ES2438216T3 - Conjugados de hidroxialquilalmidón y una proteína - Google Patents

Abstract

Método para preparar un conjugado que comprende una proteína y un polímero, en el que el polímero es un hidroxialquilalmidón (HAS), comprendiendo el método introducir al menos un grupo funcional A, en el que A es un grupo carboxilo reactivo, en el polímero para dar un derivado de polímero haciendo reaccionar al menos un grupo hidroxilo del polímero cuyo extremo reductor no está oxidado, con un diéster carbónico para dar el grupo carboxilo reactivo A, y hacer reaccionar al menos un grupo funcional A del derivado de polímero con al menos un grupo funcional Z de la proteína y formar de ese modo un enlace covalente, en el que Z es un grupo amino y en el que la proteína se selecciona del grupo que consiste en IFN alfa, IFN beta, GM-CSF, APC, tPA, A1AT, AT III, factor VII, factor VIII y factor IX.

Description

Conjugados de hidroxialquilalmidón y una proteína

La presente invención se refiere a conjugados de hidroxialquilalmidón y una proteína estando formados estos conjugados por un enlace covalente entre el hidroxialquilalmidón o un derivado del hidroxialquilalmidón y la proteína. La presente invención también se refiere al método de producción de estos conjugados y al uso de estos conjugados.

Se acepta generalmente que la estabilidad de proteínas puede mejorarse y la respuesta inmunitaria contra estas proteínas se reduce cuando estas proteínas se acoplan a moléculas poliméricas. El documento WO 94/28024 da a conocer que proteínas fisiológicamente activas modificadas con polietilenglicol (PEG) presentan inmunogenicidad y antigenicidad reducidas y circulan en el torrente sanguíneo considerablemente más tiempo que proteínas no conjugadas, es decir, tienen una tasa de aclaramiento reducida.

El documento WO 02/09766 da a conocer, entre otros, compuestos de proteína-polímero biocompatibles que se producen mediante conjugación de una proteína biológicamente activa con un derivado de polímero biocompatible. Los polímeros biocompatibles usados son polímeros ramificados altamente reactivos, y los conjugados resultantes contienen un ligador largo entre el derivado de polímero y la proteína. Como polímeros biocompatibles, se describen polímeros de fórmula (P-OCH2CO-NH-CHR-CO-)n-L-Qk-A, en la que P y Q son residuos poliméricos y k puede ser 1 ó 0. Para P y Q, se mencionan polietilenglicol, polipropilenglicol, polioxietileno, politrimetilenglicol, poli(ácido láctico) y sus derivados, poli(ácido acrílico) y sus derivados, poliaminoácido, poli(alcohol vinílico), poliuretano, polifosfazeno, poli(L-lisina), poli(óxido de alquileno), poliacrilamida y polímeros solubles en agua tales como dextrano o polisacárido. Como proteínas, entre otras, se mencionan interferones alfa, beta y gamma, factores sanguíneos, citocinas tales como interleucinas, G-CSF, GM-CSF. En los ejemplos del documento WO 02/09766, sólo se dan a conocer derivados de mono-, di- y tri-polietilenglicol que están acoplados exclusivamente a interferón y factor de crecimiento epidérmico, y hormona de crecimiento humana.

El documento WO 94/01483 da a conocer conjugados de polímeros biocompatibles que se forman uniendo covalentemente un polímero biológicamente inactivo o derivado de polímero con un polímero hidrófilo sintético, farmacéuticamente puro por medio de tipos específicos de enlaces químicos. Como polímeros que se producen de manera natural y derivados de los mismos, se dan a conocer polisacáridos tales como ácido hialurónico, proteoglucanos tales como sulfatos de condroitina A, B y C, quitina, heparina, sulfato de heparina, dextranos tales como ciclodextrano, hidroxietilcelulosa, éter de celulosa y almidón, lípidos tales como triglicéridos y fosfolípidos. Como polímeros sintéticos, entre otros, se describe que el polietileno y los derivados del mismo tienen un peso molecular promedio de desde aproximadamente 100 hasta aproximadamente 100.000. Como proteínas unidas al polímero o el derivado de polímero, se describen citocinas y factores de crecimiento, incluyendo interferones, factores de necrosis tumoral, interleucinas, factores estimulantes de colonias, factores de crecimiento tales como extracto de factor osteogénico, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento transformante, factor de crecimiento derivado de las plaquetas, factor de crecimiento de fibroblastos ácido y otros se dan a conocer. En todos los ejemplos de trabajo del documento WO 94/01483, se usan derivados de polietilenglicoles como polímero.

El documento WO 96/11953 da a conocer compuestos proteicos modificados químicamente en el extremo Nterminal y métodos de su producción. Específicamente, se describen composiciones de G-CSF que resultan del acoplamiento de un polímero soluble en agua con el extremo N-terminal de G-CSF. En el contexto del documento WO 96/11953, también se da a conocer interferones consenso acoplados en el extremo N-terminal a polímeros solubles en agua. Aunque se enumera una amplia variedad de polímeros solubles en agua en el documento WO 96/11953 (por ejemplo copolímeros de etilenglicol y propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (o bien homopolímeros o bien copolímeros al azar), poli(n-vinilpirrolidona)polietilenglicol, homopolímeros de polipropilenglicol, copolímeros de poli(óxido de propileno)/óxido de etileno o polioles polioxietilados), sólo se describen composiciones de IFN consenso o G-CSF pegilado en los ejemplos de trabajo del documento WO 96/11953.

El documento WO 97/30148 se refiere a conjugados de polipéptido con alergenicidad reducida que comprenden una molécula portadora polimérica que tiene dos o más moléculas de polipéptido acopladas a la misma. Estos conjugados son preferiblemente parte de composiciones usadas en el mercado del cuidado personal. Dichos conjugados se producen activando una molécula portadora polimérica, haciendo reaccionar dos o más moléculas de polipéptido con la molécula portadora polimérica activada y bloqueando grupos activos residuales en el conjugado. Como molécula portadora polimérica, se enumera una gran variedad en el documento WO 97/30148, incluyendo diferentes grupos de compuestos tales como homopolímeros naturales o sintéticos tales como polioles, poliaminas, poli(ácidos carboxílicos) y heteropolímeros que comprenden al menos dos grupos de unión diferentes. Se proporcionan ejemplos que comprenden PEG en estrella, PEG ramificados, poli(alcoholes vinílicos), policarboxilatos, polivinilpirrolidonas y poli-D,L-aminoácidos. Entre otros, se dan a conocer también dextranos tales como carboximetildextrano, celulosas tales como hidroxietilcelulosa o hidroxipropilcelulosa, hidrolizados de quitosano, almidones tales como hidroxietilalmidones o hidroxipropilalmidones, glucógeno, agarosa, goma guar, inulina, pululano, goma xantana, carragenanos, pectina, ácido algínico. Como polipéptidos, sólo se dan a conocer algunas enzimas explícitamente.

Baldwin, J.E. et al., Tetrahedron, vol. 27 (1981), págs. 1723-1726 describen la modificación química de dextrano e hidroxietilalmidón para dar polímeros sustituidos con aldehído que se dejan reaccionar con hemoglobina para dar hemoglobinas unidas a polímeros solubles. Se mostró que éstas podían unirse a oxígeno, pero experimentos de perfusión cardiaca indicaron claramente que las hemoglobinas unidas a polímeros no eran adecuadas para su uso como sustitutos sanguíneos.

El documento WO 99/49897 describe conjugados de hemoglobina formados haciendo reaccionar polisacáridos tales como dextrano o hidroxietilalmidón con grupos amino de la hemoglobina. Como grupos funcionales del polisacárido, se usan grupos aldehído producidos mediante apertura oxidativa del anillo de sacárido. Como agente reductor preferido usado, se da a conocer borano-dimetilamina. Además, el documento WO 99/49897 se limita exclusivamente a hemoglobina.

El documento WO 03/074087 se refiere a un método de acoplamiento de proteínas a un polisacárido modificado derivado de almidón. La acción de unión entre la proteína y el polisacárido, hidroxialquilalmidón, es un enlace covalente que se forma entre el grupo aldehído terminal o un grupo funcional que resulta de la modificación química de dicho grupo aldehído terminal de la molécula de hidroxialquilalmidón, y un grupo funcional de la proteína. Como grupo reactivo de la proteína, se dan a conocer grupos amino, grupos tio y grupos carboxilo, y no se mencionan grupos aldehído de la proteína. Además, aunque se proporciona una gran variedad de posibilidades de diferentes enlaces en forma de muchas listas, incluyendo diferentes grupos funcionales, diferentes moléculas de ligador teóricamente adecuadas y diferentes procedimientos químicos, los ejemplos de trabajo describen sólo dos alternativas: en primer lugar, se usa un hidroxietilalmidón oxidado y se acopla directamente a proteínas usando activación con etildimetilaminopropilcarbodiimida (EDC), o se usa un hidroxietilalmidón no oxidado y se acopla directamente a una proteína que forma una base de Schiff que posteriormente se reduce para dar la amina respectiva. Por tanto, los ejemplos de trabajo del documento WO 03/074087 no dan a conocer un único conjugado acoplado mediante un grupo tio o un grupo carboxilo a la proteína, ni describen un conjugado que comprende hidroxietilalmidón, la proteína, y una o más moléculas de ligador.

El documento WO 02/080979 se refiere a conjugados de hidroxialquilalmidón y un agente activo, estando el hidroxialquilalmidón o bien directamente unido covalentemente al agente activo o bien opcionalmente por medio de un ligador. Antes del acoplamiento, el hidroxialquilalmidón se oxida selectivamente en el extremo reductor. El documento WO 02/080979 se refiere además a métodos para la producción de un conjugado de HAS-agente activo covalente, mediante los cuales se hacen reaccionar HAS y un agente activo en un medio de reacción, caracterizado porque el medio de reacción es agua o una mezcla de agua y un disolvente orgánico, que comprende al menos el 10% en peso de agua.

Casi toda la bibliografía referente a técnicas de acoplamiento de un polímero a una proteína describe métodos de pegilación y proteínas pegiladas (por ejemplo interferones alfa, interferones beta). A pesar del progreso de los métodos de acoplamiento y el uso de moléculas de PEG monofuncionales, una desventaja general de los fármacos pegilados es que la ruta de metabolización de PEG como polímero no natural no se conoce en detalle.

Algunas de las patentes describen la modificación de interferón mediante sustitución de aminoácidos, aumento de la glicosilación o formación de multímeros. Estos métodos requieren altos esfuerzos tecnológicos (técnicas recombinantes) y podrían dar como resultado nuevas entidades que son notablemente diferentes de las proteínas naturales (por ejemplo interferón) y podrían presentar propiedades diferentes.

Además, se enseña en la técnica descrita la formación, por ejemplo, de complejos entre IFN-beta y polisacáridos mediante complejación con metales. Sin embargo, los complejos no son tan estables como los conjugados covalentes y contienen iones metálicos (por ejemplo Zn2+), lo que podría tener efectos secundarios no deseados.

Por tanto, era un objeto de la presente invención superar las desventajas mencionadas anteriormente de estas técnicas de conjugación y proporcionar conjugados de interferón beta basados en un polímero bien definido, biodegradable, soluble en agua, que se acopla covalentemente a la proteína.

Era otro objeto de la presente invención superar las desventajas mencionadas anteriormente de estas técnicas de conjugación y proporcionar conjugados de interferón alfa basados en un polímero bien definido, biodegradable, soluble en agua, que se acopla covalentemente a la proteína.

Era aún otro objeto de la presente invención superar las desventajas mencionadas anteriormente de estas técnicas de conjugación y proporcionar conjugados de AT III basados en un polímero bien definido, biodegradable, soluble en agua, que se acopla covalentemente a la proteína.

Era todavía otro objeto de la presente invención superar las desventajas mencionadas anteriormente de estas técnicas de conjugación y proporcionar conjugados de GM-CSF basados en un polímero bien definido, biodegradable, soluble en agua, que se acopla covalentemente a la proteína.

Era aún un objeto adicional de la presente invención superar las desventajas mencionadas anteriormente de estas técnicas de conjugación y proporcionar conjugados de A1AT y/o tPA y/o APC y/o factor VII y/o factor VIII y/o factor IX basados en un polímero bien definido, biodegradable, soluble en agua, que se acopla covalentemente a la proteína.

Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar métodos de producción de estos conjugados.

Por tanto, la presente invención se refiere a un método para preparar un conjugado que comprende una proteína y un polímero, en el que el polímero es un hidroxialquilalmidón (HAS), comprendiendo el método introducir al menos un grupo funcional A, en el que A es un grupo carboxilo reactivo, en el polímero para dar un derivado de polímero haciendo reaccionar al menos un grupo hidroxilo del polímero cuyo extremo reductor no está oxidado, con un diéster carbónico para dar el grupo carboxilo reactivo A, y hacer reaccionar al menos un grupo funcional A del derivado de polímero con al menos un grupo funcional Z de la proteína y formar de ese modo un enlace covalente, en el que Z es un grupo amino, y en el que la proteína se selecciona del grupo que consiste en IFN alfa, IFN beta, GM-CSF, APC, tPA, A1AT, AT III, factor VII, factor VIII y factor IX.

Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un conjugado tal como puede obtenerse según el método descrito anteriormente.

Las proteínas que pueden conjugarse según la invención pueden caracterizarse tal como sigue:

Los interferones son citocinas que median en actividades antivirales, antiproliferativas e inmunomoduladoras en respuesta a infección viral y otros inductores biológicos. En contraposición a IFN alfa, IFN beta es altamente específico de especie. Hay dos subtipos de IFN beta, IFN beta 1a e IFN beta 1b. Cuando se lleva a producción industrial, entonces la principal diferencia entre IFN beta 1a e IFN beta 1b son los sistemas celulares respectivos utilizados para su producción con consecuencias para la glicosilación y el número de aminoácidos. IFN beta 1a se produce por células de mamífero y recibe la designación 1a porque su secuencia de aminoácidos es idéntica a la del interferón beta que se produce de manera natural. IFN beta 1b se produce por bacterias. Los interferones, como la mayoría de las otras proteínas de mamíferos, se modifican postraduccionalmente mediante glicosilación. Sin embargo, las bacterias carecen de la capacidad para glicosilar proteínas y por tanto 1FN beta 1b no incluye las cadenas laterales de hidratos de carbono encontradas en el material natural. IFN beta 1a tiene 166 aminoácidos y un peso molecular de aproximadamente 22.500 D, IFN beta 1b tiene 165 aminoácidos y un peso molecular de aproximadamente 18.500 D, debido a que la metionina N-terminal falta en IFN beta 1b así como la glicosilación debido al método de producción bacteriano. La secuencia de aminoácidos de interferón beta humano se facilita, por ejemplo, en el documento EP 0 218 825 A1. La estructura cristalina de interferón beta se notificó en: Proc. Natl. Acad Sci. USA 94 (1997) págs. 11813-11818, Biochemistry, Karpusas M, Nolte M, Benton CB, Meier W, Lipscomb WN, Goelz S. Preparaciones comerciales de interferón beta son Betaseron (IFN beta 1b), Avonex y Rebif (IFN beta la). El interferón beta 1b se fabrica mediante fermentación bacteriana de una cepa de E. coli que lleva un plásmido modificado por ingeniería genética que contiene el gen para interferón betaseR17 humano. El gen nativo se obtuvo de fibroblastos humanos y se alteró de un modo que sustituye el residuo de cisteína encontrado en la posición 17 por serina. El interferón beta 1a se produce mediante tecnología de ADN recombinante usando células de ovario de hámster chino (CHO) modificadas por ingeniería genética en las que se ha introducido el gen de interferón beta humano. La secuencia de aminoácidos de IFN beta 1a es idéntica a la de interferón beta humano derivado de fibroblastos naturales. El interferón beta y interferón beta 1a naturales están glicosilados conteniendo cada uno un único resto de hidrato de carbono complejo unido a N en la Asn80. Los fármacos de interferón beta están indicados para el tratamiento de esclerosis múltiple remitente recidivante. Sin embargo, hay muchos efectos secundarios graves relacionados con la administración de los productos farmacológicos de interferón beta. Además, se administran mediante inyección (intramuscular o por vía subcutánea), conduciendo a riesgos adicionales. La reducción de los efectos secundarios y una administración más fácil (por ejemplo menos frecuente) son el motivo por el que se realiza mucho trabajo de desarrollo para mejorar las propiedades de IFN beta. La modificación de proteínas con polímero es una técnica que se aplica para mejorar las propiedades de las proteínas. La técnica usada principalmente es la modificación de interferón con polietilenglicol, conocida como pegilación.

Se producen de manera natural formas de IFN alfa por monocitos/macrófagos, células linfoblastoides, fibroblastos y varios tipos de células diferentes tras inducción por virus, ácidos nucleicos, hormonas glucocorticoides y otros inductores. Se conocen al menos 23 variantes diferentes de IFN alfa. Las proteínas individuales tienen masas moleculares de entre 19-26 kD y consisten en proteínas con longitudes de 156-166 ó 172 aminoácidos. Todos los subtipos de IFN alfa presentan una región de secuencia conservada común entre las posiciones de aminoácido 115151 mientras que los extremos amino-terminales son variables. Muchos subtipos de IFN alfa difieren en sus secuencias sólo en una o dos posiciones. Se forman enlaces disulfuro entre cisteínas en las posiciones 1/98 y 29/138. El enlace disulfuro 29/138 es esencial para la actividad biológica mientras que el enlace 1/98 puede reducirse sin afectar a la actividad biológica. Todas las formas de IFN alfa contienen un posible sitio de glicosilación pero la mayoría de los subtipos no están glicosilados. En contraposición a IFN gamma, las proteínas de IFN alfa son estables a un pH de 2. La producción industrial de IFN alfa se realiza usando E. coli modificada por ingeniería genética. Debido a que las bacterias carecen de la capacidad para glicosilar proteínas, las dos variantes de IFN alfa (IFN alfa 2a e IFN alfa 2b), que se usan en productos farmacológicos aprobados, están ambas no glicosiladas. Una desventaja principal de IFN alfa convencional son los efectos secundarios. Se ha realizado mucho trabajo en la mejora de fármacos de interferón alfa, que están indicados para el tratamiento de hepatitis C. La modificación de proteínas con polímero es una técnica que se aplica para mejorar las propiedades de las proteínas. La técnica usada principalmente es la modificación de interferón con polietilenglicol, conocida como pegilación. Dos variantes pegiladas disponibles comercialmente de IFN-alfa son PEGIntron (SP) y Pegasys (Roche).

La antitrombina III (AT III) es un inhibidor de serina proteasa que inhibe trombina y factor Xa (Travis, Annu. Rev. Biochem. 52: 655, 1983). En un menor grado, también se inhiben factor IXa, XIa, XIIa, tPA, urocinasa, tripsina, plasmina y calicreína (Menache, Semin. Hematol. 28: 1, 1991; Menache, Transfusion 32: 580, 1992; Lahiri, Arch. Biochem. Biophys. 175: 737, 1976). Se sintetiza AT III humana en el hígado como una glicoproteína de una única cadena de 432 aminoácidos con un peso molecular (PM) de aproximadamente 58.000 D. Su concentración plasmática normal está dentro del intervalo de 14-20 mg/dl (Rosenberg, Rev. Hematol. 2: 351, 1986; Murano, Thromb. Res. 18: 259, 1980). La proteína lleva tres puentes disulfuro (Cys 8-128, Cys 21-95, Cys 247-430) y cuatro cadenas de hidrato de carbono unidas a N (Asn 96, -135, -155, -192) que representan el 15% de la masa total (Franzen, J. Biol. Chem. 255: 5090, 1980; Peterson, The Physiological Inhibitions of Blood Coagulation and Fibrinolysis, Elsevier/North-Holland Biomedical Press 1979, p. 43). La antitrombina es un inhibidor de serina proteinasa del tipo serpina que es de importancia principal en el control de la coagulación sanguínea. AT III es el anticoagulante endógeno más abundante que circula en el plasma humano y participa en la regulación de la coagulación en estados tanto fisiológicos como patológicos (Opal, Crit. Care Med. 2002, 30: 325). Circula en dos formas con baja capacidad inhibidora de trombina (Pike, J. Biol. Chem. 272: 19562, 1997; Ersdal-Badju, Fed. Proc.

44: 404, 1985) (el 85-95% de la isoforma alfa con cadenas de oligosacáridos biantenarias, mono- y di-sialiladas, el 515% es la isoforma beta de alta afinidad por heparina que carece de glicosilación en Asn 135, enlace ácido siálico 2-6 terminal). Una pequeña fracción de la AT III circulante está unida normalmente a proteoglicanos en la superficie de células endoteliales vasculares. Estos proteoglicanos son predominantemente heparán sulfato, una molécula similar estructuralmente a la heparina, que puede catalizar la inhibición de la trombina del mismo modo que la heparina. La unión de AT III a unidades pentasacarídicas bien definidas de la heparina provoca un cambio conformacional de la proteína (Choay, Ann. NY Acad. Sci. 370: 644, 1981; Choay, Biochem. Biophys. Res. Commun.

116: 492, 1983; Olson, J. Biol. Chem. 266: 6353, 1991; Bauer, Semin. Hematol. 28: 10, 1991; Carell, Thromb. Haemost. 78: 516, 1997). Esta unión cataliza un aumento de 1000 veces de la actividad inhibidora de AT III hacia trombina y factor Xa (Rosenberg, Fed. Proc. 44: 404, 1985; Bjork, Antithrombin and related inhibitors of coagulation proteinases en Barett, Salvesen (eds.): Proteinase Inhibitors, vol. 17, Amsterdam, Países Bajos Elsevier Science Publishers (Biomedical Devision) 1986 p. 489; Olson, J. Biol. Chem. 267: 12528, 1992). Esta localización de una fracción de la AT en la superficie endotelial, en la que se generan comúnmente enzimas de la cascada de coagulación intrínseca, permite que AT III neutralice rápidamente estas enzimas hemostáticas y proteja superficies naturales de la formación de trombos. Por tanto, la propiedades clave de AT III en la prevención de acontecimientos trombóticos son su capacidad para unirse al catalizador heparina, experimentar el cambio conformacional que altera sus propiedades inhibidoras y unirse irreversiblemente a trombina o factor Xa inhibiendo de ese modo sus actividades. AT III también tiene propiedades antiinflamatorias, varias de las cuales resultan de sus acciones en la cascada de coagulación (Roemisch, Blood Coagul Fibrinolysis. 2002, 13: 657). Proteasas de coagulación activadas como trombina y factor X activados contribuyen a la inflamación, por ejemplo mediante la liberación de mediadores proinflamatorios. La inhibición de estas proteasas por AT III impide su interacción específica con células y reacciones posteriores (Roemisch, Blood Coagul Fibrinolysis. 2002, 13: 657). Las propiedades antiinflamatorias de AT III independientes de coagulación implican interacciones directas con células que conducen a la liberación de, por ejemplo, prostaciclina. La unión de AT III a un receptor celular recientemente identificado, sindecano-4, conduce a la interferencia con la señal intracelular inducida por mediadores como lipopolisacáridos y, de ese modo, a una modulación por disminución de la respuesta inflamatoria (Roemisch, Blood Coagul Fibrinolysis. 2002, 13: 657). Además del análisis de la estructura de AT III libre, se han realizado muchos estudios que evalúan los sitios de complejación para unidades oligosacarídicas de la heparina debido a la importancia del complejo heparina-AT III para la función fisiológica de AT III (Choay, Ann. NY Acad. Sci. 370: 644, 1981; Choay, Biochem. Biophys. Res. Commun. 116: 492, 1983; Olson, J. Biol. Chem. 266: 6353, 1991; Bauer, Semin. Hematol. 28: 10, 1991; Carell, Thromb. Haemost. 78: 516, 1997). Puede producirse AT III siguiendo técnicas de fraccionamiento de plasma humano clásicas. Se usa cromatografía de afinidad (heparina-sepharose) usando la alta afinidad de la heparina por AT III seguido por tratamiento térmico para la inactivación de virus para la separación del plasma. Alternativas más recientes disponibles para la producción de AT III son técnicas de producción recombinantes que proporcionan un acceso más seguro a esta proteína terapéutica (Levi, Semin Thromb Hemost 27: 405, 2001). ATryn™ es una AT III humana recombinante (rh AT III) producida por Genzyme Transgenics Corp. (GTC) en cabras transgénicas. Se han realizado investigaciones detalladas que comparan las propiedades estructurales y funcionales de tanto AT III derivada de plasma (ph AT III) como rh AT III (Edmunds, Blood, 91: 4561, 1998). Basándose en estos experimentos, rh AT III es idéntica estructuralmente a ph AT III con la excepción de la glicosilación. Se encontraron estructuras de oligomanosa en Asn 155 del material producido de manera transgénica mientras que se detectan estructuras complejas en el caso de la proteína derivada de plasma. Algunas de las unidades de galactosa de la pd AT III se sustituyen por unidades de GalNac en la rh AT III. Otra diferencia es un grado de fucosilación superior en rh AT III. Finalmente, el patrón de sialilación de ambas proteínas difiere de dos modos: la rh AT III está menos sialilada y contiene ácidos N-acetil- así como N-glicolilneuramínicos. Esta diferencia estructural entre las dos partes de hidrato de carbono de ambas moléculas también da como resultado propiedades bioquímicas diferentes. Están disponibles los siguientes fármacos de AT III en el mercado hospitalario europeo. (Fuente: IMS-ATC group 2001): Kybernin (Aventis Behring), AT III (Baxter, Grifols), Atenativ (Pharmacia), Aclotine (LFB), Grifols (Anbin).

El factor VII participa en la cascada de coagulación sanguínea intrínseca de proteinasas y promueve la hemostasia activando la ruta extrínseca de la cascada de coagulación. F VII se convierte en el factor VIIa mediante el factor Xa, factor XIIa, factor IXa o trombina mediante proteólisis menor. En presencia de factor tisular e iones calcio, el factor VIIa convierte entonces el factor X en el factor Xa mediante proteólisis limitada. El factor VIIa también convertirá el factor IX en el factor IXa en presencia de factor tisular y calcio. El factor VII es una glicoproteína dependiente de vitamina K que consiste en 406 residuos de aminoácido (PM 50 kDalton). El factor VII se produce o bien mediante extracción convencional a partir de plasma humano donado o bien, más recientemente, usando sistemas recombinantes. Novo Nordisk usa células de riñón de cría de hámster (BHK) para la producción de NovoSeven®. Se expresa como proteína monocatenaria de 406 aminoácidos con un peso molecular nominal de 55 kDa (Thim, L. et al., Biochemistry 27: 7785-7793 (1988). La molécula lleva cuatro cadenas laterales de hidrato de carbono. Dos cadenas laterales de hidrato de carbono unidas a O en Ser 52, 60 y dos cadenas laterales de hidrato de carbono unidas a N en Asn 145, 322 (Thim, L. et al., Biochemistry 27: 7785-7793 (1988).

El factor VIII participa en la cascada de coagulación sanguínea intrínseca de proteinasas y sirve como cofactor en la reacción del factor IXa que convierte el factor X en la forma activa, factor Xa, que en última instancia conduce a la formación de un coágulo de fibrina. Una carencia o la inestabilidad del factor VIII conduce a hemofilia A, un trastorno de la coagulación ligado al cromosoma x recesivo común. La frecuencia de la hemofilia A es de 1-2 en 10.000 nacimientos de varones en todos los grupos étnicos. Los pacientes o bien expresan niveles de factor VIII muy por debajo de los normales o bien pertenecen al denominado grupo de pacientes positivos para mrc (material de reacción cruzada) (aproximadamente el 5% de los pacientes) que tienen una cantidad considerable de factor VIII en su plasma (al menos el 30% de la normal), pero la proteína no es funcional. Aproximadamente el 50% de todos los pacientes tienen hemofilia A grave con una actividad del factor VIII de menos del 1% de la normal; tienen hemorragias espontáneas frecuentes en articulaciones, músculos y órganos internos.

La hemofilia A leve, que se produce en el 30-40% de los pacientes, está asociada con una actividad del 5-30% de la normal. La hemorragia se produce sólo tras una cirugía o un traumatismo significativos. La hemofilia A moderadamente grave se produce en aproximadamente el 10% de los pacientes; en este caso, la actividad del factor VIII es del 2-5% de la normal, y la hemorragia se produce tras un traumatismo menor. La semivida in vivo humana de factor VIII es de habitualmente 10-15 horas pero no se ha indicado que la cinética de liberación, estabilidad y degradación esté también influenciada por otro factor, el factor de van Willebrand.

El factor VIII se produce o bien mediante extracción convencional a partir de plasma humano donado o bien, más recientemente, usando sistemas recombinantes. Bayer usa células de riñón de cría de hámster (BHK) para la producción de Kogenate, mientras que Baxter usa células de ovario de hámster chino (CHO) para su producto Recombinate, como proteína monocatenaria completa de 2351 aminoácidos con un peso molecular nominal de 267 kDa (Toole et al., 1984, Nature 312: 342) o en diferente versiones, en la que el dominio B completo o partes del mismo se delecionan con el fin de tener un producto que es más estable y proporciona un rendimiento superior en producción (Bhattacharyya et al. 2003, CRIPS 4/3: 2-8). El producto de precursor se procesa para dar dos cadenas polipeptídicas de 200 y 80 kDa en el aparato de Golgi y las dos cadenas que se mantienen juntas mediante ión/iones metálico(s) se expresan en la sangre (Kaufman et al., 1988, J. Biol. Chem., 263: 6352).

La actividad procoagulante requiere escisión por trombina adicional para producir fragmentos de 54 kDa y 44 kDa de la cadena pesada más un fragmento de cadena ligera de 72 kDa (Aly et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 4933). En concentrados de factor VIII derivados de plasma humano, se han descrito por tanto varias formas de factor VIII completamente activas fragmentadas (Anderson et al., 1986, Proc. Natl. Acad, Sci. 83: 2979).

Un efecto secundario común de la administración de factor VIII plasmático o recombinante son reacciones inmunológicas en un número bastante grande de pacientes (hasta el 30%), que disminuyen el valor terapéutico. En el pasado, se iniciaron varios intentos de producir tolerancia en los pacientes mediante inducción de tolerancia oral pero los resultados no fueron demasiado esperanzadores. Se han propuesto nuevos medios genéticos de inducción de tolerancia pero aún no han encontrado una aplicación extendida. Se espera que una proteína hesilada tenga un grado inferior de inmunogenicidad y por tanto pueda reducir esta complicación.

El factor VIII es muy rico en residuos de lisina (más de 220 de los 2350 aminoácidos en total; véase el anexo 1), que podrían usarse para el enfoque de aminación reductora.

El factor IX es una proteína plasmática dependiente de vitamina K que participa en la ruta intrínseca de la coagulación sanguínea convirtiendo el factor X en su forma activa en presencia de iones Ca (2+), fosfolípidos y factor VIIIa. El factor IX es una glicoproteína con una masa molecular aproximada de 55.000 Da que consiste en 415 aminoácidos en una única cadena (Yoshitake S. et al., Biochemistry 24: 3736-3750 (1985)). El factor IX se produce o bien mediante extracción convencional a partir de plasma humano donado o bien, más recientemente, usando sistemas recombinantes. Wyeth usa células de ovario de hámster chino (CHO) para la producción de BeneFIX®.

Tiene una secuencia de aminoácidos primaria que es idéntica a la forma alélica Ala 148 del factor IX derivado del plasma, y tiene características estructurales y funcionales similares a las del factor IX endógeno. La proteína lleva ocho cadenas laterales de hidrato de carbono. Seis cadenas laterales de hidrato de carbono unidas a O en Ser 53, 61 y en treonina 159, 169, 172, 179 y dos cadenas laterales de hidrato de carbono unidas a N en Asn 157, 167 (Yoshitake S. et al., Biochemistry 24: 3736-3750 (1985); Balland A. et al., Eur J Biochem. 1988; 172 (3): 565-72).

El factor estimulante de las colonias de granulocitos y macrófagos humano (hGM-CSF) es un factor de actuación temprana esencial para la regulación y diferenciación de células progenitoras hematopoyéticas así como para la estimulación de la activación funcional de poblaciones de células maduras. Se ha clonado y expresado en células de levaduras, bacterias, insectos, vegetales y de mamíferos, dando como resultado una proteína que varía en estructura, composición, semivida sérica y funciones in vivo (Donahue, R. E.; Wang, E. A.; Kaufman, R. J.; Foutch, L.; Leary, A. C.; Witek-Giannetti, J. S.; Metzeger, M.; Hewick, R. M.; Steinbrink, D. R.; Shaw, G.; Kamen, R.; Clark, S.

C. Effects of N-linked carbohydrates on the in vivo properties of human GM-CSF. Cold Spring Harbor Sump. Quant. Biol. 1986, 51, págs. 685-692). hGM-CSF natural y derivado de células de mamífero es una proteína de 127 aminoácidos y contiene tanto N- como O-glicanos. Es altamente heterogénea debido a los diferentes estados de ocupación de uno o dos sitios de N-glicosilación y el/los sitio(s) de O-glicosilación (Cebon, J.; Nicola, N.; Ward, M.; Gardner, I.; Dempsey, P.; Layton, J.; Dürhrsen, U.; Burgess, A.; Nice, E.; Morstyn, G. Granulocyte-macrophage colony stimulating factor from human lymphocytes. The effect of glycosylation on receptor binding and biological activity. J Biol. Chem. 1990, 265, 4483-4491; Kaushansky, K.; O’Hara, P. J.; Hart, C. E.; Forstran, J. W.; Hagen, F. S. Role of carbohydrate in the function of human Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor. Biochemishy 1987, 26, págs. 4861-4867; Armitage, J. O.; Emerging applications of recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Blood 1998, 92, págs. 4491-4508). Esta linfocina es de interés clínico debido a su potencial en el tratamiento de leucemia mieloide y su capacidad para estimular la producción de granulocitos y macrófagos en pacientes que padecen inmunodeficiencia o que se suprimen por enfermedad o radiación y/o quimioterapia (revisado por Moonen, P.; Mermod, J.J.; Ernst, J.F.; Hirschi, M.; DeLamarter, J.F. Increased biological activity of deglycosilated recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor produced by yeast or animal cells. Proc. Natl. Acad. Sci. US. 1987, 84, págs. 4428-4431). Varios estudios han sugerido que hGM-CSF que carece de hidrato de carbono unido a N tiene una actividad específica significativamente superior in vitro en comparación con la citocina recombinante nativa (Armitage, J. O.; Emerging applications of recombinant human granulocyte-macrophage colonystimulating factor. Blood 1998, 92, págs. 4491-4508; Okamoto, M.; Nakai, M.; Nakayama, C.; Yanagi, H.; Matsui, H.; Noguchi, H.; Namiki, M.; Sakai, J.; Kadota, K.; Fukui, M.; Hara, H. Purification and characterization of three forms of diferentely glycosilated recombinant human Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor. Arch. Biochem. Biophys. 1991, 286, págs. 562-568; Hovgaard, D.; Mortensen, B. T.; Schifter, S.; Nissen, N. I. Clinical pharmacokinetic studies of a human haemopoietic growth factor, GM-CSF. Eur. J. Clin. Inv. 1992, 22, págs. 45-49). Sin embargo, hay numerosas pruebas que apoyan el papel clave de las cadenas de hidrato de carbono en las funciones de hGM-CSF, tales como farmacocinética (Cebon, J.; Nicola, N.; Ward, M.; Gardner, I.; Dempsey, P.; Layton, J.; Dürhrsen, U.; Burgess, A.; Nice, E.; Morstyn, G. Granulocyte-macrophage colony stimulating factor from human lymphocytes. The effect of glicosilation on receptor binding and biological activity. J. Biol. Chem. 1990, 265, págs. 4483-4491; Hovgaard, D.; Mortensen, B. T.; Schifter, S.; Nissen, N. I. Clinical pharmacokinetic studies of a human haemopoietic growth factor, GM-CSF. Eur. J. Clin. Inv. 1992, 22, págs. 45-49; Denzlinger, C.; Tetzloff, W.; Gerhartz, H. H., Pokorny, R.; Sagebiel, S.; Haberl, C.; Wilmanns, W. Diferenteial activation of the endogenous leukotriene biosynthesis by two different preparations of Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor in healthy volunteers. Blood 1993, 81, págs. 2007-2013), toxicidad (Denzlinger, C.; Tetzloff, W.; Gerhartz, H. H., Pokorny, R.; Sagebiel, S.; Haberl, C.; Wilmanns, W. Diferenteial activation of the endogenous leukotriene biosynthesis by two different preparations of Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor in healthy volunteers. Blood 1993, 81, págs. 2007-2013) e inmunogenicidad (Donahue, R. E.; Wang, E. A.; Kaufman, R. J.; Foutch, L.; Leary, A. C.; Witek-Giannetti, J. S.; Metzeger, M.; Hewick, R. M.; Steinbrink, D. R.; Shaw, G.; Kamen, R.; Clark, S. C. Effects de N-linked carbohydrates on the in vivo properties of human GM-CSF. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1986, 51, págs. 685-692; Revoltella, R.; Laricchia-Robbio, L.; Moscato, S.; Genua, A.; Liberati, A Natural and therapy-induced anti-GM-CSF and anti-G-CSF antibodies in human serum. Leukemia and Lymphoma1997, 26, págs. 29-34; Ragnhammar, P.; Friesen, H-J.; Frödin, J-E.; Lefvert, A-K.; Hassan, M.; Österborg, A.; Mellstedt, H. Induction of anti-recombinant human Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor (Escherichia coli-derived) antibodies and clinical effects in nonimmunocompromised patients. Blood 1994, 84, págs. 4078-4087; Wadhwa, M.; Hjelm Skog, A-L.; Bird, C.; Ragnhammar, P.; Lilljefors, M.; Gaines-Das, R.; Mellstedt, H.; Thorpe, R. Immunogenicity of Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor (GM-CSF) products in patients undergoing combination therapy with GM-CSF. Clinical Cancer Research 1999, 5, págs. 1351-1361; Gribben, J.G.; Devereix, S.; Thomas, N. S. B.; Keim, M.; Jones, H. M.; Goldstone, A. H.; Linch, D. C. Development of antibodies to unprotected glicosilation sites on recombinant GMCSF. Lancet 1990, 335, págs. 434-437). En vista de la antigenicidad que se ha notificado frecuentemente para productos clínicos de GM-CSF a partir de E. coli y a partir de levaduras, se sugiere que la estrategia de modificación química representa un enfoque prometedor para este producto incluyendo los fabricados a partir de sistemas de expresión no mamíferos. Están disponibles preparaciones de GM-CSF con los nombres Leukine (Immunex) y Leucomax (Novartis). Se usa GM-CSF en reconstitución mieloide tras trasplante de médula ósea, fallo o retraso del injerto de trasplante de médula ósea, movilización y tras trasplante de células progenitoras de sangre periférica autólogas, y tras quimioterapia de inducción en adultos más ancianos con leucemia mielógena aguda.

Alfa I-antitripsina (A1AT, también denominada inhibidor de alfa l-proteinasa) es un inhibidor de proteinasa que se ha mostrado que inhibe prácticamente todas las serina proteinasas de mamíferos (Travis Ann. Rev. Biochem. 52 (1983)

p.

655) incluyendo neutrófilo elastasa, trombina, factores Xa y XIa. A1AT es una glicoproteína monocatenaria sintetizada en el hígado con 394 aminoácidos y un peso molecular de 53 kD. La concentración plasmática está dentro de un intervalo de 1-1,3 g/l. La presencia de sólo una cisteína en toda la proteína no permite la formación de puentes disulfuro intramoleculares. La molécula lleva tres cadenas laterales de hidrato de carbono (Asn 46, 83, 247) (Mega J. Biol. Chem. 255 (1980) p. 4057; Mega J. Biol. Chem. 255 (1980) p. 4053; Carell FEBS Letters 135 (1981)

p.

301; Hodges Biochemistry 21 (1982) p. 2805) que representan el 12% del peso molecular. Se descubrieron dos tipos de cadenas de hidrato de carbono que tienen una estructura bi o triantenaria, respectivamente (Hodges J. Biol. Chem. 254 (1979) p. 8208). A1AT humana se produce en al menos veinte formas diferentes en la población general. Esta microheterogenicidad es un resultado de cantidades variables de los dos tipos de cadenas de hidrato de carbono. La función clave es el control de la actividad de neutrófilo elastasa (Travis Ann. Rev. Biochem. 52 (1983) p. 655). Una actividad no controlada de la elastasa conduce a un ataque sobre tejidos epiteliales con el resultado de daño irreparable. Durante el proceso de inactivación, A1AT actúa como sustrato para la elastasa uniéndose al centro activo de la proteasa que posteriormente se inactiva mediante esta formación de complejo. Una deficiencia de A1AT provoca por ejemplo enfisema pulmonar que está relacionado con un daño en el epitelio pulmonar. La distribución de los dos tipos de cadenas laterales de hidrato de carbono de A1AT en los tres sitios de N-glicosilación de A1AT es diferente para cada isotipo de A1AT. La producción clásica de A1AT se realiza en fraccionamiento de plasma humano usando diferentes etapas de cromatografía de afinidad. Sin embargo, un modo más reciente de producción de A I AT es el uso de técnicas recombinantes. PPL Therapeutics ha desarrollado un procedimiento que permite recuperar A1AT humana recombinante (rHA1AT) a partir de la leche de una oveja transgénica (Olman Biochem. Soc. Symp. 63 (1998) p. 141; Tebbutt Curr. Opin. Mol. Ther. 2 (2000) p. 199; Carver Cytotechnology 9 (1992) p. 77; Wright Biotechnology (NY) 9 (1991) p. 830). Con respecto a la parte de proteína de la molécula, la rhA1AT muestra una estructura idéntica en comparación con pdA1AT. Pero, como en el caso de otras proteínas humanas producidas recombinantes, se producen diferencias en las cadenas laterales de hidrato de carbono, especialmente con respecto a la cantidad de residuos de ácido siálico.

El activador de plasminógeno de tipo tisular (tPA) es una serina proteasa de tipo tripsina importante en la lisis de coágulos. En presencia de un coágulo de fibrina, tPA convierte el plasminógeno en plasmina, que degrada la fibrina. TPA presenta actividad potenciada en presencia de fibrina y, como resultado, provoca la activación del plasminógeno específica de fibrina (M. W. Spellman, L.J. Basa, C.K. Leonard, J.A. Chakel, J.V. O’Connor, The Journal of Biological Chemistry 264 (1989) p. 14100). La plasmina solubiliza la fibrina, produciendo productos de degradación de fibrina. A través de un mecanismo de retroalimentación positiva, la fibrina potencia su propia degradación estimulando la activación del plasminógeno mediada por tPA (R.J. Stewart et al. The Journal of Biological Chemistry 275 (2000) págs. 10112-10120). htPA es un activador fisiológico de la fibrinolisis, que está presente en diferentes tipos de tejidos. Es una glicoproteína con un peso molecular de aproximadamente 68 kD. En forma nativa, tPA existe en una forma monocatenaria (activador de plasminógeno de tipo tisular monocatenario, sctPA), que puede convertirse por escisión de plasmina en el enlace peptídico Arg 275-Ile 276 en una estructura bicatenaria (activador de plasminógeno de tipo tisular bicatenario, tctPA). Para la terapia de fibrinolisis se produce recombinante como rtPA (activador de plasminógeno de tipo tisular recombinante). Existen diferentes tipos de tPA que muestran diferencias estructurales en la estructura de hidratos de carbono. tPA de tipo I tiene oligosacáridos unidos a N en los aminoácidos Asn117, Asn184 y Asn448. tPA de tipo II está glicosilado en Asn117 y Asn448. Ambos tipos contienen un residuo de fucosa unido a O en Thr61 (K. Mori et al. The Journal of Biological Chemistry 270 (1995) págs. 3261-3267). Se investigó la estructura de hidratos de carbono de tPA expresado en células CHO, mostrando una gran variedad de estructuras di-, tri- y tetraantenarias de las cadenas de azúcar (M. W. Spellman,

L.J. Basa, C.K. Leonard, J.A. Chakel, J.V. O’Connor, The Journal of Biological Chemistry 264 (1989) p. 14100). La estructura primaria de tPA contiene varias cisteínas, que se cree que están reticuladas más un residuo de cisteína libre en el sitio 83, que puede interaccionar con otro tPA, formando un dímero. Varios resultados indican que el aclaramiento in vivo de tPA se ve influenciado por la estructura de hidratos de carbono, particularmente por el oligosacárido con alto contenido en manosa unido en el sitio Asn117. Otro mecanismo de aclaramiento propuesto implica el reconocimiento del residuo de fucosa unido a O en Thr61 por un receptor de alta afinidad en hepatocitos. Este residuo está próximo a Cys83. Se desarrolló un tPA modificado por ingeniería biológica (TNK-tPA) para prolongar la semivida. El sitio de glicosilación en la posición 117 se cambió a la posición 103 sustituyendo la asparagina en el sitio 117 por glutamina y la treonina en el sitio 103 sustituida por asparagina. TNK-tPA es resistente a la inactivación por el inhibidor 1 de activador de plasminógeno debido a una sustitución de tetra-alanina en el dominio de proteasa (R.J. Stewart et al. The Journal of Biological Chemistry 275 (2000) págs. 10112-10120). TNKtpA está en el mercado como Tenecteplase® (Boehringer Ingelheim) y puede administrarse como un único bolo intravenoso, mientras que tPA tiene que administrarse como un bolo seguido por una infusión.

La proteína C activada (APC) es un modulador de la coagulación e inflamación asociada con septicemia grave. La proteína C activada se convierte a partir de su precursor inactivo (proteína C) por trombina acoplada a trombomodulina. Este complejo escinde un péptido de activación N-terminal corto de la cadena pesada de la proteína C, dando como resultado la proteína C activada. La drotrecogina alfa (activada) es una proteína C activada humana recombinante (rhAPC) con una secuencia de aminoácidos idéntica a la proteína C activada derivada del plasma y con propiedades similares. La proteína C activada se comercializa por Eli Lilly como Xigris®. Se produce en una línea celular humana (HEK293), en la que se introdujeron los vectores de expresión de proteína C. Se usó

esta línea celular particular debido a su capacidad para realizar la serie correcta de modificaciones postraduccionales complejas que se requieren para la actividad funcional. La proteína C activada humana recombinante es una glicoproteína bicatenaria que contiene 4 sitios de N-glicosilación y 12 enlaces disulfuro. La cadena pesada contiene 250 aminoácidos, de los cuales siete residuos son cisteína y tiene tres sitios de glicosilación unidos a N (Asn-248, Asn-313 y Asn-329). Los siete residuos de cisteína forman tres enlaces disulfuro dentro de la cadena pesada y un enlace disulfuro entre las cadenas. La cadena ligera contiene un sitio de glicosilación unido a N (Asn-97) y 17 residuos de cisteína, que forman ocho enlaces disulfuro dentro de la cadena ligera y un enlace disulfuro con la cadena pesada. Los primeros nueve ácidos glutámicos en la cadena ligera están gamma-carboxilados (Gla) y el ácido aspártico 71 está beta-hidroxilado. rhAPC tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a la proteína C activada derivada del plasma humana, pero difiere de esta última en su patrón de glicosilación. La proteína C activada es una proteasa que pertenece a la familia de serina proteasa y desempeña un papel principal en la regulación de la coagulación. Básica para la función antitrombótica de la proteína C activada es su capacidad para inhibir la función de la trombina. Además, la proteína C activada es un modulador importante de la inflamación asociada con septicemia grave. Inhibidores de serina proteasa endógenos son inhibidores naturales para proteína C activada, provocando que la proteína C activada tenga una semivida de actividad circulatoria muy corta (inferior a 30 min.) in vivo. El aclaramiento de la proteína C activada de la circulación está mediado por una combinación de al menos tres procesos incluyendo la inhibición de la actividad enzimática de la proteína C activada por inhibidores de proteasa endógenos, el aclaramiento de proteína C activada y/o complejos de proteína C activada-inhibidor de serina proteasa por órganos tales como el hígado y el riñón, y la degradación de proteína C activada y/o complejos de proteína C activada-inhibidor de serina proteasa por proteasas circulantes o tisulares. Estudios clínicos de fase I con infusión de 24 h a 24 !g/kg/h dieron como resultado una concentración plasmática en estado estacionario de 70 ng/ml. La semivida de rhAPC medida al final de una infusión era de 0,5-1,9 h. Las concentraciones de rhAPC plasmáticas cayeron por debajo del límite de detección de 10 ng/ml en el plazo de 2 h tras la terminación de la infusión. Debido a su corta semivida fisiológica y farmacocinética, la proteína C activada se infunde de manera continua a una determinada velocidad para mantener la concentración plasmática deseada en el uso clínico en la terapia de septicemia. Se realiza algún esfuerzo para mejorar el perfil farmacocinético de la proteína C activada. Por ejemplo D.T. Berg et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100 (2003) págs. 4423-4428, describen una variante modificada por ingeniería genética de proteína C activada con una semivida plasmática prolongada.

En el contexto de la presente invención, el término “hidroxialquilalmidón” (HAS) se refiere a un derivado de almidón que se ha sustituido con al menos un grupo hidroxialquilo. Un hidroxialquilalmidón preferido de la presente invención tiene una constitución según la fórmula (I)

en la que el extremo reductor de la molécula de almidón se muestra en forma no oxidada y la unidad de sacárido terminal se muestra en forma de acetal que, dependiendo de por ejemplo el disolvente, puede estar en equilibrio con la forma de aldehído.

El término hidroxialquilalmidón tal como se usa en la presente invención no se limita a compuestos en los que el resto de hidrato de carbono terminal comprende grupos hidroxialquilo R1, R2 y/o R3 tal como se representa, por motivos de brevedad, en la fórmula (I), sino que también se refiere a compuestos en los al menos un grupo hidroxilo presente en cualquier lugar, o bien en el resto de hidrato de carbono terminal y/o bien en la parte restante de la molécula de almidón, HAS’, está sustituido por un grupo hidroxialquilo R1, R2 o R3.

También es posible hidroxialquilalmidón que comprende dos o más grupos hidroxialquilo diferentes.

El al menos un grupo hidroxialquilo comprendido en HAS puede contener dos o más grupo hidroxilos. Según una realización preferida, el al menos un grupo hidroxialquilo comprendido en HAS contiene un grupo hidroxilo.

La expresión “hidroxialquilalmidón” también incluye derivados en los que el grupo alquilo está mono- o polisustituido. En este contexto, se prefiere que el grupo alquilo esté sustituido con un halógeno, especialmente flúor, o con un grupo arilo. Además, el grupo hidroxilo terminal de un grupo hidroxialquilo puede esterificarse o eterificarse.

Además, en lugar de alquilo, también pueden usarse grupos alqueno lineales o ramificados sustituidos o no sustituidos.

El hidroxialquilalmidón es un derivado de éter del almidón. Además de dichos derivados de éter, también pueden usarse otros derivados de almidón en el contexto de la presente invención. Por ejemplo, son útiles derivados que comprenden grupos hidroxilo esterificados. Estos derivados pueden ser por ejemplo derivados de ácidos mono- o dicarboxílicos no sustituidos con 2-12 átomos de carbono o de derivados sustituidos de los mismos. Especialmente útiles son derivados de ácidos monocarboxílicos no sustituidos con 2-6 átomos de carbono, especialmente derivados de ácido acético. En este contexto, se prefieren acetilalmidón, butirilalmidón y propinoilalmidón.

Además, se prefieren derivados de ácidos dicarboxílicos no sustituidos con 2-6 átomos de carbono.

En el caso de derivados de ácidos dicarboxílicos, es útil que el segundo grupo carboxilo del ácido dicarboxílico esté también esterificado. Además, derivados de ésteres monoalquílicos de ácidos dicarboxílicos son también adecuados en el contexto de la presente invención.

Para los ácidos mono- o dicarboxílicos sustituidos, los grupos sustitutos pueden ser preferiblemente los mismos que se mencionaron anteriormente para residuos de alquilo sustituidos.

Se conocen en la técnica técnicas para la esterificación de almidón (véase por ejemplo Klemm D. et al, Comprehensive Cellulose Chemistry vol. 2, 1998, Whiley-VCH, Weinheim, Nueva York, especialmente el capítulo 4.4, Esterification of Cellulose (ISBN 3-527-29489-9).

Según una realización preferida de la presente invención, se emplea hidroxialquilalmidón según la fórmula (I).

En la fórmula (I), el anillo de sacárido descrito explícitamente y el residuo indicado como HAS’ representan juntos la molécula de hidroxialquilalmidón preferida. Las otras estructuras de anillos de sacáridos comprendidas en HAS’ puede ser iguales que o diferentes del anillo de sacárido descrito explícitamente.

En lo que respecta a los residuos R1, R2 y R3 según la fórmula (I), no hay limitaciones específicas. Según una realización preferida, R1, R2 y R3 son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, un grupo hidroxiarilo, un grupo hidroxiaralquilo o a un grupo hidroxialcarilo que tiene de desde 2 hasta 10 átomos de carbono en el residuo de alquilo respectivo o un grupo (CH2CH2O)n-H, en el que n es un número entero, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. Se prefieren grupos hidrógeno e hidroxialquilo que tienen de desde 2 hasta 10. Más preferiblemente, el grupo hidroxialquilo tiene desde 2 hasta 6 átomos de carbono, más preferiblemente desde 2 hasta 4 átomos de carbono, e incluso más preferiblemente desde 2 hasta 4 átomos de carbono. “Hidroxialquilalmidón” comprende por tanto preferiblemente hidroxietilalmidón, hidroxipropilalmidón e hidroxibutilalmidón, prefiriéndose particularmente hidroxietilalmidón e hidroxipropilalmidón y siendo el hidroxietilalmidón el más preferido.

El grupo alquilo, arilo, aralquilo y/o alcarilo puede ser lineal o ramificado y opcionalmente puede estar adecuadamente sustituido.

Por tanto, la presente invención también se refiere a un método tal como se describió anteriormente en el que R1, R2 y R3 son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo lineal o ramificado con desde 1 hasta 6 átomos de carbono.

Por tanto, R1, R2 y R3 pueden ser preferiblemente hidroxihexilo, hidroxipentilo, hidroxibutilo, hidroxipropilo tal como 2hidroxipropilo, 3-hidroxipropilo, 2-hidroxiisopropilo, hidroxietilo tal como 2-hidroxietilo, hidrógeno y siendo el grupo 2hidroxietilo especialmente preferido.

Por tanto, la presente invención también se refiere a un método y un conjugado tal como se describió anteriormente en el que R1, R2 y R3 son independientemente hidrógeno o un grupo 2-hidroxietilo, siendo especialmente preferida una realización en la que al menos un residuo R1, R2 y R3 es 2-hidroxietilo.

El hidroxietilalmidón (HES) es el más preferido para todas las realizaciones de la presente invención.

Por tanto, la presente invención se refiere al método y el conjugado tal como se describió anteriormente, en el que el polímero es hidroxietilalmidón y el derivado de polímero es un derivado de hidroxietilalmidón.

El hidroxietilalmidón (HES) es un derivado de amilopectina que se produce de manera natural y se degrada por alfaamilasa en el cuerpo. HES es un derivado sustituido del polímero de hidrato de carbono amilopectina, que está presente en el almidón de maíz a una concentración de hasta el 95% en peso. HES presenta propiedades biológicas ventajosas y se usa como agente de reemplazo del volumen sanguíneo y en terapia de hemodilución en la práctica clínica (Sommermeyer et al., 1987, Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278; y Weidler et al., 1991, Arzneim.Forschung/Drug Res., 41, 494-498).

La amilopectina consiste en restos de glucosa, en la que en la cadena principal están presentes enlaces glicosídicos alfa-1,4 y en los sitios de ramificación se encuentran enlaces glicosídicos alfa-1,6. Las propiedades fisicoquímicas de esta molécula se determinan principalmente por el tipo de enlaces glicosídicos. Debido al enlace glicosídico alfa-1,4 mellado, se producen estructuras helicoidales con aproximadamente seis monómeros de glucosa por vuelta. Las propiedades fisicoquímicas así como bioquímicas del polímero pueden modificarse mediante sustitución. La introducción de un grupo hidroxietilo puede lograrse mediante hidroxietilación alcalina. Adaptando las condiciones de reacción, es posible aprovechar la diferente reactividad del grupo hidroxilo respectivo en el monómero de glucosa no sustituido con respecto a una hidroxietilación. Debido a este hecho, el experto puede influir en el patrón de sustitución en un grado limitado.

HES se caracteriza principalmente por la distribución de peso molecular y el grado de sustitución. Hay dos posibilidades de descripción del grado de sustitución:

1.

El grado de sustitución puede describirse en relación con la parte de monómeros de glucosa sustituidos con respecto a todos los restos de glucosa.

2.

El grado de sustitución puede describirse como la sustitución molar, en la que se describe el número de grupos hidroxietilo por resto de glucosa.

En el contexto de la presente invención, el grado de sustitución, indicado como DS (“degree of substitution”), se refiere a la sustitución molar, tal como se describió anteriormente (véase también Sommermeyer et al., 1987, Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278, tal como se mencionó anteriormente, en particular la p. 273).

Se presentan disoluciones de HES como composiciones polidispersas, en las que cada molécula difiere de la otra con respecto al grado de polimerización, el número y el patrón de sitios de ramificación y el patrón de sustitución. HES es, por tanto, una mezcla de compuestos con diferente peso molecular. En consecuencia, una disolución de HES particular se determina mediante el peso molecular promedio con la ayuda de medios estadísticos. En este contexto, Mn se calcula como la media aritmética dependiendo del número de moléculas. Alternativamente, Mw (o PM), la media de peso, representa una unidad que depende de la masa del HES.

En el contexto de la presente invención, el hidroxietilalmidón puede tener preferiblemente un peso molecular medio (media de peso) de desde 1 hasta 300 kD. El hidroxietilalmidón puede presentar además un grado de sustitución molar preferido de desde 0,1 hasta 3, preferiblemente de 0,1 a 2, más preferido, de 0,1 a 0,9, preferiblemente de 0,1 a 0,8, y una razón preferida entre sustitución C2:C6 en el intervalo de desde 2 hasta 20 con respecto a grupos hidroxietilo.

El término “peso molecular medio” tal como se usa en el contexto de la presente invención se refiere al peso tal como se determina según el método de LALLS-(dispersión de luz láser de ángulo bajo, “low angle laser light scattering”)-GPC tal como se describe en Sommermeyer et al., 1987, Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278; y Weidler et al., 1991, Arzneim.-Forschung/Drug Res., 41, 494-498. Para pesos moleculares medios de 10 kD y más pequeños, adicionalmente, la calibración se llevó a cabo con un patrón que se había cualificado previamente mediante LALLS-GPC.

Según una realización preferida de la presente invención, el peso molecular medio del hidroxietilalmidón empleado es de desde 1 hasta 300 kD, preferiblemente desde 2 hasta 200 kD, más preferiblemente de desde 3 hasta 100 kD, más preferiblemente de desde 4 hasta 70 kD.

Un ejemplo de HES que presenta un peso molecular medio de aproximadamente 130 kD es un HES con un grado de sustitución de 0,2 a 0,8 tal como 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 ó 0,8, preferiblemente de 0,4 a 0,7 tal como 0,4, 0,5, 0,6 ó 0,7.

Un ejemplo para HES con un peso molecular medio de aproximadamente 130 kD es Voluven® de Fresenius. Voluven® es un coloide artificial, empleado, por ejemplo, para el reemplazo del volumen usado en la indicación terapéutica para terapia y profilaxis de hipovolemia. Las características de Voluven® son un peso molecular medio de 130.000 +/- 20.000 D, una sustitución molar de 0,4 y una razón C2:C6 de aproximadamente 9:1.

Por tanto, la presente invención también se refiere a un método y a conjugados tal como se describió anteriormente en los que el hidroxialquilalmidón es hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de desde 4 hasta 100 kD, preferiblemente de 4 a 70 kD.

Intervalos preferidos del peso molecular medio son, por ejemplo, de 4 a 70 kD o de 10 a 70 kD o de 12 a 70 kD o de 18 a 70 kD o de 50 a 70 kD o de 4 a 50 kD o de 10 a 50 kDo de 12 a 50 kD o de 18 a 50 kD o de 4 a 18 kD o de 10 a 18 kD o 12 a 18 kD o de 4 a12 kD o de 10 a 12 kD o de 4 a 10 kD.

Según realizaciones particularmente preferidas de la presente invención, el peso molecular medio del hidroxietilalmidón empleado está en el intervalo de desde más de 4 kD y menos de 70 kD, tal como de aproximadamente 10 kD, o en el intervalo de desde 9 hasta 10 kD o desde 10 hasta 11 kD o desde 9 hasta 11 kD, o de aproximadamente 12 kD, o en el intervalo de desde 11 hasta 12 kD o desde 12 hasta 13 kD o desde 11 hasta 13 kD, o de aproximadamente 18 kD, o en el intervalo de desde 17 hasta 18 kD o desde 18 hasta 19 kD o desde 17 hasta 19 kD, o de aproximadamente 30 kD, o en el intervalo de desde 29 hasta 30, o desde 30 hasta 31 kD, o de aproximadamente 50 kD, o en el intervalo de desde 49 hasta 50 kD o desde 50 hasta 51 kD o desde 49 hasta 51 kD.

Como límite superior del grado de sustitución (DS) molar, son también posibles valores de hasta 3,0 tal como 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 ó 2,0, prefiriéndose valores de menos de 2,0, prefiriéndose más valores de menos de 1,5, prefiriéndose todavía más valores de menos de 1,0 tales como 0,7, 0,8 ó 0,9.

Por tanto, intervalos preferidos del grado de sustitución molar son de desde 0,1 hasta 2 o desde 0,1 hasta 1,5 o desde 0,1 hasta 1,0 o desde 0,1 hasta 0,9 o desde 0,1 hasta 0,8. Intervalos más preferidos del grado de sustitución molar son de desde 0,2 hasta 2 o desde 0,2 hasta 1,5 o desde 0,2 hasta 1,0 o desde 0,2 hasta 0,9 o desde 0,2 hasta 0,8. Intervalos todavía más preferidos del grado de sustitución molar son de desde 0,3 hasta 2 o desde 0,3 hasta 1,5

o desde 0,3 hasta 1,0 o desde 0,3 hasta 0,9 o desde 0,3 hasta 0,8. Intervalos incluso más preferidos del grado de sustitución molar son de desde 0,4 hasta 2 o desde 0,4 hasta 1,5 o desde 0,4 hasta 1,0 o desde 0,4 hasta 0,9 o desde 0,4 hasta 0,8.

En lo que respecta al grado de sustitución (DS), el DS es preferiblemente de al menos 0,1, más preferiblemente de al menos 0,2, y más preferiblemente de al menos 0,4. Intervalos preferidos de DS son de desde 0,1 hasta 0,8, más preferiblemente desde 0,2 hasta 0,8, más preferiblemente desde 0,3 hasta 0,8 e incluso más preferiblemente desde 0,4 hasta 0,8, todavía más preferiblemente desde 0,1 hasta 0,7, más preferiblemente desde 0,2 hasta 0,7, más preferiblemente desde 0,3 hasta 0,7 y más preferiblemente desde 0,4 hasta 0,7. Valores particularmente preferidos de DS son, por ejemplo, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 ó 0,8, prefiriéndose más 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 ó 0,8, prefiriéndose incluso más 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 ó 0,8, prefiriéndose todavía más 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 ó 0,8 y, por ejemplo, prefiriéndose particularmente 0,4 y 0,7.

En el contexto de la presente invención, un valor dado del grado de sustitución molar tal como 0,8 puede ser el valor exacto o puede entenderse que está en un intervalo de desde 0,75 hasta 0,84. Por tanto, por ejemplo, un valor dado de 0,1 puede ser el valor exacto de 0,1 o estar en el intervalo de desde 0,05 hasta 0,14, un valor dado de 0,4 puede ser el valor exacto de 0,4 o estar en el intervalo de desde 0,35 hasta 0,44, o un valor dado de 0,7 puede ser el valor exacto de 0,7 o estar en el intervalo de desde 0,65 hasta 0,74.

Combinaciones particularmente preferidas de peso molecular del hidroxialquilalmidón, preferiblemente hidroxietilalmidón, y su grado de sustitución DS son, por ejemplo, 10 kD y 0,4 ó 10 kD y 0,7 ó 12 kD y 0,4 ó 12 kD y 0,7 ó 18 kD y 0,4 ó 18 kD y 0,7 ó 30 kD y 0,4 ó 30 kD y 0,7 ó 50 kD y 0,4 ó 50 kD y0,7 ó 100 kD y0,7.

En lo que respecta a la razón de sustitución C2:C6, dicha sustitución está preferiblemente en el intervalo de desde 2 hasta 20, más preferiblemente en el intervalo de desde 2 hasta 15 e incluso más preferiblemente en el intervalo de desde 3 hasta 12.

Según una realización adicional de la presente invención, también pueden emplearse mezclas de hidroxietilalmidones que tienen diferentes pesos moleculares medios y/o diferentes grados de sustitución y/o diferentes razones de sustitución C2:C6. Por tanto, pueden emplearse mezclas de hidroxietilalmidones que tienen diferentes pesos moleculares medios y diferentes grados de sustitución y diferentes razones de sustitución C2:C6, o que tienen diferentes pesos moleculares medios y diferentes grados de sustitución y la misma o aproximadamente la misma razón de sustitución C2:C6, o que tienen diferentes pesos moleculares medios y el mismo o aproximadamente el mismo grado de sustitución y diferentes razones de sustitución C2:C6, o que tienen el mismo o aproximadamente el mismo peso molecular medio y diferentes grados de sustitución y diferentes razones de sustitución C2:C6, o que tienen diferentes pesos moleculares medios y el mismo o aproximadamente el mismo grado de sustitución y la misma o aproximadamente la misma razón de sustitución C2:C6, o que tienen los mismos o aproximadamente los mismos pesos moleculares medios y diferentes grados de sustitución y la misma o aproximadamente la misma razón de sustitución C2:C6, o que tienen el mismo o aproximadamente el mismo peso molecular medio y el mismo o aproximadamente el mismo grado de sustitución y diferentes razones de sustitución C2:C6, o que tienen aproximadamente el mismo peso molecular medio y aproximadamente el mismo grado de sustitución y aproximadamente la misma razón de sustitución C2:C6.

En diferentes conjugados y/o diferentes métodos según la presente invención, pueden emplearse diferentes hidroxialquilalmidones, preferiblemente diferente hidroxietilalmidones y/o diferentes mezclas de hidroxialquilalmidones, preferiblemente diferentes mezclas de hidroxietilalmidones.

Según una realización descrita, el grupo funcional Z de la proteína es un grupo aldehído o un grupo ceto. Por tanto, se describen un método y conjugados tal como se describió anteriormente, en los que el grupo funcional Z de la proteína es un grupo aldehído o un grupo ceto.

Aunque no hay restricciones generales en cuanto a la ubicación del grupo aldehído o ceto dentro de la proteína, el grupo aldehído o ceto está ubicado según una realización descrita en una cadena lateral de hidrato de carbono de la proteína. Por tanto, en el contexto de esta realización, se emplea una proteína glicosilada.

Como proteína glicosilada, se prefieren formas glicosiladas de IFN beta tal como IFN beta o IFN beta 1a humano natural, hGM-CSF derivado de células eucariotas o natural que contiene tanto N- como O-glicanos, proteína C activada humana recombinante (rhAPC) que es una glicoproteína bicatenaria que contiene 4 sitios de Nglicosilación, tPA humano (htPA) o tPA humano recombinante (rhtPA) tal como tPA de tipo I que tiene oligosacáridos unidos a N en los aminoácidos Asn117, Asn184 y Asn448 o tPA de tipo II que está glicosilado en Asn117 y Asn448, A1AT derivada del plasma o A1AT humana recombinante (pdA1AT o rhA1AT), AT III humana recombinante (rhAT III), factor VII, factor VIII y factor IX.

Se prefieren especialmente formas glicosiladas de IFN beta, AT III y GM-CSF.

En el contexto de la presente invención, el término “proteína glicosilada”, es decir, una proteína que tiene una “cadena lateral de hidrato de carbono” se refiere a proteínas que comprenden restos de hidrato de carbono tales como hidroxialdehídos o hidroxicetonas así como modificaciones químicas de los mismos (véase Römpp Chemielexikon, Thieme Verlag Stuttgart, Alemania, 9ª edición 1990, volumen 9, páginas 2281-2285 y la bibliografía mencionada en el mismo). Además, también se refiere a derivados de restos de hidrato de carbono que se producen de manera natural como galactosa, ácido N-acetilneurámico y N-acetilgalactosamina) y similares.

En una realización, el grupo aldehído o el grupo ceto es parte de un residuo de galactosa de la cadena lateral de hidrato de carbono. Este residuo de galactosa puede hacerse disponibles para la reacción con el grupo funcional A comprendido en el polímero o derivado de polímero mediante la eliminación de ácidos siálicos terminales, seguido por oxidación, tal como se describe a continuación en el presente documento.

Se describe además que el polímero o derivado de polímero que comprende el grupo funcional A está unido a un residuo de ácido siálico de las cadenas laterales de hidrato de carbono, preferiblemente el residuo de ácido siálico terminal de la cadena lateral de hidrato de carbono.

Puede realizarse la oxidación de restos de hidrato de carbono terminales o bien químicamente o bien enzimáticamente.

Se conocen en la técnica métodos para la oxidación química de restos de hidrato de carbono de polipéptidos e incluyen el tratamiento con peryodato (Chamow et al., 1992, J. Biol. Chem., 267, 15916-15922).

Mediante oxidación química, es posible en principio oxidar cualquier resto de hidrato de carbono, esté colocado de manera terminal o no. Sin embargo, eligiendo condiciones de reacción suaves es posible oxidar preferiblemente el ácido siálico terminal de una cadena lateral de hidrato de carbono para dar el grupo aldehído o el grupo ceto.

Según una realización descrita a continuación en el presente documento, dichas condiciones de reacción suaves se refieren a hacer reaccionar la proteína con una disolución de peryodato acuosa adecuada, que tiene una concentración de peryodato preferida en el intervalo de desde 1 hasta 50 mM, más preferiblemente de desde 1 hasta 25 mM y de manera especialmente preferible de desde 1 hasta 10 mM tal como de aproximadamente 1 mM, y a una temperatura de reacción preferida de desde 0 hasta 40ºC y de manera especialmente preferible de desde 0 hasta 21ºC tal como de aproximadamente 0ºC, y durante un tiempo de reacción preferido de desde 5 min. hasta 5 h, más preferiblemente desde 10 min. hasta 2 h y de manera especialmente preferible desde 10 min. hasta 1 h tal como de aproximadamente 1 h. La razón molar preferida de peryodato:proteína es de desde 1:200 hasta 1:1 y más preferiblemente desde 1:50 hasta 1:5. tal como aproximadamente 15:1.

Por tanto, se describen un método y un conjugado tal como se describió anteriormente, en el que, antes de la reacción de la proteína y el polímero o derivado de polímero, se hace reaccionar una proteína glicosilada con una disolución de peryodato para dar una proteína que tiene un grupo aldehído o un grupo ceto ubicado en la cadena lateral de hidrato de carbono oxidada, llevándose a cabo preferiblemente dicha reacción en reacciones de oxidación suaves. El término “condiciones de reacción suaves” tal como se usa en este contexto se refiere a, por ejemplo, una disolución de peryodato 1 mM y una temperatura de reacción de 0ºC en contraposición a condiciones duras tales como una disolución de peryodato 10 mM y una temperatura de reacción de 20 a 25ºC.

Alternativamente, la cadena lateral de hidrato de carbono puede oxidarse enzimáticamente. Se conocen en la técnica enzimas para la oxidación de la cadena lateral de hidrato de carbono individual, por ejemplo en el caso de galactosa la enzima es galactosa oxidasa. Si se pretende oxidar restos de galactosa terminales, será necesario finalmente eliminar ácidos siálicos terminales (parcial o completamente) si el polipéptido se ha producido en células que pueden unir ácido siálicos a cadenas de hidrato de carbono, por ejemplo en células de mamífero o en células que se han modificado genéticamente para que puedan unir ácido siálicos a cadenas de hidrato de carbono. Se conocen en la técnica métodos químicos o enzimáticos para la eliminación de ácido siálicos (Chaplin y Kennedy (eds.), 1996, Carbohydrate Analysis: a practical approach, especialmente el capítulo 5 Montreuill, Glycoproteins, páginas 175-177; IRL Press Practical approach series (ISBN 0-947946-44-3)).

Se describe además que el grupo aldehído o grupo ceto puede estar ubicado en el extremo N-terminal de la proteína y es accesible por oxidación adecuada. Especialmente en el caso de que un aminoácido que contiene grupo hidroxilo esté ubicado en el extremo N-terminal de la proteína en la posición -1, tal como treonina o serina, puede llevarse a cabo la oxidación de dicho aminoácido N-terminal conduciendo a dicho grupo ceto o un grupo aldehído, preferiblemente un grupo aldehído. Como método para la oxidación química del aminoácido N-terminal adecuado, puede aplicarse cualquier método concebible, prefiriéndose la oxidación con peryodato, prefiriéndose especialmente condiciones de oxidación suaves.

Según una realización adicional descrita a continuación en el presente documento, dichas condiciones de reacción suaves se refieren a hacer reaccionar la proteína con una disolución de peryodato acuosa adecuada, que tiene una concentración de peryodato preferida en el intervalo de desde 1 hasta 50 mM, más preferiblemente de desde 1 hasta 25 mM y de manera especialmente preferible de desde 1 hasta 10 mM tal como de aproximadamente 1 mM, y a una temperatura de reacción preferida de desde 0 hasta 40ºC y de manera especialmente preferible de desde 0 hasta 21ºC tal como de aproximadamente 0ºC, y durante un tiempo de reacción preferido de desde 5 min. hasta 5 h, más preferiblemente desde 10 min. hasta 2 h y de manera especialmente preferible desde 10 min. hasta 1 h tal como de aproximadamente 1 h. La razón molar preferida de peryodato:proteína es de desde 1:200 hasta 1:1 y más preferiblemente desde 1:50 hasta 1:5, tal como de aproximadamente 15:1.

Por tanto, se describen además un método y un conjugado tal como se describió anteriormente, en el que el grupo aldehído o el grupo ceto está ubicado en una cadena lateral de hidrato de carbono de la proteína y/o en el grupo Nterminal de la proteína.

El patrón de oligosacáridos de proteínas producidas en células eucariotas que por tanto se han glicosilado postraduccionalmente, no es idéntico a las proteínas derivadas de seres humanos. Además, muchas proteínas glicosiladas no tienen el número deseado de residuos de ácido siálico terminales que enmascaran un resto de hidrato de carbono adicional tal como un residuo de galactosa. Sin embargo, los restos de hidrato de carbono adicionales tales como un residuo de galactosa, si no están enmascarados, son posiblemente responsables de desventajas tales como una semivida plasmática más corta de la proteína en posibles usos de la proteína como medicamento. Se encontró sorprendentemente que proporcionando un conjugado de proteína formado por un polímero de hidroxialquilalmidón, preferiblemente un polímero de hidroxietilalmidón, que está unido covalentemente, por ejemplo mediante un enlace oxima tal como se da a conocer a continuación en el presente documento, a un resto de hidrato de carbono de una cadena lateral de hidrato de carbono de la proteína, o bien directamente o bien por medio de al menos un compuesto de ligador tal como uno o dos compuestos de ligador, es posible superar al menos la desventaja mencionada anteriormente. Por tanto, se cree que acoplando un polímero de hidroxialquilalmidón o derivado del mismo, preferiblemente un polímero de hidroxietilalmidón o un derivado del mismo, a al menos una cadena lateral de hidrato de carbono de una proteína glicosilada, se compensa la carencia de residuos de hidrato de carbono terminales adecuados ubicados en una cadena lateral de hidrato de carbono. Según otro aspecto de la invención, dotar al conjugado respectivo de un polímero de hidroxialquilalmidón o derivado del mismo, preferiblemente un polímero de hidroxietilalmidón o un derivado del mismo, acoplado al resto de hidrato de carbono oxidado tal como se describió anteriormente, no sólo compensa la desventaja sino que proporciona un conjugado de proteína que tiene mejores características en el campo de uso deseado que la respectiva proteína que se produce de manera natural. Por tanto, los respectivos conjugados según la invención tienen un efecto de compensación e incluso un efecto sinérgico sobre la proteína. También es posible que incluso proteínas que son idénticas a proteínas humanas o que son proteínas humanas no tengan el número deseado de residuos de hidrato de carbono terminales de enmascaramiento adecuados tales como residuos de ácido siálico en restos de hidrato de carbono que se producen de manera natural. En tales casos, dotar al conjugado respectivo de un polímero de hidroxialquilalmidón o derivado del mismo, preferiblemente un polímero de hidroxietilalmidón o un derivado del mismo, acoplado al resto de hidrato de carbono oxidado tal como se describió anteriormente, no solo supera y compensa una desventaja de una proteína producida artificialmente, sino que mejora las características de la proteína natural que se produce de manera natural. En cuanto al grupo funcional del hidroxialquilalmidón, preferiblemente hidroxietilalmidón, o un derivado del mismo, que se acopla al grupo aldehído o grupo ceto del resto de hidrato de carbono oxidado de la proteína, se hace referencia a los grupos funcionales A tal como se dan a conocer a continuación en el presente documento. Este concepto general no sólo puede aplicarse a G-CSF glicosilado, sino principalmente a todas las proteínas glicosiladas que tienen dicha carencia de residuos de hidrato de carbono terminales. Entre otras, pueden mencionarse eritropoyetina (EPO), interferón beta 1a (IFN beta 1a), ATIII, factor VIII, alfa I-antitripsina (A1AT), htPA o GM-CSF.

Por tanto, se describe además el uso de hidroxialquilalmidón, preferiblemente hidroxietilalmidón, o un derivado del mismo, para compensar la carencia de residuos de hidrato de carbono terminales, preferiblemente residuos de ácido siálico, en restos de hidrato de carbono unidos postraduccionalmente o que se producen de manera natural de una proteína, acoplando covalentemente el almidón o derivado del mismo a al menos un resto de hidrato de carbono oxidado de una proteína que tiene al menos un grupo ceto o aldehído.

Por consiguiente, también se describe un método para compensar la carencia de residuos de hidrato de carbono terminales, preferiblemente residuos de ácido siálico, en restos de hidrato de carbono unidos postraduccionalmente

o que se producen de manera natural de una proteína, acoplando covalentemente hidroxialquilalmidón, preferiblemente hidroxietilalmidón, o un derivado del mismo a al menos un resto de hidrato de carbono oxidado de una proteína que tiene al menos un grupo ceto o aldehído, preferiblemente por medio de un enlace oxima.

Además, se describe un conjugado formado por enlace covalente de un hidroxialquilalmidón, preferiblemente

5 hidroxietilalmidón, o un derivado del mismo, a al menos un resto de hidrato de carbono oxidado de una proteína, estando dicha proteína o bien aislada de fuentes naturales o bien producida mediante expresión en células eucariotas, tales como células de mamíferos, de insectos o de levaduras, teniendo dicho resto de hidrato de carbono al menos un grupo ceto o aldehído, en el que el conjugado tiene en el campo de uso deseado, preferiblemente el uso como medicamento, las mismas o mejores características que la respectiva proteína no modificada.

10 En el caso de que el grupo funcional Z de la proteína sea un grupo aldehído o un grupo ceto, el grupo funcional A del polímero o el derivado del mismo comprende un grupo amino según la estructura -NH-.

Por tanto, se describe además un método y un conjugado tal como se describió anteriormente en el que el grupo 15 funcional A que puede hacerse reaccionar con el extremo reductor opcionalmente oxidado del polímero comprende un grupo amino según la estructura -NH-.

Además, este grupo funcional A es un grupo que tiene la estructura R’-NH-en la que R’ es hidrógeno o un residuo alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, arilcicloalquilo, alcarilo o cicloalquilarilo en el que el residuo cicloalquilo, arilo, 20 aralquilo, arilcicloalquilo, alcarilo o cicloalquilarilo puede unirse directamente al grupo NH o, según otra realización, puede unirse mediante un puente de oxígeno al grupo NH. Los residuos alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, arilcicloalquilo, alcarilo o cicloalquilarilo pueden estar sustituidos adecuadamente. Como sustituyentes preferidos,

pueden mencionarse halógenos tales como F, Cl o Br. Residuos de R’ especialmente preferidos son grupos

hidrógeno, alquilo y alcoxilo, e incluso más preferidos son grupos hidrógeno y alcoxilo y alquilo no sustituidos.

25 Entre los grupos alquilo y alcoxilo, se prefieren grupos con 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 átomos de C. Más preferidos son grupos metilo, etilo, propilo, isopropilo, metoxilo, etoxilo, propoxilo e isopropoxilo. Especialmente se prefieren metilo, etilo, metoxilo, etoxilo, y se les da preferencia particular a metilo o metoxilo.

30 Por tanto, se describen un método y un conjugado tal como se describen anteriormente en los que R’ es hidrógeno o un grupo metilo o metoxilo.

Además, el grupo funcional A tiene la estructura R’-NH-R”-en la que R” comprende preferiblemente la unidad estructural -NH- y/o la unidad estructural -(C=G)- en la que G es O o S, y/o la unidad estructural -SO2-. Según 35 realizaciones más preferidas, el grupo funcional R” se selecciona del grupo que consiste en

en los que, si G está presente dos veces, es independientemente O o S.

45 Por tanto, grupos funcionales A preferidos que comprenden un grupo amino -NH2, son, por ejemplo, H2N-

en los que G es O o S y, si está presente dos veces, independientemente O o S, y R’ es metilo.

Grupos funcionales A especialmente preferidos que comprenden un grupo amino son grupos aminooxilo

prefiriéndose particularmente H2N-O-, y el grupo hidrazido

en el que G es preferiblemente O.

Por tanto, se describe además un método tal como se describió anteriormente, en el que el grupo funcional Z de la proteína es un grupo aldehído o un grupo ceto, y el grupo funcional A es un grupo aminooxilo o un grupo hidrazido. Según una realización especialmente preferida de la presente invención, A es un grupo aminooxilo.

Por tanto, también se describe un conjugado, tal como se describió anteriormente, en el que el grupo funcional Z de la proteína es un grupo aldehído o un grupo ceto, y el grupo funcional A es un grupo aminooxilo o un grupo hidrazido. Según una realización descrita A es un grupo aminooxilo.

Cuando se hace reaccionar el grupo aminooxilo del polímero o derivado de polímero con el grupo aldehído o el grupo ceto de la proteína, se forma un enlace de oxima.

Por tanto, también se describe un conjugado tal como se describió anteriormente, en el que el enlace covalente entre la proteína y el polímero o derivado de polímero es un enlace de oxima formado mediante la reacción del grupo funcional Z de la proteína, siendo dicho grupo funcional Z un grupo aldehído o un grupo ceto, y el grupo funcional A del polímero o derivado de polímero, siendo dicho grupo funcional A un grupo aminooxilo.

Cuando se hace reaccionar el grupo hidrazido del polímero o derivado de polímero con el grupo aldehído o el grupo ceto de la proteína, se forma un enlace de hidrazona.

Por tanto, se describe un conjugado tal como se describió anteriormente, en el que el enlace covalente entre la proteína y el polímero o derivado de polímero es un enlace de hidrazona formado mediante la reacción del grupo funcional Z de la proteína, siendo dicho grupo funcional Z un grupo aldehído o un grupo ceto, y el grupo funcional A del polímero o derivado de polímero, siendo dicho grupo funcional A un grupo hidrazido.

Con el fin de introducir el grupo funcional A en el polímero, no existen restricciones específicas dado que resulta un derivado de polímero que comprende el grupo funcional A.

Además se describe que el grupo funcional A se introduce en el polímero haciendo reaccionar el polímero con un compuesto al menos bifuncional, del que un grupo funcional puede hacerse reaccionar con al menos un grupo funcional del polímero, y siendo al menos otro grupo funcional del compuesto al menos bifuncional, el grupo funcional A o pudiendo modificarse químicamente para dar el grupo funcional A.

Además se describe que el polímero se hace reaccionar con el compuesto al menos bifuncional en su extremo reductor opcionalmente oxidado.

En el caso de que se haga reaccionar el polímero con su extremo reductor no oxidado, el polímero preferiblemente tiene la constitución

en la que en fórmula (I), se incluye la forma aldehído del extremo reductor no oxidado.

En el caso de que se haga reaccionar el polímero con su extremo reductor oxidado, el polímero preferiblemente tiene la constitución según la fórmula (IIa)

10 y/o según la fórmula (IIb)

La oxidación del extremo reductor del polímero, preferiblemente hidroxietilalmidón, puede llevarse a cabo según 15 cada método o combinación de métodos lo que da como resultado compuestos que tienen las estructuras (IIa) y/o (IIb) mencionadas anteriormente.

Aunque la oxidación puede llevarse a cabo según cualquier método o todos los métodos adecuados que dan como resultado el extremo reductor oxidado de hidroxialquilalmidón, preferiblemente se lleva a cabo usando una disolución 20 de yodo alcalina tal como se describe, por ejemplo, en el documento DE 196 28 705 A1 cuyos respectivos contenidos (ejemplo A, columna 9, líneas de 6 a 24) se incorporan en el presente documento como referencia.

Como grupo funcional del compuesto al menos bifuncional que puede hacerse reaccionar con el extremo reductor opcionalmente oxidado del polímero, puede usarse cada grupo funcional que pueda formar un enlace químico con el 25 extremo reductor opcionalmente oxidado del hidroxialquilalmidón.

Según una realización preferida de la presente invención, este grupo funcional comprende la estructura química -NH-.

30 Por tanto, además se describen un método y un conjugado tal como se describen anteriormente en los que el grupo funcional del compuesto al menos bifuncional, pudiendo hacerse reaccionar dicho grupo funcional con el extremo reductor opcionalmente oxidado del polímero, comprende la estructura -NH-.

Además se describe que este grupo funcional del compuesto al menos bifuncional es un grupo que tiene la 35 estructura R’-NH-en la que R’ es hidrógeno o un residuo alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, arilcicloalquilo, alcarilo

o cicloalquilarilo en el que el residuo cicloalquilo, arilo, aralquilo, arilcicloalquilo, alcarilo o cicloalquilarilo puede unirse directamente al grupo NH o, según otra realización, puede unirse mediante un puente de oxígeno al grupo NH. Los residuos alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, arilcicloalquilo, alcarilo o cicloalquilarilo pueden estar sustituidos adecuadamente. Como sustituyentes preferidos, pueden mencionarse halógenos tales como F, Cl o Br. Residuos de

R’ especialmente preferidos son grupos hidrógeno, alquilo y alcoxilo, e incluso más preferidos son grupos hidrógeno

y alcoxilo y alquilo no sustituidos.

5 Entre los grupos alquilo y alcoxilo, se prefieren grupos con 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 átomos de C. Más preferidos son grupos metilo, etilo, propilo, isopropilo, metoxilo, etoxilo, propoxilo e isopropoxilo. Especialmente se prefieren metilo, etilo, metoxilo, etoxilo, y se les da preferencia particular a metilo o metoxilo.

Por tanto, además se describen un método y un conjugado tal como se describen anteriormente en los que R’ es 10 hidrógeno o un grupo metilo o metoxilo.

Además se describe que el grupo funcional del compuesto al menos bifuncional tiene la estructura R’-NHR”- en la que R” comprende preferiblemente la unidad estructural -NH- y/o la unidad estructural -(C=G)- en la que G es O o S, y/o la unidad estructural -SO2-. Además se describe que el grupo funcional R” se selecciona del grupo que consiste

15 en

en los que, si G está presente dos veces, es independientemente O o S.

25 Por tanto, se describen además un método y un conjugado tal como se describieron anteriormente, en los que el grupo funcional del compuesto al menos bifuncional, pudiendo hacerse reaccionar dicho grupo funcional con el extremo reductor opcionalmente oxidado del polímero, se selecciona del grupo que consiste en

H2N-30

35 en los que G es O o S y, si está presente dos veces, independientemente O o S, y R’ es metilo.

También se describe que el grupo funcional del compuesto al menos bifuncional, pudiendo hacerse reaccionar dicho grupo funcional con el extremo reductor opcionalmente oxidado del polímero y comprendiendo un grupo amino, es un grupo aminooxilo

prefiriéndose particularmente H2N-O-, o el grupo hidrazido

en el que G es preferiblemente O.

Por tanto, también se describen un método y un conjugado tal como se describieron anteriormente, en los que el grupo funcional Z de la proteína es un grupo aldehído o un grupo ceto, y el grupo funcional del compuesto al menos bifuncional, pudiendo hacerse reaccionar dicho grupo funcional con el extremo reductor opcionalmente oxidado del polímero, es un grupo aminooxilo o un grupo hidrazido, preferiblemente un grupo aminooxilo.

Por tanto, también se describe un conjugado, tal como se describió anteriormente, en el que el grupo funcional Z de la proteína es un grupo aldehído o un grupo ceto, y el grupo funcional del compuesto al menos bifuncional, pudiendo hacerse reaccionar dicho grupo funcional con el extremo reductor opcionalmente oxidado del polímero, es un grupo aminooxilo o un grupo hidrazido, preferiblemente un grupo aminooxilo.

Además, también se describe una realización, en la que, el compuesto al menos bifuncional se hace reaccionar con el polímero en su extremo reductor no oxidado.

Además se describe que el compuesto al menos bifuncional que se hace reaccionar con el extremo reductor opcionalmente oxidado del polímero, comprende el grupo funcional A.

El compuesto al menos bifuncional puede hacerse reaccionar con el polímero en primer lugar para dar un derivado de polímero que se hace reaccionar posteriormente con la proteína por medio del grupo funcional A. También es posible hacer reaccionar el compuesto al menos bifuncional por medio del grupo funcional A con la proteína en primer lugar para dar un derivado de proteína que se hace reaccionar posteriormente con el polímero por medio de al menos un grupo funcional del residuo del compuesto al menos bifuncional comprendido en el derivado de proteína.

Según una realización descrita el compuesto al menos bifuncional se hace reaccionar con el polímero en primer lugar.

Por tanto, también se describen un método y un conjugado, tal como se describieron anteriormente, comprendiendo además dicho método hacer reaccionar el polímero en su extremo reductor no oxidado con un compuesto de enlace al menos bifuncional que comprende un grupo funcional que puede hacerse reaccionar con el extremo reductor no oxidado del polímero y un grupo A, antes de la reacción del derivado de polímero que comprende A y la proteína que comprende Z.

El término “el polímero (o HAS) se hace reaccionar por medio del extremo reductor” o “el polímero (o HAS) se hace reaccionar por medio del extremo reductor oxidado de manera selectiva” tal como se usa en el contexto de la presente invención se refiere a un procedimiento según el cual el polímero (o HAS) se hace reaccionar predominantemente por medio de su extremo reductor (oxidado de manera selectiva).

Este término “predominantemente por medio de su extremo reductor (oxidado de manera selectiva)” se refiere a

procedimientos según los que estadísticamente más del 50%, preferiblemente al menos el 55%, más preferiblemente al menos el 60%, más preferiblemente al menos el 65%, más preferiblemente al menos el 70%, más preferiblemente al menos el 75%, más preferiblemente al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 85%, más preferiblemente al menos el 90%, y todavía más preferiblemente al menos el 95% tal como el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% de las moléculas de hidroxialquilalmidón empleadas para una reacción dada se hacen reaccionar por medio de al menos un extremo reductor (oxidado de manera selectiva) por molécula de polímero (o HAS), en la que una molécula de polímero (o HAS) dada que se hace reaccionar por medio de al menos un extremo reductor puede hacerse reaccionar en la misma reacción dada por medio de al menos un grupo funcional adecuado adicional que se comprende en dicha molécula de polímero (o HAS) y que no es un extremo reductor. Si una o más moléculas de polímero (o HAS) se hacen reaccionar por medio de al menos un extremo reductor simultáneamente por medio de al menos un grupo funcional adecuado adicional que se comprende en esta(s) molécula(s) de polímero (o HAS) y que no es un extremo reductor, estadísticamente de manera preferible más del 50%, preferiblemente al menos el 55%, más preferiblemente al menos el 60%, más preferiblemente al menos el 65%, más preferiblemente al menos el 70%, más preferiblemente al menos el 75%, más preferiblemente al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 85%, más preferiblemente al menos el 90%, y todavía más preferiblemente al menos el 95% tal como el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% de todos los grupos funcionales que se han hecho reaccionar de estas moléculas de polímero (o HAS), incluyendo dichos grupos funcionales los extremos reductores, son extremos reductores.

El término “extremo reductor” tal como se usa en el contexto de la presente invención se refiere al grupo aldehído

terminal de una molécula de polímero (o HAS) que puede estar presente como grupo aldehído y/o como la forma acetal correspondiente. En el caso de oxidarse el extremo reductor, el grupo aldehído o acetal están en forma de un grupo carboxilo y/o de la lactona correspondiente.

El grupo funcional del compuesto de enlace al menos bifuncional que se hace reaccionar con el polímero y el grupo

5 funcional A del compuesto de enlace al menos bifuncional que se hace reaccionar con el grupo funcional Z de la proteína, pueden estar separados por cualquier espaciador adecuado. Entre otros, el espaciador puede ser un residuo hidrocarbonado lineal, ramificado y/o cíclico opcionalmente sustituido. Generalmente, el residuo hidrocarbonado tiene hasta 60, preferiblemente hasta 40, más preferiblemente hasta 20, más preferiblemente hasta 10, más preferiblemente hasta 6 y de manera especialmente preferible hasta 4 átomos de carbono. Si hay heteroátomos presentes, el grupo de separación que comprende generalmente de 1 hasta 20, preferiblemente desde 1 hasta 8, más preferiblemente de 1 a 6, más preferiblemente de 1 a 4 y de manera especialmente preferible desde 1 hasta 2 heteroátomos. Como heteroátomo, se prefiere O. El residuo hidrocarbonado puede comprender una cadena de alquilo opcionalmente ramificada o un grupo arilo o un grupo cicloalquilo que tiene, por ejemplo, desde 5 hasta 7 átomos de carbono, o puede ser un grupo aralquilo, un grupo alcarilo en el que la parte de alquilo puede ser

15 un grupo alquilo lineal y/o cíclico. Según una realización incluso más preferida de la presente invención, los grupos funcionales están separados por una cadena hidrocarbonada lineal que tiene 4 átomos de carbono. Según otra realización preferida de la presente invención, los grupos funcionales están separados por una cadena hidrocarbonada lineal que tiene 4 átomos de carbono y al menos uno, preferiblemente un heteroátomo, de manera particularmente preferible un átomo de oxígeno.

Según una realización descrita adicionalmente, el compuesto de enlace al menos bifuncional es un compuesto de enlace homobifuncional. Por tanto, la presente invención también se refiere a un método de producción de un conjugado tal como se describió anteriormente, en el que el compuesto de enlace al menos bifuncional es un compuesto homobifuncional.

25 Por tanto, con respecto a los grupos funcionales preferidos mencionados anteriormente del compuesto de enlace, comprendiendo dicho compuesto de enlace homobifuncional preferiblemente o bien dos grupos aminooxilo H2N-O- o dos grupos aminooxilo R’-O-NH- o dos grupos hidrazido H2N-NH-(C=G) -, prefiriéndose los grupos aminooxilo H2N-O- y los grupos hidrazido H2N-NH-(C=O)-, y prefiriéndose especialmente grupos aminooxilo H2N-O-.

Entro todos los compuestos homobifuncionales concebibles que comprenden dos grupos hidrazido H2N-NH-(C=O)-, se prefieren hidrazidas en las que los dos grupos hidrazido están separados por un residuo hidrocarbonado que tiene hasta 60, preferiblemente hasta 40, más preferiblemente hasta 20, más preferiblemente hasta 10, más preferiblemente hasta 6 y de manera especialmente preferible hasta 4 átomos de carbono. Más preferiblemente, el

35 residuo hidrocarbonado tiene de 1 a 4 átomos de carbono tales como 1, 2, 3 ó 4 átomos de carbono. Lo más preferiblemente, el residuo hidrocarbonado tiene 4 átomos de carbono. Por tanto, se prefiere un compuesto homobifuncional según la fórmula.

En la realización descrita anteriormente en la que un grupo aldehído o un grupo ceto de la proteína se hace reaccionar con un compuesto que comprende dos grupos hidrazido H2N-NH-(C=O)-, los hidroxietilalmidones particularmente preferidos son, por ejemplo, hidroxietilalmidones que tienen un peso molecular medio de aproximadamente 10 kD y un DS de aproximadamente 0,4. También son posibles, por ejemplo, hidroxietilalmidón 45 que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 10 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 18 kD y un DS de aproximadamente 0,4

o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 50 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 50 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 12 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 12 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 18 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 30 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 30 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente

55 50 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 50 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 100 kD y un DS de aproximadamente 0,7.

En cuanto a cada una de estas combinaciones de peso molecular medio y DS, también se prefiere un valor de DS de aproximadamente 0,8.

Según una realización descrita adicionalmente, el compuesto de enlace bifuncional es carbohidrazida

En la realización descrita anteriormente en la que un grupo aldehído o un grupo ceto de la proteína se hace reaccionar con carbohidrazida, los hidroxietilalmidones particularmente preferidos son, por ejemplo, hidroxietilalmidones que tienen un peso molecular medio de aproximadamente 10 kD y un DS de aproximadamente 0,4. También son posibles, por ejemplo, hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 10 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 18 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 50 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 50 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 12 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 12 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 18 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 30 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 30 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 50 kD y un DS de aproximadamente 0,4

o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 50 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 100 kD y un DS de aproximadamente 0,7.

En cuanto a cada una de estas combinaciones de peso molecular medio y DS, también se prefiere un valor de DS de aproximadamente 0,8.

Tal como se describió anteriormente, también se describen un método y un conjugado tal como se describieron anteriormente, en los que el compuesto de enlace al menos bifuncional es un compuesto homobifuncional y comprende dos grupos aminooxilo. Por tanto, también se describen un método y un conjugado tal como se describieron anteriormente, en los que el compuesto de enlace al menos bifuncional es un compuesto homobifuncional y comprende dos grupos aminooxilo H2N-O-.

Tal como se describió anteriormente, además se describe que el polímero se hace reaccionar en su extremo reductor que no está oxidado antes de la reacción con el compuesto de enlace bifuncional. Por tanto, hacer reaccionar el compuesto homobifuncional preferido que comprende dos grupos aminooxilo H2N-O- con el polímero da como resultado un derivado de polímero que comprende un enlace de oxima.

Por tanto, puesto que el grupo funcional Z de la proteína es un grupo aldehído o ceto que se hace reaccionar preferiblemente con un grupo aminooxilo del derivado de polímero, también se describe un conjugado tal como se describió anteriormente, comprendiendo dicho conjugado el polímero y la proteína, estando unidos cada uno de manera covalente a un compuesto de enlace por un enlace de oxima o un enlace de amina cíclica.

Entro todos los compuestos homobifuncionales concebibles que comprenden dos grupos aminooxilo H2N-O-, se prefieren compuestos bifuncionales en los que los dos grupos aminooxilo se separen mediante un residuo hidrocarbonado que tiene desde 1 hasta 60, preferiblemente desde 1 hasta 40, más preferiblemente desde 1 hasta 20, más preferiblemente desde 1 hasta 10, más preferiblemente desde 1 hasta 6 y de manera especialmente preferible de 1 a 4 átomos de carbono. Más preferiblemente, el residuo hidrocarbonado tiene de 1 a 4 átomos de carbono tales como 1, 2, 3 ó 4 átomos de carbono. Lo más preferiblemente, el residuo hidrocarbonado tiene 4 átomos de carbono. Incluso más preferiblemente, el residuo hidrocarbonado tiene al menos un heteroátomo, más preferiblemente un heteroátomo, y lo más preferiblemente un átomo de oxígeno. El compuesto O-[2-(2-aminooxietoxi)-etil]hidroxil-amina según la fórmula

es especialmente preferido.

Por tanto, además se describe un conjugado tal como se describió anteriormente, teniendo dicho conjugado una constitución según la fórmula

y/o

siendo HAS’ preferiblemente HES’. Los hidroxietilalmidones particularmente preferidos son, por ejemplo,

hidroxietilalmidones que tienen un peso molecular medio de aproximadamente 10 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 10 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 12 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 12 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 18 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 18 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 30 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 30 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 50 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 50 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 100 kD y un DS de aproximadamente 0,7.

En cuanto a cada una de estas combinaciones de peso molecular medio y DS, también se prefiere un valor de DS de aproximadamente 0,8.

En la realización descrita anteriormente en la que un grupo aldehído o un grupo ceto de la proteína se hace reaccionar con un grupo hidroxiamino del polímero o derivado de polímero, los hidroxietilalmidones particularmente preferidos son, por ejemplo, hidroxietilalmidones que tienen un peso molecular medio de aproximadamente 10 kD y un DS de aproximadamente 0,4 y hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 10 kD y un DS de aproximadamente 0,7 y hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 18 kD y un DS de aproximadamente 0,4 y hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 50 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 50 kD y un DS de aproximadamente 0,7. También son posibles, por ejemplo, hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 12 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 12 kD y un DS de aproximadamente 0,7

o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 18 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 30 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 30 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 50 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 50 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 100 kD y un DS de aproximadamente 0,7.

Como proteínas, se prefieren especialmente IFN beta glicosilado, AT III glicosilado y GM-CSF glicosilado. Por tanto, en caso de que el hidroxialquilalmidón sea preferiblemente hidroxietilalmidón, también se describe un conjugado

y/o un conjugado

y/o un conjugado

y/o un conjugado

15 y/o un conjugado

y/o un conjugado

en el que HES’ se deriva preferiblemente de manera independiente para cada proteína a partir de hidroxietilalmidón

que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 10 kD y un DS de aproximadamente 0,4 y/o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 10 kD y/o un DS de aproximadamente 0,7 y/o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 18 kD y un DS de aproximadamente 0,4 y/o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 50 kD y un DS de aproximadamente 0,4 y/o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 50 kD y un DS de aproximadamente 0,7 y/o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 100 kD y un DS de aproximadamente 0,7.

La reacción del polímero en este extremo reductor no oxidado con el compuesto de enlace, especialmente en el caso de que dicho compuesto de enlace sea un compuesto de enlace homobifuncional que comprende dos grupos aminooxilo H2N-O-, se lleva a cabo preferiblemente en un sistema acuoso.

El término “sistema acuoso” tal como se usa en el contexto descrito anteriormente y a continuación en el presente

documento se refiere a un disolvente o una mezcla de disolventes que comprende agua en el intervalo de desde al menos el 10% en peso, preferiblemente al menos el 50% en peso, más preferiblemente al menos el 80% en peso, incluso más preferiblemente al menos el 90% en peso o hasta el 100% en peso, en base al peso de los disolventes implicados. El medio de reacción preferido es agua.

Según otra realización, puede usarse al menos otro disolvente en el que HAS, preferiblemente HES sea soluble. Ejemplos de estos disolventes son, por ejemplo, DMF, dimetilacetamida o DMSO.

En lo que respecta a las temperaturas que se aplican durante la reacción, no existen limitaciones específicas dado que la reacción da como resultado el derivado de polímero deseado.

En el caso de que se haga reaccionar el polímero con el compuesto de enlace homobifuncional que comprende dos grupos aminooxilo H2N-O-, preferiblemente O-[2-(2-aminooxi-etoxi)-etil]hidroxilamina, la temperatura está preferiblemente en el intervalo de desde 5 hasta 45ºC, más preferiblemente en el intervalo de desde 10 hasta 30ºC y de manera especialmente preferible en el intervalo de desde 15 hasta 25ºC.

El tiempo de reacción para la reacción del polímero con el compuesto de enlace homobifuncional que comprende dos grupos aminooxilo H2N-O-, preferiblemente O-[2-(2-aminooxi-etoxi)-etil]hidroxilamina, puede adaptarse a las necesidades específicas y está generalmente en el intervalo de desde 1 h hasta 7 d, preferiblemente en el intervalo de desde 1 h hasta 3 d y más preferiblemente de desde 2 h hasta 48 h.

El valor de pH para la reacción del polímero con el compuesto de enlace homobifuncional que comprende dos grupos aminooxilo H2N-O-, preferiblemente O-[2-(2-aminooxi-etoxi)etil]hidroxilamina, puede adaptarse a las necesidades específicas tales como la naturaleza química de los reactivos. El valor de pH está preferiblemente en el intervalo de desde 4,5 hasta 6,5.

Ejemplos específicos de las condiciones de reacción mencionadas anteriormente son, por ejemplo, una temperatura de reacción de aproximadamente 25ºC y un pH de aproximadamente 5,5.

El valor de pH adecuado de la mezcla de reacción puede ajustarse añadiendo al menos un tampón adecuado. Entre los tampones preferidos pueden mencionarse tampón de acetato de sodio, tampones de fosfato o borato.

Una vez se forma el derivado de polímero que comprende el polímero y el compuesto de enlace bifuncional unido al mismo, puede aislarse de la mezcla de reacción mediante al menos un método adecuado. Si es necesario, el derivado de polímero puede precipitarse antes del aislamiento mediante al menos un método adecuado.

Si el derivado de polímero se precipita en primer lugar, es posible, por ejemplo, poner en contacto la mezcla de reacción con al menos un disolvente o mezcla de disolventes distinto del disolvente o mezcla de disolventes presentes en la mezcla de reacción a temperaturas adecuadas, tales como, por ejemplo mezclas de acetona/etanol en razones volumen/volumen adecuadas, tales como 1/1 v/v o isopropanol a temperaturas adecuadas tales como desde -20ºC hasta 50ºC o desde 0ºC hasta 25ºC. Según una realización particularmente preferida de la presente invención en la que se usa un medio acuoso, preferiblemente agua, como disolvente, la mezcla de reacción se pone en contacto con una mezcla de 2-propanol a una temperatura, preferiblemente en el intervalo de desde -20 hasta +50ºC y de manera especialmente preferible en el intervalo de desde 0 hasta 25ºC.

5 El aislamiento del derivado de polímero puede llevarse a cabo mediante un procedimiento adecuado que puede comprender una o más etapas. Según una realización preferida de la presente invención, el derivado de polímero se separa en primer lugar de la mezcla de reacción o de la mezcla de la mezcla de reacción con, por ejemplo, mezcla de 2-propanol acuoso, mediante un método adecuado tal como centrifugación o filtración. En una segunda etapa, el derivado de polímero separado puede someterse a un tratamiento adicional tal como un tratamiento posterior tal

10 como diálisis, filtración por centrifugación o filtración por presión, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de fase inversa, HPLC, MPLC, filtración en gel y/o liofilización. Según una realización incluso más preferida, el derivado de polímero separado se dializa en primer lugar, preferiblemente frente a agua, y entonces se liofiliza hasta que el contenido en disolvente del producto de reacción es suficientemente bajo según las especificaciones deseadas del producto. La liofilización puede llevarse a cabo a temperatura de desde 20 hasta 35ºC, preferiblemente

15 de desde 20 hasta 30ºC.

Entonces, el derivado de polímero así aislado se hace reaccionar adicionalmente, por medio del grupo funcional A, con el grupo funcional Z de la proteína, siendo Z un grupo aldehído o un grupo ceto. En el caso especialmente preferido de que A sea un grupo aminooxilo H2N-O- para dar un enlace oxima entre el derivado de polímero y la 20 proteína, la reacción se lleva a cabo preferiblemente en un medio acuoso, preferiblemente agua, a una temperatura preferida en el intervalo de desde 0 hasta 40ºC, más preferiblemente desde 4 hasta 25ºC y de manera especialmente preferible desde 15 hasta 25ºC. El valor de pH del medio de reacción está preferiblemente en el intervalo de desde 4 hasta 10, más preferiblemente en el intervalo de desde 5 hasta 9 y de manera especialmente preferible en el intervalo de desde 5 hasta 7. El tiempo de reacción está preferiblemente en el intervalo de desde 1

25 hasta 72 h, más preferiblemente en el intervalo de desde 1 hasta 48 h y de manera especialmente preferible en el intervalo de desde 4 hasta 24 h.

El conjugado puede someterse a un tratamiento adicional tal como un tratamiento posterior tal como diálisis, filtración por centrifugación o filtración por presión, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de fase

30 inversa, HPLC, MPLC, filtración en gel y/o liofilización.

Según la presente invención, el grupo funcional Z de la proteína es un grupo amino y la proteína se selecciona del grupo que consiste en IFN alfa, IFN beta, GM-CSF, APC, tPA, A1AT, AT III, factor VII, factor VIII y factor IX. Por tanto, la presente invención se refiere a un método y un conjugado tal como se describieron anteriormente, en los

35 que el grupo funcional Z de la proteína es un grupo amino y la proteína se selecciona del grupo que consiste en IFN alfa, IFN beta, GM-CSF, APC, tPA, A1AT, AT III, factor VIII, factor VIII y factor IX.

Según la presente invención, el grupo funcional A que va a hacerse reaccionar, siendo el grupo funcional Z un grupo amino, es un grupo carboxilo reactivo. Por tanto, la presente invención también se refiere a un método y un

40 conjugado tal como se describieron anteriormente, en los que el grupo funcional Z es un grupo amino y el grupo funcional A del polímero o el derivado de polímero es un grupo carboxilo reactivo.

Según una realización descrita, el grupo carboxilo reactivo se introduce en el polímero oxidando de manera selectiva el polímero en su extremo reductor.

45 Por tanto, según esta realización, el polímero en el que se introduce el grupo carboxilo reactivo tiene la constitución según la fórmula (IIa)

y/o según la fórmula (IIb)

La oxidación del extremo reductor del polímero según la fórmula (I)

preferiblemente hidroxietilalmidón, puede llevarse a cabo según cada método o combinación de métodos que dan como resultado compuestos que tienen las estructuras (IIa) y/o (IIb) mencionadas anteriormente.

10 Aunque la oxidación puede llevarse a cabo según cualquier método o todos los métodos adecuados que dan como resultado el extremo reductor oxidado de hidroxialquilalmidón, se lleva a cabo preferiblemente usando una disolución de yodo alcalina tal como se describe, por ejemplo, en el documento DE 196 28 705 A1 cuyos contenidos respectivos (ejemplo A, columna 9, líneas 6 a 24) se incorporan en el presente documento como referencia.

15 La introducción del grupo carboxilo reactivo en el polímero que está oxidado de manera selectiva en su extremo reductor puede llevarse a cabo mediante todos los métodos concebibles.

El polímero oxidado puede emplearse como tal o como una sal, tal como una sal de metal alcalino, preferiblemente como una sal de sodio y/o de potasio.

20 También se describe que el polímero que está oxidado de manera selectiva en su extremo reductor se hace reaccionar en el extremo reductor oxidado con al menos un alcohol, preferiblemente con al menos un alcohol ácido. Todavía más preferidos son alcoholes ácidos que tienen un valor de pKA en el intervalo de desde 6 hasta 12, más preferiblemente de desde 7 hasta 11 a 25ºC. El peso molecular del alcohol ácido está preferiblemente en el intervalo

25 de desde 80 hasta 500 g/mol, más preferiblemente de desde 90 hasta 300 g/mol y de manera especialmente preferible de desde 100 hasta 200 g/mol.

Alcoholes ácidos adecuados son todos los alcoholes H-O-RA que tienen un protón ácido y pueden hacerse reaccionar con el polímero oxidado para dar el respectivo éster de polímero reactivo, preferiblemente según la 30 fórmula

todavía más preferiblemente según la fórmula

Alcoholes preferidos son N-hidroxisuccinimidas tales como N-hidroxisuccinimida o sulfo-N-hidroxisuccinimida, fenoles adecuadamente sustituidos tales como p-nitrofenol o p-dinitrofenol, u o’-dinitrofenol, triclorofenol tal como 2,4,6-triclorofenol o 2,4,5-triclorofenol, trifluorofenol tal como 2,4,6-trifluorofenol o 2,4,5-trifluorofenol, pentaclorofenol, pentafluorofenol o hidroxiazoles tales como hidroxibenzotriazol. Especialmente se prefieren N-hidroxisuccinimidas, prefiriéndose especialmente N-hidroxisuccinimida y sulfo-N-hidroxisuccinimida. Todos los alcoholes pueden emplearse solos o como combinación adecuada de dos o más de los mismos. En el contexto de la presente invención, también es posible emplear un compuesto que libera el respectivo alcohol, por ejemplo añadiendo diésteres de ácidos carbónicos.

Por tanto, también se describen un método y un conjugado tal como se describieron anteriormente, en los que el polímero oxidado de manera selectiva en su extremo reductor se activa haciendo reaccionar el polímero oxidado con un alcohol ácido, preferiblemente con N-hidroxisuccinimida y/o sulfo-N-hidroxisuccinimida.

Además se describe que el polímero que está oxidado de manera selectiva en su extremo reductor se hace reaccionar en el extremo reductor oxidado con al menos un diéster carbónico RB-O-(C=O)-O-RC, en el que RB y RC pueden ser iguales o diferentes. Preferiblemente, este método da polímeros reactivos según la fórmula

en la que HAS’ es preferiblemente HES’.

Como compuestos de diéster carbónico adecuados, pueden emplearse compuestos cuyos componentes de alcohol sean independientemente N-hidroxisuccinimidas tales como N-hidroxisuccinimida o sulfo-N-hidroxisuccinimida, fenoles adecuadamente sustituidos tales como p-nitrofenol o p-dinitrofenol, u o’-dinitrofenol, triclorofenol tal como 2,4,6-triclorofenol o 2,4,5-triclorofenol, trifluorofenol tal como 2,4,6-trifluorofenol o 2,4,5-trifluorofenol, pentaclorofenol, pentafluorofenol o hidroxiazoles tales como hidroxibenzotriazol. Especialmente se prefieren carbonato de N,N’disuccinimidilo y carbonato de sulfo-N,N’-disuccinimidilo, prefiriéndose especialmente carbonato de N,N’disuccinimidilo.

Por tanto, también se describen un método y un conjugado tal como se describieron anteriormente, en los que el polímero oxidado de manera selectiva en su extremo reductor se activa haciendo reaccionar el polímero oxidado con carbonato de N,N’-disuccinimidilo.

El alcohol ácido se hace reaccionar con el polímero oxidado o la sal del polímero oxidado a una razón molar de alcohol ácido:polímero preferiblemente de desde 5:1 hasta 50:1, más preferiblemente de desde 8:1 hasta 20:1, a una temperatura de reacción preferida de desde 2 hasta 40ºC, más preferiblemente de desde 10 hasta 30ºC y de manera especialmente preferible de desde 15 hasta 25ºC. El tiempo de reacción está preferiblemente en el intervalo de desde 1 hasta 10 h, más preferiblemente de desde 2 hasta 5 h, más preferiblemente de desde 2 hasta 4 h y particularmente de desde 2 hasta 3 h.

El compuesto de diéster carbónico se hace reaccionar con el polímero oxidado o la sal del polímero oxidado a una razón molar de compuesto de diéster:polímero preferiblemente de desde 1:1 hasta 3:1, más preferiblemente de desde 1:1 hasta 1,5:1. El tiempo de reacción está preferiblemente en el intervalo de desde 0,1 hasta 12 h, más preferiblemente de desde 0,2 hasta 6 h, más preferiblemente de desde 0,5 hasta 2 h y particularmente de desde 0,75 hasta 1,25 h.

Además se describe que la reacción del polímero oxidado con alcohol ácido y/o diéster carbónico se lleva a cabo en al menos un disolvente aprótico, de manera particularmente preferible en un disolvente aprótico anhidro que tiene un contenido en agua de no más del 0,5 por ciento en peso, preferiblemente de no más del 0,1 por ciento en peso.

5 Disolventes adecuados son, entre otros, dimetilsulfóxido (DMSO), N-metilpirrolidona, dimetilacetamida (DMA), dimetilformamida (DMF) y mezclas de dos o más de los mismos. Las temperaturas de reacción están preferiblemente en el intervalo de desde 2 hasta 40ºC, más preferiblemente de desde 10 hasta 30ºC.

Para hacer reaccionar el polímero oxidado con el al menos un alcohol ácido, se emplea al menos un agente de 10 activación adicional.

Agentes de activación adecuados son, entre otros, carbonildiimidazol, carbodiimidas tales como diisopropilcarbodiimida (DIC), diciclohexilcarbodiimidas (DCC), 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC), prefiriéndose especialmente diciclohexilcarbodiimidas (DCC) y 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC).

15 Por tanto, también se describen un método y un conjugado tal como se describieron anteriormente, en los que el polímero oxidado en su extremo reductor, se hace reaccionar con un alcohol ácido en presencia de un agente de activación adicional para dar el éster de polímero reactivo.

20 Además se describe que la reacción del polímero oxidado con diéster carbónico y/o alcohol ácido se lleva a cabo en una actividad de base baja que puede determinarse añadiendo la mezcla de reacción a agua con una razón en volumen de agua con respecto a la mezcla de reacción de 10:1. Antes de la adición, el agua que no comprende esencialmente tampón, tiene un valor de pH de 7 a 25ºC. Tras la adición de la mezcla de reacción y midiendo el valor de pH, se obtiene la actividad de base de la mezcla de reacción, que tiene un valor de preferiblemente no más

25 de 9,0, más preferiblemente de no más de 8,0 y de manera especialmente preferible de no más de 7,5.

Además se describe que el polímero oxidado se hace reaccionar con N-hidroxisuccinimida en DMA seco en ausencia de agua con EDC para dar de manera selectiva el éster de N-hidroxisuccinimida de polímero según la fórmula

siendo HAS’ más preferiblemente HES’.

35 Sorprendentemente, esta reacción no da subproductos que resultan de reacciones de EDC con grupos OH de HES, y sorprendentemente, la reacción de transposición de la O-acilisourea formada por EDC y el polímero oxidado con la N-acilurea respectiva se suprime.

También se describe que el polímero oxidado se hace reaccionar con carbonato de N,N’-disuccinimidilo en DMF

40 anhidro y en ausencia de un agente de activación para dar de manera selectiva el éster de N´hidroxisuccinimida de polímero según la fórmula

siendo HAS’ más preferiblemente HES’.

El polímero reactivo tal como se describió anteriormente se hace reaccionar además preferentemente con al menos un grupo amino de la proteína para dar un enlace amida. Según una realización preferida de la presente invención, 5 el polímero reactivo se hace reaccionar con un grupo amino de la proteína.

El grupo amino de la proteína puede ser un grupo amino de un residuo de aminoácido adecuado de la proteína tal como un residuo de lisina o un residuo de histidina o el grupo amino ubicado en el extremo N terminal de la proteína.

10 Por tanto, también se describe un conjugado que tiene una constitución según la fórmula

en la que el átomo de N del enlace amida se deriva de un grupo amino de la proteína, siendo HAS’ preferiblemente

15 HES’, siendo el hidroxietilalmidón preferiblemente hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 10 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 10 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 12 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 12 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un

20 peso molecular medio de aproximadamente 18 kD y un DS’ de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 18 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 30 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 30 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 50 kD y un DS de aproximadamente 0,4

25 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 50 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 100 kD y un DS de aproximadamente 0,7.

En cuanto a cada una de estas combinaciones de peso molecular medio y DS, también se prefiere un valor de DS 30 de aproximadamente 0,8.

Una proteína especialmente preferida acoplada por medio del enlace amida mencionado anteriormente con hidroxialquilalmidón, preferiblemente hidroxietilalmidón, es AT III. Por tanto, además se describe un conjugado

en el que el átomo de N del enlace amida se deriva de un grupo amino de AT III y en el que HAS’ es preferiblemente HES’ e incluso más preferiblemente hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular de aproximadamente 10 kD y un

valor de DS de aproximadamente 0,4.

40 Otra proteína especialmente preferida acoplada por medio de un enlace amida mencionado anteriormente con hidroxialquilalmidón, preferiblemente hidroxietilalmidón, es IFN alfa. Por tanto, también se describe un conjugado

en el que el átomo de N del enlace amida se deriva de un grupo amino de IFN alfa y en el que HAS’ es preferiblemente HES’ e incluso más preferiblemente hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular de

aproximadamente 18 kD y un valor de DS de aproximadamente 0,8.

En la realización descrita anteriormente en la que un grupo amino de la proteína se hace reaccionar con un grupo carboxilo reactivo del polímero o derivado de polímero, los hidroxietilalmidones particularmente preferidos son, por ejemplo, hidroxietilalmidones que tienen un peso molecular medio de aproximadamente 10 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidones que tienen un peso molecular medio de aproximadamente 18 kD y un DS de aproximadamente 0,8. También son posibles hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 10 kD y un DS de aproximadamente 0,7 y hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 18 kD y un DS de aproximadamente 0,4 y hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 50 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 50 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 12 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 12 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 18 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 30 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 30 kD y un DS de aproximadamente 0,7

o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 50 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 50 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 100 kD y un DS de aproximadamente 0,7.

En cuanto a cada una de estas combinaciones de peso molecular medio y DS, también se prefiere un valor de DS de aproximadamente 0,8.

La reacción del polímero reactivo con la proteína puede llevarse a cabo combinando la mezcla de reacción de la preparación del polímero reactivo, es decir sin aislamiento del polímero reactivo, que comprende al menos el 10, más preferiblemente al menos el 30 y todavía más preferiblemente al menos el 50 por ciento en peso de polímero reactivo, con una disolución acuosa de la proteína. Las disoluciones acuosas preferidas de la proteína comprenden de desde el 0,05 hasta el 10, más preferiblemente de desde el 0,5 hasta el 5 y de manera especialmente preferible de desde el 0,5 hasta el 2 por ciento en peso de proteína a un pH preferido de desde 5,0 hasta 9,0, más preferiblemente de desde 6,0 hasta 9,0 y de manera especialmente preferible de desde 7,5 hasta 8,5.

También es posible purificar el polímero reactivo mediante al menos una, preferiblemente múltiples precipitaciones con al menos un agente de precipitación adecuado tal como etanol anhidro, isopropanol y/o acetona para dar un sólido que comprende al menos el 10, más preferiblemente al menos el 30 y todavía más preferiblemente al menos el 50 por ciento en peso polímero reactivo.

El polímero reactivo purificado puede añadirse a la disolución acuosa de la proteína. También es posible añadir una disolución del polímero reactivo purificado a la disolución acuosa de la proteína.

También se describe que la reacción del polímero reactivo con la proteína para dar un enlace amida se lleva a cabo a una temperatura de desde 2 hasta 40ºC, más preferiblemente de desde 5 hasta 35ºC y especialmente de desde 10 hasta 30ºC y a un pH preferido de desde 7,0 hasta 9,0, preferiblemente de desde 7,5 hasta 9,0 y de manera especialmente preferible de desde 7,5 hasta 8,5, a un tiempo de reacción preferido de desde 0,1 hasta 12 h, más preferiblemente de desde 0,5 hasta 5 h, más preferiblemente de desde 0,5 hasta 3 h, todavía más preferiblemente de desde 0,5 hasta 2 h y de manera especialmente preferible de desde 0,5 hasta 1 h, siendo la razón molar de éster de polímero reactivo: proteína preferiblemente de desde 1:1 hasta 70:1, más preferiblemente de desde 5:1 hasta

50:1 y de manera especialmente preferible de desde 10:1 hasta 50:1.

También se describe que el polímero que está oxidado de manera selectiva en su extremo reductor se hace reaccionar en el extremo reductor oxidado con una azolida tal como carbonildiimidazol o carbonildibencimidazol para dar un polímero que tiene un grupo carboxilo reactivo. En el caso de carbonildiimidazol, resulta un derivado de polímero reactivo según la fórmula,

5 en la que HAS’ es preferiblemente HES’. La imidazolida que resulta de la reacción del polímero con la azolida puede hacerse reaccionar preferentemente con un grupo amino de la proteína para dar un enlace amida. También es posible una reacción, si está presente, con un grupo hidroxilo de la proteína para dar un enlace de éster, o con un grupo tio de la proteína para dar un enlace tioéster o, si está presente, con un grupo carboxilo de la proteína para

10 dar un enlace -(C=O)-O-(C=O)-.

En la realización descrita anteriormente en la que se usa una azolida para introducir el grupo carboxilo reactivo en el polímero o derivado de polímero, los hidroxietilalmidones particularmente preferidos son, por ejemplo, hidroxietilalmidones que tienen un peso molecular medio de aproximadamente 10 kD y un DS de aproximadamente 15 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 10 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 18 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 30 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 30 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 50 kD 20 y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 50 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 12 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 12 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 18 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular

25 medio de aproximadamente 50 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 50 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 100 kD y un DS de aproximadamente 0,7.

En cuanto a cada una de estas combinaciones de peso molecular medio y DS, también se prefiere un valor de DS 30 de aproximadamente 0,8.

También se describe que el polímero que tiene un grupo carboxilo reactivo A que resulta de la reacción del extremo reductor oxidado de manera selectiva del polímero con uno de los compuestos mencionados anteriormente, preferiblemente con al menos uno de los alcoholes ácidos y/o al menos uno de los compuestos de diéster carbónico, 35 puede unirse con el grupo funcional Z de la proteína por medio de al menos un compuesto ligador. En el caso de que se use un compuesto ligador, dicho compuesto es un compuesto al menos bifuncional que tiene al menos un grupo funcional F1 que puede hacerse reaccionar con el grupo funcional A del derivado de polímero, y al menos un grupo funcional F2 que puede hacerse reaccionar con el grupo funcional Z de la proteína o un grupo funcional F2 que puede modificarse químicamente que va a hacerse reaccionar con el grupo funcional Z de la proteína. La 40 modificación química puede ser, por ejemplo, una reacción del grupo funcional F2 con un grupo funcional F3 de un compuesto ligador adicional o una oxidación o una reducción de un grupo funcional F2 adecuado. En el caso de que se use al menos un compuesto ligador, la reacción no está restringida al grupo amino de la proteína pero, dependiendo de la naturaleza química de los grupos funcionales del compuesto ligador o compuestos ligadores, puede usarse para formar un enlace con cada grupo funcional adecuado de la proteína, tal como un grupo carboxilo, 45 un grupo carboxilo reactivo, un grupo aldehído, un grupo ceto, un grupo tio, un grupo amino o un grupo hidroxilo. En el caso de que se usen dos compuestos ligadores, se emplea un primer compuesto ligador que tiene al menos un grupo funcional F1 que puede hacerse reaccionar con el grupo carboxilo reactivo A del polímero, tal como un grupo amino, un grupo tio, un grupo hidroxilo o un grupo carboxilo. Además, el primer compuesto ligador tiene al menos otro grupo funcional F2 que puede hacerse reaccionar con al menos un grupo funcional F3 del segundo compuesto

50 ligador. Como grupo funcional F2, se mencionan los siguientes grupos funcionales, entre otros:

-

dobles enlaces C-C o triples enlaces C-C o enlaces C-C aromáticos;

-

el grupo tio o los grupos hidroxilo; 55

-

hidrazida del ácido alquilsulfónico, hidrazida del ácido arilsulfónico;

-

1,2-dioles;

-

1,2-aminoalcoholes;

-

1,2-amino-tioalcoholes;

-

azidas;

-

el grupo amino -NH2 o derivados de los grupos amino que comprenden la unidad estructural -NH- tales como grupos aminoalquilo, grupos aminoarilo, grupos aminoaralquilo o grupos alcarilamino;

-

el grupo hidroxilamino -O-NH2, o derivados del grupo hidroxilamino que comprenden la unidad estructural -O-NH-, tales como grupos hidroxilalquilamino, grupos hidroxilarilamino, grupos hidroxilaralquilamino o grupos hidroxialcarilamino;

-

grupos alcoxiamino, grupos ariloxiamino, grupos aralquiloxiamino o grupos alcariloxiamino, comprendiendo cada uno la unidad estructural -NH-O-;

- residuos que tienen un grupo carbonilo, -Q-C(=G)-M, en el que G es O o S, y M es, por ejemplo, -- -OH o -SH; -- un grupo alcoxilo, un grupo ariloxilo, un grupo aralquiloxilo o un grupo alcariloxilo; -- un grupo alquiltio, un grupo ariltio, un grupo aralquiltio o un grupo alcariltio; -- un grupo alquilcarboniloxilo, un grupo arilcarboniloxilo, un grupo aralquilcarboniloxilo, un grupo alcarilcarboniloxilo; -- ésteres activados tales como ésteres de hidroxilaminas que tienen estructura terciaria tal como N

hidroxisuccinimida o que tienen una unidad estructural O-N en la que N es parte de un compuesto de heteroarilo o, con G=O y Q ausentes, tal como compuestos ariloxilo con un residuo arilo sustituido tal como pentafluorofenilo, paranitrofenilo o triclorofenilo;

en los que Q está ausente o NH o un heteroátomo tal como S u O; - -NH-NH2, o -NH-NH-; - -NO2;

-

el grupo nitrilo;

-

grupos carbonilo tales como el grupo aldehído o el grupo ceto;

-

el grupo carboxilo;

-

el grupo -N=C=O o el grupo -N=C=S;

-

grupos haluro de vinilo tales como el grupo yoduro de vinilo o bromuro de vinilo o triflato; - -C≡C-H; - -(C=NH2Cl)-O-alquilo

-

grupos -(C=O)-CH2-Hal en los que Hal es Cl, Br o I; - -CH=CH-SO2-;

-

un grupo disulfuro que comprende la estructura -S-S-;

-

el grupo

-

el grupo

en los que F3 es un grupo que puede formar un enlace químico con uno de los grupos mencionados anteriormente y se selecciona preferiblemente de los grupos mencionados anteriormente. Además, el segundo compuesto ligador tiene al menos un grupo funcional que puede hacerse reaccionar con el grupo funcional Z de la proteína, que es, por ejemplo, un grupo amino, un grupo tio, un grupo carboxilo, un grupo carboxilo reactivo, un grupo aldehído, un grupo ceto o un grupo hidroxilo. En el caso de que se use un compuesto de enlace para unir de manera covalente el polímero y la proteína, el polímero puede hacerse reaccionar con el compuesto de enlace y el derivado de polímero resultante se hace reaccionar con la proteína, o la proteína puede hacerse reaccionar con el compuesto de enlace y el derivado de proteína resultante se hace reaccionar con el polímero. En el caso de que se usen dos compuestos de enlace L1 y L2, es posible hacer reaccionar el polímero con L1, hacer reaccionar el derivado de polímero resultante con L2 y hacer reaccionar el derivado de polímero resultante con la proteína, o hacer reaccionar la proteína con L2, hacer reaccionar el derivado de proteína resultante con L1 y hacer reaccionar el derivado de proteína resultante con el polímero. También es posible hacer reaccionar el polímero con L1 y hacer reaccionar la proteína con L2 y hacer reaccionar el derivado de polímero con el derivado de proteína. Además, es posible hacer reaccionar L1 con L2, hacer reaccionar el compuesto resultante con el polímero y el derivado de polímero resultante con la proteína. Además, es posible hacer reaccionar L1 con L2, hacer reaccionar el compuesto resultante con la proteína y el derivado de proteína resultante con el polímero.

En la realización descrita anteriormente en la que se usa compuesto ligador en combinación con un alcohol ácido y/o un carbonato de diéster y/o una azolida, los hidroxietilalmidones particularmente preferidos son, por ejemplo, hidroxietilalmidones que tienen un peso molecular medio de aproximadamente 10 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 10 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 18 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 50 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 50 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 12 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 12 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 18 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 30 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 30 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 50 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 50 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 100 kD y un DS de aproximadamente 0,7.

En cuanto a cada una de estas combinaciones de peso molecular medio y DS, también se prefiere un valor de DS de aproximadamente 0,8.

Según la presente invención el grupo carboxilo reactivo se introduce en el polímero cuyo extremo reductor no está oxidado, haciendo reaccionar al menos un grupo hidroxilo del polímero con un diéster carbónico.

Por tanto, la presente invención también se refiere a un método y un conjugado tal como se describieron anteriormente, en los que A es un grupo carboxilo reactivo, y en los que A se introduce en el polímero cuyo extremo reductor no está oxidado, haciendo reaccionar al menos un grupo hidroxilo del polímero con al menos un diéster carbónico RB-O-(C=O)-O-RC, en el que RB y RC pueden ser iguales o diferentes.

Según otra realización de la presente invención, el polímero cuyo extremo reductor no está oxidado, se hace reaccionar en al menos un grupo hidroxilo con una azolida tal como carbonildiimidazol, carbonil-di-(1,2,4-triazol) o carbonildibencimidazol para dar un polímero que tiene un grupo carboxilo reactivo.

Como compuestos de diéster carbónico adecuados, pueden emplearse compuestos cuyo componente de alcoholes son independientemente N-hidroxisuccinimidas tales como N-hidroxisuccinimida o sulfo-N-hidroxisuccinimida, fenoles adecuadamente sustituidos tales como p-nitrofenol o p-dinitrofenol, u o’-dinitrofenol, triclorofenol tal como 2,4,6-triclorofenol o 2,4,5-triclorofenol, trifluorofenol tal como 2,4,6-trifluorofenol o 2,4,5-trifluorofenol, pentaclorofenol, pentafluorofenol o hidroxiazoles tales como hidroxibenzotriazol.

Especialmente se prefieren compuestos simétricos de diéster carbónico, por tanto siendo RB y RC iguales. El componente de alcohol del diéster carbónico se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en Nhidroxisuccinimida, N-hidroxisuccinimida sulfonatada, N-hidroxibenzotriazol y fenoles sustituidos con nitro y halógeno. Entre otros, se prefieren nitrofenol, dinitrofenol, triclorofenol, trifluorofenol, pentaclorofenol y pentafluorofenol. Especialmente se prefieren carbonato de N,N’-disuccinimidilo y carbonato de sulfo-N,N’disuccinimidilo, prefiriéndose especialmente carbonato de N,N’-disuccinimidilo.

Por tanto, la presente invención también se refiere a un derivado de hidroxialquilalmidón y un método de producción del mismo, preferiblemente un derivado de hidroxietilalmidón, en el que al menos un grupo hidroxilo, preferiblemente al menos dos grupos hidroxilo de dicho almidón se han hecho reaccionar con un compuesto de diéster carbónico para dar el respectivo éster reactivo.

Según una realización preferida de la presente invención, la reacción del polímero cuyo extremo reductor no está oxidado, con el al menos un compuesto de diéster carbónico se lleva a cabo a una temperatura de desde 2 hasta 40ºC, más preferiblemente de desde 10 hasta 30ºC y especialmente de desde 15 hasta 25ºC y a un tiempo de reacción preferido de desde 0,5 hasta 5 h, más preferiblemente de desde 1 hasta 3 h, y de manera especialmente preferible de desde 2 hasta 3 h.

Según otra realización de la presente invención, el polímero cuyo extremo reductor no está oxidado, se hace reaccionar en al menos un grupo hidroxilo con una azolida tal como carbonildiimidazol, carbonil-di-(1,2,4-triazol) o carbonildibencimidazol para dar un polímero que tiene un grupo carboxilo reactivo.

La razón molar de diéster carbónico y/o azolida, preferiblemente compuesto de diéster carbónico:polímero depende del grado de sustitución del polímero con respecto al número de grupos hidroxilo que se han hecho reaccionar con el compuesto de diéster carbónico en relación con el número de grupos hidroxilo presentes en el polímero sin reaccionar.

Según una realización preferida de la presente invención, la razón molar de compuesto de diéster carbónico:polímero está en el intervalo de desde 1:2 hasta 1:1000, más preferiblemente de desde 1:3 hasta 1:100 y de manera especialmente preferible de desde 1:10 hasta 1:50, para dar un grado de sustitución en el intervalo de desde 0,5 hasta 0,001, preferiblemente de desde 0,33 hasta 0,01 y de manera especialmente preferible de desde 0,1 hasta 0,02. El grado de sustitución se determina mediante espectroscopía UV.

Según una realización preferida de la presente invención, la reacción del polímero cuyo extremo reductor no está oxidado, con diéster carbónico se lleva a cabo en al menos un disolvente aprótico, de manera particularmente preferible en un disolvente aprótico anhidro que tiene un contenido en agua de no más del 0,5 por ciento en peso, preferiblemente de no más del 0,1 por ciento en peso. Disolventes adecuados son, entre otros, dimetilsulfóxido (DMSO), N-metilpirrolidona, dimetilacetamida (DMA), dimetilformamida (DMF) y mezclas de dos o más de los mismos.

Por tanto, la presente invención también se refiere a un método y un conjugado tal como se describieron anteriormente, en los que la reacción del al menos un grupo hidroxilo del polímero cuyo extremo reductor no está oxidado, con el diéster carbónico para dar un grupo éster reactivo A se lleva a cabo en un disolvente polar aprótico anhidro, siendo el disolvente preferiblemente dimetilacetamida, dimetilformamida o una mezcla de los mismos.

La reacción del polímero reactivo que comprende al menos un grupo éster reactivo, preferiblemente al menos dos grupos éster reactivos, con la proteína para dar al menos un enlace amida, preferiblemente al menos dos enlaces amida, puede llevarse a cabo combinando la mezcla de reacción de la preparación del polímero reactivo, es decir sin aislamiento del polímero reactivo, que comprende al menos el 5, más preferiblemente al menos el 10 y todavía más preferiblemente al menos el 15 por ciento en peso de polímero reactivo, con una disolución acuosa de la proteína. Las disoluciones acuosas preferidas de la proteína comprenden de desde el 0,05 hasta el 10, más preferiblemente de desde el 0,5 hasta el 5 y de manera especialmente preferible de desde el 0,5 hasta el 2 por ciento en peso de proteína a un pH preferido de desde 7,0 hasta 9, más preferiblemente de desde 7,5 hasta 9 y de manera especialmente preferible de desde 7,5 hasta 8,5.

Según la presente invención, también es posible purificar el polímero reactivo mediante al menos una, preferiblemente mediante múltiples precipitaciones con al menos un agente de precipitación adecuado tal como etanol anhidro, isopropanol y/o acetona para dar un sólido que comprende al menos el 20, más preferiblemente al menos el 50 y todavía más preferiblemente al menos el 80 por ciento en peso de polímero reactivo.

El polímero reactivo purificado puede añadirse a la disolución acuosa de la proteína. También es posible añadir una disolución del polímero reactivo purificado a la disolución acuosa de la proteína.

Según una realización preferida de la presente invención, la reacción del polímero reactivo con la proteína para dar al menos uno, preferiblemente al menos dos enlaces amida se lleva a cabo a una temperatura de desde 2 hasta 40ºC, más preferiblemente de desde 5 hasta 35ºC y especialmente de desde 10 hasta 30ºC y un pH preferido de desde 7,0 hasta 9,5, preferiblemente de desde 7,5 hasta 9 y de manera especialmente preferible de desde 7,5 hasta 8,5, a un tiempo de reacción preferido de desde 0,5 hasta 5 h, más preferiblemente de desde 0,5 hasta 3 h y de manera especialmente preferible de desde 0,5 hasta 1 h, siendo la razón molar de éster de polímero reactivo:proteína preferiblemente de desde 1:1 hasta 70:1, más preferiblemente de desde 5:1 hasta 50:1 y de manera especialmente preferible de desde 10:1 hasta 50:1.

Según una realización preferida de la presente invención, se obtienen polímeros sustituidos con oligo o multiproteínas en los que las moléculas de proteína se unen al polímero por medio de un enlace amida.

PDS está en el intervalo de desde 0,001 hasta 1, preferiblemente desde 0,005 hasta 0,5, más preferiblemente desde 0,005 hasta 0,2.

En la realización descrita anteriormente en la que al menos se introduce un grupo carboxilo reactivo en el polímero o derivado de polímero mediante reacción con al menos un grupo hidroxilo del polímero o derivado de polímero, los hidroxietilalmidones particularmente preferidos son, por ejemplo, hidroxietilalmidones que tienen un peso molecular medio de aproximadamente 10 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 10 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 18 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 50 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 50 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 12 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 12 kD y un DS de aproximadamente 0,7

o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 18 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 30 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 30 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 50 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 50 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 100 kD y un DS de aproximadamente 0,7.

En cuanto a cada una de estas combinaciones de peso molecular medio y DS, también se prefiere un valor de DS de aproximadamente 0,8.

Según otra realización de la presente invención, el polímero que tiene un grupo carboxilo reactivo A que resulta de la reacción de al menos un grupo hidroxilo del polímero con uno de los compuestos mencionados anteriormente, preferiblemente con al menos uno de los compuestos de diéster carbónico, puede unirse con el grupo funcional Z de la proteína por medio de al menos un compuesto ligador. En el caso de que se use un compuesto ligador, dicho compuesto es un compuesto al menos bifuncional que tiene al menos un grupo funcional F1 que puede hacerse reaccionar con el grupo funcional A del derivado de polímero, y al menos un grupo funcional F2 que puede hacerse reaccionar con el grupo funcional Z de la proteína o un grupo funcional F2 que puede modificarse químicamente que va a hacerse reaccionar con el grupo funcional Z de la proteína. La modificación química puede ser, por ejemplo, una reacción del grupo funcional F2 con un grupo funcional F3 de un compuesto ligador adicional o una oxidación o una reducción de un grupo funcional F2 adecuado. En el caso de que se use al menos un compuesto ligador, la reacción no se restringe al grupo amino de la proteína pero, dependiendo de la naturaleza química de los grupos funcionales del compuesto ligador o compuestos ligadores, puede usarse para formar un enlace con cada grupo funcional adecuado de la proteína, tal como un grupo carboxilo, un grupo carboxilo reactivo, un grupo aldehído, un grupo ceto, un grupo tio, un grupo amino o un grupo hidroxilo. En el caso de que se usen dos compuestos ligadores, se emplea un primer compuesto ligador que tiene al menos un grupo funcional F1 que puede hacerse reaccionar con el grupo carboxilo reactivo A del polímero, tal como un grupo amino, un grupo tio, un grupo hidroxilo o un grupo carboxilo. Además, el primer compuesto ligador tiene al menos otro grupo funcional F2 que puede hacerse reaccionar con al menos un grupo funcional F3 del segundo compuesto ligador. Como grupo funcional F2, se mencionan los siguientes grupos funcionales, entre otros:

-

dobles enlaces C-C o triples enlaces C-C o enlaces C-C aromáticos;

-

el grupo tio o los grupos hidroxilo;

-

hidrazida del ácido alquilsulfónico, hidrazida del ácido arilsulfónico;

-

1,2-dioles;

-

1,2-aminoalcoholes;

-

azidas;

-

1,2-amino-tioalcoholes;

-

el grupo amino -NH2 o derivados de los grupos amino que comprenden la unidad estructural -NH- tales como grupos aminoalquilo, grupos aminoarilo, grupos aminoaralquilo, o grupos alcarilamino;

-

el grupo hidroxilamino -O-NH2, o derivados del grupo hidroxilamino que comprenden la unidad estructural -O-NH-, tales como grupos hidroxilalquilamino, grupos hidroxilarilamino, grupos hidroxilaralquilamino o grupos hidroxialcarilamino;

-

grupos alcoxiamino, grupos ariloxiamino, grupos aralquiloxiamino o grupos alcariloxiamino, comprendiendo cada uno la unidad estructural -NH-O-;

-

residuos que tienen un grupo carbonilo, -Q-C(=G)-M, en el que G es O o S, y M es, por ejemplo, -- -OH o -SH; -- un grupo alcoxilo, un grupo ariloxilo, un grupo aralquiloxilo o un grupo alcariloxilo; -- un grupo alquiltio, un grupo ariltio, un grupo aralquiltio o un grupo alcariltio; -- un grupo alquilcarboniloxilo, un grupo arilcarboniloxilo, un grupo aralquilcarboniloxilo, un grupo alcarilcarboniloxilo; -- ésteres activados tales como ésteres de hidroxilaminas que tienen estructura terciaria tal como N

hidroxisuccinimida o que tienen una unidad estructural O-N en la que N es parte de un compuesto de heteroarilo o con G=O y Q ausentes, tal como compuestos ariloxilo con un residuo arilo sustituido tal como pentafluorofenilo, paranitrofenilo o triclorofenilo;

en los que Q está ausente o NH o un heteroátomo tal como S u O; - -NH-NH2 o -NH-NH-; - -NO2;

-

el grupo nitrilo;

-

grupos carbonilo tales como el grupo aldehído o el grupo ceto;

-

el grupo carboxilo;

-

el grupo -N=C=O o el grupo -N=C=S;

-

grupos haluro de vinilo tales como el grupo yoduro de vinilo o bromuro de vinilo o triflato; - -C≡C-H; - -(C=NH2Cl)-O-alquilo

-

grupos -(C=O)-CH2-Hal en los que Hal es Cl, Br o I; - -CH=CH-SO2-;

-

un grupo disulfuro que comprende la estructura -S-S-;

-

el grupo

-

el grupo

en los que F3 es un grupo que puede formar un enlace químico con uno de los grupos mencionados anteriormente y se selecciona preferiblemente de los grupos mencionados anteriormente. Además, el segundo compuesto ligador tiene al menos un grupo funcional que puede hacerse reaccionar con el grupo funcional Z de la proteína, que es, por ejemplo, un grupo amino, un grupo tio, un grupo carboxilo, un grupo carboxilo reactivo, un grupo aldehído, un grupo ceto o un grupo hidroxilo. En el caso de que se use un compuesto de enlace para unir de manera covalente el polímero y la proteína, el polímero puede hacerse reaccionar con el compuesto de enlace y el derivado de polímero resultante se hace reaccionar con la proteína, o la proteína puede hacerse reaccionar con el compuesto de enlace y el derivado de proteína resultante se hace reaccionar con el polímero. En el caso de que se usen dos compuestos de enlace L1 y L2, es posible hacer reaccionar el polímero con L1, hacer reaccionar el derivado de polímero resultante con L2 y hacer reaccionar el derivado de polímero resultante con la proteína, o hacer reaccionar la proteína con L2, hacer reaccionar el derivado de proteína resultante con L1 y hacer reaccionar el derivado de proteína resultante con el polímero. También es posible hacer reaccionar el polímero con L1 y hacer reaccionar la proteína con L2 y hacer reaccionar el derivado de polímero con el derivado de proteína. Además, es posible hacer reaccionar L1 con L2, hacer reaccionar el compuesto resultante con el polímero y el derivado de polímero resultante con la proteína. Además, es posible hacer reaccionar L1 con L2, hacer reaccionar el compuesto resultante con la proteína y el derivado de proteína resultante con el polímero.

En la realización descrita anteriormente en la que se usa un compuesto ligador, los hidroxietilalmidones particularmente preferidos son, por ejemplo, hidroxietilalmidones que tienen un peso molecular medio de aproximadamente 10 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 10 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 18 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 50 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 50 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 12 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 12 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 18 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 30 kD y un DS de aproximadamente 0,4

o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 30 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 50 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 50 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 100 kD y un DS de aproximadamente 0,7.

En cuanto a cada una de estas combinaciones de peso molecular medio y DS, también se prefiere un valor de DS de aproximadamente 0,8.

Según una realización descrita adicionalmente, el grupo funcional A que va a hacerse reaccionar, siendo el grupo funcional Z un grupo amino, es un grupo aldehído, un grupo ceto o un grupo hemiacetal. Por tanto, también se describen un método y un conjugado tal como se describieron anteriormente, en los que el grupo funcional Z es un grupo amino y el grupo funcional A del polímero o el derivado del mismo es un grupo aldehído, un grupo ceto o un grupo hemiacetal, en los que la proteína se selecciona del grupo que consiste en IFN alfa, IFN beta, GM-CSF, APC, tPA, A1AT, AT III, factor VII, factor VIII y factor IX.

Según una realización descrita, se hacen reaccionar el grupo funcional Z y el grupo funcional A por medio de una reacción de aminación reductora.

La reacción de aminación reductora, en la que el polímero o derivado de polímero se une de manera covalente por medio de al menos un grupo aldehído a al menos un grupo amino de la proteína mediante aminación reductora, se lleva a cabo preferiblemente a una temperatura de desde 0 hasta 40ºC, más preferiblemente de 0 a 37ºC, más preferiblemente de desde 0 hasta 25ºC, en particular desde 4 hasta 21ºC, pero de manera especialmente preferible de desde 0 hasta 21ºC. El tiempo de reacción oscila preferiblemente de desde 0,5 hasta 72 h, más preferiblemente de desde 2 hasta 48 h y de manera especialmente preferible de desde 4 hasta 7 h. Como disolvente para la reacción, se prefiere un medio acuoso.

Por tanto, también se describen un método y un conjugado tal como se describieron anteriormente, en los que la aminación reductora se lleva a cabo a una temperatura de desde 4 hasta 21ºC, pero de manera especialmente preferible de 0 a 21ºC.

Por tanto, también se describen un método y un conjugado tal como se describieron anteriormente, en los que se lleva a cabo la aminación reductora en un medio acuoso.

Por tanto, también se describen un método y un conjugado tal como se describieron anteriormente, en los que la aminación reductora se lleva a cabo a una temperatura de desde 4 hasta 21ºC, pero de manera especialmente preferible de 0 a 21ºC, en un medio acuoso.

El término “medio acuoso” tal como se usa en el contexto descrito anteriormente y a continuación en el presente documento se refiere a un disolvente o una mezcla de disolventes que comprende agua en el intervalo de desde al menos el 10% en peso, más preferiblemente al menos el 20% en peso, más preferiblemente al menos el 30% en peso, más preferiblemente al menos el 40% en peso, más preferiblemente al menos el 50% en peso, más preferiblemente al menos el 60% en peso, más preferiblemente al menos el 70% en peso, más preferiblemente al menos el 80% en peso, incluso más preferiblemente al menos el 90% en peso o hasta el 100% en peso, en base al peso de los disolventes implicados. El medio de reacción preferido es agua.

El valor de pH del medio de reacción está generalmente en el intervalo de desde 4 hasta 9 o desde 4 hasta 8 o desde 4 hasta 7,3.

Según una realización descrita, el pH al que se lleva a cabo la aminación reductora, es por debajo de 10, preferiblemente por debajo de 7,5, preferiblemente por debajo de 7,3, más preferiblemente más pequeño que o igual a 7 y lo más preferiblemente por debajo de 7, es decir en el intervalo ácido. Por tanto los intervalos preferidos son de desde 3 hasta por debajo de 7, más preferiblemente de desde 3,5 hasta 6,5, todavía más preferiblemente de desde 4 hasta 6, todavía más preferiblemente de desde 4,5 hasta 5,5 y de manera especialmente preferible aproximadamente 5,0, es decir 4,6 ó 4,7 ó 4,8 ó 4,9 ó 5,0 ó 5,1 ó 5,2 ó 5,3 ó 5,4. Los intervalos preferidos son, entre otros, de 3 a 6,9 o de 3 a 6,5o de 3 a 6 o de 3 a 5,5 o de 3 a 5 o de 3 a 4,5 o de 3 a 4 o de 3 a 3,5 o de 3,5 a 6,9o de 3,5 a 6,5 o de 3,5 a 6 o de 3,5 a 5,5 o de 3,5 a 5 o de 3,5 a 4,5 o de 3,5 a 4 o de 4 a 6,9 o de 4 a 6,5 o de 4 a 6 o de 4 a 5,5 o de 4 a 5 o de 4 a 4,5 o de 4,5 a 6,9 o de 4,5 a 6,5 o de 4,5 a 6 o de 4,5 a 5,5 o de 4,5 a 5 o de 5 a 6,9 o de 5 a 6,5 o de 5 a 6 o de 5 a 5,5 o de 5,5 a 6,9 o de 5,5 a 6,5 o de 5,5 a 6 o de 6 a 6,9 o de 6 a 6,5 o de 6,5 a 6,9.

Por tanto, también se describen un método y un conjugado tal como se describieron anteriormente, en los que la aminación reductora se lleva a cabo a un pH de 7 o menos, más preferiblemente a un pH de 6 o menos.

Por tanto, también se describen un método y un conjugado tal como se describieron anteriormente, en los que la aminación reductora se lleva a cabo a una temperatura de desde 0 hasta 21ºC, preferiblemente de 4 a 21ºC a un pH de 7,5 o menos, preferiblemente de 7 o menos, preferiblemente de 6 o menos.

Por tanto, también se describen un método y un conjugado tal como se describieron anteriormente, en los que la aminación reductora se lleva a cabo en un medio acuoso a un pH de 7 o menos, preferiblemente de 6 o menos.

Por consiguiente, también se describen un método y un conjugado tal como se describieron anteriormente, en los que la aminación reductora se lleva a cabo a una temperatura de desde 4 hasta 21ºC en un medio acuoso a un pH de 7 o menos, preferiblemente de 6 o menos.

La razón molar de derivado de polímero:proteína usada para la reacción está preferiblemente en el intervalo de desde 200:1 hasta 5:1, más preferiblemente de desde 100:1 hasta 10:1 y de manera especialmente preferible de desde 75:1 hasta 20:1.

Sorprendentemente se encontró que era posible, especialmente en los intervalos de pH preferidos facilitados anteriormente, particularmente a un pH por debajo de 7 y mayor o igual a 4, hacer reaccionar el derivado de polímero predominantemente con el grupo amino ubicado en el extremo N terminal de la proteína. El término “predominantemente” tal como se usa en el contexto de la presente invención se refiere a una realización en la que al menos el 80%, preferiblemente al menos el 85% de los grupos amino N-terminales disponibles se hacen reaccionar por medio de aminación reductora. También es posible hacer reaccionar al menos el 90% o al menos el 95% o al menos el 96% o al menos el 97% o al menos el 98% o al menos el 99% de los grupos amino N-terminales disponibles. Aunque el acoplamiento a grupos amino distintos del grupo amino N-terminal no se pudo descartar completamente, se cree que el acoplamiento por medio de aminación reductora según la presente invención a un pH de por debajo de 7, preferiblemente por debajo de 6, tuvo lugar esencialmente de manera selectiva en el grupo amino N-terminal. En particular, estas condiciones de reacción se prefieren para proteínas que son estables en estas condiciones. Si una proteína fuera, por ejemplo, lábil en medio ácido, tal como alfa 1-antitripsina, entonces se prefiere elegir condiciones de reacción apropiadas, en particular a pH desde menor de 7,5 hasta mayor de 5.

Por tanto, también se describen un método y un conjugado tal como se describieron anteriormente, en los que la proteína comprende el grupo amino N-terminal y al menos un grupo amino adicional, dicho conjugado comprende el polímero que va a acoplarse predominantemente con el grupo amino N-terminal.

Según una realización, se describe un método de enlazar hidroxialquilalmidón funcionalizado con aldehído o ceto o hemiacetal o un derivado de hidroxialquilalmidón funcionalizado con aldehído o ceto o hemiacetal predominantemente con el grupo amino N-terminal de una proteína, comprendiendo dicho método someter a dicho hidroxialquilalmidón o derivado del mismo a una reacción de aminación reductora, a un pH de 7 o menos, preferiblemente a un pH de 6 o menos, llevándose a cabo dicha reacción de aminación reductora preferiblemente en un medio acuoso.

Según esta realización, se prefiere hidroxialquilalmidón funcionalizado con aldehído o un derivado de hidroxialquilalmidón funcionalizado con aldehído.

Además se describe un método de enlazar hidroxietilalmidón funcionalizado con aldehído o ceto o hemiacetal o un derivado de hidroxietilalmidón funcionalizado con aldehído o ceto o hemiacetal de manera selectiva con el grupo amino N-terminal de una proteína, comprendiendo dicho método someter dicho hidroxialquilalmidón o derivado del mismo a una reacción de aminación reductora, a un pH de 7 o menos, preferiblemente a un pH de 6 o menos, llevándose a cabo dicha reacción de aminación reductora preferiblemente en un medio acuoso, siendo el hidroxietilalmidón empleado preferiblemente hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 10 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 10 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 12 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 12 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 18 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 18 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 30 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 30 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 50 kD y un DS de aproximadamente 0,4

o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 50 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 100 kD y un DS de aproximadamente 0,7.

En cuanto a cada una de estas combinaciones de peso molecular medio y DS, también se prefiere un valor de DS de aproximadamente 0,8.

La reacción del derivado de polímero y la proteína entre el grupo aldehído o grupo ceto o grupo hemiacetal y el grupo amino es una aminación reductora en la que se produce una base de Schiff. Posteriormente después de la reacción, esta base puede reducirse mediante al menos un agente reductor para dar un enlace estable entre el derivado de polímero y la proteína. También es posible llevar a cabo la reacción en presencia de al menos un agente reductor. Según una realización preferida, la reacción de aminación reductora se lleva a cabo en presencia de al menos un agente reductor.

Agentes reductores preferidos son borohidruro de sodio, cianoborohidruro de sodio, compuestos complejos de borano orgánico tales como un complejo de 4-(dimetilamin)piridina-borano, complejo de N-etildiisopropilaminaborano, complejo de N-etilmorfolina-borano, N-metilmorfolina-borano, complejo de N-fenilmorfolina-borano, complejo de lutidina-borano, complejo de trietilamina-borano o complejo de trimetilamina-borano. Particularmente, se prefiere cianoborohidruro de sodio.

Por tanto, también se describen un método y un conjugado tal como se describieron anteriormente, en los que la aminación reductora se lleva a cabo en presencia de NaCNBH3.

Por tanto, también se describen un método y un conjugado tal como se describieron anteriormente, en los que la aminación reductora se lleva a cabo en un medio acuoso a un pH de 7 o menos, preferiblemente de 6 o menos en presencia de agente reductor, preferiblemente NaCNBH3.

Por consiguiente, también se describen un método y un conjugado tal como se describieron anteriormente, en los que la aminación reductora se lleva a cabo a una temperatura de desde 4 hasta 21ºC en un medio acuoso a un pH de 7 o menos, preferiblemente de 6 o menos en presencia de agente reductor, preferiblemente NaCNBH3.

La razón molar de derivado de polímero:proteína usada para la reacción está preferiblemente en el intervalo de desde 200:1 hasta 10:1 más preferiblemente de desde 100:1 hasta 10:1 y de manera especialmente preferible de desde 75:1 hasta 20:1.

Por tanto, también se describe un método de producción de un conjugado, comprendiendo dicho método hacer

5 reaccionar un polímero o un derivado de polímero que comprende un grupo aldehído en un medio acuoso con un grupo amino de la proteína en presencia de un agente reductor, siendo dicho agente reductor preferiblemente NaCNBH3.

Según la realización, según la que el polímero comprende al menos dos grupos aldehído que se introducen en el

10 polímero mediante una reacción de oxidación de apertura de anillo, el polímero comprende preferiblemente al menos una estructura según la fórmula

15 Según esta realización, puede emplearse cada agente de oxidación o combinación de agentes de oxidación que pueda oxidar al menos un anillo de sacárido del polímero para dar un anillo de sacárido abierto que tiene al menos uno, preferiblemente al menos dos grupos aldehído. Esta reacción se ilustra mediante el siguiente esquema de reacción que muestra un anillo de sacárido del polímero que se oxida para dar un anillo abierto que tiene dos grupos aldehído:

Agentes oxidantes adecuados son, entre otros, peryodatos tales como peryodatos de metal alcalino o mezclas de dos o más de los mismos, prefiriéndose peryodato de sodio y peryodato de potasio.

25 Por tanto, además se describen un método y un conjugado tal como se describieron anteriormente, en los que el polímero se somete a una reacción de oxidación de apertura de anillo usando un peryodato para dar un derivado de polímero que tiene al menos uno, preferiblemente al menos dos grupos aldehído.

30 Para esta reacción de oxidación, el polímero puede emplearse con su extremo reductor o bien en la forma oxidada o la no oxidada, prefiriéndose la forma no oxidada.

Por tanto, también se describen un método y un conjugado tal como se describieron anteriormente, en los que el polímero se emplea con su extremo reductor en la forma no oxidada.

35 La temperatura de reacción está en un intervalo preferido de desde 0 hasta 40ºC, más preferiblemente de desde 0 hasta 25ºC y de manera especialmente preferible de desde 0 hasta 5ºC. El tiempo de reacción está en un intervalo preferido de desde 1 min. hasta 5 h y de manera especialmente preferible de desde 10 min. hasta 4 h. Dependiendo del grado deseado de oxidación, es decir el número de grupos aldehído que resultan de la reacción de oxidación, la

40 razón molar de peryodato:polímero puede elegirse apropiadamente.

Por tanto, también se describen un método y un conjugado tal como se describieron anteriormente, en los que la reacción de oxidación de apertura de anillo se lleva a cabo a una temperatura de desde 0 hasta 5ºC.

La reacción de oxidación del polímero con peryodato se lleva a cabo preferiblemente en un medio acuoso, lo más preferiblemente en agua.

Por tanto, también se describen un método y un conjugado tal como se describieron anteriormente, en los que la reacción de oxidación de apertura de anillo se lleva a cabo en un medio acuoso. El valor de pH adecuado de la mezcla de reacción puede ajustarse añadiendo al menos un tampón adecuado. Entre los tampones preferidos, pueden mencionarse tampón de acetato de sodio, tampones de fosfato o borato.

El hidroxietilalmidón sometido a dicha reacción de oxidación de apertura de anillo es preferiblemente hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 10 kD y un DS de aproximadamente 0,4

o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 10 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 12 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 12 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 18 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 18 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 30 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 30 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 50 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 50 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 100 kD y un DS de aproximadamente 0,7.

En cuanto a cada una de estas combinaciones de peso molecular medio y DS, también se prefiere un valor de DS de aproximadamente 0,8.

El derivado de polímero resultante puede purificarse a partir de la mezcla de reacción mediante al menos un método adecuado. Si es necesario, el derivado de polímero puede precipitarse antes del aislamiento mediante al menos un método adecuado.

Si el derivado de polímero se precipita en primer lugar, es posible, por ejemplo, poner en contacto la mezcla de reacción con al menos un disolvente o mezcla de disolventes diferente del disolvente o mezcla de disolventes presente en la mezcla de reacción a temperaturas adecuadas. Según una realización particularmente preferida en la que se usa un medio acuoso, preferiblemente agua, como disolvente, la mezcla de reacción se pone en contacto con 2-propanol o con una mezcla de acetona y etanol, preferiblemente una mezcla 1:1 (v/v), que indica volúmenes iguales de dichos compuestos, a una temperatura, preferiblemente en el intervalo de desde -20 hasta +50ºC y de manera especialmente preferible en el intervalo de desde -20 hasta 25ºC.

El aislamiento del derivado de polímero puede llevarse a cabo mediante un procedimiento adecuado que puede comprender una o más etapas. Según una realización preferida, el derivado de polímero se separa en primer lugar de la mezcla de reacción o la mezcla de la mezcla de reacción con, por ejemplo, mezcla de 2-propanol acuoso, mediante un método adecuado tal como centrifugación o filtración. En una segunda etapa, el derivado de polímero separado puede someterse a un tratamiento adicional tal como un tratamiento posterior tal como diálisis, filtración por centrifugación o filtración por presión, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de fase inversa, HPLC, MPLC, filtración en gel y/o liofilización. Según una realización incluso más preferida, el derivado de polímero separado se dializa en primer lugar, preferiblemente frente a agua, y entonces se liofiliza hasta que el contenido en disolvente del producto de reacción es suficientemente bajo según las especificaciones deseadas del producto. La liofilización puede llevarse a cabo a temperatura de desde 20 hasta 35ºC, preferiblemente de desde 20 hasta 30ºC.

Según una realización preferida, el polímero oxidado que resulta de la reacción de oxidación se purifica usando al menos un método adecuado tal como ultrafiltración y/o diálisis con el fin de, por ejemplo, eliminar sales de peso molecular bajo no deseadas y componentes de polímero, ofreciendo así también un medio de control del intervalo de peso molecular del polímero oxidado.

El polímero oxidado puede usarse directamente para la reacción con la proteína o se recupera de manera adecuada en una primera etapa, por ejemplo mediante liofilización y se vuelve a disolver en agua para la conjugación con la proteína en una segunda etapa. En cuanto al acoplamiento de al menos un grupo amino de la proteína con al menos un grupo aldehído del polímero mediante aminación reductora, se hace referencia a la descripción detallada anterior que se refiere a los parámetros de reacción específicos de la reacción de aminación reductora tal como pH o temperatura. Según realizaciones especialmente preferidas de la presente invención, la aminación reductora se lleva a cabo preferiblemente a una temperatura de desde 0 hasta 5ºC tal como aproximadamente 4ºC a un pH de aproximadamente de 4,5 a 5,5 tal como aproximadamente 5,0 y durante un tiempo de reacción de aproximadamente de 20 a 30 h tal como aproximadamente 24 h.

Según la segunda realización preferida, el polímero se hace reaccionar con un compuesto al menos bifuncional que comprende al menos un grupo funcional M que puede hacerse reaccionar con el polímero y al menos un grupo funcional Q que es un grupo aldehído, un grupo ceto o un grupo hemiacetal y que se hace reaccionar con un grupo

amino de la proteína mediante aminación reductora.

Prefiere emplearse un compuesto que tiene, aparte del grupo aldehído o grupo ceto o grupo hemiacetal, al menos un grupo carboxilo o al menos un grupo carboxilo reactivo, preferiblemente un grupo carboxilo o un grupo carboxilo reactivo. El grupo aldehído o grupo ceto o grupo hemiacetal y el grupo carboxilo o el grupo carboxilo reactivo pueden estar separados por cualquier espaciador adecuado. Entre otros, el espaciador puede ser un residuo hidrocarbonado lineal, ramificado y/o cíclico opcionalmente sustituido. Generalmente, el residuo hidrocarbonado tiene desde 1 hasta 60, preferiblemente desde 1 hasta 40, más preferiblemente desde 1 hasta 20, más preferiblemente desde 2 hasta 10, más preferiblemente desde 2 hasta 6 y de manera especialmente preferible desde 2 hasta 4 átomos de carbono. Si hay heteroátomos presentes, el grupo de separación comprende generalmente desde 1 hasta 20, preferiblemente desde 1 hasta 8 y de manera especialmente preferible desde 1 hasta 4 heteroátomos. El residuo hidrocarbonado puede comprender una cadena de alquilo opcionalmente ramificada o un grupo arilo o un grupo cicloalquilo que tiene, por ejemplo, desde 5 hasta 7 átomos de carbono, o ser un grupo aralquilo, un grupo alcarilo en el que la parte de alquilo puede ser un grupo alquilo lineal y/o cíclico.

Según una realización preferida, el residuo hidrocarbonado es un grupo alquilo que tiene de 2 a 6 y preferiblemente de 2 a 4 átomos de carbono. También es posible que ningún átomo de carbono esté presente entre el grupo aldehído o ceto y el grupo carboxilo. Alternativamente, el residuo hidrocarbonado puede ser un grupo hidrocarbonado cíclico sustituido o no sustituido que tiene de 3 a 11 átomos de carbono, preferiblemente, de 3 a 6 o de 3 a 5 átomos de carbono. Cuando el grupo hidrocarbonado cíclico está sustituido, el sustituyente puede seleccionarse del grupo que consiste en grupos amino o alcoxilo sustituidos o no sustituidos. Si está presente, el número de sustituyentes es preferiblemente de 1 a 3. Además, el grupo hidrocarbonado cíclico y/o alquilo pueden contener uno o más heteroátomos, tales como O o S, en particular O. En este caso, están presentes preferiblemente de 1 a 3, en particular 1 ó 2 heteroátomos. En este contexto los compuestos preferidos se seleccionan del siguiente grupo de compuestos.

Según una realización incluso más preferida, el residuo hidrocarbonado es un residuo arilo que tiene de 5 a 7 y preferiblemente 6 átomos de carbono. Lo más preferiblemente, el residuo hidrocarbonado es el residuo benceno. Según esta realización preferida, el grupo carboxilo y el grupo aldehído pueden ubicarse en el anillo de benceno en la posición 1,4, posición 1,3 o posición 1,2, prefiriéndose la posición 1,4.

Como grupo carboxilo reactivo, puede mencionarse un éster reactivo, isotiocianatos o isocianato. Los ésteres reactivos preferidos se derivan de N-hidroxisuccinimidas tales como N-hidroxisuccinimida o sulfo-Nhidroxisuccinimida, fenoles adecuadamente sustituidos tales como p-nitrofenol o p-dinitrofenol, u o’-dinitrofenol, triclorofenol tal como 2,4,6-triclorofenol o 2,4,5-triclorofenol, trifluorofenol tal como 2,4,6-trifluorofenol o 2,4,5trifluorofenol, pentaclorofenol, pentafluorofenol o hidroxiazoles tales como hidroxibenzotriazol. Especialmente se prefieren N-hidroxisuccinimidas, prefiriéndose especialmente N-hidroxisuccinimida y sulfo-N-hidroxisuccinimida. Todos los alcoholes pueden emplearse solos o como combinación adecuada de dos o más de los mismos. Como ésteres reactivos, se prefieren especialmente éster pentafluorofenílico y éster de N-hidroxisuccinimida.

Ejemplos específicos del compuesto al menos bifuncional que comprende un grupo carboxilo que puede hacerse reaccionar para obtener un grupo carboxilo reactivo son los compuestos de 1 a 11 de la lista anterior en el presente documento. En este contexto, el término “grupo carboxilo” también se refiere a una lactona y un anhídrido interno de un compuesto de ácido dicarboxílico.

Por tanto, una realización, se describe en relación a un método y un conjugado tal como se describieron anteriormente, en los que el polímero se hace reaccionar con ácido formilbenzoico.

Además, se describen un método y un conjugado tal como se describieron anteriormente, en los que el polímero se hace reaccionar con éster pentafluorofenílico del ácido formilbenzoico.

Además, también se describen un método y un conjugado tal como se describieron anteriormente, en los que el polímero se hace reaccionar con éster de N-hidroxisuccinimida del ácido formilbenzoico.

Además se describen un método y un conjugado tal como se describieron anteriormente, en los que el polímero se hace reaccionar con ácido 4-(4-formil-3,5-dimetoxifenoxi)butírico.

El hidroxietilalmidón sometido a la reacción con el compuesto que comprende M, siendo M preferiblemente un grupo carboxilo o un grupo carboxilo reactivo y siendo Q un grupo aldehído o un grupo ceto o un grupo hemiacetal, es, lo más preferiblemente hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 10 kD y un DS de aproximadamente 0,7. También son posibles hidroxietilalmidones que tienen un peso molecular medio de aproximadamente 10 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 12 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 12 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 18 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 18 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 30 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 30 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 50 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 50 kD y un DS de aproximadamente 0,7

o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 100 kD y un DS de aproximadamente 0,7.

En cuanto a cada una de estas combinaciones de peso molecular medio y DS, también se prefiere un valor de DS de aproximadamente 0,8.

De manera particularmente preferible, el hidroxialquilalmidón e incluso más preferiblemente el hidroxietilalmidón se emplea con su extremo reductor en forma oxidada.

El derivado de polímero resultante con el grupo aldehído o el grupo ceto o un grupo hemiacetal se hace reaccionar posteriormente con un grupo amino de la proteína por medio de aminación reductora. En cuanto al acoplamiento de al menos un grupo amino de la proteína con al menos un grupo aldehído o grupo ceto o grupo hemiacetal del polímero mediante aminación reductora, se hace referencia a la descripción detallada anteriormente que se refiere a los parámetros de reacción específicos de la reacción de aminación reductora tal como pH o temperatura. Según una realización especialmente preferida de la presente invención, la reacción con el grupo amino de la proteína se lleva a cabo preferiblemente a una temperatura de desde 0 hasta 40ºC, más preferiblemente de desde 0 hasta 25ºC y de manera especialmente preferible de desde 4 hasta 21ºC. El tiempo de reacción oscila preferiblemente de desde 30 min. hasta 72 h, más preferiblemente de desde 2 hasta 48 h y de manera especialmente preferible de desde 4 h hasta 17 h. Como disolvente para la reacción, se prefiere un medio acuoso. El valor de pH del medio de reacción está preferiblemente en el intervalo de desde 4 hasta 9, más preferiblemente de desde 4 hasta 8 y de manera especialmente preferible de desde 4,5 hasta 5,5.

Además se describe que el polímero se hace reaccionar en su extremo reductor opcionalmente oxidado con un compuesto al menos bifuncional que comprende un grupo amino M y un grupo funcional Q, en el que dicho grupo amino M se hace reaccionar con el extremo reductor opcionalmente oxidado del polímero y en el que el grupo funcional Q se modifica químicamente para dar un derivado de polímero funcionalizado con aldehído que se hace reaccionar con un grupo amino de la proteína mediante aminación reductora.

En cuanto al grupo funcional Q, se mencionan los siguientes grupos funcionales, entre otros:

-

dobles enlaces C-C o triples enlaces C-C o enlaces C-C aromáticos;

-

el grupo tio o los grupos hidroxilo;

-

hidrazida del ácido alquilsulfónico, hidrazida del ácido arilsulfónico;

-

1,2-dioles;

-

1,2-amino-tioalcoholes;

-

azidas;

-

1,2-aminoalcoholes;

-

el grupo amino -NH2 o derivados de los grupos amino que comprenden la unidad estructural - NH- tales como grupos aminoalquilo, grupos aminoarilo, grupos aminoaralquilo, o grupos alcarilamino;

-

el grupo hidroxilamino -O-NH2, o derivados del grupo hidroxilamino que comprenden la unidad estructural -O-NH-, tales como grupos hidroxilalquilamino, grupos hidroxilarilamino, grupos hidroxilaralquilamino o grupos hidroxialcarilamino;

-

grupos alcoxiamino, grupos ariloxiamino, grupos aralquiloxiamino o grupos alcariloxiamino, comprendiendo cada uno la unidad estructural -NH-O-;

-

residuos que tienen un grupo carbonilo, -Q-C(=G)-M, en el que G es O o S, y M es, por ejemplo, -- -OH o -SH;

-

un grupo alcoxilo, un grupo ariloxilo, un grupo aralquiloxilo o un grupo alcariloxilo;

-

un grupo alquiltio, un grupo ariltio, un grupo aralquiltio o un grupo alcariltio;

-

un grupo alquilcarboniloxilo, un grupo arilcarboniloxilo, un grupo aralquilcarboniloxilo, un grupo alcarilcarboniloxilo; -- ésteres activados tales como ésteres de hidroxilaminas que tienen estructura terciaria tal como Nhidroxisuccinimida o que tienen una unidad estructural O-N en la que N es parte de un compuesto de heteroarilo o,

con G=O y Q ausentes, tal como compuestos ariloxilo con un residuo arilo sustituido tal como pentafluorofenilo, paranitrofenilo o triclorofenilo; en los que Q está ausente o NH o un heteroátomo tal como S u O; - -NH-NH2, o -NH-NH-; - -NO2;

-

el grupo nitrilo;

-

grupos carbonilo tales como el grupo aldehído o el grupo ceto;

-

el grupo carboxilo;

-

el grupo -N=C=O o el grupo -N=C=S;

-

grupos haluro de vinilo tales como el grupo yoduro de vinilo o bromuro de vinilo o triflato; - -C≡C-H; - -(C=NH2Cl)-O-alquilo

-

grupos -(C=O)-CH2-Hal en los que Hal es Cl, Br o I; - -CH=CH-SO2-;

-

un grupo disulfuro que comprende la estructura -S-S-;

-

el grupo

-

el grupo

También se describe que el término “grupo funcional Q” se refiere a un grupo funcional Q que comprende la estructura química -NH-.

10 También se describe que el grupo funcional M es un grupo que tiene la estructura R’-NH-en la que R’ es hidrógeno

o un residuo alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, arilcicloalquilo, alcarilo o cicloalquilarilo en el que el residuo cicloalquilo, arilo, aralquilo, arilcicloalquilo, alcarilo o cicloalquilarilo puede unirse directamente al grupo NH o, según otra realización, puede unirse mediante un puente de oxígeno al grupo NH. Los residuos alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, arilcicloalquilo, alcarilo o cicloalquilarilo pueden estar sustituidos adecuadamente. Como sustituyentes

15 preferidos, pueden mencionarse halógenos tales como F, Cl o Br. Residuos de R’ especialmente preferidos son grupos hidrógeno, alquilo y alcoxilo, e incluso más preferidos son grupos hidrógeno y alcoxilo y alquilo no sustituidos.

Entre los grupos alquilo y alcoxilo, se prefieren grupos con 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 átomos de C. Más preferidos son grupos 20 metilo, etilo, propilo, isopropilo, metoxilo, etoxilo, propoxilo e isopropoxilo. Especialmente se prefieren metilo, etilo, metoxilo, etoxilo, y se les da preferencia particular a metilo o metoxilo.

También se describe que el grupo funcional M tiene la estructura R’- NH-R”-en la que R” comprende preferiblemente la unidad estructural -NH- y/o la unidad estructural -(C=G)- en la que G es O o S, y/o la unidad 25 estructural -SO2-. Ejemplos específicos para el grupo funcional R” son

en los que, si G está presente dos veces, es independientemente O o S.

35 Por tanto, también se describen un método y un conjugado tal como se mencionaron anteriormente en los que el grupo funcional M se selecciona del grupo que consiste en H2N-

en los que G es O o S y,si está presente dos veces, independientemente O o S, y R’ es metilo.

5 Según una realización descrita adicionalmente, el grupo funcional M es un grupo amino -NH2.

El término “grupo amino Q” se refiere a un grupo funcional Q que comprende la estructura química -NH-.

También se describe que el grupo funcional Q es un grupo que tiene la estructura R’-NH-en la que R’ es hidrógeno

10 o un residuo alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, arilcicloalquilo, alcarilo o cicloalquilarilo en el que el residuo cicloalquilo, arilo, aralquilo, arilcicloalquilo, alcarilo o cicloalquilarilo puede unirse directamente al grupo NH o, según otra realización, puede unirse mediante un puente de oxígeno al grupo NH. Los residuos alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, arilcicloalquilo, alcarilo o cicloalquilarilo pueden estar sustituidos adecuadamente. Como sustituyentes

preferidos, pueden mencionarse halógenos tales como F, Cl o Br. Residuos de R’ especialmente preferidos son

15 grupos hidrógeno, alquilo y alcoxilo, e incluso más preferidos son grupos hidrógeno y alcoxilo y alquilo no sustituidos.

Entre los grupos alquilo y alcoxilo, se prefieren grupos con 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 átomos de C. Más preferidos son grupos metilo, etilo, propilo, isopropilo, metoxilo, etoxilo, propoxilo e isopropoxilo. Especialmente se prefieren metilo, etilo, 20 metoxilo, etoxilo, y se les da preferencia particular a metilo o metoxilo.

También se describe que el grupo funcional Q tiene la estructura R’- NH-R”-en la que R” comprende preferiblemente la unidad estructural -NH- y/o la unidad estructural -(C=G)- en la que G es O o S, y/o la unidad estructural -SO2-.

Según realizaciones más preferidas, el grupo funcional R” se selecciona del grupo que consiste en

y

en los que, si G está presente dos veces, es independientemente O o S.

Por tanto, también se describen un método y un conjugado tal como se mencionaron anteriormente en los que el 35 grupo funcional Q se selecciona del grupo que consiste en

H2N-

en los que G es O o S y, si está presente dos veces, independientemente O o S, y R’ es metilo,. 45 También se describe que el grupo funcional Q es un grupo amino NH2.

Además se describe que tanto M como Q comprenden un grupo amino -NH-. Según una realización particularmente preferida, tanto M como Q son un grupo amino -NH2.

También se describe que el compuesto que comprende M y Q es un compuesto homobifuncional, más preferiblemente un compuesto homobifuncional que comprende, como grupos funcionales M y Q, lo más preferiblemente el grupo amino -NH2, o según otras realizaciones, el grupo hidroxilamino -O-NH2 o el grupo

siendo G preferiblemente O. Ejemplos específicos para estos compuestos que comprenden M y Q son

15 o

o

El hidroxietilalmidón sometido a la reacción con el compuesto que comprende M, siendo M preferiblemente un grupo

amino -NH- y siendo más preferiblemente un grupo amino -NH2, todavía más preferiblemente comprendiendo tanto 25 M como Q un grupo amino -NH- y de manera particularmente preferible comprendiendo tanto M como Q un grupo

amino -NH2, es preferiblemente el hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 10 kD

y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 10

kD y un DS de aproximadamente 0,7. También son posibles o hidroxietilalmidones que tienen un peso molecular

medio de aproximadamente 12 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso 30 molecular medio de aproximadamente 12 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un

peso molecular medio de aproximadamente 18 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene

un peso molecular medio de aproximadamente 18 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que

tiene un peso molecular medio de aproximadamente 30 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón

que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 30 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o 35 hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 50 kD y un DS de aproximadamente 0,4

o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 50 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 100 kD y un DS de aproximadamente 0,7.

40 En cuanto a cada una de estas combinaciones de peso molecular medio y DS, también se prefiere un valor de DS de aproximadamente 0,8.

En el caso de que tanto M como Q sean un grupo amino -NH2, M y Q pueden separarse mediante cualquier

espaciador adecuado. Entre otros, el espaciador puede ser un residuo hidrocarbonado lineal, ramificado y/o cíclico 45 opcionalmente sustituido. Generalmente, el residuo hidrocarbonado tiene desde 1 hasta 60, preferiblemente desde 1

hasta 40, más preferiblemente desde 1 hasta 20, más preferiblemente desde 2 hasta 10, más preferiblemente desde

2 hasta 6 y de manera especialmente preferible desde 2 hasta 4 átomos de carbono. Si hay heteroátomos

presentes, el grupo de separación comprende generalmente desde 1 hasta 20, preferiblemente desde 1 hasta 8 y de

manera especialmente preferible desde 1 hasta 4 heteroátomos. El residuo hidrocarbonado puede comprender una 50 cadena de alquilo opcionalmente ramificada o un grupo arilo o un grupo cicloalquilo que tiene, por ejemplo, desde 5

hasta 7 átomos de carbono, o ser un grupo aralquilo, un grupo alcarilo en el que la parte alquilo puede ser un grupo

alquilo lineal y/o cíclico. Según una realización incluso más preferida, el residuo hidrocarbonado es una cadena de alquilo de desde 1 hasta 20, preferiblemente desde 2 hasta 10, más preferiblemente desde 2 hasta 6, y de manera especialmente preferible desde 2 hasta 4 átomos de carbono.

Por tanto, también se describen un método y un conjugado tal como se describieron anteriormente, en los que el polímero se hace reaccionar con 1,4-diaminobutano, 1,3-diaminopropano o 1,2-diaminoetano para dar un derivado de polímero.

Según una primera alternativa, siendo el grupo funcional M un grupo amino NH2, se hace reaccionar con el extremo reductor oxidado del polímero dando como resultado un enlace de grupo amido del polímero y el compuesto que comprende M y Q.

Según una segunda alternativa, siendo el grupo funcional M un grupo amino NH2 se hace reaccionar con el extremo reductor no oxidado del polímero por medio de aminación reductora dando como resultado un grupo imino que posteriormente se hidrogena preferiblemente para dar un grupo amino, el grupo imino y el grupo amino, respectivamente, enlazan el polímero y el compuesto que comprende M y Q. En este caso, es posible que el grupo funcional Q sea un grupo amino. En el caso de que el derivado de polímero resultante deba someterse a una reacción posterior con un compuesto al menos bifuncional por medio de un grupo carboxilo o un grupo carboxilo reactivo, tal como se describe a continuación en el presente documento, u otro grupo de un compuesto al menos bifuncional que va a hacerse reaccionar con un grupo amino, se prefiere que el compuesto que comprende M y Q sea una amina primaria que contenga, como grupo funcional, solo un grupo amino. En este caso específico, aunque el compuesto contenga solo un grupo funcional, se considera como compuesto bifuncional que comprende M y Q en el que M es el grupo amino contenido en el compuesto sometido a la aminación reductora con el extremo reductor del polímero, y en el que Q es el grupo amino secundario que resulta de la aminación reductora y posterior hidrogenación.

Según una tercera alternativa, el extremo reductor no oxidado del polímero se hace reaccionar con amoniaco por medio de aminación reductora dando como resultado un grupo imino terminal del polímero que posteriormente se hidrogena preferiblemente para dar un grupo amino terminal del polímero y por tanto un grupo amino primario terminal. En este caso específico, el amoniaco se considera como compuesto bifuncional que comprende M y Q en el que M es NH2 comprendido en el amoniaco empleado, y en el que Q es el grupo amino primario que resulta de la aminación reductora y posterior hidrogenación.

La reacción del compuesto al menos bifuncional que comprende M y Q con el polímero se lleva a cabo preferiblemente a una temperatura de desde 0 hasta 100ºC, más preferiblemente de desde 4 hasta 80ºC y de manera especialmente preferible de desde 20 hasta 80ºC; el tiempo de reacción oscila preferiblemente de desde 4 h hasta 7 d, más preferiblemente de desde 10 h hasta 5 d y de manera especialmente preferible de desde 17 hasta 4

h. La razón molar de compuesto al menos bifuncional: polímero está preferiblemente en el intervalo de desde 10 hasta 200, especialmente desde 50 hasta 100.

Como disolvente para la reacción del compuesto al menos bifuncional con el polímero, se prefiere al menos un disolvente aprótico, de manera particularmente preferible un disolvente aprótico anhidro que tiene un contenido en agua de no más del 0,5 por ciento en peso, preferiblemente de no más del 0,1 por ciento en peso. Disolventes adecuados son, entre otros, dimetilsulfóxido (DMSO), N-metilpirrolidona; dimetilacetamida (DMA), dimetilformamida (DMF) y mezclas de dos o más de los mismos.

Como disolvente para la reacción del compuesto al menos bifuncional con el polímero, también puede usarse un medio acuoso.

También se describe que el derivado de polímero que comprende el polímero y el compuesto al menos bifuncional se modifica químicamente en el grupo funcional Q libre para dar un derivado de polímero que comprende un grupo aldehído o grupo ceto o grupo hemiacetal. Según esta realización, se prefiere hacer reaccionar el derivado de polímero con al menos un compuesto al menos bifuncional que comprende un grupo funcional que puede hacerse reaccionar con el grupo funcional Q y un grupo aldehído o grupo ceto o grupo hemiacetal.

Como compuesto al menos bifuncional, es adecuado cada compuesto que tiene un grupo aldehído o grupo ceto o grupo hemiacetal y al menos un grupo funcional que puede formar un enlace con el grupo funcional Q del derivado de polímero. Se selecciona el al menos un grupo funcional de la misma fuente de grupos funcionales que Q y se elige para que pueda hacerse reaccionar con Q. En el caso preferido de que Q sea un grupo amino -NH2, prefiere emplearse un compuesto que tiene, aparte del grupo aldehído o grupo ceto o grupo hemiacetal, al menos un grupo carboxilo o al menos un grupo carboxilo reactivo, preferiblemente un grupo carboxilo o un grupo carboxilo reactivo. El grupo aldehído o grupo ceto o grupo hemiacetal y el grupo carboxilo o el grupo carboxilo reactivo pueden separarse mediante cualquier espaciador adecuado. Entre otros, el espaciador puede ser un residuo hidrocarbonado lineal, ramificado y/o cíclico opcionalmente sustituido. Generalmente, el residuo hidrocarbonado tiene desde 1 hasta 60, preferiblemente desde 1 hasta 40, más preferiblemente desde 1 hasta 20, más preferiblemente desde 2 hasta 10, más preferiblemente desde 2 hasta 6 y de manera especialmente preferible desde 2 hasta 4 átomos de carbono. Si hay heteroátomos presentes, el grupo de separación comprende generalmente desde 1 hasta 20, preferiblemente

desde 1 hasta 8 y de manera especialmente preferible desde 1 hasta 4 heteroátomos. El residuo hidrocarbonado puede comprender una cadena de alquilo opcionalmente ramificada o un grupo arilo o un grupo cicloalquilo que tiene, por ejemplo, desde 5 hasta 7 átomos de carbono, o ser un grupo aralquilo, un grupo alcarilo en el que la parte alquilo puede ser un grupo alquilo lineal y/o cíclico.

Además se describe que el residuo hidrocarbonado es un grupo alquilo que tiene de 2 a 6 y preferiblemente de 2 a 4 átomos de carbono. También es posible que no haya ningún átomo de carbono presente entre el grupo aldehído o ceto y el grupo carboxilo. Alternativamente, el residuo hidrocarbonado puede ser un grupo hidrocarbonado cíclico sustituido o no sustituido que tiene de 3 a 11 átomos de carbono, preferiblemente, de 3 a 6 o de 3 a 5 átomos de carbono. Cuando el grupo hidrocarbonado cíclico está sustituido, el sustituyente puede seleccionarse del grupo que consiste en grupos amino o alcoxilo sustituidos o no sustituidos. Si están presentes, el número de sustituyentes es preferiblemente de 1 a 3. Además, el grupo hidrocarbonado cíclico y/o alquilo pueden contener uno o más heteroátomos, tales como O o S, en particular O. En este caso, están presentes preferiblemente de 1 a 3, en particular 1 ó 2 heteroátomos. En este contexto, los compuestos preferidos se seleccionan del siguiente grupo de compuestos.

También se describe que el residuo hidrocarbonado es un residuo arilo que tiene de 5 a 7 y preferiblemente 6 átomos de carbono. Lo más preferiblemente, el residuo hidrocarbonado es el residuo benceno. Según esta realización, el grupo carboxilo y el grupo aldehído pueden ubicarse en el anillo de benceno en la posición 1,4, posición 1,3 o posición 1,2, prefiriéndose la posición 1,4.

Como grupo carboxilo reactivo, pueden mencionarse un éster reactivo, isotiocianatos o isocianato. Los ésteres reactivos preferidos se derivan a partir de N-hidroxisuccinimidas tales como N-hidroxisuccinimida o sulfo-Nhidroxisuccinimida, fenoles adecuadamente sustituidos tales como p-nitrofenol o p-dinitrofenol, u o’-dinitrofenol, triclorofenol tal como 2,4,6-triclorofenol o 2,4,5-triclorofenol, trifluorofenol tal como 2,4,6-trifluorofenol o 2,4,5trifluorofenol, pentaclorofenol, pentafluorofenol o hidroxiazoles tales como hidroxibenzotriazol. Especialmente se prefieren N-hidroxisuccinimidas, prefiriéndose especialmente N-hidroxisuccinimida y sulfo-N-hidroxisuccinimida. Todos los alcoholes pueden emplearse solos o como combinación adecuada de dos o más de los mismos. Como ésteres reactivos, se prefieren especialmente éster pentafluorofenílico y éster de N-hidroxisuccinimida.

Según una realización específica, el grupo funcional que puede formar un enlace químico con el grupo funcional Q, siendo Q preferiblemente NH2 o un derivado del grupo amino que comprende la unidad estructural –NH- tal como grupos aminoalquilo, grupos aminoarilo, grupos aminoaralquilo o grupos alcarilamino, siendo en particular NH2, es un grupo carboxilo reactivo.

En este caso, el grupo funcional que puede formar un enlace químico con el grupo funcional Q y que es un grupo carboxilo, se hace reaccionar adecuadamente para obtener un grupo carboxilo reactivo tal como se describió anteriormente en el presente documento. Por tanto, se prefiere someter el al menos un compuesto al menos bifuncional que comprende un grupo carboxilo y un grupo aldehído o grupo ceto o grupo hemiacetal, a una reacción en la que el grupo carboxilo se transforma en un grupo carboxilo reactivo, y el compuesto resultante al menos bifuncional se purifica y se hace reaccionar con el grupo funcional Q del derivado de polímero.

Ejemplos específicos del compuesto al menos bifuncional que comprende un grupo carboxilo que pueden hacerse reaccionar para obtener un grupo carboxilo reactivo son los compuestos de 1 a 11 de la lista anterior en el presente

documento. En este contexto, el término “grupo carboxilo” también se refiere a una lactona y a un anhídrido interno

de un compuesto de ácido dicarboxílico.

Por tanto, también se describen un método y un conjugado tal como se describieron anteriormente, en los que el derivado de polímero que comprende Q, siendo Q un grupo amino NH2, se hace reaccionar adicionalmente con ácido formilbenzoico.

Además, también se describen un método y un conjugado tal como se describieron anteriormente, en los que el derivado de polímero que comprende Q, siendo Q un grupo amino, se hace reaccionar adicionalmente con éster pentafluorofenílico del ácido formilbenzoico.

Aún según otra realización, también se describen un método y un conjugado tal como se describieron anteriormente, en los que el derivado de polímero que comprende Q, siendo Q un grupo amino, se hace reaccionar adicionalmente con éster de N-hidroxisuccinimida del ácido formilbenzoico.

Aún según otra realización, también se describen un método y un conjugado tal como se describieron anteriormente, en los que el derivado de polímero que comprende Q, siendo Q un grupo amino, se hace reaccionar adicionalmente con ácido 4-(4-formil-3,5-dimetoxifenoxi)butírico.

Según otra realización preferida, también se describen un método y un conjugado tal como se describieron anteriormente, en los que el derivado de polímero que comprende Q, siendo Q un grupo amino -NH2, se hace reaccionar adicionalmente con un compuesto bifuncional que es un compuesto biocompatible del grupo que consiste en ácidos alfa-cetocarboxílicos, ácidos siálicos o derivados de los mismos y fosfato de piridoxal.

Con respecto a los ácidos alfa-cetocarboxílicos, éstos son preferiblemente ácidos alfa-cetocarboxílicos derivados de aminoácidos y en la mayoría de los casos también pueden encontrarse en el cuerpo humano. Los ácidos alfacetocarboxílicos preferidos derivados de aminoácidos se seleccionan del grupo que consiste en ceto-valina, cetoleucina, ceto-isoleucina y ceto-alanina. El grupo carboxilo de los ácidos alfa-cetocarboxílicos se hace reaccionar con el grupo Q del polímero siendo un grupo amino. Mediante esto, se forma un grupo amido. Entonces el grupo ceto libre restante del ácido alfa-cetocarboxílico puede hacerse reaccionar con un grupo funcional de la proteína, en particular un grupo amino. Mediante esto se forma un grupo imino que puede hidrogenarse.

Por consiguiente, también se describen un método y un conjugado tal como se describieron anteriormente, en los que el derivado de polímero que comprende Q, siendo Q un grupo amino, se hace reaccionar adicionalmente con un ácido alfa-cetocarboxílico.

Con respecto a los ácidos siálicos o derivados de los mismos, éstos son preferiblemente biocompatibles, en particular son azúcares encontrados en el cuerpo humano, que están N- y/o O-acetilados. En una realización preferida, los ácidos neurámicos o ácidos siálicos son ácidos N-acetilo neurámicos. Estos compuestos muestran una rigidez deseada debido a la estructura de piranosa con el fin de cumplir la función como espaciador. Por otro lado, puede ser posible introducir un grupo aldehído en estos compuestos a través de oxidación selectiva. Los ácidos siálicos se encuentran en el cuerpo humano por ejemplo como monosacáridos terminales en cadenas de glicano de proteínas glicosiladas.

En una realización preferida, el ácido siálico puede oxidarse de manera selectiva para dar un grupo aldehído.

En la técnica se conocen métodos para oxidar de manera selectiva ácidos siálicos o ácidos neurámicos, por ejemplo de L.W. Jaques, B.F. Riesco, W. Weltner, Carbohydrate Research, 83 (1980), 21-32 y T. Masuda, S. Shibuya, M. Aral, S. Yoshida, T. Tomozawa, A. Ohno, M. Yamashita, T. Honda, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 13 (2003), 669-673. Preferiblemente la oxidación del ácido siálico puede realizarse antes de la reacción con el polímero que contiene Q, siendo Q un grupo amino.

Entonces, el ácido siálico opcionalmente oxidado puede hacerse reaccionar por medio de su grupo ácido carboxílico con el grupo amino del polímero.

Los compuestos resultantes contienen un grupo aldehído que entonces puede hacerse reaccionar adicionalmente mediante aminación reductora con un grupo amino de una proteína.

Por consiguiente, también se describe un conjugado tal como se describió anteriormente, en el que el derivado de polímero que comprende Q, siendo Q un grupo amino, se hace reaccionar adicionalmente con un ácido siálico opcionalmente oxidado.

Con respecto al fosfato de piridoxal (PyP), este es un compuesto bifuncional altamente biocompatible y también se denomina vitamina B6. PyP es una coenzima que participa en transaminaciones, descarboxilaciones, racemizaciones y numerosas modificaciones de cadenas laterales de aminoácido. Todas las enzimas que requieren PyP actúan por medio de la formación de una base de Schiff entre el aminoácido y la coenzima.

El grupo fosfato del PyP puede hacerse reaccionar con el grupo amino del polímero, preferiblemente hidroxialquilalmidón, en particular hidroxietilalmidón, formando una fosforamida. Entonces, el grupo aldehído de PyP puede hacerse reaccionar con el grupo amino de una proteína, formando una base de Schiff, que entonces puede reducirse. En una realización preferida, la estructura del conjugado es HES-NH-P(O)2-O-(piridoxal)-CH-NH-proteína.

En el caso de PyP, el grupo funcional Q del polímero se introduce preferiblemente en el polímero mediante el uso de un compuesto de diamino tal como se describió anteriormente.

Por consiguiente, también se describen un método y un conjugado tal como se describieron anteriormente, en los que el derivado de polímero que comprende Q, siendo Q un grupo amino, se hace reaccionar adicionalmente con fosfato de piridoxal.

Como disolvente para la reacción del derivado de polímero que comprende un grupo amino y, por ejemplo, ácido formilbenzoico, se prefiere al menos un disolvente aprótico o al menos un disolvente polar. Disolventes adecuados son, entre otros, agua, dimetilsulfóxido (DMSO), N-metilpirrolidona, dimetilacetamida (DMA), dimetilformamida (DMF) y mezclas de dos o más de los mismos.

Como disolvente para la reacción del derivado de polímero que comprende un grupo amino y el compuesto al menos bifuncional que comprende un grupo carboxilo, también es posible usar un medio acuoso. El término “medio acuoso” tal como se usa en este contexto de la presente invención se refiere a un disolvente o una mezcla de disolventes que comprende agua en el intervalo de desde al menos el 10% en peso o al menos el 20% en peso o al menos el 30% en peso o al menos el 40% en peso o al menos el 50% en peso o al menos el 60% en peso o al menos el 70% en peso o al menos el 80% en peso o al menos el 90% en peso o hasta el 100% en peso, en base al peso de los disolventes implicados.

La reacción se lleva a cabo preferiblemente a una temperatura de desde 0 hasta 40ºC, más preferiblemente de desde 0 hasta 25ºC y de manera especialmente preferible de desde 15 hasta 25ºC durante un tiempo de reacción preferiblemente de desde 0,5 hasta 24 h y de manera especialmente preferible de desde 1 hasta 17 h.

Además se describe que la reacción se lleva a cabo en presencia de un agente de activación. Agentes de activación adecuados son, entre otros, carbodiimidas tales como diisopropilcarbodiimida (DIC), diciclohexilcarbodiimidas (DCC); 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC), prefiriéndose especialmente diisopropilcarbodiimida (DIC).

El derivado de polímero resultante puede purificarse a partir de la mezcla de reacción mediante al menos un método adecuado. Si es necesario, el derivado de polímero puede precipitarse antes del aislamiento mediante al menos un método adecuado.

Si el derivado de polímero se precipita en primer lugar, es posible, por ejemplo, poner en contacto la mezcla de reacción con al menos un disolvente o mezcla de disolventes distinto del disolvente o mezcla de disolventes presente en la mezcla de reacción a temperaturas adecuadas. Además se describe que se usa un medio acuoso, preferiblemente agua, como disolvente, la mezcla de reacción se pone en contacto con 2-propanol o con una mezcla de acetona y etanol, preferiblemente una mezcla 1:1 (v/v), que indica volúmenes iguales de dichos compuestos, a una temperatura, preferiblemente en el intervalo de desde -20 hasta +50ºC y de manera especialmente preferible en el intervalo de desde -20 hasta 25ºC.

El aislamiento del derivado de polímero puede llevarse a cabo mediante un procedimiento adecuado que puede comprender una o más etapas. Según una realización preferida de la presente invención, el derivado de polímero se separa en primer lugar de la mezcla de reacción o la mezcla de la mezcla de reacción con, por ejemplo, mezcla de 2-propanol acuoso, mediante un método adecuado tal como centrifugación o filtración. En una segunda etapa, el derivado de polímero separado puede someterse a un tratamiento adicional tal como un tratamiento posterior tal como diálisis, filtración por centrifugación o filtración por presión, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de fase inversa, HPLC, MPLC, filtración en gel y/o liofilización. Según una realización incluso más preferida, el derivado de polímero separado se dializa en primer lugar, preferiblemente frente a agua, y entonces se liofiliza hasta que el contenido en disolvente del producto de reacción es suficientemente bajo según las especificaciones deseadas del producto. La liofilización puede llevarse a cabo a temperatura de desde 20 hasta 35ºC, preferiblemente de desde 20 hasta 30ºC.

El derivado de polímero resultante con el grupo aldehído o grupo ceto o grupo hemiacetal se hace reaccionar posteriormente con un grupo amino de la proteína por medio de aminación reductora. En cuanto al acoplamiento de al menos un grupo amino de la proteína con al menos un grupo aldehído o grupo ceto o grupo hemiacetal del polímero mediante aminación reductora, se hace referencia a la descripción detallada anterior que se refiere a los parámetros de reacción específicos de la reacción de aminación reductora tal como pH o temperatura. Según una

5 realización especialmente preferida de la presente invención, la aminación reductora se lleva a cabo a una temperatura de desde 0 hasta 10ºC tal como desde 1 hasta 8ºC o desde 2 hasta 6ºC tal como aproximadamente 4ºC a un pH de aproximadamente de 4,5 a 5,5 tal como aproximadamente 5,0. El tiempo de reacción es aproximadamente de 10 a 20 h tal como desde 12 hasta 19 h o desde 14 hasta 18 h tal como aproximadamente 17 h o aproximadamente de 20 a 30 h tal como aproximadamente 24 h.

10 Por tanto, en caso de que el polímero se hiciera por medio de su extremo reductor oxidado, se describe un conjugado según la fórmula

Según una realización especialmente preferida, el polímero es hidroxietilalmidón, es decir HAS’ es HES’, y n = 2, 3 ó

4, lo más preferiblemente 4, tal como se describió anteriormente. Por tanto, en caso de que se hiciera reaccionar el polímero por medio de su extremo reductor oxidado, también se describe un conjugado según la fórmula.

En caso de que se hiciera reaccionar el polímero por medio de su extremo reductor oxidado, también se describe un conjugado según la fórmula

en la que n = 2, 3 ó 4, siendo R4 independientemente hidrógeno o un grupo metoxilo, y m = 0 en caso de que R4 sea hidrógeno y m = 1 en caso de que R4 sea metoxilo, siendo HAS preferiblemente HES’.

30 En cada una de las fórmulas anteriores, el nitrógeno unido a la proteína deriva del grupo amino de la proteína a la que se une el derivado de polímero por medio del grupo aldehído.

Con respecto a las realizaciones mencionadas anteriormente según las que los grupos funcionales M y Q comprenden un grupo amino -NH2, también es posible que M sea un grupo amino -NH2 y Q comprende un grupo amino beta hidroxilo -CH(OH)-CH2-NH2 y preferiblemente es un grupo amino beta hidroxilo.

Por tanto, también se describen un método y un conjugado tal como se describieron anteriormente, en los que el grupo amino Q del compuesto que comprende dos grupos amino M y Q, es un grupo amino beta hidroxilo -CH(OH)-CH2-NH2.

En este caso, M y Q pueden separarse mediante cualquier espaciador adecuado. Entre otros, el espaciador puede ser un residuo hidrocarbonado lineal, ramificado y/o cíclico opcionalmente sustituido. Generalmente, el residuo hidrocarbonado tiene desde 1 hasta 60, preferiblemente desde 1 hasta 40, más preferiblemente desde 1 hasta 20, más preferiblemente desde 2 hasta 10, más preferiblemente desde 1 hasta 6 y de manera especialmente preferible desde 1 hasta 2 átomos de carbono. Si hay heteroátomos presentes, el grupo de separación comprende generalmente desde 1 hasta 20, preferiblemente desde 1 hasta 8 y de manera especialmente preferible desde 1 hasta 4 heteroátomos. El residuo hidrocarbonado puede comprender una cadena de alquilo opcionalmente ramificada o un grupo arilo o un grupo cicloalquilo que tiene, por ejemplo, desde 5 hasta 7 átomos de carbono, o ser un grupo aralquilo, un grupo alcarilo en el que la parte alquilo puede ser un grupo alquilo lineal y/o cíclico. Según una realización incluso más preferida, el residuo hidrocarbonado es una cadena de alquilo de desde 1 hasta 20, preferiblemente desde 1 hasta 10, más preferiblemente desde 1 hasta 6, más preferiblemente desde 1 hasta 4 átomos de carbono y de manera especialmente preferible desde 1 hasta 2 átomos de carbono. Todavía más preferiblemente, M y Q están separados por un grupo metileno.

Por tanto, también se describen un método y un conjugado tal como se describieron anteriormente, en los que el polímero se hace reaccionar con 1,3-diamino-2-hidroxipropano.

En caso de que se haga reaccionar el polímero por medio de su extremo reductor oxidado, resulta de manera especialmente preferible un derivado de polímero según la fórmula

con HAS’ = HES’

La reacción del compuesto al menos bifuncional que comprende M y Q, de manera particularmente preferible 1,3diamino-2-hidroxipropano, con el polímero se lleva a cabo preferiblemente a una temperatura de desde 40 hasta 120ºC, más preferiblemente de desde 40 hasta 90ºC y de manera especialmente preferible de desde 60 hasta 80ºC. El tiempo de reacción oscila preferiblemente desde 17 hasta 168 h, más preferiblemente desde 17 hasta 96 h y de manera especialmente preferible desde 48 hasta 96 h. La razón molar de compuesto al menos bifuncional:polímero está preferiblemente en el intervalo de desde 200:1 hasta 10:1, especialmente desde 50:1 hasta 100:1.

Como disolvente para la reacción del compuesto al menos bifuncional con el polímero, se prefiere al menos un disolvente aprótico, preferiblemente un disolvente aprótico anhidro que tiene un contenido en agua de no más del 0,5 por ciento en peso, preferiblemente de no más del 0,1 por ciento en peso. Disolventes adecuados son, entre otros, dimetilsulfóxido (DMSO), N-metilporrolidona, dimetilacetamida (DMA), dimetilformamida (DMF) y mezclas de dos o más de los mismos.

El grupo amino beta hidroxilo Q del derivado de polímero puede hacerse reaccionar generalmente con un compuesto al menos bifuncional que comprende al menos un grupo funcional que puede hacerse reaccionar con Q y que comprende además al menos un grupo funcional siendo un grupo aldehído o grupo ceto o grupo hemiacetal o un grupo funcional que puede modificarse para dar un grupo aldehído o grupo ceto o grupo hemiacetal. Según otra realización, el grupo amino beta hidroxilo se modifica químicamente de manera directa para dar un grupo aldehído mediante oxidación química.

Esta oxidación puede llevarse a cabo con todos los agentes de oxidación adecuados, que pueden convertir el grupo amino beta hidroxilo en un grupo aldehído. Reactivos de oxidación preferidos son peryodatos tales como peryodatos de metal alcalino. Especialmente se prefiere peryodato de sodio que se emplea preferiblemente como disolución acuosa. Esta disolución tiene una concentración de yodato preferida de desde 1 hasta 50 mM, más preferiblemente desde 1 hasta 25 mM y de manera especialmente preferible de desde 1 hasta 10 mM. La oxidación se lleva a cabo a una temperatura de desde 0 hasta 40ºC, preferiblemente desde 0 hasta 25ºC y de manera especialmente preferible desde 4 hasta 20ºC.

5 El derivado de polímero resultante puede purificarse a partir de la mezcla de reacción mediante al menos un método adecuado. Si es necesario, el derivado de polímero puede precipitarse antes del aislamiento mediante al menos un método adecuado.

Si el derivado de polímero se precipita en primer lugar, es posible, por ejemplo, poner en contacto la mezcla de

10 reacción con al menos un disolvente o mezcla de disolventes distinto del disolvente o mezcla de disolventes presente en la mezcla de reacción a temperaturas adecuadas. Según una realización particularmente preferida en la que se usa un medio acuoso, preferiblemente agua, como disolvente, la mezcla de reacción se pone en contacto con 2-propanol o con una mezcla de acetona y etanol, preferiblemente una mezcla 1:1 (v/v), que indica volúmenes iguales de dichos compuestos, a una temperatura, preferiblemente en el intervalo de desde -20 hasta +50ºC y de

15 manera especialmente preferible en el intervalo de desde -20 hasta 25ºC.

El aislamiento del derivado de polímero puede llevarse a cabo mediante un procedimiento adecuado que puede comprender una o más etapas. Según una realización preferida, el derivado de polímero se separa en primer lugar de la mezcla de reacción o la mezcla de la mezcla de reacción con, por ejemplo, mezcla de 2-propanol acuoso, 20 mediante un método adecuado tal como centrifugación o filtración. En una segunda etapa, el derivado de polímero separado puede someterse a un tratamiento adicional tal como un tratamiento posterior tal como diálisis, filtración por centrifugación o filtración por presión, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de fase inversa, HPLC, MPLC, filtración en gel y/o liofilización. Según una realización incluso más preferida, el derivado de polímero separado se dializa en primer lugar, preferiblemente frente a agua, y entonces se liofiliza hasta que el contenido en

25 disolvente del producto de reacción es suficientemente bajo según las especificaciones deseadas del producto. La liofilización puede llevarse a cabo a temperatura de desde 20 hasta 35ºC, preferiblemente de desde 20 hasta 30ºC.

Por tanto, también se describen un método y un conjugado tal como se describieron anteriormente, en los que la oxidación del grupo amino beta hidroxilo Q se lleva a cabo usando un peryodato.

30 Por tanto, también se describe un método de producción de un conjugado, en el que, en caso de que se empleara el polímero con el extremo reductor oxidado, se oxida un derivado de polímero que tiene un grupo amino beta hidroxilo, de manera especialmente preferible

y particularmente con HAS’ = HES’, preferiblemente con un peryodato, para dar un derivado de polímero que tiene

un grupo aldehído, de manera especialmente preferible

y particularmente con HAS’ = HES’.

Además, también se describe que también es posible hacer reaccionar el compuesto que comprende una estructura

45 1-amino-2-hidroxilo representada anteriormente con un compuesto al menos bifuncional que comprende un grupo carboxilo o un grupo carboxilo reactivo y un grupo aldehído, ceto o acetal descrito anteriormente en el presente documento para obtener un derivado de polímero que puede someterse a aminación reductora con un grupo amino de la proteína.

El derivado de polímero resultante con el grupo aldehído A se hace reaccionar posteriormente con la proteína. Por tanto, también se describe un método de producción de un conjugado, comprendiendo dicho método hacer reaccionar un derivado de polímero que tiene un grupo amino beta hidroxilo, en caso de que se empleara el polímero con el extremo reductor oxidado de manera especialmente preferible según la fórmula

y particularmente con HAS’ = HES’, con un grupo amino de la proteína.

10 El derivado de polímero resultante con el grupo aldehído se hace reaccionar posteriormente con un grupo amino de la proteína por medio de aminación reductora. En cuanto al acoplamiento de al menos un grupo amino de la proteína con al menos un grupo aldehído del polímero mediante aminación reductora, se hace referencia a la descripción detallada anterior.

15 Por tanto, según la realización preferida mencionada anteriormente, la presente invención también se refiere a un conjugado según la fórmula

particularmente con HAS’ = HES’, en caso de que se empleara el polímero con el extremo reductor oxidado. En la

fórmula anterior, el nitrógeno unido a la proteína deriva del grupo amino de la proteína a la que se une el derivado de polímero por medio del grupo aldehído.

25 Según una realización adicional, el polímero se hace reaccionar en primer lugar con un compuesto adecuado para dar un primer derivado de polímero que comprende al menos un grupo carboxilo reactivo. Este primer derivado de polímero se hace reaccionar entonces con un compuesto al menos bifuncional, adicional en el que al menos un grupo funcional de este compuesto adicional se hace reaccionar con al menos un grupo carboxilo reactivo del derivado de polímero y al menos otro grupo funcional del compuesto adicional es un grupo aldehído o grupo ceto o

30 grupo hemiacetal o es un grupo funcional que se modifica químicamente para dar un grupo aldehído o grupo ceto o grupo hemiacetal; y en el que el derivado de polímero resultante que comprende dicho grupo aldehído o grupo ceto

o grupo hemiacetal se hace reaccionar por medio de aminación reductora, tal como se describió anteriormente, con al menos un grupo amino de la proteína. También es posible alterar la secuencia de reacción de los respectivos compuestos entre sí.

35 Según una primera alternativa de dicha realización adicional, el polímero que comprende al menos un grupo carboxilo reactivo se prepara oxidando de manera selectiva el polímero en su extremo reductor y haciendo reaccionar posteriormente el polímero oxidado que es una lactona y/o un ácido carboxílico

o una sal adecuada del ácido carboxílico tal como sal de metal alcalino, preferiblemente como sal de sodio y/o

potasio, y siendo HAS’ preferiblemente HES’, con un compuesto adecuado para dar el polímero que comprende al

menos un grupo carboxilo reactivo.

10 La oxidación del polímero, preferiblemente hidroxietilalmidón, puede llevarse a cabo según cada método o combinación de métodos que dan como resultado compuestos que tienen las estructuras (IIa) y/o (IIb) mencionadas anteriormente.

15 Aunque la oxidación puede llevarse a cabo según cualquier método o todos los métodos adecuados dando como resultado el extremo reductor oxidado de hidroxialquilalmidón, se lleva a cabo preferiblemente usando una disolución de yodo alcalina tal como se describe, por ejemplo, en el documento DE 196 28 705 A1 cuyos respectivos contenidos (ejemplo A, columna 9, líneas de 6 a 24) se incorporan en el presente documento como referencia.

20 La introducción del grupo carboxilo reactivo en el polímero que está oxidado de manera selectiva en su extremo reductor puede llevarse a cabo mediante todos los métodos concebibles y todos los compuestos adecuados.

Además, también se describe que el polímero que está oxidado de manera selectiva en su extremo reductor se hace reaccionar en el extremo reductor oxidado con al menos un alcohol, preferiblemente con al menos un alcohol ácido

25 tal como alcoholes ácidos que tienen un valor de pKA en el intervalo de desde 6 hasta 12 o de desde 7 hasta 11 a 25ºC. El peso molecular del alcohol ácido puede estar en el intervalo de desde 80 hasta 500 g/ mol, tal como de desde 90 hasta 300 g/mol o de desde 100 hasta 200 g/ mol.

Alcoholes ácidos adecuados son todos los alcoholes H-O-RA que tiene un protón ácido y pueden hacerse reaccionar 30 con el polímero oxidado para dar el respectivo éster de polímero reactivo, preferiblemente según la fórmula

todavía más preferiblemente según fórmula

Alcoholes preferidos son N-hidroxisuccinimidas tales como N-hidroxisuccinimida o sulfo-N-hidroxisuccinimida, fenoles adecuadamente sustituidos tales como p-nitrofenol o p-dinitrofenol, u o’-dinitrofenol, triclorofenol tal como 2,4,6-triclorofenol o 2,4,5-triclorofenol, trifluorofenol tal como 2,4,6-trifluorofenol o 2,4,5-trifluorofenol, pentaclorofenol, pentafluorofenol o hidroxiazoles tales como hidroxibenzotriazol. Especialmente se prefieren N-hidroxisuccinimidas, prefiriéndose especialmente con N-hidroxisuccinimida y sulfo-N-hidroxisuccinimida. Pueden emplearse todos los alcoholes solos o como combinación adecuada de dos o más de los mismos. También es posible emplear un compuesto que libera el respectivo alcohol, por ejemplo añadiendo diésteres de ácido carbónico.

Por tanto, también se describe un método tal como se describió anteriormente, en el que el polímero que está oxidado de manera selectiva en su extremo reductor se activa haciendo reaccionar el polímero oxidado con un alcohol ácido, preferiblemente con N-hidroxisuccinimida y/o sulfo-N-hidroxisuccinimida.

También se describe que el polímero que está oxidado de manera selectiva en su extremo reductor se hace reaccionar en el extremo reductor oxidado con al menos un diéster carbónico RB-O-(C=O)-O-RC, en el que RB y RC pueden ser iguales o diferentes. Preferiblemente, este método da polímeros reactivos según la fórmula

en la que HAS’ es preferiblemente HES’.

Como compuestos de diéster carbónico adecuados, pueden emplearse compuestos cuyo componentes de alcohol sean independientemente N-hidroxisuccinimidas tales como N-hidroxisuccinimida o sulfo-N-hidroxisuccinimida, fenoles adecuadamente sustituidos tales como p-nitrofenol o p-dinitrofenol, u o’-dinitrofenol, triclorofenol tal como 2,4,6-triclorofenol o 2,4,5-triclorofenol, trifluorofenol tal como 2,4,6-trifluorofenol o 2,4,5-trifluorofenol, pentaclorofenol, pentafluorofenol o hidroxiazoles tales como hidroxibenzotriazol. Especialmente se prefieren carbonato de N,N’disuccinimidilo y carbonato de sulfo-N,N’-disuccinimidilo, prefiriéndose especialmente carbonato de N,N’disuccinimidilo.

Por tanto, también se describe un método tal como se describió anteriormente, en el que el polímero que está oxidado de manera selectiva en su extremo reductor se activa haciendo reaccionar el polímero oxidado con carbonato de N,N’-disuccinimidilo.

El alcohol ácido se hace reaccionar con el polímero oxidado o la sal del polímero oxidado a una razón molar de alcohol ácido:polímero preferiblemente de desde 5:1 hasta 50:1, más preferiblemente de desde 8:1 hasta 20:1, a una temperatura de reacción preferida de desde 2 hasta 40ºC, más preferiblemente de desde 10 hasta 30ºC y de manera especialmente preferible de desde 15 hasta 25ºC. El tiempo de reacción está preferiblemente en el intervalo de desde 1 hasta 10 h, más preferiblemente de desde 2 hasta 5 h, más preferiblemente de desde 2 hasta 4 h y particularmente de desde hasta 3 h.

El compuesto de diéster carbónico se hace reaccionar con el polímero oxidado o la sal del polímero oxidado a una razón molar de compuesto de diéster:polímero generalmente de desde 1:1 hasta 3:1, tal como de desde 1:1 hasta 1,5:1. El tiempo de reacción está generalmente en el intervalo de desde 0,1 hasta 12 h, tal como de desde 0,2 hasta 6 h, o de desde 0,5 hasta 2 h o de desde 0,75 hasta 1,25 h.

También se describe que la reacción del polímero oxidado con alcohol ácido y/o diéster carbónico se lleva a cabo en al menos un disolvente aprótico, tal como en un disolvente aprótico anhidro que tiene un contenido en agua de no más del 0,5 por ciento en peso, preferiblemente de no más del 0,1 por ciento en peso. Disolventes adecuados son, entre otros, dimetilsulfóxido (DMSO), N-metilpirrolidona, dimetilacetamida (DMA), dimetilformamida (DMF) y mezclas de dos o más de los mismos. Las temperaturas de reacción están preferiblemente en el intervalo de desde 2 hasta 40ºC, más preferiblemente de desde 10 hasta 30ºC.

5 Para hacer reaccionar el polímero oxidado con el al menos un alcohol ácido, se emplea al menos un agente de activación adicional.

Agentes de activación adecuados son, entre otros, carbonildiimidazol, carbodiimidas tales como

10 diisopropilcarbodiimida (DIC), diciclohexilcarbodiimidas (DCC), 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC), prefiriéndose especialmente diciclohexilcarbodiimidas (DCC) y 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC).

Por tanto, también se describe el método tal como se describió anteriormente, en el que el polímero que se oxida en su extremo reductor y se hace reaccionar con un alcohol ácido en presencia de un agente de activación adicional

15 para dar el éster de polímero reactivo.

También se describe que la reacción del polímero oxidado con diéster carbónico y/o alcohol ácido se lleva a cabo a una actividad de base baja que puede determinarse añadiendo la mezcla de reacción a agua con una razón en volumen de agua con respecto a la mezcla de reacción de 10:1. Antes de la adición, el agua que no comprende

20 esencialmente tampón, tiene un valor de pH de 7 a 25ºC. Tras la adición de la mezcla de reacción y midiendo el valor de pH, se obtiene que la actividad de base de la mezcla de reacción, tiene un valor de preferiblemente de no más de 9,0, más preferiblemente de tampoco más de 8,0 y de manera especialmente preferible de no más de 7,5.

También se describe que el polímero oxidado se hace reaccionar con N-hidroxisuccinimida en DMA seca en

25 ausencia de agua con EDC para dar de manera selectiva el éster de N-hidroxisuccinimida del polímero según la fórmula

30 siendo HAS’ más preferiblemente HES’.

Sorprendentemente, esta reacción no da subproductos que resultan de reacciones de EDC con grupos OH de HES, y sorprendentemente, la reacción de transposición de la O-acilisourea formada por EDC y el polímero oxidado con la N-acilurea respectiva se suprime.

35 También se describe que el polímero oxidado se hace reaccionar con carbonato de N,N’-disuccinimidilo en DMF seco en ausencia de agua y en ausencia de un agente de activación para dar de manera selectiva el éster de Nhidroxisuccinimida del polímero según la fórmula

siendo HAS’ más preferiblemente HES’.

Según otra realización el polímero que está oxidado de manera selectiva en su extremo reductor se hace reaccionar

en el extremo reductor oxidado con una azolida tal como carbonildiimidazol o carbonildibencimidazol para dar un polímero que tiene un grupo carboxilo reactivo. En el caso de carbonildiimidazol, resulta un derivado de polímero de imidazolida reactivo según la fórmula

en la que HAS’ es preferiblemente HES’.

Según la invención el grupo carboxilo reactivo se introduce en el polímero cuyo extremo reductor no está oxidado, haciendo reaccionar al menos un grupo hidroxilo del polímero con un diéster carbónico.

Por tanto, la presente invención se refiere a un método y conjugados en los que el grupo carboxilo reactivo se introduce en el polímero cuyo extremo reductor no está oxidado, haciendo reaccionar al menos un grupo hidroxilo del polímero con al menos un diéster carbónico diéster carbónico RB-O-(C=O)-O-RC, en el que RB y RC pueden ser iguales o diferentes.

Según otra realización de la presente invención, el polímero cuyo extremo reductor no está oxidado, se hace reaccionar en al menos un grupo hidroxilo con una azolida tal como carbonildiimidazol, carbonil-di-(1,2,4-triazol) o carbonildibencimidazol para dar un polímero que tiene un grupo carboxilo reactivo.

Como compuestos adecuados de diéster carbónico, pueden emplearse compuestos cuyo componentes de alcohol son independientemente N-hidroxisuccinimidas tales como N-hidroxisuccinimida o sulfo-N-hidroxisuccinimida, fenoles adecuadamente sustituidos tales como p-nitrofenol o p-dinitrofenol, u o’-dinitrofenol, triclorofenol tal como 2,4,6-triclorofenol o 2,4,5-triclorofenol, trifluorofenol tal como 2,4,6-trifluorofenol o 2,4,5-trifluorofenol, pentaclorofenol, pentafluorofenol o hidroxiazoles tales como hidroxibenzotriazol.

Especialmente se prefieren compuestos simétricos de diéster carbónico, por tanto siendo RB y RC iguales. El componente de alcohol del diéster carbónico se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en Nhidroxisuccinimida, N-hidroxisuccinimida sulfonatada, N-hidroxibenzotriazol, y fenoles sustituidos con nitro y halógeno. Entre otros, se prefieren nitrofenol, dinitrofenol, triclorofenol, trifluorofenol, pentaclorofenol y pentafluorofenol. Especialmente se prefieren carbonato de N,N’-disuccinimidilo y carbonato de sulfo-N,N’disuccinimidilo, prefiriéndose especialmente carbonato de N,N’-disuccinimidilo.

Por tanto, la presente invención también se refiere a un derivado de hidroxialquilalmidón, preferiblemente un derivado de hidroxietilalmidón, en el que al menos un grupo hidroxilo, preferiblemente al menos dos grupos hidroxilo de dicho almidón se han hecho reaccionar con un compuesto de diéster carbónico para dar el respectivo éster reactivo.

Según una realización de la presente invención, la reacción del polímero cuyo extremo reductor no está oxidado, con el al menos un compuesto de diéster carbónico se lleva a cabo a una temperatura de desde 2 hasta 40ºC, más preferiblemente de desde 10 hasta 30ºC y especialmente de desde 15 hasta 25ºC. Un tiempo de reacción preferido oscila entre 0,5 y 5 h, más preferiblemente entre 1 y 3 h, y de manera especialmente preferible entre 2 y 3 h.

La razón molar de compuesto de diéster carbónico:polímero depende del grado de sustitución del polímero con respecto al número de grupos hidroxilo que se han hecho reaccionar con el compuesto de diéster carbónico en relación con el número de grupos hidroxilo presentes en el polímero sin reaccionar.

Según una realización de la presente invención, la razón molar de compuesto de diéster carbónico:unidades de glucosa anhidra del polímero está en el intervalo de desde 1:2 hasta 1:1000, más preferiblemente de desde 1:3 hasta 1:100 y de manera especialmente preferible de desde 1:10 hasta 1:50, para dar un grado de sustitución en el intervalo de desde 0,5 hasta 0,001, preferiblemente de desde 0,33 hasta 0,01 y de manera especialmente preferible de desde 0,1 hasta 0,02

Según una realización de la presente invención, la reacción del polímero cuyo extremo reductor no está oxidado, con diéster carbónico se lleva a cabo en al menos un disolvente aprótico, de manera particularmente preferible en un disolvente aprótico anhidro que tiene un contenido en agua de no más del 0,5 por ciento en peso, preferiblemente de no más del 0,1 por ciento en peso. Disolventes adecuados son, entre otros, dimetilsulfóxido (DMSO), Nmetilpirrolidona, dimetilacetamida (DMA), dimetilformamida (DMF) y mezclas de dos o más de los mismos.

Por tanto, la presente invención también se refiere a un método tal como se describió anteriormente en el que la reacción del al menos un grupo hidroxilo del polímero cuyo extremo reductor no está oxidado, con el diéster carbónico para dar un grupo carboxilo reactivo se lleva a cabo en un disolvente polar aprótico anhidro, siendo el disolvente preferiblemente dimetilacetamida, dimetilformamida o una mezcla de las mimas.

El derivado de polímero reactivo que comprende al menos un grupo carboxilo reactivo, preferiblemente que resulta de la reacción del polímero con el alcohol ácido, el carbonato y/o la azolida, tal como se describió anteriormente, se hace reaccionar adicionalmente con un compuesto al menos bifuncional, adicional en el que al menos un grupo funcional F1 de este compuesto adicional se hace reaccionar con al menos un grupo carboxilo reactivo del derivado de polímero. Como al menos un grupo funcional F1 del compuesto adicional no existen limitaciones específicas dado que una reacción con el al menos un grupo carboxilo reactivo del polímero es posible. Grupos funcionales F1 preferidos son, por ejemplo un grupo amino o un grupo hidroxilo o un grupo tio o un grupo carboxilo.

El compuesto al menos bifuncional, adicional comprende al menos otro grupo funcional F2 que es un grupo aldehído

o un grupo funcional F2 que puede modificarse químicamente para dar un grupo aldehído. La modificación química puede ser, por ejemplo, una reacción del grupo funcional F2 con un grupo funcional F3 un compuesto ligador adicional o una oxidación o una reducción de un grupo funcional adecuado F2.

En caso de que se haga reaccionar F2 con un grupo funcional F3 de un compuesto adicional, el grupo funcional F2 puede seleccionarse de, entre otros,

-

dobles enlaces C-C o triples enlaces C-C o enlaces C-C aromáticos;

-

el grupo tio o el grupo hidroxilo;

-

hidrazida del ácido alquilsulfónico, hidrazida del ácido arilsulfónico;

-

1,2-dioles;

-

1,2-aminoalcoholes;

-

1,2-amino-tioalcoholes;

-

azidas;

-

el grupo amino -NH2 o derivados de los grupos amino que comprenden la unidad estructural - NH- tales como grupos aminoalquilo, grupos aminoarilo, grupos aminoaralquilo, o grupos alcarilamino;

-

el grupo hidroxilamino -O-NH2, o derivados del grupo hidroxilamino que comprenden la unidad estructural -O-NH-, tales como grupos hidroxilalquilamino, grupos hidroxilarilamino, grupos hidroxilaralquilamino o grupos hidroxialcarilamino;

-

grupos alcoxiamino, grupos ariloxiamino, grupos aralquiloxiamino o grupos alcariloxiamino, comprendiendo cada uno la unidad estructural -NH-O-;

- residuos que tienen un grupo carbonilo, -Q-C(=G)-M, en el que G es O o S, y M es, por ejemplo, -- -OH o -SH; -- un grupo alcoxilo, un grupo ariloxilo, un grupo aralquiloxilo o un grupo alcariloxilo; -- un grupo alquiltio, un grupo ariltio, un grupo aralquiltio o un grupo alcariltio; -- un grupo alquilcarboniloxilo, un grupo arilcarboniloxilo, un grupo aralquilcarboniloxilo, un grupo alcarilcarboniloxilo; -- ésteres activados tales como ésteres de hidroxilaminas que tienen estructura terciaria tal como N

hidroxisuccinimida o que tienen una unidad estructural O-N en la que N es parte de un compuesto de heteroarilo o, con G=O y Q ausentes, tal como compuestos ariloxilo con un residuo arilo sustituido tal como pentafluorofenilo, paranitrofenilo o triclorofenilo;

en los que Q está ausente o NH o un heteroátomo tal como S u O;

-NH-NH2, o -NH-NH-; - -NO2;

- el grupo nitrilo; 5 - grupos carbonilo tales como el grupo aldehído o el grupo ceto;

-

el grupo carboxilo;

-

el grupo -N=C=O o el grupo -N=C=S;

-

grupos haluro de vinilo tales como el grupo yoduro de vinilo o bromuro de vinilo o triflato;

-

-C≡C-H; 15 - -(C=NH2Cl)-O-alquilo

-

grupos -(C=O)-CH2-Hal en los que Hal es Cl, Br o I; - -CH=CH- SO2-;

-

un grupo disulfuro que comprende la estructura -S-S-;

-

el grupo

-

el grupo

30 en los que F3 es un grupo que puede formar un enlace químico con uno de los grupos mencionados anteriormente y se selecciona preferiblemente de los grupos mencionados anteriormente. Además, el segundo compuesto ligador preferiblemente tiene al menos un grupo aldehído o grupo ceto o grupo hemiacetal que puede hacerse reaccionar con un grupo amino de la proteína por medio de aminación reductora.

35 El grupo funcional F1 y el grupo aldehído o grupo ceto o grupo hemiacetal del compuesto de enlace al menos bifuncional que se hace reaccionar con el polímero, y/o los grupos funcionales F1 y F2 del compuesto de enlace al menos bifuncional que se hace reaccionar con el polímero, y/o el grupo funcional F3 y el grupo aldehído o grupo ceto

o grupo hemiacetal del compuesto de enlace al menos bifuncional, adicional puede separarse independientemente

40 mediante cualquier espaciador adecuado. Entre otros, el espaciador puede ser un residuo hidrocarbonado lineal, ramificado y/o cíclico, alifático y/o aromático opcionalmente sustituido. Generalmente, el residuo hidrocarbonado tiene hasta 60, preferiblemente hasta 40, más preferiblemente hasta 20, más preferiblemente hasta 10 átomos de carbono. Si hay heteroátomos presentes, el grupo de separación comprende generalmente desde 1 hasta 20, preferiblemente desde 1 hasta 8, más preferiblemente de 1 a 6, más preferiblemente de 1 a 4 y de manera

45 especialmente preferible desde 1 hasta 2 heteroátomos. Como heteroátomo, se prefiere O. El residuo hidrocarbonado puede comprender una cadena de alquilo opcionalmente ramificada o un grupo arilo o un grupo cicloalquilo que tiene, por ejemplo, desde 5 hasta 7 átomos de carbono, o ser un grupo aralquilo, un grupo alcarilo en el que la parte alquilo puede ser un grupo alquilo lineal y/o cíclico.

50 Ejemplos de un compuesto con grupos funcionales F1 y F2 son, por ejemplo, diaminoalcano opcionalmente sustituido que tiene desde 2 hasta 20 átomos de carbono, de manera especialmente preferible 1,2-diaminoetano, 1,3diaminopropano y 1,4-diaminobutano. Ejemplos preferidos de un compuesto con grupos funcionales F3 y un grupo aldehído o un grupo ceto o un grupo hemiacetal son, por ejemplo, ácido formilbenzoico, éster pentafluorofenílico del ácido 4-formilbenzoico, éster de N-hidroxisuccinimida del ácido 4-formilbenzoico y ácido 4-(4-formil-3,5dimetoxifenoxi)butírico.

Por tanto, la presente invención también se refiere a un método de producción de un conjugado, comprendiendo dicho método hacer reaccionar el polímero, preferiblemente hidroxietilalmidón, en su extremo reductor opcionalmente oxidado con un compuesto, seleccionado del grupo que consiste en alcoholes ácidos, diésteres carbónicos y azolidas, para dar un derivado de polímero que comprende al menos un grupo carboxilo reactivo, hacer reaccionar dicho derivado de polímero con al menos un compuesto al menos bifuncional para dar un derivado de polímero que comprende un grupo aldehído o un grupo ceto o un grupo hemiacetal o un grupo funcional que puede modificarse químicamente para dar un grupo aldehído o un grupo ceto o un grupo hemiacetal, opcionalmente modificar químicamente dicho grupo funcional para dar un derivado de polímero que comprende un grupo aldehído o un grupo ceto o un grupo hemiacetal, y hacer reaccionar el derivado de polímero que comprende un grupo aldehído

o un grupo ceto o un grupo hemiacetal con un grupo amino de una proteína por medio de aminación reductora.

Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un conjugado que comprende un polímero, preferiblemente hidroxietilalmidón, y una proteína unidos de manera covalente entre sí, que puede obtenerse mediante un método de producción de un conjugado, comprendiendo dicho método hacer reaccionar el polímero, en su extremo reductor opcionalmente oxidado con un compuesto, seleccionado del grupo que consiste en alcoholes ácidos, diésteres carbónicos y azolidas, para dar un derivado de polímero que comprende al menos un grupo carboxilo reactivo, hacer reaccionar dicho derivado de polímero con al menos un compuesto al menos bifuncional para dar un derivado de polímero que comprende un grupo aldehído o un grupo ceto o un grupo hemiacetal o un grupo funcional que puede modificarse químicamente para dar un grupo aldehído o un grupo ceto o un grupo hemiacetal, opcionalmente modificar químicamente dicho grupo funcional para dar un derivado de polímero que comprende un grupo aldehído o un grupo ceto o un grupo hemiacetal, y hacer reaccionar el derivado de polímero que comprende un grupo aldehído o un grupo ceto o un grupo hemiacetal con un grupo amino de una proteína por medio de aminación reductora.

Un ejemplo específico de un compuesto que tiene un grupo funcional F1 y un grupo funcional F2 que se oxida para dar un grupo aldehído es, por ejemplo, un compuesto que tiene un grupo amino como F1 y un grupo amino beta hidroxilo como F2. Un ejemplo especialmente preferido es 1,3-diamino-2-hidroxipropano. Esta oxidación puede llevarse a cabo con todos los agentes de oxidación adecuados, que pueden convertir el grupo amino beta hidroxilo en un grupo aldehído. Reactivos de oxidación preferidos son peryodatos tales como peryodatos de metal alcalino. Especialmente se prefiere peryodato de sodio que se emplea preferiblemente como disolución acuosa. Esta disolución tiene una concentración de yodato preferida de desde 1 hasta 50 mM, más preferiblemente desde 1 hasta 25 mM y de manera especialmente preferible de desde 1 hasta 10 mM. La oxidación se lleva a cabo a una temperatura de desde 0 hasta 40ºC, preferiblemente desde 0 hasta 25ºC y de manera especialmente preferible desde 4 hasta 20ºC.

El derivado de polímero resultante puede purificarse a partir de la mezcla de reacción mediante al menos un método adecuado. Si es necesario, el derivado de polímero puede precipitarse antes del aislamiento mediante al menos un método adecuado.

Si el derivado de polímero se precipita en primer lugar, es posible, por ejemplo poner en contacto la mezcla de reacción con al menos un disolvente o mezcla de disolventes distinto del disolvente o mezcla de disolventes presente en la mezcla de reacción a temperaturas adecuadas. Según una realización particularmente preferida de la presente invención en la que se usa un medio acuoso, preferiblemente agua, como disolvente, la mezcla de reacción se pone en contacto con 2-propanol o con una mezcla de acetona y etanol, preferiblemente una mezcla 1:1 (v/v), que indica volúmenes iguales de dichos compuestos, a una temperatura, preferiblemente en el intervalo de desde -20 hasta +50ºC y de manera especialmente preferible en el intervalo de desde -20 hasta 25ºC.

El aislamiento del derivado de polímero puede llevarse a cabo mediante un procedimiento adecuado que puede comprender una o más etapas. Según una realización preferida de la presente invención, el derivado de polímero se separa en primer lugar de la mezcla de reacción o la mezcla de la mezcla de reacción con, por ejemplo, mezcla de 2-propanol acuoso, mediante un método adecuado tal como centrifugación o filtración. En una segunda etapa, el derivado de polímero separado puede someterse a un tratamiento adicional tal como un tratamiento posterior tal como diálisis, filtración por centrifugación o filtración por presión, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de fase inversa, HPLC, MPLC, filtración en gel y/o liofilización. Según una realización incluso más preferida, el derivado de polímero separado se dializa en primer lugar, preferiblemente frente a agua, y entonces se liofiliza hasta que el contenido en disolvente del producto de reacción es suficientemente bajo según las especificaciones deseadas del producto. La liofilización puede llevarse a cabo a temperatura de desde 20 hasta 35ºC, preferiblemente de desde 20 hasta 30ºC.

También se describe que el grupo funcional Z de la proteína que va a hacerse reaccionar con el grupo funcional A del polímero o derivado de polímero es un grupo tiol, seleccionándose la proteína del grupo que consiste en IFN alfa, IFN beta, tPA y A1AT. Las más preferidas son IFN alfa e IFN beta.

El grupo tiol puede estar presente en la proteína como tal. Además, es posible introducir un grupo tiol en la proteína según un método adecuado. Entre otros, pueden mencionarse métodos químicos. Si un puente de disulfuro está presente en la proteína, es posible reducir la estructura -S-S- para obtener un grupo tiol. También es posible transformar un grupo amino presente en el polipéptido en un grupo SH mediante la reacción del polipéptido por medio del grupo amino con un compuesto que tiene al menos dos grupos funcionales diferentes, uno de los cuales

5 puede hacerse reaccionar con el grupo amino y el otro es un grupo SH o un precursor de un grupo SH. También es posible introducir un grupo SH mediante mutación de la proteína tal como introduciendo una cisteína o un aminoácido funcional con SH adecuado en la proteína o tal como eliminar una cisteína de la proteína de modo que se inhabilita a otra cisteína en la proteína para que forme un puente de disulfuro.

10 Lo más preferiblemente, el polímero está unido a una cisteína libre de la proteína, de manera especialmente preferible a la cisteína libre en la posición 17 de IFN beta (en caso de variantes con una cisteína en la posición 17), a una cisteína en la posición 1 y/o 98 de IFN alfa.

También se describe que el grupo funcional Z de la proteína es un grupo tiol y el grupo funcional A del polímero es

15 un grupo halogenoacetilo y en el que A se introduce haciendo reaccionar el polímero en su extremo reductor opcionalmente oxidado con un compuesto al menos bifuncional que tiene al menos dos grupos funcionales comprendiendo cada uno un grupo amino para dar un derivado de polímero que tiene al menos un grupo funcional que comprende un grupo amino y hacer reaccionar el derivado de polímero con un ácido acético sustituido con monohalógeno y/o un derivado de ácido acético sustituido con monohalógeno reactivo.

20 En cuanto al compuesto al menos bifuncional que tiene al menos dos grupos funcionales comprendiendo cada uno un grupo amino, son concebibles todos los compuestos que pueden hacerse reaccionar con el polímero en su extremo opcionalmente reductor para dar un derivado de polímero que comprende un grupo amino que puede hacerse reaccionar con un ácido acético sustituido con monohalógeno y/o un derivado de ácido acético sustituido

25 con monohalógeno reactivo.

Según una realización preferida, un grupo funcional del compuesto al menos bifuncional, haciéndose reaccionar dicho grupo funcional con el extremo reductor opcionalmente oxidado del polímero, se selecciona del grupo que consiste en

30 H2N-

en los que G es O o S y, si está presente dos veces, independientemente O o S, y R’ es metilo.

Según una realización especialmente preferida, el grupo funcional del compuesto al menos bifuncional, haciéndose

40 reaccionar dicho grupo funcional con el extremo opcionalmente reductor oxidado, es el grupo amino -NH2. Según una realización todavía más preferida, este grupo funcional, lo más preferiblemente el grupo amino, se hace reaccionar con el extremo reductor oxidado del polímero.

Según una realización preferida, el grupo funcional del compuesto al menos bifuncional, haciéndose reaccionar

45 dicho grupo funcional con el ácido acético sustituido con monohalógeno y/o un derivado de ácido acético sustituido con monohalógeno reactivo, es un grupo amino -NH2.

Los grupo funcionales, siendo ambos preferiblemente un grupo amino -NH2, del compuesto al menos bifuncional, haciéndose reaccionar dichos grupos funcionales con el polímero en su extremo opcionalmente reductor oxidado, 50 preferiblemente el extremo reductor oxidado, y el ácido acético sustituido con monohalógeno y/o derivado de ácido acético sustituido con monohalógeno reactivo, pueden estar separados por cualquier espaciador adecuado. Entre otros, el espaciador puede ser un residuo hidrocarbonado lineal, ramificado y/o cíclico opcionalmente sustituido. Sustituyentes adecuados son, entre otros, grupos alquilo, arilo, aralquilo, alcarilo, halógeno, carbonilo, acilo, carboxilo, éster carboxílico, hidroxilo, tio, alcoxilo y/o alquiltio. Generalmente, el residuo hidrocarbonado tiene desde 55 1 hasta 60, preferiblemente desde 1 hasta 40, más preferiblemente desde 1 hasta 20, más preferiblemente desde 2 hasta 10, más preferiblemente desde 2 hasta 6 y de manera especialmente preferible desde 2 hasta 4 átomos de carbono. Si hay heteroátomos presentes, el grupo de separación comprende generalmente desde 1 hasta 20, preferiblemente desde 1 hasta 8 y de manera especialmente preferible desde 1 hasta 4 heteroátomos. El residuo hidrocarbonado puede comprender una cadena de alquilo opcionalmente ramificada o un grupo arilo o un grupo cicloalquilo que tiene, por ejemplo, desde 5 hasta 7 átomos de carbono, o ser un grupo aralquilo, un grupo alcarilo 5 en el que la parte alquilo puede ser un grupo alquilo lineal y/o cíclico. Según una realización incluso más preferida, el residuo hidrocarbonado es una cadena de alquilo de desde 1 hasta 20, preferiblemente desde 2 hasta 10, y de manera especialmente preferible desde 2 hasta 8 átomos de carbono. Por tanto, compuestos al menos bifuncionales preferidos son compuestos de amino bifuncionales, de manera especialmente preferible 1,8-diaminooctano, 1,7diaminoheptano, 1,6-diaminohexano, 1,5-diaminopentano, 1,4-diaminobutano, 1,3-diaminopropano, y 1,2

10 diaminoetano. Según una realización adicional preferida, el compuesto al menos bifuncional es un diaminopolietilenglicol, preferiblemente un diaminopolietilenglicol según la fórmula

H2N-(CH2-CH2-O)m-CH2-CH2-NH2

15 en la que m es un número entero, siendo m preferiblemente 1, 2, 3 ó 4.

Por tanto, también se describen un método y un conjugado tal como se describieron anteriormente, en los que el polímero se hace reaccionar con 1,8-diaminooctano, 1,7-diaminoheptano, 1,6-diaminohexano, 1,5-diaminopentano, 1,4-diaminobutano, 1,3-diaminopropano y 1,2-diaminoetano en su extremo reductor oxidado para dar un derivado de

20 polímero según la fórmula

con n = 2, 3, 4, 5, 6, 7 ó 8, y siendo el polímero de manera especialmente preferible HES.

Por tanto, también se describen un método y un conjugado tal como se describieron anteriormente, en los que el polímero se hace reaccionar con H2N-(CH2- CH2-O)m-CH2-CH2-NH2 en su extremo reductor oxidado, en el que m es 1, 2, 3 ó 4, para dar un derivado de polímero según la fórmula

con m = 1, 2, 3 ó 4, y siendo el polímero de manera especialmente preferible HES.

La oxidación del extremo reductor del polímero, preferiblemente hidroxietilalmidón, puede llevarse a cabo según 35 cada método o combinación de métodos que dan como resultado compuestos que tiene las estructuras (IIa) y/o (IIb):

Aunque la oxidación puede llevarse a cabo según cualquier método o todos los métodos adecuados dando como resultado el extremo reductor oxidado de hidroxialquilalmidón, se lleva a cabo preferiblemente usando una disolución 5 de yodo alcalina tal como se describe, por ejemplo, en el documento DE 196 28 705 A1 cuyos respectivos contenidos (ejemplo A, columna 9, líneas de 6 a 24) se incorporan en el presente documento como referencia.

El derivado de polímero que resulta de la reacción del polímero con el compuesto al menos bifuncional se hace reaccionar adicionalmente con el ácido acético sustituido con monohalógeno y/o un derivado de ácido acético 10 sustituido con monohalógeno reactivo.

Como ácido reactivo o ácido acético sustituido con monohalógeno, se prefiere ácido acético sustituido con Cl, sustituido con Br y sustituido con I.

15 Si el ácido sustituido con halógeno se emplea como tal, se prefiere hacer reaccionar el ácido con el derivado de polímero en presencia de un agente de activación. Agentes de activación adecuados son, entre otros, carbodiimidas tales como diisopropilcarbodiimida (DIC), diciclohexilcarbodiimidas (DCC), 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC), prefiriéndose especialmente diciclohexilcarbodiimidas (DCC) y 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC).

20 Por tanto, también se describen un método y un conjugado tal como se describieron anteriormente, en los que el polímero, preferiblemente HES, se hace reaccionar con un compuesto de diamino, preferiblemente un diaminoalcano con de 2 a 8 átomos de carbono o H2N-(CH2-CH2-O)m-CH2-CH2-NH2 con m = 1, 2, 3 ó 4, y hacer reaccionar el derivado de polímero resultante con ácido acético sustituido con Br y sustituido con I en presencia de

25 un agente de activación, preferiblemente EDC.

Por tanto, también se describe un derivado de polímero según la fórmula

con X = Cl, Br o I, n = 2, 3, 4, 5, 6, 7 ó 8, y siendo el polímero de manera especialmente preferible HES, o un derivado de polímero según la fórmula

con X = Cl, Br o I, m = 1, 2, 3 ó 4, y siendo el polímero de manera especialmente preferible HES. La reacción del derivado de polímero con el ácido acético sustituido con halógeno se lleva a cabo preferiblemente en

un sistema acuoso, preferiblemente agua, a un pH preferido de desde 3,5 hasta 5,5, más preferiblemente de 4,0 a 5,0 y de manera especialmente preferible desde 4,5 hasta 5,0; y una reacción de temperatura preferida de desde 4 hasta 30ºC, más preferiblemente desde 15 hasta 25ºC y de manera especialmente preferible desde 20 hasta 25ºC; y durante un tiempo de reacción preferido de desde 1 hasta 8 h, más preferiblemente desde 2 hasta 6 h y de manera

5 especialmente preferible desde 3 hasta 5 h.

La mezcla de reacción que comprende el derivado de polímero que comprende el polímero, el compuesto al menos bifuncional y el ácido acético sustituido con halógeno, puede usarse para la reacción con la proteína como tal. Según una realización preferida, el derivado de polímero se separa de la mezcla de reacción, preferiblemente mediante

10 ultrafiltración, precipitación posterior, lavado opcional y secado a vacío.

La reacción del derivado de polímero con la proteína se lleva a cabo a un pH preferido de desde 6,5 hasta 8,5, más preferiblemente desde 7,0 hasta 8,5 y de manera especialmente preferible desde 7,5 hasta 8,5; y una reacción de temperatura preferida de desde 4 hasta 30ºC, más preferiblemente desde 15 hasta 25ºC y de manera especialmente

15 preferible desde 20 hasta 25ºC; y durante un tiempo de reacción preferido de desde 0,5 hasta 8 h, más preferiblemente desde 1 hasta 6 h y de manera especialmente preferible desde 2 hasta 5 h.

La reacción del derivado de polímero con el grupo tiol de la proteína da como resultado un enlace tioéter entre el derivado de polímero y la proteína.

20 Por tanto, también se describen un método y un conjugado tal como se describieron anteriormente, en los que el polímero, preferiblemente HES, se hace reaccionar con un compuesto de diamino, preferiblemente un diaminoalcano con de 2 a 8 átomos de carbono o H2N-(CH2-CH2-O)m-CH2-CH2-NH2 con m = 1, 2, 3 ó 4, el derivado de polímero resultante se hace reaccionar con ácido acético sustituido con Br y sustituido con I en presencia de un

25 agente de activación, preferiblemente EDC, y el derivado de polímero resultante se hace reaccionar con un grupo tiol de la proteína para dar un conjugado que comprende un enlace tioéter entre la proteína y el derivado de polímero.

Por tanto, también se describe un conjugado según la fórmula

con n = 2, 3, 4, 5, 6, 7 ó 8, y siendo el polímero de manera especialmente preferible HES y siendo la proteína IFN alfa, IFN beta, tPA o A1AT, preferiblemente IFN alfa o IFN beta, derivándose el átomo de S a partir de la cisteína libre en la posición 17 de IFN beta 1a o una cisteína libe disponible, o un conjugado según la fórmula

con m = 1, 2, 3 ó 4, y siendo el polímero de manera especialmente preferible HES y siendo la proteína IFN alfa, IFN beta, tPA o A1AT o APC, preferiblemente IFN alfa o IFN beta, derivándose el átomo de S, por ejemplo, a partir de la 40 cisteína libre en la posición 17 de IFN beta 1a.

El hidroxietilalmidón es preferiblemente hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 10 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 10 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio 45 de aproximadamente 12 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 12 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 18 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 18 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene

un peso molecular medio de aproximadamente 30 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 30 kD y un DS de aproximadamente 0,7, o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 50 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 50 kD y un DS de aproximadamente 0,7

5 o Hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 100 kD y un DS de aproximadamente 0,7.

En cuanto a cada una de estas combinaciones de peso molecular medio y DS, también se prefiere un valor de DS de aproximadamente 0,8.

Según una segunda realización, el grupo funcional Z de la proteína es un grupo tiol y el grupo funcional A del polímero comprende un grupo maleimido.

Según esta realización, existen diversas posibilidades para producir el conjugado. En general, el polímero se hace

15 reaccionar en su extremo reductor opcionalmente oxidado con al menos un compuesto al menos bifuncional, en el que este compuesto al menos bifuncional comprende un grupo funcional que puede hacerse reaccionar con el extremo reductor opcionalmente oxidado del polímero, y al menos un grupo funcional que o bien comprende el grupo maleimido o bien se modifica químicamente para dar un derivado de polímero que comprende el grupo maleimido. Según una realización preferida, dicho grupo funcional se modifica químicamente para dar un derivado de polímero que comprende el grupo maleimido.

Por tanto, también se describen un método y un conjugado tal como se describieron anteriormente, haciendo reaccionar un derivado de polímero que comprende un grupo maleimido con un grupo tiol de la proteína, comprendiendo dicho método hacer reaccionar el polímero en su extremo reductor opcionalmente oxidado con un

25 compuesto al menos bifuncional que comprende un grupo funcional U que puede hacerse reaccionar con el extremo opcionalmente reductor oxidado, el compuesto al menos bifuncional que comprende además un grupo funcional W que puede modificarse químicamente para dar un grupo maleimido, comprendiendo el método además modificar químicamente el grupo funcional W para dar un grupo maleimido.

En cuanto a un grupo funcional U, es concebible cada grupo funcional que puede hacerse reaccionar con el extremo opcionalmente reductor oxidado del polímero.

Según una realización descrita adicionalmente, el grupo funcional U comprende la estructura química -NH-.

35 Por tanto, también se describen un método y un conjugado tal como se describieron anteriormente, en los que el grupo funcional U comprende la estructura -NH-.

Según una realización descrita, el grupo funcional U es un grupo que tiene la estructura R’-NH-en la que R’ es hidrógeno o un residuo alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, arilcicloalquilo, alcarilo o cicloalquilarilo en el que el residuo cicloalquilo, arilo, aralquilo, arilcicloalquilo, alcarilo o cicloalquilarilo puede unirse directamente al grupo NH o, según otra realización, puede unirse mediante un puente de oxígeno al grupo NH. Los residuos alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, arilcicloalquilo, alcarilo o cicloalquilarilo pueden estar sustituidos adecuadamente. Como

sustituyentes preferidos, pueden mencionarse halógenos tales como F, Cl o Br. Residuos de R’ especialmente

preferidos son grupos hidrógeno, alquilo y alcoxilo, e incluso más preferidos son grupos hidrógeno y alcoxilo y alquilo 45 no sustituidos.

Entre los grupos alquilo y alcoxilo, se prefieren grupos con 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 átomos de C. Más preferidos son grupos metilo, etilo, propilo, isopropilo, metoxilo, etoxilo, propoxilo e isopropoxilo. Especialmente se prefieren metilo, etilo, metoxilo, etoxilo, y se les da preferencia particular a metilo o metoxilo.

Por tanto, también se describen un método y un conjugado tal como se describieron anteriormente, en los que R’ es hidrógeno o un grupo metilo o metoxilo.

Según otra realización descrita, el grupo funcional U tiene la estructura R’-NH-R”-en la que R” comprende

55 preferiblemente la unidad estructural -NH- y/o la unidad estructural -(C=G)- en la que G es O o S, y/o la unidad estructural -SO2-. Según realizaciones más preferidas, el grupo funcional R” se selecciona del grupo que consiste en

y en los que, si G está presente dos veces, es independientemente O o S.

Por tanto, también se describen un método y un conjugado tal como se describieron anteriormente, en los que el grupo funcional U se selecciona del grupo que consiste en H2N-

en los que G es O o S y, si está presente dos veces, independientemente O o S, y R’ es metilo.

15 Según una realización todavía más preferida, U comprende un grupo amino -NH2.

Según una realización, el grupo funcional W del compuesto al menos bifuncional se modifica químicamente haciendo reaccionar el derivado de polímero que comprende W con un compuesto al menos bifuncional, adicional

20 que comprende un grupo funcional que puede hacerse reaccionar con W y que comprende además un grupo maleimido.

En cuanto al grupo funcional W y el grupo funcional de dicho compuesto al menos bifuncional, adicional que puede hacerse reaccionar con W, se mencionan los siguientes grupos funcionales, entre otros:

-

dobles enlaces C-C o triples enlaces C-C o enlaces C-C aromáticos;

-

el grupo tio o los grupos hidroxilo; 30 - hidrazida del ácido alquilsulfónico, hidrazida del ácido arilsulfónico;

- 1,2-dioles;

-

1,2-aminoalcoholes; 35

-

1,2-amino-tioalcoholes;

-

azidas;

40 - el grupo amino -NH2 o derivados de los grupos amino que comprenden la unidad estructural - NH- tales como grupos aminoalquilo, grupos aminoarilo, grupos aminoaralquilo o grupos alcarilamino;

-

el grupo hidroxilamino -O-NH2, o derivados del grupo hidroxilamino que comprenden la unidad estructural -O-NH-,

tales como grupos hidroxilalquilamino, grupos hidroxilarilamino, grupos hidroxilaralquilamino o grupos 45 hidroxilalcarilamino;

-

grupos alcoxiamino, grupos ariloxiamino, grupos aralquiloxiamino o grupos alcariloxiamino, comprendiendo cada uno la unidad estructural -NH-O-;

50 - residuos que tienen un grupo carbonilo, -Q-C(=G)-M, en el que G es O o S, y M es, por ejemplo, -- -OH o -SH;

--

un grupo alcoxilo, un grupo ariloxilo, un grupo aralquiloxilo o un grupo alcariloxilo;

--

un grupo alquiltio, un grupo ariltio, un grupo aralquiltio o un grupo alcariltio; 5 -- un grupo alquilcarboniloxilo, un grupo arilcarboniloxilo, un grupo aralquilcarboniloxilo, un grupo alcarilcarboniloxilo;

--

ésteres activados tales como ésteres de hidroxilaminas que tienen estructura terciaria tal como Nhidroxisuccinimida o que tienen una unidad estructural O-N en la que N es parte de un compuesto de heteroarilo o, 10 con G=O y Q ausentes, tal como compuestos ariloxilo con un residuo arilo sustituido tal como pentafluorofenilo, paranitrofenilo o triclorofenilo;

en los que Q está ausente o NH o un heteroátomo tal como S u O;

15 - -NH-NH2, o -NH-NH-;

-

-NO2;

-

el grupo nitrilo; 20

- grupos carbonilo tales como el grupo aldehído o el grupo ceto;

-

el grupo carboxilo; 25 - el grupo -N=C=O o el grupo -N=C=S;

-

grupos haluro de vinilo tales como el grupo yoduro de vinilo o bromuro de vinilo o triflato;

-

-C=C-H; 30 - -(C=NH2Cl)-O-alquilo

-

grupos –(C=O)-CH2-Hal en los que Hal es Cl, Br o I; 35 - -CH=CH-SO2-;

- un grupo disulfuro que comprende la estructura -S-S-;

-

el grupo 40

-

el grupo

45 en los que W y el grupo funcional del compuesto al menos bifuncional, adicional, respectivamente, es un grupo que puede formar un enlace químico con uno de los grupos mencionados anteriormente. 50 Según una realización todavía más preferida, W comprende un grupo amino -NH2. Según las realizaciones preferidas, tanto W como el otro grupo funcional son grupos de la lista de grupos facilitada anteriormente. 55 Según una realización, uno de estos grupos funcionales es un grupo tio. En este caso particular, el otro grupo

funcional se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en

5 en los que Hal es Cl, Br o I, preferiblemente Br o I.

Según una realización especialmente preferida, uno de estos grupos funcionales se selecciona del grupo que consiste en un éster reactivo tal como un éster de hidroxilaminas que tiene estructura de imida tal como Nhidroxisuccinimida o que tienen una unidad estructural O-N en la que N es parte de un compuesto de heteroarilo o

10 tal como un compuesto de ariloxilo con un residuo arilo sustituido tal como pentafluorofenilo, paranitrofenilo o triclorofenilo, o un grupo carboxilo que se transforma opcionalmente en un éster reactivo. En este caso particular, el otro grupo funcional comprende la estructura química -NH-.

Según una realización especialmente preferida, W comprende la estructura -NH- y el compuesto al menos 15 bifuncional, adicional comprende un éster reactivo y el grupo maleimido.

En cuanto al grupo funcional W que comprende la estructura -NH-, puede hacerse referencia al grupo funcional tal como se describió anteriormente, en el que W puede ser igual o diferente de U. Según una realización preferida, U y W son iguales. Más preferiblemente, tanto U como W comprenden un grupo amino. De manera particularmente

20 preferida, tanto U como W son un grupo amino -NH2.

También se describe que el polímero puede hacerse reaccionar con el compuesto al menos bifuncional que comprende U y W en su extremo reductor no oxidado en un medio acuoso. Según una realización preferida en la que U y W son ambos un grupo amino, la reacción se lleva a cabo usando el polímero con el extremo reductor en

25 forma oxidada, en al menos un disolvente aprótico, de manera particularmente preferible en un disolvente aprótico anhidro que tiene un contenido en agua de no más del 0,5 por ciento en peso, preferiblemente de no más del 0,1 por ciento en peso. Disolventes adecuados son, entre otros, dimetilsulfóxido (DMSO), N-metilpirrolidona, dimetilacetamida (DMA), dimetilformamida (DMF) y mezclas de dos o más de los mismos.

30 Especialmente en caso de que tanto U como W sean un grupo amino -NH2, U y W pueden estar separados por cualquier espaciador adecuado. Entre otros, el espaciador puede ser un residuo hidrocarbonado lineal, ramificado y/o cíclico opcionalmente sustituido. Sustituyentes adecuados son, entre otros, grupos alquilo, arilo, aralquilo, alcarilo, halógeno, carbonilo, acilo, carboxilo, éster carboxílico, hidroxilo, tio, alcoxilo y/o alquiltio. Generalmente, el residuo hidrocarbonado tiene desde 1 hasta 60, preferiblemente desde 1 hasta 40, más preferiblemente desde 1

35 hasta 20, más preferiblemente desde 2 hasta 10, más preferiblemente desde 2 hasta 6 y de manera especialmente preferible desde 2 hasta 4 átomos de carbono. Si hay heteroátomos presentes, el grupo de separación comprende generalmente desde 1 hasta 20, preferiblemente desde 1 hasta 8 y de manera especialmente preferible desde 1 hasta 4 heteroátomos. El residuo hidrocarbonado puede comprender una cadena de alquilo opcionalmente ramificada o un grupo arilo o un grupo cicloalquilo que tiene, por ejemplo, desde 5 hasta 7 átomos de carbono, o ser

40 un grupo aralquilo, un grupo alcarilo en el que la parte alquilo puede ser un grupo alquilo lineal y/o cíclico. Según una realización incluso más preferida, el residuo hidrocarbonado es una cadena de alquilo de desde 1 hasta 20, preferiblemente desde 2 hasta 10, más preferiblemente desde 2 hasta 6, y de manera especialmente preferible desde 2 hasta 4 átomos de carbono.

45 Por tanto, también se describen un método y un conjugado tal como se describieron anteriormente, en los que el polímero se hace reaccionar con su extremo reductor oxidado con 1,4-diaminobutano, 1,3-diaminopropano o 1,2diaminoetano para dar un derivado de polímero según la fórmula

con n = 2, 3 ó 4, siendo el polímero preferiblemente HES.

Según la realización preferida mencionada anteriormente, el derivado de polímero que comprende un grupo amino se hace reaccionar adicionalmente con un compuesto al menos bifuncional que comprende un grupo éster reactivo y 5 el grupo maleimido. El grupo éster reactivo y el grupo maleimido pueden estar separados por cualquier espaciador adecuado. En cuanto a este espaciador, puede hacerse referencia al espaciador entre los grupos funcionales U y W. Según una realización preferida de la presente invención, el grupo éster reactivo y el grupo maleimido están separados por una cadena hidrocarbonada que tiene desde 1 hasta 10, preferiblemente desde 1 hasta 8, más preferiblemente desde 1 hasta 6, más preferiblemente desde 1 hasta 4, más preferiblemente desde 1 hasta 2 y de

10 manera particularmente preferible 1 átomo de carbono. Según una realización todavía más preferida, el éster reactivo es un éster de succinimida, y según una realización particularmente preferida, el compuesto al menos bifuncional que comprende el grupo maleimido y el grupo éster reactivo es éster de N-(alfamaleimidoacetoxi)succinimida.

15 Por tanto, también se describe un derivado de polímero según la fórmula

con n = 2, 3 ó 4, siendo el polímero preferiblemente HES.

20 El derivado de polímero que comprende el grupo maleimido se hace reaccionar adicionalmente con el grupo tiol de la proteína para dar un conjugado que comprende el derivado de polímero unido a la proteína por medio de un grupo tioéter.

25 Por tanto, también se describe un conjugado, que comprende la proteína y el polímero, según la fórmula

con n = 2, 3 ó 4, preferiblemente 4, siendo el polímero preferiblemente HES, siendo la proteína IFN alfa, IFN beta, 30 tPA o A1AT, preferiblemente IFN alfa o IFN beta, y en el que el átomo de S en la fórmula anterior se deriva, por ejemplo, a partir de Cys17 de IFN beta 1a.

El hidroxietilalmidón es preferiblemente hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 10 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de 35 aproximadamente 10 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 12 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 12 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 18 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 18 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene 40 un peso molecular medio de aproximadamente 30 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 30 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 50 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 50 kD y un DS de aproximadamente 0,7

o hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 100 kD y un DS de aproximadamente 45 0,7.

En cuanto a cada una de estas combinaciones de peso molecular medio y DS, también se prefiere un valor de DS de aproximadamente 0,8.

La reacción del derivado de polímero que comprende el grupo maleimido con el grupo tiol de la proteína se lleva a

5 cabo preferiblemente en un sistema acuoso tamponado, a un pH preferido de desde 5,5 hasta 8,5, más preferiblemente desde 6 hasta 8 y de manera especialmente preferible desde 6,5 hasta 7,5, y una temperatura de reacción preferida de desde 0 hasta 40ºC, más preferiblemente desde 0 hasta 25 y de manera especialmente preferible desde 4 hasta 21ºC, y durante un tiempo de reacción preferido de desde 0,5 hasta 24 h, más preferiblemente desde 1 hasta 20 h y especialmente desde 2 hasta 17 h. El valor de pH adecuado de la mezcla de

10 reacción puede ajustarse añadiendo al menos un tampón adecuado. Entre los tampones preferidos, pueden mencionarse tampón acetato de sodio, tampones fosfato o borato, que contienen o bien urea a una concentración preferida de desde 0 hasta 8 M, más preferida de desde 2 hasta 8 M y especialmente preferida de desde 4 hasta 8 M, y/o bien que contienen SDS a una concentración preferida de desde el 0 hasta el 1% (p/v), más preferida de desde el 0,4 hasta el 1% (p/v) y especialmente preferida de desde 0,8 hasta 1% (p/v).

15 El conjugado puede someterse a un tratamiento adicional tal como un tratamiento posterior tal como diálisis, filtración por centrifugación o filtración por presión, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de fase inversa, HPLC, MPLC, filtración en gel y/o liofilización.

20 En los métodos para preparar un conjugado de la invención la tasa de conversión en los métodos descritos anteriormente puede ser de al menos el 50%, más preferida de al menos el 70%, incluso más preferida de al menos el 80% y en particular del 95% o incluso más, tales como al menos del 98% o del 99%.

También se describe un conjugado, que comprende una proteína y un polímero o un derivado de los mismos, en el

25 que el polímero es un hidroxialquilalmidón (HAS) y la proteína se selecciona del grupo que consiste en IFN beta, GM-CSF, APC, tPA, A1AT, AT III, factor VII, factor VIII y factor IX, teniendo dicho conjugado una estructura según la fórmula

35 en las que R1, R2 y R3 son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, un grupo hidroxiarilo, un grupo hidroxiaralquilo o un grupo hidroxialcarilo que tiene de desde 2 hasta 10 átomos de carbono, preferiblemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, más preferiblemente hidrógeno o un grupo hidroxietilo,

en las que G se selecciona del grupo que consiste en O y S, preferiblemente O, y en las que L es un residuo

40 hidrocarbonado lineal, ramificado y/o cíclico opcionalmente sustituido de manera adecuada, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo, preferiblemente un residuo alquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo, heteroaralquilo que tiene desde 2 hasta 60 átomos de carbono.

También se describe un conjugado tal como se describió anteriormente, en el que -L- es -(CH2)n- con n = 2, 3, 4, 5, 45 6, 7, 8, 9, 10, preferiblemente 2, 3, 4, 5, 6, más preferiblemente 2, 3, 4, y de manera especialmente preferible 4.

Además se describe un conjugado que comprende una proteína y un polímero o un derivado de los mismos, en el que el polímero es un hidroxialquilalmidón (HAS) y la proteína se selecciona del grupo que consiste en IFN beta, GM-CSF, APC, tPA, A1AT, AT III, factor VII, factor VIII y factor IX, teniendo dicho conjugado una estructura según la fórmula

en las que R1, R2 y R3 son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, un grupo hidroxiarilo, un grupo

10 hidroxiaralquilo o un grupo hidroxialcarilo que tiene de desde 2 hasta 10 átomos de carbono, preferiblemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, más preferiblemente hidrógeno o un grupo hidroxietilo, y en las que G se selecciona del grupo que consiste en O y S, preferiblemente O.

Además se describe un conjugado que comprende una proteína y un polímero o un derivado de los mismos, en el

15 que el polímero es un hidroxialquilalmidón (HAS) y la proteína se selecciona del grupo que consiste en IFN beta, GM-CSF, APC, tPA, A1AT, AT III, factor VII, factor VIII y factor IX, teniendo dicho conjugado una estructura según la fórmula

25 en las que R1, R2 y R3 son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, un grupo hidroxiarilo, un grupo hidroxiaralquilo o un grupo hidroxialcarilo que tiene de desde 2 hasta 10 átomos de carbono, preferiblemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, más preferiblemente hidrógeno o un grupo hidroxietilo, y en las que L es un residuo hidrocarbonado lineal, ramificado y/o cíclico opcionalmente sustituido de manera adecuada, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo, preferiblemente un residuo alquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo,

30 heteroaralquilo que tiene desde 2 hasta 60 átomos de carbono.

También se describe un conjugado tal como se describió anteriormente, en el que -L- es -[(CRaRb)mG]n[CRcRd]o-

en el que Ra; Rb, Rc, Rd son independientemente hidrógeno, alquilo, arilo, preferiblemente hidrógeno, en el que G se selecciona del grupo que consiste en O y S, preferiblemente O, y en el que 5 m es 1, 2, 3 ó 4, en el que los residuos Ra y Rb pueden ser iguales o diferentes en los m grupos CRaRb;

n es de 0 a 20, preferiblemente de 0 a 10, más preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, lo más preferiblemente 1 ó 2;

10 o es de 0 a 20, preferiblemente de 0 a 10, más preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, lo más preferiblemente 1 ó 2, en el que los residuos Rc y Rd pueden ser iguales o diferentes en los o grupos CRcRd;

en el que los números enteros para n y o se seleccionan de una manera que en la fórmula anterior no de cómo resultado un resto peróxido, por ejemplo n y o no son 0 al mismo tiempo. Además se describe, un conjugado tal 15 como se describió anteriormente, en el que Ra; Rb, Rc, Rd son hidrógeno, m = 2, n = 1, y o = 2.

Además, se describe un conjugado que comprende una proteína y un polímero o un derivado de los mismos, en el que el polímero es un hidroxialquilalmidón (HAS) y la proteína se selecciona del grupo que consiste en IFN alfa, IFN beta, GM-CSF, APC, tPA, A1AT, AT III, factor VII, factor VIII y factor IX, teniendo dicho conjugado una estructura

20 según la fórmula

en la que R1, R2 y R3 son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, un grupo hidroxiarilo, un grupo 25 hidroxiaralquilo o un grupo hidroxialcarilo que tiene de desde 2 hasta 10 átomos de carbono, preferiblemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, más preferiblemente hidrógeno o un grupo hidroxietilo.

La presente invención se refiere a un conjugado que comprende una proteína y un polímero o un derivado de los mismos, en el que el polímero es un hidroxialquilalmidón (HAS) y la proteína se selecciona del grupo que consiste 30 en IFN alfa, IFN beta, GM-CSF, APC, tPA, A1AT, AT III, factor VII, factor VIII y factor IX” que tiene una estructura según la fórmula

35 en la que R1, R2 y R3 son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, un grupo hidroxiarilo, un grupo hidroxiaralquilo o un grupo hidroxialcarilo que tiene de desde 2 hasta 10 átomos de carbono, preferiblemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, más preferiblemente hidrógeno o un grupo hidroxietilo, y

en la que el enlace -O-(C=O)- se formó mediante una reacción de un grupo carboxilo o un grupo carboxilo reactivo 40 con grupo hidroxilo de la molécula de HAS.

Además, se describe un conjugado, que comprende una proteína y un polímero o un derivado de los mismos, en el que el polímero es un hidroxialquilalmidón (HAS) y la proteína se selecciona del grupo que consiste en IFN alfa, IFN beta, GM-CSF, APC, tPA, A1AT, AT III, factor VII, factor VIII y factor IX, teniendo dicho conjugado una estructura

45 según la fórmula y/o

en las que R1, R2 y R3 son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, un grupo hidroxiarilo, un grupo hidroxiaralquilo o un grupo hidroxialcarilo que tiene de desde 2 hasta 10 átomos de carbono, preferiblemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, más preferiblemente hidrógeno o un grupo hidroxietilo, y

10 en las que L es un residuo hidrocarbonado lineal, ramificado y/o cíclico opcionalmente sustituido, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo, que tiene desde 1 hasta 60 preferiblemente desde 1 hasta 40, más preferiblemente desde 1 hasta 20, más preferiblemente desde 1 hasta 10, más preferiblemente desde 1 hasta 6 más preferiblemente desde 1 hasta 2 átomos de carbono y de manera especialmente preferible 1 átomo de carbono,

15 siendo L en particular CH2.

Además también se describe un conjugado, que comprende una proteína y un polímero o un derivado de los mismos, en el que el polímero es un hidroxialquilalmidón (HAS) y la proteína se selecciona del grupo que consiste en IFN alfa, IFN beta, GM-CSF, APC, tPA, A1AT, AT III, factor VII, factor VIII y factor IX, teniendo dicho conjugado

20 una estructura según la fórmula

en la que R1, R2 y R3 son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, un grupo hidroxiarilo, un grupo 25 hidroxiaralquilo o un grupo hidroxialcarilo que tiene de desde 2 hasta 10 átomos de carbono, preferiblemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, más preferiblemente hidrógeno o un grupo hidroxietilo, y

en la que L1 y L2 son independientemente un residuo hidrocarbonado lineal, ramificado y/o cíclico opcionalmente sustituido, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo, que comprende un resto alquilo, arilo, aralquil30 heteroalquilo y/o heteroaralquilo, teniendo dicho residuo desde 1 hasta 60 preferiblemente desde 1 hasta 40, más preferiblemente desde 1 hasta 20, más preferiblemente desde 1 hasta 10 átomos de carbono, y

en la que D es un enlace, preferiblemente un enlace covalente que se formó mediante un grupo funcional adecuado F2 unido a L1 y un grupo funcional adecuado F3 unido a L2.

35 Además, se describe un conjugado tal como se describió anteriormente, en el que L1 es -(CH2)n- con n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, preferiblemente 2, 3, 4, 5, 6, más preferiblemente 2, 3, 4, y de manera especialmente preferible 4.

También se describe un conjugado tal como se describió anteriormente, en el que L2 comprende un resto arilo sustituido opcionalmente de manera adecuada, preferiblemente un resto arilo que contiene 6 átomos de carbono, siendo L2 de manera especialmente preferible C6H4.

También se describe un conjugado tal como se describió anteriormente, en el que se selecciona del grupo que consiste en

-

dobles enlaces C-C o triples enlaces C-C o enlaces C-C aromáticos;

-

el grupo tio o los grupos hidroxilo;

-

hidrazida del ácido alquilsulfónico, hidrazida del ácido arilsulfónico;

-

1,2-dioles;

-

1,2-amino-tioalcoholes;

-

azidas;

-

1,2-aminoalcoholes;

-

el grupo amino -NH2 o derivados de los grupos amino que comprenden la unidad estructural -NH- tales como grupos aminoalquilo, grupos aminoarilo, grupos aminoaralquilo o grupos alcarilamino;

-

el grupo hidroxilamino -O-NH2, o derivados del grupo hidroxilamino que comprenden la unidad estructural -O-NH-, tales como grupos hidroxilalquilamino, grupos hidroxilarilamino, grupos hidroxilaralquilamino o grupos hidroxialcarilamino;

-

grupos alcoxiamino, grupos ariloxiamino, grupos aralquiloxiamino o grupos alcariloxiamino, comprendiendo cada uno la unidad estructural -NH-O-;

- residuos que tienen un grupo carbonilo, -Q-C(=G)-M, en el que G es O o S, y M es, por ejemplo, -- -OH o -SH; -- un grupo alcoxilo, un grupo ariloxilo, un grupo aralquiloxilo o un grupo alcariloxilo; -- un grupo alquiltio, un grupo ariltio, un grupo aralquiltio o un grupo alcariltio; -- un grupo alquilcarboniloxilo, un grupo arilcarboniloxilo, un grupo aralquilcarboniloxilo, un grupo alcarilcarboniloxilo; -- ésteres activados tales como ésteres de hidroxilaminas que tienen estructura de imida tal como N

hidroxisuccinimida o que tienen una unidad estructural O-N en la que N es parte de un compuesto de heteroarilo o, con G=O y Q ausentes, tal como compuestos de ariloxilo con un residuo arilo sustituido tal como pentafluorofenilo, paranitrofenilo o triclorofenilo;

en los que Q está ausente o NH o un heteroátomo tal como S u O;

-NH-NH2, o -NH-NH-; - -NO2;

-

el grupo nitrilo;

-

grupos carbonilo tales como el grupo aldehído o el grupo ceto;

-

el grupo carboxilo;

-

el grupo -N=C=O o el grupo -N=C=S;

-

grupos haluro de vinilo tales como el grupo yoduro de vinilo o bromuro de vinilo o triflato; - -C=C-H; - -(C=NH2Cl)-O-alquilo

-

grupos -(C=O)-CH2-Hal en los que Hal es Cl, Br o I; - -CH=CH-SO2-;

-

un grupo disulfuro que comprende la estructura -S-S-;

-

el grupo

-

el grupo

15 y en los que F3 es un grupo funcional que puede formar un enlace químico con F2 y se selecciona preferiblemente del grupo mencionado anteriormente, F2 preferiblemente que comprende el resto -NH-, más preferiblemente que comprende un grupo amino, F3 preferiblemente que comprende el resto -(C=G)-, más preferiblemente -(C=O)-, más preferiblemente el resto -(C=G)-G-, todavía más preferiblemente -(C=O)-G-, y de manera especialmente preferible -(C=O)-O, siendo D de manera particularmente preferible un enlace amida.

20 Además, se describe un conjugado, que comprende una proteína y un polímero o un derivado de los mismos, en el que el polímero es un hidroxialquilalmidón (HAS) y la proteína se selecciona del grupo que consiste en IFN alfa, IFN beta, GM-CSF, APC, tPA, A1AT, AT III, factor VII, factor VIII y factor IX, teniendo dicho conjugado una estructura según la fórmula

en la que el átomo de carbono del resto -CH2-NH- se deriva de un grupo aldehído que se introdujo en el polímero mediante una reacción de oxidación de apertura de anillo, y en la que el átomo de nitrógeno se deriva de un grupo 30 amino de la proteína, en la que HAS” se refiere a la molécula de HAS sin el átomo de carbono de dicho aldehído implicado en la reacción.

También se describe un conjugado, que comprende una proteína y un polímero o un derivado de los mismos, en el que el polímero es un hidroxialquilalmidón (HAS) y la proteína se selecciona del grupo que consiste en IFN alfa, IFN 35 beta, tPA, A1AT, factor VII y factor IX, teniendo dicho conjugado una estructura según la fórmula

en la que R1, R2 y R3 son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, un grupo hidroxiarilo, un grupo 40 hidroxiaralquilo o un grupo hidroxialcarilo que tiene de desde 2 hasta 10 átomos de carbono, preferiblemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, más preferiblemente hidrógeno o un grupo hidroxietilo, y

en la que L es un residuo hidrocarbonado lineal, ramificado y/o cíclico opcionalmente sustituido, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo, que comprende un resto alquilo, arilo, aralquil-heteroalquilo y/o 45 heteroaralquilo, teniendo dicho residuo desde 2 hasta 60 preferiblemente desde 2 hasta 40, más preferiblemente

desde 2 hasta 20, más preferiblemente desde 2 hasta 10 átomos de carbono, y en la que el átomo de azufre se deriva de un residuo cisteína o un grupo disulfuro de la proteína.

5 Además, se describe un conjugado tal como se describió anteriormente, en el que -L- es -[(CRaRb)mG]n[CRcRd]o-en el que Ra; Rb, Rc, Rd son independientemente hidrógeno, alquilo, arilo, preferiblemente hidrógeno, en el que G se

10 selecciona del grupo que consiste en O y S, preferiblemente O, y en el que m es 1, 2, 3 ó 4, lo más preferiblemente 2, en el que los residuos Ra y Rb pueden ser iguales o diferentes en los m grupos (CRaRb); 15 n es de 1 a 20, preferiblemente de 1 a 10, lo más preferiblemente 1, 2, 3 ó 4;

o es de 1 a 20, preferiblemente de 1 a 10, más preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, más preferiblemente 1 ó 2, lo más preferiblemente 1, en el que los residuos Rc y Ra pueden ser iguales o diferentes en los o grupos CRcRd; 20 o en el que

n es 0, y 25

o es de 2 a 20, preferiblemente de 2 a 10, más preferiblemente 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8, en el que los residuos Rc y Rd pueden ser iguales o diferentes en los o grupos CRcRd.

Además, se describe un conjugado, que comprende una proteína y un polímero o un derivado de los mismos, en el 30 que el polímero es un hidroxialquilalmidón (HAS) y la proteína se selecciona del grupo que consiste en IFN alfa, IFN beta, tPA, A1AT, factor VII y factor IX, teniendo dicho conjugado una estructura según la fórmula

35 en la que R1, R2 y R3 son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, un grupo hidroxiarilo, un grupo hidroxiaralquilo o un grupo hidroxialcarilo que tiene de desde 2 hasta 10 átomos de carbono, preferiblemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, más preferiblemente hidrógeno o un grupo hidroxietilo, y

en la que L es un residuo hidrocarbonado lineal, ramificado y/o cíclico opcionalmente sustituido, que comprende

40 opcionalmente al menos un heteroátomo, que comprende un resto alquilo, arilo, aralquilo heteroalquilo y/o heteroaralquilo, teniendo dicho residuo desde 2 hasta 60 preferiblemente desde 2 hasta 40, más preferiblemente desde 2 hasta 20, más preferiblemente desde 2 hasta 10 átomos de carbono, y

en la que el átomo de azufre se deriva de un residuo de cisteína o un grupo disulfuro de la proteína. 45 También se describe un conjugado tal como se describió anteriormente, en el que -L- es

-

[(CRaRb)mG]n[CRcRd]o-

50 en el que Ra; Rb, Rc, Rd son independientemente hidrógeno, alquilo, arilo, preferiblemente hidrógeno, en el que G se selecciona del grupo que consiste en O y S, preferiblemente O, y en el que

m es 1, 2, 3 ó 4, lo más preferiblemente 2, en el que los residuos Ra y Rb pueden ser iguales o diferentes en los m grupos (CRaRb); 55 n es de 1 a 20, preferiblemente de 1 a 10, lo más preferiblemente 1, 2, 3 ó 4;

o es de 1 a 20, preferiblemente de 1 a 10, más preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, más preferiblemente 1 ó 2, lo más preferiblemente 1, en el que los residuos Rc y Rd pueden ser iguales o diferentes en los o grupos CRcRd;

o

en el que

n es 0, y

o es de 2 a 20, preferiblemente de 2 a 10, más preferiblemente 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8, en el que los residuos Rc y Rd pueden ser iguales o diferentes en los o grupos CRcRd.

La presente invención también se refiere a un conjugado tal como se describió anteriormente, en el que el hidroxialquilalmidón es hidroxietilalmidón.

La presente invención también se refiere a un conjugado tal como se describió anteriormente, en el que el hidroxietilalmidón tiene un peso molecular de desde 2 hasta 200 kD, preferiblemente de desde 4 hasta 130 kD, más preferiblemente de desde 4 hasta 70 kD.

Según un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un conjugado tal como se describió anteriormente, o un conjugado, que puede obtenerse mediante un método tal como se describió anteriormente, para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal.

Los conjugados según la invención pueden ser puros al menos al 50%, incluso más preferido puros al menos al 70%, incluso más preferido puros al menos al 90%, en particular puros al menos al 95% o al menos al 99%. En una realización más preferida, los conjugados pueden ser puros al 100%, es decir no hay otros subproductos presentes.

Por tanto, según otro aspecto, la presente invención también se refiere a una composición que puede comprender el/los conjugado(s) de la invención, en la que la cantidad del/de los conjugado(s) puede ser de al menos el 50% en peso, incluso más preferido de al menos el 70% en peso, incluso más preferido de al menos el 90% en peso, en particular de al menos el 95% en peso o al menos el 99% en peso. En una realización más preferida, la composición puede consistir en el/los conjugado(s), es decir la cantidad del/de los conjugado(s) es del 100% en peso.

Además, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende, en una cantidad terapéuticamente eficaz, un conjugado tal como se describió anteriormente o un conjugado, que puede obtenerse mediante un método tal como se describió anteriormente.

Todos los conjugados de proteína-HAS de la presente invención se administran mediante métodos adecuados tales como por ejemplo métodos enterales, parenterales o pulmonares, preferiblemente se administran por vías i.v., s.c. o

i.m. La vía específica elegida dependerá del estado que está tratándose. Preferiblemente, los conjugados se administran junto con un portador adecuado, tal como se conoce en la técnica (por ejemplo tal como se usa en el producto biofarmacéutico de primera generación/no modificado, sin albúmina o con albúmina como excipiente), un diluyente adecuado, tal como disoluciones estériles para la aplicación i.v., i.m. o s.c.. La dosificación requerida dependerá de la gravedad del estado que está tratándose, la respuesta individual de los pacientes, el método de administración usado, y similares. El experto puede establecer una dosificación correcta basándose en sus conocimientos generales.

Según otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de un conjugado de HAS-, preferiblemente un conjugado de HES-proteína tal como se describió anteriormente o un conjugado de HAS-, preferiblemente un conjugado de HES-proteína, que puede obtenerse mediante un método tal como se describió anteriormente, en el que la proteína es factor VIII, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de hemofilia A.

Según otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de un conjugado de HAS-AT III tal como se describió anteriormente o un conjugado de HAS-proteína, que puede obtenerse mediante un método tal como se describió, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de deficiencia hereditaria de AT III, enfermedad venooclusiva, quemaduras y resistencia a la heparina en cirugía de injerto de derivación arterial coronaria (CABG), perforación intestinal que resulta de un traumatismo o cirugía gastrointestinal; coagulación intravascular diseminada (CID) y/o septicemia así como para la prevención de formación de microcoágulos asociada con terapia de ventilación. Por tanto, la composición farmacéutica que comprende el conjugado de HAS-AT III de la invención puede usarse para estos fines.

Según otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de un conjugado de HAS-, preferiblemente un conjugado de HES-proteína tal como se describió anteriormente o un conjugado de HAS-, preferiblemente un conjugado de HES-proteína, que puede obtenerse mediante un método tal como se describió anteriormente, en el que la proteína es A1AT, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfisema, fibrosis quística, dermatitis atópica, y/o bronquitis. La composición farmacéutica de la invención que comprende el conjugado de HAS-A1AT de la invención también puede usarse para estos fines.

Según otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de un conjugado de HAS-, preferiblemente un conjugado de HES-proteína tal como se describió anteriormente o un conjugado de HAS-, preferiblemente un conjugado de HES-proteína, que puede obtenerse mediante un método tal como se describió anteriormente, en el que la proteína es tPA, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de infartos de miocardio (ataques al corazón), trombosis, tromboembolia o enfermedades oclusivas, especialmente enfermedades arteriales oclusivas.

Según otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de un conjugado de HAS-, preferiblemente un conjugado de HES-proteína tal como se describió anteriormente o un conjugado de HAS-, preferiblemente un conjugado de HES-proteína, que puede obtenerse mediante un método tal como se describió anteriormente, en el que la proteína es APC, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de septicemia grave, trombosis, tromboembolia o enfermedades oclusivas, especialmente enfermedades arteriales oclusivas.

Según otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de un conjugado de HAS-, preferiblemente un conjugado de HES-proteína tal como se describió anteriormente o un conjugado de HAS-, preferiblemente un conjugado de HES-proteína, que puede obtenerse mediante un método tal como se describió anteriormente, en el que la proteína es IFN alfa, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de leucemia por ejemplo tricoleucemia, leucemia mielógena crónica, mieloma múltiple, linfoma folicular, cáncer, por ejemplo tumor carcinoide, melanoma maligno y hepatitis, por ejemplo hepatitis B crónica y hepatitis C crónica.

Según otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de un conjugado de HAS-, preferiblemente un conjugado de HES-proteína tal como se describió anteriormente o un conjugado de HAS-, preferiblemente un conjugado de HES-proteína, que puede obtenerse mediante un método tal como se describió anteriormente, en el que la proteína es IFN beta, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de esclerosis múltiple, preferiblemente formas recidivantes de esclerosis múltiple.

La invención se refiere además al uso de un conjugado de GM-CSF-HAS tal como se describió anteriormente, para la preparación de un medicamento para la reconstitución mieloide tras trasplante de médula ósea o quimioterapia de inducción en adultos más ancianos con leucemia mielógena aguda, fallo o retraso del injerto de trasplante de médula ósea, movilización y trasplante posterior de células progenitoras de sangre periférica autólogas.

La presente invención también se refiere al uso de un conjugado de HAS-Factor VII para la preparación de un medicamento para el tratamiento de episodios en pacientes con hemofilia A o B con inhibidores del factor VIII o factor IX.

La presente invención también se refiere al uso de un conjugado de HAS-factor IX para la preparación de un medicamento para el control y la prevención de episodios hemorrágicos en pacientes con hemofilia B (por ejemplo deficiencia de factor IX congénita o enfermedad de Christmas), incluyendo el control y la prevención de sangrado en entornos quirúrgicos.

Breve descripción de las figuras

Figura 1

La figura 1 muestra un análisis de SDS page de los conjugados de HES-IFN beta, producidos según el ejemplo 1.2. Para la electroforesis en gel se emplearon un instrumento XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, A) y una fuente de alimentación Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B). Se usaron un gel de Bis-Tris al 12% junto con un tampón de ejecución MOPS SDS en condiciones reductoras (ambos de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, A) según las instrucciones del fabricante.

Carril A: Marcador proteico SeeBlue®Plus2 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, A). Marcador del peso molecular desde arriba hasta abajo: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kD, 6 kD, 3 kD

Carril B: Producto bruto tras la conjugación de IFN beta oxidado con derivado de HES preparado tal como se describe en el ejemplo 1.1(a)

Carril C: Producto bruto tras la conjugación de IFN beta oxidado con derivado de HES preparado tal como se describe en el ejemplo 1.1(b)

Carril D: Producto bruto tras la conjugación de IFN beta oxidado con derivado de HES preparado tal como se describe en el ejemplo 1.1(c)

Carril E: Producto bruto tras la conjugación de IFN beta oxidado con derivado de HES preparado tal como se describe en el ejemplo 1.1(d).

Carril F: Producto bruto tras la conjugación de IFN beta oxidado con derivado de HES preparado tal como se describe en el ejemplo 1.1(e)

Carril G: Producto bruto tras la conjugación de IFN beta oxidado con derivado de HES preparado tal como se describe en el ejemplo 1.1(f)

Carril H: Producto bruto tras la conjugación de IFN beta oxidado con derivado de HES preparado tal como se describe en el ejemplo 1.1(g)

Carril I: Producto bruto tras la conjugación de IFN beta oxidado con derivado de HES preparado tal como se describe en el ejemplo 1.1(h)

Carril J: Producto bruto tras la conjugación de IFN beta oxidado con derivado de HES preparado tal como se describe en el ejemplo 1.1(i)

Carril K: IFN beta oxidado, preparado como en el ejemplo 1.2(a)

Figura 2

La figura 2 muestra un análisis de SDS page de los conjugados de HES-IFN beta, producidos según el ejemplo 1.4. Para la electroforesis en gel se emplearon un instrumento XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, A) y una fuente de alimentación Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B). Se usaron un gel de Bis-Tris al 12% junto con un tampón de ejecución MOPS SDS en condiciones reductoras (ambos de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, A) según las instrucciones del fabricante. Se concentraron las muestras con un volumen mayor de 15 !l a vacío hasta este volumen.

Carril A: Marcador proteico SeeBlue®Plus2 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, A) Marcador del peso molecular desde arriba hasta abajo: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kD, 6 kD, 3 kD.

Carril H: Conjugación de IFN-beta con aldehído-HES sintetizado tal como se describe en el ejemplo 1.3(a).

Carril I: Conjugación de IFN-beta con aldehído-HES sintetizado tal como se describe en el ejemplo 1.3(b).

Carril J: Control: IFN-beta, tratado con borohidruro de sodio sin aldehído-HES.

Figura 3

La figura 3 muestra un análisis de SDS page de los conjugados de HES-IFN alfa, producidos según el ejemplo 2.2. Para la electroforesis en gel se emplearon un instrumento XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, A) y una fuente de alimentación Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B). Se usaron un gel de Bis-Tris al 12% junto con un tampón de ejecución MOPS SDS en condiciones reductoras (ambos de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, A) según las instrucciones del fabricante. Se concentraron las muestras con un volumen mayor de 15 !l a vacío hasta este volumen.

Carril A: Marcador proteico SeeBlue®Plus2 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, A). Marcador del peso molecular desde arriba hasta abajo: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kD, 6 kD, 3 kD.

Carril E: Conjugación de IFN-alfa con aldehído-HES sintetizado tal como se describe en el ejemplo 2.1(a).

Carril F: Conjugación de IFN-alfa con aldehído-HES sintetizado tal como se describe en el ejemplo 2.1(b).

Carril G: Control: IFN-alfa según el ejemplo 2.2, tratado con borohidruro de sodio sin aldehído-HES.

Figura 4

La figura 4 muestra un análisis de SDS page de los conjugados de HES-AT III, producidos según el ejemplo 3.2. Para la electroforesis en gel se emplearon un instrumento XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, A) y una fuente de alimentación Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B). Se usaron un gel de Tris-Acetato al 3-8% de NuPage junto con un tampón de ejecución Tris-Acetato SDS en condiciones reductoras (ambos de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, A) según las instrucciones del fabricante.

Carril A: Marcador proteico SeeBlue®Plus2 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, A) Marcador del peso molecular desde arriba hasta abajo: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kD, 6 kD, 3 kD

Carril B: Producto bruto tras la conjugación de ATIII oxidada con derivado de HES preparado tal como se describe en el ejemplo 3.1(a)

Carril C: Producto bruto tras la conjugación de ATIII oxidada con derivado de HES preparado tal como se describe

en el ejemplo 3.1(b) Carril D: Producto bruto tras la conjugación de ATIII oxidada con derivado de HES preparado tal como se describe en el ejemplo 3.1(c)

Carril E: Producto bruto tras la conjugación de ATIII oxidada con derivado de HES preparado tal como se describe

en el ejemplo 3.1(d) Carril F: Producto bruto tras la conjugación de ATIII oxidada con derivado de HES preparado tal como se describe en el ejemplo 3.1(e)

Carril G: Producto bruto tras la conjugación de ATIII oxidada con derivado de HES preparado tal como se describe

en el ejemplo 3.1(f) Carril H: Producto bruto tras la conjugación de ATIII oxidada con derivado de HES preparado tal como se describe en el ejemplo 3.1(g)

Carril I: Producto bruto tras la conjugación de ATIII oxidada con derivado de HES preparado tal como se describe en el ejemplo 3.1(h) Carril K: ATIII oxidado GlycoThera, según el ejemplo 3.2

Figura 5 La figura 5 muestra un análisis de SDS page de los conjugados de HES-AT III, producidos según el ejemplo 3.4. Para la electroforesis en gel se emplearon un instrumento XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, A) y una fuente de alimentación Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B). Se usaron un gel de Tris-Acetato al 3-8% junto con un tampón de ejecución Tris-Acetato SDS en condiciones reductoras (ambos de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, A) según las instrucciones del fabricante.

Carril A: Marcador proteico SeeBlue®Plus2 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, A) Marcador del peso molecular desde arriba hasta abajo: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kD, 6 kD, 3 kD. Carril B: Conjugación de AT III con aldehído-HES sintetizado tal como se describe en el ejemplo 3.3(a). Carril C: Conjugación de AT III con aldehído-HES sintetizado tal como se describe en el ejemplo 3.3(b). Carril D: Control: AT III según el ejemplo 3.3, tratado con borohidruro de sodio sin aldehído-HES. Figura 6

La figura 6 muestra el cromatograma de HPGPC (“High-Performance Gel Permeation Chromatography”

cromatografía de permeación en gel de alto rendimiento) con respecto a la AT III purificada a partir de glicerol según el ejemplo 3.5 (detector UV y MALLS dan como resultado un cromatograma individual, refiriéndose el eje x a tiempo/minutos).

Se usaron los siguientes parámetros en el análisis de HPGPC:

Columna: Superose 12 HR 10/30 300 x 10 mm D.I. (Pharmacia)

Eluyente: Na2HPO4 27,38 mM; NaH2PO4 12,62 mM; NaCl 0,2 M; NaN3 al 0,005% en 1 l de agua desmineralizada

Flujo:

0,24 ml/h

Detector 1:

detector MALLS

Detector 2:

UV (280 nm)

Detector 3:

IR (detector del índice de refracción)

Figura 7

La figura 7 muestra el cromatograma de HPGPC (cromatografía de permeación en gel de alto rendimiento) con respecto al conjugado de AT III según el ejemplo 3.5 (detector MALLS en el cromatograma superior, detector UV en

el cromatograma inferior, refiriéndose el eje x al tiempo/minutos.). Se usaron los siguientes parámetros en el análisis de HPGPC: Columna: Superose 12 HR 10/30 300 x 10 mm D.I. (Pharmacia) Eluyente: Na2HPO4 27,38 mM; NaH2PO4 12,62 mM; NaCl 0,2 M; NaN3 al 0,005% en 1 l de agua

desmineralizada

Flujo:

0,24 ml/h

Detector 1:

detector MALLS

Detector 2:

UV (280 nm)

Detector 3:

IR (detector del índice de refracción)

Figura 8

La figura 8 muestra un análisis de SDS page de los conjugados de HES-GM-CSF, producidos según el ejemplo 4.2. Para la electroforesis en gel se emplearon un instrumento XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, A) y una fuente de alimentación Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B). Se usaron un gel de Bis-Tris al 12% junto con un tampón de ejecución MOPS SDS en condiciones reductoras (ambos de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, A) según las instrucciones del fabricante.

Carril A: Marcador proteico SeeBlue®Plus2 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, A) Marcador del peso molecular desde arriba hasta abajo: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kD, 6 kD, 3 kD

Carril B: Producto bruto tras la conjugación de GM-CSF oxidado con derivado de HES preparado tal como se describe en el ejemplo 4.1(a)

Carril C: Producto bruto tras la conjugación de GM-CSF oxidado con derivado de HES preparado tal como se describe en el ejemplo 4.1(b)

Carril D: Producto bruto tras la conjugación de GM-CSF oxidado con derivado de HES preparado tal como se describe en el ejemplo 4.1(c)

Carril E: Producto bruto tras la conjugación de GM-CSF oxidado con derivado de HES preparado tal como se describe en el ejemplo 4.1(d)

Carril F: Producto bruto tras la conjugación de GM-CSF oxidado con derivado de HES preparado tal como se describe en el ejemplo 4.1(e)

Carril G: Producto bruto tras la conjugación de GM-CSF oxidado con derivado de HES preparado tal como se describe en el ejemplo 4.1(f)

Carril H: Producto bruto tras la conjugación de GM-CSF oxidado con derivado de HES preparado tal como se describe en el ejemplo 4.1(g)

Carril I: Producto bruto tras la conjugación de GM-CSF oxidado con derivado de HES preparado tal como se describe en el ejemplo 4.1(g)

Carril J: Producto bruto tras la conjugación de GM-CSF oxidado con derivado de HES preparado tal como se describe en el ejemplo 4.1(h)

Carril K: GM-CSF oxidado según el ejemplo 4.2.

Figura 9

La figura 9 muestra un análisis de SDS page de los conjugados de HES-GM-CSF, producidos según el ejemplo 4.4. Para la electroforesis en gel se emplearon un instrumento XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, A) y una fuente de alimentación Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B). Se usaron un gel de Bis-Tris al 12% junto con un tampón de ejecución MOPS SDS en condiciones reductoras (ambos de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, A) según las instrucciones del fabricante. Se concentraron las muestras con un volumen mayor de 15 !l a vacío hasta este volumen.

Carril A: Marcador proteico SeeBlue®Plus2 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, A) Marcador del peso molecular desde arriba hasta abajo: 188 KD, 98 KD, 62 KD, 49 KD, 38 KD, 28 KD, 17 KD, 14 KD, 6 KD, 3 KD

Carril H: Conjugación de GM-CSF con aldehído-HES sintetizado tal como se describe en el ejemplo 4.3(a)

Carril I: Conjugación de GM-CSF con aldehído-HES sintetizado tal como se describe en el ejemplo 4.3(b)

Carril J: Control: GM-CSF según el ejemplo 4.4, tratado con borohidruro de sodio sin aldehído-HES

Figura 10

La figura 10 muestra un análisis de SDS page del conjugado de IFN beta, producido según el ejemplo 5.2. Para la electroforesis en gel se emplearon un instrumento XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, A) y una fuente de alimentación Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B). Se usaron un gel de Bis-Tris al 12% junto con un tampón de ejecución MOPS SDS en condiciones reductoras (ambos de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, A) según las instrucciones del fabricante.

Carril A: Marcador proteico SeeBlue®Plus2 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, A) Marcador del peso molecular desde arriba hasta abajo: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kD, 6 kD, 3 kD.

Carril B: Producto bruto tras la conjugación de IFN beta oxidado con derivado de hidroxilamino-HES preparado tal como se describe en el ejemplo 1.1(c).

Carril C: IFN beta oxidado.

Figura 11

La figura 11 muestra un gel de SDS-PAGE de IFN-1 (célula CHO) modificado con HAS purificado mediante RP-HPLC. La flecha indica la posición de migración de IFN-1 no modificado presumiblemente debido a formas que carecen de derivados de ácido siálico terminal mientras que se detectó el IFN-1 modificado con HAS como un área teñida con Coomassie difusa amplia que abarca masas moleculares de 35 Kda-120 Kda.

Figura 12

La figura 12 muestra un análisis de HPAEC-PAD de oligosacáridos unidos a N liberados enzimáticamente a partir de IFN-1 modificado con HAS

Figura 13

La figura 13 muestra un análisis de HPAEC-PAD de oligosacáridos unidos a N tras hidrólisis suave preparados a partir de IFN-1 modificado con HAS

Figura 14A

La figura 14A muestra un análisis de SDS-PAGE de antitrombina III: 1 = AT III no tratada; 2 = AT III tratada con peryodato; 3 = AT IIII modificada con HAS; se aplicaron 10 !g de uno sobre un gel de poliacrilamida al 10%

Figura 14B

La figura 14B muestra un análisis de SDS-PAGE de antitrombina III: 1 = AT III no tratada; 2 = AT III tratada con peryodato; 3 = AT IIII modificada con HAS; se aplicaron 10 !g de uno sobre un gel de poliacrilamida al 10%. 1+, 2+ y 3+ indican muestras de AT III tras des-N-glicosilación con polipéptido N-glicosidasa.

Figura 15

La figura 15 muestra un análisis de HPAEC-PAD de glicanos unidos a N de muestras de AT III obtenidas tras el tratamiento con polipéptido-N-glicosidasa tal como se describe en el ejemplo 8.6.b). 1 = N-glicanos a partir de AT III no tratada; 2 = N-glicanos a partir de AT III tratada con peryodato suave; 3 = N-glicanos a partir de AT III modificada con HAS. A = área de elución de oligosacáridos neutros incluyendo glicanos oligomanosídicos (con de 6 a 9 residuos de manosa). B= área de elución de N-glicanos monosialilados; C = área de elución de N-glicanos disialilados; D = área de elución de N-glicanos trisialilados. La elución de N-glicanos modificados con HAS se indica en la traza n.º 3.

Figura 16

La figura 16 muestra un análisis de HPAEC-PAD de N-glicanos desialilados (a partir del tratamiento con ácido suave del ejemplo 8.6.(c)) obtenidos a partir de muestras de AT III tras el tratamiento con polipéptido-N-glicosidasa (Ejemplo 8.6.b)). 1 = N-glicanos a partir de AT III no tratada; 2 = N-glicanos a partir de AT III tratada con peryodato suave; 3 = N-glicanos a partir de AT modificada con HAS. En la traza n.º1 el pico que eluye a los 16 min. representa ácido N-acetilneuramínico, el pico a los 38 min. representa ácido N-glicolilneuramínico. El pico principal a los 19 min. representa una estructura diantenaria con fucosa unida a al-6 proximal. Los picos restantes son estructuras diantenarias sin fucosa, diantenarias menos 1 galactosa y oligomanosídicas principalmente con 6-9 residuos de manosa. La posición de elución de derivados de ácido siálico modificados con HAS se indica en la traza n.º 3.

Figura 17

La figura 17 muestra un análisis de SDS-PAGE de GM-CSF modificado con HAS (10 Kda) 1 = eluato de RP-HPLC; 2 = material de partida de GM-CSF recombinante humano. Los paréntesis indican la posición de migración de C = formas solo O-glicosiladas y no glicosiladas; B = formas GM-CSF con un sitio de N-glicosilación individual ocupado; A = GM-CSF con 2 sitios de N-glicosilación ocupados con hidratos de carbono (véase Forno et al., 2004).

Figura 18

La figura 18 muestra un análisis de SDS-PAGE de GM-CSF modificado con HAS (10 Kda) 1 = eluato de RP-HPLC; 2 = eluato de RP-HPLC tras digestión con polipéptido N-glicosidasa; 3 = eluato de RP-HPLC tras tratamiento con ácido suave. El paréntesis indica el GM-CSF que presumiblemente está modificado con HAS en residuos de ácido siálico oxidados con peryodato unidos a O-glicanos.

Figura 19

La figura 19 muestra un análisis de HPAEC-PAD de N-glicanos aislados a partir de GM-CSF

Traza 1 = proteína no tratada; traza 2 = GM-CSF oxidado con peryodato suave; GM-CSF modificado con HAS (10 Kda) tras purificación mediante RP-HPLC. Las flechas A-E indican las posiciones de elución de asialo, mono, di, tri y tetrasialooligosacáridos. La composición de oligosacáridos del material de partida era esencialmente la misma tal como se describió en la referencia Forno et al., 2004.

Figura 20

La figura 20 muestra un gel de electroforesis de los productos brutos tras la conjugación de ATIII oxidada con derivados de HES según el ejemplo 9.3.

Para la electroforesis en gel se emplearon un instrumento XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, A) y una fuente de alimentación Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B). Se usaron un gel de Tris-Acetato al 3-8% de NuPage junto con un tampón de ejecución Tris-Acetato SDS en condiciones reductoras (ambos de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, A) según las instrucciones del fabricante. Se tiñó el gel con Roti-Blue (Carl Roth GmbH + Co.KG, Karlsruhe, A) según las instrucciones del fabricante.

Carril A: Marcador proteico Roti-Mark STANDARD (Carl Roth GmbH + Co.KG, Karlsruhe, A) Marcador del peso molecular desde arriba hasta abajo: 200 KD, 119 KD, 66 KD, 43 KD, 29 KD, 20 KD, 14,3 KD.

Carril B: Producto bruto tras la conjugación de ATIII oxidada con derivado de HES preparado tal como se describe en el ejemplo 9.1(a).

Carril C: Producto bruto tras la conjugación de ATIII oxidada con derivado de HES preparado tal como se describe en el ejemplo 9.1(b).

Carril D: Producto bruto tras la conjugación de ATIII oxidada con derivado de HES preparado tal como se describe en el ejemplo 9.1(c).

Carril E: Producto bruto tras la conjugación de ATIII oxidada con derivado de HES preparado tal como se describe en el ejemplo 9.1(d).

Carril F: Producto bruto tras la conjugación de ATIII oxidada con derivado de HES preparado tal como se describe en el ejemplo 9.1(e).

Carril G: Producto bruto tras la conjugación de ATIII oxidada con derivado de HES preparado tal como se describe en el ejemplo 9.1(f).

Carril H: Producto bruto tras la conjugación de ATIII oxidada con derivado de HES preparado tal como se describe en el ejemplo 9.1(g). Carril K: Control de reacción.

Figura 21 La figura 21 muestra un gel de electroforesis de conjugados de ATIII producidos según el ejemplo 9.4.Para la electroforesis en gel se emplearon un instrumento XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, A) y una fuente de alimentación Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B). Se usaron un gel de Tris-Acetato al 3-8% de NuPage junto con un tampón de ejecución Tris-Acetato SDS en condiciones reductoras (ambos de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, A) según las instrucciones del fabricante. Se tiñó el gel con Roti-Blue (Carl Roth GmbH + Co.KG, Karlsruhe, A) según las instrucciones del fabricante.

Carril A: Marcador proteico Roti-Mark STANDARD (Carl Roth GmbH + Co.KG, Karlsruhe, A) Marcador del peso

molecular desde arriba hasta abajo: 200 KD, 119 KD, 66 KD, 43 KD, 29 KD, 20 KD, 14,3 KD. Carril B: Producto bruto tras la conjugación de ATIII con derivado de HES preparado tal como se describe en el ejemplo 9.2(b).

Carril C: Producto bruto tras la conjugación de ATIII con derivado de HES preparado tal como se describe en el ejemplo 9.2(d). Carril D: Control de reacción. Carril E: Marcador proteico Roti-Mark STANDARD. Figura 22 La figura 22 muestra SEC de IFN-alfa-HES acoplado por medio de ácidos aldónicos activados según el ejemplo

10.3. Detección MALLS y UV probaron el alto grado de conversión de IFN-alfa en la reacción.

Figura 23

La Figura 23 muestra la actividad de Intron® A en comparación con patrón de NIH de IFN-alfa 2a (véase el ejemplo 11.1)

Figura 24

La figura 24 muestra la actividad in vitro relativa de IFN-alfa-HES (columna derecha) en comparación con Intron® A (columna izquierda), véase el ejemplo 11.2.

Figura 25

La figura 25 muestra el resultado del ejemplo 12.2 (el triángulo representa material de partida de IFN-alfa, los cuadrados representan IFN alfa modificado con HES; dilución de muestras de suero requerida para lograr una protección del 50% de células MDBK contra infección viral frente al tiempo tras inyección i.v. de 30 !g/kg en ratones). El suero de ratones tratados con material de partida no modificado tiene un efecto antiviral muy bajo. La modificación de IFN-alfa con HES prolonga sustancialmente el efecto antiviral del suero.

Figura 26

La figura 26 muestra los resultados del ejemplo 13 (análisis de los conjugados de a1AT-HES brutos preparados tal como se describe en el ejemplo 13.5 mediante electroforesis en gel).

Para la electroforesis en gel se empelaron un instrumento XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, A) y una fuente de alimentación Power Pac 200 (Bio-Rad, Múnich, A). Se usaron un gel de Tris-Acetato al 3-8% junto con un tampón de ejecución Tris-Acetato SDS en condiciones reductoras (ambos de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, A) según las instrucciones del fabricante.

Carril A: Marcador proteico de SDS Page no teñido 6,5-200 KDa (SERVA Elektrophoresis GmbH, Heidelberg, A) Marcador del peso molecular desde arriba hasta abajo: 200 KD, 116 KD, 67 KD, 45 KD, 29 KD, 21 KD, 14,3 KD, 6,5 KD;

Carril B: Conjugación con aldehído-HES tal como se describe en el ejemplo 13.5;

Carril C: Conjugación con HES tal como se describe en el ejemplo 13.6. Figura 27 La figura 27 muestra los resultados del ejemplo 13 (análisis de las fracciones B1-C6 recogidas tras la cromatografía

de intercambio iónico (véase el ejemplo 13.7) Condiciones para la electroforesis en gel, véase la figura 26. Carril A: Marcador proteico de SDS Page no teñido 6,5-200 KDa (SERVA Elektrophoresis GmbH, Heidelberg, A)

Marcador del peso molecular desde arriba hasta abajo: 200 KD, 116 KD, 67 KD, 45 KD, 29 KD, 21 KD, 14,3 KD,

6,5 KD;

Carril B: Fracción B1

Carril C: Fracción C1

Carril D: Fracción C2

Carril E: Fracción C3

Carril F: Fracción C4

Carril G: Fracción C5

Carril H: Fracción C6

Carril I: A1AT (GTC Biotherapeutics Inc., Framingham, MA, n.º de lote 080604A)

Figura 28 La figura 28 muestra el diagrama de la actividad enzimática residual frente a la concentración de Prolastin® HS (Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Alemania, n.º de lote PR4HA43), A1AT (GTC Biotherapeutics Inc., Framingham, MA, n.º de lote 080604A) y un conjugado de HES-A1AT sintetizado tal como se describe en el ejemplo 13.5.

Figura 29

La figura 29 muestra el análisis de conjugados de IFN-alfa-HES del ejemplo 14.3.1 mediante electroforesis en gel.

Para la electroforesis en gel se emplearon un instrumento XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, A)

y una fuente de alimentación Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B). Se usaron un gel de Bis-Tris al 10% junto

con un tampón de ejecución MOPS SDS en condiciones reductoras (ambos de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, A)

según las instrucciones del fabricante.

Carril X: Roti®-Mark STANDARD (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, A) Marcador del peso molecular desde

arriba hasta abajo: 200 KD, 119 KD, 88 KD, 43 KD, 29 KD, 20 KD, 14,3 KD;

Carril A: Conjugación con aldehído-BES10/0.4 tal como se describe en el ej. 14.3.1, entrada A;

Carril B: Conjugación con aldehído-HES10/0.7 tal como se describe en el ej. 14.3.1, entrada B;

Carril C: Conjugación con aldehído-HES30/0.4 tal como se describe en el ej. 14.3.1, entrada C;

Carril D: Conjugación con aldehído-HES30/0.7 tal como se describe en el ej. 14.3.1, entrada D;

Carril E: Conjugación con aldehído-HES50/0.4 tal como se describe en el ej. 14.3.1, entrada E;

Carril F: Conjugación con aldehído-HES50/0.7 tal como se describe en el ej. 14.3.1, entrada F;

Carril G: Control de reacción, sin aldehído-HES tal como se describe en el ej. 14.3.1, entrada G;

Carril I: Control de reacción, sin aldehído-HES y sin NaCNBH3 tal como se describe en el ej. 14.3.1, entrada I;

Carril J: Control de reacción, con HES10/0.4 tal como se describe en el ej. 14.3.1, entrada J;

Carril K: Control de reacción, con HES10/0.4 pero sin NaCNBH3 tal como se describe en el ej. 14.3.1, entrada K. Figura 30 La figura 30 muestra el análisis de conjugados de IFN-alfa-HES del ejemplo 14.3.2 mediante electroforesis en gel. Para la electroforesis en gel se empelaron un instrumento XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, A)

y una fuente de alimentación Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B). Se usaron un gel de Bis-Tris al 10% junto con un tampón de ejecución MOPS SDS en condiciones reductoras (ambos de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, A) según las instrucciones del fabricante.

Carril X: Roti®-Mark STANDARD (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, A) Marcador del peso molecular desde arriba hasta abajo: 200 KD, 119 KD, 88 KD, 43 KD, 29 KD, 20 KD, 14,3 KD; Carril A: Conjugación con aldehído-HES tal como se describe en el ejemplo 14.3.2 entrada A; Carril B: Conjugación con aldehído-HES tal como se describe en el ejemplo 14.3.2 entrada B; Carril C: Conjugación con aldehído-HES tal como se describe en el ejemplo 14.3.2 entrada C; Carril D: Conjugación con aldehído-HES tal como se describe en el ejemplo 14.3.2 entrada D; Carril E: Conjugación con aldehído-HES tal como se describe en el ejemplo 14.3.2 entrada E; Carril F: Conjugación con aldehído-HES tal como se describe en el ejemplo 14.3.2 entrada F; Carril G: Control de reacción, con HES tal como se describe en el ejemplo 14.3.2 entrada G. Como resulta evidente a partir de la figura 30, no se observó reacción para el control de reacción G. Figura 31

La figura 31 muestra el análisis de conjugados de IFN-alfa-HES del ejemplo 14.3.3 mediante electroforesis en gel. Para la electroforesis en gel se empelaron un instrumento XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, A) y una fuente de alimentación Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B). Se usaron un gel de Bis-Tris al 10% junto con un tampón de ejecución MOPS SDS en condiciones reductoras (ambos de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, A) según las instrucciones del fabricante.

Análisis de los conjugados de IFNa-HES brutos mediante electroforesis en gel.

Carril A: Roti®-Mark STANDARD (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, A) Marcador del peso molecular desde arriba hasta abajo: 200 KD, 119 KD, 66 KD, 43 KD, 29 KD, 20 KD, 14,3 KD; Carril B: Conjugación de IFNa con aldehído-HES30/0.8 tal como se describe 14.3.3; Carril C: Conjugación de IFNa con aldehído-HES130/0.7 tal como se describe en 14.3.3; Carril D: Conjugación de IFNa con HES10/0.4 sódico (control de reacción) tal como se describe en 14.3.3 Figura 32 La figura 32 muestra el análisis de conjugados de IFN-alfa-HES del ejemplo 14.3.4 mediante electroforesis en gel. Para la electroforesis en gel se emplearon un instrumento XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, A)

y una fuente de alimentación Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B). Se usaron un gel de Bis-Tris al 10% junto con un tampón de ejecución MOPS SDS en condiciones reductoras (ambos de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, A) según las instrucciones del fabricante.

Carril X: Roti®-Mark STANDARD (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, A) Marcador del peso molecular desde arriba hasta abajo: 200 KD, 119 KD, 88 KD, 43 KD, 29 KD, 20 KD, 14,3 KD Carril A: Conjugación con aldehído-HES tal como se describe en el ejemplo 14.3.4; Carril B: Control de reacción; conjugación con HES tal como se describe en el ejemplo 14.3.4.

Como resulta evidente a partir de la figura 32, no se observó reacción para el control de reacción B. Figura 33 La figura 33 muestra la actividad proliferativa de Intron® A en comparación con patrón de NIH de rhIFN-alfa 2a

según el ejemplo 15.1. Figura 34 La figura 34 muestra la actividad in vitro relativa de IFN-alfa-HES incubado de manera simulada en comparación con

material de partida de IFN-alfa no modificado según el ejemplo 15.2. Figura 35 La Figura 35 muestra la actividad in vitro relativa de conjugados de IFN-alfa-HES en comparación con material de

partida de IFN-alfa no modificado, Intron® A y Pegasys, respectivamente, según el ejemplo 15.3. Figura 36 La figura 36 muestra la actividad in vitro relativa del conjugado de IFN-alfa-HES en comparación con Intron® A

según el ejemplo 15.4. Figura 37 La figura 37 muestra los resultados del ejemplo 15.5 en una gráfica (actividad antiviral de conjugados de IFN-alfa-

HES) Figura 38 La figura 38 muestra la dilución de muestras de suero requerida para lograr una protección del 50% de células

MDBK contra infección viral frente al tiempo tras inyección i.v. de 30 !g/kg en ratones. El suero de ratones tratados con material de partida no modificado tiene un efecto antiviral muy bajo. La modificación de IFN-alfa con HES prolonga el efecto antiviral del suero sustancialmente. La semivida aumenta con el peso molecular de HES usado para la modificación de IFN-alfa (véase el ejemplo 16).

Figura 39

La figura 39 muestra los resultados del ejemplo 16.3 en una gráfica (actividad antiviral de conjugados de IFN-alfa-HES) Figura 40 La figura 40 muestra datos del estudio de PK en conejos según el ejemplo 17. IFN-alfa-HES muestra una

prolongación clara de la semivida en comparación con el material de partida de IFN-alfa. Para > 24 h (aproximadamente < 1000 pCi/ml) la curva del material no modificado se estabiliza y casi no puede observarse disminución adicional de la actividad

Figura 41 La figura 41 muestra el estudio de PK en conejos según el ejemplo 17. Se evaluaron los datos en el periodo entre 4

y 24 h. IFN-alfa-HES muestra una prolongación clara de la semivida en comparación con el material de partida de IFN-alfa no modificado. Figura 42 La figura 42 muestra la evaluación estadística del estudio de PK (mostrado: periodo hasta 12 h) según el ejemplo 17.

En el caso del material de partida no modificado (véase la figura 42(a)), la concentración cayó hasta casi cero durante las primeras dos horas, mientras que IFN-alfa-HES muestra una semivida claramente prolongada (figura 42 (b)).

Figura 43

La figura 43 permite un análisis de SDS-PAGE del conjugado de alfa-lAT-HES bruto preparado tal como se describe en el ejemplo 18.5 Para la electroforesis en gel se empelaron un instrumento XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, A)

y una fuente de alimentación Power Pac 200 (Bio-Rad, Múnich, A). Se usaron un gel de Tris-Acetato al 3-8% junto con un tampón de ejecución Tris-Acetato SDS en condiciones reductoras (ambos de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, A) según las instrucciones del fabricante.

Carril A: Marcador proteico de SDS Page no teñido de 6,5-200 KDa (SERVA Elektrophoresis GmbH, Heidelberg, A) Marcador del peso molecular desde arriba hasta abajo: 200 KD, 116 KD, 67 KD, 45 KD, 29 KD, 21 KD, 14,3 KD, 6,5 KD;

Carril B: alfa1AT (GTC Biotherapeutics Inc., Framingham, MA, n.º de lote 080604A);

Carril C: Conjugación con maleimido-HES tal como se describe en el ejemplo 18.5;

Carril D: Conjugación con maleimido-HES tal como se describe en el ejemplo 18.5 (concentración doble);

Figura 44

La figura 44 muestra un análisis de las fracciones A, B y C recogidas tras la cromatografía de intercambio iónico (véase el ejemplo 18.7)

Para la electroforesis en gel se empelaron un instrumento XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, A) y una fuente de alimentación Power Pac 200 (Bio-Rad, Múnich, A). Se usaron un gel de Tris-Acetato al 3-8% junto con un tampón de ejecución Tris-Acetato SDS en condiciones reductoras (ambos de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, A) según las instrucciones del fabricante.

Carril 1: Marcador proteico de SDS Page no teñido Mark12® de 2,5-200 KDa (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, A) Marcador del peso molecular desde arriba hasta abajo: 200 KD, 116 KD, 97 KD, 66 KD, 55 KD, 36 KD, 31 KD, 21 KD; 14 KD, 4 KD

Carril 2: Fracción A

Carril 3: Fracción B

Carril 4: Fracción C

Carril 5: alfa1AT (GTC Biotherapeutics Inc., Framingham, MA, n.º de lote 080604A)

Ejemplos

Ejemplo 1: Síntesis de conjugados de IFN beta

Ejemplo de referencia 1.1 Síntesis de derivados de hidroxietilalmidón funcionalizados con hidroxiamino

Ejemplo 1.1(a) Síntesis de hidroxilaminoHES10/0.4

Se disolvieron 2 g de HES10/0.4 (PM = 10000 D, DS = 0,4, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, A) en 17 ml de tampón acetato de sodio 0,1 M, pH 5,2 y se añadieron 20 mmol de O-[2-(2-aminooxi-etoxi)-etil]hidroxilamina. Tras agitar durante 19 h a 22ºC, se añadió la mezcla de reacción a 100 ml de una mezcla 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v). Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se redisolvió en 50 ml de agua, se dializó durante 21 h frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El peso molecular del HES10/0.4 cuando se midió con LALLS-GPC era de 8500 D y el DS era de 0,41.

Ejemplo 1.1(b) Síntesis de hidroxilaminoHES10/0.7

Se disolvieron 2 g de HES10/0.7 (PM = 10000 D, DS = 0,7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, A) en 18 ml de tampón acetato de sodio 0,1 M, pH 5,2 y se añadieron 20 mmol de O-[2-(2-aminooxi-etoxi)-etil]hidroxilamina. Tras agitar durante 19 h a 22ºC, se añadió la mezcla de reacción a 100 ml de una mezcla 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v). Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se redisolvió en 50 ml de agua, se dializó durante 21 h frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El peso molecular del HES10/0.7 cuando se midió con LALLS-GPC era de 10500 D y el DS era de 0,76.

Ejemplo 1.1(c) Síntesis de hidroxilaminoHES50/0.7

Se disolvieron 2 g de HES50/0.7 (PM = 50000 D, DS = 0,7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, A) en 20 ml de tampón acetato de sodio 0,1 M, pH 5,2 y se añadieron 4 mmol de O-[2-(2-aminooxi-etoxi)-etil]hidroxilamina. Tras agitar durante 19 h a 22ºC, se añadió la mezcla de reacción a 100 ml de una mezcla 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v). Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se redisolvió en 50 ml de agua, se dializó durante 21 h frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El peso molecular del HES50/0.7 cuando se midió con LALLS-GPC era de 47000 D y el DS era de 0,76.

Ejemplo 1.1(d) Síntesis de hidroxilaminoHES50/0.4

Se disolvieron 2 g de HES50/0.4 (PM = 50000 D, DS = 0,4, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, A) en 20 ml de tampón acetato de sodio 0,1 M, pH 5,2 y se añadieron 4 mmol de O-[2-(2-aminooxi-etoxi)-etil]hidroxilamina. Tras agitar durante 17,5 h a 22ºC, se añadió la mezcla de reacción a 70 ml de una mezcla 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v). Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 0ºC, se lavó con 30 ml de una mezcla 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v), se redisolvió en 50 ml de agua, se dializó durante 19,5 h frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El peso molecular del HES50/0.4 cuando se midió con LALLS-GPC era de 56000 D y el DS era de 0,41.

Ejemplo 1.1(e) Síntesis de hidroxilaminoHES18/0.4

Se preparó HES oxidado tal como se describe en el documento DE 196 28 705 A1. Se calentaron 200 mg de HES18/0.4 oxidado (PM = 18000 D, DS = 0,4) a 80ºC a vacío durante 17 h y se disolvieron en 2 ml de DMSO seco (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A). A la disolución se le añadieron 2 mmol de O-[2-(2-aminooxietoxi)-etil]-hidroxilamina. Tras la incubación durante 5 d a 65ºC, se añadió la mezcla de reacción a 20 ml de 2propanol enfriado con hielo y se incubó a -20ºC durante 1 h. Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se lavó con 42 ml de 2-propanol enfriado con hielo, se redisolvió en 10 ml de agua, se dializó durante 27 h frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El peso molecular del HES18/0.4 cuando se midió con LALLS-GPC era de 18000 D y el DS era de 0,41.

Ejemplo 1.1(f) Síntesis de hidrazidoHES10/0.4

Se preparó HES oxidado tal como se describe en el documento DE 196 28 705 A1. Se calentaron 200 mg de HES10/0.4 oxidado (PM = 10000 D, DS = 0,4, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, A) a 80ºC a vacío durante 17 h y se disolvieron en 2 ml de DMSO seco (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A). A la disolución se le añadieron 2 mmol de dihidrazida adípica (Lancaster Synthesis GmbH, Frankfurt/Main A). Tras la incubación durante 5 d a 65ºC, se añadió la mezcla de reacción a 20 ml de 2-propanol enfriado con hielo y se incubó a -20ºC durante 1 h. Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se lavó con 42 ml de 2propanol enfriado con hielo, se redisolvió en 10 ml de agua, se dializó durante 27 h frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El peso molecular del HES10/0.4 cuando se midió con LALLS-GPC era de 11000 D y el DS era de 0,41.

Ejemplo 1.1(g) Síntesis de carbohidrazidoHES10/0.4

Se preparó HES oxidado tal como se describe en el documento DE 196 28 705 A1. Se calentaron 200 mg de HES10/0.4 oxidado (PM = 10000 D, DS = 0,4, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, A) a 80ºC a vacío durante 17 h y se disolvieron en 2 ml de DMSO seco (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A). A la disolución se le añadieron 2 mmol de carbohidrazida (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A). Tras la incubación durante 5 d a 65ºC, se añadió la mezcla de reacción a 20 ml de 2-propanol enfriado con hielo y se incubó a -20ºC durante 1 h. Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se lavó con 42 ml de 2-propanol enfriado con hielo, se redisolvió en 10 ml de agua, se dializó durante 27 h frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El peso molecular del HES10/0.4 cuando se midió con LALLS-GPC era de 11000 D y el DS era de 0,41.

Ejemplo 1.1(h) Síntesis de hidrazidoHES10/0.4

Se disolvieron 200 mg de HES10/0.4 (PM = 10000 D, DS = 0,4, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, A) en 2 ml de tampón acetato de sodio 0,1 M, pH 5,2. A la disolución se le añadieron 2 mmol de dihidrazida adípica (Lancaster Synthesis GmbH, Frankfurt/Main D). Tras agitar durante 19 h a 22ºC, se añadió la mezcla de reacción a 21 ml de 2-propanol enfriado con hielo y se incubó a -20ºC durante 1 h. Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se lavó con 42 ml de 2-propanol enfriado con hielo, se redisolvió en 10 ml de agua, se dializó durante 27 h frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El peso molecular del HES10/0.4 cuando se midió con LALLS-GPC era de 8500 D y el DS era de 0,41.

Ejemplo 1.1(i) Síntesis de carbohidrazidoHES10/0.4

Se disolvieron 200 mg de HES10/0.4 (PM = 10000 D, DS = 0,4, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, A) en 2 ml de tampón acetato de sodio 0,1 M, pH 5,2. A la disolución se le añadieron 2 mmol de carbohidrazida (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A). Tras agitar durante 19 h a 22ºC, se añadió la mezcla de reacción a 21 ml de 2-propanol enfriado con hielo y se incubó a -20ºC durante 1 h. Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se lavó con 42 ml de 2-propanol enfriado con hielo, se redisolvió en 10 ml de agua, se dializó durante 27 h frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El peso molecular del HES10/0.4 cuando se midió con LALLS-GPC era de 8500 D y el DS era de 0,41.

Ejemplo de referencia 1.2 Síntesis de los conjugados de IFN beta

Ejemplo 1.2(a) Oxidación de IFN beta

Interferón beta-1a humano recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica que los productos

comerciales AVONEX™ (BIOGEN) y Rebif (Serono) y se expresó a partir de una línea celular CHO transfectada tal

como se describió (Dittmar et al., 1989) y purificado tal como se describe en el ejemplo 6.1. La oxidación fue esencialmente tal como se describe en el ejemplo 6.2, seguido por intercambio de tampón tal como se describe en el ejemplo 6.3.

Ejemplo 1.2(b) Reacción de IFN-beta oxidado del ejemplo 1,2(a) con derivados de HES de los ejemplos 1.1(a) – 1.1(i)

A 25,9 !l de una disolución de IFN-beta oxidado en tampón acetato de sodio 0,1 M, pH 5,5, se le añadieron 5,27 !l de una disolución del derivado de HES en tampón acetato de sodio 0,1 M, pH 5,5 y se incubó la disolución durante 16,5 h a 22ºC. Se emplearon las siguientes concentraciones:

(i)

78,9 mg/ml para derivados de HES preparados según el ejemplo 1.1(a), 1.1(b), 1.1(f), 1.1(g), 1.1(h) y 1.1(j)

(ii)

395 mg/ml para derivados de HES preparados según el ejemplo 1.1(c) y 1.1(d)

(iii) 142 mg/ml para derivado de HES preparado según el ejemplo 1.1(e)

Se analizó la mezcla de reacción respectiva mediante electroforesis en gel (véase la figura 1).

Ejemplo de referencia 1.3 Síntesis de derivados de hidroxietilalmidón funcionalizados con aldehído

Ejemplo 1.3(a) Síntesis de aldehído-HES10/0.4 a partir de amino-HES10/0.4 y ácido 4-formilbenzoico

Se preparó oxo-HES10/0.4 (PM = 10 kD, DS = 0,4) por Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, A; según el documento DE 196 28 705 A1. El peso molecular del HES10/0.4 cuando se midió con LALLS-GPC era de 14500 D y el DS era de 0,41.

Se disolvieron 5,1 g (0,51 mmol) de oxo-HES10/0.4 en 15 ml de dimetilsulfóxido anhidro (DMSO, Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A)) y se añadieron gota a gota bajo nitrógeno a una disolución de 5,1 ml (51 mmol) de 1,4-diaminobutano en 10 ml de dimetilsulfóxido anhidro y se agitó a 40ºC durante 19 h. Se añadió la mezcla de reacción a una mezcla de 80 ml de etanol y 80 ml de acetona. Se separó el precipitado resultante mediante centrifugación, se lavó con una mezcla de 20 ml de etanol y 20 ml de acetona y se redisolvió en 80 ml de agua. Se dializó la disolución durante 4 días frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, A) y posteriormente se liofilizo. El rendimiento era del 67% (3,4 g) de amino-HES10/0.4.

Se disolvieron 150 mg de ácido 4-formilbenzoico y 230 mg de 1-hidroxi-1H-benzotriazol (ambos de Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A) en 10 ml de N,N-dimetilformamida (calidad para síntesis peptídica, Biosolve, Valkenswaard, PB) y se añadieron 204 !l de N,N’-diisopropilcarbodiimida. Tras la incubación a 21ºC durante 30 min., se añadió 1 g del amino-HES10/0.4. Tras agitar durante 19 h a 22ºC, se añadió la mezcla de reacción a 84 ml de una mezcla 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v). Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se redisolvió en 50 ml de agua, se dializó durante 2 d frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó.

Ejemplo 1.3(b) Síntesis de aldehído-HES10/0.4 mediante oxidación con peryodato de HES10/0.4 oxidado en su extremo reductor

Se preparó Oxo-HES10/0.4 (PM = 10 kD, DS = 0,4) por Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, A; según el documento DE 196 28 705 A1. El peso molecular del HES10/0.4 cuando se midió con LALLS-GPC era de 8500 D y el DS era de 0,41.

Se disolvieron 300 mg de oxo-HES10/0.4 en 15 ml de tampón fosfato de sodio 20 mM, pH 7,2. Se disolvieron 64,2 mg de peryodato de sodio (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A) en 15 ml del mismo tampón. Se mezclaron ambas disoluciones y tras la incubación durante 30 min. a 21ºC, se añadieron 2 ml de glicerol y se incubó la mezcla de reacción a 21ºC durante 10 min. Se dializó la mezcla de reacción durante 24 h frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó.

Ejemplo de referencia 1.4 Síntesis de conjugados de IFN beta mediante aminación reductora con hidroxietilalmidón funcionalizado con aldehído sintetizado según los ejemplos 1.3(a) y 1.3(b)

Interferón beta-1a humano recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica que los productos

comerciales AVONEX™ (BIOGEN) y Rebif (Serono) y se expresó a partir de una línea celular CHO transfectada tal

como se describió (Dittmar et al., 1989) y purificado tal como se describe en el ejemplo 6.1. A 40 !l de una disolución de IFN beta en tampón acetato de sodio 0,1 M, pH 5,0 (0,5 mg/ml) se le añadieron 5 !l de una disolución del derivado de HES (sintetizado tal como se describe en los ejemplos 1.3(a) o 1.3(b)) en el mismo tampón (200 mg/ml). Se enfrió la mezcla hasta 4ºC y se añadieron 9 !l de una disolución 120 mM de cianoborohidruro de sodio en el mismo tampón a 4ºC y se incubó la mezcla durante 24 h a 4ºC. Se analizó la mezcla de reacción bruta mediante electroforesis en gel. Se observó una conjugación satisfactoria, tal como se indica por la migración de la banda de proteína a un peso molecular superior (véase la figura 2). El aumento de la anchura de la banda se debe a la distribución de peso molecular del derivado de HES usado y el número de derivados de HES unidos a la proteína.

Ejemplo 1.5 Descripción del bioensayo de actividad antiviral de IFN beta – Observaciones generales

En la farmacopea europea, actualmente sólo se facilitan ensayos para la determinación de la actividad de interferóna e interferón-y. Sin embargo, debido a que la potencia antiviral de interferón-a se mide en estas pruebas usando un bioensayo de efecto citopático (CPE) in vitro tal como se describe en el Suplemento de 2001 (capítulo 5.6) y ya que se aplica para los productos farmacológicos de IFN-1 aprobados hasta la fecha, la actividad antiviral puede someterse a prueba en analogía al interferón-a.

La actividad antiviral de IFN-1 puede someterse a prueba utilizando un bioensayo de efecto citopático in vitro específico por ejemplo con células de carcinoma de pulmón (A549) y virus de encefalomiocarditis (VEMC). Otras posibles combinaciones que pueden usarse para la determinación de la actividad antiviral de interferones son líneas celulares WISH o líneas celulares de riñón bovino de Madin-Darby (MDBK) y VEV (virus de la estomatitis vesicular).

Ensayo antiviral de interferón – idea general

En una primera etapa, se comparó la actividad antiviral in vitro de conjugados de HES-IFN-beta con IFN-beta no modificado.

En el ensayo de CPE (MDBK/VEV), se compararon diluciones de interferón patrón y conjugado de HES-IFN-beta. Se trataron previamente las células con las muestras de prueba durante aproximadamente 48 h antes de que se pusieran en contacto con el virus.

Tras un periodo de incubación (aprox. 22 h), se estimó el efecto protector del interferón frente al efecto citopático viral.

Ensayo antiviral de interferón – detalles experimentales

Se realizaron las siguientes etapas:

-

Se diluyeron previamente disoluciones de interferón en medio de cultivo celular para células MDBK (1:10). Se diluyeron secuencialmente estas disoluciones hasta 1:2 - 1:2.097.152 (=1:221)

-

4 duplicados (100 !l cada pocillo)

-

Se añadieron células MDBK recién tripsinizadas (5.000 células/pocillo en 50 !l)

-

Incubación: 48 horas a 37ºC

-

Se añadieron 50 !l de disolución de VEV diluida previamente (250 virus/pocillo)

-

Incubación: 22 horas a 37ºC

-

Determinación del efecto protector del interferón frente al efecto citopático viral

-

Cálculo del título de interferón usando el método de Spearman-Kärber Controles: Disoluciones de células MDBK con interferón, sin virus (control negativo) Células MDBK sin interferón con virus (control positivo) Resultados: Se sometieron a prueba dos muestras de interferón beta y los respectivos conjugados de HES en el ensayo de CPE

usando dos diluciones diferentes (1.000.000 UI/ml y 200.000 UI/ml estimadas). Se calculó el título de interferón según la fórmula de Spearman y Kärber. Se calculó la razón de las actividades de las diferentes muestras. Teniendo en cuenta la actividad específica estimada de las muestras, se calcularon y

compararon (datos no mostrados) las concentraciones CE50, a las cuales el 50% de las células están protegidas frente a la incubación del virus. El IFN-beta modificado conservaba la bioactividad. Ejemplo de referencia 2 Síntesis de conjugados de IFN alfa Ejemplo 2.1(a) Síntesis de aldehído-HES10/0.4 a partir de amino-HES10/0.4 y ácido 4-formilbenzoico Se preparó aldehído-HES10/0.4 según el ejemplo 1.3(a). Ejemplo 2.1(b) Síntesis de aldehído-HES10/0.4 a partir de amino-HES10/0.4 y ácido 4-formilbenzoico Se preparó aldehído-HES10/0.4 según el ejemplo 1,3(b). Ejemplo 2.2 Síntesis de conjugados de IFN alfa mediante aminación reductora con hidroxietilalmidón funcionalizado

con aldehído sintetizado según los ejemplos 2.1(a) y 2.1(b) Se usó rhIFN disponible comercialmente (Strathmann Biotec, Hamburgo, A, código de producto hIFNa). A 15 !l de una disolución de IFN beta en tampón acetato de sodio 0,1 M, pH 5,0 (1 mg/ml) se le añadieron 3,91 !l de

una disolución del derivado de HES (sintetizado tal como se describe en los ejemplos 2.1(a) o 2.1(b)) en el mismo tampón (200 mg/ml). Se enfrió la mezcla hasta 4ºC y se añadieron 3,78 !l de una disolución 120 mM de cianoborohidruro de sodio en el mismo tampón a 4ºC y se incubó la mezcla durante 24 h a 4ºC. Se analizó la mezcla de reacción bruta mediante electroforesis en gel. Se observó una conjugación satisfactoria, tal como se indica por la migración de la banda de proteína a un peso molecular superior (véase la figura 3). El aumento de la anchura de la banda se debe a la distribución de peso molecular de los derivados de HES usados y el número de derivados de HES unidos a la proteína.

Ejemplo de referencia 3 Síntesis de conjugados de AT III Ejemplo 3.1 Síntesis de derivados de hidroxietilalmidón funcionalizado con hidroxiamino Ejemplo 3.1(a) Síntesis de hidroxilaminoHES10/0.4 Se disolvieron 2 g de HES10/0.4 (PM = 10000 D, DS = 0,4, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim,

A) en 17 ml de tampón acetato de sodio 0,1 M, pH 5,2 y se añadieron 20 mmol de O-[2-(2-aminooxi-etoxi)-etil]hidroxilamina. Tras agitar durante 19 h a 22ºC, se añadió la mezcla de reacción a 100 ml de una mezcla 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v). Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se redisolvió en 50 ml de agua, se dializó durante 21 h frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El peso molecular del HES10/0.4 cuando se midió con LALLS-GPC era de 8500 D y el DS era de 0,41.

Ejemplo 3.1(b) Síntesis de hidroxilaminoHES10/0.7 Se disolvieron 2 g de HES10/0.7 (PM = 10000 D, DS = 0,7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, A) en 18 ml de tampón acetato de sodio 0,1 M, pH 5,2 y se añadieron 20 mmol de O-[2-(2-aminooxi-etoxi)-etil]

hidroxilamina. Tras agitar durante 19 h a 22ºC, se añadió la mezcla de reacción a 100 ml de una mezcla 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v). Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se redisolvió en 50 ml de agua, se dializó durante 21 h frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El peso molecular del HES10/0.7 cuando se midió con LALLS-GPC era de 10500 D y el DS era de 0,76.

Ejemplo 3.1(c) Síntesis de hidroxilaminoHES50/0.7

Se disolvieron 2 g de HES50/0.7 (PM = 50000 D, DS = 0,7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, A) en 20 ml de tampón acetato de sodio 0,1 M, pH 5,2 y se añadieron 4 mmol de O-[2-(2-aminooxi-etoxi)-etil]hidroxilamina. Tras agitar durante 19 h a 22ºC, se añadió la mezcla de reacción a 100 ml de una mezcla 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v). Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se redisolvió en 50 ml de agua, se dializó durante 21 h frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El peso molecular del HES50/0.7 cuando se midió con LALLS-GPC era de 47000 D y el DS era de 0,76.

Ejemplo 3.1(d) Síntesis de hidroxilaminoHES18/0.4

Se preparó HES oxidado esencialmente tal como se describe en el documento DE 19628705A1. Se calentaron 200 mg de HES18/0.4 oxidado (PM = 18000 D, DS = 0,4) a 80ºC a vacío durante 17 h y se disolvieron en 2 ml de DMSO seco (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A). A la disolución se le añadieron 2 mmol de O-[2(2-aminooxi-etoxi)-etil]-hidroxilamina. Tras la incubación durante 5 d a 65ºC, se añadió la mezcla de reacción a 20 ml de 2-propanol enfriado con hielo y se incubó a -20ºC durante 1 h. Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se lavó con 42 ml de 2-propanol enfriado con hielo, se redisolvió en 10 ml de agua, se dializó durante 27 h frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El peso molecular del HES18/0.4 cuando se midió con LALLS-GPC era de 18000 D y el DS era de 0,41.

Ejemplo 3.1(e) Síntesis de hidrazidoHES10/0.4

Se preparó HES oxidado esencialmente tal como se describe en el documento DE 19628705A1. Se calentaron 200 mg de HES10/0.4 oxidado (PM = 10000 D, DS = 0,4, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, A) a 80ºC a vacío durante 17 h y se disolvieron en 2 ml de DMSO seco (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A). A la disolución se le añadieron 2 mmol de dihidrazida adípica (Lancaster Synthesis GmbH, Frankfurt/Main D). Tras la incubación durante 5 d a 65ºC, se añadió la mezcla de reacción a 20 ml de 2-propanol enfriado con hielo y se incubó a -20ºC durante 1 h. Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se lavó con 42 ml de 2-propanol enfriado con hielo, se redisolvió en 10 ml de agua, se dializó durante 27 h frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El peso molecular del HES10/0.4 cuando se midió con LALLS-GPC era de 11000 D y el DS era de 0,41.

Ejemplo 3.1(f) Síntesis de carbohidrazidoHES10/0.4

Se preparó HES oxidado esencialmente tal como se describe en el documento DE 19628705A1. Se calentaron 200 mg de HES10/0.4 oxidado (PM = 10000 D, DS = 0,4, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, A) a 80ºC a vacío durante 17 h y se disolvieron en 2 ml de DMSO seco (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A). A la disolución se le añadieron 2 mmol de carbohidrazida (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A). Tras la incubación durante 5 d a 65ºC, se añadió la mezcla de reacción a 20 ml de 2-propanol enfriado con hielo y se incubó a -20ºC durante 1 h. Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se lavó con 42 ml de 2-propanol enfriado con hielo, se redisolvió en 10 ml de agua, se dializó durante 27 h frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El peso molecular del HES10/0.4 cuando se midió con LALLS-GPC era de 11000 D y el DS era de 0,41.

Ejemplo 3.1(g) Síntesis de hidrazidoHES10/0.4

Se disolvieron 200 mg de HES10/0.4 (PM = 10000 D, DS = 0,4, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, A) en 2 ml de tampón acetato de sodio 0,1 M, pH 5,2. A la disolución se le añadieron 2 mmol de dihidrazida adípica (Lancaster Synthesis GmbH, Frankfurt/Main D). Tras agitar durante 19 h a 22ºC, se añadió la mezcla de reacción a 21 ml de 2-propanol enfriado con hielo y se incubó a -20ºC durante 1 h. Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se lavó con 42 ml de 2-propanol enfriado con hielo, se redisolvió en 10 ml de agua, se dializó durante 27 h frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El peso molecular del HES10/0.4 cuando se midió con LALLS-GPC era de 8500 D y el DS era de 0,41.

Ejemplo 3.1(h) Síntesis de carbohidrazidoHES10/0.4

Se disolvieron 200 mg de HES10/0.4 (PM = 10000 D, DS = 0,4, Supramol Parenteral Colloids GmbH, RosbachRodheim, A) en 2 ml de tampón acetato de sodio 0,1 M, pH 5,2. A la disolución se le añadieron 2 mmol de carbohidrazida (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A). Tras agitar durante 19 h a 22ºC, se añadió la mezcla de reacción a 21 ml de 2-propanol enfriado con hielo y se incubó a -20ºC durante 1 h. Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se lavó con 42 ml de 2-propanol enfriado con hielo, se redisolvió en 10 ml de agua, se dializó durante 27 h frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El peso molecular del HES10/0.4 cuando se midió con LALLS-GPC era de 8500 D y el DS era de 0,41.

Ejemplo 3.2 Síntesis de conjugados de AT III

Ejemplo 3.2(a) Oxidación de AT III

La AT III usada era AT III humana recombinante (ATryn® de GTC Biotherapeutics). La oxidación fue esencialmente tal como se describe en el ejemplo 7.2, seguido por intercambio de tampón tal como se describe en el ejemplo 7.3.

Ejemplo 3.2(b) Reacción de AT III oxidada del ejemplo 3.2(a) con derivados de HES de los ejemplos 3.1(a) – 3.1(h)

A 4 !l de una disolución de ATIII oxidada en tampón acetato de sodio 0,1 M, pH 5,5, se le añadieron 3 !l de una disolución del derivado de HES en tampón acetato de sodio 0,1 M, pH 5,5 y se incubó la disolución durante 16,5 h a 22ºC. Se emplearon las siguientes concentraciones:

(i)

57 mg/ml para derivados de HES preparados según el ejemplo 3.1(a), 3.1(b), 3.1(e), 3.1(f), 3.1(g) y 3.1(h)

(ii)

287 mg/ml para derivados de HES preparados según el ejemplo 3.1(c)

(iii) 103 mg/ml para derivado de HES preparado según el ejemplo 3.1(d).

Se analizó la mezcla de reacción mediante electroforesis en gel (véase la figura 4).

Ejemplo 3.3 Síntesis de conjugados de AT III

Ejemplo 3.3(a) Síntesis de aldehído-HES10/0.4 a partir de amino-HES10/0.4 y ácido 4-formilbenzoico

Se preparó aldehído-HES10/0.4 según el ejemplo 1.3 (a).

Ejemplo 3.3(b) Síntesis de aldehído-HES10/0.4 a partir de amino-HES10/0.4 y ácido 4-formilbenzoico

Se preparó aldehído-HES10/0.4 según el ejemplo 1.3 (b).

Ejemplo 3.4 Síntesis de conjugados de AT III mediante aminación reductora con hidroxietilalmidón funcionalizado con aldehído sintetizado según los ejemplos 3.3(a) y 3.3(b)

La AT III usada era AT III humana recombinante (ATryn® de GTC Biotherapeutics).

A 6,67 !l de una disolución de AT III en tampón acetato de sodio 0,1 M, pH 5,0 (3 mg/ml) se le añadieron 1,73 !l de una disolución del derivado de HES (sintetizado tal como se describe en los ejemplos 3.3(a) o 3.3(b)) en el mismo tampón (200 mg/ml). Se enfrió la mezcla hasta 4ºC y se añadieron 1,68 !l de una disolución 120 mM de cianoborohidruro de sodio en el mismo tampón a 4ºC y se incubó la mezcla durante 24 h a 4ºC. Se analizó la mezcla de reacción bruta mediante electroforesis en gel. Se observó una conjugación satisfactoria, tal como se indica por la migración de la banda de proteína a un peso molecular superior (véase la figura 5). El aumento de la anchura de la banda se debe a la distribución de peso molecular del derivado de HES usado y el número de derivados de HES unidos a la proteína.

Ejemplo 3.5 Síntesis de conjugados de AT III mediante reacción de hidroxietilalmidón que tiene un grupo éster reactivo con AT III

Se usó una disolución de AT III con una concentración de aproximadamente 25 mg/ml en un tampón citrato de sodio 5 mM, glicerol 66 mM, NaCl 67 mM, pH de aproximadamente 7 para este ejemplo. La AT III usada era AT III humana recombinante (ATryn® de GTC Biotherapeutics).

Se liberó AT III del glicerol no deseado mediante ultrafiltración con un tampón fosfato, pH 7,2, y una membrana con un punto de corte de 10 kD. La concentración final de la disolución purificada resultante era de aproximadamente 25 mg/1,25 ml. Se controló la calidad de la proteína mediante análisis de HPGPC (véase la figura 6).

Se usaron los siguientes parámetros en el análisis de HPGPC: Columna: Superose 12 HR 10/30 300 x 10 mm D.I. (Pharmacia) Eluyente: Na2HPO4 27,38 mM; NaH2PO4 12,62 mM; NaCl 0,2 M; NaN3 al 0,005% en 1 l de agua desmineralizada Flujo: 0,24 ml/h Detector 1: Detector MALLS Detector 2: UV (280 nm) Detector 3: RI

Se preparó Oxo-HES10/0.4 (PM = 10, 559 D, DS = 0,4) por Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, A; según el documento DE 196 28 705 A1. El grado de oxidación de oxo-HES era del 95%

Se disolvieron 52 mg de oxo-HES10/0.4 en 0,2 ml de DMF anhidra. A esta disolución, se le añadieron 2,6 mg de carbonato de N,N’-disuccinimidilo, y se agitó la mezcla durante 2 h a temperatura ambiente.

Se añadieron 0,5 ml de disolución de bicarbonato de sodio 1 M a 0,5 ml de la disolución de AT III resultante en una disolución que tenía una concentración de aproximadamente AT III 10 mg/ml, pH 8,2. A esta disolución, se le añadió la disolución que contenía el oxo-HES reactivo, tal como se preparó anteriormente, en porciones de 50 !l hasta que, tras aproximadamente 30 min., la reacción había llegado a su final. Entonces, se ajustó el pH de la mezcla hasta 7 usando HCl 0,1 N y se congeló a -18ºC hasta que un análisis de HPGPC (cromatografía de permeación en gel de alta resolución) dio un rendimiento de aproximadamente un 60% de conjugado. Este resultado se muestra en la figura 7.

Se usaron los siguientes parámetros en el análisis de HPGPC:

Columna: Superose 12 HR 10/30 300 x 10 mm D.I. (Pharmacia) Eluyente: Na2HPO4 27,38 mM; NaH2PO4 12,62 mM; NaCl 0,2 M; NaN3 al 0,005% en 1 l de agua desmineralizada Flujo: 0,24 ml/h Detector 1: Detector MALLS Detector 2: UV (280 nm) Detector 3: RI

Ejemplo de referencia 4 Síntesis de conjugados de GM-CSF

Ejemplo 4.1 Síntesis de derivados de hidroxietilalmidón funcionalizados con hidroxiamino

Ejemplo 4.1(a) Síntesis de hidroxilaminoHES10/0.4

Se disolvieron 2 g de HES10/0.4 (PM = 10000 D, DS = 0,4, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, A) en 17 ml de tampón acetato de sodio 0,1 M, pH 5,2 y se añadieron 20 mmol de O-[2-(2-aminooxi-etoxi)-etil]hidroxilamina. Tras agitar durante 19 h a 22ºC, se añadió la mezcla de reacción a 100 ml de una mezcla 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v). Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se redisolvió en 50 ml de agua, se dializó durante 21 h frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El peso molecular del HES10/0.4 cuando se midió con LALLS-GPC era de 8500 D y el DS era de 0,41.

Ejemplo 4.1(b) Síntesis de hidroxilaminoHES10/0.7

Se disolvieron 2 g de HES10/0.7 (PM = 10000 D, DS = 0,7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, A) en 18 ml de tampón acetato de sodio 0,1 M, pH 5,2 y se añadieron 20 mmol de O-[2-(2-aminooxi-etoxi)-etil]hidroxilamina. Tras agitar durante 19 h a 22ºC, se añadió la mezcla de reacción a 100 ml de una mezcla 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v). Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se redisolvió en 50 ml de agua, se dializó durante 21 h frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El peso molecular del HES10/0.7 cuando se midió con LALLS-GPC era de 10500 D y el DS era de 0,76.

Ejemplo 4.1(c) Síntesis de hidroxilaminoHES50/0.7

Se disolvieron 2 g de HES50/0.7 (PM = 50000 D, DS = 0,7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, A) en 20 ml de tampón acetato de sodio 0,1 M, pH 5,2 y se añadieron 4 mmol de O-[2-(2-aminooxi-etoxi)-etil]hidroxilamina. Tras agitar durante 19 h a 22ºC, se añadió la mezcla de reacción a 100 ml de una mezcla 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v). Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se redisolvió en 50 ml de agua, se dializó durante 21 h frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El peso molecular del HES50/0.7 cuando se midió con LALLS-GPC era de 47000 D y el DS era de 0,76.

Ejemplo 4.1(d) Síntesis de hidroxilaminoHES50/0.4

Se disolvieron 2 g de HES50/0.4 (PM = 50000 D, DS = 0,4, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, A) en 20 ml de tampón acetato de sodio, pH 5,2 y se añadieron 4 mmol de O-[2-(2-aminooxi-etoxi)-etil]hidroxilamina. Tras agitar durante 17,5 h a 22ºC, se añadió la mezcla de reacción a 70 ml de una mezcla 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v). Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 0ºC, se lavó con 30 ml de una mezcla 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v), se redisolvió en 50 ml de agua, se dializó durante 19,5 h frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El peso molecular del HES50/0.4 cuando se midió con LALLS-GPC era de 56000 D y el DS era de 0,41.

Ejemplo 4.1(e) Síntesis de hidroxilaminoHES18/0.4

Se preparó HES oxidado tal como se describe en el documento DE 19628705A1. Se calentaron 200 mg de HES18/0.4 oxidado (PM = 18000 D, DS = 0,4) a 80ºC a vacío durante 17 h y se disolvieron en 2 ml de DMSO seco (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A). A la disolución se le añadieron 2 mmol de O-[2-(2-aminooxietoxi)-etil]-hidroxilamina. Tras la incubación durante 5 d a 65ºC, se añadió la mezcla de reacción a 20 ml de 2propanol enfriado con hielo y se incubó a -20ºC durante 1 h. Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se lavó con 42 ml de 2-propanol enfriado con hielo, se redisolvió en 10 ml de agua, se dializó durante 27 h frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El peso molecular del HES18/0.4 cuando se midió con LALLS-GPC era de 18000 D y el DS era de 0,41.

Ejemplo 4.1(f) Síntesis de hidrazidoHES10/0.4

Se preparó HES oxidado esencialmente tal como se describe en el documento DE 19628705A1. Se calentaron 200 mg de HES10/0.4 oxidado (PM = 10000 D, DS = 0,4, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, A) a 80ºC a vacío durante 17 h y se disolvieron en 2 ml de DMSO seco (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A). A la disolución se le añadieron 2 mmol de dihidrazida adípica (Lancaster Synthesis GmbH, Frankfurt/Main D). Tras la incubación durante 5 d a 65ºC, se añadió la mezcla de reacción a 20 ml de 2-propanol enfriado con hielo y se incubó a -20ºC durante 1 h. Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se lavó con 42 ml de 2-propanol enfriado con hielo, se redisolvió en 10 ml de agua, se dializó durante 27 h frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El peso molecular del HES10/0.4 cuando se midió con LALLS-GPC era de 11000 D y el DS era de 0,41.

Ejemplo 4.1(g) Síntesis de carbohidrazidoHES10/0.4

Se preparó HES oxidado tal como se describe en el documento DE 19628705A1. Se calentaron 200 mg de HES10/0.4 oxidado (PM = 10000 D, DS = 0,4, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, A) a 80ºC a vacío durante 17 h y se disolvieron en 2 ml de DMSO seco (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A). A la disolución se le añadieron 2 mmol de carbohidrazida (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A). Tras la incubación durante 5 d a 65ºC, se añadió la mezcla de reacción a 20 ml de 2-propanol enfriado con hielo y se incubó a -20ºC durante 1 h. Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se lavó con 42 ml de 2-propanol enfriado con hielo, se redisolvió en 10 ml de agua, se dializó durante 27 h frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El peso molecular del HES10/0.4 cuando se midió con LALLS-GPC era de 11000 D y el DS era de 0,41.

Ejemplo 4.1(h) Síntesis de hidrazidoHES10/0.4

Se disolvieron 200 mg de HES10/0.4 (PM = 10000 D, DS = 0,4, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, A) en 2 ml de tampón acetato de sodio 0,1 M, pH 5,2. A la disolución se le añadieron 2 mmol de dihidrazida adípica (Lancaster Synthesis GmbH, Frankfurt/Main D). Tras agitar durante 19 h a 22ºC, se añadió la mezcla de reacción a 21 ml de 2-propanol enfriado con hielo y se incubó a -20ºC durante 1 h. Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se lavó con 42 ml de 2-propanol enfriado con hielo, se redisolvió en 10 ml de agua, se dializó durante 27 h frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El peso molecular del HES10/0.4 cuando se midió con LALLS-GPC era de 8500 D y el DS era de 0,41.

Ejemplo 4.1(i) Síntesis de carbohidrazidoHES10/0.4

Se disolvieron 200 mg de HES10/0.4 (PM = 10000 D, DS = 0,4, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, A) en 2 ml de tampón acetato de sodio 0,1 M, pH 5,2. A la disolución se le añadieron 2 mmol de carbohidrazida (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A). Tras agitar durante 19 h a 22ºC, se añadió la mezcla de reacción a 21 ml de 2-propanol enfriado con hielo y se incubó a -20ºC durante 1 h. Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se lavó con 42 ml de 2-propanol enfriado con hielo, se redisolvió en 10 ml de agua, se dializó durante 27 h frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El peso molecular del HES10/0.4 cuando se midió con LALLS-GPC era de 8500 D y el DS era de 0,41.

Ejemplo 4.2 Síntesis de conjugados de GM-CSF

Ejemplo 4.2(a) Oxidación de GM-CSF

Se purificó GM-CSF tal como se describe en el ejemplo 8.1. La oxidación fue esencialmente tal como se describe en el ejemplo 8.2, seguido por intercambio de tampón tal como se describe en el ejemplo 8.3.

Ejemplo 4.2(b) Reacción de GM-CSF oxidado del ejemplo 4.2(a) con derivados de HES de los ejemplos 4.1(a) – 4.1(i)

A 27 !l de una disolución de GM-CSF oxidado en tampón acetato de sodio 0,1 M, pH 5,5, se le añadieron 3,81 !l de una disolución del derivado de HES en tampón acetato de sodio 0,1 M, pH 5,5 y se incubó la disolución durante 16,5 h a 22ºC. Se emplearon las siguientes concentraciones:

(i)

78,9 mg/ml para derivados de HES preparados según el ejemplo 4.1(a), 4.1(b), 4.1(f), 4.1(g), 4.1 (h) y 4.1(i)

(ii)

395 mg/ml para derivados de HES preparados según el ejemplo 4.1 (c) y 4.1(d)

(iii) 142 mg/ml para derivado de HES preparado según el ejemplo 4.1(e). Se analizó la mezcla de reacción mediante electroforesis en gel (véase la figura 8). Ejemplo 4.3 Síntesis de conjugados de GM-CSF Ejemplo 4.3(a) Síntesis de aldehído-HES10/0.4 a partir de amino-HES10/0.4 y ácido 4-formilbenzoico Se preparó aldehído-HES10/0.4 según el ejemplo 1.3(a). Ejemplo 4.3(b) Síntesis de aldehído-HES10/0.4 a partir de amino-HES10/0.4 y ácido 4-formilbenzoico Se preparó aldehído-HES10/0.4 según el ejemplo 1.3(b). Ejemplo 4.4 Síntesis de conjugados de GM-CSF mediante aminación reductora con hidroxietilalmidón funcionalizado

con aldehído sintetizado según los ejemplos 4.3(a) y 4.3(b) A 20 !l de una disolución de GM-CSF en tampón acetato de sodio 0,1 M, pH 5,0 (1 mg/ml) se le añadieron 1,91 !l de una disolución del derivado de HES (sintetizado tal como se describe en los ejemplos 3.3(a) o 3.3(b)) en el mismo tampón (200 mg/ml). Se enfrió la mezcla hasta 4ºC y se añadieron 4,38 !l de una disolución 120 mM de cianoborohidruro de sodio en el mismo tampón a 4ºC y se incubó la mezcla durante 24 h a 4ºC. Se analizó la mezcla de reacción bruta mediante electroforesis en gel. Se observó una conjugación satisfactoria, tal como se indica por migración de la banda de proteína a un peso molecular superior (véase la figura 9). El aumento de la anchura de la

banda se debe a la distribución de peso molecular del derivado de HES usado y el número de derivados de HES unidos a la proteína. Ejemplo de referencia 5 Síntesis de conjugados de AT III, IFN beta y GM-CSF con hidroxietilalmidón funcionalizado

con hidroxilamino Ejemplo 5.1 Síntesis de hidroxietilalmidón funcionalizado con hidroxilamino

(a)

Se sintetizó hidroxilaminoHES10/0.4 tal como se describió en el ejemplo 1.1(a) anteriormente en el presente documento.

(b)

Se sintetizó hidroxilaminoHES50/0.7 tal como se describió en el ejemplo 1.1(c) anteriormente en el presente documento.

Ejemplo 5.2 Síntesis de un conjugado de IFN beta con hidroxilaminoHES50/0.7 según el ejemplo 5.1(b)

A 1190 !l de una disolución de IFN beta oxidado en tampón acetato de sodio 0,1 M, pH 5,5 (obtenido tras la etapa del ejemplo 6.3), se le añadió una disolución de 81,4 mg de hidroxilaminoHES50/0.7 en 200 !l de tampón acetato de sodio 0,1 M, pH 5,5 y se incubó la disolución durante 19 h a 22ºC. Se analizó la mezcla de reacción mediante electroforesis en gel (véase la figura 10).

Ejemplo 5.3 Síntesis de un conjugado de AT III con hidroxilaminoHES10/0.4 según el ejemplo 5.1(a)

A 500 !l de una disolución de AT III oxidado en tampón acetato de sodio 0,1 M, pH 5,5 (obtenido tras la etapa del ejemplo 7.3) se le añadió una disolución de 21,6 mg de hidroxilaminoHES10/0.4 en 1500 !l de tampón acetato de sodio 0,1 M, pH 5,5 y se incubó la disolución durante 20,5 h a 22ºC.

Ejemplo 5.4 Síntesis de un conjugado de GM-CSF con hidroxilaminoHES10/0.4 según el ejemplo 5.1(a)

A 720 !l de una disolución de GM-CSF oxidado en tampón acetato de sodio 0,1 M, pH 5,5 (obtenido tras la etapa del ejemplo 8.3), se le añadió una disolución de 14,0 mg de hidroxilaminoHES10/0.4 en 180 !l de tampón acetato de sodio 0,1 M, pH 5,5 y se incubó la disolución durante 18 h a 22ºC.

Ejemplo 6 Caracterización adicional de conjugados de IFN-beta 1a

Ejemplo 6.1(a) Purificación y análisis de interferón beta humano recombinante

Interferón beta-1a humano recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica que los productos comerciales AVONEX™ (BIOGEN) y Rebif (Serono) y se expresó a partir de una línea celular CHO transfectada tal como se describió (Dittmar et al., 1989). Se purificó IFN-1 mediante un procedimiento de tres etapas que comprende adsorción del sobrenadante de cultivo sobre Blue Sepharose, elución con tampón fosfato de Na 0,05 M, pH 7,0 que contiene NaCl 0,7 M + etilenglicol al 60% y cromatografía sobre una columna de quelato de Zn FF de 10 ml a temperatura ambiental. Se equilibró previamente la columna con 30 ml de tampón fosfato de Na 20 mM, NaCl 0,3 M, pH 7,4. Se aplicó la muestra tras una dilución 1:2 con 15 ml de fosfato de Na 20 mM, pH 7,2-7,5. Entonces se lavó la columna con 25 ml de fosfato de Na 20 mM, NaCl 0,3 M, pH 7,4, seguido por la elución I (20 ml de acetato de Na 0,1 M, NaCl 0,5 M, pH 5,9) y la elución II (15 ml de acetato de Na 0,1 M, NaCl 0,5 M, pH 4,7). Se realizó la purificación final mediante RP-HPLC en una columna Vydac C4 equilibrada en TFA al 0,1% (disolvente A) usando un gradiente de desde el 0 - 100% de disolvente B (el 80% de acetonitrilo en TFA al 0,1%).

Ejemplo 6.1(b)

El IFN-beta 1a usado era > 95% puro (basándose en el análisis de SDS-PAGE y RP-HPLC y contenía < 5% de dímeros (condiciones no reductoras). Las estructuras de hidrato de carbono de la preparación eran esencialmente

las mismas que las de AVONEX™ y mostraban la presencia de un 42% de estructuras diantenarias, un 16% de

fucosa proximal negativa diantenaria, un 12% de triantenaria, un 7% de tetranatenaria y un 9% de triantenaria con 1 repetición de N-acetil-lactosamina (el 12% restante eran estructuras de agalacto y pequeñas cantidades de cadenas con fucosa periférica). Basándose en la respuesta de HPAEC-PAD, aproximadamente el 14% de las cadenas de oligosacáridos eran asialo, el 21% eran monosialo, el 35% eran disialo y el 19% eran trisialo. Estaban presentes pequeñas cantidades de estructuras de tetrasialo. La gran mayoría de los ácidos siálicos se encontraron como ácido N-acetilneuramínico y estaba presente < 5% de ácido N-glicolilneuramínico en la preparación, por tanto la

preparación usada se parecía más al producto comercial AVONEX™ puesto que Rebif (producto de Serono)

contiene >15% de ácido N-glicolilneuramínico (datos no mostrados).

Ejemplo 6.2 Oxidación con peryodato de residuos de ácido N-acetilneuramínico mediante tratamiento suave con peryodato de IFN-11a a partir de células CHO

A una disolución de 500 !g/ml de IFN-1 (en tampón acetato de Na 0,1 M, pH 5,5 enfriado previamente y mantenido a 0ºC) se le añadió una disolución enfriada con hielo de meta-peryodato de sodio 10 mM dando como resultado una concentración final de meta-peryodato de sodio 1 mM. Se incubó la mezcla a 0ºC durante 1 hora en un baño de hielo en la oscuridad y se terminó la reacción mediante la adición de 20 !l de glicerol y se incubó durante 5 minutos adicionales. Posteriormente, se concentraron las muestras de IFN-1 usando una unidad concentradora Vivaspin tal como se describe a continuación.

Ejemplo 6.3 Intercambio de tampón de IFN-11a oxidado con peryodato para su hesilación posterior

Se realizó el intercambio de tampón usando 2 unidades concentradoras Vivaspin de 0,5 ml (Vivaspin AG, Hannover, Alemania) con una membrana de polietersulfona (PES) y un punto de corte de 10 Kda. En primer lugar, se lavó la unidad concentradora mediante la adición de 0,5 ml de tampón acetato de Na 0,1 M, pH 5,5 y centrifugación a 4000 rpm a 6ºC en un instrumento Megafuge 1.0R (Kendro Laboratory Equipment, Osterode, Alemania). Posteriormente, se añadieron 0,5 ml de la disolución de IFN-1 oxidado con peryodato a la unidad concentradora y se centrifugó a 4000 rpm durante 25 min. hasta que se logró una concentración de al menos 5 veces. Se añadió tampón acetato de Na pH 5,5 al concentrado hasta un volumen final de 0,5 ml que se centrifugó tal como se describió anteriormente. Se repitió el ciclo de centrifugación 3 veces, se separó el concentrado final y se transfirió a un vial de plástico de 2 ml (Eppendorff, Alemania) y se mantuvo en hielo hasta su uso adicional en la reacción de modificación con HAS.

Ejemplo 6.4 Síntesis de conjugados de HAS e IFN-1 Se llevó a cabo la síntesis tal como se describió en el ejemplo 5.2 anteriormente.

5 Ejemplo 6.5 Separación de IFN-1 hesilado y derivados de HAS en exceso de incubaciones de la proteína oxidada con peryodato, con hidroxilamino-HES50/0.7. Resumen: Se realizaron ejecuciones de RP-HPLC a temperatura ambiente usando un equipo ÄKTA explorer 10 y

una velocidad de flujo de 1,25 ml/min. Se aplicaron alícuotas de las mezclas de incubación que contenían 400 !g de IFN-1 sobre una columna de 250 mm x 10 mm de fase C18 equilibrada con 1,25 VC del 11% de disolvente B (TFA al 0,1%, acetonitrilo al 90%) y el 89% de disolvente A (TFA al 0,1%). Entonces se inyectaron las muestras (aprox. 1,25 ml) y se lavó el bucle de muestra con 11 ml del 11% de disolvente B. Tras lavar la columna con 0,2 VC del 11% de disolvente B, se aplicó un gradiente lineal del 11% al 90% de disolvente B a lo largo de 2 VC. Se continuó la elución de la columna usando 0,8 VC del 90% de disolvente B, y finalmente se reequilibró la columna con 1,0 VC del

15 11% de disolvente B. Las proteínas de IFN-1 eluyeron en un volumen de 7,5 ml a una concentración del 62% de disolvente B. La recuperación de la proteína era del 60% (HES IFN-1 CHO) basándose en el área de pico específico de 790 mAU x ml x mg-1 que se obtuvo con una preparación de IFN-1 patrón en una columna de fase C4 usando el mismo equipo.

Materiales y métodos para el ejemplo 6.5 Equipo y materiales Equipo: ÄKTA explorer 10 (Amersham Pharmacia Biotech), con:

25 Bomba P-903 Mezclador M-925, con una cámara de 0,6 ml Monitor UV-900, con una célula de flujo de 10 mm Monitor pH/C-900 Colector de fracciones Frac-900 35 Bucle de muestra de 2 ml

Software Unicorn versión 3.21 Columna: 250 mm x 10 mm, Macherey-Nagel 250-1/2”-10 Nucleosil 7 C18, n.º de cat. 715002, n.º de lote 4020854

Volumen de la columna: 20 ml

45 Velocidad de flujo: 1,25 ml/min. Disolvente A TFA al 0,1% en HPLC-agua Disolvente B Acetonitrilo al 90%; TFA al 0,1% en HPLC-agua Método para la ejecución de RP-HPLC del ejemplo 6.5.

Volumen Etapa Disolvente A Disolvente B

0,25 VC Equilibrado 89% 11% 11 ml Inyección de la muestra 89% 11%

Fraccionamiento 89% 11% 0,20 VC Lavado de la muestra no unida 89% 11% 2,00 VC Gradiente lineal 89-10% 11-90% 0,80 VC Isocrático 10% 90%

Fraccionamiento final 10% 90% 1,00 VC Reequilibrado 89% 11%

Detección: A 280 nm

A 221 nm

A 206 nm

Conductividad

Fraccionamiento: 1,25 ml/fracción

Ejemplo 6.6 Experimentos analíticos:

Ejemplo 6.6(a) Liberación de oligosacáridos unidos a N con polipéptido N-glicosidasa recombinante (Roche, Penzberg, Alemania)

A 100-120 !g de IFN-11a nativo, oxidado con peryodato o modificado con HAS en tampón fosfato de Na 50 mM, pH 7,2 se le añadieron 25 !l de polipéptido N-glicosidasa recombinante (Roche, Penzberg, Alemania; 250 unidades/250 !l, lote: 101610420). Se incubó la mezcla de reacción a 37ºC durante 12-18 horas y se comprobó la liberación de oligosacáridos unidos de manera N-glicosídica mediante análisis de SDS-PAGE de 3-5 !g de proteína en condiciones reductoras y tinción posterior de las bandas de proteínas con azul de Coomassie (Carl Roth GmbH Karlsruhe, Alemania) y detección del desplazamiento específico de la banda de proteína de IFN-beta a la posición de migración de la forma des-N-glicosilada.

Ejemplo 6.6(b)

Se separaron los N-glicanos liberados del polipéptido mediante adición de 3 volúmenes de etanol al 100% a -20ºC y se realizó una incubación a -20ºC durante al menos 2 horas. Se separó la proteína precipitada mediante centrifugación a 13.000 rpm durante 10 minutos a 4ºC. Entonces se sometió el sedimento a dos lavados adicionales con 500 !l de etanol al 70% enfriado con hielo. Se secaron los oligosacáridos en los sobrenadantes reunidos en una centrífuga de vacío (Speed Vac concentrator, Savant Instruments Inc., EE.UU.). Se desalaron las muestras de glicano usando cartuchos Hypercarb (100 ó 200 mg) tal como sigue: antes de su uso, se lavaron los cartuchos tres veces con 500 !l de acetonitrilo al 80% (v/v) en TFA al 0,1% (v/v) seguido por tres lavados con 500 !l de agua. Se diluyeron las muestras con agua hasta un volumen final de al menos 300 !l antes de cargarse sobre los cartuchos. Se lavaron rigurosamente con agua. Se eluyeron los oligosacáridos con 1,2 ml de acetonitrilo al 25% que contenía TFA al 0,1% (v/v). Se neutralizaron los oligosacáridos eluidos con NH4OH 2 M y se secaron en un concentrador Speed Vac. Se almacenaron a -20ºC en H2O.

Ejemplo 6.6(c) Hidrólisis ácida suave

Se realizó una hidrólisis ácida suave de los oligosacáridos (liberación de ácidos siálicos y derivados de ácido siálico modificados con HAS de N-glicanos) tal como sigue: se mezclaron alícuotas de los oligosacáridos desalados u oligosacáridos modificados con HAS con el mismo volumen de H2SO4 10 mM y se incubaron durante 90 minutos a 80ºC. Tras la neutralización con NaOH 50 mM, se secó la mezcla de glicanos desialilados en un concentrador Speed-Vac y se ajustó a una concentración apropiada para el análisis en HPAEC-PAD (cromatografía de intercambio aniónico a pH alto con detección amperométrica pulsada). Para el análisis de EM MALDI/TOF posterior de oligosacáridos neutros se desalaron muestras (0,05-1 nmol) usando columnas Hypercarb pequeñas preparadas añadiendo 25-40 !l de carbono grafitizado a puntas de pipeta de 200 !l.

Ejemplo 6.6(d) Mapeo de oligosacáridos mediante HPAEC-PAD (cromatografía de intercambio aniónico a pH alto con detección amperométrica pulsada)

Se usó un sistema BioLC, (Dionex, Sunnyvale) que consiste en un inyector automático AS50, un compartimento térmico AS50, un detector electroquímico ED50, una bomba de gradiente GS50, Software Chromeleon Chromatography Management System, junto con una columna de separación CarboPac PA-100 (4 x 250 mm) y una precolumna CarboPac PA-100 (4 x 50 mm). Se usaron dos modos diferentes para el mapeo y para la cuantificación de oligosacáridos.

I) Modo de asialo:

Se sometieron oligosacáridos neutros a mapeo mediante HPAEC-PAD usando un gradiente de disolvente A (NaOH 200 mM) y disolvente B (NaOH 200 mM más acetato de Na 600 mM) tal como se representa en la siguiente tabla:

Tabla: Gradiente para el mapeo de oligosacáridos neutros

Tiempo [min.]

disolvente A [%] disolvente B [%]

0

100

0

5

100 0

35

80 20

45

70 30

47

0 100

52

0 100

53

100 0

60

100 0

Velocidad de flujo: 1 ml/min.

Los potenciales de detector para el detector electroquímico eran: Tabla: Potenciales de detector para oligosacáridos

Tiempo [ms]

potencial [mV]

0

50

200

50

400

50

410

750

600

750

610

-150

1000

-150

II) Modo de oligos: 10 Se sometieron oligosacáridos nativos a mapeo mediante HPAEC-PAD usando un gradiente de disolvente C (NaOH 100 mM) y disolvente D (NaOH 100 mM más acetato de Na 600 mM) tal como se representa en la siguiente tabla: Tabla: Mapeo en gradiente de oligosacáridos nativos (sialilados)

Tiempo [min.]

disolvente C [%] disolvente D [%]

0

100

0

2

100 0

50

65 35

60

0 100

63

0 100

64

100 0

70

100 0

Velocidad de flujo: 1 ml/min.

15 Los potenciales de detector para el detector electroquímico eran: Tabla: Potenciales de detector para oligosacáridos

Tiempo [ms]

potencial [mV]

0

50

200

50

400

50

410

750

600

750

610

-150

1000

-150

Se calcularon las áreas de picos específicos (nC x min. x nmol-1) usando factores de respuesta obtenidos con patrones de oligosacáridos definidos (estructuras diantenarias disialiladas, triantenarias trisialiladas y tetrantenarias tetrasialiladas con y sin repeticiones de N-acetil-lactosamina (Nimtz et al., 1993, Schroeter et al., 1999, Grabenhorst 25 et al., 1999).

Resultados para IFN-1 modificado con HAS

Tras la RP-HPLC en fase C-18, se detectó IFN-1 modificado con HAS en las fracciones 32-37. Se calculó la 30 recuperación de HAS-IFN-1.

La flecha en la figura 11 indica la posición de migración de IFN-1 no modificado presumiblemente debido a formas que carecen de derivados de ácidos siálicos terminales mientras que el IFN-1 modificado con HAS se detectó como una zona teñida con Coomassie difusa ancha que abarca masas moleculares de 35 Kda - 120 Kda.

Se reunieron las fracciones 32-37 del eluato de RP-HPLC y se concentraron en un concentrador Speed Vac tras la neutralización. Normalmente, se secaron alícuotas de 100-200 !g de la muestra de IFN-1 y se disolvieron en fosfato de Na 50 mM, pH 7,2 más Tween-20 al 0,05% y se incubó con polipéptido N-glicosidasa durante 20-30 horas a 37ºC. Se sometieron los oligosacáridos resultantes a análisis mediante HPAEC-PAD (ejemplo 6.6d) antes y después del tratamiento con ácido suave.

Tal como se representa en la figura 12, el material de oligosacárido del IFN-1 modificado con HAS eluyó tras 52 minutos de la columna en condiciones en las que se detectaron el asialo, mono, di y trisialilado a los 16-20 min., 21-26 min., 28-33 min. y 34-38 min., respectivamente. Tras el tratamiento con ácido suave de la muestra de oligosacáridos en condiciones en las que se logra la liberación completa de ácidos siálicos, se detectaron los Nglicanos de tipo complejo neutros esperados de IFN-1 en el perfil de HPAEC-PAD y se detectó el derivado de HAS liberado a un tiempo de retención de 46-49 min. (usando el gradiente del modo de asialo, véase el ejemplo 6.6 dI), esto indica que HAS se une a los oligosacáridos unidos a N de IFN-1 mediante un enlace lábil al ácido tal como se espera (figura 13).

Ejemplo 7 Caracterización adicional de conjugados de AT III

Ejemplo 7.1 AT III humana

La AT III usada era AT III humana recombinante (ATryn® de GTC Biotherapeutics).

Ejemplo 7.2 Oxidación con peryodato de residuos de ácido N-acetilneuramínico mediante tratamiento con peryodato suave de AT III

Se llevó a cabo la oxidación con peryodato esencialmente tal como se describió para IFN-beta en el ejemplo 6.2.

Ejemplo 7.3 Intercambio de tampón de AT III oxidada con peryodato para su hesilación posterior

Se llevó a cabo el intercambio de tampón esencialmente tal como se describió para IFN-beta en el ejemplo 6.3.

Ejemplo 7.4 Síntesis de conjugados de HAS y AT III

La síntesis fue tal como se describió en el ejemplo 5.3 anterior.

Ejemplo 7.5 Cromatografía de intercambio iónico de AT III para la separación de AT III modificada con HAS del reactivo de HAS en exceso

7.5.1. Se realizó el intercambio de tampón de muestras de antitrombina III para su posterior purificación mediante cromatografía de intercambio iónico usando concentradores Vivaspin (10.000 PM CO PES, n.º de cat. de Vivascience VS0602, n.º de lote 03VS0633). Se diluyeron muestras de reacciones de modificación con HAS (2 mg de AT III en 1,6 ml) hasta 5 ml con tampón A (ácido N-morfolinopropanosulfónico 20 mM ajustado a pH 8,0 con NaOH, MOPS). Se centrifugaron las muestras según las recomendaciones del fabricante hasta aproximadamente 0,4-0,6 ml y se repitió dos veces la etapa de dilución/concentración dos veces. Finalmente, se lavaron las muestras de proteína de la unidad concentradora.

7.5.2. Se realizó la purificación de la muestra de AT III a temperatura ambiental usando un sistema ÄKTA explorer 10 (Amersham Pharmacia Biotech) que consiste en una bomba P-903, una mezcladora M-925, con una cámara de 0,6 ml, se usó un monitor UV-900 junto con una célula de flujo de 10 mm, un monitor pH/C-900, una bomba demuestra P-950 y un bucle de muestra de 5 ml. Se ejecutó el sistema ÄKTA con el Software Unicorn versión 3.21. Se aplicó la mezcla de incubación en tampón A (MOPS 20 mM, pH 8,0) a una velocidad de flujo de 0,6 ml/min. a una columna que contenía 2 ml de Q-Sepharose Fast Flow (Amersham, n.º de código 17-0510-01, n.º de lote 254665), columna (Amersham Biosciences C 10/10) equilibrada con 6 VC de tampón A a una velocidad de flujo de 1 ml/min. Se lavó la columna con 6 VC de tampón A a una velocidad de flujo de 0,8 ml/min. y se realizó la elución usando 4 VC de tampón B (NaCl 0,5 M en fosfato de Na 20 mM, pH 6,5) a una velocidad de flujo de 0,6 ml/min. Se regeneró la columna usando 4 VC de tampón C (NaCl 1,5 M en fosfato de Na 20 mM, pH 6,5) a una velocidad de flujo de 0,6 ml/min. y se reequilibró con tampón A. Se eluyó la proteína AT III de la columna en un volumen de aproximadamente 4 ml.

Método

Volumen Etapa Tampón Velocidad de flujo

1 VC Equilibrado 100% de tampón A 1,0 ml/min.

Inicio del fraccionamiento 100% de tampón A 1,0 ml/min. 10 ml Carga de la muestra muestra en tampón A 0,6 ml/min. 6 VC Lavado de la muestra no unida 100% de tampón A 0,8 ml/min. 4 VC Elución 100% de tampón B 0,6 ml/min. 4 VC Regeneración (elución 2) 100% de tampón C 0,6 ml/min.

Detención del fraccionamiento 100% de tampón C 0,6 ml/min. 5 VC Reequilibrado 100% de tampón A 1,0 ml/min.

Tampón A: MOPS 20 mM/NaOH pH 8,0; tampón B: fosfato de Na 20 mM, NaCl 0,5 M, pH 6,5; tampón C: fosfato de 5 Na 20 mM, NaCl 1,5 M, pH 6,5. Se detectó la elución de proteína a A280 nm y se recogieron fracciones de 1 ml.

Ejemplo 7.6 Experimentos analíticos:

Ejemplo 7.6(a) Liberación de N-glicanos de muestras de AT III no modificada, oxidada con peryodato y modificada 10 con HAS se realizó con recombinante

Se redujeron 300-600 !g de muestras de AT III en presencia de ditioeritreitol 5 mM durante 10 min. a 90ºC a pH 8,1 en presencia de SDS al 0,6%, después de eso se añadió NP 40 hasta una concentración final del 0,6%. A 0,30,6 mg de AT III nativa, oxidada con peryodato o modificada con HAS en tampón fosfato de Na 50 mM, pH 7,2 se le 15 añadieron 40 !l de polipéptido N-glicosidasa recombinante (Roche, Penzberg, Alemania; 250 unidades/250 !l del lote: 101610420). Se incubó la mezcla de reacción a 37ºC durante 12-18 horas y se comprobó la liberación de oligosacáridos unidos de manera N-glicosídica mediante análisis de SDS-PAGE de 5-10 !g de proteína en condiciones reductoras y tinción posterior de las bandas de proteínas con azul de Coomassie (Carl Roth GmbH Karlsruhe, Alemania) y detección del desplazamiento específico de la banda de proteína AT III a la posición de

20 migración de la forma de proteína des-N-glicosilada.

Ejemplo 7.6(b)

Se separaron los N-glicanos liberados del polipéptido mediante la adición de 3 volúmenes de etanol al 100% a -20ºC

25 y se realizó una incubación a -20ºC durante al menos 2 horas. Se separó la proteína precipitada mediante centrifugación a 13.000 rpm durante 10 minutos a 4ºC. Entonces se sometió el sedimento a dos lavados adicionales con 500 !l de etanol al 70% enfriado con hielo. Se secaron los oligosacáridos en los sobrenadantes reunidos en una centrífuga de vacío (concentrador Speed Vac, Savant Instruments Inc., EE.UU.). Se desalaron las muestras de glicano usando cartuchos Hypercarb (100 ó 200 mg) tal como sigue: antes de su uso, se lavaron los cartuchos tres

30 veces con 500 !l de acetonitrilo al 80% (v/v) en TFA al 0,1% (v/v) seguido por tres lavados con 500 !l de agua. Se diluyeron las muestras con agua hasta un volumen final de al menos 300 !l antes de cargarse sobre los cartuchos. Se lavaron rigurosamente con agua. Se eluyeron los oligosacáridos con 1,2 ml de acetonitrilo al 25% que contenía TFA al 0,1% (v/v). Se neutralizaron los oligosacáridos eluidos con NH4OH 2 M y se secaron en un concentrador Speed Vac. Se almacenaron a -20ºC en H2O.

35 Ejemplo 7.6(c) Hidrólisis ácida suave

Se realizó una hidrólisis ácida suave de oligosacáridos (liberación de ácidos siálicos y derivados de ácido siálico modificados con HAS de N-glicanos) tal como sigue: se mezclaron alícuotas de los oligosacáridos desalados u 40 oligosacáridos modificados con HAS con el mismo volumen de H2SO4 10 mM y se incubaron durante 90 minutos a 80ºC. Tras la neutralización con NaOH 50 mM, se secó la mezcla de glicanos desialilados en un concentrador Speed-Vac y se ajustó a una concentración apropiada para el análisis en HPAEC-PAD (cromatografía de intercambio aniónico a pH alto con detección amperométrica pulsada). Para el análisis de EM MALDI/TOF posterior de oligosacáridos neutros, se desalaron muestras (0,05-1 nmol) usando columnas Hypercarb pequeñas preparadas

45 añadiendo 25-40 !l de carbono grafitizado a 200 !l de puntas de pipeta.

Ejemplo 7.6(d) Mapeo de oligosacáridos mediante HPAEC-PAD (cromatografía de intercambio aniónico a pH alto con detección amperométrica pulsada)

50 Se usó un sistema BioLC, (Dionex, Sunnyvale) que consiste en un inyector automático AS50, un compartimento térmico AS50, un detector electroquímico ED50, una bomba de gradiente GS50, Software Chromeleon Chromatography Management System, junto con una columna de separación CarboPac PA-100 (4 x 250 mm) y una precolumna CarboPac PA-100 (4 x 50 mm). Se usaron dos modos diferentes para el mapeo y para la cuantificación de oligosacáridos.

I) Modo de asialo: Se sometieron oligosacáridos neutros a mapeo mediante HPAEC-PAD usando un gradiente de disolvente A (NaOH 200 mM) y disolvente B (NaOH 200 mM más acetato de Na 600 mM) tal como se representa en la siguiente tabla: Tabla: Gradiente para el mapeo de oligosacáridos neutros

Tiempo [min.]

disolvente A [%] disolvente B [%]

0

100

0

5

100 0

35

80 20

45

70 30

47

0 100

52

0 100

53

100 0

60

100 0

Velocidad de flujo: 1 ml/min.

10 Los potenciales de detector para el detector electroquímico eran: Tabla: Potenciales de detector para oligosacáridos

Tiempo [ms]

potencial [mV]

0

50

200

50

400

50

410

750

600

750

610

-150

1000

-150

15 II) Modo de oligos: Se sometieron oligosacáridos nativos a mapeo mediante HPAEC-PAD usando un gradiente de disolvente C (NaOH 100 mM) y disolvente D (NaOH 100 mM más acetato de Na 600 mM) tal como se representa en la siguiente tabla: 20 Tabla: Mapeo en gradiente de oligosacáridos nativos (sialilados)

Tiempo [min.]

disolvente C [%] disolvente D [%]

0

100

0

2

100 0

50

65 35

60

0 100

63

0 100

64

100 0

70

100 0

Velocidad de flujo: 1 ml/min.

Los potenciales de detector para el detector electroquímico eran: Tabla: Potenciales de detector para oligosacáridos

Tiempo [ms]

potencial [mV]

0

50

200

50

400

50

410

750

600

750

610

-150

1000

-150

Se calcularon las áreas de picos específicos (nC x min. x nmol-1) usando factores de respuesta obtenidos con patrones de oligosacáridos definidos (estructuras diantenarias disialiladas, triantenarias trisialiladas y tetrantenarias tetrasialiladas con y sin repeticiones de N-acetil-lactosamina (Nimtz et al., 1993, Schroeter et al., 1999, Grabenhorst et al., 1999).

Resultados

La modificación con HAS de AT III dio como resultado un desplazamiento de masa molecular significativo en SDS-PAGE que indicaba la unión covalente de HAS a la proteína (véase la figura 14a.)

La cromatografía de intercambio iónico de la AT III sometida a modificación con HAS proporcionó una fracción de AT III (> 85% de recuperación basándose en la comparación con AT IIII no tratada).

La des-N-glicosilación de la AT III no tratada, la AT IIII tratada con peryodato y la AT-III modificada con HAS obtenida tras el intercambio aniónico en Q-Sepharose dio como resultado un desplazamiento de peso molecular comparable en SDS-PAGE tal como se representa en la figura 14B.

Se aislaron los N-glicanos liberados de las muestras de AT III mediante adsorción a y elución de cartuchos Hypercarb y se sometieron a análisis mediante HPAEC-PAD. Los N-glicanos nativos de AT III modificada con HAS revelaron la presencia de todos los picos de oligosacáridos neutros detectados en muestras control (véase la traza 1 en la figura 15). Tras el tratamiento con ácido suave, todas las tres preparaciones de N-glicanos mostraron un patrón muy similar de los oligosacáridos neutros indicando la naturaleza lábil al ácido de la modificación con HAS que es compatible con la modificación con HAS en los derivados de ácido siálico de los oligosacáridos (véase la figura 16). Se confirmó la comparabilidad de las estructuras desialiladas mediante análisis de MALDI/TOF (datos no mostrados).

Ejemplo 8 Caracterización adicional de conjugados de GM-CSF

Ejemplo 8.1 Descripción de GM-CSF

Se preparó GM-CSF recombinante humano tras la expresión a partir de células CHO K1 esencialmente tal como se describe por Forno et al., 2004, (Guillermina Forno, Mariela Bollati Fogolin, Marcos Oggero, Ricardo Kratje, Marina Etcheverrigaray, Harald S. Conradt, Manfred Nimtz (2004) N- and O- linked carbohydrates and glycosylation site occupancy in recombinant human granulocyte-macrophage colony- stimulating factor secreted by a Chinese hamster ovary cell line; Eur J Biochem, 271 (5), 907-919), y tenía las estructuras de hidrato de carbono descritas en ese documento.

También se purificó el GM-CSF recombinante mediante etapas cromatográficas convencionales por ejemplo tal como se describe en: Okamoto, M., Nakai, M., Nakayama, C., Yanagi, H., Matsui, H., Noguchi, H., Namiki, M., Sakai, J., Kadota, K., Fukui, M. & Hara, H. (1991) Purification and characterization of three forms of diferentely glycosylated recombinant human Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor. Archives of Biochemistry and Biophysics 286, 562-568.

Secuencia de aminoácidos de GM-CSF humano usado en este estudio:

1APA RSPSPSTQPW EHVNAIQEAR RLLNLSRDTA AEMNETVEVI SEMFDLQEPT CLQTRLELYK QGLRGSLTKL KGPLTMMASH YKQHCPPTPE TSCATQIITF ESFKENLKDF LLVIPFDCWE PVQE127 (según la referencia Forno et al., citado anteriormente).

Ejemplo 8.2 Oxidación con peryodato de residuos de ácido N-acetilaneuramínico mediante tratamiento con peryodato suave de GM-CSF recombinante

A una disolución de 0,80 mg/ml de GM-CSF en acetato de Na 0,1 M, pH 5,5 mantenida a 0ºC se le añadió una disolución enfriada con hielo de meta-peryodato de sodio 10 mM dando como resultado una concentración final de meta-peryodato de sodio 1 mM. Se incubó la mezcla a 0ºC durante 1 hora en un baño de hielo en la oscuridad y se terminó la reacción mediante la adición de 20 !l de glicerol y se incubó durante 5 minutos adicionales.

Ejemplo 8.3 Intercambio de tampón de GM-CSF oxidado con peryodato para su posterior modificación con HAS

Se realizó el intercambio de tampón usando un concentrador Vivaspin 6 de 5 ml (Vivaspin AG, Hannover, Alemania) con una membrana de polietersulfona (PES). Se lavó la unidad concentradora mediante la adición de 5 ml de tampón acetato de Na 0,1 M, pH 5,5 y centrifugación de la unidad concentradora a 4000 rpm a 6ºC en un instrumento Megafuge 1.0R (Kendro Laboratory Equipment, Osterode, Alemania). Posteriormente, se añadieron 15 ml de la disolución de GM-CSF oxidado con peryodato a la unidad concentradora y se centrifugó a 4000 rpm durante 25 min. hasta que se logró una concentración de 5 veces. Se añadieron 4 ml de tampón acetato de Na 0,1 M, pH 5,5 al concentrado que se centrifugó tal como se describió anteriormente. Se repitió el ciclo de centrifugación 3 veces, se separó el concentrado final y se transfirió a un vial de plástico de 2,0 ml, tras lavar la unidad concentradora 2 veces con 150 !l cada vez de tampón acetato de Na pH 5,5; se ajustó el volumen de la proteína con tampón acetato de Na pH 5,5 a

Ejemplo 8.4 Síntesis de conjugados de HAS y GM-CSF

La síntesis fue tal como se describió en el ejemplo 5.4 anterior.

Ejemplo 8.5 Purificación de GM-CSF tras la modificación con HAS

Separación de GM-CSF modificado con HAS de los derivados de HES activados en exceso a partir de incubaciones de la proteína oxidada con peryodato con hidroxilamino-HES10/0.7.

Resumen: Se realizaron ejecuciones a temperatura ambiente usando un equipo ÄKTA explorer 10 y una velocidad de flujo de 1,25 ml/min. Se aplicaron alícuotas de las mezclas de incubación con 400 !g de IFN-1 sobre una columna de 250 mm x 10 mm de fase C18 equilibrada con 1,25 VC del 11% de eluyente B (TFA al 0,1%, acetonitrilo al 90%) y el 89% de eluyente A (TFA al 0,1%). Entonces se inyectaron las muestras (aprox. 1,25 ml) y se lavó el bucle de muestra con 11 ml del 11% de eluyente B. Tras lavar la columna con 0,2 VC del 11% de eluyente B, se aplicó un gradiente lineal del 11% al 90% de eluyente B a lo largo de 2 VC. Se continuó la elución de la columna usando 0,8 VC del 90% de eluyente B, y finalmente se reequilibró la columna con 1,0 VC del 11% de eluyente B.

La proteína GM-CSF eluyó en un volumen de 7,5 ml a una concentración del % de eluyente B. La recuperación de la proteína era del 60% (HES GM-CSF) basándose en una preparación de GM-CSF patrón ejecutada en la columna usando el mismo gradiente.

Materiales y métodos para el ejemplo 8.5

Equipo y materiales Equipo:

ÄKTA explorer 10 (Amersham P harmacia Biotech), con: Bomba P-903

Mezclador M-925, con una cámara de 0,6 ml

Monitor UV-900, con una célula de flujo de 10 mm Monitor pH/C-900 Colector de fracciones Frac-900

Bucle de muestra de 2 ml

Software Unicorn versión 3.21

Columna: lote 4020854

250 mm x 10 mm, Macherey-Nagel 250-1/2”-10 Nucleosil 7 C18, n.º de cat. 715002, n.º de

Volumen de la columna:

20 ml

Velocidad de flujo: Disolvente A Disolvente B

1,25 ml/min. TFA al 0,1% en HPLC-agua Acetonitrilo al 90%; TFA al 0,1% en agua de calidad para HPLC

Método para la ejecución de RP-HPLC del ejemplo 8.5. Volumen Etapa Disolvente A Disolvente B

0,25 VC Equilibrado 89% 11% 11 ml Inyección de la muestra 89% 11%

Fraccionamiento 89% 11% 0,20 VC Lavado de la muestra no unida 89% 11% 2,00 VC Gradiente lineal 89-10% 11-90% 0,80 VC Isocrático 10% 90%

Fraccionamiento final 10% 90% 1,00 VC Reequilibrado 89% 11%

Detección:

280 nm

221 nm

206 nm

Conductividad

Volumen de fracción:

1,25 ml/fracción

Resultados del ejemplo 8.5

La separación mediante RP-HPLC de GM-CSF (ejemplo 8,5) del derivado de HAS en exceso (10 Kda) proporcionó las fracciones 26-32 que contenían todo el GM-CSF modificado con HAS que eluye de la columna. El patrón de SDS-PAGE de la proteína tras la modificación HAS mostró una banda difusa ancha en la región de masa molecular entre 35-90 Kda, mientras que el GM-CSF no modificado mostró el patrón de las formas no glicosilada, mono-Nglicosilada y di-N-glicosilada (figura 17, véase la referencia Forno et al., 2004).

Ejemplo 8.6 Experimentos analíticos

a) Liberación de oligosacáridos unidos a N con polipéptido N-glicosidasa recombinante

A 200 !g-1 mg de GM-CSF nativo, oxidado con peryodato o modificado con HAS en tampón fosfato de Na 50 mM, pH 7,2 se le añadieron 25 !l de polipéptido N-glicosidasa recombinante (Roche, Penzberg, Alemania; 250 unidades/250 !l del lote: 101610420). Se incubó la mezcla de reacción a 37ºC durante 12-18 horas y se comprobó la liberación de oligosacáridos unidos de manera N-glicosídica mediante análisis de SDS-PAGE de 510 !g de proteína en condiciones reductoras y tinción posterior de las bandas de proteína con azul de Coomassie (Carl Roth GmbH Karlsruhe, Alemania) y detección del desplazamiento de la banda de proteína de GM-CSF a la posición de migración de las formas de proteína des-N-glicosiladas (véase la figura 18).

b) Aislamiento y desalación de N-glicanos liberados enzimáticamente y N-glicanos modificados con HAS

Se separaron los N-glicanos liberados del polipéptido mediante la adición de 3 volúmenes de etanol al 100% frío e incubación a -20ºC durante al menos 2 horas. Se separó la proteína precipitada mediante centrifugación a

13.000 rpm durante 10 minutos a 4ºC. Entonces se sometió el sedimento a dos lavados adicionales con 500 !l de etanol al 70% enfriado con hielo. Se secaron los oligosacáridos en los sobrenadantes reunidos en una centrífuga de vacío (concentrador Speed Vac, Savant Instruments Inc., EE.UU.). Se desalaron las muestras de glicanos usando cartuchos Hypercarb (100 ó 200 mg) tal como sigue: antes de su uso, se lavaron los cartuchos tres veces con 500 !l de acetonitrilo al 80% (v/v) en TFA al 0,1% (v/v) seguido por tres lavados con 500 !l de agua. Se diluyeron las muestras con agua hasta un volumen final de al menos 300 !l antes de cargarse sobre los cartuchos. Se lavaron rigurosamente con 83 volúmenes del cartucho de agua). Se eluyeron los oligosacáridos con 1,2 ml de acetonitrilo al 25% que contenía TFA al 0,1% (v/v). Se neutralizaron los oligosacáridos eluidos con NH4OH 2 M y se secaron en un concentrador Speed Vac. Se almacenaron a -20ºC en H2O hasta su uso adicional.

c) Hidrólisis ácida suave de oligosacáridos (eliminación de ácidos siálicos y derivados de ácido siálico modificados con HAS de oligosacáridos)

Se mezclaron alícuotas de los oligosacáridos desalados con el mismo volumen de H2SO4 10 mM y se incubaron durante 90 minutos a 80ºC. Tras la neutralización con NaOH 50 mM, se secaron los glicanos desialilados en un instrumento Speed-Vac y se ajustaron a una concentración apropiada para el análisis en HPAEC-PAD (cromatografía de intercambio aniónico a pH alto con detección amperométrica pulsada). Para el análisis de MALDI/TOF-EM, se desalaron N-glicanos neutros usando puntas de pipeta que contenían 20-30 !l de material Hypercarb para adsorción, lavado y elución con el 25% de acetonitrilo en trifluoro ácido acético al 0,1% en H2O.

d) mapeo de oligosacáridos mediante HPAEC-PAD (cromatografía de intercambio aniónico a pH alto con detección amperométrica pulsada)

Se llevó a cabo el mapeo y la cuantificación de oligosacáridos esencialmente tal como se describió en el ejemplo 7.6.d).

Resultados

Se usó el material purificado mediante RP-HPLC del ejemplo 8.5 para demostrar la modificación de la proteína con derivados de HAS en su cadena de hidrato de carbono por medio de ácidos siálicos oxidados. El análisis de la composición de monosacáridos mediante análisis cromatográfico de gases de sus derivados trimetilsialilados reveló la presencia de glucosa y los derivados de glucosa mono y dihidroxietilados así como manosa, galactosa y Nacetilglucosamina y pequeñas cantidades de N-acetilgalactosamina.

El análisis mediante HPAEC-PAD de los oligosacáridos nativos liberados del GM-CSF modificado con HAS reveló un pico correspondiente a la modificación con HAS de los oligosacáridos de tipo complejo (véase la figura 19).

Tras el tratamiento con ácido suave, se detectaron los N-glicanos neutros de GM-CSF en la muestra de la proteína modificada con HAS y también el derivado de HAS modificado que eluye a los 47-49 minutos.

Ejemplo de referencia 9 Síntesis de conjugados de ATIII

Ejemplo 9.1 Síntesis de derivados de hidroxilamino-HES

Ejemplo 9.1(a) Síntesis de hidroxilaminoHES10/0.4

Se disolvieron 0,8 g de HES10/0.4 (PM = 10000 D, DS = 0,4, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, A) en 8 ml de tampón acetato de sodio 0,1 M, pH 5,5 y se añadieron 8 mmol de O-[2-(2-aminooxi-etoxi)etil]-hidroxilamina. Tras agitar durante 19 h a 22ºC, se añadió la mezcla de reacción a 40 ml de 2-propanol a -20ºC. Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se redisolvió en 50 ml de agua, se dializó durante 45 h frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El rendimiento de producto aislado era del 73%. El peso molecular del HES10/0.4 cuando se midió con LALLS-GPC era de 8500 D y el DS era de 0,41.

Ejemplo 9.1(b) Síntesis de hidroxilaminoHES10/0.7

Se disolvieron 1,06 g de HES10/0.7 (PM = 10000 D, DS = 0,7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, A) en 10 ml de tampón acetato de sodio 0,1 M, pH 5,5 y se añadieron 10,9 mmol de O-[2-(2-aminooxietoxi)-etil]-hidroxilamina. Tras agitar durante 19 h a 22ºC, se añadió la mezcla de reacción a 40 ml de 2-propanol a -20ºC. Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se redisolvió en 50 ml de agua, se dializó durante 45 h frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El rendimiento de producto aislado era del 60%. El peso molecular del HES10/0.7 cuando se midió con LALLS-GPC era de 10500 D y el DS era de 0,76.

Ejemplo 9.1(c) Síntesis de hidroacilaminoHES30/0.4

Se disolvieron 2 g de HES30/0.4 (PM = 30000 D, DS = 0,4, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, A) en 18 ml de tampón acetato de sodio 0,1 M, pH 5,5 y se añadieron 6,67 mmol de O-[2-(2-aminooxi-etoxi)-etil]hidroxilamina. Tras agitar durante 15,5 h a 22ºC, se añadió la mezcla de reacción a 80 ml de 2-propanol a -20ºC. Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se redisolvió en 50 ml de agua, se dializó durante 45 h frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El rendimiento de producto aislado era del 83%. El peso molecular del HES30/0.4 cuando se midió con LALLS-GPC era de 33000 D y el DS era de 0,41.

Ejemplo 9.1(d) Síntesis de hidroxilaminoHES30/0.7

Se disolvieron 2 g de HES30/0.7 (PM = 30000 D, DS = 0,7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, A) en 18 ml de tampón acetato de sodio 0,1 M, pH 5,5 y se añadieron 6,67 mmol de O-[2-(2-aminooxi-etoxi)-etil]hidroxilamina. Tras agitar durante 15 h a 22ºC, se añadió la mezcla de reacción a 80 ml de 2-propanol a -20ºC. Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se redisolvió en 50 ml de agua, se dializó durante 45 h frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El rendimiento de producto aislado era del 86%. El peso molecular del HES30/0.7 cuando se midió con LALLS-GPC era de 31000 D y el DS era de 0,76.

Ejemplo 9.1(e) Síntesis de hidroxilaminoHES50/0.4

Se disolvieron 2 g de HES50/0.4 (PM = 50000 D, DS = 0,4, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, A) en 20 ml de tampón acetato de sodio 0,1 M, pH 5,5 y se añadieron 4 mmol de O-[2-(2-aminooxi-etoxi)-etil]hidroxilamina. Tras agitar durante 19,5 h a 22ºC, se añadió la mezcla de reacción a 80 ml de 2-propanol a -20ºC. Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se redisolvió en 50 ml de agua, se dializó durante 45 h frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El rendimiento de producto aislado era del 94%. El peso molecular del HES50/0.4 cuando se midió con LALLS-GPC era de 56000 D y el DS era de 0,41.

Ejemplo 9.1(f) Síntesis de hidroxilaminoHES50/0.7

Se disolvieron 2,5 g de HES50/0.7 (PM = 50000 D, DS = 0,7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, A) en 25 ml de tampón acetato de sodio 0,1 M, pH 5,5 y se añadieron 5 mmol de O-[2-(2-aminooxi-etoxi)etil]-hidroxilamina. Tras agitar durante 19,5 h a 22ºC, se añadió la mezcla de reacción a 80 ml de 2-propanol a -20ºC. Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se redisolvió en 50 ml de agua, se dializó durante 45 h frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El rendimiento de producto aislado era del 85%. El peso molecular del HES50/0.7 cuando se midió con LALLS-GPC era de 47000 D y el DS era de 0,76.

Ejemplo 9.1(g) Síntesis de hidroxilaminoHES10/0.7

Se disolvieron 2 g de HES10/0.7 (PM = 10000 D, DS = 0,7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, A) en 18 ml de tampón acetato de sodio 0,1 M, pH 5,2 y se añadieron 20 mmol de O-[2-(2-aminooxi-etoxi)-etil]hidroxilamina. Tras agitar durante 19 h a 22ºC, se añadió la mezcla de reacción a 100 ml de una mezcla 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v). Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se redisolvió en 50 ml de agua, se dializó durante 21 h frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. No se determinó el rendimiento de producto aislado. El peso molecular del HES10/0.7 cuando se midió con LALLS-GPC era de 10500 D y el DS era de 0,76.

Ejemplo 9.2 Síntesis de derivados de aldehído-HES

Ejemplo 9.2(a) Síntesis de aminoHES10/0.7

Se disolvieron 6,02 g de oxo-HES10/0.7 (PM = 10000 D, DS = 0,7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, A, preparado según el documento DE 196 28 705 A1) bajo nitrógeno en 32 ml de dimetilsulfóxido seco (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A) y se añadieron 6,03 ml de 1,4-diaminobutano. Tras agitar a 40ºC durante 17 h, se añadió la mezcla de reacción a 150 ml de una mezcla 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v). Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se lavó con 40 ml de una mezcla 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v) y se recogió mediante centrifugación. Se disolvió el producto bruto en 80 ml de agua, se dializó durante 4 d frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El rendimiento de producto aislado era del 52%. El peso molecular del HES10/0.7 cuando se midió con LALLS-GPC era de 15000 D y el DS era de 0,76.

Ejemplo 9.2(b) Síntesis de aldehídoHES10/0.7

Se disolvieron 150 mg de ácido 4-formilbenzoico y 230 mg de 1-hidroxi-1H-benzotriazol (ambos de Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A) en 10 ml de N,N-dimetilformamida (calidad para síntesis peptídica, Biosolve, Valkenswaard, PB) y se añadieron 204 !l de N,N’-diisopropilcarbodiimida (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A). Tras la incubación a 21ºC durante 30 min., se añadió 1 g de aminoHES10/0.7 (sintetizado tal como se describió en 9.2 (a)). Tras agitar durante 19 h a 22ºC, se añadió la mezcla de reacción a 84 ml de una mezcla 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v). Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se redisolvió en 50 ml de agua, se dializó durante 2 d frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El rendimiento de producto aislado era del 83%.

Ejemplo 9.2(c) Síntesis de aminoHES50/0.7

Se disolvieron 6,09 g de oxo-HES50/0.7 (PM = 50000 D, DS = 0,7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, A preparado según el documento DE 198 26 705 A1 con adaptación de las razones molares de los componentes) bajo nitrógeno en 32 ml de dimetilsulfóxido seco (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A) y se añadieron 1,22 ml de 1,4-diaminobutano. Tras agitar a 40ºC durante 17 h se añadió la mezcla de reacción a 150 ml de una mezcla 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v). Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se lavó con 40 ml de una mezcla 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v) y se recogió mediante centrifugación. Se disolvió el producto bruto en 80 ml de agua, se dializó durante 4 d frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El rendimiento de producto aislado era del 67%. El peso molecular del HES50/0.7 cuando se midió con LALLS-GPC era de 57000 D y el DS era de 0,76.

Ejemplo 9.2(d) Síntesis de aldehídoHES50/0.7

Se disolvieron 124 mg de ácido 4-formilbenzoico y 174 mg de 1-hidroxi-1H-benzotriazol (ambos de Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A) en 38 ml de N,N-dimetilformamida (calidad para síntesis peptídica, Biosolve, Valkenswaard, PB) y se añadieron 155 !l de N,N’-diisopropilcarbodiimida (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A). Tras la incubación a 21ºC durante 30 min., se añadieron 3,8 g de aminoHES50/0.7 (sintetizado tal como se describió en 9.2 (c)). Tras agitar durante 19 h a 22ºC, se añadió la mezcla de reacción a 160 ml de una mezcla 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v). Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se redisolvió en 20 ml de N,N-dimetilformamida y se precipitó con 80 ml de una mezcla 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v) tal como se describió anteriormente. Tras la centrifugación, se disolvió el precipitado en 50 ml de agua, se dializó durante 2 d frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El rendimiento de producto aislado era del 77%.

Ejemplo 9.3 Síntesis de los conjugados de ATIII mediante la estrategia de glicanos

Ejemplo 9.3(a) Reacción de ATIII oxidada con productos de reacción de los ejemplos 9.1(a) – 9.1(g)

A 685 !l de una disolución de ATIII oxidada en tampón acetato de sodio 0,1 M, pH 5,5 (GlycoThera, B52 perj-ox STM LJ2-366, 4,375 mg/ml, véase el ejemplo 3.2.), se le añadieron 814 !l de tampón acetato de sodio 0,1 M, pH 5,5 y 1,5 ml de una disolución del derivado de HES en tampón acetato de sodio 0,1 M, pH 5,5 y se incubó la disolución durante 26 h a 22ºC.

Se emplearon las siguientes concentraciones de HES finales:

0,46 mg/ml para derivados de HES preparados según el ejemplo 9.1(a) y 9.1(b).

1,38 mg/ml para derivados de HES preparados según el ejemplo 9.1(c) y 9.1(d).

9,1 mg/ml para el derivado de HES preparado según el ejemplo 9.1(e).

10,5 mg/ml para el derivado de HES preparado según el ejemplo 9.1(f).

17,25 mg/ml para el derivado de HES preparado según el ejemplo 9.1(g).

HES50/0.7 9 mg/ml (Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, A) como control de reacción. El peso molecular del HES50/0.7 cuando se midió con LALLS-GPC era de 47000 D y el DS era de 0,76.

Se analizó la mezcla de reacción respectiva mediante electroforesis en gel (véase la figura 20).

Ejemplo 9.4 Síntesis de los conjugados de ATIII mediante aminación reductora

Ejemplo 9.4(a) Intercambio de tampón:

Se disolvió ATIII (Atryn, GTC Biotherapeutics, Framingham, MA, EE.UU.) con 10 ml de agua para producir una disolución de ATIII 25 mg/ml en citrato de sodio 5 mM, glicina 67 mM y cloruro de sodio 68 mM, pH 7,0. Se diluyó 1 ml de esta disolución con tampón acetato de sodio 0,1 M frío, pH 5,0, se concentró mediante diafiltración a 4ºC hasta 4 ml con un concentrador Vivaspin de 20 ml (VS2001, MWCO de 10 KD, membrana de PES, Vivascience AG, Hannover, A) y volvió a diluirse hasta 20 ml con tampón. Se repitió esta diafiltración dos veces. La concentración final en la última etapa de diafiltración era de 3 mg/ml.

Ejemplo 9.4(b) Reacción de ATIII con productos de reacción del ejemplo 9.2(b) y 9.2(d):

A 1 ml de una disolución de ATIII tras el intercambio de tampón a tampón acetato de sodio 0,1 M, pH 5,0, se le añadieron 1 ml de una disolución del derivado de HES en tampón acetato de sodio 0,1 M, pH 5,0 y 1 ml de una disolución de cianoborohidruro de sodio 60 mM en el mismo tampón y se incubó la disolución durante 15,5 h a 4ºC. Se enfriaron todas las disoluciones hasta 0ºC antes de mezclar. Se emplearon las siguientes concentraciones de HES finales:

13 mg/ml para el derivado de HES preparado según el ejemplo 9.2(b).

64,7 mg/ml para el derivado de HES preparado según el ejemplo 9.2(d).

HES50/0.7 64,7 mg/ml (Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, A) como control de reacción.

Se analizó la mezcla de reacción respectiva mediante electroforesis en gel.

Ejemplo de referencia 10 Síntesis de conjugados de IFN-alfa por medio de ácidos aldónicos activados

El IFN-alfa usado era un interferón alfa-2b humano recombinante fabricado mediante tecnología de ADN 5 recombinante usando Escherichia coli (E. coli). Está compuesto por 165 aminoácidos y presenta una secuencia de aminoácidos que es idéntica al interferón alfa 2b humano natural (hIFN-alfa 2b).

Ejemplo 10.1 Síntesis de HES oxidado (oxo-HES)

10 Se preparó HES oxidado a partir de HES (PM = 57 kD, DS = 0,76, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, A) según el documento DE 196 28 705 A1.

Ejemplo 10.2 Síntesis de oxo-HES activado con NHS

15 Se secaron 4,81 g de ox-HES 50/0.7 tal como se preparó en el ejemplo 10.1 en un horno a 80ºC durante la noche. Se disuelve el ox-HES a 80ºC en DMF seca y se enfría hasta temperatura ambiente.

A partir de una disolución de 102,1 mg de carbonato de N,N’-disuccinimidilo (Aldrich) en 1 ml de DMF seca, se hacen gotear 400 ml en el recipiente de reacción agitado y se agita durante 2 horas a temperatura ambiente. Se

20 añade gota a gota la mezcla de reacción a 50 ml de acetona seca y se recoge el producto precipitado mediante centrifugación y se lava con 4 X 50 ml de acetona seca, en la que se centrifuga el producto resuspendido. Se elimina el disolvente residual a temperatura ambiente a vacío.

Ejemplo 10.3 Síntesis de un conjugado de IFN-alfa por medio de ácido aldónico activado (AAA)

25 Se concentró la proteína usando módulos de filtración de Amicon Ultra 4 (punto de corte de peso molecular (MWCO) de 5 kDa) en una centrífuga enfriada (4ºC) hasta una concentración final de 10 mg/ml. Se intercambió el tampón durante este procedimiento a tampón fosfato isotónico, pH 8.

30 Para el acoplamiento, se incubaron 9 mg de la disolución de proteína con la cantidad molar de 20 veces del ox-HES activado con NHS del ejemplo 10.1 durante dos horas a temperatura ambiente. Se purificó la mezcla de reacción de NHS mediante ultrafiltración usando módulos de filtración Amicon Ultra 4 (MWCO de 5 kDa) en una centrífuga enfriada (4ºC). Se intercambió el tampón durante este procedimiento a fosfato de sodio 25 mM, cloruro de sodio 30 mM, EDTA 0,3 mM, a pH 7,5.

35 El rendimiento de reacción del experimento fue de > 90% tal como se determina mediante SEC (véase la figura 22).

Ejemplo 10.4 Purificación de IFN-alfa-HES

40 Se realizó la purificación de la muestra a temperatura ambiente usando un equipo ÄKTA explorer 10. Se equilibró la columna que contenía 5 ml de Q-Sepharose Fast Flow con 5 VC de tampón A1 (Tris/HCl 20 mM, pH 8,0). Se diluyeron las muestras 1:16 con tampón A y se aplicaron usando la bomba de muestra a una velocidad de flujo de 6 ml/min. Tras el lavado de la bomba de muestra con 20 ml de tampón A1, se lavó adicionalmente la columna con 15 ml de tampón A1 a una velocidad de flujo de 1,0 ml/min. Se realizó la elución usando un gradiente lineal del 0

45 100% de tampón B1 (NaCl 0,3 M en Tris/HCl 20 mM, pH 8,0) a lo largo de 37,5 min. y una ejecución isocrática con tampón B a lo largo de 12,5 min. a una velocidad de flujo de 0,8 ml/min. Se regeneró la columna usando 15 ml de tampón B2 (NaCl 1,5 M en Tris/HCl 20 mM, pH 8,0) seguido por 5 ml de tampón B a una velocidad de flujo de 0,8 ml/min. Se realizó el reequilibrado para la siguiente ejecución usando 25 ml de tampón A1 y una velocidad de flujo de 1,0 ml/min.

50 Equipo: Äkta explorer 10 (Amersham Bioscience) con:

Bomba P-903 Mezclador M-925 con cámara de 0,6 ml Monitor UV-900 con célula de flujo de 10 mm Monitor pH/C-900 Bomba P-950 (bomba de muestra) Software Unicorn versión 3.21

Columna: Amersham Bioscience C 10/10 Material de la columna: Q-Sepharose Fast Flow, n.º de lote OD 06453 Volumen de la columna: 5 ml Programa: Q Seph 5 ml sin inyección para IFN-a

Eluyente A1: Tris/HCl 20 mM, pH 8,0 (PL0935) Eluyente B1: NaCl 0,3 M en Tris/HCl 20 mM, pH 8,0 (PL0938) Eluyente B2: NaCl 1,5 M en Tris/HCl 20 mM, pH 8,0 (PL0937)

Método

Volumen Etapa Eluyente Velocidad de flujo

25 ml Equilibrado 100% de eluyente A1 1 ml/min. 40 ml Carga de la muestra Sonda en eluyente A1 6 ml/min. 20 ml Lavado de la bomba de muestra 100% de eluyente A1 6 ml/min. 15 ml Lavado de la columna 100% de eluyente A1 1 ml/min. 30 ml Elución (gradiente) del 0 al 100% de eluyente B1 0,8 ml/min. 10 ml Elución (isocrática) 100% de eluyente B1 0,8 ml/min. 15 ml Regeneración 100% de eluyente B2 0,8 ml/min. 5 ml Regeneración 100% de eluyente B1 0,8 ml/min. 25 ml Reequilibrado 100% de eluyente A1 1,0 ml/min.

Detección 280 nm, 260 nm, 220 nm pH Conductividad

Fraccionamiento Fracciones de 1 ml 5 Ejemplo 11 Descripción del ensayo de actividad antiviral de IFN alfa

Tras diluir previamente los artículos de prueba en medio de cultivo celular, se prepararon disoluciones en serie de dos veces. En placas de microtitulación de 96 pocillos, se añadió interferón diluido (en duplicados de cuatro veces 10 por dilución) a células MDBK recién tripsinizadas (40.000 células por pocillo). Se incubaron los ensayos durante 24 horas a 37ºC (volumen total por pocillo: 150 !l (ejemplo 11.1) o 175 !l (ejemplo 11.2)).

Posteriormente, se añadieron 50 !l de disolución madre de VEV diluida a cada pocillo (excepto para los pocillos control positivo) dando como resultado una multiplicidad de infección de 0,1.

15 Se incluyeron los siguientes controles en cada ensayo: 12 pocillos que recibieron virus más medio de cultivo celular en lugar de interferón (control negativo) y 12 pocillos que recibieron medio de cultivo celular en lugar de interferón y virus (control positivo). Se encubaron los ensayos durante 42 horas a 37ºC.

20 Al final del periodo de incubación, se reemplazó el sobrenadante de cultivo celular de cada pocillo por 50 !l de una disolución de MTT (al menos 2 mg/ml en medio de cultivo celular). Se incubaron las células durante tres horas. Se solubilizó el colorante de formazán púrpura formado por las células en proliferación añadiendo 100 !l de disolución de isopropanol/HCl (isopropanol con HCl 40 mM) a cada pocillo. Posteriormente, se midieron los valores de absorbancia de las disoluciones a 570/630 nm en un lector de placas de microtitulación.

25 Se calculó la actividad proliferativa de células MDBK hechas crecer en presencia de interferón y VEV para cada dilución de interferón tal como sigue:

((Absorbancia media de cuatro pocillos tratados con interferón) – (absorbancia media del control negativo)) * 100 (Absorbancia media del control positivo) – (absorbancia media del control negativo)

30 Se determinó la actividad antiviral de interferón-alfa en cuatro ensayos separados para cada uno de los artículos de prueba.

Ejemplo 11.1 Actividad antiviral de Intron® A en relación con un patrón de NIH

35 En todos los experimentos, se usó Intro® A (IFN-alfa 2b, Schering-Plough), calibrado frente al patrón de NIH rhIFNalfa 2a (NIAID, NIH, Bethesda, EE.UU., Gxa01-901-535) como referencia de laboratorio interna. El patrón de NIH tenía una actividad específica de 9.000 UI/ml. La referencia de laboratorio interna Intron® A tenía una actividad específica de 8.487.000 UI/ml en la prueba tal como se describe en el ejemplo 11 (véase la figura 23).

40 Ejemplo 11.2 Actividad antiviral de IFN-alfa-HES en relación con Intron® A

En el sistema de ensayo descrito en el ejemplo 11, se sometió a prueba el conjugado del ejemplo 10.4 en comparación con Intron® A. Se calculó la concentración CPE50 de ambos materiales. IFN-alfa-HES tenía más del 25% de la actividad de Intron® A (véase la figura 24).

Ejemplo 12 Bioactividad in vivo de IFN-alfa-HES (estudio PK en ratones)

Ejemplo 12.1 Influencia del suero de ratón sobre el sistema de ensayo descrito en el ejemplo 11

Se prepararon diluciones de interferón-alfa en medio de cultivo celular (control) y en suero de ratón (dilución 1:40 y dilución 1:80). Se realizó el ensayo tal como se describió en el ejemplo 11.

Se determinó la actividad antiviral de interferón-alfa en dos ensayos separados para el control, para el suero de ratón diluido 1:40 así como para el suero de ratón diluido 1:80. Los resultados indicaron que el suero de ratón a una dilución 1:40 y 1:80 no afecta al bioensayo para la actividad antiviral de interferón-alfa.

Ejemplo 12.2 Estudio in vivo en ratones

Se sometió a ensayo la actividad antiviral de suero reunido en el ensayo antiviral. Se recogió suero de dos ratones (ratones BALB/c hembra, de 8 semanas de edad) a cada tiempo, que se sacrificaron a las 2 h, 4 h, 12 h y 24 h tras la inyección i.v. de 30 !g/kg (basándose en el contenido en proteína) de IFN-alfa o el conjugado.

Se descongelaron las muestras de suero y se homogeneizaron meticulosamente mediante agitación con vórtex. Se prepararon diluciones en serie de dos veces en medio de cultivo celular. Se descongeló un vial de Intron® A y se homogeneizó meticulosamente mediante agitación con vórtex. Se prepararon diluciones en serie de dos veces en medio de cultivo celular.

Se determinaron las diluciones de CE50 en el ensayo de CPE a partir de curvas de respuesta a la dosis de una serie de dilución 1:2 tal como se describió en el ejemplo 11.

Se determinó la semivida de los materiales en comparación con material de partida no modificado y Pegasys. Se calculó la semivida a partir de un gráfico semilogarítmico de la dilución CE50 frente al tiempo tras la inyección (véase la figura 25).

Se detectó la actividad antiviral para IFN-alfa-HES hasta 24 h. Se observó un aumento de la semivida mediante la derivatización de IFN-alfa con HES (semivida de aproximadamente 5 h). Para IFN-alfa no modificado, la actividad antiviral del suero era demasiado baja como para calcular una semivida sérica.

Ejemplo de referencia 13 Conjugados de A1AT (a1AT, alfa1aT) sintetizados mediante aminación reductora

Ejemplo 13.1 Síntesis de amino-HES (A) a partir de HES oxidado

Se calentaron 6,09 g de oxo-HES (PM = 57.000 D, DS = 0,76, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, A, preparado según el documento DE 196 28 705 A1) durante la noche a 80ºC a vacío, se disolvieron bajo nitrógeno en 32 ml de dimetilsulfóxido seco (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A) y se añadieron 1,22 ml de 1,4-diaminobutano (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A). Tras agitar a 40ºC durante 17 h se añadió la mezcla de reacción a 150 ml de una mezcla 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v). Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se lavó con 40 ml de una mezcla 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v) y se recogió mediante centrifugación. Se disolvió el producto bruto en 80 ml de agua, se dializó durante 4 d frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El rendimiento de producto aislado era del 82%.

Ejemplo 13.2 Síntesis de aldehído-HES (A) a partir de amino-HES (A) del ejemplo 13.1

Se disolvieron 125 mg de ácido 4-formilbenzoico y 174 mg de 1-hidroxi-1H-benzotriazol (ambos de Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A) en 38 ml de N,N-dimetilformamida (calidad para síntesis peptídica, Biosolve, Valkenswaard, PB) y se añadieron 155 !l de N,N’-diisopropilcarbodiimida (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A). Tras la incubación a 21ºC durante 30 min., se añadieron 3,8 g de amino-HES (A) (preparado tal como se describió en el ejemplo 13.1). Tras agitar durante 19 h a 22ºC, se añadió la mezcla de reacción a 160 ml de una mezcla 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v). Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se redisolvió en 20 ml de N,N-dimetilformamida y se precipitó con 80 ml de una mezcla 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v) tal como se describió en el ejemplo 13.1. Tras la centrifugación, se disolvió el precipitado en 50 ml de agua, se dializó durante 2 d frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El rendimiento de producto aislado era del 77%.

Ejemplo 13.3 Síntesis de amino-HES (B) a partir de HES oxidado

Se calentaron 10 g de oxo-HES (PM = 57 kD, DS = 0,76, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, A, preparado según el documento DE 196 28 705 A1) durante la noche a 80ºC a vacío, se disolvieron bajo nitrógeno en 52 ml de dimetilsulfóxido seco (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A) y se añadieron 2 ml de 1,4diaminobutano (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A). Tras agitar a 40ºC durante 17 h se añadió la mezcla de reacción a 350 ml de 2-propanol enfriado con hielo (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, A). Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se lavó con 80 ml de 2-propanol enfriado con hielo y se recogió mediante centrifugación. Se disolvió el producto bruto en 80 ml de agua, se dializó durante 2 d frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El rendimiento de producto aislado era del 85%.

Ejemplo 13.4 Síntesis de aldehído-HES (B) a partir de amino-HES (B) del ejemplo 13.3

Se disolvieron 153 mg de ácido 4-formilbenzoico y 241 mg de 1-hidroxi-1H-benzotriazol (ambos de Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A) en 51 ml de N,N-dimetilformamida (calidad para síntesis peptídica, Biosolve, Valkenswaard, PB) y se añadieron 170 !l de N,N’-diisopropilcarbodiimida (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A). Tras la incubación a 21ºC durante 30 min., se añadieron 5,1 g de amino-HES (B) (preparado tal como se describió en el ejemplo 13.3). Tras agitar durante 16 h a 22ºC, se añadió la mezcla de reacción a 360 ml de una mezcla 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v). Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se redisolvió en 50 ml de agua y se precipitó con 360 ml de una mezcla 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v) tal como se describió en el ejemplo 13.1. Tras la centrifugación, se disolvió el precipitado en 50 ml de agua, se dializó durante 2 d frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El rendimiento de producto aislado era del 87%.

Ejemplo 13.5 Conjugación de aldehído-HES (A) y (B) con A1AT mediante aminación reductora

Se disolvió una mezcla de 189 mg de aldehído-HES (B) (preparado tal como se describió en el ejemplo 13.4) y 172 mg de aldehído-HES (A) (preparado tal como se describió en el ejemplo 13.2) en 2,88 ml de tampón de reacción (tampón fosfato de sodio 0,1 M, cloruro de sodio 150 mM, pH 7,2). A 20ºC, se añadieron 1,67 ml de una disolución de cianoborohidruro de sodio 60 mM en el mismo tampón seguido por 0,455 ml de una disolución de A1AT (c (A1AT) = 11,0 mg/ml en tampón fosfato de sodio 0,1 M, cloruro de sodio 150 mM, pH 7,2, A1AT = rh A1AT proporcionada por GTC Biotherapeutics Inc., Framingham, MA, n.º de lote 080604A). Se incubó la mezcla a 20ºC. Tras 17 h, se añadieron 6,7 mg adicionales de cianoborohidruro de sodio disuelto en 200 !l del tampón de reacción y se incubó la mezcla durante 24 h adicionales a la misma temperatura. Se analizaron 10 !l de esta disolución tras un tiempo de incubación total de 25 h mediante electroforesis en gel (véase la figura 26).

Ejemplo 13.6 Conjugación de HES con A1AT mediante aminación reductora (control de reacción)

Se disolvieron 362 mg de HES (PM = 42 kD, DS = 0,41, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, A) en 2,88 ml de tampón de reacción (tampón fosfato de sodio 0,1 M, cloruro de sodio 150 mM, pH 7,2). A 20ºC, se añadieron 1,67 ml de una disolución de cianoborohidruro de sodio 60 mM en el mismo tampón seguido por 0,455 ml de una disolución de A1AT (c (A1AT) = 11,0 mg/ml en tampón fosfato de sodio 0,1 M, cloruro de sodio 150 mM, pH 7,2, a1AT= rh a1AT proporcionada por GTC Biotherapeutics Inc., Framingham, MA, n.º de lote 080604A). Se incubó la mezcla a 20ºC. Tras 17 h, se añadieron 6,7 mg adicionales de cianoborohidruro de sodio disuelto en 200 !l del tampón de reacción y se incubó la mezcla durante 24 h adicionales a la misma temperatura. Se analizaron 10 !l de esta disolución tras un tiempo de incubación total de 25 h mediante electroforesis en gel (véase la figura 27).

Ejemplo 13.7 Purificación del conjugado de HES-A1AT mediante cromatógrafo de intercambio iónico (IEC)

Se purificaron conjugados de A1AT mediante cromatografía de intercambio iónico en una columna HiTrap Q HPusando un sistema de cromatografía ÄKTA-Explorer (ambos de Amersham Biosciences). Se realizó la purificación según el aislamiento de A1AT de plasma humano tal como se describe en “Chen, Hammond, Lang y Lebing, Purification of a1Proteinase Inhibitor from Human Plasma Fraction IV-1 by Ion Exchange Chromatography, VoxSanguinis 1998, 74, 232-241”.

Preparación de la muestra: Intercambio de tampón en una columna de desalación HiPrep 26/10 (AmershamBiosciences) en combinación con el sistema de cromatografía ÄKTA-Explorer usando fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 20 mM, pH 8 como eluyente.

Se realizó el intercambio de tampón tras la dilución de la mezcla de reacción bruta (preparación tal como se describe en el ejemplo 13.5, aproximadamente 5 ml) con agua desalada hasta un volumen final de 10 ml usando los Volumen de la muestra: 10 ml Fraccionamiento del eluato: 2,5 ml Equilibrado: 5 volúmenes de columna Longitud de elución: 2 volúmenes de columna

siguientes parámetros:

Columna:

HiPrep 26/10 de desalación

Velocidad de flujo:

10 ml/min.

Eluyente:

fosfato de sodio 20 mM,

cloruro de sodio 20 mM,

pH 8

Se reunieron los primeros 14 ml de eluyente, y se añadió tampón de unión para producir un volumen final de 20 ml. Se purificó esta disolución, que contenía aproximadamente 5 mg de proteína, mediante IEC usando los siguientes parámetros:

5 Columna: HiTrap Q HP de 1 ml Velocidad de flujo: 1 ml/min. Tampón de unión (BB): fosfato de sodio 20 mM,

cloruro de sodio 20 mM, pH 8

Tampón de elución (EB): fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 1 M, pH 8

Volumen de la muestra: 20 ml Fraccionamiento de la fracción 2 ml no retenida Fraccionamiento del eluato: 1 ml Concentración inicial de EB: 0% Equilibrado: 5 volúmenes de columna Lavado de la muestra no unida: 15 ml Concentración objetivo de EB: 15% Longitud de gradiente: 20 ml

Se analizaron las fracciones recogidas tras la cromatografía mediante SDS-Page. Se reunieron las fracciones que contenían conjugado de HES-A1AT (volumen de elución de desde 40 hasta 47 ml que corresponde a las fracciones B1 - C6, véase la figura 27). En algunas de las fracciones reunidas podía detectarse una pequeña cantidad de A1AT 10 sin reaccionar. La concentración inicial de la fracción reunida tras la cromatografía determinada mediante BCA (n.º de cat. de Pierce 23225), usando A1AT (proporcionada por GTC Biotherapeutics Inc., Framingham, MA, n.º de lote 080604A) como patrón de referencia) era de 170 !g/ml. Tras la dilución y el intercambio de tampón a fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 7,2 la concentración de proteína resultante era de 54,5 !g/ml (BCA (Pierce con A1AT de GTC como patrón de referencia)). Se usó esta disolución final para determinar la eficacia

15 inhibidora del conjugado.

Ejemplo 13.8 Determinación de la capacidad de inhibición in vitro del conjugado de HES-A1AT para elastasa de granulocitos humanos

20 Se realizaron pruebas de las actividades inhibidoras de elastasa de los conjugados según Castillo et al., Anal. Biochem. 1979, 99, 53-64 usando un lector de placas UV-VIS de Tecan modelo Sunrise.

Este ensayo se basa en la liberación de p-nitroanilina a partir de N-Met-O-succinil-Ala-Ala-Pro-Val-p-NO2-anilina catalizada por elastasa. Esta hidrólisis puede seguirse por el aumento de la absorbancia a 405 nm. La tasa de 25 hidrólisis inicial está en correlación estrecha con la actividad de la enzima. El ensayo puede llevarse a cabo en ausencia y en presencia de diferentes concentraciones del inhibidor que va a someterse a prueba. La disminución de la actividad enzimática según la actividad inhibidora de las sustancias sometidas a prueba está representada en una disminución de la pendiente en el gráfico de A405 frente al tiempo. La actividad elastasa residual en presencia de una determinada concentración de inhibidor se facilita por la pendiente de la curva inhibida dividida entre la

30 pendiente de la curva no inhibida. Hay una correlación lineal entre la actividad enzimática residual y la concentración de inhibidor. Usando regresión lineal, puede lograrse una línea uniforme lineal y puede calcularse la actividad enzimática residual para una concentración de inhibidor dada. De este modo puede compararse la actividad inhibidora (= 1- actividad enzimática residual) de la misma concentración de diferentes inhibidores (Véase la figura 28).

35 Se usaron los siguientes parámetros:

Concentración de sustrato: 1,5 mM Actividad elastasa: 7,5 mU Longitud de onda: 405 nm Temperatura: 20ºC Intervalo de tiempo: 15 s Ciclos cinéticos: 25 Modo de medición: Centro La disolución de ensayo consistía en 300 !l de tampón (Hepes 0,1 M, NaCl 0,5 M, Triton X-100 al 0,05% (m/v), pH 7,5) que contenía DMSO al 10%, N-Met-O-succinil-Ala-Ala-Pro-Val-p-NO2-anilina 1,5 mM, 7,5 mU de elastasa y cantidades variables de inhibidores.

5 Se adquirió la elastasa de Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg. Se adquirieron todas las otras sustancias de Sigma Aldrich, Taufkirchen.

Se sometió a prueba la actividad inhibidora del conjugado sintetizado tal como se describió en el ejemplo 13.5 en comparación con Prolastin® HS (Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Alemania n.º de lote PR4HA43) como referencia y con A1AT (GTC Biotherapeutics Inc., Framingham, MA, n.º de lote 080604A) como material de partida para la conjugación. Se facilita el gráfico de actividad enzimática residual frente a concentración en la figura 28. La linealidad para todas las curvas era R2 > 0,98. A continuación, se facilitan los valores de CI50 y la inhibición de la elastasa para c (inhibidor) = 1 !g/ml, así como la actividad inhibidora del material de partida y el conjugado en relación con la referencia. Los datos resumidos en la tabla a continuación demuestran claramente que la parte

15 principal de la actividad de A1AT permanecía tras la conjugación con HES.

Tabla del ejemplo 13.8

Inhibidor

Ecuación de la línea uniforme lineal CI50 [!g/ml] Inhibición de elastasa c (inhibidor) = 1 !g/ml [%] Actividad de inhibición en relación con prolastina [%]

Prolastina a1AT Conjugado de HES-A1AT

Y = -0,6754x + 0,9627 Y = -0,5046x + 0,9558 Y = -0,3757x + 0,9627 0,685 0,903 1,232 71,3 54,9 41,3 77,0 57,9

Ejemplo 13.9 Determinación de la semivida in vivo del conjugado de HES-rh alfa1AT en comparación con rh alfa1AT y h alfalAT derivada de plasma

Se utilizaron ratones hembra de 8-10 semanas de edad (BALB/cOlaHsd, Harlan GmbH, Borchen, Alemania) como

organismo de prueba (42 ratones, 14 por muestra). Se detectó el “peso corporal” de cada animal justo antes de la

25 administración de las diferentes disoluciones de muestra. Se inyectaron por vía intravenosa 100 !l de una disolución 50 !g/ml de las muestras resumidas anteriores en un tampón de pH = 7,2 (fosfato de sodio 20 mmol, cloruro de sodio 150 mmol) en la vena de la cola de los ratones.

Muestra 1: rh alfalAT (GTC Biotherapeutics Inc., Framingham, MA, n.º de lote 080604A).

Muestra 2: conjugado de rh alfa1AT-HES tal como se preparó en el ejemplo 13.5.

Muestra 3: h alfalAT derivado de plasma (SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Alemania).

35 A las 1, 2, 4, 10, 24, 31,5 y 48 horas tras la inyección, se sacrificaron dos ratones de cada grupo y se extrajeron muestras de sangre completa (�500 !l) del corazón de los animales. Se preparó suero usando Microvette® 500 Z-Gel (Sarstedt, Nümbrecht, Alemania). Se almacenaron las muestras de suero a -80ºC hasta el comienzo de las mediciones de la concentración de alfalAT.

Se detectaron las concentraciones de alfalAT usando un ELISA de alfalAT disponible comercialmente (Immundiagnostik, Bensheim, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Los resultados obtenidos demuestran un aumento de la semivida plasmática significativo para el conjugado de rh alfalAT-HES en comparación con el material de partida de rh alfalAT no modificada. La semivida medida del

45 conjugado está en el mismo intervalo que la de la h alfalAT derivada de plasma según la siguiente tabla.

Tabla del ejemplo 13.9: Semivida plasmática de las muestras 1-3

N.º de muestra

Semivida plasmática en ratones [h]

1

1,2

2

3,6

3

3,2

Ejemplo de referencia 14 Síntesis de conjugados de HES-IFN-alfa mediante aminación reductora

El IFN-a usado era un interferón alfa-2b humano recombinante fabricado mediante tecnología de ADN recombinante usando Escherichia coli (E. coli). Está compuesto por 165 aminoácidos y presenta una secuencia de aminoácidos que es idéntica al interferón alfa 2b humano natural (hIFN-alfa 2b).

Ejemplo 14.1 Síntesis de oxo-HES

Se preparó HES oxidado en su extremo reductor tal como se describe a continuación en el presente documento (oxo-HES) a partir de HES usando una disolución de yodo alcalina tal como se describe en el documento DE 196 28 705 A1, cuyo contenido respectivo (ejemplo A, columna 9, líneas 6 a 24) se incorpora en el presente documento como referencia.

Ejemplo 14.2 Síntesis de derivados de HES

En un procedimiento de dos etapas, se modificó oxo-HES del ejemplo 14.1 en su extremo reductor con una amina, y se introdujo un grupo aldehído en una segunda reacción. Se usó el aldehído-HES resultante para producir los conjugados de IFN-alfa-HES mediante aminación reductora tal como se describe en el ejemplo 14.3.

Ejemplo 14.2.1 Síntesis de amino-HES a partir de oxo-HES del ejemplo 14.1

Se calentaron 5,12 g de oxo-HES del ejemplo 14.1 (PM = 14,5 kD, DS = 0,41, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, A) durante la noche a 80ºC a vacío y se disolvieron bajo nitrógeno en 25 ml de dimetilsulfóxido seco (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A) y se añadieron 5,13 ml de 1,4-diaminobutano. Tras agitar a 40ºC durante 17 h se añadió la mezcla de reacción a 150 ml de una mezcla 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v). Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se lavó con 40 ml de una mezcla 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v) y se recogió mediante centrifugación. Se disolvió el producto bruto en 80 ml de agua, se dializó durante 4 d frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland, GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El rendimiento de producto aislado era del 67%.

Ejemplo 14.2.2 Síntesis de aldehído-HES a partir de amino-HES del ejemplo 14.2.1

Se disolvieron 105 mg de ácido 4-formilbenzoico y 135 mg de 1-hidroxi-1H-benzotriazol (ambos de Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A) en 7 ml de N,N-dimetilformamida (calidad para síntesis peptídica, Biosolve, Valkenswaard, PB) y se añadieron 135 !l de N,N’-diisopropilcarbodiimida (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A). Tras la incubación a 21ºC durante 30 min., se añadieron 0,7 g de amino-HES (sintetizado tal como se describió en el ejemplo 14.2.1). Tras agitar durante 18 h a 22ºC, se añadió la mezcla de reacción a 42 ml de una mezcla 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v). Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se redisolvió en 5 ml de DMF y se precipitó con 42 ml de etanol/acetona tal como se describió anteriormente. Tras la centrifugación, se disolvió el precipitado recogido con agua, se dializó durante 4 d frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El rendimiento de producto aislado era del 95%.

Ejemplo 14.2.3 Síntesis de amino-HES a partir de oxo-HES del ejemplo 14.1

Se calentaron 6,02 g de oxo-HES del ejemplo 14.1 (PM = 14,7 kD, DS = 0,76, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, A) durante la noche a 80ºC a vacío y se disolvieron bajo nitrógeno en 32 ml de dimetilsulfóxido seco (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A) y se añadieron 6,03 ml de 1,4-diaminobutano. Tras agitar a 40ºC durante 17 h se añadió la mezcla de reacción a 150 ml de una mezcla 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v). Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se lavó con 40 ml de una mezcla 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v) y se recogió mediante centrifugación. Se disolvió el producto bruto en 80 ml de agua, se dializó durante 4 d frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El rendimiento de producto aislado era del 52%.

Ejemplo 14.2.4 Síntesis de aldehído-HES a partir de amino-HES del ejemplo 14.2.3

Se disolvieron 150 mg de ácido 4-formilbenzoico y 230 mg de 1-hidroxi-1H-benzotriazol (ambos de Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A) en 10 ml de N,N-dimetilformamida (calidad para síntesis peptídica, Biosolve, Valkenswaard, PB) y se añadieron 204 !l de N,N’-diisopropilcarbodiimida (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A). Tras la incubación a 21ºC durante 30 min., se añadió 1 g de amino-HES (sintetizado tal como se describió en el ejemplo 14.2.3). Tras agitar durante 19 h a 22ºC, se añadió la mezcla de reacción a 84 ml de 2propanol enfriado con hielo. Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se redisolvió en 50 ml de agua, se dializó durante 2 d frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El rendimiento de producto aislado era del 83%.

Ejemplo 14.2.5 Síntesis de amino-HES a partir de oxo-HES del ejemplo 14.1

Se calentaron 5 g de oxo-HES del ejemplo 14.1 (PM = 28 kD, DS = 0,41, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, A) durante la noche a 80ºC a vacío y entonces se disolvieron bajo nitrógeno en 28 ml de dimetilsulfóxido seco (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A) y se añadieron 1,67 ml de 1,4diaminobutano. Tras agitar a 40ºC durante 17 h se añadió la mezcla de reacción a 175 ml de una mezcla 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v). Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC. Se disolvió el producto bruto en 40 ml de agua, se dializó durante 2 d frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. No se determinó el rendimiento de producto aislado.

Ejemplo 14.2.6 Síntesis de aldehído-HES a partir de amino-HES del ejemplo 14.2.5

Se disolvieron 130 mg de ácido 4-formilbenzoico y 153 mg de 1-hidroxi-1H-benzotriazol (ambos de Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A) en 36 ml de N,N-dimetilformamida (calidad para síntesis peptídica, Biosolve, Valkenswaard, PB) y se añadieron 110 !l de N,N’-diisopropilcarbodiimida (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A). Tras la incubación a 21ºC durante 30 min., se añadieron 2,61 g de amino-HES (sintetizado tal como se describió en el ejemplo 14.2.5). Tras agitar durante 22,5 h a 22ºC, se añadió la mezcla de reacción a 160 ml de una mezcla 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v). Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC y se lavó con una mezcla 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v). Tras la centrifugación, se disolvió el precipitado en 30 ml de agua, se dializó durante 1 d frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El rendimiento de producto aislado era del 81%.

Ejemplo 14.2.7 Síntesis de amino-HES a partir de oxo-HES del ejemplo 14.1

Se calentaron 5 g de oxo-HES del ejemplo 14.1 (PM = 30,8 kD, DS = 0,76, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, A) durante la noche a 80ºC a vacío y entonces se disolvieron bajo nitrógeno en 28 ml de dimetilsulfóxido seco (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A) y se añadieron 1,67 ml de 1,4diaminobutano. Tras agitar a 40ºC durante 17 h se añadió la mezcla de reacción a 175 ml de una mezcla 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v). Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC. Se disolvió el producto bruto en 40 ml de agua, se dializó durante 2 d frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. No se determinó el rendimiento de producto aislado.

Ejemplo 14.2.8 Síntesis de aldehído-HES a partir de amino-HES del ejemplo 14.2.7

Se disolvieron 122 mg de ácido 4-formilbenzoico y 144 mg de 1-hidroxi-1H-benzotriazol (ambos de Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A) en 34 ml de N,N-dimetilformamida (calidad para síntesis peptídica, Biosolve, Valkenswaard, PB) y se añadieron 103 !l de N,N’-diisopropilcarbodiimida (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A). Tras la incubación a 21ºC durante 30 min., se añadieron 2,46 g de amino-HES (sintetizado tal como se describió en el ejemplo 14.2.7). Tras agitar durante 22,5 h a 22ºC, se añadió la mezcla de reacción a 160 ml de una mezcla 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v). Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC y se lavó con una mezcla 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v). Tras la centrifugación, se disolvió el precipitado en 30 ml de agua, se dializó durante 4 d frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El rendimiento de producto aislado era del 87%.

Ejemplo 14.2.9 Síntesis de amino-HES a partir de oxo-HES del ejemplo 14.1

Se calentaron 10 g de oxo-HES (PM = 42,1 kD, DS = 0,41, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, A) durante dos días a 80ºC a vacío y entonces se disolvieron bajo nitrógeno en 53 ml de dimetilsulfóxido seco (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A) y se añadieron 2,01 ml de 1,4-diaminobutano. Tras agitar a 40ºC durante 17 h se añadió la mezcla de reacción a 350 ml de 2-propanol enfriado con hielo (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, A). Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se lavó con 80 ml de 2propanol enfriado con hielo y se recogió mediante centrifugación. Se disolvió el producto bruto en 80 ml de agua, se dializó durante 2 d frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El rendimiento de producto aislado era del 76%.

Ejemplo 14.2.10 Síntesis de aldehído-HES a partir de amino-HES del ejemplo 14.2.9

Se disolvieron 900 mg de ácido 4-formilbenzoico y 1053 mg de 1-hidroxi-1H-benzotriazol (ambos de Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A) en 30 ml de N,N-dimetilformamida (calidad para síntesis peptídica, Biosolve, Valkenswaard, PB) y se añadieron 930 !l de N,N’-diisopropilcarbodiimida (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A). Tras la incubación a 21ºC durante 30 min., se añadieron 3 g de amino-HES (sintetizado tal como se describió en el ejemplo 14.2.9 y disuelto en 20 ml de N,N-dimetilformamida). Tras agitar durante 22,5 h a 22ºC, se añadió la mezcla de reacción a 210 ml de una mezcla 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v). Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC y se lavó con una mezcla 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v). Tras la centrifugación, se disolvió el precipitado en 30 ml de agua, se dializó durante 2 d frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El rendimiento de producto aislado era del 97%.

Ejemplo 14.2.11 Síntesis de amino-HES a partir de oxo-HES del ejemplo 14.1 (A)

Se calentaron 6,09 g de oxo-HES (PM = 56,8 kD, DS = 0,76, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, A) durante la noche a 80ºC a vacío y entonces se disolvieron bajo nitrógeno en 32 ml de dimetilsulfóxido seco (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A) y se añadieron 1,22 ml de 1,4-diaminobutano. Tras agitar a 40ºC durante 17 h se añadió la mezcla de reacción a 150 ml de una mezcla 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v). Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se lavó con 40 ml de una mezcla 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v) y se recogió mediante centrifugación. Se disolvió el producto bruto en 80 ml de agua, se dializó durante 4 d frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El rendimiento de producto aislado era del 82%.

Ejemplo 14.2.12 Síntesis de aldehído-HES a partir de amino-HES del ejemplo 14.2.11

Se disolvieron 125 mg de ácido 4-formilbenzoico y 174 mg de 1-hidroxi-1H-benzotriazol (ambos de Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A) en 38 ml de N,N-dimetilformamida (calidad para síntesis peptídica, Biosolve, Valkenswaard, PB) y se añadieron 155 !l de N,N’-diisopropilcarbodiimida (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A). Tras la incubación a 21ºC durante 30 min., se añadieron 3,8 g de amino-HES (sintetizado tal como se describió en el ejemplo 14.2.11). Tras agitar durante 19 h a 22ºC, se añadió la mezcla de reacción a 160 ml de una mezcla 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v). Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se redisolvió en 20 ml de N,N-dimetilformamida y se precipitó con 80 ml de una mezcla 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v) tal como se describió anteriormente. Tras la centrifugación, se disolvió el precipitado en 50 ml de agua, se dializó durante 2 d frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El rendimiento de producto aislado era del 77%.

Ejemplo 14.2.13 Síntesis de amino-HES a partir de oxo-HES del ejemplo 14.1 (B)

Se calentaron 10 g de oxo-HES (PM = 56,8 kD, DS = 0,76, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, A) durante la noche a 80ºC a vacío y entonces se disolvieron bajo nitrógeno en 53 ml de dimetilsulfóxido seco (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A) y se añadieron 2 ml de 1,4-diaminobutano. Tras agitar a 40ºC durante 17 h se añadió la mezcla de reacción a 350 ml de 2-propanol enfriado con hielo (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, A). Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se lavó con 80 ml de 2-propanol enfriado con hielo y se recogió mediante centrifugación. Se disolvió el producto bruto en 80 ml de agua, se dializó durante 2 d frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El rendimiento de producto aislado era del 85%.

Ejemplo 14.2.14 Síntesis de aldehído-HES a partir de amino-HES del ejemplo 14.2.13

Se disolvieron 153 mg de ácido 4-formilbenzoico y 241 mg de 1-hidroxi-1H-benzotriazol (ambos de Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A) en 51 ml de N,N-dimetilformamida (calidad para síntesis peptídica, Biosolve, Valkenswaard, PB) y se añadieron 170 !l de N,N’-diisopropilcarbodiimida (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A). Tras la incubación a 21ºC durante 30 min., se añadieron 5,1 g de amino-HES (sintetizado tal como se describió en ejemplo 14.2.13). Tras agitar durante 16 h a 22ºC, se añadió la mezcla de reacción a 360 ml de una mezcla 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v). Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se redisolvió en 50 ml de agua y se precipitó con 360 ml de una mezcla 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v) tal como se describió anteriormente. Tras la centrifugación, se disolvió el precipitado en 50 ml de agua, se dializó durante 2 d frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El rendimiento de producto aislado era del 87%.

Ejemplo 14.2.15 Síntesis de amino-HES a partir de oxo-HES del ejemplo 14.1

Se calentaron 5,0 g de oxo-HES (PM = 29,3 kD, DS = 0,86, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, A) durante la noche a 80ºC a vacío, se disolvieron bajo nitrógeno en 20 ml de dimetilsulfóxido seco (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A) y se añadieron 1,67 ml de 1,4-diaminobutano (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A). Tras agitar a 40ºC durante 30,5 h se añadió la mezcla de reacción a 175 ml de una mezcla

1:1 (v/v) enfriada con hielo de acetona (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, A) y etanol (Sonnenberg, DAB, Braunschweig, A). Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación durante 120 min. a 4ºC, se disolvió en 40 ml de agua, se dializó durante 2 d frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 10 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El rendimiento de producto aislado era del 87%.

Ejemplo 14.2.16 Síntesis de aldehído-HES a partir de amino-HES del ejemplo 14.2.15

Se disolvieron 150 mg de ácido 4-formilbenzoico y 230 mg de 1-hidroxi-1H-benzotriazol (ambos de Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A) en 10 ml de N,N-dimetilformamida (calidad para síntesis peptídica, Biosolve, Valkenswaard, PB) y se añadieron 166 !l de N,N’-diisopropilcarbodiimida (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A). Tras la incubación a 21ºC durante 30 min., se añadió una disolución de 3,02 g de aminoHES

(sintetizado tal como se describió en el ejemplo 14.2.15) en 20 ml de DMF. Tras agitar durante 16 h a 22ºC, se añadió la mezcla de reacción a 215 ml de una mezcla 1:1 enfriada con hielo (v/v) de acetona (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, A) y etanol (Sonnenberg, DAB, Braunschweig, A). Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se redisolvió en 20 ml de agua y se precipitó con acetona/etanol tal como se describió anteriormente. Tras la centrifugación, se disolvió el precipitado en 30 ml de agua, se dializó durante 2,5 d frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 10 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El rendimiento de producto aislado era del 87%.

Ejemplo 14.2.17 Síntesis de amino-HES a partir de oxo-HES del ejemplo 14.1

Se calentaron 5,0 g de oxo-HES (PM = 97,9 kD, DS = 0,76, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, A) durante la noche a 80ºC a vacío, se disolvieron bajo nitrógeno en 20 ml de dimetilsulfóxido seco (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A) y se añadieron 0,50 ml de 1,4-diaminobutano (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A). Tras agitar a 40ºC durante 30,5 h se añadió la mezcla de reacción a 175 ml de una mezcla

1:1 (v/v) enfriada con hielo de acetona (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, A) y etanol (Sonnenberg, DAB, Braunschweig, A). Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación durante 120 min. a 4ºC, se disolvió en 40 ml de agua, se dializó durante 2 d frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 10 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El rendimiento de producto aislado era del 90%.

Ejemplo 14.2.18 Síntesis de aldehído-HES a partir de amino-HES del ejemplo 14.2.17

Se disolvieron 73 mg de ácido 4-formilbenzoico y 112 mg de 1-hidroxi-1H-benzotriazol (ambos de Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A) en 10 ml de N,N-dimetilformamida (calidad para síntesis peptídica, Biosolve, Valkenswaard, PB) y se añadieron 81,3 !l de N,N’-diisopropilcarbodiimida (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A). Tras la incubación a 21ºC durante 30 min., se añadió una disolución de 3,09 g de aminoHES (preparado tal como se describió en el ejemplo 14.2.17) en 20 ml de DMF. Tras agitar durante 16 h a 22ºC, se añadió la mezcla de reacción a 215 ml de una mezcla 1:1 enfriada con hielo (v/v) de acetona (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, A) y etanol (Sonnenberg, DAB, Braunschweig, A). Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se redisolvió en 20 ml de agua y se precipitó con acetona/etanol tal como se describió anteriormente. Tras la centrifugación, se disolvió el precipitado en 30 ml de agua, se dializó durante 2,5 d frente a agua (tubos de diálisis SnakeSkin, punto de corte de 10 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El rendimiento de producto aislado era del 96%.

Ejemplo 14.3 Síntesis conjugados de IFN-alfa mediante aminación reductora

Ejemplo 14.3.1 Conjugación con IFN-alfa a una escala de 20 !g

A 0,675 mg de IFN-alfa, disuelto en 0,375 ml de tampón fosfato de sodio 25 mM, pH 7,5, que contenía NaCl 150 mM y EDTA 0,3 mM, se le añadieron 4 ml del tampón de reacción (tampón acetato de sodio 0,1 M, pH 5,0) y se centrifugó la disolución durante 30 min. a 3939 x g en un concentrador Vivaspin 6 (Viva Science, MWCO de 5 kD, Hannover, Alemania). Se repitió el procedimiento de lavado dos veces mediante dilución de la disolución residual con el tampón de reacción hasta 6 ml y centrifugación tal como se describe. El volumen de la disolución de IFN-alfa final era de 0,236 ml, correspondiente a una concentración final calculada de IFN-alfa 2,86 mg/ml. No se comprobó experimentalmente la concentración de proteína.

A 7 !l de la disolución de IFN-alfa preparada tal como se describió anteriormente y enfriada hasta 0ºC, se le añadieron 10 !l (50 equiv.) de la disolución de aldehído-HES respectiva (véase la tabla a continuación) y 11,3 !l de una disolución de cianoborohidruro de sodio 60 mM, ambas en el mismo tampón (acetato de sodio, pH 5,0) y enfriadas hasta 0ºC, y se incubó la mezcla durante 17 h a 0ºC. Se analizó la mezcla de reacción mediante electroforesis en gel. Se emplearon las siguientes concentraciones de las disoluciones de aldehído-HES:

Tabla del ejemplo 14.3.1

Entrada

Derivado de HES Concentración [mg/ml]

A

aldehído-HES (ejemplo 14.2.2) 52

B

aldehído-HES (ejemplo 14.2.4) 52

C

aldehído-HES (ejemplo 14.2.6) 156

D

aldehído-HES (ejemplo 14.2.8) 156

E

aldehído-HES (ejemplo 14.2.10) 260

F

aldehído-HES (A) (ejemplo 14.2.12) 260

G

Sin derivado de HES pero con NaCNBH3 -

I

Sin derivado de HES y sin NaCNBH3 -

J

HES no oxidado (PM 7,6 kD, DS = 0,41) con NaCNBH3 52

K

HES no oxidado (PM 7,6 kD, DS = 0,41) sin NaCNBH3 52

Se muestra el análisis de SDS-Page de los conjugados en la figura 29.

Ejemplo 14.3.2 Conjugación con IFN-alfa a una escala de 3 mg

5 A 20 mg de IFN-alfa, disuelto en tampón fosfato de sodio 25 mM, pH 7,5, que contenía NaCl 150 mM y EDTA 0,3 mM, se le añadieron 8 ml del tampón de reacción (tampón acetato de sodio 0,1 M, pH 5,0) y se centrifugó la disolución durante 99 min. a 3939 x g en un concentrador Vivaspin 15R (Viva Science, MWCO de 5 KD, Hannover, Alemania). Se repitió el procedimiento de lavado dos veces mediante dilución de la disolución residual con el tampón de reacción hasta 18 ml y centrifugación tal como se describe. Se diluyó la disolución de IFN-alfa final con tampón

10 de reacción hasta 6,66 ml dando una concentración calculada final de IFN-alfa de 3 mg/ml. No se comprobó experimentalmente la concentración de proteína.

A 1 ml de la disolución de IFN-alfa preparada tal como se describió anteriormente y enfriada hasta 0ºC, se le añadieron 1 ml de la disolución de aldehídoHES (75 equiv.) y 1 ml de una disolución de cianoborohidruro de sodio

15 60 mM, ambas en el mismo tampón (acetato de sodio, pH 5,0) y enfriadas hasta 0ºC, y se incubó la mezcla durante 22 h a 0ºC. Se purificó la mezcla de reacción tras el análisis mediante electroforesis en gel. Para la reacción descrita en la entrada G, sólo se usaron 0,666 !l de las disoluciones correspondientes. Se emplearon las siguientes concentraciones de las disoluciones de aldehídoHES:

20 Tabla del ejemplo 14.3.2

Entrada

Derivado de HES Concentración [mg/ml]

A

aldehído-HES (ejemplo 14.2.2) 117

B

aldehído-HES (ejemplo 14.2.4) 117

C

aldehído-HES (ejemplo 14.2.6) 350

D

aldehído-HES (ejemplo 14.2.8) 350

E

aldehído-HES (ejemplo 14.2.10) 584

F

aldehído-HES (A) (ejemplo 14.2.12) 584

G

HES no oxidado (PM 7,6 kD, DS = 0,41) 117

Se muestra el análisis de SDS-Page de los conjugados en la figura 30.

25 Ejemplo 14.3.3 Conjugación con IFN-alfa a una escala de 3 mg

14.3.3.1 Conjugación de aldehídoHES tal como se preparó en el ejemplo 14.2.16 con IFNa mediante aminación reductora

30 A 10 mg de IFNa, disuelto en tampón fosfato de sodio 25 mM, pH 7,5, que contenía NaCl 150 mM y EDTA 0,3 mM, se le añadieron 8 ml del tampón de reacción (tampón acetato de sodio 0,1 M, pH 5,0) y se centrifugó la disolución durante 30 min. a 3939 x g en un concentrador Vivaspin 15R (Viva Science, MWCO de 5 kD, Hannover, Alemania). Se repitió el procedimiento de lavado dos veces mediante dilución de la disolución residual con el tampón de reacción hasta 18 ml y centrifugación tal como se describe. Se diluyó la disolución de IFNa final con tampón de

35 reacción hasta 3,33 ml dando una concentración calculada final de IFNa de 3 mg/ml. No se comprobó experimentalmente la concentración de proteína.

A 1 ml de la disolución de IFNa preparada tal como se describió anteriormente y enfriada hasta 0ºC, se le añadieron 1 ml de la disolución de aldehídoHES tal como se preparó en el ejemplo 14.2.16 (75 equiv., 352 mg/ml) y 1 ml de 40 una disolución de cianoborohidruro de sodio 60 mM, ambas en el mismo tampón y enfriadas hasta 0ºC, y se incubó la mezcla durante 22 h a 0ºC. Se purificó la mezcla de reacción tras el análisis mediante electroforesis en gel. Para la electroforesis en gel, se emplearon un instrumento XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, A) y una fuente de alimentación Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B). Se usaron un gel de Bis-Tris al 12% junto con un tampón de ejecución MOPS SDS en condiciones reductoras (ambos de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, A)

45 según las instrucciones del fabricante.

14.3.3.2 Conjugación de aldehídoHES tal como se preparó en el ejemplo 14.3.18 con IFNa mediante aminación reductora

50 A 1 ml de la disolución de IFNa preparada tal como se describió en 14.3.3.1 y enfriada hasta 0ºC, se le añadieron 2 ml de la disolución de aldehídoHES tal como se preparó en el ejemplo 14.3.18 (75 equiv., 369 mg/ml) y 1,5 ml de una disolución de cianoborohidruro de sodio 60 mM, ambas en el mismo tampón y enfriadas hasta 0ºC, y se incubó la mezcla durante 22 h a 0ºC. Se purificó la mezcla de reacción tras el análisis mediante electroforesis en gel. Para la electroforesis en gel, se emplearon un instrumento XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, A) y

55 una fuente de alimentación Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B). Se usaron un gel de Bis-Tris al 12% junto con un tampón de ejecución MOPS SDS en condiciones reductoras (ambos de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, A) según las instrucciones del fabricante.

14.3.3.3 Control de reacción: Conjugación de HES10/0.4 (PM 7,6 kD DS = 0,41) con IFNa mediante aminación reductora

A 1 ml de la disolución de IFNa preparada tal como se describió en 14.3.3.1 y enfriada hasta 0ºC, se le añadieron 1 ml de la disolución de HES10/0.4 (75 equiv., 117 mg/ml) y 1 ml de una disolución de cianoborohidruro de sodio 60 mM, ambas en el mismo tampón y enfriadas hasta 0ºC, y se incubó la mezcla durante 22 h a 0ºC. Se purificó la mezcla de reacción tras el análisis mediante electroforesis en gel. Para la electroforesis en gel, se emplearon un instrumento XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, A) y una fuente de alimentación Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B). Se usaron un gel de Bis-Tris al 12% junto con un tampón de ejecución MOPS SDS en condiciones reductoras (ambos de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, A) según las instrucciones del fabricante.

Se muestra el análisis de SDS-Page de los conjugados en la figura 31.

Ejemplo 14.3.4 Conjugación con IFN-alfa a una escala de 16 mg

Se intercambió el tampón de una disolución de IFN-alfa de 20 mg tal como se describió en el ejemplo 14.3.2. Se diluyó la disolución de IFN-alfa final con tampón de reacción hasta 6,37 ml dando una concentración calculada final de IFN-alfa de 3,14 mg/ml. Se diluyeron 100 !l de esta disolución con 900 !l de tampón de reacción y se determinó espectrofotométricamente a 279 nm que la concentración de proteína era de 3,01 mg/ml, basándose en el coeficiente de extinción molar de 18000. Tras la combinación con el material usado para la determinación de la concentración de proteína, el volumen final era de 7,0 ml con una concentración de proteína de 2,74 mg/ml.

A 5,91 ml de esta disolución de IFN-alfa (16,2 mg) preparada tal como se describió anteriormente y enfriada hasta 0ºC, se le añadieron una disolución de 3,152 g de aldehído-HES del ejemplo 14.2.14 (75 equiv.) en 5 ml de tampón de reacción y 6 ml de una disolución de cianoborohidruro de sodio 60 mM, ambas en el mismo tampón (acetato de sodio, pH 5,0) y enfriadas hasta 0ºC, y se incubó la mezcla durante 22 h a 0ºC (véase la figura 32, línea A).

Como control de reacción, se mezclaron 1,09 ml de la disolución de IFN-alfa enfriada previamente (3 mg) con 1 ml de una disolución de 122 mg de HES no oxidado (PM 7,6 kD, DS = 0,41) en el tampón de reacción y 1 ml de una disolución de cianoborohidruro de sodio 60 mM, ambas en el mismo tampón y enfriadas hasta 0ºC (véase la figura 32, línea B).

Se muestra el análisis de SDS-Page del conjugado en la figura 32.

Ejemplo 14.4 Purificación de los conjugados de IFN-alfa-HES

14.4.1 Purificación de HES-IFN-a de incubaciones de la proteína aminada de manera reductora con derivados activados de HES (separación de la proteína modificada y no modificada de derivados de HES)

Se realizó la purificación de todas las muestras a temperatura ambiente usando un equipo ÄKTA explorer 10. Se equilibró la columna que contenía 3 ml de Q-Sepharose Fast Flow con 10 VC de tampón A (Tris/HCl 20 mM, pH 8,0). Se diluyeron las muestras 1:10 con tampón A y se aplicaron usando la bomba de muestra a una velocidad de flujo de 1 ml/min. Tras el lavado de la bomba de muestra con 10 ml de tampón A, se lavó la columna adicionalmente con 6 VC de tampón A a una velocidad de flujo de 1,0 ml/min. Se realizó la elución usando un gradiente lineal del 0100% de de tampón B (NaCl 0,3 M en Tris/HCl 20 mM, pH 8,0) a lo largo de 2 VC y una ejecución isocrática con 0,5 VC de tampón B a una velocidad de flujo de 0,8 ml/min. Se regeneró la columna usando 2 VC de tampón C (NaCl 1,5 M en Tris/HCl 20 mM, pH 8,0) seguido por 0,5 VC de tampón B a una velocidad de flujo de 0,8 ml/min. Se realizó el reequilibrado durante la siguiente ejecución usando 6 VC de tampón A y una velocidad de flujo de 1,0 ml/min.

14.4.2 Materiales y métodos

Equipo: ÄKTA explorer 10 (Amersham Pharmacia Biotech), con:

5 Bomba P-903

Mezclador M-925, con una cámara de 0,6 ml

Monitor UV-900, con una célula de flujo de 10 mm 10 Monitor pH/C-900

Bomba P-950 (bomba de muestra)

15 Software Unicorn versión 3.21

Columna: Amersham Biosciences C 10/10

20 Material de la columna: Q-Sepharose Fast Flow, n.º de código 17-0510-01, n.º de lote OD 06453

Volumen de la columna: 3 ml

Tampón A Tris/HCl 20 mM, pH 8,0, n.º de lote PL0746 25 Tampón B: NaCl 0,3 M en Tris/HCl 20 mM, pH 8,0, n.º de lote PL0747

Tampón C: NaCl 1,5 M en Tris/HCl 20 mM, pH 8,0, n.º de lote PL0748

30 Método

Volumen Etapa Tampón Velocidad de flujo 1 VC Equilibrado 100% de tampón A 1,0 ml/min. 5-28 ml Carga de la muestra muestra 1:10 en tampón A 1,0 ml/min. 10 ml Lavado de la bomba de 100% de tampón A 1,0 ml/min.

muestra

5 VC Lavado de la muestra no 100% de tampón A 1,0 ml/min. unida Inicio del fraccionamiento 100% de tampón A 1,0 ml/min.

6 VC Elución, gradiente lineal 0-100% de tampón B 0,8 ml/min. 2 VC Elución, isocrática 100% de tampón B 0,8 ml/min. 2 VC Regeneración 100% de tampón C 0,8 ml/min. 0,5 VC Regeneración 100% de tampón B 0,8 ml/min.

Detención del 100% de tampón B 0,8 ml/min. fraccionamiento 5 VC Reequilibrado 100% de tampón A 1,0 ml/min.

Detección: 280 nm, 260 nm, 220 nm pH Conductividad

Fraccionamiento: Fracciones de 1 ml

35 14.4.3 Resultados

14.4.3.1 Muestra según el ejemplo 14

composición de la muestra: 1 mg de EP2001 (rhIFN-a2b) en fosfato de Na 25 mM, NaCl 0,13 M y EDTA 40 0,3 mM, pH 7,5 ± 0,2 volumen de partida: 0,5 ml, diluido 1:10 en tampón A = 5 ml

fracción no retenida/lavado 9,3 ml

45 fecha de ejecución: n.º de ejecución: QS24 D39 (véase la tabla para el ejemplo 14.4.4.1

14.4.3.2 Muestra según el ejemplo 14.3.2 (entrada A) composición de la muestra: 2,5 mg de EP2001 + 97,5 mg de aldehídoHES10/0.4 (NZA256) en acetato de Na

0,1 M, cianoborohidruro de Na 20 mM, pH 5,0 volumen de partida: 2,5 ml, diluido 1:10 en tampón A = 25 ml fracción no retenida/lavado: 44 ml fecha de ejecución: n.º de ejecución: QS25 D56 (véase la tabla para el ejemplo 14.4.4.1)

14.4.3.3 Muestra según el ejemplo 14.3.2 (entrada B) composición de la muestra: 2,5 mg de EP2001 + 97,5 mg de aldehídoHES10/0.7 (NZA235A) en acetato de

Na 0,1 M, cianoborohidruro de Na 20 mM, pH 5,0 volumen de partida: 2,5 ml, diluido 1:10 en tampón A = 25 ml fracción no retenida/lavado: 41 ml fecha de ejecución: n.º de ejecución: QS26 D57 (véase la tabla para el ejemplo 14.4.4.1)

14.4.3.4 Muestra según el ejemplo 14.3.2 (entrada C) composición de la muestra: 2,5 mg de EP2001 + 292 mg de aldehídoHES30/0.4 (NZA328) en acetato de Na

0,1 M, cianoborohidruro de Na 20 mM, pH 5,0 volumen de partida: 2,5 ml, diluido 1:10 en tampón A = 25 ml fracción no retenida/lavado: 42 ml fecha de ejecución: n.º de ejecución: QS27 D58 (véase la tabla para el ejemplo 14.4.4.1)

14.4.3.5 Muestra según el ejemplo 14.3.2 (entrada D) composición de la muestra: 2,5 mg de EP2001 + 292 mg de aldehídoHES30/0.7 (NZA329) en acetato de Na

0,1 M, cianoborohidruro de Na 20 mM, pH 5,0 volumen de partida: 2,5 ml, diluido 1:10 en tampón A = 25 ml fracción no retenida/lavado: 40 ml fecha de ejecución: n.º de ejecución: QS28 D59 (véase la tabla para el ejemplo 14.4.4.1)

14.4.3.6 Muestra según el ejemplo 14.3.2 (entrada E) composición de la muestra: 2,5 mg de EP2001 + 487 mg de aldehídoHES50/0.4 (NZA303) en acetato de Na

0,1 M, cianoborohidruro de Na 20 mM, pH 5,0 volumen de partida: 2,7 ml, diluido 1:10 en tampón A = 27 ml fracción no retenida/lavado: 50 ml fecha de ejecución: n.º de ejecución: QS29 D60 (véase la tabla para el ejemplo 14.4.4.1)

14.4.3.7 Muestra según el ejemplo 14.3.2 (entrada F) composición de la muestra: 2,5 mg de EP2001 + 487 mg de aldehídoHES30/0.7 (NZA309) en acetato de Na

5 0,1 M, cianoborohidruro de Na 20 mM, pH 5,0 volumen de partida: 2,6 ml, diluido 1:10 en tampón A = 26 ml fracción no retenida/lavado: 50 ml

10 fecha de ejecución: n.º de ejecución: QS30 D61 (véase la tabla para el ejemplo 14.4.4.1) 15 14.4.3.8 Muestra según el ejemplo 14.3.2 (entrada G) composición de la muestra: 1,7 mg de EP2001 + 98 mg de HES10/0.4 (lote de Supramol 407B) en acetato de Na 0,1 M, cianoborohidruro de Na 20 mM, pH 5,0 20 volumen de partida: 2,5 ml, diluido 1:10 en tampón A = 25 ml fracción no retenida/lavado: 42 ml fecha de ejecución: 25 n.º de ejecución: QS31 D62 (véase la tabla para el ejemplo 14.4.4.1)

14.4.4 Comparación de los resultados 30 14.4.4.1 Análisis de SDS-PAGE de los picos de elución de IFN-alfa Tabla para el ejemplo 14.4.4.1: Comparación de las áreas de los picos detectados a 280 nm durante la cromatografía en Q-Sepharose de IFN-a hesilado

Área de eluato Rendimiento calculado de Cantidad aplicada (280 nm) / mg de proteína total [mg]

N.º de Área de eluato

calculada de IFN-a proteína no (cuantificación mediante

ejecución (280 nm) [mAU x ml]

no modificado modificada [mAU x HPLC a 280 nm*)

ml x mg-1]

QS-24 D39 1,0 mg 961 961 0,42

QS-25 D56 2,5 mg 4370 1748 1,20

QS-26 D57 2,5 mg 5669 2268 1,64

QS-27 D58 2,5 mg 3350 1340 1,60

QS-28 D59 2,5 mg 2854 1142 1,54

QS-29 D60 2,5 mg 2255 902 1,52

QS-30 D61 2,5 mg 9278 3711 3,44

QS-31 D62 1,7 mg 1918 1128 1,40

* datos del análisis cuantitativo derivado de RP-HPLC-3

35 Ejemplo 15 Descripción del bioensayo de actividad antiviral de IFN alfa

Descripción del procedimiento de prueba: Actividad antiviral de interferón-alfa

40 Tras diluir previamente los artículos de prueba en medio de cultivo celular, se prepararon diluciones en serie de dos veces. En placas de microtitulación de 96 pocillos, se añadió interferón diluido (en duplicados de cuatro veces por dilución) a células MDBK recién tripsinizadas (40.000 células por pocillo). Se incubaron los ensayos durante 24 horas a 37ºC (volumen total por pocillo: 150 !l (ejemplo 15.1) o 175 !l (ejemplo 15.2, 15.3, 15.4, 15.5, 16.2, 16.3)).

45 Posteriormente, se añadieron 50 !l de disolución madre de VEV diluida a cada pocillo (excepto para los pocillos control positivo) dando como resultado una multiplicidad de infección de 0,1.

Se incluyeron los siguientes controles en cada ensayo: 12 pocillos que recibieron virus más medio de cultivo celular

50 en lugar de interferón (control negativo) y 12 pocillos que recibieron medio de cultivo celular en lugar de interferón y virus (control positivo).

Se incubaron los ensayos durante 42 horas a 37ºC.

Al final del periodo de incubación, se reemplazó el sobrenadante de cultivo celular de cada pocillo por 50 !l de una disolución de MTT (al menos 2 mg/ml en medio de cultivo celular). Se incubaron las células durante tres horas. Se solubilizó el colorante de formazán púrpura formado por las células en proliferación añadiendo 100 !l de disolución de isopropanol/HCl (isopropanol con HCl 40 mM) a cada pocillo. Posteriormente, se midieron los valores de absorbancia de las disoluciones a 570/630 nm en un lector de placas de microtitulación.

Se calculó la actividad proliferativa de células MDBK hechas crecer en presencia de interferón y VEV para cada dilución de interferón tal como sigue:

((Absorbancia media de cuatro pocillos tratados con interferón) – (absorbancia media del control negativo)) * 100 (Absorbancia media del control positivo) – (absorbancia media del control negativo)

Se determinó la actividad antiviral de interferón-alfa en cuatro ensayos separados para cada uno de los artículos de prueba.

Ejemplo 15. Actividad antiviral de Intron® A en relación con un patrón de NIH

En todos los experimentos, se usó Intron® A (IFN-alfa 2b, Schering-Plough), calibrado frente al patrón de NIH rhIFNalfa 2a (NIAID, NIH, Bethesda, EE.UU., Gxa01-901-535) como referencia de laboratorio interna. El patrón de NIH tenía una actividad específica de 9.000 UI/ml. La referencia de laboratorio interna Intron® A tenía una actividad específica de 8.487.000 UI/ml en la prueba tal como se describe en el ejemplo 15.

Se muestra la actividad proliferativa de Intron® A en comparación con el patrón de NIH rhIFN-alfa 2a en la figura 33.

Ejemplo 15.2 Actividad antiviral de IFN-a-HES incubado de manera simulada en relación con material de partida no modificado

Tal como se describe en el ejemplo 14.3.4, se usó IFN-alfa-HES incubado de manera simulada (descrito en el ejemplo 14.3.2, entrada G) como control de reacción. Se comparó la actividad antiviral del material con la del material de partida no modificado para investigar la influencia del procedimiento de acoplamiento y purificación sobre la bioactividad. La incubación de manera simulada no afectó a la bioactividad in vitro de IFN-alfa.

Se muestra la actividad in vitro relativa de IFN-alfa-HES incubado de manera simulada en comparación con material de partida de IFN-alfa no modificado en la figura 34.

Ejemplo 15.3 Actividad antiviral de conjugados de IFN-alfa-HES en relación con Intron® A

En el sistema de ensayo descrito en el ejemplo 15, se sometieron a prueba los conjugados (entradas A, B, C, D, E del ejemplo 14.3.2 purificados según el ejemplo 14.4) en comparación con material de partida de IFN-alfa no modificado, Intron® A y Pegasys (Roche). Se calculó la concentración CPE50 de los materiales. Todos los conjugados de IFN-alfa-HES conservaban una actividad antiviral que era sustancialmente superior a la de Pegasys.

Se muestra la actividad in vitro relativa de conjugados de IFN-alfa-HES en comparación con material de partida de IFN-alfa no modificado, Intron® A y Pegasys en la figura 35.

Ejemplo 15.4 Actividad antiviral de conjugado de IFN-alfa-HES en comparación con Intron® A

En el sistema de ensayo descrito en el ejemplo 15, se sometió a prueba el conjugado de IFN-alfa-HES del ejemplo

14.3.4 purificado según el ejemplo 14.4 en comparación con Intron® A. Se calculó la concentración CPE50 de los materiales. El conjugado de IFN-alfa-HES conservaba una alta actividad antiviral de aproximadamente el 25% en comparación con Intron® A.

Se muestra la actividad in vitro relativa de conjugados de IFN-alfa-HES en comparación con Intron® A en la figura

36.

Ejemplo 15.5 Actividad antiviral de conjugado de IFN-alfa-HES en comparación con Intron® A

En el sistema de ensayo descrito en el ejemplo 15, se sometieron a prueba los conjugados de IFN-alfa-HES del ejemplo 14.3.3, purificados según el ejemplo 14.4 en comparación con Intron® A y PegIntron®. Se calculó la concentración CPE50 de los materiales. Los conjugados de IFN-alfa-HES conservaban una actividad antiviral de aproximadamente el 25% en comparación con Intron® A, que es del mismo nivel que la actividad in vitro de PegIntron.

Se muestra la actividad in vitro relativa de conjugados de IFN-alfa-HES en comparación con Intron® A en la figura

37.

Ejemplo 16 Bioactividad in vivo de conjugados de IFN-alfa-HES (estudio PK en ratones)

Ejemplo 16.1 Influencia del suero de ratón sobre el sistema de ensayo tal como se describe en el ejemplo 9

Se prepararon diluciones de interferón-alfa en medio de cultivo celular (control) y en suero de ratón (dilución 1:40 y dilución 1:80). Se realizó el ensayo tal como se describe en el ejemplo 15.

Se determinó la actividad antiviral de interferón-alfa en dos ensayos separados para el control, para el suero de ratón diluido 1:40 así como para el suero de ratón diluido 1:80. Los resultados indicaron que el suero de ratón a una dilución 1:40 y 1:80 no afecta al bioensayo para la actividad antiviral de interferón-alfa.

Ejemplo 16.2 Estudio in vivo en ratones (I)

Se sometió a prueba la actividad antiviral de suero reunido en el ensayo antiviral. Se recogió suero de dos ratones (ratones BALB/c hembra, de 8 semanas de edad) a cada tiempo, que se sacrificaron a las 2 h, 4 h, 12 h y 24 h tras la inyección i.v. de 30 !g/kg (basándose en el contenido en proteína) de IFN-alfa o el conjugado de IFN-alfa-HES.

Se descongelaron las muestras de suero y se homogeneizaron meticulosamente agitando con vórtex (y se diluyeron). Se prepararon diluciones en serie de dos veces en medio de cultivo celular. Se descongeló un vial de Intron® A (diluido) y se homogeneizó meticulosamente agitando con vórtex. Se prepararon diluciones en serie de dos veces en medio de cultivo celular.

Se determinaron las diluciones CE50 en el ensayo de CPE a partir de curvas de respuesta a la dosis de una serie de dilución 1:2 tal como se describe en el ejemplo 15.

Se determinó la semivida de los materiales en comparación con material de partida no modificado y Pegasys. Se calculó la semivida a partir de un gráfico semilogarítmico de la dilución CE50 frente al tiempo tras la inyección.

Se detectó la actividad antiviral para (i) IFN-alfa-HES (ejemplo 14.3.2, entrada B de la tabla), (ii) IFN-alfa-HES (ejemplo 14.3.2, entrada D de la tabla), (iii) IFN-alfa-HES (ejemplo 14.3.4) hasta 24 h. Tal como puede observarse a partir de la figura 38, la semivida aumentó desde (i) (aproximadamente 3 h) a lo largo de (ii) (aprox. 5 h) hasta (iii) (aproximadamente 7 h).

Para IFN-alfa no modificado, la actividad antiviral del suero era demasiado baja como para calcular una semivida sérica. En K.R. Reddy et al. Advanced Drug Delivery Reviews 54 (2002) 571-586 se determinó una semivida sérica de IFN-alfa en ratas (i.v.) de 2 h.

Ejemplo 16.3 Estudio in vivo en ratones (II)

Se sometió a prueba la actividad antiviral de suero reunido en el ensayo antiviral. Se recogió suero de dos ratones (ratones BALB/c hembra, de 8 semanas de edad) a cada tiempo, que se sacrificaron a las 2 h, 4 h, 12 h y 24 h tras la inyección i.v. de 30 !g/kg (basándose en el contenido en proteína) de IFN-alfa o el conjugado de IFN-alfa-HES.

Se descongelaron las muestras de suero y se homogeneizaron meticulosamente agitando con vórtex (y se diluyeron). Se prepararon diluciones en serie de dos veces en medio de cultivo celular. Se descongeló un vial de Intron® A (diluido) y se homogeneizó meticulosamente agitando con vórtex. Se prepararon diluciones en serie de dos veces en medio de cultivo celular.

Se determinaron las diluciones CE50 en el ensayo de CPE a partir de curvas de respuesta a la dosis de una serie de dilución 1:2 tal como se describe en el ejemplo 15.

Se determinó la semivida de los materiales en comparación con material de partida no modificado y Pegasys. Se calculó la semivida a partir de un gráfico semilogarítmico de la dilución CE50 frente al tiempo tras la inyección.

Se detectó la actividad antiviral para (i) PegIntron, (ii) IFN-alfa-HES (ejemplo 14.3.3,1) y (iii) IFN-alfa-HES (ejemplo 1.3.3.2) hasta 24 h. Tal como puede observarse a partir de la figura 39, la semivida aumentó desde (i) (aproximadamente 3,6 h) hasta (ii) y (iii) (aproximadamente 6,5 y 6,8 h).

Ejemplo 17 Bioactividad in vivo de conjugados de IFN-alfa-HES (estudio PK en conejos)

Ejemplo 17.1 Marcaje radiactivo de IFN-alfa y conjugados de IFN-alfa-HES

Se marcaron las muestras usadas para el estudio PK con 125I con el método de cloramina T. Se hace reaccionar cloramina T con yoduro y se forma una especie de interhalógeno (I-Cl). El interhalógeno reacciona con el anillo aromático de la tirosina y lo sustituye en la posición o.

Ejemplo 17.2 Experimento de referencia: Marcaje de oxo-HES 50/0.4 con 125I

En una primera serie experimental en las condiciones de reacción dadas, se investigó si cantidades traza de yodo podían detectarse por ejemplo mediante yodo, poliyodo o poliyoduro que forman complejos con HES. En comparación, se marcaron oxo-HES (PM 42,1 kD, DS = 0,41) e IFN-alfa-HES (ejemplo 14.3.2, entrada E de la tabla) en las mismas condiciones y tras el procedimiento de purificación, se midió la radiactividad en las muestras. Según la bibliografía, la amilopectina puede formar complejos con yodo, poliyodo o poliyoduro cuando las estructuras helicoidales tienen al menos 11 unidades de glucosa anhidra.

Sólo se detectó radiactividad en la muestra de IFN-alfa-HES. Este resultado demostró que la radiactividad estaba provocada exclusivamente por la modificación covalente de residuos de tirosina en IFN-alfa pero no por yodo posiblemente unido físicamente, que no se eliminó en el procedimiento de purificación. Puede considerarse oxo-HES 50/0.4 (PM 42,1 kD, DS = 0,41) como control negativo. Debido al alto peso molecular y el bajo grado de sustitución en esta especie de oxo-HES, se esperarían las estructuras helicoidales más largas si estuviese presente alguna y, por tanto, en este caso habría habido el riesgo más alto de complejación de yodo.

Ejemplo 17.3 Marcaje de interferón-alfa con yodo no radiactivo (“yodación fría”)

Se marcó interferón alfa con yodo no radiactivo en el mismo procedimiento de marcaje y purificación que los conjugados de IFN-alfa-HES. En el ensayo antiviral se conservó la actividad antiviral. Sin embargo, no se realizó cuantificación, porque en el procedimiento de marcaje y purificación se cambió la concentración y no pudo determinarse debido a la pequeña cantidad de material disponible.

Ejemplo 17.4 Marcaje radiactivo de conjugados de IFN-alfa-HES

Se marcaron muestras según el ejemplo 17.1 con 125I radiactivo. Las muestras eran material de partida de IFN-alfa, IFN-alfa-HES (ejemplo 14.3.2, entrada D de la tabla). Las muestras tenían una actividad específica de 38 !Ci/!g (material de partida de IFN-alfa), 41 !Ci/!g (IFN-alfa-HES 30/0.7).

Ejemplo 17.5 Estudio PK in vivo en conejos

Ejemplo 17.5.1 Procedimiento experimental

Se usaron los artículos de prueba como una dilución. Se preparó una disolución de 4 !Ci/ml. El tampón de dilución era PBS.

Cuatro conejos blancos de Nueva Zelanda HsdIf:NZW. Fuente Harlan Winkelmann GmbH, D-33178 Borchen, sexo: hembra; peso corporal al comienzo del estudio: > 2,5 kg. A todos los animales se les había aplicado por vía intravenosa las sustancias de prueba radiomarcadas, recibiendo un volumen de 1 ml/kg de peso corporal, que es equivalente a una dosificación de 4 !Ci/kg de peso corporal. Se habían tomado muestras de sangre a puntos de tiempo definidos. En cada punto de toma de muestras, se tomaron aprox. 600 !l de sangre de la vena auricular de los animales para investigaciones adicionales.

Para la toma de muestras de sangre, se colocó un catéter permanente intravenoso con anestesia general (ketamina/Rompun) en la vena auricular. La anestesia les mantuvo tranquilos durante el punto de toma de muestras de sangre, durante la propia aplicación y las primeras tres tomas de muestras de sangre tras la aplicación (0,5 horas, 1 hora y 2 horas). Se dejaron los catéteres en los animales durante los puntos de toma de muestras adicionales hasta que los cortaron los propios animales. Se determinaron tomas de muestras de sangre adicionales con una cánula a través de diferentes zonas de las venas auriculares.

Se realizó el procesamiento adicional de las muestras de sangre tras la toma de muestras de sangre. Para determinar el artículo de prueba radiomarcado en la sangre, se procesaron las muestras de sangre recogidas según un protocolo de solubilización específico. Para esto, se transfirieron 250 !l de las muestras de sangre a un vial

nuevo y se añadió un volumen igual de Solvable™. Se incubaron las muestras durante una hora a 50ºC en un baño

de agua con agitación. Tras el tiempo de incubación, se enfriaron las muestras hasta temperatura ambiente y se añadieron 100 !l de disolución de EDTA [100 mM]. Posteriormente se añadieron 300 !l de H2O2 [30%] y tras agitar de nuevo se incubaron las muestras durante una hora a 50ºC en un baño de agua con agitación. Antes del procesamiento adicional se recogieron las muestras.

Al final de la recogida de sangre y la solubilización, se transfirieron las muestras a un vial de centelleo de 20 ml y se añadieron 10 ml del cóctel de centelleo Ultima Gold™. Hasta la medición del isótopo 125I en un contador de centelleo (aproximadamente 72 h tras la adición del cóctel), se almacenaron las muestras en la oscuridad a 2-8ºC.

Antes del procesamiento y el análisis estadístico de los datos, se determinó la detección de la extinción de la actividad en las condiciones experimentales específicas. El coeficiente de regresión (r2 = 0,9970) es una medida del ajuste a la línea. Se encontró que el factor de extinción [pCi/cpm] era de 3,315938.

5 Resultados (véase la figura 40):

IFN-alfa-HES mostró una prolongación definida de la semivida en comparación con el material de partida. Más allá de 24 h (aproximadamente < 1000 pCi/ml) la curva del material no modificado se niveló y casi no se observó

10 disminución de la actividad. La pequeña desviación estándar de la radiactividad medida para todas las muestras demuestra la calidad del experimento.

Se calculó la semivida a partir de la concentración de IFN-alfa en las muestras de sangre. Para la evaluación mostrada en la figura 41, sólo se consideraron los datos de muestras de sangre tomadas entre 4 y 24 h. Para el

15 material no modificado, se calculó una semivida de 7 h. Con IFN-alfa-HES, se observó un aumento sustancial de la semivida (aproximadamente 33 h).

Se evaluaron los datos estadísticamente según diferentes modelos compartimentales tal como se muestra en los diagramas en la figura 42 a, y b (recorte 0-12 h). En el modelo monocompartimental, es obvio que la concentración 20 de IFN-alfa desciende rápidamente durante las primeras 2 horas tras la inyección. Para IFN-alfa-HES, la semivida se prolonga claramente. La semivida calculada estadísticamente era de 0,26 h para IFN-alfa, 7,7 h para IFN-alfa-HES. Según el modelo no compartimental, la evaluación estadística da como resultado una semivida de 147 h para IFNalfa no modificado (basándose en datos de 24-120 h), 42,7 h para IFN-alfa-HES (basándose en datos de 36-120 h). Tal como se describió anteriormente, la semivida del IFN-alfa no modificado se prolonga sustancialmente desde que

25 la curva se nivela más allá de 24 h.

Se resume la semivida de las dos muestras en la siguiente tabla, basándose en los modelos descritos para el cálculo.

30 Tabla del ejemplo 17.5.1:

Semivida de IFN-alfa e IFN-alfa-HES calculada según diferentes modelos

Material de partida de IFN-alfa IFN-alfa-HES

t1/2 t1/2

modelo no compartimental

(147,0*) 42,7**

modelo monocompartimental

0,26 7,7

Gráfico semilogarítmico

(véase la fig. 40, 4-24 h)

7 33

* datos evaluados 24-120 h,

** datos evaluados 36-120 h

35 Ejemplo de referencia 18.1 Síntesis de hidroxietilalmidón funcionalizado con amino

Se preparó oxo-HES (PM = 41.000 D, DS = 0,76) por Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, A; según el documento DE 196 28 705 A1.

40 A una disolución de 0,51 g de oxo-HES (19,15 !mol) en 2 ml de dimetilsulfóxido seco (DMSO, Acros Organics BVBA, Geel, B) se le añadieron gota a gota bajo nitrógeno 200 !l (19,9 mmol) de 1,4-diaminobutano (Acros Organics BVBA, Geel, B) y se agitó la mezcla durante 24 h a 70ºC. Se añadió la mezcla de reacción a 20 ml de acetona fría (0ºC). Se separó el precipitado resultante mediante filtración, se lavó con 40 ml acetona y se redisolvió en 20 ml de agua. Se dializó la disolución durante un día frente a agua (tubos de diálisis Snake-Skin, punto de corte de 4-6 kD,

45 Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, A) y se liofilizó. El rendimiento era de un 80% (0,41 g) de amino-HES.

Se logró la purificación del producto mediante aplicación a una columna de desalación HiPrep 26/10 (100 mm,Amersham Biosciences) usando un sistema ÄKTA explorer (Amersham Biosciences). Por tanto, se equilibra la columna de desalación HiPrep 26/10 con disolución de NaCl 0,1 M (10 ml/min.) y se aplicó el amino-HES en NaCl 50 0,1 M (5 mg/ml, volumen de inyección de 10 ml). Se aplicaron las fracciones de amino-HES reunidas a la columna de desalación HiPrep 26/10 equilibrada con agua (volumen de inyección de 10 ml). Volvieron a aplicarse las fracciones de HES reunidas en las mismas condiciones a la columna. Se liofilizó el producto puro y se determinó la cantidad de amina mediante derivatización con ácido 2,4,6-trinitrobencenosulfónico (TNBSA (Pierce), número de producto de instrucciones de TNBSA 28997) y Boc-Lys-OH para la calibración. Se encontró que la cantidad de

55 amina era de 34,02 nmol/mg (92%) Ejemplo de referencia 18.2 Síntesis de hidroxietilalmidón funcionalizado con yodoacetilo

A una disolución de 101,9 mg de hidroxietilalmidón funcionalizado con amino (amino-HES !mol tal como se preparó

5 en el ejemplo 18.1) en 5 ml de Na2CO3 0,1 M (pH = 8,3) se le añadieron 12,63 mg de éster de N-hidroxisuccinimida de ácido yodoacético (44,65 !mol, Sigma, Taufkirchen, Alemania). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente en la oscuridad bajo nitrógeno durante 15 h. Se añadieron 15 ml de agua a la disolución acuosa y se logró la purificación del producto mediante aplicación a una columna de desalación HiPrep 26/10 (Amersham Biosciences). Por tanto, se equilibra una columna de desalación HiPrep 26/10 (100 mm) con disolución de NaCl 0,1 M (10 ml/min.) y se aplicó el

10 hidroxietilalmidón funcionalizado con yodoacetilo (volumen inyectado de 10 ml). Se aplicaron las fracciones de yodoacetil-HES reunidas a la columna de desalación HiPrep 26/10 equilibrada con agua y volvieron a aplicarse las fracciones reunidas en las mismas condiciones a la columna. Se liofilizó el producto puro y se determinó indirectamente la cantidad de yodoacetilo mediante cuantificación de amina con ácido 2,4,6-trinitrobencenosulfónico tal como se describió anteriormente. Se encontró que la cantidad de amina era de 1,65 nmol/mg correspondiente a

15 una cantidad de yodoacetilo de 32,37 nmol/mg (95%).

Ejemplo de referencia 18.3 Síntesis de maleimidoHES a partir de aminoHES del ejemplo 18.1

Se disolvieron 25 mg de amino HES (preparado tal como se describió en el ejemplo 18.1) con un contenido en

20 amino calculado de 29 nmolmg-1, en 450 !l de tampón de reacción (fosfato de sodio 0,1 M, NaCl 150 mM, EDTA 5,0 M, pH 7,0). Por separado, se disolvieron 9 mg de éster de N-[a-maleimidoacetoxi]succinimida (AMAS, Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A) en 200 !l de DMSO seco (Acros Organics BVBA, Geel, B). Se reunieron las dos disoluciones.

25 Se dejó la disolución final bajo agitación durante 100 min. a 22ºC y durante 20 min. adicionales a 40ºC. Entonces se diluyó la disolución resultante hasta 5 ml y se aplicó sobre una columna de desalación usando un sistema ÄKTA Explorer (Amersham Biosciences) con el fin de eliminar el AMAS, NHS y DMSO sin reaccionar.

Por tanto, se equilibró una columna de desalación HiPrep 26/10 (100 mm, Amersham Biosciences) con el tampón de

30 reacción (fosfato de sodio 0,1 M, cloruro de sodio 150 mM, EDTA 5 mM, pH 7,0) y se inyectó la disolución de maleimido-HES (volumen de inyección de 5 ml) y se fraccionó. Se eligieron los parámetros de purificación tal como sigue:

Columna: HiPrep 26/10 de desalación Velocidad de flujo: 10 ml/min. Eluyente: tampón fosfato de sodio 0,1 M,

cloruro de sodio 150 mM, EDTA 5 mM, pH = 7,0

Volumen de la muestra: 5,0 ml Fraccionamiento del eluato: 2,5 ml Equilibrado: 0,5 volúmenes de columna Longitud de la elución: 2,0 volúmenes de columna

35 Volvieron a inyectarse las fracciones de HES reunidas (7 ml) en las mismas condiciones para garantizar la ausencia de AMAS, NHS y DMSO en la disolución final. La segunda purificación produce 10 ml de maleimidoHES puro listo para el acoplamiento con alfalAT.

Después de eso, se concentró el polímero eluido hasta un volumen final de 250 !l en el mismo tampón.

40 Ejemplo de referencia 18.4a Reducción de alfa1AT con DL-ditiotreitol (DTT)

A una disolución de disolución de alfalAT (c (alfa1AT) = 5,0 mg en 0,5 ml de tampón fosfato de sodio 0,1 M, cloruro de sodio 150 mM, pH 7,2, alfalAT = rh alfalAT proporcionada por GTC Biotherapeutics Inc., Framingham, MA, n.º de

45 lote 080604A) se le añadieron 4 ml del tampón de reacción (tampón fosfato de sodio 0,1 M, cloruro de sodio 150 mM, EDTA 5 mM, pH = 7,0) y 68,77 mg de DTT (Sigma Taufkirchen, Alemania). Se incubó la mezcla a 20ºC durante 2 h y se purificó la proteína reducida mediante cromatografía de exclusión molecular (SEC) usando unsistema ÄKTA explorer (Amersham Biosciences). Por tanto, se equilibró una columna de desalación HiPrep 26/10 (100 mm, Amersham Biosciences) con disolución de tampón fosfato de sodio 0,1 M, cloruro de sodio 150 mM, EDTA

50 5 mM, pH = 7,0 y se aplicó la disolución de proteína reducida (volumen de inyección de 4,5 ml) y se fraccionó. Se eligieron los parámetros de purificación tal como se resume a continuación:

Columna: HiPrep 26/10 de desalación Velocidad de flujo: 10 ml/min. Eluyente: tampón fosfato de sodio 0,1 M,

cloruro de sodio 150 mM, EDTA 5 mM, pH = 7,0

Volumen de la muestra: 4,5 ml

Fraccionamiento del eluato: 2,5 ml

Equilibrado: 0,5 volúmenes de columna

Longitud de la elución: 2,0 volúmenes de columna

Volvieron a inyectarse las fracciones de proteína reunidas (8 ml) en las mismas condiciones para garantizar la ausencia de DTT en la disolución de proteína. La segunda purificación produce 10 ml de disolución de a1AT reducida pura con una concentración aproximada de 0,5 mg/ml y se usó para el acoplamiento con maleimido HES

5 tal como se describe en el ejemplo 18.5.

Ejemplo 18.4b Tratamiento previo de a1AT con clorhidrato de tris-(2-carboxietil)-fosfina (TCEP) y aislamiento de proteína que contiene tiol

10 Se trató de manera reciente alfalAT (GTC Biotherapeutics Inc., Framingham, MA, n.º de lote 080604A) con TCEP inmovilizada (Pierce 77712, 2 ml de suspensión de gel por mg de proteína) con el fin de reducir posibles enlaces disulfuro. Se preparó TCEP inmovilizada tal como se describe mediante la fabricación usando un tampón pH= 7,0 (fosfato de sodio 100 mM, cloruro de sodio 150 mM y EDTA 5 mM). Se realizó la reducción según las instrucciones del fabricante. Se incubó la proteína reducida con Sepharose activada con tiol (Amersham Biosciences 71-7106-00;

15 0,15 g de gel por mg de proteína) con el fin de unir covalentemente proteína que contiene tiol. Se lavó la proteína no unida con un tampón que contenía fosfato de sodio 100 mM, cloruro de sodio 150 mM y EDTA 5 mM, pH= 7 hasta que no podía detectarse proteína en el eluato. Para la detección de proteína se empleó un ensayo de BCA (Pierce). Se liberó la proteína unida a la columna usando un tampón pH = 7,0 (fosfato de sodio 100 mM, cloruro de sodio 150 mM y EDTA 5 mM) que contenía TCEP 20 mM.

20 Ejemplo de referencia 18.5 Preparación de conjugado de HES-alfa1AT a partir de maleimidoHES del ejemplo 18.3 por medio de acoplamiento con cisteína

Se añadieron 725 nmol de maleimidoHES (preparado tal como se describió en el ejemplo 18.3) en 250 !l de tampón

25 de reacción (fosfato de sodio 0,1 M, NaCl 150 mM, pH 7,0) a 1540 !l de una disolución de alfa1AT 0,5 mgml-1 en el mismo tampón. Se incubó previamente la proteína con DTT tal como se describe en el ejemplo T8/4a). Se agitó la reacción a 22ºC durante 18 h, entonces se detuvo congelando en nitrógeno líquido y se almacenó a -80ºC. Se analizó la mezcla de reacción mediante electroforesis en gel (véase la figura 43).

30 Ejemplo de referencia 18.6 Preparación de conjugado de HES-a1AT a partir de yodoacetamidoHES del ejemplo 18.2 por medio de acoplamiento con cisteína

Se disolvieron 96 mg de yodoacetamidoHES (preparado tal como se describió en el ejemplo 18.2) con un contenido en yodo calculado de 16 nmolmg-1, en 1,0 ml de tampón de reacción (carbonato de sodio 1,0 M, EDTA 2,0 mM, 35 pH 8,3) y 2,5 ml de agua destilada. Se mezclaron 500 !l de una disolución de alfalAT 3 mgml-1 (tratada previamente tal como se describió en el ejemplo 18.4b) en tampón fosfato de sodio 0,1 M, NaCl 150 mM (pH 7,0) con la disolución de polímero y finalmente se añadieron 500 !l de una disolución que contenía 7,2 mg de TCEP (Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, A) para producir una concentración final de 5 mM del agente reductor. Se dejó que avanzara la reacción con exclusión de luz y agitación, durante 18 h a temperatura ambiente. Después

40 de eso, se detuvo congelando en nitrógeno líquido y se almacenó a -80ºC.

Ejemplo de referencia 18.7 Purificación de conjugado de HES-alfa1AT preparado a partir de yodoacetamidoHES del ejemplo 18.2 por medio de acoplamiento con cisteína

45 Preparación de la muestra: intercambio de tampón en una columna de desalación HiPrep 26/10 (Amersham biosciences) en combinación con el sistema de cromatografía ÄKTA-Explorer usando fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 20 mM, pH 8 como eluyente. Se realizó el intercambio de tampón con la mezcla de reacción bruta (preparación tal como se describe en el ejemplo T8/6, aproximadamente 4 ml) usando los siguientes parámetros:

Columna: HiPrep 26/10 de desalación Velocidad de flujo: 10 ml/min. Eluyente: fosfato de sodio 20 mM,

cloruro de sodio 20 mM,

pH 8 Volumen de la muestra: 10 ml Fraccionamiento del eluato: 2,5 ml Equilibrado: 5 volúmenes de columna Longitud de la elución: 2 volúmenes de columna

Se agruparon las fracciones de desde 6 hasta 16 ml. Se eliminó el exceso de derivados de HES mediante IEC usando los siguientes parámetros:

Columna: HiTrap Q HP de 1 ml Velocidad de flujo: 1 ml/min. Tampón de unión (BB): fosfato de sodio 20 mM,

cloruro de sodio 20 mM, pH 8

Tampón de elución (EB): Fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 1 M, pH 8

Bucle vacío con: 12 ml Fraccionamiento de la fracción 2 ml no retenida: Fraccionamiento del eluato: 1 ml Concentración inicial de EB: 0 % Equilibrado: 5 volúmenes de columna Lavado de la muestra no unida: 15 ml Concentración objetivo de EB: 15 % Longitud del gradiente: 50 ml

5 Se recogieron las fracciones desde 43 hasta 73 ml y se concentraron hasta un volumen final de 10 ml mediante ultracentrifugación. Tras desalar tal como se describió anteriormente (volumen de la muestra de 10 ml, las fracciones recogidas contienen los primeros 14 ml), se realizó una segunda IEC para la separación del conjugado de la proteína no unida usando los siguientes parámetros:

10 Columna: HiTrap Q HP de 1 ml Velocidad de flujo: 1 ml/min. Tampón de unión (BB): fosfato de sodio 20 mM,

cloruro de sodio 20 mM,

pH 8 Tampón de elución (EB): fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 1 M, pH 8 Bucle vacío con: 15 ml Fraccionamiento de la fracción 2 ml no retenida: Fraccionamiento del eluato: 1 ml Concentración inicial de EB: 0 % Equilibrado: 1 volumen de columna Lavado de la muestra no unida: 2 ml Gradiente: 5-15 % Longitud del gradiente: 100 ml

Se recogieron las siguientes fracciones y se analizaron mediante SDS-Page (véase la figura 44):

A: 26 - 32 ml 15

B: 37 - 45 ml

C: 55 - 65 m

Claims (24)

1. REIVINDICACIONES

   1. Método para preparar un conjugado que comprende una proteína y un polímero, en el que el polímero es un hidroxialquilalmidón (HAS), comprendiendo el método introducir al menos un grupo funcional A, en el

   5 que A es un grupo carboxilo reactivo, en el polímero para dar un derivado de polímero haciendo reaccionar al menos un grupo hidroxilo del polímero cuyo extremo reductor no está oxidado, con un diéster carbónico para dar el grupo carboxilo reactivo A, y hacer reaccionar al menos un grupo funcional A del derivado de polímero con al menos un grupo funcional Z de la proteína y formar de ese modo un enlace covalente, en el que Z es un grupo amino y en el que la proteína se selecciona del grupo que consiste en IFN alfa, IFN beta, GM-CSF, APC, tPA, A1AT, AT III, factor VII, factor VIII y factor IX.
2. 2. Método según la reivindicación 1, en el que el hidroxialquilalmidón es hidroxietilalmidón.

3. 3.

   Método según la reivindicación 2, en el que el hidroxietilalmidón tiene un peso molecular de desde 2 hasta 15 200 kD, preferiblemente de desde 4 hasta 130 kD, más preferiblemente de desde 4 hasta 70 kD.

4. 4.

   Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el diéster carbónico es un diéster simétrico.

5. 5.

   Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el componente de alcohol del éster se selecciona del grupo que consiste en N-hidroxisuccinimida, N-hidroxisuccinimida sulfonatada, Nhidroxibenzotriazol y fenoles sustituidos con nitro y halógeno.

6. 6.

   Método según la reivindicación 5, en el que los fenoles sustituidos con nitro y halógeno se seleccionan del 25 grupo que consiste en nitrofenol, dinitrofenol, triclorofenol, trifluorofenol, pentaclorofenol y pentafluorofenol.

7. 7.

   Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la reacción del al menos un grupo hidroxilo del polímero cuyo extremo reductor no está oxidado con el diéster carbónico para dar un grupo éster reactivo A se lleva a cabo en un disolvente polar aprótico anhidro.

8. 8.

   Método según la reivindicación 7, en el que el disolvente es dimetilacetamida, dimetilformamida o una mezcla de las mismas.

9. 9. Conjugado tal como puede obtenerse mediante un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8. 35

10. 10.

    Conjugado según la reivindicación 9, en el que A es un grupo carboxilo reactivo, y en el que A se introdujo en el polímero cuyo extremo reductor no estaba oxidado, haciendo reaccionar al menos un grupo hidroxilo del polímero con un diéster carbónico, y en el que dicho conjugado que comprende una molécula de polímero y al menos una, en particular de desde 1 hasta 10 moléculas de proteína unidas al polímero mediante enlaces amida, y en el que la proteína se selecciona del grupo que consiste en IFN alfa, IFN beta, GM-CSF, APC, tPA, A1AT, AT III, factor VII, factor VIII y factor IX.

11. 11.

    Conjugado que comprende una proteína y un polímero o un derivado del mismo, en el que el polímero es

    un hidroxialquilalmidón (HAS) y la proteína se selecciona del grupo que consiste en IFN alfa, IFN beta, GM45 CSF, APC, tPA, A1AT, AT III, factor VII, factor VIII y factor IX, que tiene una estructura según la fórmula

    en la que el enlace -O-(C=O)- se formó mediante una reacción de un grupo carboxilo o un grupo carboxilo reactivo con un grupo hidroxilo de la molécula de HAS, y en la que HAS’’ se refiere a la molécula de HAS sin dicho grupo hidroxilo.

12. 12.

    Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal.

13. 13.

    Composición farmacéutica que comprende en una cantidad terapéuticamente eficaz un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11.

14. 14.

    Composición farmacéutica según la reivindicación 13, que comprende además al menos un diluyente, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable.

15. 15.

    Uso de un conjugado de HAS-proteína, preferiblemente un conjugado de HES-proteína, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que la proteína es IFN alfa, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de leucemia por ejemplo tricoleucemia, leucemia mielógena crónica, mieloma múltiple, linfoma folicular, cáncer, por ejemplo tumor carcinoide, melanoma maligno y hepatitis, por ejemplo hepatitis B crónica y hepatitis C crónica.

16. 16.

    Uso de un conjugado de HAS-proteína, preferiblemente un conjugado de HES-proteína, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que la proteína es IFN beta, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de esclerosis múltiple, preferiblemente formas recidivantes de esclerosis múltiple.

17. 17.

    Uso de un conjugado de HAS-proteína, preferiblemente un conjugado de HES-proteína, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que la proteína es GM-CSF, para la preparación de un medicamento para la reconstitución mieloide tras trasplante de médula ósea o quimioterapia de inducción en adultos más ancianos con leucemia mielógena aguda, fallo o retraso del injerto de trasplante de médula ósea, movilización y tras trasplante de células progenitoras de sangre periférica autólogas.

18. 18.

    Uso de un conjugado de HAS-proteína, preferiblemente un conjugado de HES-proteína, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que la proteína es APC, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de septicemia grave, trombosis, tromboembolia o enfermedades oclusivas, especialmente enfermedades arteriales oclusivas.

19. 19.

    Uso de un conjugado de HAS-proteína, preferiblemente un conjugado de HES-proteína, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que la proteína es tPA, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de infartos de miocardio (ataques al corazón), trombosis, tromboembolia o enfermedades oclusivas, especialmente enfermedades arteriales oclusivas.

20. 20.

    Uso de un conjugado de HAS-proteína, preferiblemente un conjugado de HES-proteína, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que la proteína es A1AT, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfisema, fibrosis quística, dermatitis atópica y/o bronquitis.

21. 21.

    Uso de un conjugado de HAS-proteína, preferiblemente un conjugado de HES-proteína, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que la proteína es AT III, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de deficiencia hereditaria, enfermedad venooclusiva, quemaduras y resistencia a la heparina en cirugía de injerto de derivación arterial coronaria (CABG), la prevención de la formación de microcoágulos asociada con terapia de ventilación, el tratamiento de perforación intestinal que resulta de traumatismo o cirugía gastrointestinal; coagulación intravascular diseminada (DIC) y/o septicemia.

22. 22.

    Uso de un conjugado de HAS-proteína, preferiblemente un conjugado de HES-proteína, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que la proteína es factor VII, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de episodios en pacientes con hemofilia A o B con inhibidores para el factor VIII o el factor IX.

23. 23.

    Uso de un conjugado de HAS-proteína, preferiblemente un conjugado de HES-proteína, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que la proteína es factor VIII, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de hemofilia A.

24. 24.

    Uso de un conjugado de HAS-proteína, preferiblemente un conjugado de HES-proteína, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que la proteína es factor IX, para la preparación de un medicamento para el control y la prevención de episodios hemorrágicos en pacientes con hemofilia B, preferiblemente deficiencia de factor IX congénita o enfermedad de Christmas, incluyendo el control y la prevención de hemorragia en entornos quirúrgicos.