямой, и подсчитать остаточную активность фермента для данной концентрации ингибитора. Таким образом можно сравнить ингибрующую активность (= 1-остаточная активность фермента) для одной и той же концентрации различных ингибиторов (см. фиг. 18).
Использовали следующие параметры:
Концентрация субстрата: 1,5 мМ;
Активность эластазы: 7,5 мЕд;
Длина водны: 405 нм; Температура: 20°С;
Интервал времени: 15 с;
Кинетические циклы: 25.
Способ измерения: центрованный
Раствор для анализа состоял из 300 мкл буфера (0,1 М Нерек, 0,5 М №С1, 0,05% (вес./об.) ΤπΙοπ Х100, рН 7,5), содержащего 10% ДМСО, 1,5 мМ N-Μеί-О-сукцинил-Α1а-Α1а-Ρ^ο-Vа1-р-NΟ2-анилина, 7,5 тИ мЕд эластазы и различные количества ингибитора.
Эластазу получали от 8егуа Е1ес!горйогек1к СтЬН, Не1бе1Ьегд. Все другие вещества получены от 81дта Α16γιΛ, ΤаиГк^^сйеη.
Ингибирующую активность конъюгатов, синтезированных как описано в примере 5.5., тестировали в сравнении с проластином Рго1акйп® Н8 (Вауег Уйа1 СтЬН, Беуегкикеп, Германия, лот Νο. ΡВ4ΗΑ43) в качестве ссылки и с использованием А1АТ (ОТС ВюЫегареиИск Ыс., Егаттдйат, ΜΑ, лот Νο. 080604Α) в качестве исходного вещества для конъюгирования. График остаточной активности феремента относительно концентрации приведен на фиг. 18. Линейность для всех кривых составляла В2 > 0,98. Ниже приведены значения ΙΟ'50 и ингибирование эластазы для с(ингибитор)=1 мкг/мл, а также ингибирующая активность для исходного вещества и конъюгата относительно ссылки. Данные, приведенные в таблице ниже, четко показывают, что большая часть активности А1АТ сохраняется после конъюгирования с НЕ8.
Таблица примера 5.8
Ингибитор Гладкая линейная прямая Уравнение 1С!0 [мкг/мл] Ингибирование эластазы с(ингибитор)1 мкг/мл [%] Ингибирующая активность по отношению к проластину
Проластин У=~ 0,6754х+0,9627 0, 685 71,3
А1АТ у=- 0,5046х+0,9558 0, 903 54, 9 77
НЕЗ-А1АТ- конъюгат у=- 0,3757х+0,9627 1,232 41,3 57,9
Пример 5.9. Определение т-νίνο периода полураспада конъюгата НЕ8-гй альфа1АТ по сравнению с гй альфа1АТ и полученным из плазмы крови альфа1 АТ.
Самок мышей возрастом 8-10 недель (ΒΑ^Β/сΟ1аΗкб, Наг1ап СтЬН, Вогсйеп, Германия) использовали в качестве подопытных организмов (42 мыши, 14 на образец). «Вес тела» каждого животного определяли непосредственно перед введением растворов различных образцов. 100 мкл раствора с концентра- 60 010501 цией 50 мкг/мл указанных далее образцов в буфере с рН=7,2 (200 ммоль фосфата натрия, 150 ммоль хлорида натрия) вводили внутривенно в хвостовую вену мышей.
Образец 1. гЬ альфа1АТ (СТС ВюЫегареиксз Ыс., РгатшдЬат, МА, лот №. 080604А).
Образец 2. Конъюгат гЬ альфа1АТ-НЕ8, полученный, как описано в примере 5.5.
Образец 3. Ь альфа1АТ, полученный из плазмы крови человека (8ЕКАА Е1ес1горЬогез1з СтЬН, Не1бе1Ьегд, Германия).
Через 1, 2, 4, 10, 24, 31,5 и 48 ч после инъекции двух мышей из каждой группы убивали и отбирали образцы цельной крови (~500 мкл) из сердца мышей. Готовили сыворотку крови с использованием М1с^ονеΐΐе® 500 2-Се1 (8агз1еб1, №тЬгесЬ1, Германия). Образцы сыворотки хранили при -80°С до начала измерений концентрации альфа1 АТ.
Концентрации альфа1АТ определяли с использованием коммерчески доступного альфа 1 АТ-БОЗА (Iттиηб^адηοзΐ^к, ВепзЬет, Германия) в соответствии с инструкциями производителя.
Полученные результаты показывают существенное увеличение периода полураспада в плазме крови конъюгата альфа1АТ-НЕ8 по сравнению с немодифицированным исходным веществом гЬ альфа1АТ. Измеренные периоды полураспада конъюгата находятся в том же диапазоне, что и период полураспада Ь альфа1АТ, полученного из плазмы крови человека, в соответствии со следующей таблицей.
Таблица примера 5.9. Период полураспада образцов 1-3 в плазме крови
Образец № Период полураспада в плазме крови мышей [ч]
1 1,2
2 3, 6
3 3,2
Пример 6. Синтез С-С8Р-конъюгатов.
Пример 6.1. Синтез альдегидо-НЕ8 производных.
Пример 6.1(а). Синтез амино НЕ810/0,4.
5,12 г оксо-НЕ810/0,4 (М^ = 14500 Да, Ό8 = 0,41, 8иргато1 Рагеп1ега1 Со11о1бз СтЬН, КозЬасЬКобЬет, Германия, получен в соответствии с патентом Германии ЭЕ 19628705 А1) нагревали в течение ночи при 80°С в вакууме, растворяли в токе азота в 25 мл сухого диметилсульфоксида (Р1ика, 81дтаА1бпсЬ СЬете СтЬН, ТаиЕкпсЬеп, Германия) и добавляли 5,13 мл 1,4-диаминобутана. После перемешивания при 40°С в течение 17 ч реакционную смесь добавляли к 150 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об./об.). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, промывали 40 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об/об) и собирали центрифугированием. Неочищенный продукт растворяли в 80 мл воды и проводили диализ в течение 4 дней против воды (8паке8кш тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, РегЫо 8с1епсез ЭеШзсЫапб СтЬН, Вопп, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 67%.
Пример 6.1(Ь). Синтез альдегидо НЕ810/0,4.
105 мг 4-формилбензойной кислоты и 135 мг 1-гидрокси-1Н-бензотриазола (оба от А1бпсЬ, 81дтаА1бпсЬ СЬете СтЬН, ТаЫкйсЬеп, Германия) растворяли в 7 мл Ν,Ν-диметилформамида (качество для пептидного синтеза, ВюзоЫе, Уакег^таагб, Нидерланды) и добавляли 135 мкл Ν,Ν'диизопропилкарбодиимида (Р1ика, 81дта-А1бпсЬ СЬет1е СтЬН, ТаЫкксЬеп, Германия). После выдерживания при 21°С в течение 30 мин добавляли 0,7 г амино-НЕ810/0,4 (синтезирован, как описано в примере 6.1(а)). После встряхивания в течение 18 ч при 22°С реакционную смесь добавляли к 42 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об./об.). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, повторно растворяли в 5 мл: ДМФ и осаждали 42 мл смеси этанол/ацетон, как описано выше. После центрифугирования собранный осадок растворяли в 50 мл воды и подвергали диализу в течение 1 дня против воды (8паке8кт тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, РегЫо 8Ыепсез ОеЫзсЫапб СтЬН, Вопп, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 95%.
Пример 6.1(с). Синтез амино НЕ810/0,7.
6,02 г оксо-НЕ810/0,7 (М^ = 15000 Да, Ό8 = 0,76, 8иргато1 Рагеп1ега1 Со11о1бз СтЬН, КозЬасЬКобЬе1т, Германия, получен в соответствии с патентом Германии ЭЕ 19628705) растворяли в токе азота в 32 мл сухого диметилсульфоксида (Р1ика, 81дта-А1бпсЬ СЬете СтЬН, ТаЫкксЬеп, Германия) и добавляли 6,03 мл 1,4-диаминобутана. После перемешивания при 40°С в течение 17 ч реакционную смесь добавляли к 150 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об./об.). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, промывали 40 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об./об.) и собирали центрифугированием. Неочищенный продукт растворяли в 80 мл воды и проводили диализ в течение 4 дней против воды (8паке8кт тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, РегЫо 8Ыепсез ОеЫзсЫапб СтЬН, Вопп, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 52%.
Пример 6.1(б). Синтез альдегидо НЕ810/0,7.
150 мг 4-формилбензойной кислоты и 230 мг 1-гидрокси-1Н-бензотриазола (оба от А1бпсЬ, 81дта
- 61 010501
А1бпсй Сйет1е СтЬК ТаЫкйсйеп, Германия) растворяли в 10 мл Ν,Ν-диметилформамида (качество для пептидного синтеза, В1око1уе, УаГкепк^аагб, Нидерланды) и добавляли 204 мкл Ν,Ν'-диизопропилкарбодиимида (Ийка, З1дта-А1бпсй Сйет1е СтЬК ТаЫкпсйеп, Германия). После выдерживания при 21°С в течение 30 минут добавляли 1 г амино-ΗΕЗ10/0,7 (синтезирован, как описано в примере 6.1(с)). После встряхивания в течение 19 ч при 22°С реакционную смесь добавляли к 84 мл охлажденного на льду 2-пропанола. Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, повторно растворяли в 50 мл воды и подвергали диализу в течение 2 дней против воды (ЗпакеЗкт тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, РегЫо ЗЫепсек Пеи!ксй1апб СтЬК Вопп, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 83%.
Пример 6.1(е). Синтез амино №З30/0,4.
г оксо-№З30/0,4 (МА = 28000 Да, ОЗ = 0,41, Зиргато1 Рагеп!ега1 Со11о1бк СтЬК ВокЬасйВобйет, Германия, с использованием молярных соотношений ингредиентов в соответствии с патентом Германии ΌΕ 19628705 А1) нагревали в течение ночи при 80°С в вакууме, и затем растворяли в токе азота в 28 мл сухого диметилсульфоксида (Ийка, З1дта-А1бпсй Сйет1е СтЬК ТаиГкггсйеп, Германия) и добавляли 1,67 мл 1,4-диаминобутана. После перемешивания при 40°С в течение 17 ч реакционную смесь добавляли к 175 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об./об.). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С. Неочищенный продукт растворяли в 40 мл воды и проводили диализ в течение 2 дней против воды (ЗпакеЗкт тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, РегЫо ЗЫепсек ЭеШксЫапб СтЬК Вопп, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта не определяли.
Пример 6.1(1). Синтез альдегидо №З30/0,4.
130 мг 4-формилбензойной кислоты и 153 мг 1-гидрокси-1Н-бензотриазола (оба от А1бпсй, З1дтаА1бпсй Сйет1е СтЬК ТаЫЫгсйеп, Германия) растворяли в 36 мл Ν,Ν-диметилформамида (качество для пептидного синтеза, В1око1уе, УаГкепк^аагб, Нидерланды) и добавляли 110 мкл Ν,Ν'-диизопропилкарбодиимида (Е1ика, З1дта-А1бпсй Сйет1е СтЬК ТаЫкйсйеп, Германия). После выдерживания при 21°С в течение 30 минут добавляли 2,61 г амино-ΗΕЗ30/0,4 (синтезирован, как описано в примере 6.1(е)). После встряхивания в течение 22,5 ч при 22°С реакционную смесь добавляли к 160 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об./об.). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С и промывали охлажденной на льду смесью ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об./об.). После центрифугирования осадок растворяли в 30 мл воды и подвергали диализу в течение 1 дня против воды (ЗпакеЗкт тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, РегЫо ЗЫепсек ЭеШксЫапб СтЬК Вопп, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 81%.
Пример 6.1(д). Синтез амино ΗΕЗ30/0,7.
г оксо-№З30/0,7 (МА = 31000 Да, ОЗ = 0,76, Зиргато1 Рагеп!ега1 Со11о1бк СтЬК ВокЬасйВобйе1т, Германия, с использованием молярных соотношений ингредиентов в соответствии с патентом Германии ΌΕ 19628705 А1) нагревали в течение ночи при 80°С в вакууме, и затем растворяли в токе азота в 28 мл сухого диметилсульфоксида (Ийка, З1дта-А1бпсй Сйет1е СтЬК ТаЫкйсйеп, Германия) и добавляли 1,67 мл 1,4-диаминобутана. После перемешивания при 40°С в течение 17 ч реакционную смесь добавляли к 175 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об./об.). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С. Неочищенный продукт растворяли в 40 мл воды и проводили диализ в течение 2 дней против воды (ЗпакеЗкт тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, РегЫо ЗЫепсек ЭеШксЫапб СтЬК Вопп, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта не определяли.
Пример 6.1(й). Синтез альдегидо №З30/0,7.
122 мг 4-формилбензойной кислоты и 144 мг 1-гидрокси-1Н-бензотриазола (оба от А1бпсй, З1дтаА1бпсй Сйет1е СтЬК ТаЫкйсйеп, Германия) растворяли в 34 мл Ν,Ν-диметилформамида (качество для пептидного синтеза, Вюко1уе, Уа1кепк^аагб, Нидерланды) и добавляли 103 мкл Ν,Ν'диизопропилкарбсдиимида (Ийка, З1дта-А1блсй Сйет1е СтЬК ТаЫкпсйеп, Германия). После выдерживания при 21°С в течение 30 мин добавляли 2,46 г амино-№З30/0,7 (синтезирован, как описано в примере 6.1(д)). После встряхивания в течение 22,5 ч при 22°С реакционную смесь добавляли к 160 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об./об.). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С и промывали охлажденной на льду смесью ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об./об.). После центрифугирования осадок растворяли в 30 мл воды и подвергали диализу в течение 1 дня против воды (ЗпакеЗкт тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, РегЫо ЗЫепсек ЭеШксЫапб СтЬИ Вопп, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 87%.
Пример 6.1(1). Синтез амино №З50/0,7.
6,09 г оксо-№З 50/0,7 (МА = 57000 Да, ОЗ = 0,76, Зиргато1 Рагеп!ега1 Со11о1бк СтЬК ВокЬасйВобйе1т, Германия, с использованием молярных соотношений ингредиентов в соответствии с патентом Германии ΌΕ 19628705 А1) нагревали в течение ночи при 80°С в вакууме, и затем растворяли в токе азота в 32 мл сухого диметилсульфоксида (Ийка, З1дта-А1бпсй Сйет1е СтЬК ТаЫкйсйеп, Германия) и добавляли 1,22 мл 1,4-диаминобутана. После перемешивания при 40°С в течение 17 ч реакционную смесь добавляли к 150 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об./об.). Вы
- 62 010501 павший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, промывали 40 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об./об.) и собирали центрифугированием. Неочищенный продукт растворяли в 80 мл воды и проводили диализ в течение 4 дней против воды (8иаке8кт тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, РегЫо 8аеисек Оеи1ксН1аи6 СтЬН, Воии, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 82%.
Пример 6.1(]). Синтез альдегидо ΗΕ850/0,7.
125 мг 4-формилбензойной кислоты и 174 мг 1-гидрокси-1Н-бензотриазола (оба от А16псН, 81дтаА16псН СНеиие СтЬН, ТаиГкйсНеи, Германия) растворяли в 38 мл Ν,Ν-диметилформамида (качество для пептидного синтеза, ВюкоЫе, Уа1кеик^ааг6, Нидерланды) и добавляли 155 мкл Ν,Ν'-диизопропилкарбодиимида (Е1ика, 8|дта-А16псН СНеиие СтЬН, ТаиГкйсНеи, Германия). После выдерживания при 21°С в течение 30 минут добавляли 3,8 г амино-ΗΕ850/0,7 (синтезирован, как описано в примере 6.1(1)). После встряхивания в течение 19 ч при 22°С реакционную смесь добавляли к 160 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об./об.). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, повторно растворяли в 20 мл Ν,Ν-диметилформамида и осаждали 80 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об./об.), как описано выше. После центрифугирования осадок растворяли в 50 мл воды и подвергали диализу в течение 2 дней против воды (8иаке8кш тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, РегЫо 8с1еисек Оеи1ксН1аи6 СтЬН, Воии, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 77%.
Пример 6.2. Синтез конъюгатов ΗΕ8-С-С8Ε путем восстановительного аминирования.
Пример 6.2(а). Замена буфера А.
мл раствора с концентрацией 0,454 мг/мл НС-С8Е (очищенный НС-С8Е имел по существу такие же характеристики, что и коммерческий продукт №иродеи) в 10 мМ ацетате натрия, 50 мг/мл сорбита и 0,004% Т\уееи 80 при рН 4,0 концентрировали путем диафильтрования при 0°С до 4 мл с использованием концентратора УЫакрш 15И (У815ИН11, 5КЭ М^СО, У|уакс1еисе АС, Наииоуег, Германия) и повторно разводили до 15 мл с использованием 0,1 М натрий-ацетатного буфера при рН 5,0. Такое диафильтрование повторяли дважды. Конечная концентрация на последней стадии диафильтрования составляла 3 мг/мл.
Пример 6.2(Ь). Взаимодействие НС-С8Е с производными альдегидо №8 примеров 6.1(Ь), 6.1(6) и 6.1 (ί).
К 1,67 мл раствора НС-С8Е после замены буфера в 0,1 М натрий-ацетатном буфере, рН 5,0 (как описано в примере 6.2(а) выше) добавляли 1,67 мл раствора ΗΕ8-производного и 1,67 мл 60 мМ раствора цианоборгидрида натрия, оба в том же буфере, и раствор выдерживали в течение 15,5 ч при 4°С. Все растворы охлаждали до 0°С перед смешиванием.
Использовали следующие конечные концентрации ΗΕ8:
39,4 мг/мл для производных ΗΕ8, полученных в соответствии с примерами 6.1 (Ь) и 6.1 (6).
197 мг/мл для производного ΗΕ8, полученного в соответствии с примером 6.1 (]).
197 мг/мл ΗΕ850/0,7 (М\У = 47000 Да, Ό8= 0,76, 8иргато1 Рагеи1ега1 Со11о16к СтЬН, ИокЬасНВо6Не1т, Германия) в качестве реакционного контроля.
Реакционные смеси анализировали с помощью гель-электрофореза (см. фиг. 19).
Пример 6.2(с). Замена буфера В.
мл раствора с концентрацией 0,454 мг/мл НС-С8Е (очищенный НС-С8Е имел по существу такие же характеристики, что и коммерческий продукт №иродеи) в 10 мМ ацетате натрия, 50 мг/мл сорбита и 0,004% Т\уееи 80 при рН 4,0 концентрировали путем диафильтрования при 15°С до 4 мл с использованием концентратора Угуакрш 15И (У815ИН11, 5КЭ М^СО, УйакШеисе АС, Наииоуег, Германия) и повторно разводили до 15 мл с использованием 0,1 М натрий-ацетатного буфера при рН 5,0. Такое диафильтрование повторяли дважды. Конечная концентрация на последней стадии диафильтрования составляла 1,5 мг/мл.
Пример 6.2(6). Взаимодействие НС-С8Е с производными альдегидо ΗΕ8 примеров 6.1(Г) и 6.1 (Н).
К 3,3 мл раствора НС-С8Е после замены буфера в 0,1М натрий-ацетатном буфере, рН 5,0 (как описано выше в пример 6.2(с)) добавляли 3,3 мл раствора 789 мг ΗΕ8-производного и 3,3 мл 60 мМ цианоборгидрида натрия, оба в том же буфере, и раствор выдерживали в течение 30 ч при 4°С. Все растворы охлаждали до 0°С перед смешиванием.
Через 17 ч образцы удаляли для контроля реакции. Реакционные смеси анализировали с помощью гель-электрофореза (см. фиг. 20).
Пример 6.3. Анализ митогенности вариантов С-С8Е ш уНго на мышиных клетках №8-60.
Известно специфическое действие С-С8Е на пролиферацию, дифференциацию и активацию гематопоэтических клеток нейтрофильного гранулоцитного происхождения. Митогенная способность вариантов С-С8Е была протестирована с использованием мышиных клеток №8-60 се11к (Ν. 8ЫгаГиц е( а1., Εxр. Нета(о1. 1989, 17, 116-119). Клетки выращенные в среде ИРМ1 с 10% околоплодной телячьей сыворотки (С1Ьсо INУIΤΚОСΕN СтЬН, Каг1кгиНе, Германия), содержащей кондиционированной среды 5-10% \УНН1-3В (О8М2, Вгаииксйете1д, Германия; культивированы, как описано Э8М2) как источника экзогенного 1Ь-3, собирали центрифугированием, промывали и делили на аликвоты по 100000 клеток на лунку в
- 63 010501
24-луночном планшете. Клеткам давали возможность адаптироваться в течение 1 ч при 37°С в среде КΡМI без кондиционированной среды АЕШ-3В, после чего добавляли образцы факторов роста О-С8Е, разведенные в той же среде. Клетки ΝΕ8-60 подвергали действию очищенных вариантов О-С8Е (очистка в соответствии с примерами 3 А1 и 2, количественная оценка белка в соответствии с примером 3В1):
№иродеп®, №и1ак[а®, оба от Атдеп, «конъюгат НЕ8-ОС8Е10/0,4» (10/0,4), получен в примере 6.2 (Ь), «конъюгат НЕ8-ОС8Е10/0,7» (10/0,7), получен в примере 6.2 (Ь), «конъюгат НЕ8-ОС8Е30/0,4» (30/0,4), получен в примере 6.2 (б), «конъюгат НЕ8-ОС8Е30/0,7» (30/0,7), получен в примере 6.2 (б), «конъюгат НЕ8-ОС8Е50/0,7» (50/0,7), получен в примере 6.2 (Ь), «имитирующее инкубирование» =реакционный контроль,
197 мг/мл НЕ850/0,7, МА 47000 Да, Ό8 0,76, 8иргато1 Рагеп!ега1 Со11о1бк ОтЬН, ВокЬасй Вобйет, Германия) в течение 3 дней при 37°С, а затем клетки подсчитывали электронным методом (счетчик клеток Саку ТТ Се11 СоиШег, 8сйагГе 8ук!ет, ВеиШпдеп, Ό).
Результаты суммированы ниже в таблице и на фиг. 21. Во всех случаях количество белка, приведенное ниже в таблице и на фиг. 21, представляет собой только содержание О-С8Е в конъюгатах. Как можно видеть из фиг. 21, все различные варианты О-С8Е (2,5-250 пг/мл) были способны стимулировать повышение числа клеток после 3 дней обработки по сравнению со средой, которая не содержала добавленного фактора роста. Все варианты достигали одинакового максимального уровня стимуляции при концентрации 250 пг/мл.
Таблица примера 6.3. Пролиферация мышиных клеток ΝΡ8-60, индуцированная вариантами О-С8Е
Концентрация [пг/мл] 0 2,5 2,8 5 5,7 10 11,3 25, 28,4 50 56,7 250 283, 5
Νβυροςβη 0,44 0,86 1,20 1,69 2,33 2,49 2,41
НЕЗ-ССЗГ 10/0,7 0,44 0,72 0,93 1,44 2,14 2, 41 2,41
НЕЗ-ССЗГ 10/0,4 0,44 0,72 0,97 1,40 2,17 2,67 2,75
НЕЗ-ССЗГ 50/0,7 0,44 0,62 0,70 0,97 1,68 2,15 2,32
имитирующее инкубирование 0,44 0, 85 1,31 1,91 2,38 2, 47 2,41
НЕЗ-ССЗГ 30/0,4 0,44 0,82 1,21 1,62 2,28 2,50 2,60
НЕЗ-ССЗГ 30/0,7 0,44 0,80 1, 09 1,66 2,20 2, 35 2,44
ЫеиГазРа 0,44 0,63 0,80 1,12 1,83 2,25 2,33
Пример 6.4. Биологическое действие ш у1уо конъюгатов ИО-С8Е на крысах.
По прибытии, крыс [самцы крыс СЕЕСО® (возраст 7 недель), Сйаг1ек буег ЭеШксЫапб ОтЬН, 8апдИоГег Аед 7, Ό-97633 8и1хГе1б)| случайным образом разбивали на группы по 5 штук в каждой. После акклиматизации в течение 7 дней крыс в плохом состоянии исключали из эксперимента и заменяли на запасных животных. Вес крыс по прибытии составлял 181-203 г.
Затем крысам в каждой группе из пяти случайным образом выбранных крыс вводили внутривенно 100 мкг белка на кг веса тела (скорость инъекции 15 секунд/доза; носитель 5 мл РВ8/кг веса тела) следующих некоъюгированных или конъюгированных образцов О-С8Е (очистка в соответствии с примерами 3 А1 и 2, количественная оценка белка в соответствии с примером 3В1):
№иродеп® и №и1ак!а®, оба от Атдеп, «конъюгат НЕ8-ОС8Е10/0,4» (10/0,4), получен в примере 6.2 (Ь), «конъюгат НЕ8-ОС8Е10/0,7» (10/0,7), получен в примере 6.2 (Ь), «конъюгат НЕ8-ОС8Е30/0,4» (30/0,4), получен в примере 6.2 (б), «конъюгат НЕ8-ОС8Е30/0,7» (30/0,7), получен в примере 6.2 (б), «конъюгат НЕ8-ОС8Е50/0,7» (50/0,7), получен в примере 6.2 (Ь), «имитирующее инкубирование» (=реакционный контроль, 197 мг/мл НЕ850/0,7, МА 47000 Да, Ό8 0,76, 8иргато1 Рагеп!ега1 Со11о1бк ОтЬН, КокЬасИ ВобЬет, Германия) и контрольный носитель (РВ8, используемый объем 5 мл/кг веса тела).
Образцы цельной крови у всех животных примерно с 200 мкл БОТА отбирали из ретробульбарного венозного сплетения под легкой анестезией эфиром. В день тестирования - 5 кровь отбирали один раз утром у всех животных после голодания в течение ночи. В дни тестирования с 1 по 8 день, кровь отбирали дважды в день с интервалом 12 ч. Первый образец крови в день 1 отбирали перед введением О-С8Е/ОС8Е-НЕ8-конъюгата.
- 64 010501
Подсчитывали лейкоциты (№ВС) с использованием прибора Βауе^А^VIА™ 120 (Регпга1б, Германия). Результаты показаны на фиг. 22.
Пример 6.5. Измерение периода полураспада т νί\Ό конъюгатов, полученных из НЕ850/0,7 и СС8Р путем восстановительного аминирования (пример 6.2 (Ь)) по сравнению с №иродеп® и №и1ак!а® (Атдеп).
Использовали самок мышей ВАЬВ/сО1аНкб (Наг1ап СтЬН/Вогскеп). В день введения измеряли вес животных (19-22 г). Каждой мыши вводили в виде инъекции в хвостовую вену 100 мкг на кг веса тела химически модифицированного образца гк-С-С8Р, полученного в примере 6.2(Ь), а также образцы Непрочен® и №и1ак!а® (Атдеп). Через 1, 3, 6, 11, 22, 30, 49, 72 ч после инъекции (см. таблицу ниже) отбирали образцы приблизительно в 150 мкл цельной крови из хвостовой вены или из венозного сплетения позади глазного яблока у 3 мышей соответствующей группы с использованием капилляров, содержащих гепарин натрия (Н^^кскшаηη, ЕЬегк1аб!) и хранили их на льду до получения плазмы крови.
Таблица примера 6.5. Проведение отбора проб
Образец Мышь № 1ч Зч 6ч 11ч 22ч 30ч 4 9ч 72ч
Меи1а5ба 1 X X X
2
3
4 X X X
5
6
7 X X
8
9
Меиродеп 10 X X X
11
12
13 X X
14
15
16 X X
17
18
НЕЗ-С- 19 X X
20
21
22 X X X
23
24
25 X X
26
27
Цельную кровь центрифугировали в течение 10 мин при 2000д. Плазму переносили в другую пробирку и повторно центрифугировали в течение 5 мин при 3500д. Аликвоты хранили при -80°С до дня проведения анализа. Количество С-С8Р в образцах плазмы крови оценивали количественно с использованием метода ЕЫ8А (В&Э СтЬН, №1екЬабеп) в соответствии с инструкциями производителя.
Результаты представлены на фиг. 36, откуда следует, что образец конъюгата НЕ8-С-С8Р согласно изобретению обладает намного большим периодом полураспада по сравнению с №иродеп (5,1 по сравнению с 1,2 ч), а по сравнению с №и1ак!а он имеет почти такой же период полураспада (5,1 по сравнению с 5,2 ч).
Пример 7. Конъюгация НЕ8 с рекомбинантным кЕРО с помощью восстановительного аминирования.
Использовали рекомбинантный ЕРО человека, имеющий последовательность аминокислот ЕРО человека и, по существу, такие же характеристики, что и коммерчески доступный Егуро® (Огк!о Вю!еск, 1апкеп-С11ад) или №оВесогтоп® (Воске), см. ЕР 0148605, ЕР 0205564, ЕР 0411678.
Пример 7.1. Синтез амино-НЕ8.
г окисленного НЕ8 (М№ = 57000 Да, Ό8 = 0,76, 8иргато1 Рагеп!ега1 Со11о1бк СтЬН, ВокЬаскВобке1т, Германия, получен в соответствии с патентом Германии ЭЕ 19628705 А1) нагревали в течение ночи при 80°С в вакууме, растворяли в токе азота в 53 мл сухого диметилсульфоксида (Р1ика, 81§таА1бпск Скетие СтЬН, ТаиГкпскеп, Германия) и добавляли 2 мл 1,4-диаминобутана (Р1ика, 8фта-А1бпск Скетие СтЬН, ТаиГкпскеп, Германия). После перемешивания при 40°С в течение 17 ч реакционную смесь добавляли к 350 мл охлажденного на льду 2-пропанола (Саг1 Во!к СтЬН + Со.КС, Каг1кгике, Германия). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, промывали 80 мл охлаж- 65 010501 денного на льду 2-пропанола и собирали центрифугированием. Неочищенный продукт растворяли в 80 мл воды и подвергали диализу в течение 2 дней против воды (8паке8кш тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, РегЬю 8с1епсез ОеШзсЫапб СшЬН, Вопп, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 85%.
Пример 7.2. Синтез альдегидо-НЕ8.
153 мг 4-формилбензойной кислоты и 241 мг 1-гидрокси-1Н-бензотриазола (оба от А1бпс1г 81дшаА1бпс11 СНепие СшЬН, Таи!к1гсйеп, Германия) растворяли в 51 мл Ν,Ν-диметилформамида (качество для пептидного синтеза, ВюзоКе, Vа1кеηз\νаа^б. Нидерланды) и добавляли 170 мкл Ν,Ν'-диизопропилкарбодиимида (Р1ика, 81дша-А1бпск Скеине СшЬН, Таи!к1гскеп, Германия). После выдерживания при 21°С в течение 30 мин добавляли 5,1 г амино-НЕ8, полученного в соответствии с примером 7.1. После встряхивания в течение 16 ч при 22°С реакционную смесь добавляли к 360 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об./об.). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, повторно растворяли в 50 мл воды и осаждали 360 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об./об.), как описано выше. После центрифугирования осадок растворяли в 50 мл воды и подвергали диализу в течение 2 дней против воды (8иаке8кт тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, РегЬю 8аепсез ОеШзсЫапб СшЬН, Вопп, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 87%.
Пример 7.3. Конъюгация альдегидо-НЕ8 с ЕРО с помощью восстановительного аминирования.
625 мг альдегидо-НЕ8, полученного в соответствии с примером 7.2, растворяли в 1,67 мл реакционного буфера (0,1 М натрий ацетатный буфер, рН 5,0) и охлаждали до 0°С. Добавляли 1,67 мл раствора ЕРО (3 мг/мл) и 1,67 мл 60 мМ раствора цианоборгидрида натрия, оба раствора в том же буфере и предварительно охлаждены до 0°С, и смесь выдерживали при 0°С. Через 17 ч реакционную смесь очищали после анализа с помощью гель-электрофореза (см. фиг. 23, полоса В).
Пример 7.4 Реакционный контроль А: реакция альдегидо-НЕ8 с ЕРО в отсутствие цианоборгидрида натрия.
313 мг альдегидо-НЕ8, полученного в соответствии с примером 7.2, растворяли в 0,83 мл реакционного буфера (0,1 М натрий ацетатный буфер, рН 5,0) и охлаждали до 0°С. Добавляли 0,83 мл раствора ЕРО (3 мг/мл) в том же буфере и 0,83 мл реакционного буфера, оба раствора были предварительно охлаждены до 0°С, и смесь выдерживали при 0°С. Через 17 ч реакционную смесь очищали после анализа с помощью гель-электрофореза (см. фиг. 23, полоса С).
Пример 7.5. Реакционный контроль В: реакция ЕРО с цианоборгидридом натрия.
0,83 мл раствора ЕРО (3мг/мл) в реакционном буфере (0,1 М натрий ацетатный буфер, рН 5,0) охлаждали до 0°С, добавляли 0,83 мл 60 мМ раствора цианоборгидрида натрия в том же буфере и 0,83 мл реакционного буфера, оба из которых были охлаждены до 0°С, и смесь выдерживали при 0°С. Через 17 ч реакционную смесь очищали после анализа с помощью гель-электрофореза (см. фиг. 23, полоса Ό).
Пример 7.6. Ион-обменная хроматография для очистки ЕРО и производных ЕРО.
Очистку образцов ЕРО проводили при комнатной температуре с использованием исследовательской системы АКТА ехр1огег 10 (АшегзЬаш РЬагшаша Вю1есЬ), состоящей из насоса Р-903, смесителя М925 с камерой на 0,6 мл, монитором υV-900с 10 мМ проточной ячейкой, монитора рН/С-900, коллектора для сбора фракций Ргас-900, замкнутой системы для образца на 2 мл и программного обеспечения Ишсогп Vе^з^ои 3.2.1. Колонку, содержащую 5 мл О-8ерНагозе Раз! Р1от, уравновешивали буфером А (20 мМ Ν-морфолинопропансульфоновая кислота/ИаОН буфер, рН 8,0), используя объем, равный 10 объемам колонки (ОК). Образцы ЕРО разводили в соотношении 1:10 буфером А, наконец доводили до рН 7,8-8,2 и вводили в систему с помощью насоса для образцов со скоростью потока 1 мл/мин. После промывки насоса для образцов 10 мл буфера А колонку дополнительно промывали 6 объемами колонки буфера А при скорости потока 1 мл/мин. Затем вводили 4 объема 20 мМ ^-фосфата, рН 6,5; буфер В, при скорости потока 0,8 мл/мин и ЕРО элюировали с использованием крутого градиента от 0 до 40% буфера С (0,5М №1С1 в 20 мМ ^-фосфате, рН 6,5) в течение 37 мин. Профили элюирования регистрировали при поглощении 206, 260 и 280 нм. После завершения элюирования колонку регенерировали 25 мл буфера С при скорости потока 1 мл/мин. Наконец через колонку пропускали 1М №1ОН в течение 60 мин, повторно промывали буфером С и хранили до последующего использования.
Пример 7.7. Определение белка ЕРО.
Количественное определение белка ЕРО проводили путем измерения УФ поглощения при 280 нм в соответствии с Еиг. РНаг. (Еигореап РЬагшасоре1а 4 МоподгарЬу) (Европейская Фармакопея, монография) 01/2002: 1316: концентрированный раствор эритропоэтина) в кювете с длиной пути 1 см. Дополнительно количественное содержание ЕРО оценивали с помощью метода КР-ВЭЖХ с использованием колонки КР-С4 +убас Рго1ет С4, каталожный № 214ТР5410, Сгасе Vубас, Са, США); в способе ВЭЖХ проводили калибровку с использованием в качестве ссылочного стандарта эритропоэтина ВКР'1 (Еигореап РНагшасоре1а, СопзеП бе ГЕигоре В.Р. 907-Р67029, 81газЬоигд Себех 1).
Пример 7.8. Анализ т-νΐνΘ биологической активности НЕ8-модифицированного ЕРО.
Биоанализ ЕРО в нормоцитаэмической системе мыши проводили в соответствии с методиками, описанными в Еигореап РЬагшасоре1а 4, МоподгарЬу 01/2002: 1316: Егу111горо1е1т сопсеп1га1еб зокПюп
- 66 010501 апб Рй. Еиг. Сйар1ег 5.3: 81айкПса1 Апа1ук1к оГ ЯекиЙк оГ Вю1одюа1 Аккаук апб Тек1к. Для НЕ8модифицированного ЕРО согласно примеру 7.3. величина специфической активности была определена как равная 418500 единиц на мг ЕРО белка, что указывает на приблизительно 4-5-кратное повышение специфической активности по сравнению с исходным веществом ЕРО.
Результаты исследования суммированы в следующей таблице.
Таблица примера 7.8.
Описание образца Рассчитанная специфическая активность образца ЕРО (на основе А280 и определения КР-ВЭЖХ)
Исходное вещество ЕРО (не модифицированный) 89000 Ед/мг
Исходное вещество ЕРО (реакционный контроль А) 85500 Ед/мг
ЕР0-НЕ5 согласно примеру 7.3 418500 Ед/мг
Пример 8. Синтез конъюгатов НЕ8-ШМ-альфа с помощью восстановительного аминирования.
Использованный ΣΕΝ-α представлял собой рекомбинантный интерферон альфа-2Ь человека, полученный методами рекомбинантной ДНК технологии с использованием ЕксйепсЫа сой (Е. сой). Он состоит из 165 аимнокислот и имеет последовательность аминокислот, идентичную последовательности природного интерферона альфа-2Ь человека (ЫЕХ-альфа 2Ь).
Пример 8.1. Синтез оксо-НЕ8.
НЕ8, окисленный по его восстановительному концу, как описано ниже (оксо-НЕ8), получали из НЕ8 с использованием щелочного раствора иода, как описано в патенте Германии 196 28 705 А1, соответствующее содержание которого (пример А, колонка 9, строки 6-24) включено в данное описание путем ссылки.
Пример 8.2. Синтез производных НЕ8.
В двухстадийном способе, оксо-НЕ8 примера 8.1 модифицировали по его восстановительному концу амином и вводили альдегидную группу во второй реакции. Полученный альдегидо-НЕ8 использовали для получения конъюгатов НЕ8-ШМ-альфа с помощью восстановительного аминирования, как описано в пример 8.3.
Пример 8.2.1. Синтез амино-НЕ8 из оксо-НЕ8 примера 8.1.
6,09 г оксо-НЕ8 из примера 8.1 (М№ = 14,5 кДа, Ό8 = 0,41, 8иргато1 РагеШега1 Со11о1бк СтЬН, ЯокЬасй-Яобйе1т, Германия) нагревали в течение ночи при 80°С в вакууме, и затем растворяли в токе азота в 25 мл сухого диметилсульфоксида (Р1ика, 81дта-А1бпсй Сйет1е СтЬН, ТанГЫгсйеп, Германия) и добавляли 5,13 мл 1,4-диаминобутана. После перемешивания при 40°С в течение 17 ч реакционную смесь добавляли к 150 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об./об.). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, промывали 40 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об./об.) и собирали центрифугированием. Неочищенный продукт растворяли в 80 мл воды и подвергали диализу в течение 4 дней против воды (8паке8кш тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, РегЫо 8аепсек ЭеШксЫапб СтЬН, Вопп, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 67%.
Пример 8.2.2. Синтез альдегидо-НЕ8 из амино-НЕ8 примера 8.2.1.
105 мг 4-формилбензойной кислоты и 135 мг 1-гидрскси-1Н-бензотриазола (оба от А1бпсй, 81дтаА1бпсй Сйет1е СтЬН, ТаиГкнсйеп, Германия) растворяли в 7 мл Ν,Ν-диметилформамида (качество для пептидного синтеза, ВюкоЫе, Уа1кепктаагб, Нидерланды) и добавляли 135 мкл Ν,Ν'-диизопропилкарбодиимида (Р1ика, 81дта-А1бпсй Сйет1е СтЬН, ТаиГкйсйеп, Германия). После выдерживания при 21°С в течение 30 мин добавляли 0,7 г амино-НЕ8 (синтезирован, как описано в примере 8.2.1). После встряхивания в течение 18 ч при 22°С реакционную смесь добавляли к 42 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об./об.). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, повторно растворяли в 5 мл ДМФ и осаждали 42 мл охлажденной на льду смеси этанола/ацетон, как описано выше. После центрифугирования собранный осадок растворяли в воде и подвергали диализу в течение 4 дней против воды (8паке8кш тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, РегЫо 8с1епсек ЭеШксЫапб СтЬН, Вопп, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 95%.
Пример 8.2.3. Синтез амино-НЕ8 из оксо-НЕ8 примера 8.1.
6,09 г оксо-НЕ8 из примера 8.1 (М№ = 14,7 кДа, Ό8 = 0,76, 8иргато1 РагеШега1 Со11о1бк СтЬН, ЯокЬасй-Яобйе1т, Германия) нагревали в течение ночи при 80°С в вакууме, и затем растворяли в токе азота в мл сухого диметилсульфоксида (Р1ика, 81дта-А1бпсй Сйет1е СтЬН, ТанГЫгсйеп, Германия) и добавляли 6,03 мл 1,4-диаминобутана. После перемешивания при 40°С в течение 17 ч реакционную смесь до- 67 010501 бавляли к 150 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об./об.). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, промывали 40 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об./об.) и собирали центрифугированием. Неочищенный продукт растворяли в 80 мл воды и подвергали диализу в течение 4 дней против воды (8паке8кш тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, РегЫо 8с1епсек Пеи!ксЫапй СтЬН, Вопп, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 52%.
Пример 8.2.4. Синтез альдегидо-НЕ8 из амино-НЕ8 примера 8.2.3.
150 мг 4-формилбензойной кислоты и 230 мг 1-гидрскси-1Н-бензотриазола (оба от А1йпсй, 81дтаА1йпсй Сйет1е СтЬН, ТаиГкпсйеп, Германия) растворяли в 10 мл Ν,Ν-диметилформамида (качество для пептидного синтеза, Вюко1уе, Vа1кеηк\νаа^й. Нидерланды) и добавляли 204 мкл Ν,Ν'диизопропилкарбодиимида (Р1ика, 81дта-А1йпсй Сйет1е СтЬН, ТаиГкпсйеп, Германия). После выдерживания при 21°С в течение 30 мин добавляли 1 г амино-НЕ8 (синтезирован, как описано в примере 8.2.3). После встряхивания в течение 19 ч при 22°С реакционную смесь добавляли к 84 мл охлажденного на льду 2-пропанола. Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, повторно растворяли в 50 мл воды и подвергали диализу в течение 2 дней против воды (8паке8кт тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, РегЫо 8с1епсек ЭеШксЫапй СтЬН, Вопп, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 83%.
Пример 8.2.5. Синтез амино-НЕ8 из оксо-НЕ8 примера 8.1.
г оксо-НЕ8 из примера 8.1 (МА = 28 кДа, Ό8 = 0,41, 8иргато1 Рагеп!ега1 Со11о1йк СтЬН, ВокЬасйВоййе1т, Германия) нагревали в течение ночи при 80°С в вакууме, и затем растворяли в токе азота в 28 мл сухого диметилсульфоксида (Р1ика, 81дта-А1йг1сй Сйет1е СтЬН, ТаиГкпсйеп, Германия) и добавляли 1,67 мл 1,4-диаминобутана. После перемешивания при 40°С в течение 17 ч реакционную смесь добавляли к 175 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об./об.). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С. Неочищенный продукт растворяли в 40 мл воды и подвергали диализу в течение 4 дней против воды (8паке8кт тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, РегЫо 8с1епсек Пеи!ксЫапй СтЬН, Вопп, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта не определяли.
Пример 8.2.6. Синтез альдегидо-НЕ8 из амино-НЕ8 примера 8.2.5.
130 мг 4-формилбензойной кислоты и 153 мг 1-гидрокси-1Н-бензотриазола (оба от А1йпсй, 81дтаА1йпс11 Сйет1е СтЬН, ТаиГкпсйеп, Германия) растворяли в 36 мл Ν,Ν-диметилформамида (качество для пептидного синтеза, Вюко1уе, Vа1кеηк\νаа^й. Нидерланды) и добавляли 110 мкл Ν,Ν'-диизопропилкарбодиимида (Р1ика, 81дта-А1йг1сй Сйет1е СтЬН, ТаиГкпсйеп, Германия). После выдерживания при 21°С в течение 30 мин добавляли 2,61 г амино-НЕ8 (синтезирован, как описано в примере 8.2.5). После встряхивания в течение 22,5 ч при 22°С реакционную смесь добавляли к 160 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об./об.). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С и промывали охлажденной на льду смесью ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об./об.). После центрифугирования собранный осадок растворяли в 30 мл воды и подвергали диализу в течение 1 дня против воды (8паке8кт тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, РегЫо 8с1епсек ЭеШксЫапй СтЬН, Вопп, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 81%.
Пример 8.2.7. Синтез амино-НЕ8 из оксо-НЕ8 примера 8.1.
г оксо-НЕ8 из примера 8.1 (МА = 30,8 кДа, Ό8 = 0,76, 8иргато1 Рагеп!ега1 Со11о1йк СтЬН, ВокЬасй-Воййе1т, Германия) нагревали в течение ночи при 80°С в вакууме, и затем растворяли в токе азота в 28 мл сухого диметилсульфоксида (Р1ика, 81дта-А1йг1сй Сйете СтЬН, ТаиГкпсйеп, Германия) и добавляли 1,67 мл 1,4-диаминобутана. После перемешивания при 40°С в течение 17 ч реакционную смесь добавляли к 175 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об./об.). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С. Неочищенный продукт растворяли в 40 мл воды и подвергали диализу в течение 2 дней против воды (8паке8кш тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, РегЫо 8с1епсек ОеЫксЫапй СтЬН, Вопп, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта не определяли.
Пример 8.2.8. Синтез альдегидо-НЕ8 из амино-НЕ8 примера 8.2.7.
122 мг 4-формилбензойной кислоты и 144 мг 1-гидрокси-1Н-бензотриазола (оба от А1йпсй, 81дтаА1йпс11 Сйете СтЬН, ТаиГкпсйеп, Германия) растворяли в 34 мл Ν,Ν-диметилформамида (качество для пептидного синтеза, Вюко1уе, Vа1кеηк\νаа^й. Нидерланды) и добавляли 103 мкл Ν,Ν'-диизопропилкарбодиимида (Р1ика, 81дта-А1йг1сй Сйет1е СтЬН, ТаиГкпсйеп, Германия). После выдерживания при 21°С в течение 30 мин добавляли 2,46 г амино-НЕ8 (синтезирован, как описано в примере 8.2.7). После встряхивания в течение 22,5 ч при 22°С реакционную смесь добавляли к 160 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об./об.). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С и промывали охлажденной на льду смесью ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об./об.). После центрифугирования осадок растворяли в 30 мл воды и подвергали диализу в течение 4 дней против воды (8паке8кт тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, РегЫо 8с1епсек ОеЫксй1апй СтЬН, Вопп, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 87%.
Пример 8.2.9. Синтез амино-НЕ8 из оксо-НЕ8 примера 8.1.
- 68 010501 г оксо-НЕ8 из примера 8.1 (МА = 42,1 кДа, Ό8 = 0,41, 8иргато1 Рагсп1сга1 Со11о1б§ СтЬН, ЯокЬаск-Яобкс1т, Германия) нагревали в течение ночи при 80°С в вакууме, и затем растворяли в токе азота в 53 мл сухого диметилсульфоксида (Ийка, 8щта-А1бпск СИсиис СтЬН, ТаиГЫгсксп, Германия) и добавляли 2,01 мл 1,4-диаминобутана. После перемешивания при 40°С в течение 17 часов реакционную смесь добавляли к 350 мл охлажденного на льду 2-пропанола (Саг1 КЫк СтЬН + Со.КС, Каг18гикс, Германия). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, промывали 80 мл охлажденного на льду 2-пропанола и собирали центрифугированием. Неочищенный продукт растворяли в 80 мл воды и подвергали диализу в течение 2 дней против воды (8пакс8кт тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, РсгЫо 8с1спсс5 ОсиЦсЫапб СтЬН, Вопп, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 76%.
Пример 8.2.10. Синтез альдегидо-НЕ8 из амино-НЕ8 примера 8.2.7.
900 мг 4-формилбензойной кислоты и 1053 мг 1-гидрокси-1Н-бензотриазола (оба от А1бпск, 81дтаА1бпск СИсиис СтЬН, Таиίк^^скси, Германия) растворяли в 30 мл Ν,Ν-диметилформамида (качество для пептидного синтеза, ВюкоЫс, Уа1ксп8^аагб, Нидерланды) и добавляли 930 мкл Ν,Ν'-диизопропилкарбодиимида (Ийка, 8щта-А1бпск СИсиис СтЬН, ТаиГЫгсксп, Германия). После выдерживания при 21°С в течение 30 мин добавляли 3 г амино-НЕ8 (синтезирован, как описано в примере 8.2.9 и растворенного в 20 мл Ν,Ν-диметилформамида). После встряхивания в течение 22,5 ч при 22°С реакционную смесь добавляли к 210 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об./об.). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С и промывали охлажденной на льду смесью ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об./об.). После центрифугирования осадок растворяли в 30 мл воды и подвергали диализу в течение 2 дней против воды (8пакс8кт тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, РсгЫо 8с1спсс5 Оси^сЫапб СтЬН, Вопп, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 97%.
Пример 8.2.11. Синтез амино-НЕ8 из оксо-НЕ8 примера 3.1 (А).
6,09 г оксо-НЕ8 (МА = 56,8 кДа, Ό8 = 0,76, 8иргато1 Рагсп1сга1 Со11оЫ5 СтЬН, Яо8Ьаск-Яобкс1т, Германия) нагревали в течение ночи при 80°С в вакууме, и затем растворяли в токе азота в 32 мл сухого диметилсульфоксида (Ийка, 8щта-А1бпск СИсиис СтЬН, ТаиШгсксп, Германия) и добавляли 1,22 мл 1,4-диаминобутана. После перемешивания при 40°С в течение 17 часов реакционную смесь добавляли к 150 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об./об.). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, промывали 40 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об./об.) и собирали центрифугированием. Неочищенный продукт растворяли в 80 мл воды и подвергали диализу в течение 4 дней против воды (8пакс8кт тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, РсгЫо 8с1спсс5 ПсийсЫапб СтЬН, Вопп, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 82%.
Пример 8.2.12. Синтез альдегидо-НЕ8 из амино-НЕ8 примера 8.2.11.
125 мг 4-формилбензойной кислоты и 174 мг 1-гидрокси-1Н-бензотриазола (оба от А1бпск, 81дтаА1бпск СИстю СтЬН, ТаЫкйсксп, Германия) растворяли в 38 мл Ν,Ν-диметилформамида (качество для пептидного синтеза, ВюкоЫс, Уа1ксп8^аагб, Нидерланды) и добавляли 155 мкл Ν,Ν'-диизопропилкарбодиимида (Ийка, 8щта-А1бпск Скст1с СтЬН, ТаиГЫгсксп, Германия). После выдерживания при 21°С в течение 30 мин добавляли 3,8 г амино-НЕ8 (синтезирован, как описано в примере 8.2.11). После встряхивания в течение 19 ч при 22°С реакционную смесь добавляли к 160 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об/об). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, повторно растворяли в 20 мл Ν,Ν-диметилформамида и осаждали с использованием 80 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об/об), как описано выше. После центрифугирования осадок растворяли в 50 мл воды и подвергали диализу в течение 2 дней против воды (8пакс8кш тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, РсгЫо 8с1спсс5 ОсиЦсЫапб СтЬН, Вопп, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 77%.
Пример 8.2.13. Синтез амино-НЕ8 из оксо-НЕ8 примера 8.1 (В).
г оксо-НЕ8 (МА = 56,8 кДа, Ό8 = 0,76, 8иргато1 Рагсп1сга1 Со11оЫ5 СтЬН, Ко8Ьаск-К.обкс1т, Германия) нагревали в течение ночи при 80°С в вакууме, и затем растворяли в токе азота в 53 мл сухого диметилсульфоксида (Ийка, 8щта-А1бпск Скст1с СтЬН, ТаЫкпсксп, Германия) и добавляли 2 мл 1,4диаминобутана. После перемешивания при 40°С в течение 17 ч реакционную смесь добавляли к 350 мл охлажденного на льду 2-пропанола (Саг1 Ро1к СтЬН + Со.КС, Каг18гикс, Германия). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, промывали 80 мл охлажденного на льду 2-пропанола и собирали центрифугированием. Неочищенный продукт растворяли в 80 мл воды и подвергали диализу в течение 2 дней против воды (8пакс8кш тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, РсгЫо 8с1спсс5 Оси15ск1апб СтЬН, Вопп, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 85%.
Пример 8.2.14. Синтез альдегидо-НЕ8 из амино-НЕ8 примера 8.2.13.
153 мг 4-формилбензойной кислоты и 241 мг 1-гидрокси-1Н-бензотриазола (оба от А1бпск, 81дтаА1бпск Скст1с СтЬН, ТаЫкйсксп, Германия) растворяли в 51 мл Ν,Ν-диметилформамида (качество для пептидного синтеза, Вюкокс, Уа1ксп8теаагб, Нидерланды) и добавляли 170 мкл Ν,Ν'-диизопропилкарбодиимида (Ийка, 8щта-А1бпск Скспнс СтЬН, ТаЫкпсксп, Германия). После выдерживания при
- 69 010501
21°С в течение 30 мин добавляли 5,1 г амино-НЕ8 (синтезирован, как описано в примере 8.2.13). После встряхивания в течение 16 ч при 22°С реакционную смесь добавляли к 360 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об./об.). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, повторно растворяли в 50 мл воды и осаждали с использованием 360 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об./об.), как описано выше. После центрифугирования осадок растворяли в 50 мл воды и подвергали диализу в течение 2 дней против воды (8паке8к1п тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, РегЬю 8с1епсек ^еиΐксБ1аий СтЬН, Вопп, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 87%.
Пример 8.2.15. Синтез амино-НЕ8 из оксо-НЕ8 примера 8.1 (А).
5,0 г оксо-НЕ8 (Μ\ν = 29,3 кДа, Ό8 = 0,86, 8иргато1 Рагеп!ега1 Со11о1йк СтЬН, КокЬасБ-КойБет, Германия) нагревали в течение ночи при 80°С в вакууме, растворяли в токе азота в 20 мл сухого диметилсульфоксида (Р1ика, 81дта-А1йпсБ СБет1е СтЬН, ТаиШгсБеп, Германия) и добавляли 1,67 мл 1,4диаминобутана. После перемешивания при 40°С в течение 30,5 ч реакционную смесь добавляли к 175 мл охлажденной на льду смеси ацетона (Саг1 Ко!Б СтЬН + Со.КС, Каг1кгиБе, Германия) и этанола (8оппепЬегд, ПАВ, ВгаипксБтее1д, Германия) в соотношении 1:1 (об./об.). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием в течение 120 мин при 4°С, растворяли в 40 мл воды и подвергали диализу в течение 2 дней против воды (8паке8к1п тюбинг для диализа, отсечение по массе 10 кДа, РегЬю 8с1епсек Эеи1ксБ1апй СтЬН, Вопп, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 87%.
Пример 8.2.16. Синтез альдегидо-НЕ8 из амино-НЕ8 примера 8.2.15 150 мг 4-формилбензойной кислоты и 230 мг 1-гидрокси-1Н-бензотриазола (оба от А1йпсБ, 81дта-А1йпсБ СБет1е СтЬН, ТаиШгсБеп, Германия) растворяли в 10 мл Ν,Ν-диметилформамида (качество для пептидного синтеза, Вюкойе, Уа1кепктеаагй, Нидерланды) и добавляли 166 мкл Ν,Ν'-диизопропилкарбодиимида (Р1ика, 81дта-А1йпсБ СБет1е СтЬН, ТаиШгсБеп, Германия). После выдерживания при 21°С в течение 30 мин добавляли раствор 3,02 г амино-НЕ8 (синтезирован, как описано в примере 8.2.15) в 20 мл ДМФ. После встряхивания в течение 16 ч при 22°С реакционную смесь добавляли к 215 мл охлажденной на льду смеси ацетона (Саг1 Во(Б СтЬН + Со.КС, Каг1кгиБе, Германия) и этанола (8οииеηЬе^д, ЭАВ, ВгаипксБтее1д, Германия) в соотношении 1:1 (об./об.). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, повторно растворяли в 20 мл воды и осаждали смесью ацетон/этанол, как описано выше. После центрифугирования осадок растворяли в 30 мл воды и подвергали диализу в течение 2,5 дней против воды (8паке8кш тюбинг для диализа, отсечение по массе 10 кДа, РегЬю 8с1епсек Эеи1ксБ1апй СтЬН, Вопп, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 87%.
Пример 8.2.17. Синтез амино-НЕ8 из оксо-НЕ8 примера 8.1.
5,0 г оксо-НЕ8 (Μ\ν = 97,9 кДа, Ό8 = 0,76, 8иргато1 Рагеп!ега1 Со11о1йк СтЬН, КокЬасБ-ВойБе1т, Германия) нагревали в течение ночи при 80°С в вакууме, растворяли в токе азота в 20 мл сухого диметилсульфоксида (Р1ика, 81дта-А1йпсБ СБет1е СтЬН, ТаиШгсБеп, Германия) и добавляли 0,50 мл 1,4диаминобутана (Р1ика, 81дта-А1йпсБ СБет1е СтЬН, ТаиШгсБеп, Германия). После перемешивания при 40°С в течение 30,5 ч реакционную смесь добавляли к 175 мл охлажденной на льду смеси ацетона (Саг1 Во(Б СтЬН + Со.КС, Каг1кгиБе, Германия) и этанола (8οииеηЬе^д, ЭАВ, ВгаипксБтее1д, Германия) в соотношении 1:1 (об./об.). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием в течение 120 мин при 4°С, растворяли в 40 мл воды и подвергали диализу в течение 2 дней против воды (8паке8кт тюбинг для диализа, отсечение по массе 10 кДа, РегЬю 8с1епсек Эеи1ксБ1апй СтЬН, Вопп, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 90%.
Пример 8.2.18. Синтез альдегидо-НЕ8 из амино-НЕ8 примера 8.2.17.
мг 4-формилбензойной кислоты и 112 мг 1-гидрокси-1Н-бензотриазола (оба от А1йпсБ, 81дтаА1йпсБ СБет1е СтЬН, ТаиШгсБеп, Германия) растворяли в 10 мл Ν,Ν-диметилформамида (качество для пептидного синтеза, Вюкойе, Vа1кеηк\νаа^й. Нидерланды) и добавляли 81,3 мкл Ν,Ν'-диизопропилкарбодиимида (Р1ика, 81дта-А1йпсБ СБет1е СтЬН, ТаиШгсБеп, Германия). После выдерживания при 21°С в течение 30 мин добавляли раствор 3,09 г амино-НЕ8 (синтезирован, как описано в примере 8.2.17) в 20 мл ДМФ. После встряхивания в течение 16 ч при 22°С реакционную смесь добавляли к 215 мл охлажденной на льду смеси ацетона (Саг1 Во!Б СтЬН + Со.КС, Каг1кгиБе, Германия) и этанола (8οηиеηЬе^д, ЭАВ, ВгаипксБтее1д, Германия) в соотношении 1:1 (об./об.). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, повторно растворяли в 20 мл воды и осаждали смесью ацетон/этанол, как описано выше. После центрифугирования осадок растворяли в 30 мл воды и подвергали диализу в течение 2,5 дней против воды (8паке8кт тюбинг для диализа, отсечение по массе 10 кДа, РегЬю 8с1епсек Эеи1ксБ1апй СтЬН, Вопп, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 96%.
Пример 8.3. Синтез конъюгатов ΓΕΝ-альфа с помощью восстановительного аминирования.
Пример 8.3.1. Конъюгация с ШЛ-альфа в 20 мкг масштабе.
К 0,675 мг ^Ν-альфа, растворенного в 0,375 мл 25 мМ натрий-фосфатного буфера, рН 7,5, содержащего 150 мМ Ν;·ιΟ и 0,3 мМ ЕЭТА, добавляли 4 мл реакционного буфера (0,1 М натрий-ацетатный буфер, рН 5,0), и раствор центрифугировали в течение 30 мин при 3939 х д в концентраторе У^νакр^η 6 ^теа 8с1епсе, 5 кДа М^СО, Напиονе^, Германия). Процедуру промывки повторяли дважды путем разбавления оставшегося раствора реакционным буфером до объема 6 мл и центрифугирования, как описа
- 70 010501 но. Объем конечного раствора ΙΡΝ-альфа составлял 0,236 мл, что соответствовало расчитанной конечной концентрации ΙΡΝ-альфа, равной 2,86 мг/мл. Концентрацию белка экспериментально не проверяли.
К 7 мкл раствора ΙΡΝ-альфа, полученного, как описано выше, и охлажденного до 0°С, добавляли 10 мкл (50 эквив.) раствора соответствующего альдегидо-НЕ8 (см. таблицу ниже) и 11,3 мкл 60 мМ раствора цианоборгидрида натрия, оба раствора были приготовлены в том же буфере (ацетат натрия, рН 5,0) и охлаждены до 0°С, и смесь выдерживали в течение 17 ч при 0°С. Реакционную смесь анализировали с помощью гель-электрофореза.
Были использованы следующие концетрации растворов альдегидо-НЕ8.
Таблица примера 8.3.1
Опыт Производное НЕЗ Концентрация [мг/мл]
А альдегидо-НЕЗ (пример 8.2.2) 52
В альдегидо-НЕ5 (пример 8.2.4) 52
С альдегидо-НЕЗ (пример 8.2.6) 156
Ώ альдегидо-НЕЗ (пример 8.2.8) 156
Е альдегидо-НЕЗ (пример 8.2.10) 260
Г альдегидо-НЕЗ А (пример 8.2.12) 260
С без производного НЕЗ, но в присутствии -
ΝθΟΝΒΗ.;
I без производного НЕЗ и без ΝβΟΝΒΗ3 -
σ Неокисленный НЕЗ 10/04 (Мм 7,6 кДа, 1)5-0,41) в присутствии ΝβΟΝΒΗ3 52
к Неокисленный НЕЗ 10/04 (Ми 7,6 кДа, СЗ=0,41), без ΝβΟΝΒΗ3 52
Анализ 808-Раде конъюгатов представлен на фиг. 24.
Пример 8.3.2. Конъюгация с ΙΡΝ-альфа в 3 мг масштабе.
К 20 мг ΙΡΝ-альфа, растворенного в 25 мл 25 мМ натрий-фосфатного буфера, рН 7,5, содержащего 150 мМ №С1 и 0,3 мМ ЕОТА, добавляли 8 мл реакционного буфера (0,1 М натрий-ацетатный буфер, рН 5,0), и раствор центрифугировали в течение 99 мин при 3939 х д в концентраторе ^уакрш 6 (νίνο 8αепсе, 5 кДа М^СО, Наппоуег, Германия). Процедуру промывки повторяли дважды путем разбавления оставшегося раствора реакционным буфером до объема 18 мл и центрифугирования, как описано. Конечный раствор ΙΡΝ-альфа разводили реакционным буфером до объема 6,66 мл, получая конечную расчитанную концентрацию ΙΡΝ-альфа, равную 3 мг/мл. Концентрацию белка экспериментально не проверяли.
К 1 мл раствора ΙΡΝ-альфа, полученного, как описано выше, и охлажденного до 0°С, добавляли 1 мл раствора альдегидо-НЕ8 (75 эквив.) и 1 мл 60 мМ раствора цианоборгидрида натрия, оба раствора были приготовлены в том же буфере (ацетат натрия, рН 5,0) и охлаждены до 0°С, и смесь выдерживали в течение 22 ч при 0°С. Реакционную смесь очищали после анализа с помощью гель-электрофореза. Для реакции, описанной в опыте С, использовали только 0,666 мкл соответствующих растворов. Были использованы следующие концетрации растворов альдегидо-НЕ8:
Таблица примера 8.3.2
Опыт Производное НЕЗ Концентрация [мг/мл]
А альдегидо-НЕЗ (пример 8.2.2) 117
В альдегидо-НЕЗ (пример 8.2.4) 117
С альдегидо-НЕЗ (пример 8.2.6) 350
э альдегидо-НЕЗ (пример 8.2.8) 350
Е альдегидо-НЕЗ (пример 8.2.10) 584
Е альдегидо-НЕЗ А (пример 8.2.12) 584
0 Неокисленный НЕЗ 10/04 (Мы 7,6 кДа, ϋ3=0,41) 117
- 71 010501
Анализ БЭБ-Раде конъюгатов представлен на фиг. 25.
Пример 8.3.3. Конъюгация с Ш^альфа в 3 мг масштабе.
8.3.3.1. Конъюгация альдегидо НЕБ, полученного в примере 8.2.16, с ^N<7. путем восстановительного аминирования.
К 10 мг ^Να, растворенного в 25 мл 25 мМ натрий-фосфатного буфера, рН 7,5, содержащего 150 мМ №1С1 и 0,3 мМ ЕЭТА, добавляли 8 мл реакционного буфера (0,1 М натрий-ацетатный буфер, рН 5,0), и раствор центрифугировали в течение 30 мин при 3939 х д в концентраторе У1уакрт 6 (У1уа Баеисе, 5 кДа М№СО, Напиоуег, Германия). Процедуру промывки повторяли дважды путем разбавления оставшегося раствора реакционным буфером до объема 18 мл и центрифугирования, как описано. Конечный раствор ^Να разводили реакционным буфером до объема 3,33 мл, получая конечную расчитанную концентрацию ^Να, равную 3 мг/мл. Концентрацию белка экспериментально не проверяли.
К 1 мл раствора ШЫ-альфа, полученного, как описано выше, и охлажденного до 0°С, добавляли 1 мл раствора альдегидо-НЕБ, полученного в примере 8.2.16 (75 эквив., 352 мг/мл), и 1 мл 60 мМ раствора цианоборгидрида натрия, оба раствора были приготовлены в том же буфере и охлаждены до 0°С, и смесь выдерживали в течение 22 ч при 0°С. Реакционную смесь очищали после анализа с помощью гельэлектрофореза. Для гель-электрофореза использовали мини-ячейку ХСе11 Биге Ьоск М1ш Се11 Диуйгодеи ОтЬН, Каг1кгике, Германия) и источник энергоснабжения Соикой Е143 (СО^ОКТиу, Титкои!, В). Использовали 12% бис-трис гель вместе с подвижным буфером МОРБ БОБ при восстановительных условиях (оба от Шуйгодеи ОтЬН, Каг1кгике, Германия) в соответствии с инструкциями производителя.
8.3.3.2 Конъюгация альдегидо НЕБ, полученного в примере 8.2.18, с ШИа путем восстановительного аминирования.
К 1 мл раствора ШМ-альфа, полученного, как описано в примере 8.3.3.1, и охлажденного до 0°С, добавляли 1 мл раствора альдегидо-НЕБ, полученного в примере 8.2.18 (75 эквив., 369 мг/мл), и 1,5 мл 60 мМ раствора цианоборгидрида натрия, оба раствора были приготовлены в том же буфере и охлаждены до 0°С, и смесь выдерживали в течение 22 ч при 0°С. Реакционную смесь очищали после анализа с помощью гель-электрофореза. Для гель-электрофореза использовали мини-ячейку ХСе11 Биге Ьоск М1ш Се11 Диуйгодеи ОтЬН, Каг1кгике, Германия) и источник энергоснабжения Соикой Е143 (СО^ОКТ^, Титкои!, В). Использовали 12% бис-трис гель вместе с подвижным буфером МОРБ БОБ при восстановительных условиях (оба от Щуйгодеи ОтЬН, Кайкгике, Германия) в соответствии с инструкциями производителя.
8.3.3.3 Реакционный контроль. Конъюгация НЕБ10/0,4 (Мте 7,6 кДа, ЭБ= 0,41) с ^Να путем восстановительного аминирования.
К 1 мл раствора ШН-альфа, полученного, как описано в примере 8.3.3.1, и охлажденного до 0°С, добавляли 1 мл раствора НЕБ10/0,4 (75 эквив., 117 мг/мл), и 1 мл 60 мМ раствора цианоборгидрида натрия, оба раствора были приготовлены в том же буфере и охлаждены до 0°С, и смесь выдерживали в течение 22 ч при 0°С. Реакционную смесь очищали после анализа с помощью гель-электрофореза. Для гель-электрофореза использовали мини-ячейку ХСе11 Биге Ьоск М1ш Се11 Диуйгодеи ОтЬН, Кайкгике, Германия) и источник энергоснабжения Соикой Е143 (СО^ОКТ^, Титкои!, В). Использовали 12% бис-трис гель вместе с подвижным буфером МОРБ БОБ при восстановительных условиях (оба от Шуйгодеи ОтЬН, Кайкгике, Германия) в соответствии с инструкциями производителя.
Анализ БЭБ-Раде конъюгатов представлен на фиг. 26.
Пример 8.3.4. Конъюгация с ШЛ-альфа в 16 мг масштабе.
Буфер в растворе, содержащем 20 мг ^Ν-альфа, заменяли, как описано в пример 8.3.2.
Конечный раствор IБN-альфа разводили реакционным буфером до объема 6,37 мл, получая конечную рассчитанную концентрацию, равную 3,14 мг/мл IБN-альфа. 100 мкл данного раствора разводили с использованием 900 мкл реакционного буфера и спектрофотометрически при 279 нм определяли концентрацию белка, которая оказалась равной 3,01 мг/мл, на основании молярного коэффициента экстинкции, равного 18000. После объединения с веществом, использованным для определения концентрации белка конечный объем составил 7,0 мл при концентрации белка, равной 2,74 мг/мл.
К 5,91 мл данного раствора IБN-альфа (16,2 мг), полученного, как описано выше и охлажденного до 0°С, добавляли раствор 3,152 г альдегидо-НЕБ, полученного в примере 8.2.14 (75 эквив.) в 5 мл реакционного буфера и 6 мл 60 мМ раствора цианоборгидрида натрия, оба раствора в том же буфере (ацетат натрия, рН 5,0) и охлаждены до 0°С, и смесь выдерживали в течение 22 ч при 0°С (см. фиг. 27, полоса А).
В качестве реакционного контроля 1,09 мл предварительно охлажденного раствора IБN-альфа (3 мг) смешивали с 1 мл раствора 122 мг неокисленного НЕБ10/0,4 (Мте 7,6 кДа, ОБ = 0,41) в реакционном буфере и 1 мл 60 мМ раствора цианоборгидрида натрия, оба раствора в том же буфере (ацетат натрия, рН 5,0) и охлаждены до 0°С (см.фиг. 27, полоса В).
Анализ БЭБ-Раде конъюгатов представлен на фиг. 27.
Пример 8.4. Очистка конъюгатов IБN-альфа-НЕБ.
8.4.1. Очистка НЕБ-IБN-α, полученного при выдерживании восстановительно аминированного белка с активированными производными НЕБ (отеделение модифицированного и немодифицированного
- 72 010501 белка от производных НЕ8).
Очистку всех образцов проводили при комнатной температуре с использованием исследовательской системы АКТА ехр1огег 10. Колонку, содержащую 3 мл О-8ерЬагозе Раз! Р1ом, уравновешивали буфером А (20 мМ Тпз/НС1, рН 8,0) в объеме, равном 10 объемам колонки. Образцы разводили в соотношении 1:10 буфером А и вводили в систему с помощью насоса для образцов со скоростью потока 1 мл/мин. После промывки насоса для образцов 10 мл буфера А колонку дополнительно промывали 6 объемами колонки буфера А при скорости потока 1 мл/мин. Элюирование проводили с использованием линейного градиента от 0 до 100% буфера В (0,3 М ΝΑ.! в 20 мМ Тпз/НС’к рН 8,0) на протяжении 2 ОК и изократическом проходе 0,5 ОК буфера В при скорости потока 0,8 мл/мин. Колонку регенерировали с использованием 2 объемов колонки буфера С (1,5 М Хао в 20 мМ Тпз/НС1, рН 8,0), а затем 0,5 ОК буфера В при скорости потока 0,8 мл/мин. Повторное уравновешивание для следующего прохода проводили с использованием 6 ОК буфера А и скорости потока 1,0 мл/мин.
8.4.2. Материалы и методы.
Оборудование: АКТА ехр1огег 10 (АтегзЬат РЬагташа Вю!есЬ), в комплекте с: насосом Р-903 смесителем М-925, с камерой на 0,6 мл монитором υV-900, с 10 мМ проточной ячейкой монитором рН/С900 насосом Р-950 (насос для образца).
Программное обеспечение Ишсогп Уегзюп 3.21
Колонка: АтегзЬат ВЬозсЬепсез С 10/10
Материал для 0-БерЬагозе Газб Г1оч, Соде по. 17-0510-
колонки: 01, лот № Об 06453
Объем колонки: 3 мл
Буфер А: 20 ММ ТГ13/НС1, рН 8,0, лот № ΡΣ0746
Буфер В: 0,3 Μ ΝβΟΙ в20 мМ ТГ13/НС1, рН 8,0, лот
№ РБ0747
Буфер С: 1,5 М ЫаС1 в20 мМ Тг1з/НС1, рН 8,0, лот
№ РП0748
Метод
Объем Стадия Буфер Скорость потока
1 ОК Уравновешивание 100% буфера А 1,0 мл/мин
5-28 мл Загрузка образца Образец 1:10 1,0 мл/мин
в буфере А
10 мл Промывка насоса для 100% буфера А 1,0 мл/мин
5 ОК образца Вымывание несвязанного 100% буфера А 1,0 мл/мин
образца
Начало фракционирования 100% буфера А 1,0 мл/мин
6 ОК Элюирование, линейный о-юс 1% буфера 0,8 мл/мин
градиент в
2 ОК Элюирование, 100% буфера В 0,8 мл/мин
изократическое
2 ОК Регенерирование 100% буфера С 0,8 мл/мин
0,5 ОК Регенерирование 100% буфера В 0, 8 мл/мин
Прекращение 100% буфера В 0, 8 мп/мин
фракционирования
5 ОК Повторное 100% буфера А 1,0 мл/мин
уравновешивание
Обнаружение: 280 нм, 260 нм, 220 нм. рН проводимость
Фракционирование: фракции по 1 мл
8.4.3 Результаты.
8.4.3.1. Образец в соответствии с примером 8.
- 73 010501
Состав образца: 1 мг ЕР2001 (гЫГЫ-а2Ь) в 25 мМ
Ыа-фосфате, 0,13 М ИаС1 и 0,3 мМ
ΕϋΤΑ, рН 7,5± 0,2 исходный объем: 0,5 мл, разведен 1:10 в буфере А = 5 мл проходящий поток/промывка 9,3 мл дата проведения
2004-09-29 эксперимента:
эксперимент №:
<2524 Ώ39 (см, таблицу примера
8.4.4.1)
8.4.3.2. Образец в соответствии с примером 8.3.2. (ввод =А).
альдегидоНЕЗ 10/0,4 ΝΖΑ256) в цианоборгидридз/ рн 5, С исходным объем:
проходящим эксперимента:
0525 056 (СМ, таблицу
2,5 мг ЕР2001 + 97, 5 мг
8.4.3.3. Образец в соответствии с примером 8.3.2. (ввод =В).
Состав образца:
2,5 мг ЕР2001 + 97,5 мг альдегидоНЕЗ 10/0,7 (ΝΖΑ235Α) в
0,1 М Иа-ацетате, 20 мМ Ыацианоборгидрида, рН 5,0 исходный объем:
2,5 мл, разведен 1:10 в буфере А мл проходящий мл поток/промывка:
дата проведения
2004-09-30 эксперимента:
эксперимент №:
0826 057 (см. таблицу примера
8.4.3.4. Образец в соответствии с примером 8.3.2. (ввод =С).
Состав образца: 2,5 мг ЕР2001 + 292 мг альдегидоНЕЗ 30/0,4 (ΝΖΑ329) в 0,1 М Ыа-ацетате, 20 мМ Ма- цианоборгидрида, рН 5,0
исходный объем: 2,5 мл, разведен 1:10 в буфере Ά - 25 мл
проходящий поток/промывка 42 мл
дата проведения 2004-09-30
эксперимента:
э ксп еримент №: 0527 Ώ58 (см. таблицу примера 8.4.4.1)
- 74 010501
8.4.3.5. Образец в соответствии с примером 8.3.2. (ввод =Ό)
2,5 мг ЕР2001 + 292мг
альдегидоНЕЗ 30/0,7 ΝΖΑ325)
Ма-цианоборгидрица, рН 5, С проходящий поток/промывка эксперимент ми +
8.4.3.6. Образец в соответствии с примером 8.3.2. (ввод =Е)
2,5 мг ЕР2001
Состав образца:
0,1 альдегидоНЕЗ 50/0,4
И Иа-ацетате,
487 МГ
(ΝΖΑ303) Б
20 мМ
5, 0 исходный объем:
йа-цианоборгидрида, рН
2,7 мл, разведен 1:10 буфере А мл проходящий поток/промывка 50 мл дата проведения 2004-09-30 эксперимента:
эксперимент №:
0329 060 (см,таблицу примера
8.4.4.1)
8.4.3.7. Образец в соответствии с примером 8.3.2. (ввод =Р)
2,5 мг ЕР2001 +
Состав образца:
487 мг исходный объем:
альдегидоНЕЗ 50/0,7
0,1 М Иа-ацетате,
Иа-цианоборгидрида, рН
2,6 мл, разведен 1:10 мл проходящий поток/промывка 50 мл дата проведения эксперимента: эксперимент №:
(ΝΖΆ309)
5, 0
МИ в буфере А
2004-09-30
0530 Э61 (см.таблицу примера
8.4.4.1)
8.4.3.8. Образец в соответствии с примером 8.3.2. (ввод =С).
Состав образца: 1,7 мг ЕР2001 + 98мгНЕЗ 10/0,4 (5иргато1 Ьоб. 407В) в 0,1 М Ыа-ацетате, 20 мМ Ыа-цианоборгидрида, рН 5,0
исходный объем: 2,5 мл, разведен 1:10 в буфере А = 25 мл
проходящий поток/промывка 42 мл дата проведения эксперимента:
э ксп еримент №:
8.4.4 Сравнение результатов.
2004-10-01
0331 ϋ62
8.4.4.1) (см.таблицу примера
- 75 010501
8.4.4.1. 8Э8-РАСЕ анализ пиков элюирования ШИ-альф.
Таблица 1. Сравнение площадей пиков, обнаруженных при 280 нм во вемя хроматографии на Ц8еркагоке НЕ8-производных ΞΕΝ-ο. (таблица примера 8.4.4.1)_______________________________
Опыт № Рассчитанное использованное количество немодифицированного ΙΕΝ-α Площадь элюа та (280 нм) [мдихмл] Площадь элюата (280 нм)/мг немодифицированного белка [мАих'МЛхмг'1) Вычисленный выход общего белка [мг] (ВЭЖХксличественн ая оценка при 280 нм*)
03- 24 Ω39 1 г 0 мг 961 961 0, 42
03- 25 656 2,5 мг 4370 1748 1,20
03- 26 Ό57 2,5 мг 5669 2268 1, 64
03- 27 ϋ5θ 2,5 мг 3350 1340 1, 60
05- 28 Б59 2,5 мг 2854 1142 1,54
23- 29 вео 2,5 мг 2255 902 1,52
03- 30 ϋ-61 2,5 мг 9278 3711 3,44
03- 31 ϋ62 1, 7 мг 1918 1128 1,40
* данные количественного анализа, полученные с помощью ВР-ВЭЖХ-3
Пример 9. Описание биоанализа противовирусной активности ΣΕΝ альфа.
Описание метода тестирования: противовирусная активность интерферона-альфа.
После предварительного разведения тестируемых продуктов в среде для культивирования клеток готовили серийные двукратные разведения. В лунки 96-луночного планшета добавляли разведенный интерферон в четырехкратной повторности на одно разведение к свеже трипсинизированным клеткам МЭВК (40000 клеток на лунку). Анализируемые планшеты инкубировали в течение 24 ч при 37°С (общий объем на лунку: 150 мкл (пример 9.1) или 175 мкл (пример 9.2, 9.3, 9.4, 10)).
После этого 50 мкл разведенного исходного раствора У8У добавляли в каждую лунку (за исключением лунок положительного контроля), получая множественность инфекции, равную 0,1.
В каждый анализ включали следующий контроль: 12 лунок, в которые помещали вирус плюс среду для культивирования клеток вместо интерферона (отрицательный контроль) и 12 лунок, в которые помещали среду для культивирования клеток вместо интерферона и вирус (положительный контроль).
Планшеты для анализа инкубировали в течение 42 ч при 37°С.
По окончании периода инкубации клеточный культуральный супернатант в каждой лунке заменяли на 50 мкл раствора МТТ (по меньшей мере 2 мг/мл в среде для культивирования клеток). Клетки инкубировали в течение трех часов. Краситель формазан пурпурный, образованный пролиферирующими клетками, солюбилизировали путем добавления 100 мкл раствора изопропанол/НС1 (изопропанол с 40 мМ НС1) в каждую лунку. Впоследствии измеряли значения поглощения растворов при 570/630 нм с использованием ридера для микротитровальных планшетов.
Пролиферативную активность клеток МЭВК, выращенных в присутствии интерферона и У8У рассчитывали для каждого разведения интерферона в соответствии со следующим:
(среднее поглощение четырех лунок обработанных интерфероном) - (среднее поглощение отрицательного контроля)* 100 (среднее поглощение положительного контроля) - (среднее поглощение отрицательного контроля)
Противовирусную активность интерферона-альфа определяли в четырех отдельных анализах для каждого из тестируемых объектов.
Пример 9.1. Противовирусная активность ^гоп А относительно стандарта МН.
Во всех экспериментах Ш^оп А (ШН-альфа 2Ь, 8скегшд-Р1оидк), калиброванный относительно стандарта МН - гЫЕМальфа 2а (МАШ, МН, Ве!кекба, И8А, Сха01-901-535), использовали в качестве внутренней лабораторной ссылки. Стандарт МН обладает специфической активностью 9000 МЕ/мл. Внутренний лабораторный ссылочный Ш^оп А обладает специфической активностью 8487000 МЕ/мл в исследовании, как описано в примере 9.
Пролиферативную активность Ш^оп А сравнивали со стандартом МН - гЫЕМальфа 2а, как показа
- 76 010501 но на фиг. 28.
Пример 9.2. Противовирусная активность имитировано инкубированного относительно немодифицированного исходного вещества.
Как описано в примере 8.3.4 имитировано инкубированного ШИ-а-НЕЯ (описан в примере 8.3.2, опыт О) использовали в качестве реакционного контроля. Противовирусную активность вещества сравнивали с активностью немодифицированного исходного вещества для исследования влияния процессов связывания и очистки на биоактивность. Имитирующее инкубирование не влияло на биоактивность ΛΝальфа ш уйго.
Относительная активность ш уйго имитировано инкубированного IЕN-α-НЕ8 по сравнению с немодифицированным исходным веществом показана на фиг. 29.
Пример 9.3. Противовирусная активность конъюгатов.
IЕN-альфа-НЕ8 относительно ЕНгоп А.
В системе для анализа, описанной в примере 9, конъюгаты (опыты А, В, С, Ό, Е примера 8.3.2, очищенные в соответствии с примером 8.4) были протестированы в сравнении с немодифицированным веществом ШН-альфа, Е'Игоп А и Редакук (Косйе). Для веществ рассчитывали концентрации СРЕ50. Все конъюгаты IЕN-альфа-НЕ8 сохраняли противовирусную активность, которая была существенно выше активности Редакук.
Относительная активность ш уйго конъюгатов IЕN-альфа-НЕ8 по сравнению с немодифицированным исходным веществом IЕN-альфа, ЙИгоп А и Редакук показана на фиг. 30.
Пример 9.4. Противовирусная активность конъюгата IЕN-альфа-НЕ8 в сравнении с ЙИгоп А.
В системе для анализа, описанной в примере 9, конъюгат IЕN-альфа-НЕ8 согласно примеру 8.3.4, очищенный в соответствии с примером 8.4, был протестирован в сравнении с Шйоп А. Для веществ рассчитывали концентрации СРЕ50. Конъюгат IЕN-альфа-НЕ8 сохранял высокую противовирусную активность, превышающую 25% относительно активности ЙИгоп А.
Относительная активность ш уйго конъюгатов IЕN-альфа-НЕ8 по сравнению с ЙИгоп А показана на фиг. 31.
Пример 9.5. Противовирусная активность конъюгата IЕN-альфа-НЕ8 в сравнении с Е'Игоп А.
В системе для анализа, описанной в примере 9, конъюгаты IЕN-альфа-НЕ8 согласно примеру 8.3.3, очищенные в соответствии с примером 8.4, были протестированы в сравнении с Шйоп А и РедйИгоп. Для веществ рассчитывали концентрации СРЕ50. Конъюгаты IЕN-альфа-НЕ8 сохраняли противовирусную активность на уровне примерно 25% по сравнению с ЕИгоп А, которая находится на том же уровне, что и активность РедЕ'Игоп шуйго.
Относительная активность ш уйго конъюгатов IЕN-альфа-НЕ8 по сравнению с Е'Игоп А показана на фиг. 38.
Пример 10. Биоактивность конъюгатов IЕN-альфа-НЕ8 ш у1уо (РК исследование на мышах).
Пример 10.1. Влияние мышиной сыворотки крови на систему для анализа, описанную в примере 9.
Получали разведения интерферона-альфа в среде для культивирования клеток (контроль) и в мышиной сыворотке крови (разведение 1:40 и разведение 1:80). Анализ проводили, как описано в примере
9.
Противовирусную активность интерферона-альфа для контроля определяли в двух отдельных анализах, для разведения в мышиной сыворотке 1:40 и для разведения в мышиной сыворотке 1:80. Результаты показывают, что мышиная сыворотки при разведении 1:40 и 1:80 не влияет на биоанализ противовирусной активности интерферона-альфа.
Пример 10.2. Λ у1уо исследование на мышах (I).
Противовирусную активность собранной сыворотки крови исследовали в анализе противовирусной активности. Сыворотку крови собирали от двух мышей (самки мышей ВАЬВ/с возрастом 8 недель) при умерщвлении в каждый момент времени, соответствующий 2, 4, 12 и 24 ч после внутривенной инъекции в дозе 30 мкг/кг (из расчета на содержание белка) ^Ν-альфа или конъюгата IЕN-альфа-НЕ8.
Образцы сыворотки крови оттаивали и тщательно гомогенизировали путем интенсивного вихревого перемешивания (и разводили). В среде для культивирования клеток получали серийные двукратные разведения. Оттаивали пузырек с Е'Игоп А (разведенный) и тщательно гомогенизировали путем интенсивного вихревого перемешивания. В среде для культивирования клеток получали серийные двукратные разведения.
Определяли ЕС50-разведения в анализе СРЕ из кривых доза-ответная реакция серий разведений 1:2, как описано в примере 9.
Определяли период полураспада веществ по сравнению с немодифицированным исходным веществом и Редакук. Период полураспада рассчитывали из полулогарифмического графика разведения ЕС50 относительно времени после инъекции.
Противовирусная активность была обнаружена для (ί) IЕN-альфа-НЕ8 (пример 8.3.2, опыт в таблице), (ίί) IЕN-альфа-НЕ8 (пример 8.3.2, опыт Ό в таблице), (ίίί) IЕN-альфа-НЕ8 (пример 8.3.4) в течение промежутка времени до 24 ч. Как можно видеть из фиг. 32, период полураспада увеличивался от (ί) (при
- 77 010501 близительно 3 ч) до (ίί) (приблизительно 5 ч) и далее до (ίίί) (приблизительно 7 ч).
Для немодифицированного ΙΡΝ-альфа противовирусная активность сыворотки крови была слишком низка для расчета периода полураспада в сыворотке. В публикации К. Р. Реййу е! а1. Айуасей Эгид Эейуегу Реу1е^к 54 (2002) 571-586 период полураспада ΙΡΝ-альфа в сыворотке крови крыс (внутривенно) был определен как равный 2 ч.
Пример 10.3. Ιη νίνο исследование на мышах (ΙΙ).
Противовирусную активность собранной сыворотки крови исследовали в анализе противовирусной активности. Сыворотку крови собирали от двух мышей (самки мышей ВЛЬВ/с возрастом 8 недель) при их умерщвлении в каждый момент времени, соответствующий 2, 4, 12 и 24 ч после внутривенной инъекции в дозе 30 мкг/кг (из расчета на содержание белка) ΙΡΝ-альфа или конъюгата IΡN-альфа-ΗЕ8.
Образцы сыворотки крови оттаивали и тщательно гомогенизировали путем интенсивного вихревого перемешивания (и разводили). В среде для культивирования клеток получали серийные двукратные разведения. Оттаивали пузырек с ΙηΙγοη А (разведенный) и тщательно гомогенизировали путем интенсивного вихревого перемешивания. В среде для культивирования клеток получали серийные двукратные разведения.
Определяли ЕС50-разведения в анализе СРЕ из кривых доза-ответная реакция серий разведений 1:2, как описано в примере 9.
Определяли период полураспада веществ по сравнению с немодифицированным исходным веществом и Редакук. Период полураспада рассчитывали из полулогарифмического графика разведения ЕС50 относительно времени после инъекции.
Противовирусная активность была обнаружена для (ί) РедИгоп, (ίί) IΡN-альфа-ΗЕ8 30/0,8 (пример 8.3.3.1) и (ίίί) IΡN-альфа-ΗЕ8 100/0,7 (пример 8.3.3.2) в течение промежутка времени до 24 ч. Как можно видеть из фиг. 37, период полураспада увеличивался от (ί) (приблизительно 3,6 ч) до (ίί) и (ίίί) (приблизительно 6,5 и 6,8 ч).
Пример 11. Ιη νίνο биоактивность конъюгатов IΡN-альфа-ΗЕ8 (РК исследование на кроликах).
Пример 11.1. Радиоактивное маркирование ΙΡΝ-альфа и конъюгатов IΡN-альфа-ΗЕ8.
Образцы, использованные для РК исследования, были помечены 125Ι с помощью метод использованием хлорамина Т. Хлорамин Т взаимодействует с йодом и образуется межгалогеновое (Ι-С^ промежуточное соединение. Межгалогеновое соединение взаимодействует с ароматическим кольцом тирозина и замещает его в орто-положении.
Пример 11.2. Ссылочный эксперимент: маркирование оксо-НЕ8 50/0,4 125Ι.
В первой экспериментальной серии в данных реакционных условиях исследовали возможность обнаружения следовых количеств йода, например, при образовании йодных, полийодных или полийодидных комплексов с НЕ8. Для сравнения, оксо-НЕ8 (М^ 42,1 кДа, Ό8 =0,41) и IΡN-альфа-ΗЕ8 (пример 8.3.2, опыт Е в таблице) были помечены в тех же условиях и после процесса очистки измеряли радиоактивность образцов. В соответствии с литературой амилопектин может образовывать комплексы с йодом, полийодом и полииодидом, когда спиральные структуры имеют по меньшей мере 11 звеньев ангидроглюкозы.
Радиоактивность обнаруживалась только в образце IΡN-альфа-ΗЕ8. Этот результат доказывает, что радиоактивность вызвана исключительно ковалентной модификацией тирозиновых остатков ΙΡΝ-альфа, а не потенциальным физическим связыванием йода, который не был удален в процессе очистки. оксоНЕ8 50/0,4 (М^ = 42,1 кДа, Ό8 = 0,41) можно рассматривать как отрицательный контроль. Благодаря большой молекулярной массе и низкой степени замещения в таких разновидностях оксо-НЕ8 можно было ожидать существование наиболее длинных спиральных структур, если они присутствуют, и следовательно, в таком случае имелся наиболее высокий риск комплексообразования с йодом.
Пример 11.3. Маркирование интерферона-альфа нерадиоактивным йодом («холодное иодирование»).
Интерферон-альфа метили не радиоактивным йодом в тех же самых условиях маркирования и очистки, что и конъюгаты IΡN-альфа-ΗЕ8-50/0,4. В противовирусном анализе противовирусная активность сохранялась. Однако количественная оценка проведена не была, поскольку в процессе маркирования и очистки концентрация изменялась и не могла быть определена из-за небольшого количества доступного вещества.
Пример 11.4. Радиоактивное маркирование конъюгатов.
IΡN-альфа-ΗЕ8.
Образцы помечали в соответствии с примером 11.1 с использованием радиоактивного 105Ι. Образцы представляли собой исходное вещество ΙΡΝ-альфа, IΡN-альфа-ΗЕ8 (пример 8.3.2, опыт Ό в таблице). Образцы имели специфическую активность 38 мкКи/мкг (исходное вещество ΙΡΝ-альфа), 41 мкКи/мкг (IΡN-альфа-ΗЕ8 30/0,7).
Пример 11.5. Ιη νίνο РК исследование на кроликах.
Пример 11.5. Экспериментальная методика.
Тестируемые объекты использовали в разведенном виде. Получали раствор с концентрацией 4 мкКи/мл. В качестве буфера для разведения использовали РВ8.
- 78 010501
Четыре новозеландских белых кролика ΗкбIГ:NΖV. Источник Наг1ап V^ηке1таηη СтЬН, Ό-33178 Вогсйеп. Пол: самки; вес тела в начале исследования: > 2,5 кг. Всех животных обрабатывали внутривенно с использованием радиоактивных исследуемых веществ, вводя объем равный 1 мл/кг веса тела, что эквивалентно дозе 4 мкКи/кг веса тела. В определенные моменты времени отбирали пробы крови. В каждый момент отбора пробы брали приблизительно 600 мкл крови из ушной вены для дальнейших исследований.
Для отбора крови под общей анестезией (кетамин/ромпун) устанавливали постоянный катетер в ушную вену. Анестезию прерывали для отбора проб крови перед применением образцов, во время самого ввдения и и для отбора первых трех проб крови после введения (0,5, 1 ч и 2 ч). Катетеры оставляли на животных для дальнейшего отбора проб крови до тех пор, пока их не удаляли сами животные. Дальнейший отбор проб крови проводили с помощью канюли через различные участки ушных вен.
Дальнейшую обработку образцов крови проводили после отбора проб крови. Для определения радиоактивно меченых тестируемых веществ в крови собранные образцы крови обрабатывали в соответствии с конкретным протоколом солюбилизации. Для этого 250 мкл образцов крови переносили в новую пробирку и добавляли равный объем 8о1уаЬ1е™. Образцы инкубировали в течение одного часа при 50°С при встряхивании на водяной бане. После окончания времени инкубации образцы охлаждали до комнатной температуры и добавляли 100 мкл раствора ЕЭТА [100 мМ]. Затем добавляли 300 мкл Н2О2; [30%] и после встряхивания образцы опять инкубировали в течение одного часа при 50°С при встряхивании на водяной бане. Образцы комплектовали перед дальнейшей обработкой.
По окончании отбора крови и солюбилизации образцы переносили в 20 мл сцинтилляционные ампулы и добавляли 10 мл сцинтилляционного «коктейля» ИШта Со1б. До измерения содержания изотопа 125Σ с помощью сцинтилляционного счетчика (примерно 72 ч после добавления «коктейля») образцы хранили в темноте при 2-8°С.
Перед обработкой и статистическим анализом данных определяли гашение обнаружения активности при определенных экспериментальных условиях. Коэффициент регрессии (г2=0,9970) представляет собой меру соответствия прямой линии. Было установлено, что фактор гашения был равен 3,315938.
Результаты (см. фиг. 33). IРN-альфа-ΗΕ8 продемонстрировал явное увеличение продолжительности времени полураспада по сравнению с исходным веществом. После 24 ч (приблизительно < 1000 пКи/мл) кривая немодифицированного вещества выравнивалась, и почти не наблюдалось понижения активности. Небольшие стандартные отклонения измеренной радиоактивности для всех образцов обеспечивают качество проведения эксперимента.
Период полураспада рассчитывали из концентрации [ΕΝ-альфа в образцах крови. Для оценки, представленной на фиг. 34, рассматривались только данные, полученные в промежуток времени от 4 до 24 ч. Для ^модифицированного вещества период полураспада был рассчитан как равный 7 ч. Для ШМ-альфаНЕ8 наблюдалось существенное увеличение периода полураспада (приблизительно 33 ч).
Данные оценивали статистически в соответствии с различными компартментными (разделенными по времени) моделями, как показано на диаграмме на фиг. 35а и Ь (отсечение 0-12 ч). Для однокомпартментной модели очевидно, что концентрация ΣΕΝ-альфа быстро падает в течение первых 2 ч после инъекции. Для IΕN-альфа-ΗΕ8 период полураспада четко продлевается.
Статистически подсчитанный период полураспада составлял 0,26 ч для ΣΕN-альфа, 7,7 ч для ΣΕNальфа-НЕ8. В соответствии с некомпартментной моделью статистическая оценка приводит к периоду полураспада, равному 147 ч для ^модифицированного IΕN-альфа (на основании данных полученных за 24-120 ч), и 42,7 ч для ΣΕN-альфа-ΗΕ8 (на основании данных полученных за 36-120 ч). Как описано выше, период полураспада ΣΕN-альфа существенно удлинняется поскольку кривые выравниваются после 24
ч.
Периоды полураспада двух образцов суммированы в следующей таблице на основании описанных способов расчета.
Таблица примера 11.5.1. Периоды полураспада IΕN-альфа и IΕN-альфа-ΗΕ8, рассчитанные в соответствии с различными моделями
Исходное вещество ΙΓΝ-альфа IΕΝ-альфа-НЕЗ 11/;
Не компартментная модель (147,0)* 42,7**
Однокомпартментная модель 0,26 7,7
Полулогарифмический график (см. фиг.33, 4-24 часа) 7 33
* оцененные данные 24-120 ч, ** оцененные данные 36-120 ч

Claims (67)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ получения конъюгата, включающего белок и полимер, где полимер представляет собой гидроксиалкил крахмал, указанный способ включает (a) (2) взаимодействие полимера по его необязательно окисленному восстановительному концу, по меньшей мере, с бифункциональным соединением, где указанное соединение включает две функциональные группы М и Ц, одна функциональная группа М взаимодействует с полимером и одна функциональная группа О представляет собой (1) альдегидную группу, или кетогруппу, или группу полуацеталя; или (ίί) представляет собой функциональную группу, химически модифицированную для получения производного полимера, функционализированного альдегидными или кето- или полуацетальными функциями; и (b) ковалентное связывание по меньшей мере одной альдегидной группы или кетогруппы, или группы полуацеталя полимера или его производного по меньшей мере с одной аминогруппой белка путем восстановительного аминирования.
  2. 2. Способ по п.1, где гидроксиалкилкрахмал представляет собой гидроксиэтилкрахмал.
  3. 3. Способ по п.2, где гидроксиэтилкрахмал имеет молекулярную массу от 2 до 200 кДа, предпочтительно от 4 до 130 кДа, более предпочтительно от 4 до 70 кДа.
  4. 4. Способ по любому из пп.1-3, где восстановительное аминирование проводят в водной среде.
  5. 5. Способ по любому из пп.1-4, где восстановительное аминирование проводят в присутствии ^СМЕНз.
  6. 6. Способ по любому из пп.1-5, где восстановительное аминирование проводят при рН 7,5, предпочтительно 7 или менее.
  7. 7. Способ по п. 6, где рН равен 6 или менее.
  8. 8. Способ по любому из пп.1-7, где восстановительное аминирование проводят при температуре от 0 до 25°С.
  9. 9. Способ по любому из пп.1-8, где в (а)(2) (1) функциональная группа М представляет собой карбоксильную группу или реакционноспособную карбоксильную группу, функциональная группа О представляет собой альдегидную группу или кетогруппу, или группу полуацеталя.
  10. 10. Способ по п.9, где бифункциональное соединение, включающее М и Ц, выбирают из группы, состоящей из формилбензойной кислоты, пентафторфенилового сложного эфира 4-формилбензойной кислоты, Ν-гидроксисукцинимидного сложного эфира 4-формилбензойной кислоты и 4-(4-формил-3,5диметоксифенокси)бутановой кислоты.
  11. 11. Способ по любому из пп.1-8, где в (а)(2) (ίί) функциональная группа М представляет собой аминогруппу и функциональная группа О представляет собой аминогруппу.
  12. 12. Способ по п.11, где соединение, включающее две аминогруппы М и Ц, представляет собой необязательно замещенный диаминоалкан, имеющий от 2 до 20 атомов углерода.
  13. 13. Способ по п.12, где диаминоалкан выбирают из группы, состоящей из 1,2-диаминоэтана, 1,3диаминопропана и 1,4-диаминобутана.
  14. 14. Способ по любому из пп.11-13, дополнительно включающий взаимодействие производного полимера, полученного реакцией полимера по меньшей мере с одним бифункциональным соединением, включающим две аминогруппы М и Ц, по аминогруппе О с дополнительным бифункциональным соединением, включающим карбоксильную группу или реакционноспособную карбоксильную группу и альдегидную группу или кетогруппу или группу полуацеталя с образованием производного полимера, содержащего альдегидную группу или кетогруппу или группу полуацеталя.
  15. 15. Способ по п.14, где дополнительное бифункциональное соединение выбирают из группы, состоящей из формилбензойной кислоты, пентафторфенилового сложного эфира 4-формилбензойной кислоты, Ν-гидроксисукцинимидного сложного эфира 4-формилбензойной кислоты и 4-(4-формил-3,5диметоксифенокси)бутановой кислоты.
  16. 16. Способ по п.11, где аминогруппа О соединения, включающего две аминогруппы М и Ц, представляет собой бета-гидроксиаминогруппу.
  17. 17. Способ по п.16, где бета-гидроксиаминогруппу окисляют с получением альдегидной группы.
  18. 18. Способ по п.16 или 17, где соединение, включающее две аминогруппы М и Ц, где О представляет собой бета-гидроксиаминогруппу, представляет собой 1,3-диамино-2-гидроксипропан.
  19. 19. Способ по п.17 или 18, где реакцию окисления проводят с использованием периодата.
  20. 20. Способ по любому из пп.1-19, где белок выбирают из группы, состоящей из ЕРО, С-С8Р, ШЫ альфа, ШЛ бета, АТ III, [й-2, Ш-3, миоглобина, 8ОЭ и В8А, предпочтительно из группы, состоящей из гкЕРО, гкС-С8Р, ΛΣΡΝ альфа, ΛΣΡΝ бета, гЬАТ III, гЫЬ-2, гЫЬ-3, миоглобина, 8ОЭ и В8А, или из группы, состоящей из А1АТ, фактора VII, фактора VIII, фактора IX, !РА и АРС.
  21. 21. Конъюгат, включающий белок и полимер, полученный способом, как определено в любом из пп.1-20.
  22. 22. Конъюгат по п.21, где полимер или его производное главным образом связан с Ν-концевой аминогруппой белка посредством азометиновой или аминовой связи, при этом белок, использованный для
    - 80 010501 взаимодействия, включает Ν-концевую аминогруппу и по меньшей мере одну дополнительную аминогруппу, предпочтительно дополнительную группу лизина.
  23. 23. Конъюгат по п.21 или 22, где белок является ковалентно связанным с производным полимера посредством азометиновой и/или аминовой связи, указанное производное получено реакцией полимера с соединением, включающим две аминогруппы М и О, по функциональной группе М, полученное соединение было дополнительно подвергнуто взаимодействию по О с дополнительным бифункциональным соединением, включающим карбоксильную группу или реакционноспособную карбоксильную группу и альдегидную группу или кетогруппу, или группу полуацеталя, указанная карбоксильная группа или реакционоспособная карбоксильная группа образует амидную связь с аминогруппой О, и указанная альдегидная группа или кетогруппа, или группа полуацеталя взаимодействует с аминогруппой белка при восстановительном аминировании.
  24. 24. Конъюгат по п.23, где дополнительное бифункциональное соединение, содержащее карбоксильную группу или реакционноспособную карбоксильную группу и альдегидную группу или кетогруппу, или группу полуацеталя выбирают из группы, состоящей из формилбензойной кислоты, пентафторфенилового сложного эфира 4-формилбензойной кислоты, Ν-гидроксисукцинимидного сложного эфира 4формилбензойной кислоты и 4-(4-формил-3,5-диметоксифенокси)бутановой кислоты.
  25. 25. Конъюгат по п.24, имеющий структуру в случае, когда полимер подвергали взаимодействию по его окисленному восстановительному концу, В1, В2 и В3 независимо представляют собой водород или гидроксиалкильную группу, и η = 2, 3 или 4, В4 независимо представляет собой водород или метоксигруппу, и т = 0 в случае, когда В4 представляет собой водород, и т = 1 в случае, когда В4 представляет собой метокси.
  26. 26. Конъюгат по п.21 или 22, где белок является ковалентно связанным с производным полимера посредством азометиновой и/или аминовой связи, указанное производное получено реакцией полимера с соединением, включающим две аминогруппы М и Э, где О представляет собой бетагидроксиаминогруппу и окислением бета-гидроксиаминогруппы О с образованием альдегидной группы.
  27. 27. Конъюгат по п.26, где соединение, включающее две аминогруппы М и О, где О представляет собой бета-гидроксиаминогруппу, представляет собой 1,3-диамино-2-гидроксипропан.
  28. 28. Конъюгат по п.27, имеющий структуру в случае, когда полимер подвергали взаимодействию по его окисленному восстановительному концу, В1, В2 и В3 независимо представляют собой водород или гидроксиалкильную группу.
  29. 29. Конъюгат по любому из пп.21-28, где белок выбирают из группы, состоящей из ЕРО, С-С8Ρ, ΙΡΝ альфа, ΙΡΝ бета, АТ ΙΙΙ, ΙΕ-2, ΙΕ-3, миоглобина, 8ОЭ и Β8Μ
  30. 30. Конъюгат по любому из пп.21-28, где белок выбирают из группы, состоящей из гкЕРО, ^кС-С8Е. 1Ί1ΙΡΝ альфа, 1Ί1ΙΡΝ бета, гкАТ ΙΙΙ, гЫЬ-2, гЫЬ-3, миоглобина, 8ОЭ и Β8Μ
  31. 31. Конъюгат по любому из пп.21-28, где белок выбирают из группы, состоящей из А1АТ, фактора УН, фактора УШ; фактора ΙΧ, ίРΆ и АРС.
  32. 32. Применение конъюгата по любому из пп.21-31 или конъюгата, получаемого способом по любому из пп.1-20, для лечения человека или животного.
  33. 33. Фармацевтическая композиция, включающая терапевтически эффективное количество конъюгата по любому из пп.21-31, или конъюгата, получаемого способом по любому из пп.1-20.
  34. 34. Фармацевтическая композиция по п.33, дополнительно включающая по меньшей мере один фармацевтически приемлемый разбавитель, адъювант или носитель.
  35. 35. Применение конъюгата по любому из пп.21-31 или конъюгата, получаемого способом по любому из пп.1-20, где белок представляет собой ЕРО, и полимер представляет собой НА8, предпочтительно НЕ8, для получения лекарственного средства для лечения анемических нарушений, или гематопоэтической дисфункции, или связанных с этим заболеваний.
  36. 36. Применение конъюгата по любому из пп.21-31 или конъюгата, получаемого способом по любому из пп.1-20, где белок представляет собой С-С8Ρ и полимер представляет собой НА8, предпочтитель- 81 010501 но ΗΕ8, для получения лекарственного средства для лечения нарушения, характеризуемого пониженной гематопоэтической или иммунной функцией, указанное нарушение предпочтительно возникает в результате химиотерапии, лучевой терапии, инфекционного заболевания, тяжелой хронической нейтропении или лейкоза.
  37. 37. Применение конъюгата по любому из пп.21-31 или конъюгата, получаемого способом по любому из пп.1-20, где белок представляет собой АТ III и полимер представляет собой НА8, предпочтительно ΗΕ8, для получения лекарственного средства для лечения наследственного дефекта, венозного тромбоза, ожогов и устройчивости к гепарину при аорто-коронарном шунтировании (САВС), для профилактики образования микросгустков, связанных с вентиляционной терапией, лечения перфорации кишечника в результате травмы и желудочно-кишечной хирургии, рассеянного внутрисосудистого свертывания крови (ΌΚ’) и/или сепсиса.
  38. 38. Применение конъюгата по любому из пп.21-31 или конъюгата, получаемого способом по любому из пп.1-20, где белок представляет собой Фактор УШ, и полимер представляет собой НА8, предпочтительно ΗΕ8, для получения лекарственного средства для лечения гемофилии А.
  39. 39. Применение конъюгата по любому из пп.21-31 или конъюгата, получаемого способом по любому из пп.1-20, где белок представляет собой А1АТ, и полимер представляет собой НА8, предпочтительно ΗΕ8, для получения лекарственного средства для лечения эмфиземы, цистозного фиброза, атопического дерматита, хронического обструктивного заболевания легких (ХОЗЛ) и/или бронхита.
  40. 40. Применение конъюгата по любому из пп.21-31, или конъюгата, получаемого способом по любому из пп.1-20, где белок представляет собой (РА и полимер представляет собой НА8, предпочтительно ΗΕ8, для получения лекарственного средства для лечения инфарктов миокарда (сердечных приступов), тромбоза, тромбоэмболии или окклюзионных заболеваний, особенно окклюзионных артериальных заболеваний.
  41. 41. Применение конъюгата по любому из пп.21-31 или конъюгата, получаемого способом по любому из пп.1-20, где белок представляет собой АРС и полимер представляет собой НА8, предпочтительно ΗΕ8, для получения лекарственного средства для лечения тяжелого сепсиса, тромбоза, тромбоэмболии или окклюзионных заболеваний, особенно окклюзионных артериальных заболеваний.
  42. 42. Применение конъюгата по любому из пп.21-31 или конъюгата, получаемого способом по любому из пп.1-20, где белок представляет собой ШЫ альфа и полимер представляет собой НА8, предпочтительно ΗΕ8, для получения лекарственного средства для лечения лейкоза, например лейкоза волосковых клеток, хронического миелогенного лейкоза, множественной миеломы, фоликулярной лимфомы, рака, например карциноидной опухоли, злокачественной меланомы и гепатита, например хронического гепатита В и хронического гепатита С.
  43. 43. Применение конъюгата по любому из пп.21-31 или конъюгата, получаемого способом по любому из пп.1-20, где белок представляет собой ГЕМ бета, и полимер представляет собой НА8, предпочтительно ΗΕ8, для получения лекарственного средства для лечения рассеянного склероза, предпочтительно рецидивирующих форм рассеянного склероза.
  44. 44. Конъюгат, включающий гидроксиалкилкрахмал и белок, где гидроксиалкилкрахмал связан с использованием его окисленного восстановительного конца с первым связывающим соединением посредством амидной связи, указанное связывающее соединение дополнительно связано амидной связью со вторым связывающим соединением, указанное второе связывающее соединение связано азометиновой и/или аминной связью с белком, где первое связывающее соединение предпочтительно используется в качестве диамино-функционализированного соединения, а второе связывающее соединение предпочтительно используется в качестве карбокси- и альдегидо- или кето-, или полуацеталь-, более предпочтительно в качестве карбокси- и альдегидофункционализированного соединения
  45. 45. Конъюгат, включающий белок и полимер или его производное, где полимер представляет собой гидроксиалкилкрахмал (НА8), имеющий структуру, соответствующую формуле:
    где Κ,μ И2 и К3 независимо представляют собой водород или гидроксиалкильную группу, гидроксиарильную группу, гидроксиаралкильную группу или гидроксиалкарильную группу, имеющую от 1, предпочтительно от 2 до 10 атомов углерода, предпочтительно водород или гидроксиалкильную группу, более предпочтительно водород или гидроксиэтильную группу, и где Ь независимо представляет собой необязательно замещенный, линейный, разветвленный и/или циклический углеводородный остаток, необязательно включающий по меньшей мере один гетероатом, имеющий от 1 до 60, предпочтительно от 1 до 40, более предпочтительно от 1 до 20, более предпочтительно от 1 до 10, более предпочтительно от 1 до 6, более предпочтительно от 1 до 2 атомов углерода и
    - 82 010501 особенно предпочтительно 1 атом углерода, в частности Ь представляет собой 0Η2.
  46. 46. Конъюгат, включающий белок и полимер или его производное, где полимер представляет собой гидроксиалкилкрахмал ЩАЗ), имеющий структуру, соответствующую формуле где Вь В2 и В3 независимо представляют собой водород или гидроксиалкильную группу, гидроксиарильную группу, гидроксиаралкильную группу, или гидроксиалкарильную группу, имеющую от 1, предпочтительно от 2 до 10 атомов углерода, предпочтительно водород или гидроксиалкильную группу, более предпочтительно водород или гидроксиэтильную группу, и где Ь1 и Ь2 независимо представляют собой необязательно замещенный, линейный, разветвленный и/или циклический углеводородный остаток, необязательно включающий по меньшей мере один гетероатом, включающий алкильный, арильный, аралкильный, гетероалкильный и/или гетероаралкильный фрагмент, при этом указанный остаток содержит от 1 до 60, предпочтительно от 1 до 40, более предпочтительно от 1 до 20, более предпочтительно от 1 до 10 атомов углерода, и где Ό представляет собой связь, предпочтительно ковалентную связь, которая образована подходящей функциональной группой Е2, связанной с Ь1 и подходящей функциональной группой Е3, связанной с Ь2.
  47. 47. Конъюгат по п.46, где Ь1 представляет собой где п = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, предпочти- тельно 2, 3, 4, 5, 6, более предпочтительно 2, 3, 4 и особенно предпочтительно 4.
  48. 48. Конъюгат по п.46 или 47, где Ь2 включает необзательно замещенный подходящим образом арильный фрагмент, предпочтительно арильный фрагмент, содержащий 6 атомов углерода, особенно предпочтительно Ь2 представляет собой ΟΗ.·|.
  49. 49. Конъюгат по любому из пп.46-48, где Е2 выбирают из группы, включающей двойные С-С-связи или тройные С-С-связи, или ароматические С-С-связи;
    тиогруппу или гидроксильные группы;
    гидразид алкилсульфоновой кислоты; гидразид арилсульфоновой кислоты;
    1.2- диолы;
    1.2- аминотиоспирты;
    азиды;
    1.2- аминоспирты;
    аминогруппу -ΝΗ2 или производные аминогрупп, включающие структурное звено -ΝΗ-, такие как аминоалкильные группы, аминоарильная группа, аминоаралкильные группы или алкариламиногруппы;
    гидроксиламиногруппу -Ο-ΝΗ2 или производные гидроксиаминогруппы, включающие структурное звено -Ο-ΝΗ-, такие как гидроксилалкиламиногруппы, гидроксилариламиногруппы, гидроксиларалкиламиногруппы или гидроксилалкариламиногруппы;
    алкоксиаминогруппы, арилоксиаминогруппы, аралкилоксиаминогруппы или алкарилоксиаминогруппы, каждая из которых включает структурное звено -ΝΗ-Ο-;
    остатки, имеющие карбонильную группу, А-С(=С)-М, где С представляет собой О или З, и М представляет собой, например,
    -ОН или -ЗШ алкоксильную группу, арилоксигруппу, аралкилоксигруппу или алкарилоксигруппу; алкилтиогруппу, арилтиогруппу, аралкилтиогруппу или алкарилтиогруппу;
    алкилкарбонилоксигруппу, арилкарбонилоксигруппу, аралкилкарбонилоксигруппу, алкарилкарбонилоксигруппу;
    активированные сложные эфиры, такие как сложные эфиры гидроксиламинов, имеющие имидную структуру, такую как Ν-гидроксисукцинимид, или имеющие структурное звено О-Ν, где Ν представляет собой часть гетероарильного соединения, или когда С = О и О отсутствует, такие арилоксисоединения с замещенным арильным остатком как пентафторфенил, паранитрофенил или трихлорфенил;
    где О отсутствует или представляет собой ΝΗ или гетероатом, такой как З или О;
    -ΝΗ-ΝΗ2 или -ΝΗ-ΝΗ-;
    -ΝΟ2;
    нитрильную группу;
    карбонильные группы, такие как альдегидная группа или кетогруппа;
    карбоксильную группу;
    группу -И=С=О или группу -И=С=З;
    винилгалогенидные группы, такие как винилиодидная или винилбромидная группа или трифлат;
    - 83 010501
    -С=С-Н;
    -(С-NН2С1)-О-алкил;
    группы -(С=О)-СН2-На1, где На1 представляет собой С1, Вг или I; -СН=СН-БО2-;
    дисульфидную группу, включающую структуру -Б-Б-;
    группу 2 группу и где Б3 представляет собой функциональную группу, способную образовывать химическую связь с Б2 и предпочтительно выбран из вышеуказанной группы, Б2 предпочтительно включает фрагмент -ΝΉ-, более предпочтительно включает аминогруппу, Б3 предпочтительно включает фрагмент -(С=О)-, более предпочтительно -(С=О)-, более предпочтительно фрагмент -(С=О)-О-, еще более предпочтительно -(С=О)-О- и особенно предпочтительно -(С=О)-О, Ό предпочтительно представляет собой амидную связь.
  50. 50. Конъюгат по п.49, имеющий структуру, соответствующую формуле и = 2, 3 или 4, Кд независимо представляет собой водород или метоксильную группу, и т = 0, когда К4 представляет собой водород, и т = 1 в случае, когда К4 представляет собой метокси.
  51. 51. Конъюгат по п.50, где гидроксиалкилкрахмал представляет собой гидроксиэтилкрахмал.
  52. 52. Конъюгат по п.51, где гидроксиэтилкрахмал имеет молекулярную массу от 2 до 200 кДа, предпочтительно от 4 до 130 кДа, более предпочтительно от 4 до 70 кДа.
  53. 53. Конъюгат по любому из пп.44-52, где белок выбирают из группы, состоящей из ЕРО, О-СББ, ^Ν альфа, ^Ν бета, АТ III, [Ь-2, [Ь-3, миоглобина, БОЭ и ВБА, предпочтительно из группы, состоящей из гйЕРО, гкО-СББ, рЫБХ альфа, Ηι^Ν бета, гкАТ III, гЫЬ-2, гЫЬ-3, миоглобина, БОЭ и ВБА, и/или из группы, состоящей из А1АТ, фактора VII, фактора VIII, фактора РХ, !РА и АРС.
  54. 54. Применение конъюгата по любому из пп.21-31 или 44-52, или конъюгата, получаемого способом по любому из пп.1-20, где белок представляет собой Фактор VII и полимер представляет собой НАБ, предпочтительно НЕБ, для получения лекарственного средства для лечения случаев гемофилии А или В у пациентов, обладающих ингибиторами Фактора VIII или Фактора РХ.
  55. 55. Применение конъюгата по любому из пп.21-31 или 44-52 или конъюгата, получаемого способом по любому из пп.1-20, где белок представляет собой Фактор IX и полимер представляет собой НАБ, предпочтительно НЕБ, для получения лекарственного средства для борьбы и профилактики геморрагических случаев у пациентов с гемофилией В, предпочтительно с врожденным дефицитом фактора К или болезнью Кристмаса, включая контроль и профилактику кровотечения при хирургических вмешательст вах.
  56. 56. Применение конъюгата по любому из пп.44-52 для лечения человека или животного.
  57. 57. Фармацевтическая композиция, включающая терапевтически эффективное количество конъюгата по любому из пп.44-52.
  58. 58. Фармацевтическая композиция по п.57, дополнительно включающая по меньшей мере один фармацевтически приемлемый разбавитель, адъювант или носитель.
  59. 59. Применение конъюгата по любому из пп.44-52, где белок представляет собой ЕРО и полимер представляет собой НАБ, предпочтительно НЕБ, для получения лекарственного средства для лечения анемических нарушений или гематопоэтической дисфункции или связанных с этим заболеваний.
  60. 60. Применение конъюгата по любому из пп.44-52, где белок представляет собой О-СББ и полимер представляет собой НАБ, предпочтительно НЕБ, для получения лекарственного средства для лечения нарушения, характеризуемого пониженной гематопоэтической или иммунной функцией, указанное нарушение предпочтительно возникает в результате химиотерапии, лучевой терапии, инфекционного заболевания, тяжелой хронической нейтропении или лейкоза.
  61. 61. Применение конъюгата по любому из пп.44-52, где белок представляет собой АТ III и полимер представляет собой НАБ, предпочтительно НЕБ, для получения лекарственного средства для лечения
    - 84 010501 наследственного дефекта, венозного тромбоза, ожогов и устройчивости к гепарину при аортокоронарном шунтировании ^Αβ^, для профилактики образования микросгустков, связанных с вентиляционной терапией, лечения перфорации кишечника в результате травмы и желудочно-кишечной хирургии, рассеянного внутрисосудистого свертываниюя крови (ΌΙΟ') и/или сепсиса.
  62. 62. Применение конъюгата по любому из пп.44-52, где белок представляет собой Фактор УШ и полимер представляет собой ΗΑ8, предпочтительно НЕ8, для получения лекарственного средства для лечения гемофилии А.
  63. 63. Применение конъюгата по любому из пп.44-52, где белок представляет собой А1АТ и полимер представляет собой ΗΑ8, предпочтительно НЕ8, для получения лекарственного средства для лечения эмфиземы, цистозного фиброза, атопического дерматита, хронического обструктивного заболевания легких (ХОЗЛ) и/или бронхита.
  64. 64. Применение конъюгата по любому из пп.44-52, где белок представляет собой ίΡΑ и полимер представляет собой ΗΑ8, предпочтительно НЕ8, для получения лекарственного средства для лечения инфарктов миокарда (сердечных приступов), тромбоза, тромбоэмболии или окклюзионных заболеваний, особенно окклюзионных артериальных заболеваний.
  65. 65. Применение конъюгата по любому из пп.44-52, где белок представляет собой АРС и полимер представляет собой ΗΑ8, предпочтительно НЕ8, для получения лекарственного средства для лечения тяжелого сепсиса, тромбоза, тромбоэмболии или окклюзионных заболеваний, особенно окклюзионных артериальных заболеваний.
  66. 66. Применение конъюгата по любому из пп.44-52, где белок представляет собой ШЫ альфа и полимер представляет собой ΗΑ8, предпочтительно НЕ8, для получения лекарственного средства для лечения лейкоза, например лейкоза волосковых клеток, хронического миелогенного лейкоза, множественной миеломы, фоликулярной лимфомы, рака, например карциноидной опухоли, злокачественной меланомы и гепатита, например хронического гепатита В и хронического гепатита С.
  67. 67. Применение конъюгата по любому из пп.44-52, где белок представляет собой ΙΕΝ бета и полимер представляет собой ΗΑ8, предпочтительно НЕ8, для получения лекарственного средства для лечения рассеянного склероза, предпочтительно рецидивирующих форм рассеянного склероза.
EA200601672A 2004-03-11 2005-03-11 Конъюгаты гидроксиалкилкрахмала и белка, полученные восстановительным аминированием EA010501B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US55221704P 2004-03-11 2004-03-11
EP04005855 2004-03-11
PCT/EP2005/002653 WO2005092928A1 (en) 2004-03-11 2005-03-11 Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein, prepared by reductive amination

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200601672A1 EA200601672A1 (ru) 2007-04-27
EA010501B1 true EA010501B1 (ru) 2008-10-30

Family

ID=34924481

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200601672A EA010501B1 (ru) 2004-03-11 2005-03-11 Конъюгаты гидроксиалкилкрахмала и белка, полученные восстановительным аминированием

Country Status (17)

Country Link
US (1) US8287850B2 (ru)
EP (2) EP2336192A1 (ru)
JP (1) JP5191729B2 (ru)
KR (1) KR101186821B1 (ru)
CN (2) CN1946742A (ru)
AR (1) AR048035A1 (ru)
AU (1) AU2005225513B2 (ru)
BR (1) BRPI0508607A (ru)
CA (1) CA2558738C (ru)
DE (1) DE202005021885U1 (ru)
EA (1) EA010501B1 (ru)
IL (1) IL177730A (ru)
NO (1) NO20064631L (ru)
SG (1) SG151261A1 (ru)
TW (1) TWI417303B (ru)
WO (1) WO2005092928A1 (ru)
ZA (1) ZA200607251B (ru)

Families Citing this family (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10209821A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung von Proteinen an ein modifiziertes Polysaccharid
DE10209822A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung niedermolekularer Substanzen an ein modifiziertes Polysaccharid
KR101174510B1 (ko) 2002-09-11 2012-08-16 프레제니우스 카비 도이치란트 게엠베하 하이드록시알킬전분화 폴리펩티드, 특히 하이드록시알킬전분화 에리트로포이에틴
WO2005014655A2 (en) * 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
SG145746A1 (en) * 2003-08-08 2008-09-29 Fresenius Kabi De Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and g-csf
ES2390885T3 (es) * 2004-03-11 2012-11-19 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugados de hidroxialquilalmidón y una proteína
EP2336192A1 (en) 2004-03-11 2011-06-22 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein, prepared by reductive amination
AU2006222187A1 (en) * 2005-03-11 2006-09-14 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Production of bioactive glycoproteins from inactive starting material by conjugation with hydroxyalkylstarch
EP1762250A1 (en) * 2005-09-12 2007-03-14 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Conjugates of hydroxyalkyl starch and an active substance, prepared by chemical ligation via thiazolidine
EP2041167B1 (en) 2006-07-25 2010-05-12 Lipoxen Technologies Limited Derivatisation of granulocyte colony-stimulating factor
PT2197919E (pt) 2007-08-27 2014-07-17 Ratiopharm Gmbh Formulação líquida de conjugado de g-csf
EP2070951A1 (en) * 2007-12-14 2009-06-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Method for producing a hydroxyalkyl starch derivatives with two linkers
EP2070950A1 (en) * 2007-12-14 2009-06-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Hydroxyalkyl starch derivatives and process for their preparation
CA2709960A1 (en) * 2007-12-27 2009-07-09 Baxter International Inc. Chemically modified factor ix
EP2274331B1 (en) 2008-05-02 2013-11-06 Novartis AG Improved fibronectin-based binding molecules and uses thereof
RU2010149797A (ru) * 2008-05-06 2012-06-20 Октафарма АГ (CH) Комплекс
GB0811743D0 (en) * 2008-06-26 2008-07-30 Hemosol Biopharma Inc Composition
NZ600382A (en) 2008-07-23 2013-11-29 Ambrx Inc Modified bovine G-CSF polypeptides and their uses
JP5666310B2 (ja) * 2008-12-03 2015-02-12 株式会社カネカ ホルミル基含有多孔質担体、それを用いた吸着体、およびそれらの製造方法
JP5738264B2 (ja) * 2009-03-20 2015-06-17 エフピーイノベイションズ 新規の特性を有するセルロース材料
WO2011051327A2 (en) 2009-10-30 2011-05-05 Novartis Ag Small antibody-like single chain proteins
WO2011051466A1 (en) 2009-11-02 2011-05-05 Novartis Ag Anti-idiotypic fibronectin-based binding molecules and uses thereof
AU2010341518B2 (en) 2009-12-21 2014-01-09 Ambrx, Inc. Modified porcine somatotropin polypeptides and their uses
JP2013515080A (ja) 2009-12-21 2013-05-02 アンブルックス，インコーポレイテッド 修飾されているウシのソマトトロピンポリペプチドおよびそれらの使用
WO2011092233A1 (en) 2010-01-29 2011-08-04 Novartis Ag Yeast mating to produce high-affinity combinations of fibronectin-based binders
DK2947148T3 (en) * 2010-04-20 2017-09-18 Octapharma Ag NEW STABILIZER FOR PHARMACEUTICAL PROTEINS
TWI480288B (zh) 2010-09-23 2015-04-11 Lilly Co Eli 牛顆粒細胞群落刺激因子及其變體之調配物
JP2014521594A (ja) 2011-05-25 2014-08-28 アミリン・ファーマシューティカルズ，リミテッド・ライアビリティ・カンパニー 長持続期間デュアルホルモンコンジュゲート
PL2726511T3 (pl) 2011-07-01 2019-12-31 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Kompozycje, zastosowania i sposoby leczenia zaburzeń oraz chorób metabolicznych
EP2741780A1 (en) 2011-08-10 2014-06-18 Ludwig-Maximilians-Universität München Method for the controlled intracellular delivery of nucleic acids
TR201909110T4 (tr) * 2011-09-14 2019-07-22 Glaxosmithkline Biologicals Sa Sakarit-protein glikokonjugatları yapmaya yönelik yöntemler.
JP5999659B2 (ja) * 2011-12-14 2016-09-28 国立大学法人 筑波大学 新規分岐ポリエチレングリコール及びその用途
WO2013113503A1 (en) 2012-01-31 2013-08-08 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and an oligonucleotide
NZ630484A (en) 2012-11-28 2017-04-28 Ngm Biopharmaceuticals Inc Compositions and methods for treatment of metabolic disorders and diseases
EP2938740B1 (en) 2012-12-27 2022-04-20 NGM Biopharmaceuticals, Inc. Chimeric fgf19 peptides for use in treating bile acid disorders
CN106913865A (zh) 2013-04-18 2017-07-04 阿尔莫生物科技股份有限公司 使用白细胞介素‑10治疗疾病和病症的方法
EP3010527B1 (en) 2013-06-17 2018-08-08 Armo Biosciences, Inc. Method for assessing protein identity and stability
CN105658232A (zh) 2013-08-30 2016-06-08 阿尔莫生物科技股份有限公司 使用白细胞介素-10治疗疾病和病症的方法
RU2016122957A (ru) 2013-11-11 2017-12-19 Армо Байосайенсиз, Инк. Способы применения интерлейкина-10 для лечения заболеваний и расстройств
WO2015077717A1 (en) 2013-11-25 2015-05-28 The Broad Institute Inc. Compositions and methods for diagnosing, evaluating and treating cancer by means of the dna methylation status
US11725237B2 (en) 2013-12-05 2023-08-15 The Broad Institute Inc. Polymorphic gene typing and somatic change detection using sequencing data
EP3082853A2 (en) 2013-12-20 2016-10-26 The Broad Institute, Inc. Combination therapy with neoantigen vaccine
WO2015187295A2 (en) 2014-06-02 2015-12-10 Armo Biosciences, Inc. Methods of lowering serum cholesterol
AU2015333827A1 (en) 2014-10-14 2017-04-20 Armo Biosciences, Inc. Interleukin-15 compositions and uses thereof
KR20170084033A (ko) 2014-10-22 2017-07-19 아르모 바이오사이언시스 인코포레이티드 질환 및 장애를 치료하기 위해 인터루킨-10을 사용하는 방법
IL251834B2 (en) 2014-10-23 2023-09-01 Ngm Biopharmaceuticals Inc Pharmaceutical compositions containing peptide variants and methods of using them
EP3234193B1 (en) 2014-12-19 2020-07-15 Massachusetts Institute of Technology Molecular biomarkers for cancer immunotherapy
US10993997B2 (en) 2014-12-19 2021-05-04 The Broad Institute, Inc. Methods for profiling the t cell repertoire
WO2016126615A1 (en) 2015-02-03 2016-08-11 Armo Biosciences, Inc. Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders
EP3297660A2 (en) 2015-05-20 2018-03-28 The Broad Institute Inc. Shared neoantigens
WO2016191587A1 (en) 2015-05-28 2016-12-01 Armo Biosciences, Inc. Pegylated interleukin-10 for use in treating cancer
EP3302528A1 (en) 2015-05-29 2018-04-11 Armo Biosciences, Inc. Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders
WO2017035232A1 (en) 2015-08-25 2017-03-02 Armo Biosciences, Inc. Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders
ES2871036T3 (es) 2015-11-09 2021-10-28 Ngm Biopharmaceuticals Inc Método para el tratamiento de trastornos relacionados con ácidos biliares
US20190346442A1 (en) 2016-04-18 2019-11-14 The Broad Institute, Inc. Improved hla epitope prediction
ES2953551T3 (es) * 2016-10-11 2023-11-14 Arkema Inc Uso de partículas poliméricas huecas para aislamiento térmico
US11549149B2 (en) 2017-01-24 2023-01-10 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for detecting a mutant variant of a polynucleotide
HUE065174T2 (hu) 2017-02-12 2024-05-28 Biontech Us Inc HLA-alapú módszerek és készítmények, valamint azok felhasználása
WO2019014267A1 (en) 2017-07-11 2019-01-17 Synthorx, Inc. INCORPORATION OF NON-NATURAL NUCLEOTIDES AND ASSOCIATED METHODS
AU2018309172B2 (en) 2017-08-03 2022-12-15 Synthorx, Inc. Cytokine conjugates for the treatment of autoimmune diseases
US20200353050A1 (en) 2017-11-10 2020-11-12 Armo Biosciences, Inc. Compositions and methods of use of interleukin-10 in combination with immune check-point pathway inhibitors
WO2019126186A1 (en) 2017-12-18 2019-06-27 Neon Therapeutics, Inc. Neoantigens and uses thereof
CN108837299B (zh) * 2018-07-18 2020-08-07 武汉大学 一种智能调节血糖的微针贴片及其制备方法
WO2020072700A1 (en) 2018-10-02 2020-04-09 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Hla single allele lines
US20220062394A1 (en) 2018-12-17 2022-03-03 The Broad Institute, Inc. Methods for identifying neoantigens
SG11202106678PA (en) 2018-12-21 2021-07-29 Biontech Us Inc Method and systems for prediction of hla class ii-specific epitopes and characterization of cd4+ t cells
EP3923974A4 (en) 2019-02-06 2023-02-08 Synthorx, Inc. IL-2 CONJUGATES AND METHODS OF USE THEREOF
BR112021025050A2 (pt) 2019-06-12 2022-05-03 Biontech Us Inc Composições de neoantígeno e usos das mesmas
AU2021400424A1 (en) 2020-12-14 2023-07-06 Biontech Us Inc. Tissue-specific antigens for cancer immunotherapy
WO2024015892A1 (en) 2022-07-13 2024-01-18 The Broad Institute, Inc. Hla-ii immunopeptidome methods and systems for antigen discovery
CN115477442B (zh) * 2022-08-16 2023-09-26 杭州鲲宸环境科技有限公司 一种航材园废水处理方法
WO2024077256A1 (en) 2022-10-07 2024-04-11 The General Hospital Corporation Methods and compositions for high-throughput discovery ofpeptide-mhc targeting binding proteins

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3029307A1 (de) * 1980-08-01 1982-03-04 Dr. Eduard Fresenius, Chemisch-pharmazeutische Industrie KG, 6380 Bad Homburg Haemoglobin enthaltendes blutersatzmittel
WO1994029370A1 (en) * 1993-06-08 1994-12-22 Enzon, Inc. Factor ix - polymeric conjugates
WO1998001158A2 (de) * 1996-07-08 1998-01-15 Fresenius Ag Hämoglobin-hydroxyethylstärke-konjugate als sauerstoff-transport-mittel
WO1999049897A1 (en) * 1998-03-31 1999-10-07 Hemosol Inc. Hemoglobin-polysaccharide conjugates
WO2002080979A2 (de) * 2001-03-16 2002-10-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Hydroxyalkylstärke-wirkstoff-konjugate
WO2003074088A2 (de) * 2002-03-06 2003-09-12 Biotechnologie - Gesellschaft Mittelhessen Mbh Kopplung niedermolekularer substanzen an hydroxyalkylstärke
WO2003074087A1 (de) * 2002-03-06 2003-09-12 Biotechnologie - Gesellschaft Mittelhessen Mbh Kopplung von proteinen an ein modifiziertes polysaccharid
EP1398328A1 (en) * 2002-09-11 2004-03-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Hydroxyalkyl starch derivatives
WO2004030701A1 (de) * 2002-09-11 2004-04-15 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Hydroxyalkyltärke-allergen-konjugate
WO2005014655A2 (en) * 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
WO2005014024A2 (en) * 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of a polymer and a protein linked by an oxime linking group

Family Cites Families (183)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3191291A (en) * 1959-01-21 1965-06-29 Continental Can Co Art of producing very thin steel and like sheets in wide strips
NL269801A (nl) 1960-10-04 1964-03-10 Farbwerke Höchst Ag Werkwijze ter bereiding van in water onoplosbare kleurstoffen
DE2233977A1 (de) 1971-07-14 1973-02-01 Unilever Nv Verfahren zur herstellung oxydierter kohlenhydrate
GB1419080A (en) 1972-12-29 1975-12-24 Cheminova As Chemical compounds having juvenile hormone activity
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4125492A (en) 1974-05-31 1978-11-14 Pedro Cuatrecasas Affinity chromatography of vibrio cholerae enterotoxin-ganglioside polysaccharide and the biological effects of ganglioside-containing soluble polymers
US4001401A (en) * 1975-02-02 1977-01-04 Alza Corporation Blood substitute and blood plasma expander comprising polyhemoglobin
US4001200A (en) * 1975-02-27 1977-01-04 Alza Corporation Novel polymerized, cross-linked, stromal-free hemoglobin
US4061736A (en) 1975-02-02 1977-12-06 Alza Corporation Pharmaceutically acceptable intramolecularly cross-linked, stromal-free hemoglobin
US4053590A (en) 1975-02-27 1977-10-11 Alza Corporation Compositions of matter comprising macromolecular hemoglobin
FR2309082A1 (fr) 1975-04-24 1976-11-19 Serras Paulet Edouard Dispositif a bouton poussoir de commande de commutation d'un circuit electronique ou electrique
CA1055932A (en) 1975-10-22 1979-06-05 Hematech Inc. Blood substitute based on hemoglobin
DE2616086C2 (de) 1976-04-13 1986-04-03 Dr. Eduard Fresenius, Chemisch-pharmazeutische Industrie KG, 6380 Bad Homburg Substanz zur Verwendung in einem kolloidalen Blutvolumenersatzmittel aus Hydroxyethylstärke und Hämoglobin
GB1578348A (en) * 1976-08-17 1980-11-05 Pharmacia Ab Products and a method for the therapeutic suppression of reaginic antibodies responsible for common allergic
FR2378094A2 (fr) 1977-01-24 1978-08-18 Inst Nat Sante Rech Med Nouveaux reactifs biologiques constitues par des supports solides sur lesquels sont couples des composes organiques comportant un residu glucidique
SE420847B (sv) * 1978-11-14 1981-11-02 Svenska Rayon Ab Forfarande for framstellning av krusiga modalfibrer
EP0019403B1 (en) 1979-05-10 1985-07-31 American Hospital Supply Corporation Hydroxyalkyl-starch drug carrier
US4454161A (en) * 1981-02-07 1984-06-12 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo Process for the production of branching enzyme, and a method for improving the qualities of food products therewith
JPS57206622A (en) 1981-06-10 1982-12-18 Ajinomoto Co Inc Blood substitute
US4965825A (en) * 1981-11-03 1990-10-23 The Personalized Mass Media Corporation Signal processing apparatus and methods
US5508815A (en) * 1981-12-14 1996-04-16 Smart Vcr Limited Partnership Schedule display system for video recorder programming
IE56026B1 (en) 1982-10-19 1991-03-27 Cetus Corp Cysteine-depleted muteins of biologically active proteins
DE3485810T2 (de) 1983-05-27 1992-12-10 Texas A & M University Syst Verfahren zur herstellung eines rekombinanten baculovirus-expressionsvektors.
DE3482812D1 (de) 1983-10-11 1990-08-30 Fidia Spa Fraktionen von hyaluronsaeure mit pharmazeutischer aktivitaet, verfahren zu deren herstellung und sie enthaltende pharmazeutische zusammensetzungen.
NZ210501A (en) 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
US4703008A (en) 1983-12-13 1987-10-27 Kiren-Amgen, Inc. DNA sequences encoding erythropoietin
US4496689A (en) * 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
US4952496A (en) 1984-03-30 1990-08-28 Associated Universities, Inc. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase
IL77081A (en) 1984-12-04 1999-10-28 Genetics Inst AND sequence encoding human erythropoietin, a process for its preparation and a pharmacological preparation of human erythropoietin
DE3501616A1 (de) 1985-01-17 1986-07-17 Schering AG, 1000 Berlin und 4709 Bergkamen Verfahren zur herstellung von hydroxylamin-derivaten
US4667016A (en) 1985-06-20 1987-05-19 Kirin-Amgen, Inc. Erythropoietin purification
US4766106A (en) * 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4863964A (en) 1985-07-02 1989-09-05 Biomedical Frontiers, Inc. Method for the stabilization of deferoxamine to chelate free ions in physiological fluid
US5217998A (en) * 1985-07-02 1993-06-08 Biomedical Frontiers, Inc. Composition for the stabilization of deferoxamine to chelate free ions in physiological fluid
GB8610551D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Hoffmann La Roche Polypeptide & protein derivatives
IT1203814B (it) 1986-06-30 1989-02-23 Fidia Farmaceutici Esteri dell'acido alginico
FR2600894B1 (fr) * 1986-07-02 1989-01-13 Centre Nat Rech Scient Conjugues macromoleculaires d'hemoglobine, leur procede de preparation et leurs applications
US5214132A (en) 1986-12-23 1993-05-25 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
US5362853A (en) 1986-12-23 1994-11-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
JP2594123B2 (ja) * 1987-09-12 1997-03-26 株式会社林原生物化学研究所 減感作剤
EP0307827A3 (en) 1987-09-15 1989-12-27 Kuraray Co., Ltd. Novel macromolecular complexes, process for producing same and medicinal use of such complexes
IL84252A (en) * 1987-10-23 1994-02-27 Yissum Res Dev Co Phospholipase inhibiting compositions
US4904584A (en) 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
US4847325A (en) * 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
DK110188D0 (da) 1988-03-02 1988-03-02 Claus Selch Larsen High molecular weight prodrug derivatives of antiinflammatory drugs
FR2630329B1 (fr) 1988-04-20 1991-07-05 Merieux Inst Conjugues macromoleculaires d'hemoglobine, leur procede de preparation et leurs applications
IT1219942B (it) 1988-05-13 1990-05-24 Fidia Farmaceutici Esteri polisaccaridici
US4900780A (en) * 1988-05-25 1990-02-13 Masonic Medical Research Laboratory Acellular resuscitative fluid
US4925677A (en) * 1988-08-31 1990-05-15 Theratech, Inc. Biodegradable hydrogel matrices for the controlled release of pharmacologically active agents
US5420105A (en) * 1988-09-23 1995-05-30 Gustavson; Linda M. Polymeric carriers for non-covalent drug conjugation
US5218092A (en) 1988-09-29 1993-06-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Modified granulocyte-colony stimulating factor polypeptide with added carbohydrate chains
DE3836600A1 (de) 1988-10-27 1990-05-03 Wolff Walsrode Ag Kohlensaeureester von polysacchariden und verfahren zu ihrer herstellung
CA2006596C (en) 1988-12-22 2000-09-05 Rika Ishikawa Chemically-modified g-csf
US6261800B1 (en) * 1989-05-05 2001-07-17 Genentech, Inc. Luteinizing hormone/choriogonadotropin (LH/CG) receptor
DE3919729C3 (de) 1989-06-16 1997-06-19 Fresenius Ag Hydroxyethylstärke als Plasmaexpander, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung als kolloidales Plasmaersatzmittel
JP2896580B2 (ja) 1989-08-25 1999-05-31 チッソ株式会社 アミロース―リゾチームハイブリッドと活性化糖およびその製造法
JP2838800B2 (ja) 1989-09-02 1998-12-16 株式会社林原生物化学研究所 減感作剤
KR100263845B1 (ko) 1989-10-13 2000-08-16 스튜어트 엘.왓트 에리트로포이에틴 동형체와 그의 제조방법 및 그를 포함하는제약학적 조성물
US5169784A (en) 1990-09-17 1992-12-08 The Texas A & M University System Baculovirus dual promoter expression vector
JP2909239B2 (ja) * 1991-03-27 1999-06-23 株式会社東芝 高能率符号化記録再生装置
DK130991D0 (da) * 1991-07-04 1991-07-04 Immunodex K S Polymere konjugater
US5281698A (en) * 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
DE4130807A1 (de) * 1991-09-17 1993-03-18 Wolff Walsrode Ag Verfahren zur herstellung von polysaccharidcarbonaten
JP3428033B2 (ja) * 1992-02-19 2003-07-22 株式会社日立製作所 ディジタルｖｔｒ
DE69325415T2 (de) * 1992-05-18 1999-11-25 Canon K.K., Tokio/Tokyo Datenverarbeitungsvorrichtung
US6172208B1 (en) 1992-07-06 2001-01-09 Genzyme Corporation Oligonucleotides modified with conjugate groups
GB2270920B (en) * 1992-09-25 1997-04-02 Univ Keele Alginate-bioactive agent conjugates
CA2110543A1 (en) 1992-12-09 1994-06-10 David E. Wright Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives thereof
US5659350A (en) * 1992-12-09 1997-08-19 Discovery Communications, Inc. Operations center for a television program packaging and delivery system
KR100289174B1 (ko) * 1992-12-09 2001-05-02 마크 홀린저 케이블 텔레비젼 전달 시스템을 위한 세트 탑 터미날
NZ250375A (en) 1992-12-09 1995-07-26 Ortho Pharma Corp Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives
NO934477L (no) 1992-12-09 1994-06-10 Ortho Pharma Corp PEG hydrazon- og PEG oksim-bindingdannende reagenser og proteinderivater derav
EP0601417A3 (de) 1992-12-11 1998-07-01 Hoechst Aktiengesellschaft Physiologisch verträglicher und physiologisch abbaubarer, Kohlenhydratrezeptorblocker auf Polymerbasis, ein Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung
US5805762A (en) * 1993-01-13 1998-09-08 Hitachi America, Ltd. Video recording device compatible transmitter
US5581476A (en) 1993-01-28 1996-12-03 Amgen Inc. Computer-based methods and articles of manufacture for preparing G-CSF analogs
ATE146189T1 (de) 1993-03-16 1996-12-15 Hemosol Inc Selektive vernetzung von hemoglobin mittels oxidierten, ringgeöffneten sacchariden
US5543927A (en) * 1993-04-29 1996-08-06 Sony Corporation Variable speed playback of digital video stored in a non-tape media
AU7097094A (en) 1993-06-01 1994-12-20 Enzon, Inc. Carbohydrate-modified polymer conjugates with erythropoietic activity
IL192290A0 (en) 1993-08-17 2008-12-29 Kirin Amgen Inc Erythropoietin analogs
US6275268B1 (en) * 1993-09-09 2001-08-14 United Video Properties, Inc. Electronic television program guide with remote product ordering
US5840900A (en) 1993-10-20 1998-11-24 Enzon, Inc. High molecular weight polymer-based prodrugs
JPH07188291A (ja) 1993-12-27 1995-07-25 Hayashibara Biochem Lab Inc 蛋白質とその製造方法並びに用途
US5606359A (en) * 1994-06-30 1997-02-25 Hewlett-Packard Company Video on demand system with multiple data sources configured to provide vcr-like services
WO1996006426A2 (en) * 1994-08-09 1996-02-29 Philips Electronics N.V. Apparatus for recording and/or reproducing video signals and audio signals in/from inclined tracks on a magnetic tape, and magnetic tape for such apparatus
US5625406A (en) * 1994-12-21 1997-04-29 Thomson Consumer Electronics, Inc. Unified program guide interface
KR0150702B1 (ko) * 1995-01-25 1998-10-15 구자홍 브이오디 시스템의 고속 정/역 주행 제어 방법
US5876980A (en) 1995-04-11 1999-03-02 Cytel Corporation Enzymatic synthesis of oligosaccharides
US6214331B1 (en) * 1995-06-06 2001-04-10 C. R. Bard, Inc. Process for the preparation of aqueous dispersions of particles of water-soluble polymers and the particles obtained
US5736533A (en) * 1995-06-07 1998-04-07 Neose Technologies, Inc. Bacterial inhibition with an oligosaccharide compound
WO1996040662A2 (en) * 1995-06-07 1996-12-19 Cellpro, Incorporated Aminooxy-containing linker compounds and their application in conjugates
US5748254A (en) * 1995-07-24 1998-05-05 Coach Master International Corporation Systems with a remote control in which information can be retrieved from an encoded, laser readable disc
US5981507A (en) 1995-12-14 1999-11-09 Advanced Magnetics, Inc. Polymeric carriers linked to nucleotide analogues via a phosphoramide bond
US5723589A (en) * 1995-12-21 1998-03-03 Icn Pharmaceuticals Carbohydrate conjugated bio-active compounds
SI0932399T1 (sl) 1996-03-12 2006-10-31 Pg Txl Co Lp Vodotopna paklitakselna predzdravila
KR100205549B1 (ko) * 1996-05-06 1999-07-01 윤종용 브이.오.디. 용 셋탑보드 및 셋탑보드가 장착된 컴퓨터 시스템
US5696152A (en) 1996-05-07 1997-12-09 Wisconsin Alumni Research Foundation Taxol composition for use as organ preservation and cardioplegic agents
TW517067B (en) 1996-05-31 2003-01-11 Hoffmann La Roche Interferon conjugates
US6065050A (en) * 1996-06-05 2000-05-16 Sun Microsystems, Inc. System and method for indexing between trick play and normal play video streams in a video delivery system
US5770645A (en) 1996-08-02 1998-06-23 Duke University Medical Center Polymers for delivering nitric oxide in vivo
US5851984A (en) 1996-08-16 1998-12-22 Genentech, Inc. Method of enhancing proliferation or differentiation of hematopoietic stem cells using Wnt polypeptides
KR100204575B1 (ko) * 1996-10-17 1999-06-15 정선종 위성 제어 센터에서 원격 측정 데이타의 압축저장 및 검색 방법
US6177931B1 (en) * 1996-12-19 2001-01-23 Index Systems, Inc. Systems and methods for displaying and recording control interface with television programs, video, advertising information and program scheduling information
US6011008A (en) * 1997-01-08 2000-01-04 Yissum Research Developement Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Conjugates of biologically active substances
US5952347A (en) 1997-03-13 1999-09-14 Merck & Co., Inc. Quinoline leukotriene antagonists
US6299881B1 (en) 1997-03-24 2001-10-09 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Uronium salts for activating hydroxyls, carboxyls, and polysaccharides, and conjugate vaccines, immunogens, and other useful immunological reagents produced using uronium salts
US5990237A (en) 1997-05-21 1999-11-23 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines
AU750916C (en) * 1997-08-07 2003-05-22 University Of Utah, The Prodrugs and conjugates of thiol- and selenol- containing compounds and methods of use thereof
US6378130B1 (en) * 1997-10-20 2002-04-23 Time Warner Entertainment Company Media server interconnect architecture
US6875594B2 (en) * 1997-11-13 2005-04-05 The Rockefeller University Methods of ligating expressed proteins
US6624142B2 (en) 1997-12-30 2003-09-23 Enzon, Inc. Trimethyl lock based tetrapartate prodrugs
US6172712B1 (en) * 1997-12-31 2001-01-09 Intermec Ip Corp. Television with hard disk drive
US6938268B1 (en) * 1998-01-08 2005-08-30 Winston W. Hodge Video stream sharing
DE19808079A1 (de) 1998-02-20 1999-08-26 Schering Ag Hydroxyethylstärke-Konjugate, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese enthaltende pharmazeutische Mittel
US6596135B1 (en) * 1998-03-05 2003-07-22 Asahi Glass Company, Limited Sputtering target, transparent conductive film, and method for producing the same
JP4014281B2 (ja) * 1998-03-19 2007-11-28 富士通株式会社 Ｃａｔｖにおける番組予約方式
US6153655A (en) * 1998-04-17 2000-11-28 Enzon, Inc. Terminally-branched polymeric linkers and polymeric conjugates containing the same
US6510554B1 (en) * 1998-04-27 2003-01-21 Diva Systems Corporation Method for generating information sub-streams for FF/REW applications
JPH11339374A (ja) * 1998-05-26 1999-12-10 Yamaha Corp ディジタル記録装置
US6233389B1 (en) * 1998-07-30 2001-05-15 Tivo, Inc. Multimedia time warping system
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US6261594B1 (en) 1998-11-25 2001-07-17 The University Of Akron Chitosan-based nitric oxide donor compositions
US6389218B2 (en) * 1998-11-30 2002-05-14 Diva Systems Corporation Method and apparatus for simultaneously producing compressed play and trick play bitstreams from a video frame sequence
EP1035137A1 (en) * 1999-03-12 2000-09-13 Pasteur Merieux Serums Et Vaccins Method for the reductive amination of polysaccharides
CZ299516B6 (cs) 1999-07-02 2008-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem
US7279176B1 (en) 1999-09-02 2007-10-09 Rice University Nitric oxide-producing hydrogel materials
US20020065410A1 (en) * 1999-12-02 2002-05-30 Antrim Richard L. Branched starches and branched starch hydrolyzates
US6549718B1 (en) * 1999-12-22 2003-04-15 Spotware Technologies, Inc. Systems, methods, and software for using markers on channel signals to control electronic program guides and recording devices
US6351596B1 (en) * 2000-01-07 2002-02-26 Time Warner Entertainment Co, Lp Content control of broadcast programs
US6555660B2 (en) 2000-01-10 2003-04-29 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF conjugates
US6749865B2 (en) 2000-02-15 2004-06-15 Genzyme Corporation Modification of biopolymers for improved drug delivery
US6586398B1 (en) 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
JP2001294601A (ja) 2000-04-11 2001-10-23 Akita Prefecture 高度分岐澱粉と該高度分岐澱粉の製造方法
JP2002003398A (ja) 2000-04-17 2002-01-09 Ltt Institute Co Ltd 徐放製剤、その製造法及びワクチン
US6442328B1 (en) * 2000-05-31 2002-08-27 Keen Personal Media, Inc. Digital video recorder connectable to an auxiliary interface of a set-top box that provides video data stream to a display device based on selection between recorded video signal received from the dig
US6853728B1 (en) * 2000-07-21 2005-02-08 The Directv Group, Inc. Video on demand pay per view services with unmodified conditional access functionality
US6417347B1 (en) * 2000-08-24 2002-07-09 Scimed Life Systems, Inc. High yield S-nitrosylation process
DE10041541A1 (de) 2000-08-24 2002-03-14 Michael Duchene Rekombinante Allergene aus der Motte Plodia interpunctella
CN1457257A (zh) 2000-09-08 2003-11-19 格莱风治疗公司 “拟”天然化学连接
GB0022370D0 (en) * 2000-09-13 2000-10-25 Pace Micro Tech Plc Improvements to televisionn system
KR100971696B1 (ko) * 2000-10-11 2010-07-22 유나이티드 비디오 프로퍼티즈, 인크. 데이터의 기억 장치를 주문형 매체 배달 시스템의 서버에 제공하기 위한 시스템 및 방법
US20020056970A1 (en) * 2000-11-13 2002-05-16 Groth Michael C. Variably adjustable wheelchair apparatus
US7530086B2 (en) * 2000-12-12 2009-05-05 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Media program timing and identity delivery method and system
DE10105921A1 (de) 2001-02-09 2002-08-14 Braun Melsungen Ag An Kolloide gebundene Arzneiwirkstoffe
DE10126158A1 (de) 2001-05-30 2002-12-12 Novira Chem Gmbh Eine Methode zur Synthese von Gemischen einfach aktivierter und nicht aktivierter Polyoxyalkylene zur Modifizierung von Proteinen
DE10129369C1 (de) 2001-06-21 2003-03-06 Fresenius Kabi De Gmbh Wasserlösliches, einen Aminozucker aufweisendes Antibiotikum in Form eines Pol ysaccharid-Konjugats
DE10135694A1 (de) 2001-07-21 2003-02-06 Supramol Parenteral Colloids Amphiphile Stärke-und Hydroxyethylstärke-Konjugate
US20030093800A1 (en) * 2001-09-12 2003-05-15 Jason Demas Command packets for personal video recorder
US7125843B2 (en) * 2001-10-19 2006-10-24 Neose Technologies, Inc. Glycoconjugates including more than one peptide
US7179617B2 (en) * 2001-10-10 2007-02-20 Neose Technologies, Inc. Factor IX: remolding and glycoconjugation of Factor IX
US7629456B2 (en) 2001-10-26 2009-12-08 Noxxon Pharma Ag Modified L-nucleic acid
US6375846B1 (en) * 2001-11-01 2002-04-23 Harry Wellington Jarrett Cyanogen bromide-activation of hydroxyls on silica for high pressure affinity chromatography
DE10155098A1 (de) 2001-11-09 2003-05-22 Supramol Parenteral Colloids Mittel zur Prävention von mykotischen Kontaminationen bei der Zell- und Gewebekultur bakteriellen, pflanzlichen, animalischen und humanen Ursprungs, bestehend aus Polyen-Makrolid-Konjugaten mit Polysacchariden
JP2003179836A (ja) * 2001-12-07 2003-06-27 Sony Corp サーバ装置、端末装置、番組記録制御システム及び番組記録制御方法
US6916962B2 (en) * 2001-12-11 2005-07-12 Sun Bio, Inc. Monofunctional polyethylene glycol aldehydes
DE10207072A1 (de) 2002-02-20 2003-08-28 Supramol Parenteral Colloids Stärkederivate, ihre Konjugate und Verfahren zur Herstellung derselben
DE60315145T2 (de) 2002-03-13 2008-04-30 Beijing Jiankai Technology Co., Ltd. Hydrophiles polymerderivat mit y-verzweigung und herstellungsverfahren dafür; obige verbindung enthaltender medizinischer verbundwerkstoff
DE10217994A1 (de) 2002-04-23 2003-11-06 Supramol Parenteral Colloids Konjugate von hyperverzweigten Polysacchariden
US8312504B2 (en) * 2002-05-03 2012-11-13 Time Warner Cable LLC Program storage, retrieval and management based on segmentation messages
US8443383B2 (en) * 2002-05-03 2013-05-14 Time Warner Cable Enterprises Llc Use of messages in program signal streams by set-top terminals
US7614066B2 (en) * 2002-05-03 2009-11-03 Time Warner Interactive Video Group Inc. Use of multiple embedded messages in program signal streams
EP1514107B1 (en) * 2002-06-03 2013-05-15 The Institute for Systems Biology Methods for quantitative proteome analysis of glycoproteins
US20040101546A1 (en) 2002-11-26 2004-05-27 Gorman Anne Jessica Hemostatic wound dressing containing aldehyde-modified polysaccharide and hemostatic agents
MXPA05002620A (es) 2002-09-09 2005-05-05 Nektar Therapeutics Al Corp Alcanales polimericos solubles en agua.
EP1591467A1 (en) 2002-09-09 2005-11-02 Nektar Therapeutics Al, Corporation Conjugate between a polyethylene glycol having a terminal alkanal group and a human growth hormone
ES2214166T1 (es) 2002-09-11 2004-09-16 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Polipeptidos has-ilados, especialmente, eriptropoyetina has-ilada.
DE60323756D1 (de) * 2002-10-08 2008-11-06 Fresenius Kabi De Gmbh Pharmazeutisch aktive oligosaccharid-conjugate
DE10254745A1 (de) 2002-11-23 2004-06-03 Supramol Parenteral Colloids Gmbh Imidazolide von Polysaccharid Aldonsäuren, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung zur Kopplung an pharmazeutische Wirkstoffe
DE10256558A1 (de) 2002-12-04 2004-09-16 Supramol Parenteral Colloids Gmbh Ester von Polysaccharid Aldonsäuren, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung zur Kopplung an pharmazeutische Wirkstoffe
CA2534418A1 (en) 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and g-csf
SG145746A1 (en) 2003-08-08 2008-09-29 Fresenius Kabi De Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and g-csf
JP2007519746A (ja) 2004-01-29 2007-07-19 バイオシネクサス インコーポレーティッド ワクチン調製におけるアミノ−オキシ官能基の使用
DE102004009783A1 (de) 2004-02-28 2005-09-15 Supramol Parenteral Colloids Gmbh Hyperverzweigte Stärkefraktion, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Konjugate mit pharmazeutischen Wirkstoffen
ES2390885T3 (es) 2004-03-11 2012-11-19 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugados de hidroxialquilalmidón y una proteína
TW200603818A (en) * 2004-03-11 2006-02-01 Fresenius Kabi De Gmbh Conjugates of hydroxyethyl starch and erythropoietin
EP2336192A1 (en) 2004-03-11 2011-06-22 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein, prepared by reductive amination
WO2005112954A1 (en) 2004-05-14 2005-12-01 William Marsh Rice University Nitric oxide releasing compositions and associated methods
AU2006222187A1 (en) * 2005-03-11 2006-09-14 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Production of bioactive glycoproteins from inactive starting material by conjugation with hydroxyalkylstarch
EP1762250A1 (en) 2005-09-12 2007-03-14 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Conjugates of hydroxyalkyl starch and an active substance, prepared by chemical ligation via thiazolidine
US7928079B2 (en) 2005-10-31 2011-04-19 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Polysaccharide-derived nitric oxide-releasing carbon-bound diazeniumdiolates
JP2009093397A (ja) * 2007-10-09 2009-04-30 Panasonic Corp タッチパネル及びこれを用いた入力装置
EP2070951A1 (en) 2007-12-14 2009-06-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Method for producing a hydroxyalkyl starch derivatives with two linkers
EP2070950A1 (en) 2007-12-14 2009-06-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Hydroxyalkyl starch derivatives and process for their preparation
AU2009302387B2 (en) 2008-10-07 2014-12-04 Rexahn Pharmaceuticals, Inc HPMA - docetaxel or gemcitabine conjugates and uses therefore

Patent Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3029307A1 (de) * 1980-08-01 1982-03-04 Dr. Eduard Fresenius, Chemisch-pharmazeutische Industrie KG, 6380 Bad Homburg Haemoglobin enthaltendes blutersatzmittel
WO1994029370A1 (en) * 1993-06-08 1994-12-22 Enzon, Inc. Factor ix - polymeric conjugates
WO1998001158A2 (de) * 1996-07-08 1998-01-15 Fresenius Ag Hämoglobin-hydroxyethylstärke-konjugate als sauerstoff-transport-mittel
WO1999049897A1 (en) * 1998-03-31 1999-10-07 Hemosol Inc. Hemoglobin-polysaccharide conjugates
WO2002080979A2 (de) * 2001-03-16 2002-10-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Hydroxyalkylstärke-wirkstoff-konjugate
WO2003074088A2 (de) * 2002-03-06 2003-09-12 Biotechnologie - Gesellschaft Mittelhessen Mbh Kopplung niedermolekularer substanzen an hydroxyalkylstärke
WO2003074087A1 (de) * 2002-03-06 2003-09-12 Biotechnologie - Gesellschaft Mittelhessen Mbh Kopplung von proteinen an ein modifiziertes polysaccharid
EP1398328A1 (en) * 2002-09-11 2004-03-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Hydroxyalkyl starch derivatives
EP1398327A1 (en) * 2002-09-11 2004-03-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Method of producing hydroxyalkyl starch derivatives
EP1398322A1 (en) * 2002-09-11 2004-03-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH HASylated polypeptides, especially HASylated erythropoietin
WO2004024776A1 (en) * 2002-09-11 2004-03-25 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Method of producing hydroxyalkyl starch derivatives
WO2004024761A1 (en) * 2002-09-11 2004-03-25 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Hasylated polypeptides, especially hasylated erythropoietin
WO2004024777A1 (en) * 2002-09-11 2004-03-25 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Hydroxyalkyl starch derivatives
WO2004030701A1 (de) * 2002-09-11 2004-04-15 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Hydroxyalkyltärke-allergen-konjugate
WO2005014655A2 (en) * 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
WO2005014024A2 (en) * 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of a polymer and a protein linked by an oxime linking group

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CERNY ET AL.: "A hydroxyethyl starch-hemoglobin polymer as a blood substitute" CLINICAL HEMORHEOLOGY, PERSAMON PRESS LTD, XX, vol. 2, no. 4, 1982, pages 355-365, XP002107865 the whole document *
KRAEHENBUHL J. P. ET AL.: "PREPARATION AND CHARACTERIZATION OF AN IMMUNO ELECTRON MICROSCOPE TRACER CONSISTING OF A HEME OCTA PEPTIDE COUPLED TO FAB" JOURNAL OF EXPERIMENTAL MEDICINE, vol. 139, no. 1, 1974, pages 208-223, XP002329912 ISSN: 0022-1007 the whole document *
MILTON HARRIS J. ET AL.: "PEGYLATION A NOVEL PROCESS FOR MODIFYING PHARMACOKINETICS" CLINICAL PHARMACOKINETICS, LEA & FEBIGER, PHILADELPHIA, PA, US, vol. 40, no. 7, 2001, pages 539-551, XP001106431 the whole document *
VERONESE F M.: "Peptide and protein PEGylation - a review of problems and solutions" BIOMATERIALS, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS BV., BARKING, GB, vol. 22, no. 5, 1 March 2001 (2001-03-01), pages 405-417, XP004227886 ISSN: 0142-9612 the whole document *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20070012400A (ko) 2007-01-25
AR048035A1 (es) 2006-03-22
AU2005225513A1 (en) 2005-10-06
CA2558738C (en) 2013-02-05
CN101659704A (zh) 2010-03-03
KR101186821B1 (ko) 2012-09-28
NO20064631L (no) 2006-12-11
US20070134197A1 (en) 2007-06-14
JP2007527892A (ja) 2007-10-04
JP5191729B2 (ja) 2013-05-08
TWI417303B (zh) 2013-12-01
US8287850B2 (en) 2012-10-16
ZA200607251B (en) 2009-03-25
SG151261A1 (en) 2009-04-30
CA2558738A1 (en) 2005-10-06
DE202005021885U1 (de) 2011-03-03
CN1946742A (zh) 2007-04-11
AU2005225513B2 (en) 2012-01-12
IL177730A0 (en) 2006-12-31
BRPI0508607A (pt) 2007-07-31
EP2336192A1 (en) 2011-06-22
EA200601672A1 (ru) 2007-04-27
EP1725589A1 (en) 2006-11-29
TW200600519A (en) 2006-01-01
IL177730A (en) 2013-11-28
WO2005092928A1 (en) 2005-10-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA010501B1 (ru) Конъюгаты гидроксиалкилкрахмала и белка, полученные восстановительным аминированием
JP7054407B2 (ja) オキシム連結のための求核触媒
ES2438216T3 (es) Conjugados de hidroxialquilalmidón y una proteína
KR101832937B1 (ko) 혈액 응고 단백질 복합체
JP7304402B2 (ja) オキシム連結のための求核触媒
MXPA06010189A (en) Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein, prepared by reductive amination

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): BY RU