CN1933857A - 羟烷基淀粉和蛋白质的偶联物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种羟烷基淀粉和蛋白质的偶联物，其中通过羟烷基淀粉或羟烷基淀粉的衍生物与蛋白质之间的共价键连接形成这些偶联物。本发明还涉及制备这些偶联物的方法以及这些偶联物的用途。
Description
技术领域
本发明涉及羟烷基淀粉和蛋白质的偶联物，其中通过羟烷基淀粉或羟烷基淀粉的衍生物同蛋白质之间的共价键连接形成这些偶联物。本发明也涉及制备这些偶联物的方法以及这些偶联物的用途。
背景技术
通常认为，当蛋白质与聚合的分子偶联时，可以改进这些蛋白质的稳定性，并且降低对这些蛋白质的免疫应答。WO94/28024公开了通过聚乙二醇(PEG)改性的生理活性蛋白质具有降低的免疫原性和抗原性，且在血流中较非偶联蛋白质循环的时间显著更长，也就是具有降低的清除率。
WO02/09766公开了其中通过生物活性蛋白质与生物相容性聚合物衍生物的偶联而制备的生物相容性蛋白质-聚合物化合物。所使用的生物相容性聚合物为高反应性的支化聚合物，并且所获得的偶联物在聚合物衍生物和蛋白质之间含有长的链接。作为生物相容性聚合物，描述了式(P-OCH2CO-NH-CHR-CO-)n-L-Qk-A的聚合物，其中P和Q为聚合物残基，且k可以为1或0。对于P和Q，列举了聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化乙烯、聚三亚甲基二醇、聚乳酸和其衍生物、聚丙烯酸和其衍生物、聚氨基酸、聚乙烯醇、聚氨酯、聚膦腈、聚(L-赖氨酸)、聚环氧烷烃、聚丙烯酰胺和水溶性聚合物如葡聚糖或多糖。作为蛋白质，其中列举了α、β和γ干扰素、血液因子、细胞因子如白细胞介素、G-CSF、GM-CSF。在WO02/09766的实施例中，仅仅公开了排他地与干扰素和表皮生成因子、和人生长激素偶联的单-、二-和三-聚乙二醇衍生物。
WO94/01483公开了通过特定类型的化学键将生物惰性聚合物或聚合物衍生物共价地结合到药用纯度的、合成的亲水性聚合物而形成的生物相容性聚合物偶联物。作为自然形成的聚合物和其衍生物，公开了多糖如透明质酸，蛋白多糖如硫酸软骨素A、B和C，甲壳质，肝素，硫酸肝素，葡聚糖如环葡聚糖，羟乙基纤维素，纤维素醚和淀粉，脂类如甘油三酯和磷脂。作为合成的聚合物，其中描述了平均分子量为约100～约100,000的聚乙烯和其衍生物。作为连接到聚合物或聚合物衍生物上的蛋白质，描述了细胞因子和生长因子，包括干扰素，肿瘤坏死因子，白介素，集落刺激因子，生长因子如成骨因子提取物、表皮生长因子、转化生长因子、血小板分裂生长因子、酸性成纤维细胞生长因子和其它因子。在WO94/01483的所有实施例中，使用了聚乙二醇的衍生物聚合物。
WO96/11953公开了N-末端化学修饰的蛋白质化合物和它们的制备方法。具体地，描述了G-SCF组合物，其通过将水溶性聚合物偶联到G-SCF的N末端而获得。在WO96/11953上下文中，也公开了N-末端偶联于水溶性聚合物的交感干扰素。虽然在WO96/11953中列出了多种水溶性聚合物(如乙二醇和丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊环、聚1，3，6-三氧杂环已烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、聚(n-乙烯基吡咯烷酮)、聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、或聚氧化乙基化多元醇)，但是在WO96/11953的实施例中仅仅描述了PEG化的G-CSF或交感IFN组合物。
WO97/30148涉及具有降低的变应原性的多肽偶联物，其包含两个或多个多肽分子偶联其上的聚合物载体分子。这些偶联物优选为用于人身护理市场中所用的组合物的一部分。所述偶联物通过活化聚合物载体分子，将两个或多个多肽分子同活化的聚合物载体分子反应，并将偶联物上残余的活性官能团封端来制备。作为聚合物载体分子，WO97/30148中列出了大量各种化合物，包括不同种类的类似天然或合成均聚物的化合物，如多元醇、聚胺、聚羧酸和包含至少两种不同附着官能团的杂聚物。给出的实例包括星形PEG、支化PEG、聚乙烯醇、聚羧酸酯、聚乙烯基吡咯烷酮和聚D、L-氨基酸。其中，也公开了葡聚糖如羧甲基葡聚糖，纤维素如羟乙基纤维素或羟丙基纤维素，壳聚糖的水解产物，淀粉如羟乙基淀粉或羟丙基淀粉，糖元，琼脂糖，瓜尔胶，菊糖，支链淀粉，黄原酸胶，角叉菜胶，果胶，海藻酸等。作为多肽，仅仅明确公开了一些酶。
Baldwin，J.E.等在Tetrahedron，vol.27(1981)，pp.1723-1726中描述了化学修饰葡聚糖和羟乙基淀粉以获得醛取代的聚合物，该聚合物能够与血红蛋白反应获得可溶的键合聚合物的血红蛋白。它们显示能够结合氧，但是心脏灌流实验清楚地表明键合聚合物的血红蛋白不适用于作为血液代用品。
WO99/49897描述了通过将多糖如葡聚糖或羟乙基淀粉与血红蛋白的氨基反应而形成的血红蛋白的偶联物。作为多糖的官能团，使用了通过氧化糖开环而制备的醛基。作为使用的优选还原剂，公开了硼烷二甲基胺。而且，WO99/49897仅限于血红蛋白。
WO03/074087涉及一种将蛋白质偶联于衍生自淀粉的改性多糖的方法。蛋白质与多糖、羟烷基淀粉之间的键合作用为共价键连接，其形成于末端醛基或由化学修饰所述羟烷基淀粉分子的末端醛基而获得的官能团与蛋白质官能团之间。作为蛋白质的反应性官能团，公开了氨基、巯基和羧基，但是并未提到蛋白质的醛基。而且，虽然以各种序列的形式给出了多种可能的不同链接，包括不同官能团、理论上合适的不同链接分子、和不同的化学工艺，但是实施例仅仅描述了两种替换方式：第一，使用了氧化的羟乙基淀粉，并且直接偶联于使用乙基二甲基氨基丙基碳化二亚胺(EDC)活化的蛋白质，或者使用非氧化的羟乙基淀粉，并且直接偶联于形成Schiff碱的蛋白质，然后它被还原成相应的胺。因而，WO03/074087的实施例既没有公开通过蛋白质的巯基或羧基而偶联的单一偶联物，也没有描述包含羟乙基淀粉、蛋白质和一种或多种链接分子的偶联物。
几乎全部关于将聚合物偶联于蛋白质的文献均描述了PEG化的方法和PEG化的蛋白质(如干扰素α和干扰素β)。尽管偶联方法和单官能PEG-分子的应用已有发展，但是PEG化药物的通常缺点是，作为非天然聚合物的PEG的新陈代谢路径在细节上并不清楚。
一些专利描述了通过氨基酸取代、增加的糖基化或形成多聚体而修饰干扰素的方法。这些方法需要较高的技术成果(组合的技术)，并且可能导致生成明显不同于天然蛋白质(如干扰素)的新物质，且可能显示不同的特性。
此外，现有技术也教导了，例如在IFN-β和多糖之间通过金属配位形成配合物。但是，配合物不如共价偶联物稳定，并且含有金属离子(如Zn2+)，可能具有不期望的负面影响。
发明内容
由此，本发明的目的是，克服这些偶联技术的上述缺陷，并且提供基于共价偶联于蛋白质的良好定义的、生物可降解的、水溶性聚合物的干扰素β偶联物。
本发明的另一目的是，克服这些偶联技术的上述缺陷，并且提供基于共价偶联于蛋白质的良好定义的、生物可降解的、水溶性聚合物的干扰素α偶联物。
本发明的另一目的是，克服这些偶联技术的上述缺陷，并且提供基于共价偶联于蛋白质的良好定义的、生物可降解的、水溶性聚合物的AT III偶联物。
本发明的另一目的是，克服这些偶联技术的上述缺陷，并且提供基于共价偶联于蛋白质的良好定义的、生物可降解的、水溶性聚合物的GM-CSF偶联物。
本发明的另一目的是，克服这些偶联技术的上述缺陷，并且提供基于共价偶联于蛋白质的良好定义的、生物可降解的、水溶性聚合物的A1AT和/或tPA和/或APC和/或因子VII和/或因子VIII和/或因子IX偶联物。
本发明的另一目的是，提供制备这些偶联物的方法。
因此，本发明涉及一种制备包含蛋白质同聚合物或其衍生物的偶联物的方法，其中聚合物为羟烷基淀粉(HAS)，该方法包括使聚合物或其衍生物的至少一个官能团A与蛋白质的至少一个官能团Z反应从而形成共价键，其中Z选自氨基、巯基、醛基和酮基，并且
-其中，当Z为醛基或酮基时，A包含一个氨基以与Z形成所述的键，蛋白质选自IFN-β、GM-CSF、APC、tPA、A1AT、AT III、因子VII、因子VIII和因子IX；
-其中，当Z为氨基时，A选自活性羧基和醛基、酮基或半缩醛基，且其中蛋白质选自IFN-α、IFN-β、GM-CSF、APC、tPA、A1AT、AT III、因子VII、因子VIII和因子IX；
--其中，当A为醛基、酮基或半缩醛基时，该方法进一步包括在聚合物中引入A以获得聚合物衍生物
---通过聚合物与一个至少双官能化合物反应，其一个官能团与聚合物反应，其至少另一个官能团为醛基、酮基或半缩醛基，或是进一步化学修饰后形成醛基、酮基或半缩醛基的官能团；或
---通过氧化聚合物获得至少一个，尤其是至少两个醛基；或
--其中，当A为活性羧基时，本方法进一步包括在聚合物中引入A以获得聚合物衍生物
-通过选择性氧化聚合物的还原末端并活化所得的羧基，或
---通过聚合物未氧化还原末端与碳酸二酯反应，或
-其中，当Z为巯基时，蛋白质选自IFN-α，IFN-β，tPA、A1AT因子VI和因子IX，并且A含有
--马来酰亚胺基或
--卤代乙酰基
与Z形成所述的键。
由此，本发明也涉及依据上述方法获得的偶联物。
可以依据本发明偶联得到的蛋白质可以表征如下：
干扰素是对病毒性感染和其它生物诱导物作出反应而调节抗病毒、抗增殖和免疫调节活动的细胞因子。与IFNα相对地，IFNβ是高度种特异性的。有两种子类型的IFNβ，IFNβ1a和IFNβ1b。在工业制备中，IFNβ1a和IFNβ1b之间的主要区别是它们用来生产的各自的细胞体系，结果是糖基化，和氨基酸的数目不同。IFNβ1a是由哺乳动物细胞产生的，并且得到指定的1a，因为其氨基酸序列与天然中的干扰素β相同。IFNβ1b是由细菌产生的。干扰素，与大多数哺乳动物蛋白一样，需要在翻译后进行糖基化修饰。由于细菌没有糖基化蛋白的能力，因此IFNβ1b不包含天然材料中存在的碳水化合物侧链。IFNβ1a有166个氨基酸，分子量为22500D，IFNβ1b有165个氨基酸，分子量为18,500D，这主要是由于在细菌生产方法中与糖基化一样，IFNβ1b中的N末端甲硫氨酸丢失。人类干扰素β的氨基酸序列已经被公开了，例如EP 0218 825 A1。干扰素β的晶体结构在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94(1997)pp 11813-11818，Biochemistry，Karpusas M，Nolte M，Benton CB，Meier W，Lipscomb WN，Goelz S.中已被报道，商业中制备的干扰素β是Betaseron(IFNβ1b)，Avonex和Rebif(IFNβ1a)。IFNβ1b是由具有包含有人干扰素βser17的遗传工程质粒的大肠杆菌株经细菌发酵而产生的。天然基因是从人成纤维细胞中得到的，并且以在17位以丝氨酸代替半胱氨酸残基这种方法来改变。IFNβ1a是根据植入人干扰素β基因的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的遗传工程由DNA重组技术产生的，IFNβ1a的氨基酸序列与从人干扰素β衍生的天然成纤维细胞相同。天然的干扰素β和干扰素β1a是糖基化的，并且每一个在Asn80都包含一个单一的N连接的复合碳水化合物部分。干扰素β药物具有治疗复发感染慢性多发性硬化症的作用。然而有很多与施用干扰素β药物产品相关的严重副作用。另外，注射用药(肌内或皮下)会引起附加的风险。降低其副作用和易于(例如较低频率)给药是为什么做了很多工作来提高IFNβ的性质的主要原因。蛋白质的聚合物修饰是应用于提高蛋白质性质的技术。所应用的最主要的技术是用聚乙二醇修饰干扰素，被称为PEG化(PEGylation)。
IFNα形式是由单核细胞/巨噬细胞、淋巴细胞、成纤细胞和由病毒、核苷酸、糖皮质激素和其他诱导因子诱导的一些不同类型的细胞自然产生的。IFNα至少已知有23种变种。各种的蛋白质分子量在19-26kD，包括长度为156-166或172个氨基酸的蛋白质。所有的IFNα亚型在156-166氨基酸位置之间都有一个普遍的保守序列区，但是氨基酸末端是可变的。很多IFNα亚型仅仅在序列中一、两个位置不同。在1/98和29/138的位置有二硫键形成。29/138处的二硫键对其生物活性是必须的，而1/98处的二硫键可以被还原而不影响其生物活性。所有的IFNα形式包含一个潜在的糖基化位点，但是多数亚型未被糖基化。IFNα在PH为2的环境下比IFNγ稳定。IFNα可以用遗传修饰的大肠杆菌进行工业化生产。因为细菌缺少糖基化蛋白的功能，用来改善药品的IFNα的两个变种(IFNα2a，和IFNα2b)全部都是非糖基化的。传统的IFNα的主要缺点是副作用。在改善用于治疗肝炎C的IFNα药物方面已经作了很多工作。蛋白质的聚合物修饰是一项用于提高蛋白质性质的技术。已用的主要的技术是用聚乙二醇修饰干扰素，即PEG化。两个商业上可得的IFNα的PEG化变体是PEGIntron(SP)和Pegasys(Roche)。
抗凝血酶III(AT III)是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，可以用来抑制凝血酶和因子Xa(Travis，Annu.Rev.Biochem.52：655，1983)。对因子Ixa、XIa、XIIa、tPA、尿激酶、胰岛素、纤维蛋白溶酶和激肽释放酶均有较低程度的抑制(Menache，Semin.Hematol.28：1，1991；Menache，Transfusion 32：580，1992；Lahiri，Arch.Biochem.Biophys.175：737，1976)。人AT III是一种在肝脏中合成的单链糖蛋白，有432个氨基酸，分子量大约为58.000D。它的正常的血浆浓度的范围是14-20mg/dL(Rosenberg，Rev.＝Hematol.2：351，1986；Murano，Thromb.Res.18：259，1980)。这种蛋白质含有两个二硫桥键(Cys 8-128，Cys 21-95，Cys 247-430)和四个N-连接碳水化合物链(Asn 96，-135，-155，-192)，它们占整个分子量的15％(Franzen，J.Biol.Chem.255：5090，1980；Peterson，The PhysiologicalInhibitions of Blood Coagulation和Fibrinolysis，Elsevier/North-Holland Biomedical Press 1979，p43)。抗纤维蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶抑制蛋白类型的丝氨酸蛋白酶抑制剂，它在控制血液凝结方面具有重要的作用。AT III是最丰富的内源性的抗凝血剂，它在人血液中循环，在生理和病理两种状态下参与调整血凝(Opal，Crit.CareMed.2002，30：325)。它以两种较弱凝血酶抑制作用的形式循环，(Pike，J.Biol.Chem.272：19562，1997；Ersdal-Badju，Fed.Proc.44：404，1985)(85-95％的具有4双触角(biantennary)单和二唾液酸化寡糖链的α对碘氧基苯甲醚，5-15％是具有高肝磷脂亲和性的β对碘氧基苯甲醚，在天冬酰胺135，2-6末端唾液酸键未羰基化)。一小部分的循环的AT III通常在血管内皮细胞表面与蛋白聚糖结合。这些蛋白聚糖主要是类肝素硫酸盐，其分子结构与肝素相似，与肝素一样也能催化凝血酶的抑制作用。与肝素的良好定义的五糖单元结合的AT III可以引起蛋白质的构象的变化(Choay，Ann.NY Acad.Sci.370：644，1981；Choay，Biochem.Biophys.Res.Commun.116：492，1983；Olson，J.Biol.Chem.266：6353，1991；Bauer，Semin.Hematol.28：10，1991；Carell，Thromb.Haemost.78：516，1997)。这种结合物可以催化AT III对凝血酶和因子Xa的抑制能力，使其提高100倍。(Rosenberg，Fed.Proc.44：404，1985；Bjork，Antithrombin and related inhibitors of coagulation proteinases in Barett，Salvesen(eds.)：Proteinase Inhibitors，vol 17，Amsterdam，TheNetherlands Elsevier Science Publishers(Biomedical Devision)1986 p489；Olson，J.Biol.Chem.267：12528，1992)。位于一般产生内源性凝血连锁酶的内皮表面的AT的一部分可以使AT III快速的中和这些止血酶，并且防止固有的表面形成血栓。因此，AT III在预防血栓形成中的主要性能就是它能与催化剂肝素结合的能力，经过构象的变化来改变它的抑制性质，不可逆转的与凝血酶或因子Xa结合并且抑制它们的活性。AT III还具有抗炎性质，可能是由于其在凝血连锁中的作用(Roemisch，Blood Coagul Fibrinolysis.2002，13：657)，活化的血凝固蛋白酶象激活因子X，凝血酶可能与炎症有关，例如通过释放促炎介质。这些酶通过AT III的抑制作用阻止了它们与细胞的特异相互作用和并发反应(Roemisch，Blood Coagul Fibrinolysis.2002，13：657)。AT III的不依赖于血凝固的抗炎性质包括直接与细胞作用导致释放例如前列腺环素。AT III与最近鉴定的细胞受体-多配体聚糖4结合，可以导致与由介质如脂多糖诱导的细胞内信号的干扰，因而对炎症反应出现下行性调节(Roemisch，Blood Coagul Fibrinolysis.2002，13：657)。除了对游离的AT III的结构进行分析外，已经开展了很多研究用来估测肝素的低聚糖单元的络合位点，这主要是因为由AT III的生理功能导致的肝素-AT III复合物的重要性(Choay，Ann.NYAcad.Sci.370：644，1981；Choay，Biochem.Biophys.Res.Commnun.116：492，1983；Olson，J.Biol.Chem.266：6353，1991；Bauer，Semin.Hematol.28：10，1991；Carell，Thromb.Haemost.78：516，1997)。AT III可以用传统的人血浆分馏技术来制备。利用肝素对AT III的高亲和性和高温细菌灭活的的亲和色谱法(肝素-琼脂糖)来实现从血浆中的分离。近来制备AT III更多的选择是重组生产技术，这种技术提供了一种更安全的途径来获得这种治疗蛋白(Levi，SeminThromb Hemost 27：405，2001)。ATrynTM是一种重组人AT III(rh ATIII)，是由Genzyme Transgenics Corp(GTC)通过转基因山羊得到的。在比较由血浆得到的AT III(ph AT III)和rh AT III的功能性质和结构方面已经做了详细的研究(Edmunds，Blood，91：4561，1998)。实验表明，rh AT III与ph AT III的结构除了糖基化以外基本相同。转基因产品材料在天冬酰胺155处有低聚甘露糖结构，然而是在血浆衍生蛋白中检测到的复杂结构。在pd AT III中的一些半乳糖单位在rhAT III中被N-乙酰半乳糖胺单位取代。另一个不同点是rh AT III中高程度的岩藻糖基化。最后，这两种蛋白质的唾液酸化作用模式是两种不同的途径：rh AT III被较低程度的唾液酸化，并且包含N-乙酰基-和N-乙醇酰神经氨酸(glycolylneuramin acid)。这种在两个分子中的碳水化合物部分的结构的差异导致了其生物化学特性的不同。在欧洲医院产品中已有下述AT III药物(Source：IMS-ATC group 2001)：Kybemin(AventisBehring)，AT III(Baxter，Grifols)，Atenativ(Pharmacia)，Aclotine(LFB)，Grifols(Anbin)。
因子VII参与蛋白水解酶的内在凝血级联系统并且通过激活凝血级联的外在途径提高止血作用。F VII通过蛋白质的次级水解而被因子Xa，因子XIIa，因子IXa，或者凝血酶修饰成因子VIIa。在有凝血激酶和钙离子的时候，通过限定的蛋白质水解作用，因子VIIa使因子X转变成因子Xa。在有钙和凝血激酶的时候因子VIIa也可以使因子IX转变成因子IXa。因子VII是一个维生素k依赖的糖蛋白，包含有406个氨基酸残基(MW 50K Dalton)。因子VII也是传统的从捐赠的人血浆中提取或者用近来的重组系统得到的。NovoNordisk用幼鼠的肾(BHK)细胞来生产NovoSeven_。它是一种含有406个氨基酸标称分子重55kDa的单链的蛋白质(Thim，L.etal.，Biochemistry 27：7785-7793(1988)。分子含有四个碳水化合物侧链，两个以O相连的碳水化合物侧链在Ser 52，60，两个N相连的碳水化合物侧链在Asn 145，322(Thim，L.et al.，Biochemistry 27：7785-7793(1988)。
因子VIII参与蛋白酶的内部的凝血级联系统，在因子IXa使因子X转变成活性形式的因子Xa的反应中起辅助因子的作用，因子Xa最终导致纤维蛋白凝块的形成。因子VIII的缺乏稳定性的性质可以导致A型血友病，这是一种常见的隐性x-联锁的血凝固障碍。A型血友病在所有种族间的发生率是每10000个男性新生儿就有1-2个。病人表现出因子VIII水平低于正常或者属于所谓的crm(交叉反应材料)阳性的患者(大约有5％的病人)，这种病人在血浆中有相当数量的因子VIII(至少标准水平的30％)，但是这种蛋白质是没有功能的。大约有50％的病人具有严重的血友病，其中因子VIII的活性低于正常的1％；他们经常性的在关节，肌肉和内脏自发出血。
在病人中的发病率是30-40％的轻度血友病A与正常的人5-30％的活性有关。其出血仅仅在重创或者外科手术后。较严重的血友病在病人中的发生率是10％，其中因子VIII的活性仅是正常人的2-5％，在不严重的创伤后就可流血。
因子VIII在人体内的半衰期通常是10-15小时，但必须注意到其释放、稳定性和降解动力学也受到另一因子van Willebrand因子的影响。
因子VIII也是传统的从捐赠的人血浆中提取或者用近来的重组系统得到。Bayer用幼仑鼠肾(BHK)细胞来生产重组抗血友病因子，而Baxter利用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞用于产品重组。具有正常分子量为267kDa(Toole et al.，1984，Nature 312：342)，由2351个氨基酸组成的整个单链蛋白质，或者以不同的方式，整个B-区域或者其一部分被删除来生产更稳定的产品和获得较高的产量(Bhattacharyyaet al.2003，CRIPS 4/3：2-8)。前体产品在Golghi中被处理成分子量为200kDa和80kDa的两个多肽链，在血液中这两个肽链通过金属离子结合在一起(Kaufman et al.，1988，J.Biol.Chem.，263：6352)。
促凝血剂活性还需要凝血酶裂解，重链裂解成54kDa和44kDa的片段，加上72kDa的轻链片段。(Aly et al.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA：4933)。在从人血浆中得到的因子VIII浓缩剂中，公开了几个具有完整活性的因子VIII形式的碎片(Anderson et al.，1986，Proc.Natl.Acad，Sci.83：2979)。
血浆或重组的因子VIII给药后有一个普遍的副作用是在很多病人(高达30％)中出现免疫反应，这也使其失去了治疗价值。在过去，开始了很多尝试口服诱导耐受性使病人耐受，但结果并不是都令人满意。新的通过遗传方法来诱导耐受性的方法已经被提出了，但没有被广泛的应用。羟乙基化(hesylated)蛋白质预期有较低程度的免疫原性因而能够降低这种并发症。
赖氨酸残基中有丰富的因子VIII(在2350个氨基酸中有超过220个；见附图1)，这可以用于还原氨基化的方法。
因子IX是一种维生素K依赖的血浆蛋白，它通过在Ca2+离子、磷脂类、因子VIIIa存在下把因子X转变成它的活性形式参与血液凝固的内在途径。因子IX是一种糖蛋白，分子重55,000Da，一个单链含有415个氨基酸(Yoshitake S.et al.，Biochemistry 24：3736-3750(1985))。因子IX也是传统的从捐赠的人血浆中提取或者用近来的重组系统得到。Wyeth用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞来生产BeneFIX_.。它具有和从血浆中得到因子IX的等位基因Ala148相同的基本氨基酸序列，其结构和功能性质也与内源性的因子IX结构和功能性质相似。该蛋白质含有8个碳水化合物侧链。6个以O连接的碳水化合物侧链在Ser 53，61和Threonine 159，169，172，179，2个以N连接的碳水化合物侧链在Asn 157，167(Yoshitake S.et al.，Biochemistry 24：3736-3750(1985)；Ball和A.et al.，Eur J Biochem.1988；172(3)：565-72)。
人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)是用于调整和分化造血祖细胞和刺激成熟细胞群的功能性活动所必需的早期作用因子，它可以在酵母、细菌、昆虫、植物和哺乳动物细胞中克隆和表达，产生的蛋白质在结构、组成、血清半衰期和体内功能均有不同(Donahue，R.E.；Wang，E.A.；Kaufman，R.J.；Foutch，L.；Leary，A.C.；Witek-Giannetti，J.S.；Metzeger，M.；Hewick，R.M.；Steinbrink，D.R.；Shaw，G.；Kamen，R.；Clark，S.C.Effectsof N-linked carbohydrates on the in vivo properties of humanGM-CSF.Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.1986，51，pp.685-692)。天然的和从哺乳动物细胞中得到的hGM-CSF是一种含有127个氨基酸的蛋白质，既含有N-又含有O-多聚糖。由于其一或两个N-糖基化位点和O-糖基化位点所占据的状态不同而具有很高的差异性(Cebon，J.；Nicola，N.；Ward，M.；Gardner，I.；Dempsey，P.；Layton，J.；Dürhrsen，U.；Burgess，A.；Nice，E.；Morstyn，G.Granulocyte-macrophage colony stimulatiμg Factor from humanlymphocytes.The effect of glycosylation on receptor binding andbiological activity.J；Biol.Chem.1990，265，4483-4491；Kaushansky，K.；O′Hara，P.J.；Hart，C.E.；Forstran，J.W.；Hagen，F.S.Role of carbohydrate in the function of humanGranulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor.Biochemistry1987，26，pp.4861-4867；Armitage，J.O.；Emergi ng applicationsof recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulatingFactor.Blood 1998，92，pp.4491-4508)。淋巴因子由于其潜在的治疗髓细胞性白血病的作用和刺激免疫缺陷或受疾病或辐射或/和化学疗法压抑的病人中粒细胞和巨噬细胞增生而具有临床价值(reviewedby Moonen，P.；Mermod，J.J.；Ernst，J.F.；Hirschi，M.；DeLamarter，J.F.Increased biological activity of deglycosylatedrecombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factorproduced by yeastor animal cells.Proc.Natl.Acad.Sci.US.1987，84，pp.4428-4431)。很多研究表明与天然的重组细胞因子相比，缺少N-连接碳水化合物的hGM-CSF在体外具有显著的高特异活性(Armitage，J.O.；Emerging applications of recombinant humangranulocyte-macrophage colony-stimulating Factor.Blood 1998，92，pp.4491-4508；Okamoto，M.；Nakai，M.；Nakayama，C.；Yanagi，H.；Matsui，H.；Noguchi，H.；Mild，M.；Sakai，J.；Kadota，K.；Fukui，M.；Hara，H.Purification and characterization of threeforms of differently Glycosylated recombinant humanGranulocyte-Macrophage Colony-Stimulatiμg Factor.Arch.Biochem.Biophys.1991，286，pp.562-568；Hovgaard，D.；Mortensen，B.T.；Schifter，S.；Nissen，N.1.Clinical pharmacokinetic studiesof a human haemopoietic growth Factor，GM-CSF.Eur.J Clin.Inv.1992，22，pp.45-49)。然而有很多证据支持hGM-CSF功能中碳水化合物侧链的关键作用，如药物代谢动力学(Cebon，J.；Nicola，N.；Ward，M.；Gardner，I.；Dempsey，P.；Layton，J.；Dürhrsen，U.；Burgess，A.；Nic e，E.；Morstyn，G.Granulocyte-macrophagecolony stimulatiμg Factor from human lymphocytes.The effect ofglycosylation on receptor binding andbiological activity.J Biol.Chem.1990，265，pp.4483-4491；Hovgaard，D.；Mortensen，B.T.；Schifter，S.；Nissen，N.I.Clinical pharmacokinetic studies of ahuman haemopoietic growth Factor，GM-CSF.Eur.J.Clin.If2v.1992，22，pp.45-49；Denzliμger，C.；Tetzloff，W.；Gerhartz，H.H.，Pokorny，R.；Sagebiel，S.；Haberl，C.；Wilmanns，W.differentialactivation of the endogenous leukotriene biosynthesis by two differentpreparations of Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor inhealthy volunteers.Blood 1993，81，pp.2007-2013)毒性(Denzlinger，C.；Tetzloff，W.；Gerhartz，H.H.，Pokorny，R.；Sagebiel，S.；Haberl，C.；Wilmanns，W.differential activation ofthe endogenous leukotriene biosynthesis by two different preparations ofGranulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor in healthyvolunteers.Blood 1993，81，pp.2007-2013)以及免疫原性(Donahue，R.E.；Wang，E.A.；Kaufman，R.J.；Foutch，L.；Leary，A.C.；Witek-Giannetti，J.S.；Metzeger，M.；Hewick，R.M.；Steinbrink，D.R.；Shaw，G.；Kamen，R.；Clark，S.C.Effects of N-linkcarbohydrates on the in vivo properties of human GM-CSF.Cold SpringHarbor Symp.Quant.Biol.1986，51，pp.685-692；Revoltella，R.；LaricchiaRobbio，L.；Moscato，S.；Genua，A.；Liberati，ANatural and therapy-induced anti-GM-CSF and anti-G-CSF antibodies inhuman serum.Leukemia and Lymphoma 1997，26，pp.29-34；Ragnhammar，P.；Friesen，H-J.；Fr_din，J-E.；Lefvert，A-K.；Hassan，M.；_sterborg，A.；Mellstedt，H.Induction ofanti-recombinant human Granulocyte-Macrophage Colony-StimulatingFactor(Escherichia coli-derived)antibodies and clinical effectsinnonimmunocompromised patients.Blood 1994，84，pp.4078-4087；Wadhwa，M.；Hjelm Skog，A-L.；Bird，C.；Ragnhammar，P.；Lilljefors，M.；Gaines-Das，R.；Mellstedt，H.；Thorpe，R.Immunogenicity of Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulatiμg Factor(GM-CSF)products in patients undergoing combination therapy withGM-CSF.Clinical Cancer Research 1999，5，pp.1351-1361；Gribben，J.G.；Devereix，S.；Thomas，N.S.B.；Keim，M.；Jones，H.M.；Goldstone，A.H.；Linch，D.C.Development of antibodiesto unprotected glycosylation sites on recombinant GM-CSF.Lancet1990，335，pp.434-437)。考虑到抗原血(症)，其由于从大肠杆菌和酵母中得到的GM-CSF临床产物而被频繁地报道，建议用化学修饰的策略是对于该产品是一个有前途的方法，包括从非哺乳动物表达系统制备的那些。GM-CSF制剂可以由Leucine(Immunex)和Leucomax(Novartis)获得。GM-CSF制剂可以用于骨髓重建，下述的骨髓移植、骨髓移植入失败或延缓、松动述和下述的自体外周血液祖细胞的移植和下述的患有髓细胞性白血病的老年人的化学治疗感应。
α1-抗胰蛋白酶(A1AT，也可以被称为α1-蛋白酶抑制剂)是一种蛋白酶抑制因子，其已经显示可以实际上抑制所有的哺乳动物丝氨酸蛋白酶(TravisAnn.Rev.Biochem.52(1983)p.655)包括嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、凝血酶、因子Xa和XIa。A1AT是一种单链的糖蛋白，在肝脏中合成，包括394个氨基酸，分子量为53kD。其血浆浓度在1-1.3g/l的范围之内。由于整个蛋白质分子中只有一个半胱氨酸，因此不能形成分子内的二硫桥键。分子中含有3个碳水化合物侧链(Asn 46，83，247)(MegaJ：Biol.Chem.255(1980)p.4057；MegaJ：Biol.Chem.255(1980)p.4053；Carell FEBS Letters 135(1981)p.301；Hodges Biochemistry 21(1982)p.2805)，占分子量的12％。已经发现两种类型的碳水化合物侧链分别是双或三触角型结构(Hodges，J.Biol.Chem.254(1979)p.8208)。在总的人群中，人A1AT以至少20种不同的类型存在。这种微异样性(micro-heterogenicity)是由两种类型的糖侧链的量的变化造成的。关键功能是对嗜中性粒细胞弹性蛋白酶活性的控制(Travis Ann.Rev.Biochem.52(1983)p.655)。不受控制的弹性蛋白酶活性将造成对上皮组织的攻击并产生不可修复的损坏。在活性钝化过程中，A1AT作为底物结合到蛋白酶的活性中心，从而通过复合物的形成使得该蛋白酶的活性被钝化。A1AT的缺失将导致肺气肿，而这是和肺上皮组织的损坏相关的。对每个A1AT异种型来说，A1AT的两种类型的糖侧链在A1AT的三个N糖基化位点上的分布都是不同的。典型的生产A1AT的方法是通过用不同的亲和层析柱对人血浆进行分级分离。但是，一个更现代的生产A1AT的方法是通过重组技术PPL Therapeutic已经开发了一种可以从转基因羊的奶中回收重组人A1AT(rHA1AT)的方法(Olman Biochem.Soc.Symp.63(1998)p.141；Tebbutt Curr.Opin.Mol.Ther.2(2000)p.199；CarverCytotechnology 9(1992)p.77；Wright Biotechnology(NY)9(1991)p.830)。已经证明rhA1AT的蛋白质部分和pdA1AT的结构完全相同。但是，从其它重组人蛋白质的情况看来，糖侧链仍然是有差别的，特别是在唾液酸残基的含量上是有差别的。
组织型血纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)是一种胰蛋白酶样的丝氨酸蛋白酶，它对血液凝块的溶解是很重要的。在血纤维凝块存在时，tPA转化为血纤维蛋白溶酶，它降解血纤维。在血纤维存在时，tPA的活性增强，从而导致血纤维特异的血纤维蛋白溶酶原活化(M.W.Spellman，L.J.Basa，C.K.Leonard，J.A.，Chakel，J.V.O’Connor，TheJournal of Biological Chemistry 264(1989)p.14100)。血纤维蛋白溶酶溶解血纤维并产生降解产物。通过一个正反馈机制，血纤维通过刺激tPA介导的血纤维蛋白溶酶原的活化，从而增强了自身的降解((R.J.Setwart et al The Journal of Biological Chemistry 275(2000)pp.10112-10120)。htPA是一种纤维降解的生理活性剂，它存在于不同的组织中。它是一种糖蛋白，分子量大约为68KD。天然的tPA是单链型的(单链组织型血纤维蛋白溶酶原激活剂，sctPA)，它可以通过在Arg275和Ile276之间的肽键的切开从而转化为双链的(双链组织型血纤维蛋白溶酶原，tctPA)。为了治疗血纤维溶解，人们生产了重组的rtPA(重组组织型血纤维蛋白溶酶原激活剂)。不同类型的tPA在糖链结构上都不同。I型tPA在氨基酸Asn117，Asn184和Asn448上都有N连接的寡糖。IItPA在Asn117和Asn448处糖基化。两种类型都在残基Thr61处有一个O连接的海藻糖(K.Mori et.al.The Journalof Biological Chemistry 270(1995)pp.3261-3267)。研究在CHO-细胞中表达tPA的碳水化合物的结构表明糖链中有各种各样的二、三、四-触角的结构(M.W.Spellman，L.J.Basa，C.K.Leonard，J.A.Chakel，J.V.O′Connor，The Journal of Biological Chemistry 264(1989)p.14100)。tPA的一级结构包括几个半胱氨酸，它们加上一个在83位的游离的半胱氨酸残基被认为是交联的，它们与另一个tPA相互作用形成一个二聚体。一些结果表明tPA的体内清除受碳水化合物的结构的影响，尤其是连在Asn 117位点的高位甘露糖寡糖。提出的另一种清除机制包括通过在肝细胞上的一个高亲和受体识别在Thr61处O连接的岩藻糖残基。这个残基靠近Cys83。已经发展了生物工程tPA(TNK-tPA)来延长半衰期。通过用谷氨酰胺取代117位点的天(门)冬酰胺和用天(门)冬酰胺取代103位点的苏氨酸，117位的糖基化位点转移到103位。由于位于蛋白酶结构域的四-丙氨酸取代，TNK-tPA可以通过纤溶酶原活化因子抑制剂1来抵抗活性钝化(R.J.Stewart et.al.The Journal of Biological Chemistry 275(2000)pp.10112-10120)。TNK-tpA作为替奈普酶(Tenecteplase_)(BoehringerIngelheim)上市，作为静脉注射的大丸剂可以单独给药，而tPA作为大丸剂给药必须伴随冷浸剂。
激活蛋白C(APC)是一种严重败血病伴随的凝固和发炎的调节剂。激活蛋白C是通过连接到血栓调节蛋白上的凝血酶从它的失活前体(蛋白c)转变来的。该复合物分开了蛋白质C活性重链的N末端肽，得到活化的蛋白质C。Drotrecoginα(活化的)是一个人重组的激活蛋白C(rhAPC)，它与源于血浆的激活蛋白C(rhAPC)具有相同的氨基酸序列，并且具有相似的性质。激活蛋白C是作为Xigris_由Eli Lilly上市的。它在人细胞系(HEK293)中产生，并且引入了蛋白C的表达型载体。这个特殊细胞序列由于其执行功能活性所需要的复合物翻译后修饰的正确序列而被应用。重组人激活蛋白C是一种包含4个N-糖基化位点和12个二硫键的2链糖蛋白。其中重链包含250个氨基酸，其中有7个残基是半胱氨酸，并且有3个N末端的糖基化位点(Asn-248，Asn-313和Asn-329)。在重链中这7个半胱氨酸残基形成3个二硫键，其中一个二硫键位于链之间。轻链包含一个N末端糖基化位点(Asn-97)和17个半胱氨酸残基，它们在轻链中形成8个二硫键，一个二硫键与重链相连。轻链中前9个谷氨酸被γ羧化(Gla)的，天冬氨酸71被β羟基化。rhAPC与源于人血浆的激活蛋白C有相同的氨基酸序列，但是后者的糖基化类型不同。激活蛋白C是一种属于丝氨酸蛋白酶家族的蛋白酶，在调节凝固中起主要作用。活化的蛋白C的抗凝血作用是基于其抑制凝血酶作用的能力。另外，活化的蛋白C也是一种严重败血症伴随炎症的重要调节剂。内源性的丝氨酸蛋白酶抑制剂是活化的蛋白C的天然抑制剂，它使活化蛋白C在体内的循环活性半衰期非常短(少于30分钟)。活化的蛋白C从循环中的清除是由至少三个过程联合来介导的，包括通过内源性蛋白酶抑制剂来抑制活化蛋白C的酶活性，从肝和肾等器官中清除活化的蛋白C和/或活化的蛋白C-丝氨酸蛋白酶抑制剂的复合物，以及活化的蛋白C和/或活化的蛋白C-丝氨酸蛋白酶抑制剂复合物被循环或组织蛋白酶的降解。以24μg/kg/h灌输24小时，第一阶段临床研究的结果是保持70ng/ml的稳定的血浆浓度。rhAPC的半衰期在注入结尾处测量为0.5-1.9小时。血浆中rhAPC浓度在注入终止后2个小时降低到10μg/ml的检测限以下。由于其较短的生理和药物代谢动力学上的半衰期，活化的蛋白C在临床上治疗败血症时必须以一定的速度注入以保证要求的血浆浓度。对于改善活化蛋白C的药物代谢分布(图)已经作了一些努力，例如D.T.Berg等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100(2003)pp.4423-4428，公开了所设计的具有较长血浆半衰期的活化蛋白C的变种。
在本发明中，术语″羟烷基淀粉″(HAS)是指被至少一个羟烷基基团取代的淀粉衍生物，本发明中优选的羟烷基淀粉具有式(I)所示的结构
其中淀粉分子的还原端是非氧化的形式，糖单位的末端是缩醛形式，这种状态依赖如溶剂状态下可以和乙醛形式达到平衡。
本发明中用到的术语羟烷基淀粉并非局限于所公开的碳水化合物部分含有羟烷基R1，R2，和/或R3的化合物，为了简约，在式(I)中，还指这样的化合物，其中无论在末端碳水化合物部分和/或淀粉分子的剩余部分HAS′的任何位置上，至少一个羟基被羟烷基基团R1、R2或R3取代。
包含两个或多个不同的羟烷基基团的羟烷基淀粉也是可能的。
包含在HAS中的至少一个羟烷基基团也可能包含两个或多个羟基基团。根据一个优选实施方案，HAS中包含的至少一个羟烷基基团包含一个羟基基团。
“羟烷基淀粉”也包括其中的烷基是单或多取代的衍生物。在这种情况下，优选烷基被卤素尤其是氟取代，或者被芳基取代。此外，羟烷基基团的末端羟基可以被酯化和醚化。
此外，除了烷基，也可以采用直链的或支链的、取代或未被取代的烯烃基团。
羟烷基化淀粉是淀粉的醚衍生物。在本发明中，除了所说的醚衍生物以外，还可以采用其他的淀粉衍生物。例如，包含酯化羟基基团的衍生物。这些衍生物可以是例如未被取代的2-12个碳原子的单或二羧酸的衍生物，或者其取代衍生物。特别有用的是未被取代的2-6个碳原子的一元羧酸，尤其是乙酸的衍生物。在这种情况下，优选乙酰基淀粉、丁酰基淀粉和丙酰基(propinoyl)淀粉。
此外，优选具有2-6个碳原子的未被取代的二羧酸。
在二羧酸衍生物的情况，二羧酸的第二个羧基也被酯化是有用的。另外，在本发明中也可以用二羧酸的单烷基酯衍生物。
对于取代的一元或二元羧酸，取代基优选与上述取代的烷基残基相同的那些。
淀粉的酯化工艺是本领域公知的(参见例如.Klemm D.et al，Comprehensive Cellulose Chemistry Vol.2，1998，Whiley-VCH，Weinheim，New York，especially chapter 4.4，esterification ofCellulose(ISBN 3-527-29489-9)。
根据发明优选的实施方案，采用根据式(I)的羟烷基淀粉。
在式(I)中，明确公开的糖环和表示为HAS′的残基一起代表优选的羟烷基淀粉分子。其它包含在HAS′中的糖环结构可以与明确公开的糖环相同或不同。
根据式(I)，对于式(I)中的残基R1、R2和R3没有特殊的限制。根据优选的实施方案，R1，R2和R3独立地是氢或羟烷基，羟芳基，羟芳烷基或羟烷芳基，上述基团在各烷基残基中有2-10个碳原子，或(CH2CH2O)n-H基团，其中n是整数，优选1、2、3、4、5或6。优选氢和具有2-10个碳原子的羟烷基，更优选含有2-6个碳原子的羟烷基，更优选含有2到4个碳原子，更优选从2到4个碳原子。“羟烷基淀粉”因此优选包含羟乙基淀粉、羟丙基淀粉、羟丁基淀粉，其中更优选羟乙基淀粉和羟丙基淀粉，最优选羟乙基淀粉。
烷基、芳基、芳烷基和/或烷芳基可以是线性的或分支的并可任选适当的被取代。
因此，本发明也涉及上面公开的方法，其中R1，R2和R3独立地是氢或线性的或分支的含有从1到6的碳原子的羟烷基。
因此，R1，R2和R3优选羟己基，羟戊基，羟丁基，羟丙基如2-羟丙基、3-羟丙基、2-羟基异丙基，羟乙基如2-羟乙基，更优选氢和2-羟乙基。
羟乙基淀粉(HES)在本发明所有的实施方案中是最优选的。
因此，本发明涉及上面公开的方法和偶联物。其中聚合物为羟乙基淀粉，聚合物的衍生物是羟乙基淀粉衍生物。
羟乙基淀粉(HES)是天然存在的支链淀粉的衍生物，在体内被α淀粉酶降解。HES是碳水化合物聚合物支链淀粉的取代衍生物，存在于玉米淀粉中，含量高达95％重量。HES显示有利的生物学性质，可以用作血容量替换剂和用于临床上的血液稀释疗法(Sommermeyer etal.，1987，Kranlcenhauspharmazie，8(8)，271-278；and Weidleret al.，1991，Arzneim.-Forschung/Drug Res.，41，494-498)。
支链淀粉包含葡萄糖部分，其中在主链中存在α-1，4-糖苷键，分支点是α-1，6-糖苷键。其分子的物理和化学性质主要由糖苷键的类型决定。由于其凹口形的α-1，4-糖苷键，产生了每个拐点包含6个葡萄糖苷单体的螺旋结构。聚合物的物理、化学性质和生物化学性质可以通过取代而被修饰。通过碱性的羟乙基化反应可以引入羟乙基。就羟乙基化反应来说，通过改变反应条件可以充分未取代的葡萄糖单体中各个羟基的不同反应性。基于这样的事实，有经验的人可以不同程度地影响取代模式。
HES主要通过分子量分布和取代程度来表征。描述取代程度有两种方式：
1.相对所有的葡萄糖部分而言，取代程度与取代葡萄糖单体的那部分相关。
2.取代程度可以描述为摩尔的取代，其中描述为每葡萄糖部分中羟乙基的数目。
在本发明的实施方式中，取代程度，以DS来表示，是指摩尔取代，就像前面所述(也可参见Sommermeyer et al.，1987，Krankeiihauspharmazie，8(8)，271-278，as cited above，in particularp.273)。
HES溶液作为多分散性的组合物存在，其中从聚合程度、分支位点的类型和数量和取代的类型来看，每一个分子都与其他的分子不同。HES因此是不同分子量的化合物的混合物。结果，利用统计的方法计算平均分子量可以确定具体的HES溶液。在这种情况下，取决于分子的数目，Mn作为算术平均数来计算。可替代地，重量平均数Mw(或MW)代表取决于HES质量的单位。
根据本发明的实施方案，羟乙基淀粉优选平均分子量(重均)为从1到300kD。羟乙基淀粉可进一步优选摩尔取代程度为0.1到3，优选0.1到2，更优选0.1到0.9，优选0.1到0.8，相对于羟乙基基团，C2∶C6优选比率在从2到20的范围内。
本发明中用到的术语“平均分子量”是指根据LALLS-(小角激光散射)-GPC方法决定的分子量，该方法记载在Sommermeyer等，1987，Krankenhauspharmazie，8(8)，271-278；和Weidler等，1991，Arzneim.-Forschung/Drug Res.，41，494-498。另外，对于10kD或更小的平均分子量，通过一个事先已用LALLS-GPC证明合格的标准来进行校正。
根据本发明优选的实施方案，所用的羟乙基淀粉的平均分子量是从1到300kD，优选从2到200kD，较优选从3到100kD，更优选从4到70kD。
具有平均分子量大约130kD的HES的一个例子是取代程度为0.2到0.8，如0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7或0.8的HES，其中优选0.4到0.7，如0.4、0.5、0.6或0.7。
具有平均分子量大约130kD的HES的一个例子是来自Fresenius的Voluven_。Voluven_是一种人造胶体，用作治疗和预防低血容量症的治疗指征所用的容积替代。Voluven_的特征是平均分子量为130,000+/-20,000D，摩尔取代程度为0.4，和C2∶C6比率约为9∶1。
此外，本发明还涉及到方法和前面提到的偶联物，其中羟烷基淀粉是平均分子量从4到100kD，优选4到70kD的羟乙基淀粉。
优选的平均分子量的范围是如：4到70kD或10到70kD或12到70kD或18到70kD或50到70kD或4到50kD或10到50kD或12到50kD或18到50kD或4到18kD或10到18kD或12到18kD或4到12kD或10到12kD或4到10kD。
根据本发明特别优选的实施方案，所用的羟乙基淀粉的平均分子量的范围是在大于4kD低于70kD的范围。例如大约10kD，或者在范围9到10kD或10到11kD或9到11kD，或大约12kD，或在范围11到12kD或12到13kD或11到13kD，或大约18kD，或在范围17到18kD或从18到19kD或从17到19kD，或大约30kD，或在范围从29到30，或从30到31kD，或大约50kD，或在范围从49到50kD或从50到51kD或从49到51kD。
至于摩尔取代程度(DS)的上限，可以为上限至3.0的值，如0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9或2.0都是可能的，优选低于2.0，较优选值低于1.5，值低于1.0的如0.7、0.8或0.9是更优选的。
因此，摩尔取代程度的范围优选从0.1到2或从0.1到1.5或从0.1到1.0或从0.1到0.9或从0.1到0.8.摩尔取代程度的范围更优选从0.2到2或从0.2到1.5或从0.2到1.0或从0.2到0.9或从0.2到0.8。摩尔取代程度的范围更优选从0.3到2或从0.3到1.5或从0.3到1.0或从0.3到0.9或从0.3到0.8。摩尔取代程度的范围更优选从0.4到2或从0.4到1.5或从0.4到1.0或从0.4到0.9或从0.4到0.8。
就取代程度(DS)而言，DS优选至少0.1，更优选至少0.2，更优选至少0.4。DS的优选范围是0.1到0.8，更优选从0.2到0.8，更优选从0.3到0.8甚至更优选从0.4到0.8，更优选从0.1到0.7，更优选从0.2到0.7，更优选从0.3到0.7更优选从0.4到0.7。DS的特别优选值是如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7或0.8，更优选0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7或0.8，更优选0.3、0.4、0.5、0.6、0.7或0.8，更优选0.4，0.5，0.6，0.7或0.8。尤其优选0.4和0.7。
在本发明中，给定的摩尔取代程度，例如0.8可以是确切值，或者可以理解为在范围0.75到0.84。因此，例如，给定值0.1可能是确切值0.1，或者在从0.05到0.14的范围，给定值0.4可能为确切的0.4，或在范围从0.35到0.44，或者给定值0.7可能为确切值0.7或在范围0.65到0.74。
羟烷基淀粉，优选羟乙基淀粉，其分子量和取代程度DS的尤其优选组合为，例如10kD和0.4或10kD和0.7或12kD和0.4或12kD和0.7或18kD和0.4或18kD和0.7或30kD和0.4或30kD和0.7，或50kD和0.4或50kD和0.7或100kD和0.7。
就C2∶C6取代的比率而言，所述取代优选范围为从2到20，更优选的范围从2到15，更优选的范围从3到12。
根据本发明的进一步的实施方案，使用的羟乙基淀粉的混合物有不同的平均分子量和/或不同的取代程度和/或不同的C2∶C6取代比率。因此，使用的羟乙基淀粉的混合物具有不同的平均分子量和不同的取代程度和不同的C2∶C6取代比率，或者具有不同的平均分子量和不同的取代程度和相同的或大约相同的C2∶C6取代比率，或具有不同的平均分子量和相同的或大约相同的取代程度和不同的C2∶C6取代比率，具有相同的或大约相同的平均分子量和不同的取代程度和不同的C2∶C6取代比率，具有不同的平均分子量和相同的或大约相同的取代程度和相同的或大约相同的C2∶C6取代比率，具有相同的或大约相同的平均分子量和不同的取代程度和相同的或大约相同的C2∶C6取代比率，具有相同的或大约相同的平均分子量和相同的或大约相同的取代程度和不同的C2∶C6取代比率，具有相同的或大约相同的平均分子量和相同的或大约相同的取代程度和相同的或大约相同的C2∶C6取代比率。
根据本发明不同的偶联物和/或不同的方法，使用不同的羟烷基淀粉，优选不同的羟乙基淀粉和/或不同的羟烷基淀粉混合物，优选不同的羟乙基淀粉混和物。
根据本发明的一个实施方案，蛋白的官能团Z是醛基或酮基。因此，本发明涉及上述方法和偶联物，其中，蛋白质的Z官能团是醛基或酮基。
虽然对于蛋白质中的醛基或酮基的位置没有一般的限制，但根据本发明的优选实施方案，醛基或酮基位于蛋白质的碳水化合物侧链。因此，在该实施方案的情况下使用了糖基化蛋白。
作为糖基化蛋白，IFNβ糖基化形式优选如天然的人IFNβ或IFNβ1a，天然的或真核细胞来源的包含N末端和O末端多糖的hGM-CSF，重组人活性蛋白C(rllAPC)为包含4个糖基化位点的2-链糖蛋白，人tPA(htPA)或重组人tPA(rhtPA)，如在氨基酸Asn117，Asn184和Asn448处有N-连接寡糖的I型tPA，或者在Asn117和Asn448处被糖基化的II型tPA，血浆衍生的A1AT或人重组的A1AT(pdA1AT或rhA1AT)，重组人AT III(rhAT III)，因子VII，因子VIII和因子IX。
IFNβ的糖基化形式优选AT III和GM-CSF。
在本发明中，术语“糖基化蛋白”，即具有“碳水化合物侧链”的蛋白是指包含碳水化合物部分如羟基醛或羟基酮，以及其化学修饰产物(参见R_mpp Chemielexikon；Thieme Verlag Stuttgart，Germany，9th edition 1990，Volume 9，pages 2281-2285以及其中引用的文献)。此外，也指天然产生的碳水化合物片断的衍生物，如半乳糖、N-乙酰神经氨(糖)酸和N-乙酰半乳糖胺及其类似物的衍生物。
在更优选的实施方案中，醛基或酮基是碳水化合物侧链的半乳糖残基。半乳糖残基可以与包含在聚合物或聚合物的衍生物中的官能团A反应，该反应通过切除末端的唾液酸，进而氧化来实现，就像下面所述。
在更优选的实施方案中，包含官能团A的聚合物或聚合物的衍生物与碳水化合物侧链的唾液酸残基相连，优选碳水化合物侧链的末端唾液酸残基。
末端碳水化合物部分的氧化可以通过化学的或酶的方法完成。
多肽碳水化合物部分的化学氧化方法在本领域中是公知的并且包括用高碘酸盐处理(Chamow et al.，1992，J.Biol.Chem.，267，15916-15922)。
通过化学氧化，原理上可以氧化任何一个碳水化合物部分，末端的或非末端的。然而，通过选择温和的反应条件，优选氧化碳水化合物侧链的末端唾液酸来得到醛或酮基团也是可能的。
根据本发明的一个实施方案，所说的温和反应条件是指通过适合的高碘酸盐水溶液与蛋白质的反应，优选的高碘酸盐的浓度范围在1到50mM，更优选约1-约25mM，尤其优选约1-10mM，如大约1mM，优选的反应温度是从0到40℃特别优选0到21℃如0℃，优选的反应时间从5分钟到5个小时，优选10分钟到2小时特别优选10分钟到1小时如大约1小时。高碘酸盐∶蛋白质的优选的摩尔比率是从1∶200到1∶1，优选从1∶50到1∶5如15∶1。
因此，本发明也指上述方法和偶联物，其中，在蛋白质和聚合物或聚合物的衍生物的反应之前，糖基化的蛋白与高碘酸盐溶液反应，然后得到氧化的碳水化合物侧链含有醛基或酮基的蛋白质，所说的反应优选在温和的氧化反应条件下进行。用在这种情况下的术语“温和的反应条件”是指如1mM的高碘酸盐溶液和0℃的反应温度，对应的剧烈条件是指10mM的高碘酸盐溶液和反应温度20到25℃。
选择性的，碳水化合物侧链可以酶促氧化，氧化单个碳水化合物侧链的酶在本领域是公知的，如氧化半乳糖的酶是半乳糖氧化酶。如果试图氧化末端的半乳糖部分，必须除去末端的唾液酸(部分的或全部的)，如果能够把唾液酸连到碳水化合物链上的细胞已经产生了多肽，如哺乳动物细胞，或者经过遗传上的修饰能够把唾液酸连到糖链上的细胞。用化学的或酶促的方法除去唾液酸在本领域是公知的(Chaplin和Kennedy(eds.)，1996，Carbohydrate Analysis：a practicalapproach，especially Chapter 5Montreuill，Glycoproteins，pages175-177；IRL Press Practical approach series(ISBN 0-947946-44-3))。
根据本发明的另一个优选的实施方案，醛基或酮基可位于蛋白质的N末端并可通过适当的氧化获得。尤其是当包含羟基的氨基酸位于蛋白质的N末端的1位置时，如苏氨酸或色氨酸，所说的N末端的氨基酸的氧化产生所述的酮基或醛基，优选醛基。任何可能的方法都可以应用，氧化优选高碘酸盐，优选温和的氧化环境。
根据本发明进一步优选的实施方案，所说的温和的反应条件是指合适的高碘酸盐水溶液与蛋白质反应，优选的浓度范围是1到50mM，更优选从1到25mM，特别优选1到10mM如大约1mM，优选的反应温度从0到40℃，特别优选0到21℃如0℃，优选的反应时间是5分钟到5小时，更优选10分钟到2小时特别优选从10分钟到1小时如1小时。优选的高碘酸盐∶蛋白质的摩尔比率是从1∶200到1∶1，更优选从1∶50到1∶5，如大约15∶1。
因此，本发明也涉及到上述方法和偶联物，其中醛基和酮基位于蛋白质的碳水化合物侧链和/或蛋白质的N末端基团。
产生在真核细胞因而已被翻译后糖基化的蛋白的低聚糖形式不同于源于人的蛋白质。此外，很多糖基化蛋白质不具备能掩盖深层碳水化合物部分如半乳糖残基的所需数目的唾液酸残基。那些深层的碳水化合物部分如半乳糖残基如果没有被掩盖，其不利之处在于将会有可能缩短可能作为药用蛋白的蛋白质的血浆半衰期。已惊奇地发现，通过提供羟烷基淀粉聚合物形成的蛋白偶联物，优选羟乙基淀粉聚合物，它例如通过下面提到的肟键被共价键连接到蛋白质的碳水化合物侧链的碳水化合物部分，这种连接是直接的或通过至少一个连接的化合物如一个或两个连接的化合物，这样可以克服至少上述缺点。因此，通过把羟烷基淀粉聚合物或其衍生物优选羟乙基淀粉聚合物或其衍生物，结合到糖基化蛋白的至少一个碳水化合物侧链上，就可以弥补碳水化合物侧链上缺少合适的碳水化合物残基的不足。根据本发明的另一个方面，通过将羟烷基淀粉的聚合物或其衍生物，优选羟乙基淀粉聚合物或其衍生物，结合到如上所述未氧化的碳水化合物部分上提供相应的偶联物，，不仅弥补了不足，还提供了在所需领域使用的比天然产生的蛋白质性质具有较好特性的蛋白质偶联物。
因此，根据本发明，相应的偶联物能对蛋白质有辅助作用甚至增效作用。即使与人的蛋白质相同的蛋白质或者人的蛋白质也没有达到合适的掩盖末端碳水化合物残基如在天然产生的碳水化合物部分的唾液酸残基所要求的数目。在这种情况下，通过将羟烷基淀粉聚合物或其衍生物，其中优选羟乙基淀粉聚合物或其衍生物，同上述氧化的糖蛋白结合提供相应的偶联物，不仅克服和弥补了人工生产的蛋白的缺点，还改善了天然生成的蛋白质的特性。至于被结合到蛋白质的氧化碳水化合物部分部分的醛基或酮基上的羟烷基淀粉的官能团，优选羟乙基淀粉或其衍生物，可以参考以下公开的官能团A。该一般概念不仅应用于糖基化的G-CSF，而且原则上可应用于所有缺少末端碳水化合物残基的糖基化蛋白。其他的也提到了促红细胞生成素(EPO)，干扰素β1a(IFNβ1a)，ATIII，因子VIII，α1-抗胰蛋白酶(A1AT)，htPA，或GM-CSF。
因此，本发明还涉及羟烷基淀粉优选羟乙基淀粉或其衍生物的用途，通过将淀粉或其衍生物共价结合到具有至少一个醛基或酮基的蛋白质的至少一个氧化的碳水化合物部分上，在自然发生的或蛋白质的翻译后连接的碳水化合物部分，弥补末端碳水化合物残基优选唾液酸残基的缺失。
依据本发明，也涉及通过将羟烷基淀粉优选羟乙基淀粉或衍生物共价结合到具有至少一个醛基或酮基的蛋白质的至少一个氧化的碳水化合物部分上，优选通过肟键连接，在自然发生的或翻译后连接的蛋白的碳水化合物部分弥补末端糖残基优选唾液酸残基的缺失的方法，。
此外，本发明还涉及通过将羟烷基淀粉优选羟乙基淀粉或其衍生物共价连接到蛋白质的至少一个氧化碳水化合物部分所形成的偶联物，所说的蛋白质既有从自然界中分离得到的又有真核细胞表达产生的，如哺乳动物细胞，昆虫或酵母细胞，所说的碳水化合物部分有至少一个酮基或醛基，其中在所需领域中的用途，优选作为药物的用途中，偶联物具有与相应未修饰的蛋白质相同或更好的特性。
关于蛋白质的官能团Z是醛基或酮基，聚合物或其衍生物的官能团A包含具有-NH-结构的氨基。
因此，本发明也涉及上面描述的方法和偶联物，其中官能团A能够与聚合物的任意的氧化还原末端反应，并且根据结构-NH-包含具有-NH-结构的氨基。
根据本发明的优选的实施方案，官能团A是一个具有R′-NH-结构的基团，其中R′是氢或烷基，环烷基、芳基、芳烷基，芳基环烷基，烷芳基或环烷芳基残基，这里环烷基，芳基，芳烷基，芳基环烷基，烷芳基或环烷芳基残基可以直接与NH基团相连或根据另一个实施方案可以与NH基团通过氧桥相连。烷基，环烷基，芳基，芳烷基，芳基环烷基，烷芳基，或环烷芳基残基可以被适当的取代。作为优选的取代基，有卤素如F，Cl或Br。更优选的残基R′是氢，烷基和烷氧基，更优选的是氢和未取代的烷基和烷氧基。
在烷基或烷氧基基团中，优选含有1、2、3、4、5、或6个碳原子的基团。
更优选的基团是甲基，乙基，丙基，异丙基，甲氧基，乙氧基，丙氧基，和异丙氧基。尤其优选的基团是甲基，乙基，甲氧基，乙氧基，特别优选的基团是甲基或甲氧基。
因此，本发明也涉及上面所说的方法和偶联物，其中R′是氢或甲基或甲氧基基团。
根据本发明的另一个优选的实施方案，官能团A具有R′-NH-R″的结构，其中R″优选包含结构单元-NH-和/或结构单元-(C＝G)-其中G是O或S，和/或结构单元-SO2-。根据更优选的实施方案，官能团R″选自以下基团：
其中，如果G出现两次，它独立地为O或S。
因此，优选的包含氨基-NH2的官能团A是例如
H2N-
其中
G是O或S，如果出现两次，则独立地为O或S，R′是甲基。
尤其优选的包含氨基的官能团A是氨氧基
尤其优选H2N-O-，和肼基
其中G优选为O。
因此，本发明也涉及上面描述的方法，其中蛋白质的官能团Z是醛基或酮基，官能团A是氨氧基或肼基。根据本发明尤其优选的实施方案，A是氨氧基。
因此，本发明也涉及偶联物，如上面所描述的，其中蛋白质的官能团A是醛基或酮基，官能团A是氨氧基或肼基。根据本发明的尤其优选的实施方案，A是氨氧基。
当聚合物或聚合物衍生物的氨氧基与蛋白质的醛基或酮基反应时，形成肟键。
因此，本发明也涉及到上述偶联物，其中在蛋白质和聚合物或聚合物衍生物之间的共价键是由蛋白质的官能团Z同聚合物或聚合物衍生物的官能团A反应得到的肟键，所述官能团Z是醛基或酮基，所述官能团A是氨氧基。
当聚合物或聚合物衍生物的肼基与蛋白质的醛基或酮基反应时，形成腙键。
因此，本发明也涉及到上述偶联物，其中蛋白质和聚合物或聚合物衍生物之间的共价键是由蛋白质的官能团Z同聚合物或聚合物衍生物的官能团A反应形成的腙键，所述官能团Z是醛基或酮基，所述官能团A是肼基。
为了向聚合物中引入官能团A，并无特殊限定，仅需聚合物衍生物产物中含有官能团A即可。
根据本发明的一个实施方案，通过聚合物与至少双官能团化合物反应将官能团A引入聚合物，双官能团化合物的一个官能团能与聚合物的至少一个官能团反应，至少双官能团化合物的至少另一个官能团是官能团A或能通过化学修饰产生官能团A。
根据进一步的优选的实施方案，聚合物与至少双功能团化合物在其任意的氧化还原末端反应。
如果聚合物与其非氧化还原末端反应，聚合物优选具有以下结构：
其中在式(I)中，包括非氧化还原末端的醛基。
如果聚合物与其氧化的还原末端反应，根据式(IIa)聚合物优选具有式(IIa)的结构
和/或根据式(IIb)的结构
聚合物优选羟乙基淀粉的还原末端的氧化，可以根据能够产生具有上述式(IIa)和/或式(IIb)结构的化合物的各种方法或方法的组合来完成。
尽管可以根据所有的适合方法或能产生羟烷基淀粉的氧化还原末端的方法来完成氧化，但是优选使用所述的碱性碘溶液来完成，例如DE 196 28 705 A1，在此引入其相应内容(实施例A，第9栏，第6-24行)作为参考。
至于能与聚合物的任意的氧化还原末端反应的至少双功能团化合物的官能团，可以使用能与羟烷基淀粉的任意氧化还原末端形成化学键的官能团。
根据本发明的优选的实施方案，该官能团含有化学结构-NH-。
因此，本发明也涉及上述方法和偶联物，其中至少双功能团化合物的官能团包含结构-NH-，所述官能团能与聚合物的任意的氧化还原末端反应。
根据本发明一个优选的实施方案，至少双功能团化合物的官能团是具有R′-NH-结构的基团，其中R′是氢或烷基，环烷基，芳基，芳烷基，芳基环烷基，烷芳基或环烷芳基残基，其中环烷基，芳基，芳烷基，芳基环烷基，烷芳基或环烷芳基残基可以直接连在NH基团上或根据另一个实施方案通过氧桥连到NH基团上。烷基，环烷基，芳基，芳烷基，芳基环烷基，烷芳基，或环烷芳基残基可以被适当取代。作为优选的取代基，提到了卤素如F，Cl或Br。更优选的残基R′是氢，烷基和烷氧基，更优选的是羟基和未被取代的烷基和烷氧基基团。
在烷基和烷氧基基团中，优选含有1、2、3、4、5或6个碳原子的基团。更优选的基团是甲基、乙基、异丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基，和异丙氧基。尤其优选的是甲基、乙基、甲氧基、乙氧基，特别优选甲基和甲氧基。
因此，本发明也涉及到上述方法和偶联物，其中R′是氢或甲基或甲氧基。
根据本发明中的另一个优选的实施方案，至少双功能团化合物的官能团具有R′-NH-R″的结构，这里R″优选包含结构单元-NH-和/或结构单元-(C＝G)-，其中G是O或S，和/或结构单元-SO2-。根据更优选的实施方案，官能团R″是选自以下基团：
，这里，如果G出现两次，它独立地为O或S。
因此，本发明也涉及上述方法和偶联物，其中至少双功能团化合物的官能团，所述官能团能与聚合物的任意的氧化还原末端，从以下
H2N-
的基团中选择的，其中G是O或S，并且，如果出现两次，则独立地为O或S，R′是甲基。
根据本发明更优选的实施方案，至少双功能团化合物的官能团，所述官能团能与聚合物的任意的氧化还原末端反应并且包含一个氨基，是氨氧基基团
尤其优选H2N-O-，或肼基
其中G优选O。
因此，本发明也涉及到上述方法和偶联物，其中蛋白质的官能团Z是醛基或酮基，至少双功能团化合物的官能团是氨氧基或肼基，优选氨氧基，所述官能团能与聚合物的任意的氧化还原末端反应。
因此，本发明也涉及到上述偶联物，其中蛋白质的官能团Z是醛基或酮基，至少双功能团化合物的官能团是氨氧基或肼基，优选氨氧基，所述官能团能与聚合物的任意的氧化还原末端反应。
根据本发明进一步的实施方案，至少双功能团化合物与聚合物的非氧化还原末端反应。
根据本发明另一个优选的实施方案，能够与聚合物的任意的氧化还原末端反应的至少双功能团化合物包含官能团A。
至少双功能团化合物与聚合物反应首先得到聚合物的衍生物，这个衍生物进而通过官能团A与蛋白质反应。至少双功能团化合物通过官能团A与蛋白质反应也是可以的，并且首先得到蛋白质衍生物，该衍生物进而通过包含在蛋白质衍生物中的至少双功能团化合物残基的至少一个官能团与聚合物反应。
根据本发明的优选的实施方案，至少双功能团化合物首先与聚合物反应。
因此，本发明涉及上面所说的方法和偶联物，所说的方法进一步包括在聚合物的非氧化还原末端与至少双官能团化合物反应，至少双官能团化合物包含有可以与聚合物的非氧化还原末端反应的官能团和基团A，在反应前聚合物衍生物包含A，蛋白质包含Z。
本发明中所用的术语“聚合物(或HAS)通过还原末端反应”或“聚合物(或HAS)通过选择性氧化还原末端反应”是指聚合物(或HAS)主要通过其(选择性氧化的)还原末端反应的过程。
术语“主要通过其(选择性氧化的)还原末端”是指反应过程，根据它的统计数据为多于50，优选至少55％，更优选至少60％，更优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％如95％、96％、97％、98％或99％的假定的反应中所用的羟烷基淀粉分子是通过每聚合物(或HAS)分子至少一个(选择性氧化的)还原末端来反应的，其中给定的通过至少一个还原末端反应的聚合物(或HAS)分子可以在相同的给定反应中通过至少一个更适合的官能团反应，这个官能团包含在所说的聚合物(或HAS)分子中，并且不是还原末端。如果一个或更多的聚合物(或HAS)分子通过至少一个还原末端反应，同时通过至少一个更适合的官能团反应，这种官能团包含在这(些)聚合物(或HAS)分子中并且不是还原末端，数据统计优选大于50％，优选至少55％，更优选至少60％，更优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少95％如95％、96％、97％、98％或99％的这(些)聚合物(或HAS)分子的所有反应的官能团是还原末端，所述官能团包括还原末端。
本发明中使用的术语“还原末端”指聚合物(或HAS)分子的末端醛基，它可以作为醛基和/或相应的缩醛形式存在。当还原末端被氧化时，醛基或缩醛基团是羧基和/或相应内酯的形式。
与聚合物反应的至少双官能团化合物的官能团和与蛋白质的官能团Z反应的至少双官能团化合物的官能团A可以被任何适当的间隔基隔开。其中，间隔基可以是任选取代的、线性的、分支的和/或环形的碳氢化合物残基。通常的，碳氢化合物残基是最多60，优选最多40，更优选最多20，更优选最多10，更优选最多6，尤其优选最多4个碳原子。如果存在杂原子，这个间隔基团包含通常从1到20，优选从1到8，更优选从1到6，更优选从1到4，尤其优选从1到2个杂原子。作为杂原子，优选O。碳氢化合物残基可能包含任选分支的烷基链或芳基基团或含有如从5到7个碳原子的环烷基，或是芳烷基，烷芳基，其中烷基部分可以是线性的和/或环状的烷基基团。根据本发明的更优选的实施方案，官能团被含有4个碳原子的线性碳氢化合物链间隔开。根据本发明的另一个优选的实施方案，官能团被含有4个碳原子和优选至少一个一个杂原子尤其优选氧原子的线性的碳氢化合物链间隔开。
根据进一步优选的实施方案，至少双官能团化合物是一个同双功能团键合化合物。因此，本发明也涉及产生上述偶联物的方法，其中至少双官能团化合物是一个同双官能团化合物。
因此，考虑到上述键合化合物的优选官能团，所说的同双功能团键合化合物优选包含两个氨氧基H2N-O-或两个氨氧基R′-O-NH-或两个肼基H2N-NH-(C＝G)-，其中优选氨氧基H2N-O-和肼基H2N-NH-(C＝O)-，尤其优选氨氧基H2N-O-。
在所有想到的包含有两个肼基H2N-NH-(C＝O)-的同双官能团化合物中，优选酰肼，其中两个肼(hydazido)基团被含有最多60，优选最多40，优选最多20，优选最多10，优选最多6，尤其优选最多4个碳原子的碳氢化合物残基分隔开。
碳氢化合物残基更优选的具有1到4个碳原子如1、2、3或4个碳原子。碳氢化合物残基最优选含有4个碳原子。因此，优选根据下式的同双官能团化合物。
在上述蛋白质的醛基或酮基同包含两个肼基H2N-NH-(C＝O)-的化合物反应的实施例中，特别优选的羟乙基淀粉是例如：羟乙基淀粉具有平均分子量大约10kD和DS大约0.4，更可能的是例如：羟乙基淀粉具有平均分子量大约10kD和DS大约0.7，或羟乙基淀粉具有平均分子量大约18kD和DS大约0.4，或羟乙基淀粉具有平均分子量大约50kD和DS大约0.4，或羟乙基淀粉具有平均分子量大约50kD和DS大约0.7，或羟乙基淀粉具有平均分子量大约12kD和DS大约0.4，或羟乙基淀粉具有平均分子量大约12kD和DS大约0.7，或羟乙基淀粉具有平均分子量大约18kD和DS大约0.7，或羟乙基淀粉具有平均分子量大约30kD和DS大约0.4，或羟乙基淀粉具有平均分子量大约30kD和DS大约0.7，或羟乙基淀粉具有平均分子量大约50kD和DS大约0.4，或羟乙基淀粉具有平均分子量大约50kD和DS大约0.7，或羟乙基淀粉具有平均分子量大约100kD和DS大约0.7。
至于每一个平均分子量和DS的组合，优选DS大约0.8。
根据本发明的更优选的实施方案，双功能团键合化合物是碳酰肼
在上面所述的蛋白质的醛基或酮基与碳酰肼反应的实施方案中，尤其优选的羟乙基淀粉是例如具有平均分子量大约10kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉。也有可能如羟乙基淀粉具有平均分子量大约10kD和DS大约0.7，或羟乙基淀粉具有平均分子量大约18kD和DS大约0.4，或羟乙基淀粉具有平均分子量大约50kD和DS大约0.4，或羟乙基淀粉具有平均分子量大约50kD和DS大约0.7，或羟乙基淀粉具有平均分子量大约12kD和DS大约0.4，或羟乙基淀粉具有平均分子量大约12kD和DS大约0.7，或羟乙基淀粉具有平均分子量大约18kD和DS大约0.7，或羟乙基淀粉具有平均分子量大约30kD和DS大约0.4，或羟乙基淀粉具有平均分子量大约30kD和DS大约0.7，或羟乙基淀粉具有平均分子量大约50kD和DS大约0.4，或羟乙基淀粉具有平均分子量大约50kD和DS大约0.7，或羟乙基淀粉具有平均分子量大约100kD和DS大约0.7。
至于每一个平均分子量和DS的组合，优选DS大约0.8
像上面所述，本发明涉及上面所述的方法和偶联物，其中至少双官能团化合物是同双官能团键合化合物并且包含两个氨氧基。因此，本发明也涉及上述方法和偶联物，其中至少双官能团化合物是同双官能团键合化合物并且包含两个氨氧基H2N-O-。
如上所述，聚合物优选在其反应前未被氧化的还原末端同双功能团键合化合物反应。因此，包含两个氨氧基H2N-O-的优选的同双官能团化合物同聚合物反应产生含有肟键的聚合物衍生物。
因此，由于蛋白质的官能团Z是优选与聚合物衍生物的氨氧基反应的醛基或酮基，本发明也涉及到上述偶联物，所说的偶联物包含聚合物和蛋白质，每个都通过肟键或环状缩醛胺键与键合化合物共价连接。
在所有的考虑到的包含有两个氨氧基H2NO-的同双官能团化合物，优选两个氨氧基被碳氢化合物残基分隔开的双官能团化合物，所述碳氢化合物残基含有从1到60优选从1到40更优选从1到20更优选从1到10更优选从1到6尤其优选从1到4碳原子。最优选含有1到4个碳原子如1、2、3或4个碳原子的碳氢化合物残基。甚至更优选含有至少一个杂原子更优选一个杂原子最优选氧原子的碳氢化合物残基。尤其优选根据式
的化合物O-[2-(2-氨氧基-乙氧基)-乙基]羟氨。
因此，本发明涉及上述偶联物，所述的偶联物具有下式结构
HAS′优选是HES′的化合物。特别优选的羟乙基淀粉是例如具有平均分子量大约10kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约10kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约12kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约12kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约18kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约18kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约30kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约30kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约50kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约50kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约100kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉。
至于每一个平均分子量和DS的组合，优选DS大约0.8。
在上面所述的蛋白质的醛基或酮基与聚合物或其衍生物的羟氨基反应的实施方式中，特别优选的羟乙基淀粉是例如，或具有平均分子量大约10kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉或，具有平均分子量大约10kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约18kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约50kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约50kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉。羟乙基淀粉也可以是例如具有平均分子量大约12kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约12kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约18kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约30kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约30kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约50kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约50kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约100kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉。
作为蛋白质，优选糖基化的IFNβ，糖基化的AT III和糖基化的GM-CSF。因此，如果羟烷基淀粉优选为羟乙基淀粉，本发明涉及偶联物
和/或偶联物
和/或偶联物
和/或偶联物
和/或偶联物
和/或偶联物
HES′特别优选对于每个蛋白质独立地衍生自羟乙基淀粉，其中羟乙基淀粉是具有平均分子量大约10kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约10kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约18kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约50kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约50kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约100kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉。
聚合物在它的非氧化还原端与键合化合物的反应，尤其在所说的键合化合物是一个包含两个氨氧基H2N-O-的同双功能团键合化合物的情况下，反应优选在水性体系中进行。
在本发明中用到的术语“水性体系”是指溶剂或溶剂的混合物，以包含的溶剂的重量为基础，其包含的水的范围从至少10％重量，优选至少50％重量，更优选至少80％重量，甚至更优选至少90％重量到100％重量。最优选的反应介质是水。
根据另一个实施方案，可以使用能溶解HAS，优选HES的至少一种其它溶剂。这些溶剂的例子是例如DMF，二甲基乙酰氨或DMSO。
至于在反应中应用的温度，只要反应能够产生所要求的聚合物衍生物就可以，没有特别的限制。
如果聚合物与包含两个氨氧基H2N-O-，优选O-[2-(2-氨氧基-乙氧基)-乙基]羟氨的同双功能团键合化合物反应，温度优选在从5到45℃的范围，优选的范围是从10至30℃，尤其优选的范围是从15至25℃。
聚合物与包含两个氨氧基H2N-O-，优选O-[2-(2-氨氧基-乙氧基)-乙基]羟氨的同双功能团键合化合物反应的反应时间必须适合具体的需要，一般在范围从1小时到7天，优选从1小时到3天，更优选2小时到48小时。
聚合物与包含两个氨氧基H2N-O-，优选O-[2-(2-氨氧基-乙氧基)-乙基]羟氨的同双功能团键合化合物反应的pH值必须适合具体的需要如反应物的化学性质。优选的pH值范围是4.5到6.5。
上述反应条件的具体例子是例如反应温度为约25℃和pH值大约5.5。
反应混合物的合适的pH值可以通过加入至少一种适合的缓冲液来调节。在优选的缓冲液中，提到醋酸钠缓冲液，磷酸盐或硼酸盐缓冲液。
包含聚合物和键合于其上的双功能团键合化合物的聚合物衍生物一旦形成，则可以将其通过至少一种适合的方法从反应混合物中分离出来。必要时，在通过至少一种适当方法分离之前，可以先将聚合物衍生物沉淀。
如果聚合物衍生物首先被沉淀，可以例如，在适当温度下，用与反应混合物中存在的溶剂或溶剂混合物不同的至少一种溶剂或溶剂混合物与反应混合物接触，例如，丙酮/乙醇的混合物以适当的体积/体积比率如1/1(v/v)，或异丙醇，在合适的温度如从-20℃到50℃或从0℃到25℃。根据本发明特别优选的实施方案，其中的水性介质，优选以水为溶剂，反应的混合物与2-丙醇的混合物接触，优选的温度范围是从-20℃到+50℃，优其优选在范围0℃到25℃。
聚合物衍生物的分离通过适当的可能包括一或多步的过程来进行。根据本发明的优选的实施方案，聚合物的衍生物通过适当的方法如离心或过滤实现首先从反应混合物或反应混合物与例如2-丙醇混合物的混合物中分离。第二步，已分离的聚合物衍生物还要进行进一步的处理，例如，后处理如透析、离心过滤或减压过滤、离子交换色谱、反相色谱、HPLC、MPLC、凝胶过滤和/或冻干。根据更优选的实施方案，已分离的聚合物衍生物先通过渗析，优选对水，然后根据产物的规范要求冻干至反应物的溶剂成分足够低。冻干在温度从20℃到35℃优选20℃到30℃进行。
这样分离得到的聚合物衍生物通过官能团A同蛋白质的官能团Z进一步反应，Z是醛基或酮基。在尤其优选的情况下，A是氨氧基H2N-O-，在聚合物衍生物和蛋白质之间形成肟键，反应优选在水性介质中进行，特别优选水，优选的温度范围为0℃到40℃更优选4℃道25℃，尤其优选15℃到25℃。反应介质的pH值优选在范围4到10，更优选5到9，尤其优选5到7。反应时间优选范围是1到72小时，更优选1到48小时，尤其优选范围是4到24小时。
偶联物要经过进一步的处理，例如，后处理如透析、离心过滤或减压过滤、离子交换色谱、反相色谱、HPLC、MPLC、凝胶过滤和/或冻干。
根据本发明的另一个实施方案，蛋白质的官能团Z是氨基，蛋白质选自IFNα，IFNβ，GM-CSF，APC，tPA，A1AT，AT III，因子VII，因子VIII和因子IX.。因此，本发明涉及上面所说的方法和偶联物，蛋白质的官能团Z是氨基，蛋白质选自IFNα，IFNβ，GM-CSF，APC，tPA，A1AT，AT III，因子VII，因子VIII和因子IX。
根据本发明的尤其优选的实施方案，与是氨基的官能团Z反应的官能团A是一个活性羧基。因此，本发明涉及上面所说的方法和偶联物，其中，蛋白质的官能团Z是氨基，聚合物或聚合物衍生物的官能团A是活性羧基。
根据本发明第一优选的实施方案，通过选择性地氧化聚合物的还原末端将活性羧基引入聚合物。
因此，优选引入活性羧基的聚合物具有根据式(IIa)
和/或根据式(IIb)
的结构。
根据式(I)的聚合物的还原末端的氧化，
优选羟乙基淀粉，可以根据能得到具有上述结构(IIa)和/或(IIb)的化合物的每一个方法或方法的组合来完成。
尽管根据可以产生羟烷基淀粉的氧化还原末端的所有合适的方法或多个方法进行氧化，但是优选通过碱性的碘溶液来进行，例如在DE 196 28 705 A1已公开，在此引入相应内容(实施例A，第9栏，6至24行)作为参考。
向还原端被选择性氧化的聚合物中引入活性羧基可以通过所有可能的方法来完成。
使用的氧化的聚合物可以作为例如盐，如碱金属盐，优选钠和/或钾盐。
根据本发明优选的方法，其还原端被选择性氧化的聚合物在氧化的还原端与至少一种醇醇优选至少一种酸性醇反应。更优选的是在25℃pKA值在范围从6到12，更优选从7到11的酸性醇。酸性醇的分子量优选在范围80到500g/mol。更优选从90到300g/mol，尤其优选从100到200g/mol。
适合的酸性醇是所有具有酸性质子的H-O-RA醇，能与氧化的聚合物反应，产生各自的活性的聚合物酯，优选根据式
，更优选根据式
优选的醇是N-羟基琥珀酰亚胺类如N-羟基琥珀酰亚胺或磺基(sulfo)-N羟基琥珀酰亚胺，适当取代的苯酚如p-硝基酚，o，p-二硝基苯酚，o，o′-二硝基苯酚，三氯苯酚如2，4，6-三氯苯酚或2，4，5-三氯苯酚，三氟苯酚如2，4，6-三氟苯酚或2，4，5-三氟苯酚，五氯苯酚，五氟苯酚，或羟吡咯例如羟基苯并三唑。特别优选的是N-羟琥珀酰亚胺类，特别优选N-羟基琥珀酰亚胺和磺基-N-羟基琥珀酰亚胺。所有的醇都可以单独使用或两个或更多适当组合使用。在本发明的情况下，也可以使用能够释放出相应的醇的化合物，例如通过加入碳酸的二酯。
因此，本发明也涉及到上面所说的方法和偶联物，其中，通过氧化的聚合物与酸性醇优选N-羟琥珀酰亚胺和/或磺基-N-羟琥珀酰亚胺反应，在其还原端选择性氧化的聚合物被活化。
根据本发明的最优选的实施方案，在还原端选择性氧化的聚合物通过氧化还原端与至少一个碳酸二酯RB-O-(C＝O)-O-Rc反应，其中RB和RC相同或不同。优选的，该方法得到根据式
的聚合物，其中HAS′优选HES′。
作为适当的碳酸二酯化合物，可以使用醇部分是独立的N-羟基琥珀酰亚胺如N-羟基琥珀亚酰胺或磺基-N-羟基琥珀酰亚胺的化合物，适合的取代苯酚如p-硝基酚，o，p-二硝基苯酚，o，o′-二硝基苯酚，三氯苯酚如2，4，6-三氯苯酚或2，4，5-三氯苯酚，三氟苯酚如2，4，6-三氟苯酚或2，4，5-三氟苯酚，五氯苯酚，五氟苯酚，或羟吡咯例如羟基苯并三唑。尤其优选的是N，N′-二琥珀酰亚胺碳酸酯和磺基-N，N′-二琥珀酰亚胺碳酸酯，并且优选N，N′-二琥珀酰亚胺碳酸酯。
因此，本发明还涉及到上述方法和偶联物，其中在其还原端选择性氧化的聚合物通过氧化聚合物与N-N′-二琥珀酰亚胺碳酸酯反应而被活化。
酸性醇与氧化的聚合物或氧化的聚合物的盐反应，酸性醇∶聚合物的摩尔比率优选从5∶1到50∶1，更优选从8∶1到20∶1，优选的反应温度从2℃到40℃，更优选从10℃到30℃，尤其优选从15℃到25℃。反应时间优选范围是从1到10小时，更优选从2到5小时，更优选从2到4小时尤其优选从2到3小时。
碳酸二酯化合物与氧化的聚合物或氧化的聚合物的盐反应，其中二酯化合物∶聚合物的摩尔比率优选从1∶1到3∶1，更优选从1∶1到1.5∶1。反应时间优选在范围从0.1到12小时，更优选从0.2到6小时，更优选从0.5到2小时，特别的从0.75到1.25小时。
根据本发明优选的实施方案，氧化的聚合物与酸性醇和/或碳酸二酯反应在至少一种质子惰性溶剂中进行，特别优选在无水的质子惰性溶剂下反应，其中水成分以重量计不超过0.5％，优选以重量计不超过0.1％。在溶剂中，合适的溶剂是二甲基亚砜(DMSO)，N-甲基吡咯烷酮，二甲基乙酰胺(DMA)，二甲基乙酰胺(DMF)和其两种或更多的混合物。反应的温度优选在范围从2℃到40℃，优选从10℃到30℃。
对于氧化的聚合物与至少一种酸性醇的反应，至少使用一种辅助活化剂。
其他适合的活化剂是羰二咪唑，碳化二亚胺如二异丙基碳化二亚胺(DIC)，二环己基碳化二亚胺(DCC)，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)，尤其优选二环己基碳化二亚胺(DCC)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)。
因此，本发明也涉及到上述方法和偶联物，其中，在辅助活化剂的存在下，其还原端氧化的聚合物，与酸性醇反应，产生活性的聚合物酯。
根据本发明尤其优选的实施方案，氧化的聚合物与碳酸二酯和/或酸性醇的反应在低碱性下进行，这可以通过把反应混合物加入水中实现，水与反应混合物的比率是10∶1。在加入之前，基本不含缓冲液的水，pH值在25℃时是7。在加入反应混合物之后，通过测量pH值，就可以得到反应混合物的碱性，其值优选不超过9.0，更优选不超过8.0，尤其优选不超过7.5。
根据本发明的一个优选的实施方案，氧化的聚合物在干燥的DMA下与N-羟基琥珀酰亚胺反应，在无水时与EDC反应选择性的得到下式的聚合物N-羟基琥珀酰亚胺酯：
HAS′优选是HES′。
令人惊奇的是，该反应未产生EDC同HES的OH基团反应得到的副产物，并且出人意料地被抑制了EDC和氧化聚合物形成的O-酰基异脲向相应N-酰基脲的重排反应。
根据本发明另一个优选的实施方案，氧化的聚合物在无水DMF和没有活化剂下与N，N′-二琥珀酰亚胺碳酸酯反应选择性地得到下式地聚合物N-羟琥珀酰亚胺酯
HAS′优选是HES′。
如上所述的活性聚合物优选进一步与蛋白质的至少一个氨基反应产生酰胺键。根据本发明的一个优选的实施方案，活性聚合物与蛋白质的一个氨基反应。
蛋白质的氨基可以是蛋白质的合适的氨基酸残基的氨基，如色氨酸残基或组氨酸残基或在蛋白质的N末端的氨基。
因此，本发明涉及偶联物，其优选具有根据下式
的结构，
其中，酰胺键的N原子是源于蛋白质的氨基，其中HAS′优选HES′，羟乙基淀粉优选为平均分子量大约10kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量大约10kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量大约12kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量大约12kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量大约18kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量大约18kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量大约30kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量大约30kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量大约50kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量大约50kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量大约100kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉。
至于每一个平均分子量和DS的组合，优选DS值大约0.8。
一个更优选选的通过上述酰胺键与羟烷基淀粉优选羟乙基淀粉结合的蛋白质是AT III。因此，本发明也涉及偶联物
其中，酰胺键的N原子源于AT III的氨基，其中HAS′优选HES′，甚至更优选平均分子量大约10kD和DS值大约0.4的羟乙基淀粉。
另一个尤其优选的通过上述酰胺键连接到羟烷基淀粉的蛋白质是IFNα。因此，本发明也涉及到偶联物
这里酰胺键的N原子来源于IFNα的氨基，HAS′优选HES′，甚至更优选分子量大约18kD和DS值大约0.8的羟乙基淀粉。
在上述实施方案中，蛋白质的氨基与聚合物或聚合物衍生物的活性羧基反应，聚合物或聚合物的衍生物特别优选羟乙基淀粉，如，平均分子量大约10kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量大约18kD和DS大约0.8的羟乙基淀粉。也可以是平均分子量大约10kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，和平均分子量大约18kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约50kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约50kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约12kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约12kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约18kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约30kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约30kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约50kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约50kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约100kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉。
至于每一个平均分子量和DS的组合，优选DS值大约0.8。
活性聚合物与蛋白质的反应可以通过将制备活性聚合物的反应混合物同蛋白质水溶液合并来进行，即，无需分离反应聚合物，其包含以重量计至少10％优选至少30％更优选至少50％的活性聚合物。优选的蛋白质水溶液以重量计包含从0.05％到10％，优选从0.5％到5％尤其优选从0.5％到2％的蛋白质，在pH值优选从5.0到9.0，优选从6.0到9.0，尤其优选从7.5到8.5的环境下进行。
根据本发明，可以利用至少一种适当的沉淀剂通过至少一次优选多次沉淀用以纯化活性聚合物。合适的沉淀剂如无水乙醇、异丙醇和/或丙酮，得到的固体以重量计包含至少10％优选至少30％更优选至少50％的活性聚合物。
纯化的活性聚合物可以加到蛋白质的水溶液中。也可以将纯化的活性聚合物的溶液加入到蛋白质的水溶液中。
根据本发明优选的实施方案，活性聚合物与蛋白质的形成酰胺键的反应在从2℃到40℃的温度下进行，优选从5℃到35℃，尤其优选从10℃到30℃，优选的pH是从7.0到9.0，优选从7.5到9.0，尤其优选从7.5到8.5，优选的反应时间是从0.1到12小时，更优选从0.5到5小时，更优选从0.5到3小时，更优选从0.5到2小时，尤其优选从0.5到1小时，活性聚合物酯∶蛋白质的摩尔比率优选从1∶1到70∶1，更优选从5∶1到50∶1尤其优选从10∶1到50∶1。
根据本发明的另一个实施方案，在其还原端选择性氧化的聚合物在还原端与羰基氮杂茂(azolide)如羰基二咪唑或羰基二苯并咪唑反应产生具有活性羧基的聚合物。在羰基二咪唑的情况下，得到根据下式的活性聚合物：
其中HAS′优选HES′。从聚合物与羰基氮杂茂的反应中得到的咪唑酰胺(imidazolide)可以与蛋白质的氨基反应产生酰胺键。还有可能与蛋白质的羟基反应产生酯键，或与蛋白质的巯基反应产生硫代酯键，或如果存在，与蛋白质的羧基反应产生-(C＝O)-O-(C＝O)-键。
在上述实施例中，羰基咪唑是用来向聚合物或其衍生物中引入活性羧基，聚合物或其衍生物特别优选羟乙基淀粉，如具有平均分子量大约10kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约10kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约18kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约30kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉或，具有平均分子量大约30kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约50kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约50kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约12kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约12kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约18kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约50kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约50kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约100kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉。
至于每一个平均分子量和DS的组合，优选DS值大约0.8。
根据本发明的另一个实施方案，具有从聚合物的选择性氧化的还原端与上述化合物(优选带有至少一种酸性醇和/或至少一种碳酸二酯化合物)的反应中得到的活性羧基A的聚合物，，可以通过至少一个联接化合物同蛋白质的官能团Z相连。如果使用联接化合物，所说的化合物是至少双功能团化合物，具有至少一个能与聚合物衍生物的官能团A反应的官能团F1，和至少一个能与蛋白质的官能团Z反应的官能团F2，或经化学修饰后能与蛋白质的官能团Z反应的官能团F2。化学修饰可能是，例如，官能团F2同另一种联接化合物的官能团F3反应，或氧化或还原适当官能团F2。如果使用至少一个联接化合物，反应并非限制在蛋白质的氨基，而是依赖于联接化合物或联接化合物的官能团的化学性质，可以用来与蛋白质的每个适合的官能团形成连接，适合的官能团如羧基，活性羧基，醛基、酮基、巯基，氨基或羟基。如果使用两种联接化合物，使用的第一联接化合物具有至少一个能与聚合物的活性羧基A反应的官能团F1，活性羧基A是如氨基，巯基，羟基或羧基。另外，第一联接化合物具有至少一个其它官能团F2能同第二联接化合物的至少一个官能团F3反应。至于官能团F2，在其他的中，提到了下面的基团：
-C-C-双键或-C-C-三键或-芳族C-C-键；
-巯基或羟基；
-烷基磺酸酰肼，芳基磺酸酰肼；
-1，2-二醇；
-1，2-氨基醇；
-1，2-氨基-硫醇；
-叠氮化合物；
-氨基-NH2，或包含结构单元NH-的氨基的衍生物，如氨基烷基，氨基芳基，氨基芳烷基，或烷芳基氨基；
-羟氨基-O-NH2，或包含有结构单元-O-NH-的羟氨基的衍生物，如羟烷基氨基，羟芳基氨基，羟芳烷基氨基，或羟烷芳基氨基；
-烷氧基氨基，芳氧基氨基，芳烷氧氨基，或烷芳基氧氨基，每个都包含结构单元-NH-O-；
-具有羰基的残基，-Q-C(＝G)-M，其中G是O或S，和M是例如，
--OH或-SH；
-烷氧基，芳氧基，芳烷氧基，或烷芳氧基；
-烷基巯基，芳基巯基，芳烷基巯基，或烷芳基巯基；
-烷基羰氧基，芳基羰氧基，芳烷基羰氧基，烷芳基羰氧基；
-有活性的酯，如羟氨的酯，其含有酰亚胺结构例如N-羟基琥珀酰亚胺，或含有结构单元O-N，其中N为杂芳基化合物一部分，或者，其中G＝O，Q不存在，例如含有取代芳基残基例如五氟苯基，对硝基苯基或三氯苯基的芳氧基化合物；
其中Q不存在，或者为NH或杂原子例如S或O；
--NH-NH2，或-NH-NH-；
--NO2；
-腈基；
-羰基如醛基或酮基；
-羧基；
--N＝C＝O基团或-N＝C＝S基团；
-卤化乙烯基例如乙烯基碘化物或乙烯基溴化物或三氟磺酸盐；
--C≡C-H；
--(C＝NH2Cl)-O烷基
-基团-(C＝O)-CH2-Hal其中Hal是Cl，Br，或I；
--CH＝CH-SO2-；
-包含结构-S-S-的二硫化物基团；
其中F3是一个能与上面提到的基团形成化学键并且优选自上述基团中的基团。此外，第二联接化合物具有至少一个能与蛋白质的官能团Z反应的官能团，例如，氨基、巯基，羧基，活性羧基，醛基、酮基或羟基。在一个联接化合物将聚合物和蛋白质共价的连接的情况下，聚合物可以与联接化合物反应，产生的聚合物衍生物与蛋白质反应，或者蛋白质与连接化合物反应，得到的蛋白质衍生物与聚合物反应。在使用两个联接化合物L1和L2的情况下，聚合物与L1反应，产生的聚合物衍生物与L2反应，产生的聚合物衍生物与蛋白质反应，或蛋白质与L2反应，产生的蛋白质衍生物与L1反应，产生的蛋白质衍生物与聚合物反应，都是可能的。聚合物与L1反应，蛋白质与L2反应，聚合物的衍生物与蛋白质的衍生物反应也是可能的。此外，L1与L2反应，产生的化合物与聚合物反应，产生的聚合物衍生物与蛋白质反应也是可能的。此外，L1与L2反应，产生的化合物与蛋白质反应，产生的蛋白质衍生物与聚合物反应也是可能的。
在上述实施方案中联接化合物与酸性醇和/或碳酸二酯和/或羰基氮杂茂组合使用，特别优选的羟乙基淀粉是例如具有平均分子量大约10kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约10kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约18kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约50kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约50kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约12kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约12kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约18kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约30kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约30kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约50kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约50kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约100kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉。
至于每一个平均分子量和DS的组合，优选DS大约0.8。
根据本发明的第二个优选的实施方案，涉及到把活性羧基引入到聚合物中，其中通过聚合物的至少一个羟基与碳酸二酯反应，活性羧基被引入到还原端被氧化的聚合物上。
因此，本发明也涉及到上面所说的方法和偶联物，其中，A是活性羧基，这里通过聚合物的至少一个羟基与至少一个碳酸二酯，碳酸二酯RB-O-(C＝O)-O-Rc反应，A引入到还原端被氧化的聚合物上，其中，RB和Rc可以相同也可以不同。
根据本发明的另一个实施方案，还原端没有被氧化的聚合物的至少一个羟基与羰基氮杂茂如羰二咪唑，羰基-二-(1，2，4-三唑)或羰基二苯并咪唑反应得到具有活性羧基的聚合物。
至于合适的碳酸二酯化合物，可以使用其醇组分独立地为N-羟基琥珀酰亚胺类如N-羟基琥珀酰亚胺或磺基-N-羟基琥珀酰亚胺的化合物，合适的取代苯酚如p-硝基酚，o，p-二硝基苯酚，o，o′-二硝基苯酚，三氯苯酚如2，4，6-三氯苯酚或2，4，5-三氯苯酚，三氟苯酚如2，4，6-三氟苯酚或2，4，5-三氟苯酚，五氯苯酚，五氟苯酚，或羟吡咯例如羟基苯并三唑。
尤其优选的是对称的碳酸二酯化合物，因此RB和Rc是相同的。碳酸二酯的醇组分优选选自N-羟基琥珀酰亚胺，磺化的N-羟基琥珀酰亚胺，N-羟基苯并三唑，和硝基-和卤代苯酚。其中优选硝基苯酚，二硝基苯酚，三氯苯酚，三氟苯酚，五氯苯酚，和五氟苯酚。尤其优选N.N′-二琥珀酰亚胺碳酸酯和磺基-N，N′-二琥珀酰亚胺碳酸酯，尤其优选N.N′-二琥珀酰亚胺碳酸酯。
因此，本发明也涉及羟烷基淀粉衍生物和其生产方法，优选羟乙基淀粉衍生物，其中所述淀粉至少一个羟基优选至少两个羟基已与碳酸二酯化合物反应得到各自的活性酯。
根据本发明优选的实施方案，还原端被氧化的聚合物同至少一个碳酸二酯化合物的反应是在温度2到40℃下进行的，优选10到30℃，尤其优选15到25℃，优选的反应时间从0.5到5小时，更优选从1到3小时，尤其优选2到3小时。
根据本发明的另一个实施方案，还原端没有被氧化的聚合物的至少一个羟基与羰基氮杂茂如羰二咪唑，羰基-二-(1，2，4-三唑)或羰基二苯并三唑反应得到具有活性羧基的聚合物。
碳酸二酯和/或羰基氮杂茂优选碳酸二酯化合物∶聚合物的摩尔比率依赖于聚合物的取代程度，涉及与碳酸二酯化合物反应的羟基的数目相对于在未反应的聚合物中存在的羟基的数目。
根据本发明一个优选的实施方案，碳酸二酯化合物∶聚合物的摩尔比率在范围1∶2到1∶1000、优选从1∶3到1∶100尤其优选从1∶10到1∶50，得到的取代程度的范围从0.5到0.001、优选从0.33到0.01尤其优选从0.1到0.02。取代程度可以通过UV-光谱来检测。
根据本发明一个优选的实施方案，还原端没有被氧化的聚合物与碳酸二酯的反应在至少一种质子惰性溶剂条件下进行，特别优选在无水的质子惰性溶剂下反应，其中水含量以重量计不超过0.5％，优选以重量计不超过0.1％。其中合适的溶剂是二甲基亚砜(DMSO)，N-甲基吡咯烷酮，二甲基乙酰胺(DMA)，二甲基甲酰胺(DMF)以及其两种或更多种的混合物。
因此，本发明也涉及到上述方法和偶联物，其中，还原端未被氧化的聚合物的至少一个羟基与碳酸二酯反应得到活性酯A的反应是在无水的质子惰性溶剂下进行的，溶剂优选二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺或它们的混合物。
包含至少一个优选两个活性酯基的活性聚合物与蛋白质反应形成至少一个优选至少两个酰胺键的反应，是通过将制备活性聚合物的反应混合物同蛋白质的水溶液合并而进行的，即，无需分离活性聚合物，其以重量计包含至少5％优选10％更优选15％的活性聚合物。优选的蛋白质水溶液以重量计包含从0.05％到10％，优选从0.5％到5％，优选从0.5％到2％的蛋白质，优选的pH值从7.0到9优选从7.5到9尤其优选从7.5到8.5。
根据本发明，可以利用至少一种适合的沉淀剂通过至少一次优选多次沉淀来纯化活性聚合物，适合的沉淀剂如无水乙醇、异丙醇和/或丙酮，得到的固体以重量计含有至少20％，优选至少50％，更优选至少80％的活性聚合物。
已纯化的活性聚合物可以加到蛋白质的水溶液中。也可以把纯化的活性聚合物的溶液加到蛋白质的水溶液中。
根据本发明优选的实施方案，活性聚合物与蛋白质反应产生至少一个优选至少两个酰胺键的反应是在温度从2到40℃更优选从5到35℃尤其优选从10到30℃下进行，优选的pH值从7.0到9.5，优选从7.5到9，尤其优选从7.5到8.5，优选的反应时间从0.5到5小时，更优选从0.5到3小时，尤其优选从0.5到1小时。活性聚合物酯∶蛋白质的摩尔比率优选从1∶1到70∶1，更优选从5∶1到50∶1，尤其优选从10∶1到50∶1。
根据本发明的优选的实施方案，得到了少或多蛋白质取代聚合物，其中，蛋白质分子与聚合物通过酰胺键来连接。
PDS在范围从0.001到1，优选从0.005到0.5，更优选0.005到0.2。
在上述实施方案中，通过与聚合物或聚合物衍生物的至少一个羟基基团的反应把至少一个活化羧基引入了聚合物或聚合物的衍生物中，特别优选的羟乙基淀粉是，例如，具有平均分子量大约10kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约10kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约18kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约50kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约50kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约12kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约12kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约18kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约30kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约30kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约50kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约50kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约100kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉。
至于每一个平均分子量和DS的组合，优选DS大约0.8。
根据本发明的另一个实施方案，具有从聚合物的至少一个羟基基团与上述化合物(优选至少一个碳酸二酯化合物)的反应中得到的活性羧基A的聚合物，通过至少一个联接化合物与蛋白质的官能团Z相连。如果使用联接化合物，所述化合物是至少双功能团化合物，其具有至少一个官能团F1能与聚合物衍生物的官能团A反应，和至少一个能与蛋白质的官能团Z反应的官能团F2或经化学修饰后能与蛋白质的官能团Z反应的官能团F2。化学修饰可能是，例如，官能团F2与另一个联接化合物的官能团F3反应，或氧化或还原适当官能团F2。如果使用至少一种联接化合物，反应并非限制在蛋白质的氨基，而是依赖于联接化合物或联接化合物的官能团的化学性质，可以用来形成与蛋白质的每个适合的官能团的连接，适合的官能团如羧基，活性羧基，醛基、酮基、巯基，氨基或羟基。如果使用两个联接化合物，使用的第一联接化合物具有至少一个能与聚合物的活性羧基A反应的官能团F1，活性羧基A是如氨基，巯基，羟基，或羧基。另外，第一联接化合物具有至少一个能与第二个联接化合物的至少一个官能团F3反应的官能团F2。至于官能团F2，其中提到了下面的基团，
-C-C-双键或-C-C-三键或芳族-C-C-键；
-巯基或羟基；
-烷基磺酸酰肼，芳基磺酸酰肼；
-1，2-二醇；
-1，2-氨基醇；
-叠氮化合物；
-1，2-氨基-硫代醇；
-氨基-NH2或包含结构单元NH-的氨基的衍生物，如氨基烷基，氨基芳基，氨基芳烷基，或烷芳基氨基；
-羟氨基-O-NH2，或包含有结构单元-O-NH-的羟氨基的衍生物，如羟烷基氨基，羟芳基氨基，羟芳烷基氨基，或羟烷芳基氨基；
-烷氧基氨基，芳氧基氨基，芳烷氧氨基，或烷芳基氧氨基，每个都包含结构单元-NH-O-；
-具有羰基的残基，-Q-C(＝G)-M，其中G是O或S，和M是例如，
--OH或-SH；
-烷氧基，芳氧基，芳烷氧基，或烷芳氧基；
-烷基巯基，芳基巯基，芳烷基巯基，或烷芳基巯基；
-烷基羰氧基，芳基羰氧基，芳烷基羰氧基，烷芳基羰氧基；
-活性酯如具有酰亚胺结构的羟氨的酯，例如N-羟琥珀酰亚胺，或含有结构单元O-N，其中N为芳基杂原子化合物的一部分，或者，其中G＝O和Q不存在，例如含有取代芳基残基例如五氟苯基，对硝基苯基或三氯苯基的芳氧基化合物；
其中Q不存在，或者是NH或杂原子例如S或O；
--NH-NH2，或-NH-NH-；
--NO2；
-腈；
-羰基如醛基或酮基；
-羧基；
--N＝C＝O基团或-N＝C＝S基团
-乙烯卤化物基例如乙烯基碘化物或乙烯基溴化物或三氟磺酸盐；
--C≡C-H；
--(C＝NH2Cl)-O烷基
-基团-(C＝O)-CH2-Hal其中Hal是Cl，Br，或I；
--CH＝CH-SO2-；
-包含结构-S-S-的二硫化物基团；
其中F3是能与上述基团之一形成化学键并且从上述基团中优选的基团。此外，第二联接化合物具有至少一个能与蛋白质的官能团Z反应的官能团，例如，氨基、巯基，羧基，活性羧基，醛基、酮基或羟基。在使用一个联接化合物来共价连接聚合物和蛋白质的情况下，聚合物可以与链化合物反应，产生的聚合物衍生物与蛋白质反应，或者蛋白质与联接化合物反应，得到的蛋白质衍生物与聚合物反应。在使用两个联接化合物L1和L2的情况下，聚合物与L1反应，产生的聚合物衍生物与L2反应，产生的聚合物衍生物与蛋白质反应，或蛋白质与L2反应，产生的蛋白质衍生物与L1反应，产生的蛋白质衍生物与聚合物反应，都是可能的。聚合物与L1反应，蛋白质与L2反应，聚合物的衍生物与蛋白质的衍生物反应，也是可能的。此外，Ll与L2反应，产生的化合物与聚合物反应，产生的聚合物衍生物与蛋白质反应也是可能的。此外，L1与L2反应，产生的化合物与蛋白质反应，产生的蛋白质衍生物与聚合物反应，也是可能的。
在上述使用了联接化合物的实施方案中，优选的羟乙基淀粉是例如具有平均分子量大约10kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约10kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约18kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约50kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约50kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约12kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约12kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约18kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约30kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约30kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约50kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约50kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约100kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉。
至于每一个平均分子量和DS的组合，优选DS大约0.8。
根据本发明的尤其优选的实施方案，与为氨基的官能团Z反应的官能团A是醛基、酮基或半缩醛。因此，本发明也涉及到上述方法和偶联物，其中官能团Z是，氨基，聚合物或其衍生物的官能团A是，醛基、酮基或半缩醛。其中，蛋白质选自IFNα，IFNβ，GM-CSF，APC，tPA，；A1AT，AT III，因子VII，因子VIII，和因子IX。
根据特别优选的实施方案，官能团Z和官能团A通过还原氨化来进行反应。
根据本发明的还原氨化，其中，通过还原氨化，聚合物或聚合物衍生物通过至少一个醛基同蛋白质的至少一个氨基共价连接，反应进行的温度优选从0到40℃，更优选0到37℃，更优选0到25℃，特别的4到21℃，尤其优选0到21℃。反应时间的优选范围是0.5到72小时，2到48小时，4到7小时。反应的溶剂优选水性介质。
因此，本发明也涉及到上面所说的方法和偶联物，其中，还原氨化在温度4到21℃优选0到21℃下进行。
因此，本发明也涉及到上述方法和偶联物，其中，还原氨化在水性介质下进行。
因此，本发明也涉及到上述方法和偶联物，还原氨化在温度4到21℃，优选在0到21℃，并且在水性介质中进行。
本发明中所用的术语“水性介质”是指含水的溶剂或包含水的溶剂混合物，以所包含的溶剂的重量为基础，水的重量占至少10％，优选至少20％，更优选至少30％，更优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，上限100％。优选的反应介质是水。
反应介质的pH值通常在范围从4到9，或从4到8，或从4到7.3。
根据本发明优选的实施方案，进行还原氨化的pH值低于10，优选低于7.5，优选低于7.3，更优选小于或等于7，更优选低于7，即在酸性范围内。因此，优选的范围是从3到低于7，优选从3.5到6.5，更优选从4到6，更优选从4.5到5.5，尤其优选大约5.0，即4.6或4.7或4.8或4.9或5.0.或5.1或5.2或5.3或5.4.。其中优选的范围是3到6.9，或3到6.5，或3到6，或3to5.5，或3到5，或3到4.5，或3到4，或3到3.5，或3.5到6.9，或3.5到6.5，或3.5到6，或3.5到5.5，或3.5到5，或3.5到4.5，或3.5到4或4到6.9，或4到6.5，或4到6.，或4到5.5，或4到5或4到4.5，或4.5到6.9，或4.5到6.5，或4.5到6，或4.5到5.5，或4.5到5，或5到6.9，或5到6.5，或5到6，或5到5.5，或5.5到6.9，或5.5到6.5，或5.5到6，或6到6.9，或6到6.5，或6.5到6.9。
因此，本发明也涉及到上述方法和偶联物，其中，还原氨化在pH值为7或低于7，优选在pH值为6或更低的条件下进行。
因此，本发明也涉及到上述方法和偶联物，其中，还原氨化在温度从0到21℃优选4到21℃，pH值为7.5或低于7.5，优选7或低于7，优选在pH值为6或更低的条件下进行。
因此，本发明也涉及到上述方法和偶联物，其中，还原氨化在水性介质中，pH值为7或低于7，优选在pH值为6或更低的条件下进行。
因此，本发明也涉及到上述方法和偶联物，其中，还原氨化在温度从4到21℃，在水性介质中，pH值为7或低于7，优选在pH值为6或更低的条件下进行。
反应中所用的聚合物衍生物与蛋白质的摩尔比率优选在范围从200∶1到5∶1，更优选从100∶1到10∶1，尤其优选从75∶1到20∶1。
惊奇地发现，尤其在上面给出的pH值范围内，特别是低于7高于或等于4的范围，聚合物的衍生物主要与位于蛋白质的N末端的氨基反应。在本发明中用到的术语“主要地”是指这样地实施方案，其中，至少80％，优选至少85％的可利用的N-末端氨基通过还原氨化进行反应。反应至少90％或至少95％或至少96％或至少97％或至少98％或至少99％的可利用的N-末端氨基也是可能的。尽管不能完全得出与N-末端氨基之外的氨基偶合的规则，但可以相信，根据本发明，在pH低于7优选低于6，还原氨化偶合主要选择性的发生在N-末端氨基。特别的，这些反应条件优选用于在这些条件下稳定的蛋白质。蛋白质，例如，酸不稳定的蛋白质，如α1-抗胰蛋白酶，优选选择适当的反应条件，特别在pH值从低于7.5到高于5。
因此，本发明也涉及到上述方法和偶联物，其中，蛋白质包含N-末端氨基和至少另一个氨基，所说的偶联物包括主要与N-末端氨基偶合的聚合物。
根据一个尤其优选的实施方案，本发明涉及到把醛基或酮基或半缩醛基官能化的羟烷基淀粉，或者醛基、酮基或半缩醛官能化的羟烷基淀粉衍生物连接到蛋白质的N末端氨基的方法，所说的方法包括，将所述羟烷基淀粉或羟烷基淀粉衍生物在pH为7或更低，优选6或更低，进行还原氨化，且还原氨化反应优选在水性介质中进行。
根据本发明，优选醛功能化的羟烷基淀粉或醛功能化的羟烷基淀粉衍生物。
根据一个更优选的实施方案，本发明涉及到把醛基、酮基或半缩醛官能化的羟烷基淀粉或者醛基、酮基或半缩醛官能化的羟烷基淀粉衍生物选择性地连接到蛋白质的N末端氨基的方法，所说的方法含包括，在pH为7或更低，优选6或更低的条件下，将所述羟烷基淀粉或羟烷基淀粉衍生物进行还原氨化，所述还原氨化反应优选在水性介质中进行。所用的羟乙基淀粉优选具有平均分子量大约10kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约10kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约12kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约12kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约18kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约18kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约30kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约30kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉。
反应中所用的聚合物衍生物与蛋白质的摩尔比率优选在范围从200∶1到10∶1，更优选从100∶1到10∶1，尤其优选从75∶1到20∶1。
因此，本发明也涉及产生偶联物的制备方法，所说的方法包括，具有醛基的聚合物或聚合物衍生物在水性介质中并且有还原剂存在下与蛋白质的氨基反应，所说的还原剂优选NaCNBH3。
根据本发明第一个优选的实施方案，聚合物包含至少两个通过开环氧化反应引入到聚合物上的醛基，聚合物优选包含至少一个下式的结构
根据本发明的实施方案，可以采用各种氧化剂或氧化剂的组合，它们至少能氧化聚合物的一个糖环，产生具有至少一个优选两个醛基的打开的糖环。这个反应可以通过下面的反应步骤来说明，这个步骤示出了聚合物的糖环被氧化开环得到两个醛基：
适合的氧化剂有高碘酸盐，如碱金属的高碘酸盐或其两个或更多的混合物，优选高碘酸钠盐和高碘酸钾。
因此，本发明也涉及到上述方法和偶联物，其中，聚合物在高碘酸盐作用下进行开环氧化反应，得到带有至少一个优选两个醛基的聚合物衍生物。
对于这个氧化反应，使用的聚合物的还原端可以是氧化的形式也可以是非氧化的形式，优选非氧化的形式。
因此，本发明也涉及到上述方法和偶联物，其中聚合物具有非氧化形式的还原端。
反应的温度优选在范围0到40℃，更优选在0到25℃，尤其优选在0到5℃。反应时间优选在1到5小时，尤其优选10分钟到4小时。根据要求的氧化程度，即，氧化反应得到的醛基的数目，适当地选择高碘酸盐∶聚合物的摩尔比率。
因此，本发明也涉及到上述方法和偶联物，其中，开环氧化反应在温度0到5℃下进行。
聚合物和高碘酸盐的氧化反应优选在水性介质中进行，最优选在水中。
因此，本发明也涉及到上述方法和偶联物，其中，开环氧化反应在水性介质中进行。反应混合物的pH值可以通过加入至少一种适当的缓冲液来调节。在优选的缓冲液中，提到了醋酸钠缓冲液，磷酸盐或硼酸盐缓冲液。
进行开环氧化反应的羟乙基淀粉优选具有平均分子量大约10kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约10kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约12kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约12kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约18kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约18kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约30kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约30kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约50kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约50kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约100kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉。
至于每一个平均分子量和DS的组合，优选DS大约0.8。
产生的聚合物的衍生物可以通过至少一种适合的方法来从反应的混合物中纯化。如果需要，聚合物衍生物可在分离之前通过至少一种适合的方法来沉淀。
如果聚合物的衍生物首先沉淀，例如，在适当的温度下，用与反应混合物中存在的溶剂或溶剂混合物不同的至少一种溶剂或溶剂的混合物与反应混合物接触。根据本发明特别优选的实施方案，使用水性介质优选水为溶剂，反应混合物同2-丙醇或者同优选1∶1混合(v/v)的丙酮和乙醇的混合物接触，表明所述化合物具有相同的体积，，优选的温度范围从-20到+50℃，尤其优选从-20到25℃。
聚合物衍生物的分离通过适当的可能包括一或多步的过程来进行。根据本发明的优选的实施方案，通过适当的方法如离心或过滤将聚合物衍生物首先从反应混合物或反应混合物与例如2-丙醇水性混合物的混合物中分离出来。第二步，分离出的聚合物衍生物还要进行进一步的处理，如后处理像透析、离心过滤或减压过滤、离子交换色谱、反相色谱、HPLC、MPLC、凝胶过滤和/或冻干。根据更优选的实施方案，分离出的聚合物衍生物先通过渗析，优选对水，然后根据对产物的规范要求冻干至反应物的溶剂成分足够低。冻干在温度从20℃到35℃优选20℃到30℃进行。
根据优选的实施方案，氧化反应中产生的氧化聚合物可以通过至少一种合适的方法如超滤和/或透析的方法来纯化，其目的是为了除去不需要的低分子盐和聚合物成分，也提供了一种控制氧化聚合物的分子量范围的方法。
氧化的聚合物可以直接用来与蛋白质反应，或者在第一步例如通过冻干法适当回收，，在第二步中重新溶解到水中用于与蛋白质形成偶联物。至于蛋白质的至少一个氨基同聚合物的至少一个醛基通过还原氨化进行偶合，可以参考上述具体公开的关于关于还原氨化反应的特定反应参数，如pH或温度。根据本发明尤其优选的实施方案，还原氨化优选在温度从0到5℃如4℃，pH大约4.5到5.5如大约5.0，反应时间大约20到30小时如24小时的条件下进行。
根据第二个优选的实施方案，聚合物与至少双官能团化合物反应，至少双官能团化合物包含至少一个能与聚合物反应的官能团M和至少一个能通过还原氨化与蛋白质的氨基反应的官能团Q，可以是醛基、酮基或半缩醛基。
优选使用的化合物除了醛基、酮基或半缩醛基之外，还具有至少一个羧基或至少一个活性羧基，优选一个羧基或一个活性羧基。醛基、酮基或半缩醛基与羧基或活性羧基通过适当的间隔基分开。其中间隔基可以是被任选取代，线性的，分支的和/或环形的碳氢化合物残基。通常，碳氢化合物残基含有从1到60，优选1到40，更优选从1到20，更优选从2到10，更优选从2到6，尤其优选从2到4个碳原子。如果存在杂原子，间隔基团通常包括1到20、优选1到8、尤其优选1到4个杂原子。碳氢化合物残基可以是随意分支的烷基链，或芳基，或含有例如从5到7个碳原子的环烷基，或是烷芳基，烷芳基中的烷基可以是线性的或环烷基。
根据优选的实施方案，碳氢化合物残基是含有2到6个优选2到4个碳原子的烷基。在醛基或酮基与羧基之间没有碳原子也是可能的。可选择的，碳氢化合物残基可以是取代的或未取代的具有3到11个碳的环烃基，优选3到11个碳原子，优选3到6或3到5个碳原子。当环烃基被取代时，取代基可以选自取代或未取代的氨基或烷氧基基团。如果存在，取代基的数目优选1到3。另外，烷基和/或环烃基可以包含一个或多个杂原子，如O或S，特别是O。在这种情况下，优选存在1到3，特别优选1到2个杂原子。在这种情况下优选的化合物从下面的化合物中选择
根据一个更优选的实施方案，碳氢化合物残基是含有5到7优选6个碳原子的芳基。最优选的碳氢化合物残基是苯残基。根据优选的实施方案，羧基和醛基可以在苯环的1，4-位，1，3-位或1，2-位，优选1，4-位。
作为活性羧基，提到了活性酯，异硫代氰酸酯或异氰酸酯。优选的活性酯衍生自N-羟基琥珀酰亚胺类如N-羟琥珀酰亚胺或磺基-N-羟基琥珀酰亚胺，适当取代的苯酚如p-硝基酚，o，p-二硝基苯酚，o，o′-二硝基苯酚，三氯苯酚如2，4，6-三氯苯酚或2，4，5-三氯苯酚，三氟苯酚如2，4，6-三氟苯酚或2，4，5-三氟苯酚，五氯苯酚，五氟苯酚，或羟吡咯例如羟基苯并三唑。尤其优选N-羟基琥珀酰亚胺类，更尤其优选N-羟基琥珀酰亚胺和磺基-N-羟基琥珀酰亚胺。所有的醇都可以单独使用或两个或多个适当组合使用。作为活性酯，尤其优选五氟苯酚酯和N-羟基琥珀酰亚胺酯。
包含羧基以反应得到活性羧基的的至少双功能团化合物的具体例子是在上文列出的化合物1到11。在这种情况下，术语“羧基”也指二羧酸化合物的内酯和内酐。
因此，根据优选的实施方案，本发明也涉及上述方法和偶联物，其中，聚合物与甲酰基苯甲酸反应。
根据另一个优选的实施方案，本发明也涉及上述方法和偶联物，其中，聚合物与甲酰苯甲酸五氟苯酚酯反应。
根据另一个优选的实施方案，本发明也涉及上述方法和偶联物，其中，聚合物与甲酰苯甲酸N-羟琥珀酰亚胺酯反应。
根据另一个优选的实施方案，本发明也涉及上述方法和偶联物，其中，聚合物与4-(4-甲酰-3，5-二甲氧基苯氧)丁酸反应。
M优选羧基或活性羧基，Q是醛基或酮基或半缩醛基，与包含M的化合物进行反应的羟乙基淀粉优选具有平均分子量大约10kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约10kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约12kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约12kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉或具有平均分子量大约18kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约18kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约30kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约30kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约50kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约50kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约100kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉。
至于每一个平均分子量和DS的组合，优选DS大约0.8。
特别优选使用羟烷基淀粉，尤其优选使用还原端是氧化形式的羟乙基淀粉。
产生的含有醛基或酮基或半缩醛基的聚合物衍生物接着通过还原氨化同蛋白质的氨基反应。至于蛋白质的至少一个氨基同聚合物的至少一个醛基通过还原氨化进行偶合，可以参考上述具体公开的关于关于还原氨化反应的特定反应参数，如pH或温度。根据本发明一个尤其优选的实施方案，与蛋白质的氨基的反应优选在温度0到40℃更优选0到25℃尤其优选0到21℃下进行，反应时间的范围优选从30分钟到72小时，优选2到48小时，尤其优选4到17小时。反应的溶剂优选水性介质。反应介质的pH值优选在4到9更优选4到8尤其优选4.5到5.5。
根据第三优选的实施方案，聚合物在其选择性氧化的还原端同包含氨基M和官能团Q的至少双功能团化合物反应，其中，所说的氨基M与聚合物任选的氧化还原端反应，官能团Q经化学修饰后得到醛功能化的聚合物，其可以通过还原氨化与蛋白质的氨基反应。
对于官能团Q，其中提到了下面的官能团：
-C-C-双键或-C-C-三键或芳族-C-C-键；
-巯基或羟基；
-烷基磺酸酰肼，芳基磺酸酰肼；
-1，2-二醇；
-1，2-氨基-硫代醇；
-叠氮化合物；
-1，2-氨基醇；
-氨基-NH2，或包含结构单元NH-的氨基的衍生物，如氨基烷基，氨基芳基，氨基芳烷基，或烷芳基氨基；
-羟氨基-O-NH2，或包含有结构单元-O-NH-的羟氨基的衍生物，如羟烷基氨基，羟芳基氨基，羟芳烷基氨基，或羟烷芳基氨基；
-烷氧基氨基，芳氧基氨基，芳烷氧氨基，或烷芳基氧氨基，每个都包含结构单元-NH-O-；
-含有羰基的残基，-Q-C(＝G)-M，其中G是O或S，和M是例如，
--OH或-SH；
-烷氧基，芳氧基，芳烷氧基，或烷芳氧基；
-烷基巯基，芳基巯基，芳烷基巯基，或烷芳基巯基；
-烷基羰氧基，芳基羰氧基，芳烷基羰氧基，烷芳基羰氧基；
-活性酯，如具有酰亚胺结构的羟氨的酯，例如N-羟琥珀酰亚胺，或含有结构单元O-N其中N为杂芳基化合物的一部分，或者，其中G＝O和Q不存在，例如含有取代芳基残基例如五氟苯基，对硝基苯基或三氯苯基的芳氧基化合物；
-其中Q不存在，或者为NH或杂原子例如S或O；
--NH-NH2，或-NH-NH-；
--NO2；
-腈基；
-羰基如醛基或酮基；
-羧基；
--N＝C＝O基团或-N＝C＝S基团
-乙烯卤代基例如乙烯基碘或乙烯基溴或三氟磺酸盐；
--C≡C-H；
--(C＝NH2Cl)-O烷基
-基团-(C＝O)-CH2-Hal其中Hal是Cl，Br，或I；
--CH＝CH-SO2-；
-包含结构-S-S-的二硫化物基团；
根据本发明的优选的实施方案，术语“官能团Q”是指包含化学结构-NH-的官能团Q。
根据本发明的一个优选的实施方案，官能团M是具有R′-NH-结构的基团，其中，R′是氢或烷基、环烷基、芳基、芳烷基、芳基环烷基，烷芳基或环烷芳基残基，这里，环烷基、芳基、芳烷基、芳基环烷基，烷芳基或环烷芳基残基可以直接与NH基连接，或根据另一个实施方案，通过氧桥与NH基连接。烷基、环烷基、芳基、芳烷基、芳基环烷基，烷芳基或环烷芳基残基可以被适当的取代。作为优选的取代基，提到了卤素如F，Cl或Br。尤其优选的残基R′是氢、烷基和烷氧基。甚至更优选的是氢和未取代的烷基和烷氧基。
在烷基和烷氧基中，优选含有1、2、3、4、5或6个碳原子的基团。更优选的是甲基、乙基、丙基、异丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基和异丙氧基。尤其优选甲基、乙基、甲氧基、乙氧基，特别优选甲基或甲氧基。
根据本发明的另一个优选的实施方案，官能团M具有R′-NH-R″结构，这里R″优选包含结构单元-NH-和/或结构单元-(C＝G)-，这里G是O或S，和/或结构单元-SO2-。官能团R″的具体例子是
这里如果G出现两次，则独立的是O或S。
因此，本发明也涉及到上述方法和偶联物，其中官能团M选自以下的基团
H2N-
这里，G是O或S，如果出现两次，则独立的是O或S，R’是甲基。
根据本发明的特别优选的一个实施例，官能团M是氨基-NH2。
术语“氨基Q”是指包含化学结构-NH-的官能团Q。
根据本发明的一个优选的实施方案，官能团Q是一个具有R′-NH-结构的基团，其中，R′是氢或烷基、环烷基、芳基、芳烷基、芳基环烷基，烷芳基或环烷芳基残基，这里，环烷基、芳基、芳烷基、芳基环烷基，烷芳基或环烷芳基残基可以直接与NH基连接，或根据另一个实施方案，通过氧桥与NH基连接。烷基、环烷基、芳基、芳烷基、芳基环烷基，烷芳基或环烷芳基残基可以被适当的取代。作为优选的取代基，提到了卤素如F，Cl或Br。尤其优选的残基R′是氢、烷基和烷氧基。甚至更优选的是氢和未取代的烷基和烷氧基。
在烷基和烷氧基中，优选含有1、2、3、4、5或6个碳原子的基团。更优选的是甲基、乙基、丙基、异丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基和异丙氧基。尤其优选甲基、乙基、甲氧基、乙氧基，特别优选甲基或甲氧基。
根据本发明的另一个优选的实施方案，官能团Q具有R′-NH-R″结构，这里R″优选包含结构单元-NH-和/或结构单元-(C＝G)-，这里G是O或S，和/或结构单元-SO2-。官能团R″的具体例子是
这里如果G出现两次，则独立的是O或S。
因此，本发明也涉及到上述方法和偶联物，其中官能团Q选自以下的基团
H2N-
这里，G是O或S，如果出现两次，则独立的是O或S，R’是甲基。
根据本发明的特别优选的实施方案，官能团Q是氨基-NH2-的。
根据本发明进一步优选的实施方案，M和Q均包含氨基-NH2。根据特别优选的实施方案，M和Q均为氨基-NH2。
根据本发明一个优选的实施方案，包含M和Q的化合物是同双官能团化合物，更优选的同双官能团化合物包含M和Q作为官能团，更优选氨基-NH2，或根据另一个实施方案，羟氨基-O-NH2或基团
G优选O。这些包含M和Q的化合物的具体例子是
M优选为氨基-NH-更优选为氨基-NH2-，更优选M和Q均包含氨基-NH-，特别优选M和Q均包含氨基-NH2，与包含M的化合物进行反应的羟乙基淀粉优选具有平均分子量大约10kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉或具有平均分子量大约10kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约12kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约12kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约18kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约18kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约30kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约30kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约50kD和DS大约0.4的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约50kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉，或具有平均分子量大约100kD和DS大约0.7的羟乙基淀粉。
至于每一个平均分子量和DS的组合，优选DS大约0.8。
在M和Q均为氨基-NH2的情况下，M和Q可以被适当的间隔基分隔开。其中间隔基可以是任选取代的、线性的、分支的和/或环形的碳氢化合物残基。通常，碳氢化合物残基含有从1到60优选1到40，更优选从1到20更优选从2到10，更优选从2到6尤其优选从2到4个碳原子。如果存在杂原子，间隔基团包括通常从1到20优选从1到8尤其优选从1到4个杂原子。碳氢化合物残基可以是任选分支的烷基链或芳基或含有例如从5到7个碳原子环烷基，或是烷芳基，烷芳基中的烷基可以是线性的或环烷基。根据一个甚至更优选的实施方案，碳氢化合物残基是一个包含1到20优选2到10更优选2到6尤其优选2到4个碳原子的烷烃链。
因此，本发明也涉及到上述方法和偶联物，其中聚合物同1，4-二氨基丁烷，1，3-二氨基丙烷或1，2-二氨基乙烷反应得到聚合物衍生物。
根据第一选择，官能团M是氨基NH2，它与聚合物的氧化还原端反应得到连在聚合物上的氨基和包含M和Q的化合物。
根据第二选择，官能团M是氨基NH2，它通过还原氨化与聚合物的非氧化还原端反应产生亚氨基，该基团进而优选氢化得到氨基，亚氨基和氨基分别连接聚合物和包含M和Q的化合物。在这种情况下，官能团Q可以为氨基。如果产生的聚合物衍生物接着通过如下文所述的羧基或活性羧基同至少双功能团化合物反应，或者同将与氨基反应的至少双功能团化合物的另一个基团反应，优选包含M和Q的化合物是仅包含一个氨基作为官能团的伯胺。在这种具体的情况下，尽管化合物包含仅一个官能团，但它被视为包含M和Q的双官能团化合物，其中M是包含在将与聚合物还原末端还原氨化的化合物中的氨基，并且其中Q是从还原氨化和之后的氢化得到的仲氨基。
根据第三选择，聚合物的非氧化还原端通过还原氨化与氨水反应得到聚合物的末端亚氨基，该基团接着优选被氢化得到聚合物的末端氨基，即末端伯氨基。在这种具体情况下，氨水被看作包含有M和Q的双官能团化合物，其中，M是包含在所用的氨水里的NH2，Q是从还原氨化和接下来的氢化中得到的伯氨基。
包含有M和Q的双官能团化合物与聚合物的反应优选在温度从0到100℃更优选从4到80℃尤其优选从20到80℃；反应时间范围优选在4小时到7天，更优选10小时到5天，尤其优选17到4小时的条件下进行。至少双功能团化合物∶聚合物的摩尔比率优选范围在10到200，特别是从50到100。
至于双官能团化合物与聚合物的反应溶剂，优选至少一种质子惰性溶剂，特别优选在无水的质子惰性溶剂下反应，其中水成分以重量计不超过0.5％，优选以重量计不超过0.1％。在其他的溶剂中，合适的溶剂是二甲基亚砜(DMSO)，N-甲基吡咯烷酮，二甲基乙酰胺(DMA)，二甲基甲酰胺(DMF)及其两种或更多种的混合物。
至于双官能团化合物与聚合物的反应溶剂，也可以使用水性介质。
根据一个优选的实施方案，包含聚合物和至少双官能团化合物的聚合物衍生物可以在游离的官能团Q上进行化学修饰，得到包含醛基或酮基或半缩醛基的聚合物衍生物。根据这种实施方式，聚合物衍生物优选同包含能与官能团Q反应的官能团以及醛基或酮基或半缩醛基的至少一个至少双功能团化合物反应。
对于至少双功能团化合物，包含醛基或酮基或半缩醛基以及能与聚合物衍生物的官能团Q形成键的至少一个官能团的化合物都是合适的。至少一个官能团是从像Q一样的官能团池中选择的并且能够与Q反应。在优选的情况下，Q是氨基-NH2，更优选使用除了含有醛基或酮基或半缩醛基之外，还含有至少一个羧基或至少一个活性羧基优选一个羧基或一个活性羧基的化合物。醛基或酮基或半缩醛基和羧基或活性羧基可以被适合的间隔基分开。其中间隔是可任选取代的、线性的、分支的和/或环形的碳氢化合物残基。通常的，碳氢化合物残基具有1-60优选1-40，更优选最多1-20，更优选2-10，更优选2-6，尤其优选2-4个碳原子。如果存在杂原子，该间隔基团通常包含1到20，优选1到8，更优选1到4个杂原子。碳氢化合物残基可能包含任选分支的烷基链或芳基基团或含有5到7个碳原子的环烷基，或是芳烷基，烷芳基，其中烷基部分是一个线性的和/或环烷基基团。
根据一个优选的实施方案，碳氢化合物残基是含有2到6个碳原子优选2到4个碳原子的烷基。在醛基或酮基与羧基之间没有碳原子也是可能的。另外，碳氢化合物残基可以是取代的和未被取代的含有3到11个碳原子优选3到6或3到5个碳原子的环状碳氢化合物。当环碳氢化合物被取代时，取代基可以选自取代或未取代的氨基或烷氧基的基团。如果存在，取代基的数目优选1到3。另外，烷基和/或环状碳氢化合物可以包含一或多个杂原子，如O或S，特别选O。在这种情况下，优选存在1到3个，特别优选存在1到2个杂原子。在这种情况下优选的化合物选自下面的化合物：
根据更优选的一个实施例，碳氢化合物残基是含有5到7个优选6个碳原子的芳基残基。碳氢化合物残基最优选苯残基。根据这个优选的实施方案，羧基和醛基可以位于苯环的1，4-位、1，3-位或1，2-位，优选1，4-位。
作为反应的羧基，提到了活性酯，异硫代氰酸酯或异氰酸酯。优选的活性酯源自N-羟基琥珀酰亚胺类如N-羟基琥珀酰亚胺或磺基-N-羟基琥珀酰亚胺，适当取代的苯酚如p-硝基酚，o，p-二硝基苯酚，o，o′-二硝基苯酚，三氯苯酚如2，4，6-三氯苯酚或2，4，5-三氯苯酚，三氟苯酚如2，4，6-三氟苯酚或2，4，5-三氟苯酚，五氯苯酚，五氟苯酚，或羟吡咯例如羟基苯并三唑。尤其优选N-羟基琥珀酰亚胺类，尤其优选N-羟基琥珀酰亚胺和磺基-N-羟基琥珀酰亚胺。所有的醇都可以单独使用或两个或多个适当组合使用。作为活性酯，尤其优选五氟苯酯和N-羟基琥珀酰亚胺酯。
根据一个具体的实施例，可以与官能团Q形成化学键的官能团是活性羧基，其中，Q优选为NH2或包含结构单元-NH-的氨基的衍生物，如氨基芳基，氨基芳烷基，或烷芳基氨基，特别是NH2。
在这种情况下，能与官能团Q形成化学键并且为羧基的官能团适当的反应可以得到上面所说的活性羧基。因此，优选至少一个包含有羧基和醛基或酮基或半缩醛基的至少双功能团化合物来进行反应，其中，羧基转变成活性羧基，产生的至少双功能团化合物被纯化并与聚合物衍生物的官能团Q反应。
包含能够通过反应得到活性羧基的羧基的至少双功能团化合物的具体的例子是在上文列出的化合物1到11。在这种情况下，术语“羧基”也指二羧酸化合物的内酯和内酐。
因此，根据优选的实施方案，本发明也涉及上述方法和偶联物，其中，包含Q的聚合物衍生物进一步与甲酰基苯甲酸反应，Q是氨基-NH2。
根据另一个优选的实施方案，本发明也涉及上述方法和偶联物，其中，包含Q的聚合物衍生物进一步与甲酰苯氧酸五氟苯酚酯反应，Q是氨基。
根据另一个优选的实施方案，本发明也涉及上述方法和偶联物，其中，包含Q的聚合物衍生物进一步与甲酰苯氧酸N-羟琥珀酰亚胺酯反应，Q是氨基，。
根据另一个优选的实施方案，本发明也涉及上述方法和偶联物，其中，包含Q，Q是一个氨基的聚合物衍生物，进一步与4-(4-甲酰-3，5-二甲氧基苯氧基)丁酸反应。
因此，根据优选的实施方案，本发明也涉及上述方法和偶联物，其中，包含Q的聚合物衍生物进一步与双官能团化合物反应，，Q是氨基-NH2，双官能团化合物是一个选自α-酮羧酸、唾液酸或其衍生物和吡哆醛磷酸酯的生物相容性化合物。
关于α-酮羧酸，优选从氨基酸衍生的α-酮羧酸，大多数情况下能在人体内发现。优选的源于氨基酸的α-酮羧酸选自酮缬氨酸，酮亮氨酸，酮异亮氨酸和酮丙氨酸。α-酮羧酸的羧基与聚合物的为氨基的基团Q反应。于是，形成了氨基。α-酮羧酸的剩余的游离的酮基可以与蛋白质的官能团反应，特别是氨基。于是，形成了能被氢化的亚氨基。
因此，本发明也指上述方法和偶联物，其中包含Q的聚合物衍生物与α-酮羧酸反应，Q为氨基。
关于唾液酸或其衍生物，这里优选具有生物相容性的，特别是在体内发现的N-和/或O-乙酰化的糖。在优选的实施方案中，神经氨酸或唾液酸是N-乙酰化的神经氨酸。因为有吡喃糖结构，这些化合物显示出需要的刚性，也是为了实现作为间隔基的功能。另外，通过选择性氧化把醛基引入到这些化合物中也是可能的。唾液酸在人体内发现，例如，作为糖基化蛋白质的聚糖链的末端单糖。。
在一个优选的实施方案中，唾液酸可以被选择性的氧化成醛基。
选择性氧化唾液酸或神经氨酸的方法在本领域是公知的，例如，从L.W.Jaques，B.F.Riesco，W.Weltner，Carbohydrate Research，83(1980)，21-32和T.Masuda，S.Shibuya，M.Arai，S.Yoshida，T.Tomozawa，A.Ohno，M.Yamashita，T.Honda，Bioorganic&Medical Chemistry Letters，13(2003)，669-673。优选唾液酸的氧化在同包含Q的聚合物的反应之前进行，Q为氨基。
任选被氧化的唾液酸然后通过它的羧酸基团与聚合物的氨基反应。
产生的化合物包含醛基，该醛基可以进一步通过还原氨化与蛋白质的氨基反应。
因此，本发明也指上述方法和偶联物，其中包含Q的聚合物衍生物进一步与被任选氧化的唾液酸反应，Q为氨基。
关于吡哆醛磷酸酯(PyP)，这是一个高度生物相容性的双官能团化合物，也被称为维生素B6。PyP是一个辅酶，能参与体内转氨，脱羧，消旋和多种修饰氨基酸侧链的反应。所有的PyP需要的酶产生作用都要经过在氨基酸和辅酶之间形成Schiff’s碱。
PyP的磷酸盐可以与聚合物优选羟烷基淀粉特别是羟乙基淀粉的氨基反应，形成磷酰胺。然后PyP的醛基与蛋白质的氨基反应，形成Schiffs碱，然后被还原。在优选的实施方案中，偶联物的结构是HES-NH-P(O)2-O-(吡哆醛)-CH-NH-蛋白质。
关于PyP，聚合物的官能团Q优选如上所述通过使用二-氨基化合物将聚合物的官能团Q引入聚合物。
因此，本发明也指上述方法和偶联物，其中包含Q的聚合物衍生物进一步与吡哆醛磷酸酯反应，Q为氨基。
至于包含氨基的聚合物衍生物同例如苯甲酸的反应的溶剂，优选至少一种质子惰性溶剂或至少一种极性溶剂。在其他的溶剂中，合适的溶剂是二甲基亚砜(DMSO)，N-甲基吡咯烷酮，二甲基乙酰胺(DMA)，二甲基甲酰胺(DMF)和两种或更多的混合物。
至于包含氨基的聚合物衍生物与包含羧基的至少双功能团化合物的反应所用的溶剂，可以使用水性介质。本发明的情况下所用的术语“水性介质”是指包含水的溶剂或溶剂混合物，以所包含的溶剂的重量为基础，水的重量占至少10％，优选至少20％，更优选至少30％，更优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，上限100％。
该反应优选在温度0到40℃下进行，更优选0到25℃，尤其优选15℃到25℃，反应时间优选0.5到24小时，尤其优选1到17小时。
根据一个优选的实施方案，反应在有活化剂存在下进行。适当的活化剂包括碳化二亚胺如二异丙基碳化二亚胺(DIC)，二环己基碳化二亚胺(DCC)，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)，尤其优选二异丙基碳化二亚胺(DIC)。
产生的聚合物衍生物可以通过至少一种适合的方法从反应混合物中纯化。如果需要，聚合物的衍生物可以在分离之前通过至少一种适合的方法来沉淀。
如果聚合物衍生物首先被沉淀，可以在适当温度下，例如用与反应混合物中存在的溶剂或溶剂混合物不同的至少一种溶剂或溶剂混合物与反应混合物接触。根据本发明特别优选的实施方案，使用水性介质优选水为溶剂，反应混合物同2-丙醇或同优选1∶1混合(v/v)的丙酮和乙醇的混合物接触，表明所述化合物具有相同的体积，在温度优选范围从-20到+50℃，尤其优选从-20到25℃。
聚合物衍生物的分离通过适当的可能包括一或多步的过程来进行。根据本发明的优选的实施方案，聚合物的衍生物通过适当的方法如离心或过滤实现首先从反应混合物或反应混合物与如2-丙醇混合物的混合物中分离。第二步，已分离的聚合物衍生物还要进行进一步的处理，如后处理像透析、离心过滤或减压过滤、离子交换色谱、反相色谱、HPLC、MPLC、凝胶过滤和/或冻干。根据更优选的实施方案，已分离的聚合物衍生物先通过渗析，优选对水，然后根据对产物的规范要求冻干至反应物的溶剂成分足够低。冻干在从20℃到35℃优选20℃到30℃的温度下进行。
产生的含有醛基或酮基或半缩醛基的聚合物衍生物接着通过还原氨化与蛋白质的氨基反应。至于蛋白质的至少一个氨基通过还原氨化与聚合物的至少一个醛基或酮基或半缩醛基偶合，参考上述具体公开的关于还原氨化反应的具体反应参数，对如pH或温度。根据本发明一个尤其优选的实施方案，与蛋白质的氨基的反应优选在温度0到10℃如1到8℃，或2到6℃如4℃，pH值大约4.5到5.5如大约5.0。反应的时间范围从10小时到20小时，如12到19小时，或从14到18小时，如17小时，或大约20到30小时，如24小时。
因此，根据上述优选的实施方案，如果聚合物通过其氧化还原端反应，本发明也涉及到到根据下式的偶联物
根据一个优选的实施方案，像上面所说的，聚合物是羟乙基淀粉，即HAS′是HES′，并且n＝2、3或4，最优选4。因此，如果聚合物通过它的氧化还原端反应，本发明也涉及到根据下式的偶联物：
根据另一个优选的实施方案，如果聚合物通过它的氧化还原端反应，本发明也涉及到根据下式的偶联物：
其中，n＝2、3或4，R4是独立的氢或甲氧基，和如果R4是则氢m＝0，如果R4是甲氧基则m＝1，HAS优选为HES′。
在每一个上面的式子中，连在蛋白质上的氮是源于蛋白质的氨基，聚合物衍生物通过醛基相连。
考虑到上述实施例，根据这个实施例，官能团M和Q包含氨基-NH2，M是氨基-NH2且Q包含β羟氨基-CH(OH)-CH2-NH2优选β羟氨基也是可能的。
因此，本发明也涉及到上述偶联物和方法，其中，包含两个氨基M和Q的化合物的氨基Q是β羟氨基-CH(OH)-CH2-NH2。
在这种情况下，M和Q可以被适当的间隔基分开。其中间隔基可以是任选取代，线性的，分支的和/或环形的碳氢化合物残基。通常，碳氢化合物残基含有从1到60，优选1到40，更优选从1到20，更优选从2到10，更优选从1到6，尤其优选从1到2个碳原子。如果存在杂原子，间隔基团包括通常从1到20优选从1到8尤其优选从1到4个杂原子。碳氢化合物残基可以是随意分支的烷基链或芳基或含有例如从5到7个碳原子的环烷基，或是芳烷基，烷芳基，烷芳基中的烷基可以是线性的或环烷基。根据一个甚至更优选的实施方案，碳氢化合物残基是一个含有1到20，优选1到10，更优选1到6，更优选1到4个，尤其优选1到2碳原子的烷基链。更优选，M和Q通过亚甲基分开。
因此，本发明也涉及到上述方法和偶联物，其中聚合物与1，3-二氨基-2-羟丙烷反应。
如果聚合物通过它的氧化还原端反应，产生了根据下式的聚合物衍生物。
尤其优选HAS′＝HES′。
包含M和Q的至少双功能团化合物，特别是1，3-二氨基-2-羟丙烷与聚合物的反应在温度40到120℃，更优选40到90℃，尤其优选60到80℃。反应时间优选17到168小时，更优选17到96小时，尤其优选48到96小时。至少双功能团化合物∶聚合物的摩尔比率在范围从200∶1到10∶1，特别是从50∶1到100∶1。
至于至少双功能团化合物与聚合物反应的溶剂，优选至少一种质子惰性溶剂，特别优选在无水的质子惰性溶剂下反应，其中水成分以重量计不超过0.5％，优选以重量计不超过0.1％。在其他的溶剂中，合适的溶剂是二甲基亚砜(DMSO)，N-甲基吡咯烷酮，二甲基乙酰胺(DMA)，二甲基甲酰胺(DMF)及其两种或更多种的混合物。
聚合物衍生物的β羟氨基Q通常与至少双功能团化合物反应，至少双功能团化合物包含有至少一个能与Q反应的官能团并还包含至少一个为醛基或酮基或半缩醛基的官能团或能够被修饰得到醛基或酮基或半缩醛基的官能团。根据本发明的另一个优选的实施方案，β羟氨基通过化学氧化直接化学修饰成醛基。
这种氧化反应在合适的氧化剂下进行，这种氧化剂能把β羟氨基转变为醛基。优选的氧化剂是高碘酸盐如碱金属的高碘酸盐。尤其优选的是高碘酸钠，优选在水溶液中使用。优选的高碘酸盐的浓度范围是1到50mM，更优选从1到25mM，特别优选1到10mM。氧化反应在温度从0到40℃，优选0到25℃尤其优选4到20℃下进行。
产生的聚合物的衍生物可以通过至少一种适合的方法来从反应的混合物中纯化。如果需要，聚合物的衍生物在分离之前通过至少一种适合的方法来沉淀。
如果聚合物衍生物首先被沉淀，例如，在适当的温度下，用与反应混合物中存在的溶剂或溶剂混合物不同的至少一种溶剂或溶剂的混合物同反应混合物接触。根据本发明特别优选的实施方案，使用水性介质优选水为溶剂，反应混合物同2-丙醇或同优选1∶1混合(v/v)的丙酮和乙醇的混合物接触，表明所说的化合物具有相同的体积，优选的温度范围从-20到+50℃，尤其优选从-20到25℃。
聚合物衍生物的分离通过适当的可能包括一或多步的过程来进行。根据本发明的优选的实施方案，聚合物的衍生物通过适当的方法如离心或过滤实现首先从反应的混合物或反应混合物与如2-丙醇混合物的混合物中分离。第二步，已分离的聚合物衍生物还要进行进一步的处理，如后处理方法像透析、离心过滤或减压过滤、离子交换色谱、反相色谱、HPLC、MPLC、凝胶过滤和/或冻干。根据更优选的实施方案，已分离的聚合物衍生物先通过渗析，优选对水，然后根据对产物的规范要求冻干至反应物的溶剂成分足够低。冻干在从20℃到35℃优选20℃到30℃的温度下进行。
因此，本发明也涉及到上述方法和偶联物，其中β羟氨基Q的氧化反应通过高碘酸盐来进行。
因此，本发明也涉及到上述方法和偶合物，其中使用的聚合物具有氧化的还原端，优选用高碘酸盐使具有β羟氨基的聚合物衍生物，尤其优选
其中HAS′＝HES′的聚合物衍生物被氧化成含有醛基的聚合物衍生物，尤其优选
其中HAS′＝HES′。
根据本发明，包含上面说的1-氨基2-羟基结构的化合物同包含有上文中描述的羧基或活性羧基和醛基、酮基或缩醛的至少双功能团化合物反应得到聚合物衍生物，该衍生物可以与蛋白质的氨基进行还原氨化反应。
产生的带有醛基A的聚合物衍生物接着与蛋白质反应。因此，本发明也涉及产生偶联物的方法，所说的方法包括含有β羟氨基的聚合物衍生物与蛋白质的氨基反应，这里，如果所用的聚合物具有氧化还原端尤其优选根据式
并且特别是HAS′＝HES′。
产生的带有醛基A的聚合物衍生物接着通过还原氨化与蛋白质的氨基反应。关于蛋白质的至少一个氨基与聚合物的至少一个醛基通过还原氨化进行偶合反应，参考上述具体公开的内容。
因此，根据上述优选的实施方案，如果所用的聚合物带有氧化还原端，本发明也涉及根据式
的偶联物，特别是HAS′＝HES′。在上面的式中，连在蛋白质上的氮来自于蛋白质的氨基，聚合物衍生物通过醛基连接。
根据本发明进一步优选的实施方案，聚合物首先与适当的化合物反应得到包含至少一个活性羧基的第一聚合物衍生物。第一聚合物衍生物进一步与另外一个至少双功能团化合物反应，其中该另外的化合物的至少一个官能团与聚合物的衍生物的至少一个活性羧基反应，并且这个另外的化合物的至少另一个官能团是醛基、酮基或半缩醛基或能化学修饰成醛基、酮基或半缩醛基的官能团，其中得到的包含所述醛基、酮基或半缩醛基的聚合物衍生物通过还原氨化与蛋白质的至少一个氨基反应。也可以改变相应的化合物彼此反应的顺序。
根据所说的进一步实施方案的第一个选择，包含至少一个活性羧基的聚合物可以通过聚合物还原端的选择性氧化，并接着为内酯的氧化聚合物
和/或羧酸
或羧酸的适当盐如碱金属盐优选钠盐和/或钾盐，同适当的化合物反应，得到包含至少一个活性羧基的聚合物，HAS′优选为HES′。
聚合物优选羟乙基淀粉的氧化，可以根据能得到具有上述结构(IIa)和/或(IIb)的化合物的每一个方法或方法的组合来进行。
尽管该氧化反应可以通过所有的适合的方法或产生具有氧化还原端的羟烷基淀粉的方法来进行，优选使用上述碱性的碘溶液来进行，例如DE 196 28 705 A1(实施例A，第9栏，6至24行)中的相应内容在此引入作为参考。
可以通过所有可能的方法和所有适当的化合物，实现把活性羧基引入到还原末端被选择性氧化的聚合物上。
根据本发明明确的方法，在25℃下，还原末端被选择性氧化的聚合物在氧化还原末端和至少一种醇反应，优选至少一种酸性醇，例如pKA值范围为6至12或pKA值范围为7至11的酸性醇。酸性醇的分子量可能为80至500g/mol，例如酸性醇的分子量为90至300g/mol或100至200g/mol。
适当的酸性醇是所有的醇H-O-RA，其具有酸性质子且能与氧化的聚合物反应生成相应的活性聚合物酯，优选如下结构
更优选如下结构
优选的醇是N-羟基琥珀酰亚胺类例如N-羟基琥珀酰亚胺或磺基-N-羟基琥珀酰亚胺，适当取代的苯酚例如p-硝基酚、o，p二硝基酚、o，o′-二硝基酚，三氯苯酚例如2，4，6-三氯苯酚或2，4，5-三氯苯酚，三氟苯酚例如2，4，6-三氟苯酚或2，4，5-三氟苯酚，五氯苯酚、五氟苯酚，或羟基吡咯例如羟基苯并三唑。尤其优选为N-羟基琥珀酰亚胺类，尤其优选N-羟基琥珀酰亚胺或磺基-N-羟基琥珀酰亚胺。所有的醇可以单独使用或作为其中两个或更多适当组合使用。在本发明中，还可以使用例如可以通过加入碳酸二酯而释放出相应的醇的化合物。
因此，本发明同样涉及上述方法，其中通过氧化的聚合物与酸性醇反应，优选N-羟基琥珀酰亚胺和/或磺基-N-羟基琥珀酰亚胺，还原末端选择性氧化的聚合物被活化。
因此，根据本发明优选的实施方案，其中还原末端选择性氧化的聚合物，在氧化还原末端与至少一种碳酸酯RB-O-(C＝O)-O-Rc反应，其中RB和Rc可以相同或不同。优选地，该方法得到结构如下式所示的活性聚合物：
其中HAS’优选HES′。
作为适当的碳酸二酯化合物，可以使用这样的化合物，化合物的醇成分独立地是N-羟基琥珀酰亚胺类，例如N-羟基琥珀酰亚胺或磺基-N-羟基琥珀酰亚胺，适当取代的苯酚例如p-硝基酚、o，p二硝基酚、o，o′-二硝基酚，三氯苯酚例如2，4，6-三氯苯酚或2，4，5-三氯苯酚、三氟苯酚例如2，4，6-三氟苯酚或2，4，5-三氟苯酚，五氯苯酚、五氟苯酚，或羟基吡咯例如羟基苯并三唑。尤其优选的是N-N′-琥珀酰亚胺基碳酸酯和磺基-N-N′琥珀酰亚胺基碳酸酯，其中尤其优选N-N′琥珀酰亚胺基碳酸酯。
因此，本发明同样涉及上述方法，其中通过氧化的聚合物与N-N′琥珀酰亚胺基碳酸酯反应，还原末端选择性氧化的聚合物被活化。
在酸性醇∶聚合物的摩尔率优选为5∶1至50∶1，更优选8∶1至20∶1的条件下，反应温度优选为2至40℃，更优选10至30℃和尤其优选15至25℃，反应时间优选为1至10h，更优选2至5h，更优选2至4h下，酸性醇与氧化聚合物或氧化聚合物的盐反应。
碳酸二酯化合物同氧化聚合物或氧化聚合物的盐反应，反应条件如下：二酯化合物∶聚合物的摩尔率通常为1∶1至3∶1，例如1∶1至1.5∶1；反应时间通常为0.1至12h，例如0.2至6h，或0.5至2h或0.75至1.25h下。
根据本发明优选的实施方案，氧化聚合物与酸性醇和/或碳酸二酯的反应在至少一种疏质子溶剂中进行，例如在按重量计，含水量至多为0.5％，优选含水量至多为0.1％的无水疏质子溶剂中。适当的溶剂是二甲亚砜(DMSO)、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺(DMA)、二甲基甲酰胺(DMF)和其中两种或更多的混合物。反应温度优选为2至40℃，更优选10至30℃。
对于氧化聚合物与至少一种酸性醇的反应，使用至少一种活化剂。
其中适当的活化剂是羰基二咪唑，碳二酰亚胺例如二异丙基碳二酰亚胺(DIC)、二环己基碳二酰亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)，尤其优选二环己基碳二亚胺(DCC)和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)。
因此，本发明同样涉及上述方法，其中在活化剂存在下，还原末端氧化的聚合物与酸性醇反应生成活性聚合物酯。
因此，本发明的实施方案，在低碱性下，氧化聚合物与碳酸二酯和/或酸性醇反应，低碱性可以通过向水中加入活性混合物来控制，水∶活性混合物的体积比率为10∶1。在添加之前，基本上不合缓冲液的水，在25℃下pH为7。在加入反应混合物之后，通过测定pH值，获得反应混合物的低碱性，优选pH值至多为9.0，更优选pH至多8.0和尤其优选pH至多7.5。
根据本发明的另一个实施方案，氧化的聚合物同N-羟基琥珀酰亚胺在无水干燥DMA中，在无水条件下同EDC反应，选择性的生成聚合物N-羟基琥珀酰亚胺酯，结构如下式所示
更优选HAS’为HES’。
令人惊讶的是，本反应没有生成由EDC与HES的OH基反应而得到的副产物，并且出人意料地被抑制了EDC和氧化聚合物形成的O-酰基异脲向相应N-酰基脲的重排反应。。
根据本发明的另一个实施方案，在没有水和活化剂的条件下，在干燥的DMF中，氧化聚合物与N-N′二琥珀酰亚胺基碳酸酯反应，选择性的生成聚合物N-羟基琥珀酰亚胺酯，结构如下式所示
更优选HAS’为HES’。
根据本发明的另一个实施方案，还原末端选择性氧化的聚合物，在氧化还原末端同羰基氮杂茂例如羰基二咪唑或羰基二苯并咪唑反应生成具有活性羧基的聚合物。在羰基二咪唑的情形，得到活性咪唑酰胺(imidazolide)聚合物衍生物，结构如下式所示：
，其中HAS’为HES’。
根据本发明关于将至少一个活性羧基引入聚合物的进一步实施方案的第二种选择，通过聚合物的至少一个羟基和碳酸二酯反应，将活性羧基引入还原末端未被氧化的聚合物。
因此，根据本发明同样涉及方法和偶联物，其中通过聚合物的至少一个羟基与至少一种碳酸二酯RB-O-(C＝O)-O-Rc反应，其中RB和Rc可以相同或不同，将活性羧基引入到还原末端未被氧化的聚合物中。
根据本发明的另一个实施方案，还原末端未被氧化的聚合物的至少一个羟基与羰基氮杂茂，例如羰基二咪唑，羰基-二-(1，2，4-三唑)或羰基二苯并咪唑反应，生成具有活性羧基的聚合物。
作为适当的碳酸酯化合物，可以使用这样的化合物，化合物的醇成分独立地是N-羟基琥珀酰亚胺类，例如N-羟基琥珀酰亚胺或磺基-N-羟基琥珀酰亚胺，适当取代的苯酚例如p-硝基酚、o，p二硝基酚、o，o′-二硝基酚，三氯苯酚例如2，4，6-三氯苯酚或2，4，5-三氯苯酚、三氟苯酚例如2，4，6-三氟苯酚或2，4，5-三氟苯酚、五氯苯酚、五氟苯酚，或羟基吡咯例如羟基苯并三唑。
尤其优选的是对称的碳酸二酯化合物，因此RB和RC是相同的。碳酸酯的醇组分优选自N-羟基琥珀酰亚胺、磺化的N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基苯并三唑和硝基-和卤代苯酚。在其中，优选硝基苯酚、二硝基苯酚、三氯苯酚、三氟苯酚、五氯苯酚和五氟苯酚。尤其优选为N，N′-二琥珀酰亚胺碳酸酯和磺基-N，N′-二琥珀酰亚胺碳酸酯，其中特别优选N，N′-二琥珀酰亚胺碳酸酯。
因此，本发明同样涉及羟烷基淀粉衍生物，优选羟乙基淀粉衍生物，其中所述淀粉的至少一个羟基优选至少两个羟基同碳酸二酯化合物反应生成相应的活性酯。
根据本发明的一个实施方案，还原末端未被氧化的聚合物与至少一个碳酸二酯化合物反应，反应条件如下：反应温度为2至40℃，更优选10至30℃和尤其优选15至25℃，反应时间优选为0.5至5h，更优选1至3h，和尤其优选2至3。
碳酸二酯化合物∶聚合物的摩尔比取决于聚合物的取代程度，关系到与碳酸二酯化合物反应的羟基数目相对于未反应的聚合物中存在的羟基数目。
根据本发明的一个实施方案，碳酸二酯化合物∶聚合物的无水葡萄糖单元的摩尔比为1∶2至1∶1000，更优选1∶3至1∶100，特别优选1∶10至1∶50，取代程度的范围为0.5至0.001，优选0.33至0.01，特别优选0.1至0.02。
根据本发明的一个实施方案，还原末端未被氧化的聚合物与碳酸二酯在至少一种疏质子溶剂中反应，尤其优选在按重量计，含水量至多为0.5％，优选含水量至多为0.1％的无水疏质子溶剂中。其中，适当的溶剂是二甲亚砜(DMSO)、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺(DMA)、二甲基甲酰胺(DMF)和其中两种或更多的混合物。
因此，本发明也涉及上述的方法，其中在无水的质子惰性极性溶剂中，其还原末端未被氧化的聚合物的至少一个羟基与碳酸二酯反应生成活性羧基，所述溶剂优选二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺或其混合物。
活性聚合物含有至少一个活性羧基，优选得自于聚合物与酸性醇、碳酸盐和/或羰基氮杂茂的反应，，如上文所述，活性聚合物衍生物与另一个至少双官能团化合物进一步反应，其中该另一个至少双官能团化合物的F1官能团与聚合物衍生物的至少一个活性羧基反应。对于另一个化合物的至少一个官能团F1没有特别的限制，只要能够与聚合物的至少一个活性羧基反应即可。官能团F1优选，例如氨基或羟基或巯基或羧基。
该另一个至少双功能团化合物含有为醛基的至少一个其它官能团F2，或能经化学修饰提供醛基的官能团F2。化学修饰可能是，例如官能团F2与进一步连接化合物官能团F3的反应，或适当官能团F2的氧化，或适当官能团F2的还原。
如果，官能团F2与进一步化合物的官能团F3反应，其中官能团F2选自，
-C-C-双键或C-C-三键或芳族C-C-键；
-巯基或羟基；
-烷基磺酸酰肼，芳基磺酸酰肼；
-1，2-二醇；
-1，2-氨基醇；
-1，2氨基-巯；
-叠氮化物
-氨基-NH2，或含-NH结构单元的氨基的衍生物，例如氨烷基、氨芳基、氨芳烷基或烷芳基氨基，；
-羟氨基-O-NH2，或含-O-NH-结构单元的羟氨基基团的衍生物，例如羟烷氨基、羟芳氨基、羟芳烷氨基或羟烷芳氨基；
-烷氧氨基，芳氧氨基，芳烷氧氨基或烷芳氧氨基，均含-NH-O-结构单元；
-含有羰基的残基，-Q-C(＝G)-M，其中G为O或S，M为，例如，
-OH或-SH；
--烷氧基、芳氧基、芳烷氧基或烷芳氧基；
--烷硫基、芳硫基、芳烷硫基，或烷芳硫基；
--烷基羰氧基、芳基羰氧基、芳烷基羰氧基，或烷芳基羰氧基；
--活化酯，例如羟胺酯，具有醯亚胺结构如N-羟基琥珀酰亚胺，或具有O-N结构单元其中N为杂芳基化合物的一部分，或者，G＝O和Q不存在，例如具有取代芳基如五氟苯基、对硝基苯基或三氯苯基的芳氧基化合物；
其中Q不存在，或者为NH或杂原子如S或O；
--NH-NH2，或-NH-NH-；
--NO2；
-腈基；
-羰基如醛基或酮基；
-羧基；
--N＝C＝O基或-N＝C＝S基；
-乙烯卤化物基，如乙烯碘化物或乙烯溴化物基或三氟磺酸盐；
--C≡C-H；
--(C＝NH2Cl)-O烷基；
--(C＝O)-CH2-Hal基，其中Hal是Cl，Br，或I；
--CH＝CH-SO2-；
-含有-S-S-结构的二硫基；
其中，F3为能够与上述官能团形成化学键的基团，并优选自上述官能团。此外，第二连接化合物优选含有至少一个醛基或酮基或半缩醛基，其能够与蛋白质的氨基经还原氨化进行反应。
与聚合物反应的至少双官能团连接化合物中的官能团F1同醛基或酮基或半缩醛基，和/或至少双官能团连接化合物中的官能团F1同F2与，和/或另一个至少双官能团连接化合物中的官能团F3同醛基或酮基或半缩醛基，可以各自独立地通过合适的间隔基分隔开。其中，间隔基可以是任选适当取代的、直链、支链/或环状、脂肪族和/或芳香族烃残基。通常，烃残基具有最高60个碳原子，优选最高40个碳原子，更优选最高20个碳原子，更优选最高10个碳原子。如果存在杂原子，间隔基基通常含有1至20个杂原子，优选1至8个杂原子，更优选1至6个杂原子，尤其优选1至4个杂原子，特别优选1至2杂原子。作为杂原子，优选O，烃残基可能含有任选的支链烷基或芳基，或具有例如5至7个碳原子环烷基，，或芳烷基、烷芳基，其中烷基部分可以是直链和/或环烷基。
具有F1和F2官能团的化合物的例子是，例如任选取代的具有2至20个碳原子的二氨基烷烃，尤其优选1，2-二氨基乙烷、1，3二氨基丙烷或1，4二氨基丁烷，具有官能团F3和醛基或酮基或半缩醛基的化合物，优选例如甲酰基安息香酸、4-甲酰基安息香酸五氟苯基酯、4-甲酰基安息香酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯和4-(4-甲酰基-3，5-二甲氧基苯氧基)丁酸。
因此，本发明也涉及制备偶联物的方法，该方法包括，聚合物，优选羟乙基淀粉，在聚合物的任意氧化还原末端与选自酸性醇、碳酸二酯和羰基氮杂茂中的化合物反应，生成含有至少一个活性羧基的聚合物衍生物，该聚合物衍生物与至少一个至少双功能团反应生成聚合物衍生物，所生成的聚合物衍生物含有醛基或酮基或半缩醛基或能经化学修饰提供醛基或酮基或半缩醛基的官能团，任意化学修饰该官能团生成含有醛基或酮基或半缩醛基的聚合物衍生物，且含有醛基或酮基或半缩醛基的聚合物衍生物同蛋白质的氨基通过还原氨化进行反应。
因此，本发明还涉及一种含有聚合物和蛋白的偶联物，其中聚合物和蛋白彼此共价连接，聚合物优选羟乙基淀粉，该偶联物通过制备偶联物的方法得到，该方法包括，聚合物在其任意氧化还原末端同选自酸性醇、碳酸二酯和羰基氮杂茂中的化合物反应，生成含有至少一个活性羧基的聚合物衍生物，该聚合物衍生物与至少一个至少双功能团化合物反应生成聚合物衍生物，生成的聚合物衍生物含有醛基或酮基或半缩醛基或能化学修饰提供醛基或酮基或半缩醛基的官能团，任意化学修饰该官能团生成含有醛基或酮基或半缩醛基的聚合物衍生物，且含有醛基或酮基或半缩醛基的聚合物衍生物与蛋白质的氨基通过还原氨化进行反应。
含有官能团F1和经氧化生成醛基的官能团F2的化合物的具体例子有，例如具有氨基基团作为F1和具有β羟氨基作为F2的化合物。特别优选的例子是1，3-二氨基-2-羟基丙烷。可以用任何适当的氧化剂进行氧化，使β羟氨基转化为醛基。
优选的氧化剂是高碘酸盐例如碱金属高碘酸盐。尤其优选作为水溶液使用的高碘酸钠。该溶液优选的碘酸盐浓度为1至50mM，更优选1至25mM，尤其优选1至10mM。氧化在温度0至40℃下进行，优选0至25℃，更优选4至20℃。
生成的聚合物衍生物可以通过至少一种合适的方法从反应混合物中纯化。可能的话，聚合物衍生物在分离之前可以先用一种合适的方法沉淀。
如果聚合物衍生物首先沉淀，可能的，例如将反应混合物在适当的温度下与至少一种，与反应中使用的溶液或乳液混合物不同的，溶液或溶液混合物接触。根据本发明特别优选的一个实施方案，其中水性介质，优选水，用作溶剂。优选在-20至+50℃的温度下，尤其优选在-20至25℃范围内，反应混合物同2-丙醇或同优选1∶1混合(v/v)的丙酮和乙醇的混合物接触，表示所述化合物体积相同，。
聚合物衍生物的分离可以由适合的步骤进行，其中可以包括一步或更多步骤。根据本发明的优选实施方案，聚合物衍生物首先通过适当的方法例如离心或过滤，从反应混合物或反应混合物与例如2-丙醇水溶液的混合物中分离出来。在第二步骤中，分离出的聚合物衍生物进行进一步处理，例如透析、离心过滤或减压过滤，离子交换色谱，反相色谱，HPLC，MPLC，凝胶过滤和/或冻干。在更优选的实施方案中，分离后的聚合物衍生物首先透析，优选与水透析，然后冻干直至反应产物的溶剂含量十分低，根据产物的需求规格而定。离心可以在温度为20至35℃进行，优选在20至30℃。
根据本发明的另一个优选实施方案，同聚合物或聚合物衍生物的官能团A反应的蛋白质的官能团Z是巯基，其中蛋白质选自IFNα、IFNβ、tPA和A1AT。最优选是IFNα和IFNβ。
蛋白质中可以原本就存在巯基。而且，可根据合适的方法向蛋白质中引入巯基。其中，涉及化学方法。如果蛋白质中存在二硫桥键，可以还原S-S结构，生成巯基。也可以通过多肽经氨基同含有至少两个不同功能团的化合物反应，将多肽中的氨基转化为SH基，，，含有至少两个不同功能团的化合物的官能团之一能够与氨基反应，而另一个为SH基或SH基的前体。还可以通过蛋白质突变引入SH基，例如通过将半胱氨酸或合适的SH官能团氨基酸引入蛋白质中，或例如除去蛋白质中的半胱氨酸以使得蛋白质中的另一半胱氨酸失去活性，从而形成二硫桥键。
最优选，聚合物被连接到蛋白质的游离半胱氨酸上，尤其优选连接至IFNβ的17位游离半胱氨酸(在17位半胱氨酸变异情况下)，至半胱氨酸在IFNα的1和/或98位。
根据一个首选的实施方式，蛋白质的功能团Z为巯基，聚合物的官能团A为卤代乙酰基，其中通过聚合物在其任意的氧化还原末端与至少双官能团化合物反应引入A，其中，化合物的至少两个官能能团每个都含有氨基，以生成具有至少一个含氨基官能团的聚合物衍生物，该聚合物衍生物与单卤代醋酸和/或活性单卤代醋酸衍生物反应。
至少双官能团化合物具有至少两个官能团，每个含有氨基，这样的至少双官能团化合物可以是所有可想到的下述化合物它们能够同聚合物的任意还原末端反应生成含有氨基的聚合物衍生物，其可以与单卤代醋酸和/或活化单卤代醋酸衍生物反应。
根据一个优选的实施方式，至少双官能团化合物的一个官能团，所述的官能团为能够与聚合物任意的氧化还原末端反应，选自以下基团：
H2N
其中G为O或S，且如果出现两次，则独立的为O或S，且R′为甲基。
根据本发明一个特别优选的实施方案，至少双官能团化合物的官能团，所述的官能团为能够与蛋白质任意的氧化还原末端反应，为氨基-NH2。根据更优选的实施方案，最优选氨基的该功能团，与聚合物的氧化还原末端反应。
根据本发明的优选实施方案，至少双官能团化合物中能够与单卤代醋酸和/或活化单卤代醋酸衍生物反应的官能团，为氨基-NH2。
至少双官能团化合物中的官能团，优选两者均为氨基-NH2，可通过任何适合的间隔基被隔开，所述的官能团能够同聚合物任选的氧化还原末端优选氧化还原末端，和单卤代醋酸和/或活化单卤代醋酸衍生物反应。其中，间隔可以是任选取代的、直链、支链和/或环状烃残基。适合的取代为，烷基、芳基、芳烷基、烷芳基、卤素、羰基、酰基、羧基、羧酸酯、羟基、硫代、烷氧基和/或烷硫基基团。通常，烃残基含有1至60，优选1至40，更优选1至20，更优选2至10，更优选2至6，尤其优选2至4个碳原子。如果含有杂原子，间隔基团含有通常1至20，优选1至8并尤其优选1至4个杂原子。烃残基可以含有任选的支链烷基链或芳基，或具有例如5至7个碳原子的环烷基，或为芳烷基，烷芳基，烷基部分可为直链和/或环烷基。根据本发明更优选的实施方案，烃残基为1至20碳原子的烃基链，优选为2至10碳原子的烃基链，尤其优选为2至8碳原子的烃基链。因此，优选的至少双功能团化合物是双功能团氨基化合物，特别优选1，8-二氨基辛烷、1，7-二氨基庚烷、1，6-二氨基己烷、1，5-二氨基戊烷、1，4-二氨基丁烷、1，3-二氨基丙烷和1，2-二氨基乙烷。根据更优选的实施方案，至少双功能团化合物为二氨基聚乙二醇，优选根据下式的二氨基聚乙二醇：
H2N-(CH2-CH2-O)m-CH2-CH2-NH2，
其中m是整数，m优选1、2、3或4。
因此，本发明同样涉及上述的方法和偶联物，其中聚合物与1，8-二氨基辛烷、1，7-二氨基庚烷、1，6-二氨基己烷、1，5-二氨基戊烷、1，4-二氨基丁烷、1，3-二氨基丙烷和1，2-二氨基乙烷，在其氧化还原末端反应，生成聚合物衍生物，其结构式如下
其中n＝2、3、4、5、6、7或8，且聚合物优选为HES。
因此，本发明同样涉及上述的方法和偶联物，其中聚合物与H2N-(CH2-CH2-O)m-CH2-CH2-NH2在其氧化还原末端反应，其中m为1、2、3或4，生成结构式如下的聚合物衍生物：
其中m＝1、2、3或4，且聚合物优选为HES。
可以根据任何能得到具有以下结构(IIa)和/或(IIb)的化合物的方法或方法的组合，实现聚合物还原末端的氧化，：
虽然可以通过所有能产生羟烷基淀粉的氧化还原末端的适当方法进行氧化，优选使用所述的碱性碘溶液进行，例如在DE 196 28 705A1中的相应内容(实施例A，第9栏，6至24行)在此引入作为参考。
具有至少双功能团化合物同聚合物反应得到的聚合物衍生物，进一步与单卤代乙酸和/或活性单卤代乙酸衍生物反应。
作为单卤代乙酸或活性酸，Cl-取代乙酸、Br-取代乙酸和I-取代乙酸。
假如使用卤代酸，优选酸与聚合物衍生物在活化剂存在下反应。其中，适当的活化剂是碳二亚胺例如二异丙基碳二亚胺(DIC)、二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳酰亚胺(EDC)，尤其优选二环己基碳二酰胺(DCC)和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)。
因此，本发明同样涉及上述的方法和偶联物，其中聚合物，优选HES，与二氨基化合物反应，优选2至8个碳原子的二氨基烷烃或H2N-(CH2-CH2-O)m-CH2-CH2-NH2，其中m是整数，m优选1、2、3或4，且在活化剂优选EDC存在下，得到的聚合物衍生物与Br-取代乙酸和I-取代乙酸反应。
因此，本发明同样涉及聚合物衍生物，结构式如下
其中X＝Cl、Br或I，n＝2、3、4、5、6、7或8，且聚合物尤其优选HES，本发明同样涉及结构式如下的聚合物衍生物：
其中X＝Cl、Br或I，m＝1、2、3获4，且聚合物尤其优选HES。
聚合物衍生物与卤代醋酸的反应，优选在水性体系中进行，优选水，优选pH优选3.5至5.5，更优选4.0至5.0，尤其优选4.5至5.0；优选反应温度为4至30℃，更优选15至25℃，尤其优选20至25℃；优选的反应时间为1至8h，更优选2至6h，尤其优选3至5h。
反应混合物含有聚合物衍生物，其中含有聚合物、至少双官能团化合物和卤代醋酸，这样的混合物可以直接用于与蛋白质反应。根据本发明优选的实施方案，优选通过超滤、然后沉淀、任选的冲洗和真空干燥，将聚合物衍生物从反应混合物中分离。
聚合物衍生物与蛋白质的反应，优选在pH6.5至8.5进行，更优选7.0至8.5，尤其优选7.5至8.5；优选反应温度为4至30℃，更优选15至25℃，尤其优选20至25℃；优选的反应时间为0.5至8h，更优选1至6h，尤其优选2至5h。
聚合物衍生物与蛋白质巯基的反应，使得聚合物与蛋白质之间形成硫醚键。
因此，本发明同样涉及上述的方法和偶联物，其中聚合物，优选HES，与二氨基化合物反应，优选含有2至8个碳原子的二氨基烷烃或H2N-(CH2-CH2-O)m-CH2-CH2-NH2，其中m＝1、2、3或4，在活化剂优选EDC存在的条件下，生成的聚合物衍生物与Br代和I代醋酸反应，生成的聚合物衍生物与蛋白质的巯基反应，得到偶联物，其含有聚合物与蛋白质之间的硫醚键。
因此，本发明同样涉及以下式的偶联物
其中，n＝2、3、4、5、6、7或8，聚合物尤其优选为HES，蛋白质为IFN-α、IFN-β、tPA或A1AT，优选为IFN-α或IFN-β。S原子源自于IFN-β1a 17位的游离半胱氨酸或活性游离半胱氨酸。或下式的偶联物
其中，m＝1、2、3或4，聚合物尤其优选为HES，蛋白质为IFN-α、IFN-β、tPA或AlAT或APC，优选为IFN-α或IFN-β。S原子源自于IFN-β1a 17位的游离半胱氨酸。
羟乙基淀粉优选为具有约10KD平均分子量和约0.4DS的羟乙基淀粉，
或者具有约10KD平均分子量和约0.7DS的羟乙基淀粉
或者具有约12KD平均分子量和约0.4DS的羟乙基淀粉
或者具有约12KD平均分子量和约0.7DS的羟乙基淀粉
或者具有约18KD平均分子量和约0.4DS的羟乙基淀粉
或者具有约18KD平均分子量和约0.7DS的羟乙基淀粉
或者具有约30KD平均分子量和约0.4DS的羟乙基淀粉
或者具有约30KD平均分子量和约0.7DS的羟乙基淀粉
或者具有约50KD平均分子量和约0.4DS的羟乙基淀粉
或者具有约50KD平均分子量和约0.7DS的羟乙基淀粉
或者具有约100KD平均分子量和约0.7DS的羟乙基淀粉。
至于这些平均分子量和DS的各个组合，DS值也优选约0.8。
根据另一个实施方案，蛋白质的官能团Z为巯基，且聚合物衍生物的官能团A包含马来酰亚胺基。
根据该实施方案，偶联物的产生存在几种可能性。通常聚合物在其任意氧化还原末端与至少一个至少双功能团化合物反应，其中这个至少双功能团化合物含有一个能与聚合物的任意氧化还原末端反应的官能团，以及至少一个含有马来酰亚胺基的官能团，或能经化学修饰而得到含马来酰亚胺基的聚合物衍生物的官能团。根据更优选的实施方案，该官能团能经化学修饰生成含有马来酰亚胺基的聚合物衍生物。
因此，本发明还涉及上述的方法和偶联物，通过含马来酰亚胺基的聚合物衍生物同蛋白质的巯基反应，所述方法包括，聚合物在其任选氧化还原末端与含有官能团U的至少双功能团化合物反应，官能团U能与任选氧化还原末端反应，至少双功能团化合物还含有能化学修饰生成马来酰亚胺基的官能团W，所述方法进一步包括将官能团W化学修饰生成马来酰亚胺基。
对于官能团U，可以是能与聚合物的任选氧化还原末端反应的每个官能团。
根据本发明优选的实施方案，官能团U含有-NH-化学结构。
因此，本发明同样涉及上述的方法和偶联物，其中官能团U含有-NH-化学结构。
根据本发明更优选的一个实施方案，官能团U具有R′-NH-结构，其中R′为氢或烷基、环烷基、芳基、芳烷基、芳基环烷基、烷芳基或环烷芳基残基，其中环烷基、芳基、芳烷基、芳基环烷基、烷芳基或环烷芳基残基可能直接与NH基连接，或者另一个实施方案，环烷基、芳基、芳烷基、芳基环烷基、烷芳基或环烷芳基残基可能通过氧桥与NH基连接。烷基、环烷基、芳基、芳烷基、芳基环烷基、烷芳基或环烷芳基残基可被适当取代。作为优选的取代基，可以提及卤化物例如F，Cl或Br。尤其优选的残基R′为氢、烷基和烷氧基，更优选的是氢和未取代的烷基和烷氧基。
其中烷基和烷氧基中，优选具有1、2、3、4、5或6个碳原子的基团烷基和烷氧基。更优选的是甲基、乙基、丙基、异丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基和异丙氧基。尤其优选的是甲基、乙基、甲氧基、乙氧基，和特别优选的是甲基或甲氧基。
因此，本发明同样涉及上述的方法和偶联物，其中R′为氢或甲基或甲氧基。
根据本发明的另一个优选的实施方案，官能团U具有R′-NH-R″结构，其中R″优选含有-NH-结构单元和/或-(C＝G)-结构单元和/或-SO2-结构单元，其中G是O或S。根据更优选的实施方案，官能团R″选自下面的基团
其中，假如G出现两次，则独立地为O或S。
因此，本发明同样涉及上述的方法和偶联物，其中官能团U选自下面的基团
H2N-
其中G是O或S，如果出现两次，则独立的为O或S，且R′是甲基。
根据本发明的又一个优选实施方案，U含有氨基基团-NH2。
根据本发明的实施方案，含至少双功能团化合物的官能团W通过如下方式被化学修饰，含有W的聚合物衍生物同另一至少双功能团化合物反应，其中另一至少双功能团化合物含有能够与W反应的官能团并更进一步含有马来酰亚氨基。
至于官能团W和能与W反应的所述另一至少双官能团化合物的官能团，有以下官能团，其中：
-C-C-双键或C-C-三键或芳族C-C-键；
-硫代基或羟基；
-烷基磺酸酰肼，芳基磺酸酰肼；
-1，2-二醇；
-1，2-氨基醇；
-1，2氨基-巯；
-叠氮化物
-氨基-NH2或含-NH结构单元的氨基的衍生物，例如氨烷基、氨芳基、氨烷芳基，或氨芳烷基；
-羟氨基-O-NH2或含-O-NH-结构单元的羟氨基基团的衍生物，例如羟烷氨基、羟芳氨基、羟芳烷氨基或羟烷芳氨基；
-烷氧氨基，芳氧氨基，芳烷氧氨基或烷芳氧氨基；均含-NH-O-结构单元；
-含羰基的残基基团，-Q-C(＝G)-M，其中G为O或S，M为，例如，
-OH或-SH；
--烷氧基、芳氧基、芳烷氧基或烷芳氧基；
--烷硫基、芳硫基、芳烷硫基，或烷芳硫基；
--烷羰氧基、芳羰氧基、芳烷羰氧基，或烷芳羰氧基；
--活化酯，例如羟胺酯，具有的醯亚胺结构，例如N-羟基琥珀酰亚胺，或具有O-N结构单元其中N为杂芳基化合物的一部分，或者，G＝O和Q不存在，例如具有取代芳基例如五氟苯基、对硝基苯基或三氯苯基的芳氧基化合物；
其中Q不存在或为NH或杂原子S或O；
--NH-NH2，或-NH-NH-；
--NO2；
-腈基；
-羰基如醛基或酮基；
-羧基；
--N＝C＝O基或-N＝C＝S基；
-乙烯卤化物基，如乙烯碘化物或乙烯溴化物基或三氟磺酸盐；
--C≡C-H；
--(C＝NH2Cl)-O烷基；
--(C＝O)-CH2-Hal基，其中Hal是Cl，Br，或I；
--CH＝CH-SO2-；
-含有-S-S-的二硫基；
其中W和另一至少双官能团化合物的官能团，分别为能够与上述基团形成化学键的基团
根据本发明更优选的实施方案，W含有氨基-NH2。
根据本发明更优选的实施方案，W和其它官能团来自上面所列的基团。
根据本发明的实施方案，这些官能团其中之一是硫代基。在这个具体的方案中，其它官能团优选自以下基团：
其中Hal是Cl，Br，或I，更优选Br或I。
根据本发明尤其优选的实施方案，官能团之一选自，活性酯，如具有酰亚胺结构的羟胺酯，如N-羟基琥珀酰亚胺，或O-N结构单元，其中N是杂芳基化合物的一部分，或例如带有取代芳基的芳氧基化合物，取代芳基如五氟苯基、对硝基苯基或三氯苯基，或可任选地转换成活性酯的羧基，在这种情形中，其它的官能团包含化学结构-NH-。
根据本发明尤其优选的实施方案，W含有结构-NH-，另一至少双功能团化合物含有活性酯和马来酰亚胺基团。
至于含有-NH-结构的官能团W，以上述的结构作为参考，其中W可能与U相同或不同。根据本发明尤其优选的实施方案，W和U相同的。更优选的，U和W都含有氨基。尤其优选的，U和W都是-NH2氨基。
根据本发明的一个实施方案，在水性介质中，聚合物可以与含有U和W的至少双功能团化合物在其非氧化还原末端反应。根据更优选的方案，U和W都是氨基，反应采用具有氧化形式的还原末端的聚合物，在至少一种质子惰性溶剂中进行，尤其优选的是无水的质子惰性溶剂，其中水的含量按重量计至多0.5％，更优选的是水的含量按重量计至多0.1％。合适的溶剂是，二甲亚砜(DMSO)、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺(DMA)、二甲基甲酰胺(DMF)和其中两种或更多的混合物。
特别是，在U和W均是-NH2氨基的情形，U和W可以通过合适的间隔基分隔开。其中，间隔基可以是任意适当的取代、直链、支链/或环烃残基。其中，适当的取代基是烷基、芳基、芳烷基、烷芳基、卤素、羰基、酰基、羧基、羧基酯、羟基、硫代、烷氧基和/或烷硫基。通常，烃残基具有1至60个碳原子，优选1至40个碳原子，更优选1至20个碳原子，更优选2至10个碳原子，更优选2至6个碳原子，尤其优选2至4个碳原子。如果存在杂原子，间隔基通常含有1至20个杂原子，优选1至8个杂原子，尤其优选1至4的杂原子。烃残基可能含有任选的支链烷基或芳基，或含有例如5至7个碳原子的环烷基，或芳烷基、烷芳基，其中烷基部分可以是直链和/或环烷基。根据更优选的实施方案，碳氢化合物残基为1至20个碳原子的烷基链，优选2至10个碳原子，更优选2至6个碳原子，和尤其优选2至4个碳原子。
因此，本发明也涉及如上所述的方法和偶联，其中聚合物的氧化还原末端与1，4-二氨丁烷、1，3二氨丙烷或1，2-二氨乙烷反应，生成下式的聚合物衍生物：
其中：n＝2、3或4，聚合物优选为HES。
根据上述的优选实施方案，含有氨基的聚合物衍生物，进一步同含有活性酯基和马来酰亚氨基的至少双官能团化合物反应。活性酯和马来酰亚氨基可以通过合适的间隔基分隔开。至于间隔基，可以参考官能团U和W的间隔基。根据本发明的更优选的实施方案，活性酯基和马来酰亚氨基通过烃链隔开，所述烃链具有1至10个碳原子，优选1至8个碳原子，更优选1至6个碳原子，更优选1至4个碳原子，更优选1至2个碳原子和尤其优选1个碳原子。根据又一个更优选的实施方案，活性酯是琥珀酰亚胺酯，并且根据更优选的实施方案，含有马来酰亚氨基和活性酯基的至少双官能团化合物是N-(α-马来酰亚胺乙酸基)琥珀酰亚胺酯。
因此，发明也涉及下式的聚合物衍生物
其中n＝2，3，或4，聚合物优选为HES。
含有马来酰亚氨基的聚合物衍生物，进一步与蛋白质的巯基反应生成偶联物，偶联物含有通过硫醚基连接到蛋白质上的聚合物衍生物。
因此，本发明同样涉及一种含有蛋白质和聚合物的偶联物，结构如下：
其中，n＝2、3，或4，优选4，聚合物优选HES，蛋白质为IFNα、IFNβ、tPA，或A1AT，优选IFNα或IFNβ，其中上述化学式中的S原子衍生自，例如，IFNβ1a的Cys17。
羟乙基淀粉优选为具有约10KD平均分子量和约0.4DS的羟乙基淀粉
或者具有约10KD平均分子量和约0.7DS的羟乙基淀粉
或者具有约12KD平均分子量和约0.4DS的羟乙基淀粉
或者具有约12KD平均分子量和约0.7DS的羟乙基淀粉
或者具有约18KD平均分子量和约0.4DS的羟乙基淀粉
或者具有约18KD平均分子量和约0.7DS的羟乙基淀粉
或者具有约30KD平均分子量和约0.4DS的羟乙基淀粉
或者具有约30KD平均分子量和约0.7DS的羟乙基淀粉
或者具有约50KD平均分子量和约0.4DS的羟乙基淀粉
或者具有约50KD平均分子量和约0.7DS的羟乙基淀粉
或者具有约100KD平均分子量和约0.7DS的羟乙基淀粉。
至于平均分子量和DS的各个组合，DS值也优选约0.8。
含有马来酰亚氨基的聚合物衍生物同蛋白质的巯基之间的反应，优选在缓冲水溶液中进行，优选pH值5.5至8.5，更优选6至8和尤其优选6.5至7.5，优选的反应温度0至40℃，更优选0至25℃，尤其优选4至21℃，优选反应时间0.5至24h，更优选1至20h和尤其优选2至17h。通过加入至少一种合适的缓冲液来调节反应混合物至合适的pH值。其中优选的缓冲液，为醋酸钠缓冲液，磷酸盐或硼酸盐缓冲液，其含有优选浓度0至8M，更优选2至8M和尤其优选4至8M的脲，和/或含有优选浓度0至1％(w/v)，更优选0.4至1％(w/v)，尤其优选0.8至1％(w/v)的SDS。
偶联物可以被进一步处理，例如像透析、离心、过滤或压力过滤、离子交换色谱法、反向色谱、HPLC、MPLC、凝胶过滤和/或冷冻干燥的后处理。
在本发明制备偶联物的方法中，上述方法的转化率可以为至少50％，更优选至少70％，甚至更优选80％和尤其是95％或更多，例如至少98％或99％。
本发明也涉及一种偶联物，其含有蛋白质和聚合物或其衍生物，其中聚合物是羟烷基淀粉(HAS)，且蛋白质选自IFNβ、GM-CSF、APC、tPA、A1AT、AT III、因子VII、因子VIII和因子IX，所述偶联物结构如下式所示
其中R1，R2和R3独立地为氢或有2至10个碳原子的羟烷基，羟芳基，羟芳烷基或羟烷芳基，优选氢或羟烷基，更优选氢或羟乙基，其中G选自O或S，优选O，其中L是任选适当的取代，直链，支链和/或环状碳氢化合物残基，任选含有至少一个杂原子，优选2至60个碳原子的烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基残基。
本发明也涉及上述的偶联物，其中-L-是-(CH2)n-，n＝2、3、4、5、6、7、8、9、10，更优选2、3、4，尤其优选4。
本发明也涉及一种偶联物，其含有蛋白质和聚合物或其衍生物，其中聚合物是羟烷基淀粉(HAS)，且蛋白质选自IFNβ、GM-CSF、APC、tPA、A1AT、AT III、因子VII、因子VIII和因子IX，所述偶联物结构如下式所示
其中R1、R2和R3独立地为氢或有2至10个碳原子的羟烷基、羟芳基、羟芳烷基或羟烷芳基，优选氢或羟烷基，更优选氢或羟乙基，其中G选自O或S，优选O，并且
本发明也涉及一种偶联物，含有蛋白质和聚合物或其衍生物，其中聚合物是羟烷基淀粉(HAS)，且蛋白质选自IFNβ、GM-CSF、APC、tPA、A1AT、AT III、因子VII、因子VIII和因子IX，所述偶联物结构如下式所示
其中R1、R2和R3是独立的氢或有2至10个碳原子的羟烷基、羟芳基、羟芳烷基或羟烷芳基，优选氢或羟烷基，更优选氢或羟乙基，且
其中L是任选适当的取代、直链、支链和/或环状碳氢化合物残基，任选含有至少一个杂原子，优选2至60个碳原子的烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基残基。
本发明也涉及上述的偶联物，其中-L-为
-[(CRaRb)mG]n[CRcRd]o-
其中Ra、Rb、Rc、Rd独立地为氢、烷基、芳基，更优选氢，其中G选自O或S，优选O，并且
并且其中
m 1、2、3或4，其中在m个CRaRb基团中，残基Ra和Rb可以相同或不同；
n 0至20，优选0至10，更优选1、2、3、4、5，最优选1或2；
o 0至20，优选0至10，更优选更优选1、2、3、4、5，最优选1或2，其中在o个CRcRd基团中，残基Rc和Rd可以相同或不同，其中n和o的整数以上述结构式无过氧部分结果的方式选择，例如n和o不能同时为0。
本发明也涉及上述的偶联物，其中Ra、Rb、Rc、Rd为氢，m＝2，n＝1，且o＝2。
本发明也涉及一种偶联物，含有蛋白质和聚合物或其衍生物，其中聚合物是羟烷基淀粉(HAS)，且蛋白质选自IFNα、IFNβ、GM-CSF、APC、tPA、A1AT、AT III、因子VII、因子VIII和因子IX，所述偶联物结构如下式所示
其中R1、R2和R3独立地为氢或有2至10个碳原子的羟烷基、羟芳基、羟芳烷基或羟烷芳基，优选氢或羟烷基，更优选氢或羟乙基。
本发明也涉及一种偶联物，含有蛋白质和聚合物或其衍生物，其中聚合物是羟烷基淀粉(HAS)，且蛋白质是选自IFNα、IFNβ、GM-CSF、APC、tPA、A1AT、AT III、因子VII、因子VIII和因子IX，所述偶联物结构如下式所示
其中R1、R2和R3独立地为氢或有2至10个碳原子的羟烷基、羟芳基、羟芳烷基或羟烷芳基，优选氢或羟烷基，更优选氢或羟乙基。其中键-O-(C＝O)-是通过羧基或活性羧基同HAS分子的羟基反应形成的。
本发明也涉及一种偶联物，含有蛋白质和聚合物或其衍生物，其中聚合物是羟烷基淀粉(HAS)，且蛋白质选自IFNα、IFNβ、GM-CSF、APC、tPA、A1AT、AT III、因子VII、因子VIII和因子IX，所述结构如下式所示
其中R1、R2和R3独立地为氢或有2至10个碳原子羟烷基、羟芳基、羟芳烷基或羟烷芳基，优选氢或羟烷基，更优选氢或羟乙基，且
其中L是任选适当的取代、直链、支链和/或环状碳氢化合物残基，可任选含有至少一个杂原子，有1至60个碳原子，优选1至40个碳原子，更优选1至20个碳原子，更优选1至10个碳原子，更优选1至6个碳原子，更优选1至2个碳原子和尤其优选1个碳原子，尤其是L为CH2。
本发明也涉及一种偶联物，含有蛋白质和聚合物或其衍生物，其中聚合物是羟烷基淀粉(HAS)且蛋白质选自IFNα、IFNβ、GM-CSF、APC、tPA、A1AT、AT III、因子VII、因子VIII和因子IX，所述偶联物结构如下式所示
其中R1、R2和R3位独立的氢或有2至10个碳原子的羟烷基、羟芳基、羟芳烷基或羟烷芳基，优选氢或羟烷基，更优选氢或羟乙基，且
其中L1、L2是任选适当的取代、直链、支链和/或环状碳氢化合物残基，可任选含有至少一个杂原子，含有烷基、芳基、芳烷基、杂芳基，和/或杂芳烷基部分，该残基有1至60个碳原子，优选1至40个碳原子，更优选1至20个碳原子，更优选1至10个碳原子，其中D是键，优选共价键，它通过连接到L1上的适当官能团F2与连接到L2上的适当官能团F3形成的。
本发明也涉及上述的偶联物，其中L1为-(CH2)n-，n＝2、3、4、5、6、7、8、9、10，优选2、3、4、5、6，更优选2、3、4，尤其优选4。
本发明也涉及上述的偶联物，其中L2含有任选适当取代的芳基部分，优选含有6个碳原子的芳基部分，L2尤其优选为C6H4。
本发明也涉及上述的偶联物，其中选自：
-C-C双键或C-C三键或芳族C-C键。
-硫代基或羟基；
-烷基磺酸酰肼，芳基磺酸酰肼；
-1，2-二醇；
-1，2氨基巯；
-叠氮化物；
-1，2-氨基醇；
-氨基-NH2或含有NH-结构单元的氨基衍生物，例如氨烷基、氨芳基、氨芳烷基，或烷芳氨基；
-羟氨基-O-NH2，或含有-O-NH-结构单元的羟氨基衍生物，例如羟烷基氨、羟芳氨基、羟芳烷胺基或羟烷芳氨基；
-烷氧基氨基、芳氧基氨基、芳烷氧基氨基或烷芳氧基氨基，均含有-NH-O-结构单元；
-含有羰基的残基，-Q-C(＝G)-M，其中G为O或S，M为，例如，
-OH或-SH；
--烷氧基、芳氧基、芳烷氧基或烷芳氧基；
--烷硫基、芳硫基、芳烷硫基或烷芳硫基；
--烷羰氧基、芳羰氧基、芳烷羰氧基或烷芳羰氧基；
--活化酯，例如具有酰亚胺结构的羟胺酯，例如N-羟基琥珀酰亚胺，或具有O-N结构单元其中N为杂芳基化合物的一部分，或者，G＝O和Q不存在，例如具有取代芳基例如五氟苯基、对硝基苯基或三氯苯基的芳氧基化合物；
其中Q不存在或为NH或杂原子例如S或O；
--NH-NH2，或-NH-NH-；
--NO2；
-腈基；
-羰基如醛基或酮基；
-羧基；
--N＝C＝O基或-N＝C＝S基；
-乙烯卤化物基，如乙烯碘化物或乙烯溴化物基或三氟磺酸盐；
--C≡C-H；
--(C＝NH2Cl)-O烷基；
--(C＝O)-CH2-Hal基，其中Hal是Cl，Br，或I；
--CH＝CH-SO2-；
-含有-S-S-的二硫基；
其中F3为能够与F2形成化学键的官能团，并优选自上述官能团，F2优选含有-NH-部分，更优选含有氨基，F3优选含有-(C＝G)-部分，更优选含有-(C＝O)-，更优选含有-(C＝G)-G-，更优选含有-(C＝O)-G-，尤其优选含有-(C＝O)-O，D尤其优选酰胺键。
本发明也涉及一种偶联物，含有蛋白质和聚合物或其衍生物，其中聚合物是羟烷基淀粉(HAS)，且蛋白质选自IFNα、IFNβ、GM-CSF、APC、tPA、A1AT、AT III、因子VII、因子VIII和因子IX，所述偶联物结构如下式所示
HAS″-CH2-NH2-蛋白质′
其中，-CH2-NH-部分中的碳原子衍生自通过开环氧化作用引入聚合物的醛基，且其中氮原子衍生自蛋白质的氨基，其中HAS″为没有上述反应中引入的醛基碳原子的HAS分子。
本发明也涉及一种偶联物，含有蛋白质和聚合物或其衍生物，其中聚合物是羟烷基淀粉(HAS)，且蛋白质选自从IFNα、IFNβ、tPA、A1A因子VII和因子IX，所述偶联物结构如下式所示
其中R1、R2和R3独立地为氢或有2至10个碳原子羟烷基、羟芳基、羟芳烷基或羟烷芳基，优选氢或羟烷基，更优选氢或羟乙基，且
其中L是任选适当的取代、直链、支链和/或环状碳氢化合物残基，可任选含有至少一个杂原子，含有烷基、芳基、芳烷基、杂芳基，和/或杂芳烷基的一部分，该残基有2至60个碳原子，优选2至40个碳原子，更优选2至20个碳原子，更优选2至10个碳原子，其中硫原子来自半胱氨酸残基或蛋白质的二硫基。
本发明也涉及上述的偶联物，其中-L-为
-[(CRaRb)mG]n[CRcRd]o-
其中Ra、Rb、Rc、Rd独立地为氢、烷基、芳基、更优选氢，其中G选自O或S，优选O，并且
m 1、2、3或4，最优选2，其中在m个CRaRb官能团中，残基Ra和Rb可能相同或不同；
n 1至20，优选1至10，最优选1、2、3或4；
o 1至20，优选1至10，更优选更优选1、2、3、4、5，更优选1或2，最优选1，其中在o个基团CRcRd中，残基Rc和Rd可以相同或不同；
或其中
n 0和
o 2至20，优选2至10，更优选更优选2、3、4、5、6、7，或8，其中在o个基团CRcRd中，残基Rc和Rd可以相同或不同；
本发明也涉及一种偶联物，含有蛋白质和聚合物或其衍生物，其中聚合物是羟烷基淀粉(HAS)，且蛋白质选自IFNα、IFNβ、tPA、A1AT、因子VII和因子IX，所述偶联物结构如下式所示
其中R1、R2和R3独立地为氢或有2至10个碳原子的羟烷基、羟芳基、羟芳烷基或羟烷芳基，优选氢或羟烷基，更优选氢或羟乙基，且
其中L是任选适当的取代、直链、支链和/或环状碳氢化合物残基，可任选含有至少一个杂原子，含有烷基、芳基、芳烷基、杂芳基，和/或杂芳烷基的一部分，该残基有2至60个碳原子，优选2至40个碳原子，更优选2至20个碳原子，更优选2至10个碳原子，且
其中硫原子来自半胱氨酸或蛋白质的二硫基。
本发明也涉及上述的偶联物，其中-L-为
-[(CRaRb)mG]n[CRcRd]o-
其中Ra、Rb、Rc、Rd独立地为氢、烷基、芳基、更优选氢，其中G选自O或S，优选O，并且
m 1、2、3或4，最优选2，其中在m个CRaRb基团中，残基Ra和Rb可以相同或不同；
n 1至20，优选1至10，最优选1、2、3或4；
o 1至20，优选1至10，更优选更优选1、2、3、4、5，更优选1或2，最优选1，其中在o个CRcRd中，残基Rc和Rd可以相同或不同；
或其中
n 0和
o 2至20，优选2至10，更优选更优选2、3、4、5、6、7，或8，其中在o个CRcRd中，残基Rc和Rd可以相同或不同；
本发明也涉及上述的偶联物，其中羟烷基淀粉是羟乙基淀粉。
本发明也涉及上述的偶联物，其中羟乙基淀粉的分子量为2至200KD，优选4至130KD，更优选4至70KD。
根据另一个方面，本发明涉及上述的偶联物，或一种通过上述方法获得的偶联物在治疗人类或动物身体的方法中的用途。
根据本发明的偶联物可以是至少50％纯的，甚至更优选是至少70％纯的，甚至更优选是至少90％纯的，甚至是至少是95％或至少99％纯的。在最优选的实施方案中，即没有其它副产物存在下，偶联物可以是100％纯的。
因此，根据另一个方面，本发明也涉及含有本发明的偶联物组的合物，其中偶联物的量可能为至少50wt％，甚至更优选至少70wt％，甚至更优选至少90wt％，尤其的是至少95wt％或至少99wt％。最优选的实施方案，组合物由偶联物组成，即偶联物的量是100wt％。
此外，本发明涉及一种含有效治疗量的上述偶联物或者通过上述方法获得的偶联物的药物组合物。
本发明的所有蛋白质-HAS偶联物通过合适的方法给药，例如通过肠(entheral)，非肠胃(parentheral)或肺的方法，优选通过静脉(i.v.)，皮下(s.c.)，肌肉内(i.m.)途径给药。依靠治疗条件选择具体的给药途径。
优选的，偶联物通过合适的载体给药，例如在本领域中众所周知的(例如用于第一代/未修饰的生物药物的，不含白蛋白的，或含有白蛋白作为赋形剂的)，也可以通过适当的稀释剂给药，例如用于i.v.，s.c.，i.m.给药的无菌溶液。所需剂量取决于治疗病症的严重性，患者的个体反应，给药的方法等。本领域技术人员能够通过常识确定正确的剂量。
根据另一个方面，本发明涉及上述的HAS-优选HES-蛋白质偶联物的用途，或者通过上述方法获得的HAS-优选HES-蛋白质偶联物的用途，其中蛋白质为因子VIII，用于制备治疗血友病A的药物。
根据另一个方面，本发明也涉及上述的HAS-AT III偶联物的用途或者通过上述方法获得的HAS-蛋白质偶联物的用途，用于制备治疗以下疾病的药物：AT III遗传缺陷、静脉性闭塞性疾病、烧伤，和在冠状动脉旁路移植术(CABG)中的肝素抗凝，预防供氧治疗中微血凝块形成联合，治疗创伤或胃肠手术引起的内脏穿孔；弥散性血管内凝血(二C)和/或败血症。因此本发明含有HAS-AT III偶联物的药物组合物可以用于上述目的。
根据另一个方面，本发明也涉及上述HAS-优选HES-蛋白质偶联物的用途，或者通过上述方法获得的HAS-优选HES-蛋白质偶联物的用途，其中蛋白质为A1AT，用于治疗肺气肿、囊肿性纤维化、遗传性过敏性皮炎，和/或支气管炎的药物的制备，本发明含有HAS-A1AT-偶联物的药物组合物也可以用于上述目的。
根据另一个方面，本发明也涉及上述HAS-优选HES-蛋白质偶联物的用途，或者通过上述方法获得的HAS-优选HES-蛋白质偶联物的用途，其中蛋白质为tPA，用于制备药物，治疗心肌梗塞(心脏病)、血栓症、血栓栓塞或闭塞性疾病，尤其是闭塞动脉性疾病。
根据另一个方面，本发明也涉及上述的HAS-优选HES-蛋白质偶联物的用途，或者通过上述方法获得的HAS-优选HES-蛋白质偶联物的用途，其中蛋白质为APC，用于制备药物，治疗严重败血症、血栓症、血栓栓塞或闭塞性疾病，尤其是闭塞动脉性疾病。
根据另一个方面，本发明也涉及上述的HAS-优选HES-蛋白质偶联物的用途，或者通过上述方法获得的HAS-优选HES-蛋白质偶联物的用途，其中蛋白质为IFNα，用于制备药物，用于治疗白血病如毛细胞白血病、慢性粒细胞性白血病、多骨髓瘤、卵泡淋巴瘤、癌症如良性瘤，恶性黑素瘤和肝炎如慢性肝炎B和慢性肝炎C。
根据另一个方面，本发明也涉及上述的HAS-优选HES-蛋白质偶联物的用途，或者通过上述方法获得的HAS-优选HES-蛋白质偶联物的用途，其中蛋白质为IFNβ，用于制备药物，用于治疗多发性硬化症，尤其是复发感染型多发性硬化症。
本发明进一步涉及上述GM-CSF-HAS偶联物的用途，用于制备药物，用于治疗骨髓移植或老年人急性骨髓性白血病的诱导性化学疗法，骨髓移植物移入失败或延迟，松动以及在移植自体周边血液干细胞之后的骨髓恢复。
本发明也涉及HAS-因子VII偶联物的用途，用于与因子VIII或因子IX抑制剂一起制备药物，其用于治疗发病期的A或B型血友病患者。
本发明也涉及HAS-因子IX偶联物的用途，用于制备药物，用于控制和预防血友病B患者的出血性发病(例如天生性因子IX缺乏或血友病B)，包括控制和预防手术过程中的出血。
本发明通过随后的附图，表格和实施例来进一步说明，其不限制本发明保护的范围。
附图简述
附图1
附图1显示了实施例1.2所得HES-IFNβ偶联物的SDS-PAGE分析。在凝胶电泳中，使用XCell Sure Lock Mini Cell(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)和Consort E143电源(CONSORTnv，Turnhout，B)。按照生产商的指示，使用12％的Bis-Tris凝胶与还原条件的MOPS SDS跑板缓冲液(均来自Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。
道A：蛋白质标记的SeeBluet_Plus2(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。标记分子量由顶端至底部为：188kD，98kD，62kD，49kD，38kD，28kD，17kD，14kD，6kD，3kD。
道B：实施例1.1(a)制备的氧化IFNβ与HES衍生物偶联的粗产品
道C：实施例1.1(b)制备的氧化IFNβ与HES衍生物偶联的粗产品
道D：实施例1.1(c)制备的氧化IFNβ与HES衍生物偶联的粗产品
道E：实施例1.1(d)制备的氧化IFNβ与HES衍生物偶联的粗产品
道F：实施例1.1(e)制备的氧化IFNβ与HES衍生物偶联的粗产品
道G：实施例1.1(f)制备的氧化IFNβ与HES衍生物偶联的粗产品
道H：实施例1.1(g)制备的氧化IFNβ与HES衍生物偶联的粗产品
道I：实施例1.1(h)制备的氧化IFNβ与HES衍生物偶联的粗产品
道J：实施例1.1(i)制备的氧化IFNβ与HES衍生物偶联的粗产品
道K：实施例1.2(a)制备的氧化IFNβ
附图2
附图2显示了实施例1.4.所得HES-IFNβ偶联物的SDS-PAGE分析。在凝胶电泳中，使用XCell Sure Lock Mini Cell(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)和Consort E143电源(CONSORTnv，Turnhout，B)。按照生产商的指示，使用12％的Bis-Tris凝胶与还原条件的MOPS SDS跑板缓冲液(均来自Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。大于15μl样品在真空中浓缩至该体积。
道A：蛋白质标记的SeeBluet_Plus2(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。标记分子量由顶端至底部为：188kD，98kD，62kD，49kD，38kD，28kD，17kD，14kD，6kD，3kD。
道H：实施例1.3(a)中合成的醛基HES与IFN-β的偶联
道I：实施例1.3(b)中合成的醛基HES与IFN-β的偶联
道J：对照：没有醛基HES下，用硼氢化钠处理IFN-β
附图3
附图3显示了实施例2.2.所得HES-IFNα偶联物的SDS-PAGE分析。在凝胶电泳中，使用XCell Sure Lock Mini Cell(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)和Consort E143电源(CONSORTnv，Turnhout，B)。按照生产商的指示，使用12％的Bis-Tris凝胶与还原条件的MOPS SDS跑板缓冲液(均来自Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。大于15μl样品在真空中浓缩至该体积。
道A：蛋白质标记的SeeBluet_Plus2(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。标记分子量由顶端至底部为：188kD，98kD，62kD，49kD，38kD，28kD，17kD，14kD，6kD，3kD。
道E：实施例2.1(a)中合成的醛基HES与IFN-α的偶联
道F：实施例2.1(b)中合成的醛基HES与IFN-α的偶联
道G：对照：根据实施例2.2，没有醛基HES下，用硼氢化钠处理IFN-α
附图4
附图4显示了实施例3.2.所得HES-AT III偶联物的SDS-PAGE分析。在凝胶电泳中，使用XCell Sure Lock Mini Cell(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)和Consort E143电源(CONSORTnv，Turnhout，B)。按照生产商的指示，使用NuPage 3-8％的Tris-Acetate凝胶与还原条件的Tris-Acetate SDS跑板缓冲液(均来自InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。
道A：蛋白质标记的SeeBluet_Plus2(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。标记分子量由顶端至底部为：188kD，98kD，62kD，49kD，38kD，28kD，17kD，14kD，6kD，3kD。
道B：实施例3.1(a)制备的氧化AT III与HES衍生物偶联的粗产品
道C：实施例3.1(b)制备的氧化AT III与HES衍生物偶联的粗产品
道D：实施例3.1(c)制备的氧化AT III与HES衍生物偶联的粗产品
道E：实施例3.1(d)制备的氧化AT III与HES衍生物偶联的粗产品
道F：实施例3.1(e)制备的氧化AT III与HES衍生物偶联的粗产品
道G：实施例3.1(f)制备的氧化AT III与HES衍生物偶联的粗产品
道H：实施例3.1(g)制备的氧化AT III与HES衍生物偶联的粗产品
道I：实施例3.1(h)制备的氧化AT III与HES衍生物偶联的粗产品
道K：实施例3.2所述的氧化ATIIIGlycoThera
附图5
附图5显示了实施例3.4.所得HES-AT III偶联物的SDS-PAGE分析。在凝胶电泳中，使用XCell Sure Lock Mini Cell(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)和Consort E143电源(CONSORTnv，Turnhout，B)。按照生产商的指示，使用3-8％的Tris-Acetate凝胶与还原条件的Tris-Acetate SDS跑板缓冲液(均来自InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。
道A：蛋白质标记的SeeBluet_Plus2(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。标记分子量由顶端至底部为：188kD，98kD，62kD，49kD，38kD，28kD，17kD，14kD，6kD，3kD。
道B：实施例3.3(a)制备的AT III与醛基HES合成的偶联物
道C：实施例3.3(b)制备的AT III与醛基HES合成的偶联物
道D：对照：根据实施例3.3，没有醛基HES下，用硼氢化钠处理AT III
附图6：
附图6显示了实施例3.5中从甘油中纯化的AT III的HPGPC(高效凝胶渗透色谱)色谱(单一柱的UV和MALLS的检测结果，X轴为时间/分钟)。
以下参数用于HPGPC分析：
柱：Superose 12HR 10/30300×10mm I.D.(Pharmacia)
洗脱液：27.38mM Na2HPO4：12.62mM NaH2PO4；0.2MNaCl；含0.005％NaN3的11软化水
流速：0.24ml/h
检测器1：MALLS检测器
检测器2：UV(280nm)
检测器3：RI(折光率检测器)
附图7
附图7显示了实施例3.5中AT III偶联物的HPGPC(高效凝胶渗透色谱)色谱图(上面的色谱图是MALLS检测器，下面的色谱图是UV检测器，X轴为时间/分钟)。
以下参数用于HPGPC分析：
柱：Superose 12HR 10/30 300×10mm I.D.(Pharmacia)
洗脱液：27.38mM Na2HPO4：12.62mM NaH2PO4；0.2MNaCl；含0.005％NaN3的11软化水
流速：0.24ml/h
检测器1：MALLS检测器
检测器2：UV(280nm)
检测器3：RI(折光率检测器)
附图8
附图8显示了实施例4.2所得HES-GM-CSF偶联物的SDS-PAGE分析。在凝胶电泳中，使用XCell Sure Lock Mini Cell(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)和Consort E143电源(CONSORTnv，Turnhout，B)。按照生产商的指示，使用12％的Bis-Tris凝胶与还原条件的MOPS SDS跑板缓冲液(均来自Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。
道A：蛋白质标记的SeeBluet_Plus2(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。标记分子量由顶端至底部为：188kD，98kD，62kD，49kD，38kD，28kD，17kD，14kD，6kD，3kD。
道B：实施例4.1(a)制备的氧化GM-CSF与HES衍生物偶联的粗产品
道C：实施例4.1(b)制备的氧化GM-CSF与HES衍生物偶联的粗产品
道D：实施例4.1(c)制备的氧化GM-CSF与HES衍生物偶联的粗产品
道E：实施例4.1(d)制备的氧化GM-CSF与HES衍生物偶联的粗产品
道F：实施例4.1(e)制备的氧化GM-CSF与HES衍生物偶联的粗产品
道G：实施例4.1(f)制备的氧化GM-CSF与HES衍生物偶联的粗产品
道H：实施例4.1(g)制备的氧化GM-CSF与HES衍生物偶联的粗产品
道I：实施例4.1(g)制备的氧化GM-CSF与HES衍生物偶联的粗产品
道J：实施例4.1(h)制备的氧化GM-CSF与HES衍生物偶联的粗产品
道K：实施例4.2所述的氧化GM-CSF
附图9
附图9显示了实施例4.4.所得HES-GM-CSF偶联物的SDS-PAGE分析。在凝胶电泳中，使用XCell Sure Lock Mini Cell(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)和Consort E143电源(CONSORTnv，Turnhout，B)。按照生产商的指示，使用12％的Bis-Tris凝胶与还原条件的MOPS SDS跑板缓冲液(均来自Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。大于15μl的样品在真空中浓缩至该体积。
道A：蛋白质标记的SeeBluet_Plus2(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。标记分子量由顶端至底部为：188kD，98kD，62kD，49kD，38kD，28kD，17kD，14kD，6kD，3kD。
道H：实施例4.3(a)中合成的醛基HES与GM-CSF的偶联道I：实施例4.3(b)中合成的醛基HES与描GM-CSF的偶联
道J：对照：根据实施例4.4，没有醛基HES下，用硼氢化钠处理GM-CSF
附图10
附图10显示了实施例5.2.所得IFNβ偶联物的SDS-PAGE分析。在凝胶电泳中，使用XCell Sure Lock Mini Cell(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)Consort E143电源(CONSORTnv，Turnhout，B)。按照生产商的指示，使用12％的Bis-Tris凝胶与还原条件的MOPSSDS跑板缓冲液(均来自Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。
道A：蛋白质标记的SeeBluet_Plus2(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。标记分子量由顶端至底部为：188kD，98kD，62kD，49kD，38kD，28kD，17kD，14kD，6kD，3kD。
道B：实施例1.1(c)制备的氧化IFNβ与羟氨基HES衍生物偶联的粗产品
道C：氧化IFNβ
附图11
附图11显示了经RP-HPLC纯化的HAS修饰IFNβ(CHO细胞)的SDS-PAGE凝胶。
箭头指出未修饰IFNβ的位移位置，推测可能因为结构缺乏末端唾液酸衍生物，然而，HAS修饰IFNβ被检测为由分子量为35Kda-120Kda形成的宽弥散性考马斯染色区。
附图12
附图12显示HAS修饰IFN-β酶解得到N链低聚糖的HPAEC-PAD分析。
附图13
附图13显示HAS修饰IFN-β弱水解制备N链低聚糖的HPAEC-PAD分析。
附图14A
附图14A显示抗凝血酶III的SDS-PAGE分析：1＝未处理的ATIII；2＝高碘酸盐处理的AT III；3＝HAS修饰的AT III；各10ug点样于10％聚丙烯酰胺凝胶上。
附图14B
附图14B显示抗凝血酶III的SDS-PAGE分析：1＝未处理的AT
III；2＝高碘酸盐处理的AT III；3＝HAS修饰的AT III；各10ug点样于10％聚丙烯酰胺凝胶上。1+，2+和3+显示用多肽N-糖苷酶去-N-糖基化后的AT III的样品。
附图15
附图15显示了在实施例8.6.b)中，经多肽-N-糖苷酶处理后获得的AT III样品的N链多聚糖的HPAEC-PAD分析。1＝来自未处理的AT III的N-多聚糖；2＝来自用高碘酸盐弱处理的AT III；3＝来自用HAS修饰的AT IIII的N-多聚糖。A＝中性低聚糖的洗脱面积包括低聚甘露糖苷多聚糖(具有6-9个甘露糖残基)D＝三唾液酸化N-多聚糖的洗脱面积。HAS修饰的N-多聚糖的洗脱如轨迹3所示。
附图16
附图16显示了经多肽-N-糖苷酶处理后(实施例8.6.b))得到的AT III样品的去唾液酸化N-多聚糖(来自实施例8.6.c)弱酸处理)的HPAEC-PAD分析。1＝来自未处理的AT III的N-多聚糖；2＝来自用高碘酸盐弱处理的AT III；3＝来自用HAS修饰的AT的N-多聚糖。在轨迹1中，在16分钟洗脱出的峰代表N-乙酰基神经氨酸，在38分钟的峰代表N-羟乙酰神经氨酸。19分钟的最大峰代表与a1-6链海藻糖最接近的二触角结构。保留峰为二触角结构，其无海藻糖，二触角减去1半乳糖，及含有6-9个甘露糖残基的低聚甘露糖甘结构。HAS修饰的唾液酸衍生物的洗脱位置显示在轨迹3中。
附图17
附图17显示HAS(10Kda)修饰的GM-CSF的SDS-PAGE分析
1＝RP-HPLC洗脱液；2＝重组人GM-CSF原料。括号指示了位移位置C＝仅O-糖基化和非糖基化形式；B＝含有单N糖基占位的GM-CSF形式；A＝2个N-糖基化位点被碳水化合物占位的GM-CSF形式(Fomo et al.，2004比较)。
附图18
附图18显示了HAS(10Kda)修饰的(10Kda)GM-CSF的SDS-PAGE分析
1＝RP-HPLC洗脱液；2＝多肽N糖苷酶消化后的RP-HPLC洗脱液；3＝弱酸处理后的RP-HPLC洗脱液。括号指示了推测用HAS修饰高碘酸氧化唾液酸残基附加O-多糖的GM-CSF。
附图19
附图1显示了从GM-CSF分离的N-多聚糖的HPAEC-PAD分析
轨迹1＝未标记的蛋白质；轨迹2＝弱高碘酸盐氧化的GM-CSF；经RP-HPLC净化后的HAS(10Kda)修饰的GM-CSF。箭头A-E指示了无唾液酸、单、双、三和四唾液酸低聚糖的洗脱位置。起始原料的低聚糖的成分基本上与参考文献Forno et al.，2004中的描述一致。
附图20
附图20显示了根据实施例9.3.氧化ATIII和HES衍生物偶联后粗产品的凝胶电泳。
在凝胶电泳中，使用XCell Sure Lock Mini Cell(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)Consort E143电源(CONSORTnv，Turnhout，B)。按照生产商的指示，使用NuPage 3-8％的Tris-Acetate凝胶与还原条件的Tris-Acetate SDS跑板缓冲液(均来自Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。凝胶用Roti-Blue(Carl Roth GmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)染色。
道A：蛋白质标记的Roti-Mark ST和ARD(Carl Roth GmbH+Co.KG，Karlsruhe ，D)，标记分子量由顶端至底部为：200kD，119kD，66kD，43kD，29kD，20kD，14.3kD。
道B：实施例9.1(a)制备的氧化AT III与HES衍生物偶联的粗产品
道C：实施例9.1(b)制备的氧化AT III与HES衍生物偶联的粗产品
道D：实施例9.1(c)制备的氧化AT III与HES衍生物偶联的粗产品
道E：实施例9.1(d)制备的氧化AT III与HES衍生物偶联的粗产品
道F：实施例9.1(e)制备的氧化AT III与HES衍生物偶联的粗产品
道G：实施例9.1(f)制备的氧化AT III与HES衍生物偶联的粗产品
道H：实施例9.1(g)制备的氧化AT III与HES衍生物偶联的粗产品
道K：对照反应物
附图21
附图21显示了实施例9.4.所得ATIII偶联物的凝胶电泳。在凝胶电泳中，使用XCell Sure Lock Mini Cell(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)Consort E143电源(CONSORTnv，Turnhout，B)。按照生产商的指示，使用NuPage 3-8％的Tris-Acetate凝胶与还原条件的Tris-Acetate SDS跑板缓冲液(均来自Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。凝胶用Roti-Blue(Carl Roth GmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)染色。
道A：蛋白质标记的Roti-Mark ST和ARD(Carl Roth GmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)，标记分子量由顶端至底部为：200kD，119kD，66kD，43kD，29kD，20kD，14.3kD。
道B：实施例9.2(b)制备的AT III与HES衍生物偶联的粗产品
道C：实施例9.2(d)制备的AT III与HES衍生物偶联的粗产品
道D：对照反应物
道E：蛋白质标记的Roti-Mark STANDARD
附图22
附图22显示了根据实施例10.3.经活化醛糖酸偶合的IFN-α-HES的SEC。MALLS和UV-检测在反应中证实了反应中IFN-α的高转化程度。
附图23
附图23显示了Intron_A与NIH标准IFN-α2a的活性比较(参见实施例11.1)。
附图24
附图24显示了IFN-α-HES(右侧柱)与Intron_A(左侧柱)相对体外活性的比较，参见实施例11.2。
附图25
附图25显示了实施例12.2的结果(三角代表了IFN-α起始原料，正方形代表了HES-修饰的IFNα；对抗病毒感染实现MDBK细胞50％保护的稀释血清样品对在小鼠中i..v.注射30Fg/kg后的时间)。用未修饰起始原料处理的小鼠血清具有低抗病毒作用。用HES修饰的IFN-α可以充分延长血清的抗病毒作用。
附图26
附图26显示了实施例13的结果(通过凝胶电泳分析实施例13.5的α1AT-HES偶联物粗产品)
在凝胶电泳中，使用XCell Sure Lock Mini Cell(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)和与其配合的Power Pac 200(Bio-Rad，Munchen，D)。按照生产商的指示，使用3-8％的Tris-Acetate凝胶与还原条件的Tris-Acetate SDS跑板缓冲液(均来自InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。
道A：未染色的SDSPAGE蛋白质标记6.5-200KDa(SERVAElektrophoreisi GmbH，Heidelberg，D)，标记分子量由顶端至底部为：200KD，116KD，67KD，45kD，29KD，21KD，14.3KD，6.5KD；
道B：实施例13.5描述的醛基HES偶联物
道C：实施例13.6描述的HES偶联物
附图27
附图27显示了实施例13的结果(离子交换色谱收集的B1-C6级分的分析(参见实施例13.7)
凝胶电泳的条件参见图26。
道A：未染色的SDSPage蛋白质标记6.5-200KDa(SERVAElektrophoreisi GmbH，Heidelberg，D)，标记分子量由顶端至底部为：200KD，116KD，67KD，45kD，29KD，21KD，14.3KD，6.5KD；
道B：级分B1
道C：级分C1
道D：级分C2
道E：级分C3
道F：级分C4
道G：级分C5
道H：级分C6
道I：级分A1AT(GTC Biotherapeutics Inc.，Framingham，MA，lot No.080604A)
附图28
附图28显示了Prolastin_HS(Bayer Vital GmbH，Leverkusen，Germany，Lot No.PR4HA43)，A1AT(GTC Biotherapeutics Inc.，Framingham，MA，lot No.080604A)和实施例13.5中合成的HES-A1AT-偶联物的残留酶活性对浓度的图。
附图29
附图29显示了通过凝胶电泳分析实施例14.3的IFN-α-HES偶联物。
在凝胶电泳中，使用XCell Sure Lock Mini Cell(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)Consort E143电源(CONSORTnv，Turnhout，B)。按照生产商的指示，使用10％的Bis-Tris凝胶与还原条件的MOPS SDS跑板缓冲液(均来自Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。
道X：Roti_-Mark ST和ARD(Carl Roth GmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)标记分子量由顶端至底部为：200KD，119KD，88KD，43kD，29KD，20KD，14.3KD；
道A：实施例14.3.1A条所述的醛基HES10/0.4偶联物
道B：实施例14.3.1B条所述的醛基HES10/0.7偶联物
道C：实施例14.3.1C条所述的醛基HES30/0.4偶联物
道D：实施例14.3.1D条所述的醛基HES30/0.7偶联物
道E：实施例14.3.1E条所述的醛基HES50/0.4偶联物
道F：实施例14.3.1F条所述的醛基HES50/0.7偶联物
道G：对照反应物，不包括实施例14.3.1G条所述的醛基HES
道I：对照反应物，不包括实施例14.3.1I条所述的醛基HES和NaCNBH3
道J：对照反应物，不包括实施例14.3.1J条所述的HES10/0.4
道K：对照反应物，包括实施例14.3.1K条所述的HES10/0.4但不包括NaCNBH3
附图30
附图30显示了通过凝胶电泳分析实施例14.3.2的IFN-α-HES偶联物。
在凝胶电泳中，使用XCell Sure Lock Mini Cell(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)Consort E143电源(CONSORTnv，Turnhout，B)。按照生产商的指示，使用10％的Bis-Tris凝胶与还原条件的MOPS SDS跑板缓冲液(均来自Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。
道X：Roti_-Mark ST和ARD(Carl Roth GmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)标记分子量由顶端至底部为：200KD，119KD，88KD，43kD，29KD，20KD，14.3KD；
道A：实施例14.3.2A条所述的醛基HES偶联物
道B：实施例14.3.2B条所述的醛基HES偶联物
道C：实施例14.3.2C条所述的醛基HES偶联物
道D：实施例14.3.2D条所述的醛基HES偶联物
道E：实施例14.3.2E条所述的醛基HES偶联物
道F：实施例14.3.2F条所述的醛基HES偶联物
道G：对照反应物，包括实施例14.3.2G条所述的HES
附图30中显而易见的是，发现对照反应物G不反应。
附图31
附图31显示了通过凝胶电泳分析实施例14.3.3的IFN-α-HES偶联物。
在凝胶电泳中，使用XCell Sure Lock Mini Cell(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)Consort E143电源(CONSORTnv，Turnhout，B)。按照生产商的指示，使用10％的Bis-Tris凝胶与还原条件的MOPS SDS跑板缓冲液(均来自Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。
通过凝胶电泳分析IFN-α-HES偶联物粗产物。
道A：Roti_-Mark ST和ARD(Carl Roth GmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)标记分子量由顶端至底部为：200KD，119KD，66KD，43kD，29KD，20KD，14.3KD；
道B：实施例14.3.3条所述的IFNα和醛基HES30/0.8偶联物
道C：实施例14.3.3条所述的IFNα和醛基HES130/0.7偶联物
道D：实施例14.3.3条所述的IFNα和HES10/0.4钠(反应对照物)偶联物。
附图32
附图32显示了通过凝胶电泳分析实施例14.3.4的IFN-α-HES偶联物。
在凝胶电泳中，使用XCell Sure Lock Mini Cell(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)Consort E143电源(CONSORTnv，Turnhout，B)。按照生产商的指示，使用10％的Bis-Tris凝胶与还原条件的MOPS SDS跑板缓冲液(均来自Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。
道X：Roti_-Mark ST和ARD(Carl Roth GmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)标记分子量由顶端至底部为：200KD，119KD，88KD，43kD，29KD，20KD，14.3KD；
道A：实施例14.3.4条所述的醛基HES偶联物
道B：对照反应物，实施例14.3.4条所述的HES偶联物
附图32中显而易见的是，发现对照反应物B不反应。
附图33
附图33显示了实施例15.1中，Intron_A与NIH标准rhIFN-α2a增生活性的比较。
附图34
附图34显示了在实施例15.2中，模拟反应的IFN-α-HES与未修饰的IFN-α起始原料的相对体外活性的比较。
附图35
附图35显示了在实施例15.3中，IFN-α-HES偶联物分别与未修饰的IFN-α的起始原料、Intron_A和Pegasys的相对体外活性的比较。
附图36
附图36显示了在实施例15.4中，IFN-α-HES偶联物与Intron_A的相对体外活性的比较。
附图37
附图37以图表的形式显示了实施例15.5的结果(IFN-α-HES偶联物的抗病毒活性)。
附图38
附图38显示了对抗病毒感染实现MDBK细胞50％保护的稀释血清样品vs.在小鼠中i..v.注射30μg/kg后的时间。用未修饰的起始原料处理的小鼠血清具有低抗病毒作用。用HES修饰IFN-α实质上延长了血清的抗病毒作用。半衰期随着用于修饰IFN-α的HES的分子量的增大而增大(参见实施例16)。
附图39
附图39以图表的形式显示了实施例16.3的结果(IFN-α-HES偶联物的抗病毒活性)。
附图40
附图40显示了实施例17在兔子中的PK研究数据。与IFN-α起始原料相比，IFN-α-HES显示出明显的半衰期延长。＞24小时(大概＜1000pCi/ml)，能够发现，未修饰原料曲线变平，且活性几乎没进一步增长。
附图41
附图41显示了实施例17在兔子中的PK研究数据。评估4至24小时阶段的数据。与未修饰的IFN-α起始原料相比IFN-α-HES显示出明显的半衰期延长。
附图42
附图42显示实施例17的PK研究(显示为：12h以上阶段)的统计评估。在未修饰原料的情况下(见附图42(a))，在前两个小时，浓度降低至几乎为0，然而，IFNα-HES显示出明显延长的半衰期(附图42(b))。
附图43
附图43显示了实施例18.5制备的粗α1 AT-HES偶联物的SDS-PAGE分析。
在凝胶电泳中，使用XCell Sure Lock Mini Cell(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)和Power Pac 200电源(Bio-Rad，Munchen，D)。按照生产商的指示，使用3-8％的Tris-Acetate凝胶与还原条件的Tris-Acetate SDS跑板缓冲液(均来自Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。
道A：未染色的SDSPage蛋白质标记6.5-200KDa(SERVAElektrophoreisi GmbH，Heidelberg，D)，标记分子量由顶端至底部为：200KD，116KD，67KD，45kD，29KD，21KD，14.3KD，6.5KD；
道B：α1AT(GTC Biotherapeutics Inc.，Framiμgham，MA，lotNo.080604A)；
道C：实施例18.5描述的马来酰亚胺HES偶联物
道D：实施例18.6描述的马来酰亚胺HES偶联物(二次浓缩)
附图44
附图44显示了离子交换色谱收集的级分A、B和C的分析(见实施例18.7)。
在凝胶电泳中，使用XCell Sure Lock Mini Cell(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)Power Pac 200电源(Bio-Rad，Munchen，D)。按照生产商的指示，使用3-8％的Tris-Acetate凝胶与还原条件的Tris-Acetate SDS跑板缓冲液(均来自Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。
道1：未染色的SDS页蛋白质标记Mark 12_2.5-200KDa(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)，标记分子量由顶端至底部为：200KD，116KD，97KD，66kD，55KD，36KD，31KD，21KD，14KD，4KD
道2：级分A
道3：级分B
道4：级分C
道5：α1AT(GTC Biotherapeutics Inc.，Framiμgham，MA，lotNo.080604A)
具体实施方式
实施例
实施例1：IFNβ偶联物的合成
实施例1.1羟氨基官能化的羟乙基淀粉衍生物的合成
实施例1.1(a)羟氨基HES10/0.4的合成
将2g HES 10/0.4(MW＝10000D，DS＝0.4，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)溶解于17mL0.1M醋酸钠缓冲液中，pH 5.2，加入20mmol的O-[2-(2-氨氧基-乙氧基)-乙基]-羟基胺。22℃下振摇19小时后，将反应混合物加入100mL冰冷的1∶1混合的丙酮和乙醇(v/v)混合物中。4℃下离心收集沉淀产物，再溶解于50mL水中，水中透析21h(蛇皮透析袋，3.5kD截留，PerbioSciences Deutschl和GmbH，Bonn，D)，冻干。
用LALLS-GPC测量，HES10/0.4的分子量为8500D，DS为0.41。
实施例1.1(b)羟氨基HES10/0.7的合成
将2g HES 10/0.7(MW＝10000D，DS＝0.7，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)溶解于18mL 0.1M醋酸钠缓冲液中，pH 5.2，加入20mmol的O-[2-(2-氨氧基-乙氧基)-乙基]-羟基胺。22℃下振摇19小时后，将反应混合物加入100mL冰冷的1∶1混合的丙酮和乙醇(v/v)混合物中。4℃下离心收集沉淀产物，再溶解于50mL水中，水中透析21h(蛇皮透析袋，3.5kD截留，PerbioSciences Deutschl和GmbH，Bonn，D)，冻干。
用LALLS-GPC测量，HES10/0.7的分子量为10500D，DS为0.76。
实施例1.1(c)羟氨基HES50/0.7的合成
将2g HES 50/0.7(MW＝50000D，DS＝0.7，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)溶解于20mL 0.1M醋酸钠缓冲液中，pH 5.2，加入4mmol的O-[2-(2-氨氧基-乙氧基)-乙基]-羟基胺。22℃下振摇19小时后，将反应混合物加入100mL冰冷的1∶1混合的丙酮和乙醇(v/v)混合物中。4℃下离心收集沉淀产物，再溶解于50mL水中，水中透析21h(蛇皮透析袋，3.5kD截留，PerbioSciences Deutschl和GmbH，Bonn，D)，冻干。
用LALLS-GPC测量，HES50/0.7的分子量为47000D，DS为0.76。
实施例1.1(d) 羟氨基HES50/0.4的合成
将2g HES 50/0.4(MW＝50000D，DS＝0.4，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)溶解于20mL 0.1M醋酸钠缓冲液中，pH 5.2，加入4mmol的O-[2-(2-氨氧基-乙氧基)-乙基]-羟基胺。22℃下振摇17.5小时，将反应混合物加入70mL冰冷的1∶1混合的丙酮和乙醇(v/v)混合物中。0℃下离心收集沉淀产物，用30mL冰冷的1∶1混合的丙酮和乙醇(v/v)混合物冲洗，再溶解于50mL水中，水中透析19.5h(蛇皮透析袋，3.5kD截留，Perbio SciencesDeutschl和GmbH，Bonn，D)，冻干。
用LALLS-GPC测量，HES50/0.4的分子量为56000D，DS为0.41。
实施例1.1(e)羟氨基HES 18/0.4的合成
按照DE19628705A1的描述制备氧化HES。将200mg氧化HES 18/0.4(MW＝18000D，DS＝0.4)80℃真空加热17h，溶解于2ml干燥DMSO(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)。向溶液中加入2mmol的O-[2-(2-氨氧基-乙氧基)-乙基]-羟基胺。65℃反应5d后，将反应混合物加入20mL冰冷的2-丙醇中，-20℃反应1h。4℃下离心收集沉淀产物，用42mL冰冷的2-丙醇冲洗，再溶解于10mL水中，水中透析27h(蛇皮透析袋，3.5kD截留，PerbioSciences Deutschl和GmbH，Bonn，D)，冻干。
用LALLS-GPC测量，HES18/0.4的分子量为18000D，DS为0.41。
实施例1.1(f)酰肼基HES10/0.4的合成
按照DE19628705A1的描述制备氧化HES。将200mg氧化HES10/0.4(MW＝10000D，DS＝0.4)80℃真空加热17h，溶解于2ml干燥DMSO(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)。向溶液中加入2mmol的脂肪二酰肼(Lancaster Synthesis GmbH，Frankfurt/Main D)。65℃反应5d后，将反应混合物加入20mL冰冷的2-丙醇中，-20℃反应1h。4℃下离心收集沉淀产物，用42mL冰冷的2-丙醇冲洗，再溶解于10mL水中，水中透析27h(蛇皮透析袋，3.5kD截留，Perbio Sciences Deutschl和GmbH，Bonn，D)，冻干。
用LALLS-GPC测量，HES 10/0.4的分子量为11000D，DS为0.41。
实施例1.1(g)碳酰肼基HES10/0.4的合成
按照DE19628705A1的描述制备氧化HES。将200mg氧化HES10/0.4(MW＝10000D，DS＝0.4，Supramol Parenteral ColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D)80℃真空加热17h，溶解于2ml干燥DMSO(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)。向溶液中加入2mmol的碳酰肼(Lancaster Synthesis GmbH，Frankfurt/Main D)。65℃反应5d后，将反应混合物加入20mL冰冷的2-丙醇中，-20℃反应1h。4℃下离心收集沉淀产物，用42mL冰冷的2-丙醇冲洗，再溶解于10mL水中，水中透析27h(蛇皮透析袋，3.5kD截留，Perbio Sciences Deutschl和GmbH，Bonn，D)，冻干。
用LALLS-GPC测量，HES 10/0.4的分子量为11000D，DS为0.41。
实施例1.1(h)酰肼基HES10/0.4的合成
将200mg的HES10/0.4(MW＝10000D，DS＝0.4，SupramolParenteral Colloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)溶解于2mL 0.1M醋酸钠缓冲液中，pH 5.2，加入到2mmol的脂肪二酰肼(LancasterSynthesis GmbH，Frankfurt/Main D)。22℃下搅拌19小时后，将反应混合物加入21mL冰冷的2-丙醇中，-20℃反应1h。4℃下离心收集沉淀产物，用42mL冰冷的2-丙醇冲洗，再溶解于10mL水中，水中透析27h(蛇皮透析袋，3.5kD截留，Perbio Sciences Deutschl和GmbH，Bonn，D)，冻干。
用LALLS-GPC测量，HES10/0.4的分子量为8500D，DS为0.41。
实施例1.1(i)碳酰肼基HES10/0.4的合成
将200mg的HES 10/0.4(MW＝10000D，DS＝0.4，SupramolParenteral Colloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)溶解于2mL 0.1M醋酸钠缓冲液中，pH 5.2，加入到2mmol的碳酰肼(Lancaster SynthesisGmbH，Frankfurt/Main D)。22℃下搅拌19h后，将反应混合物加入21mL冰冷的2-丙醇中，-20℃反应1h。4℃下离心收集沉淀产物，用42mL冰冷的2-丙醇冲洗，再溶解于10mL水中，水中透析27h(蛇皮透析袋，3.5kD截留，Perbio Sciences Deutschl和GmbH，Bonn，D)，冻干。
用LALLS-GPC测量，HES10/0.4的分子量为8500D，DS为0.41。
实施例1.2IFNβ偶联物的合成
实施例1.2(a)IFNβ的氧化
重组人干扰素β-1a与市售的AVONEXTM(BIOGEN)和Rebif(Serono)含有完全相同的氨基酸序列，提取自如(dittmar et al.，1989)描述的转染的CHO细胞系，按照实施例6.1的描述进行纯化。氧化基本如实施例6.2所记载的，然后进行实施例6.3所述的缓冲交换。
实施例1.2(b)实施例1.2(a)的氧化IFNβ与实施例1.1(a)-1.1(i)的HES衍生物的反应
向25.9μL氧化IFNβ的0.1M醋酸钠缓冲溶液，pH 5.5，中加入5.27μL HES衍生物的0.1M醋酸钠缓冲溶液，pH 5.5，并将溶液在22℃反应16.5h。用以下方式浓缩：
(i)按照实施例1.1(a)、1.1(b)、1.1(f)、1.1(g)、1.1(h)、1.1(i)的方法制备78.9mg/ml的HES衍生物
(ii)按照实施例1.1(c)、1.1(d)的方法制备395mg/ml的HES衍生物。
(iii)按照实施例1.1(e)的方法制备142mg/ml的HES衍生物
各反应混合物通过凝胶电泳分析(见图1)。
实施例1.3醛基官能化羟乙基淀粉的合成
实施例1.3(a)通过氨基HES10/0.4和4-甲酰苯甲酸合成醛基HES10/04
氧代HES10/0.4(MW＝10kD，DS＝0.4)，按照DE19628705A1的方法由Supramol Parenteral Colloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D制备。用LALLS-GPC测量的HES10/0.4的分子量为14500D且DS为0.41。
将5.1g(0.51mmol)氧代HES10/0.4加入15mL无水二甲亚砜(DMSO，Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)，氮气保护下滴加至5.1ml(51mmol)1，4-二氨丁烷的10ml无水二甲亚砜溶液中，40℃下搅拌19h。将反应混合物加入80ml乙醇和80ml丙酮的混合物中。离心分离生成的产物，用20ml乙醇和20ml丙酮混合溶液冲洗，再溶解于80ml水中。水中透析4天(蛇皮透析袋，3.5kD截留，Perbio Sciences Deutschl和GmbH，Bonn，D)，随后冻干。产率为67％(3.4g)氨基HES10/0.4。
将150mg的4-甲酰苯甲酸和230mg的1-羟基-1H-苯并三唑(均为Aldrich，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)溶解于10ml的N，N-二甲基甲酰胺(peptide synthesis grade，Biosolve，Valkenswaard，ML)并加入204μL的N，N’-二异丙基碳化二亚胺。21℃反应30min后，加入1g氨基HES10/0.4。在22℃振摇19h，将反应混合物加入84mL冰冷的1∶1混合的丙酮和乙醇(v/v)混合物中。4℃下离心收集沉淀产物，再溶解于50mL水中，水中透析2天(蛇皮透析袋，3.5kD截留，Perbio Sciences Deutschl和GmbH，Bonn，D)，冻干。
实施例1.3(b)通过用高碘酸盐氧化作用将HES10/0.4还原末端氧化，合成醛基HES10/0.4
氧代HES10/0.4(MW＝10kD，DS＝0.4)，按照DE19628705A1的方法由Supramol Parenteral Colloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D制备。用LALLS-GPC测量的HES10/0.4的分子量为14500D且DS为0.41。
将300mg的氧代HES10/0.4溶解于15ml的20mM磷酸钠缓冲溶液中，pH 7.2。将64.2mg高碘酸钠(Fluka，Sigma-Aldrich ChemieGmbH，Taufkirchen，D)溶解于15ml的相同缓冲溶液。混合两种溶液，21℃下反应30min后，加入2ml甘油，反应混合物在21℃下反应10min。反应混合物在水中透析24h(蛇皮透析袋，3.5kD截留，Perbio Sciences Deutschl和GmbH，Bonn，D)，冻干。
实施例1.4通过还原氨化实施例1.3(a)和1.3(b)的醛官能化羟乙基淀粉，合成IFNβ偶联物
重组人干扰素β-1a与市售的AVONEXTM(BIOGEN)和Rebif(Serono)含有完全相同的氨基酸序列，提取自如(dittmar et al.，1989)描述的转染的CHO细胞系，按照实施例6.1的描述进行纯化。
向40μl的IFNβ的0.1M醋酸钠缓冲溶液pH 5.0(0.5mg/ml)加入5μL的HES衍生物(按照实施例1.3(a)和1.3(b)所述的方法制备)的相同的缓冲溶液(200mg/mL)。将混合物冷却至4℃，加入4℃的120mM氰基硼氢化钠的相同缓冲溶液9μL，混合物在4℃反应24h。粗反应混合物用凝胶电泳分析。可发现成功的偶联，由于蛋白质带位移至更高的分子量位置显像(见图2)。增加的带宽与使用的HES衍生物分子量分布和连接到蛋白质上的HES衍生物数量有关。
实施例1.5IFNβ的抗病毒活性生物鉴定描述-常规评述
在欧洲药典中，现在仅给出的测定法是用于测定干扰素α和干扰素γ的活性。然而，因为干扰素α的抗病毒效力通过用体外细胞病变效应(CPE)生物鉴定的试验测试，如增刊2001(chapter5.6)所述，如迄今为止的IFN药物产品申请，抗病毒活性可通过与干扰素α类似地方式测定。
IFNβ的抗病毒活性可以利用特殊的体外细胞病变效应生物鉴定来测定，例如，使用肺癌细胞(A549)和脑心肌炎病毒(EMCV)。其他可能的联用，可用于测定干扰素的抗病毒活性，为WISH细胞系或Madin-Darby牛肾(MDBK)细胞系和VSV(疱疹性病毒)。
干扰素抗病毒测定-提要
第一步，HES-IFNβ偶联物的体外抗病毒活性与未修饰的IFNβ进行比较。
在CPE测定法(MDBK/VSV)中，稀释标准干扰素和HES-IFNβ偶联物相比较。细胞在接触病毒前，用测试样品预处理约48h。
培养期之后(大约24h)，可以估算干扰素对病毒致细胞病变效应的保护作用。
干扰素抗病毒测定-实验细节
执行以下步骤：
-干扰素溶液用MDBK细胞的细胞培养基质预稀释(1∶10)
该溶液继续稀释至1∶2-1∶2，097，152(＝1∶221)
-4复制(100μL每孔)
-加入新鲜的胰蛋白酶处理的MDBK细胞(5,000细胞/孔50μL)
-反应：在37℃48小时
-加入50μL预稀释的VSV溶液(250病毒/孔)
-反应：在37℃22小时
-测定干扰素对病毒致细胞病变效应的保护作用
-使用Spearman-Karber′s方法，计算干扰素的效价
对照：
MDBK细胞与干扰素溶液，无病毒(阴性对照)
MDBK细胞无干扰素溶液，与病毒(阳性对照)
结果：
两种干扰素β样品与各自的HES偶联物使用两种不同的稀释法用CPE测定法测试(估计1,000,000IU/ml和200,000IU/ml)。
通过Spearman和Karber公式计算干扰素的效价。计算出不同样品的活性率。考虑，计算并比较特殊活性，EC50浓度，在其中50％的细胞受保护免于病毒反应(数据未示出)。
修饰后的IFNβ保留生物活性。
实施例2IFNα偶联物的合成
实施例2.1(a)由氨基HES10/0.4和4-甲酰苯甲酸合成醛基HES10/0.4
醛基HES10/0.4按照实施例1.3(a)的方法制备。
实施例2.1(b)由氨基HES10/0.4和4-甲酰苯甲酸合成醛基HES10/0.4
醛基HES10/0.4按照实施例1.3(b)的方法制备。
实施例2.2通过还原氨化实施例2.3(a)和2.3(b)合成的醛官能化羟乙基淀粉，合成IFNβ偶联物
使用市售的rhIFNα(Strathmann Biotec，Hamburg，D，product code hIFNa)。
向15μl的IFNβ的0.1M醋酸钠缓冲溶液pH 5.0(1mg/ml)加入3.91μL的HES衍生物(按照实施例2.1(a)和2.2(b)所述的方法制备)的相同的缓冲溶液(200mg/ml)。将混合物冷却至4℃，加入4℃的120mM氰基硼氢化钠的相同缓冲溶液3.78μL，混合物在4℃反应24h。粗反应混合物用凝胶电泳分析。可发现成功的偶联，由于蛋白质带位移至更高的分子量位置显像(见图3)。增加的带宽与使用的HES衍生物分子量分布和连接到蛋白质上的HES衍生物的数量有关。
实施例3ATIII偶联物的合成
实施例3.1羟氨基官能化羟乙基淀粉的合成
实施例3.1(a)羟氨基HES10/0.4的合成
将2g HES 10/0.4(MW＝10000D，DS＝0.4，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)溶解于17mL0.1M醋酸钠缓冲液中，pH 5.2，加入20mmol的O-[2-(2-氨氧基-乙氧基)-乙基]-羟基胺。22℃下振摇19小时，将反应混合物加入100mL冰冷的1∶1混合的丙酮和乙醇(v/v)中。4℃下离心收集沉淀产物，再溶解于50mL水中，水中透析21h(蛇皮透析袋，3.5kD截留，Perbio SciencesDeutschl和GmbH，Bonn，D)，冻干。
用LALLS-GPC测量，HES10/0.4的分子量为8500D，DS为0.41。
实施例3.1(b)羟氨基HES 10/0.7的合成
将2g HES 10/0.7(MW＝10000D，DS＝0.7，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)溶解于18mL 0.1M醋酸钠缓冲液中，pH 5.2，加入20mmol的O-[2-(2-氨氧基-乙氧基)-乙基]-羟基胺。22℃下振摇19小时，将反应混合物加入100mL冰冷的1∶1混合的丙酮和乙醇(v/v)中。4℃下离心收集沉淀产物，再溶解于50mL水中，水中透析21h(蛇皮透析袋，3.5kD截留，Perbio SciencesDeutschl和GmbH，Bonn，D)，冻干。
用LALLS-GPC测量，HES10/0.7的分子量为10500D，DS为0.76。
实施例3.1(c)羟氨基HES50/0.7的合成
将2g HES 50/0.7(MW＝50000D，DS＝0.7，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)溶解于20mL 0.1M醋酸钠缓冲液中，pH 5.2，加入4mmol的O-[2-(2-氨氧基-乙氧基)-乙基]-羟基胺。22℃下振摇19小时，将反应混合物加入100mL冰冷的1∶1混合的丙酮和乙醇(v/v)中。4℃下离心收集沉淀产物，再溶解于50mL水中，水中透析21h(蛇皮透析袋，3.5kD截留，Perbio SciencesDeutschl和GmbH，Bonn，D)，冻干。
用LALLS-GPC测量，HES50/0.7的分子量为47000D，DS为0.76。
实施例3.1(d)羟氨基HES18/0.4的合成
按照DE19628705A1的描述制备氧化HES。将200mg氧化HES 18/0.4(MW＝18000D，DS＝0.4)80℃真空加热17h，溶解于2ml干燥DMSO(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)。向溶液中加入2mmol的O-[2-(2-氨氧基-乙氧基)-乙基]-羟基胺。65℃反应5d后，将反应混合物加入20mL冰冷的2-丙醇中，-20℃反应1h。4℃下离心收集沉淀产物，用42mL冰冷的2-丙醇冲洗，再溶解于10mL水中，水中透析27h(蛇皮透析袋，3.5kD截留，PerbioSciences Deutschl和GmbH，Bonn，D)，冻干。
用LALLS-GPC测量，HES18/0.4的分子量为18000D，DS为0.41。
实施例3.1(e)酰肼基HES10/0.4的合成
按照DE19628705A1的描述制备氧化HES。将200mg氧化HES10/0.4(MW＝10000D，DS＝0.4)80℃真空加热17h，溶解于2ml干燥DMSO(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)。向溶液中加入2mmol的脂肪二酰肼(Lancaster Synthesis GmbH，Frankfurt/Main D)。65℃反应5d后，将反应混合物加入20mL冰冷的2-丙醇中，-20℃反应1h。4℃下离心收集沉淀产物，用42mL冰冷的2-丙醇冲洗，再溶解于10mL水中，水中透析27h(蛇皮透析袋，3.5kD截留，Perbio Sciences Deutschl和GmbH，Bonn，D)，冻干。
用LALLS-GPC测量，HES10/0.4的分子量为11000D，DS为0.41。
实施例3.1(f)碳酰肼基HES10/0.4的合成
按照DE19628705A1的描述制备氧化HES。将200mg氧化HES10/0.4(MW＝10000D，DS＝0.4，Supramol Parenteral ColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D)80℃真空加热17h，溶解于2ml干燥DMSO (Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)。向溶液中加入2mmol的碳酰肼(Lancaster Synthesis GmbH，Frankfurt/Main D)。65℃反应5d后，将反应混合物加入20mL冰冷的2-丙醇中，-20℃反应1h。4℃下离心收集沉淀产物，用42mL冰冷的2-丙醇冲洗，再溶解于10mL水中，水中透析27h(蛇皮透析袋，3.5kD截留，Perbio Sciences Deutschl和GmbH，Bonn，D)，冻干。
用LALLS-GPC测量，HES10/0.4的分子量为11000D，DS为0.41。
实施例3.1(g)酰肼基HES10/0.4的合成
将200mg的HES10/0.4(MW＝10000D，DS＝0.4，Supramol
Parenteral Colloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)溶解于2mL 0.1M醋酸钠缓冲液中，pH 5.2，加入2mmol的脂肪二酰肼(LancasterSynthesis GmbH，Frankfurt/Main D)。22℃下搅拌19小时后，将反应混合物加入21mL冰冷的2-丙醇中，-20℃反应1h。4℃下离心收集沉淀产物，用42mL冰冷的2-丙醇冲洗，再溶解于10mL水中，水中透析27h(蛇皮透析袋，3.5kD截留，Perbio Sciences Deutschl和GmbH，Bonn，D)，冻干。
用LALLS-GPC测量，HES10/0.4的分子量为8500D，DS为0.41。
实施例3.1(h)碳酰肼基HES10/0.4的合成
将200mg的HES10/0.4(MW＝10000D，DS＝0.4，SupramolParenteral Colloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)溶解于2mL 0.1M醋酸钠缓冲液中，pH 5.2，加入2mmol的碳酰肼(Lancaster SynthesisGmbH，Frankfurt/Main D)。22℃下搅拌19h后，将反应混合物加入21mL冰冷的2-丙醇中，-20℃反应1h。4℃下离心收集沉淀产物，用42mL冰冷的2-丙醇冲洗，再溶解于10mL水中，水中透析27h(蛇皮透析袋，3.5kD截留，Perbio Sciences Deutschl和GmbH，Bonn，D)，冻干。
用LALLS-GPC测量，HES10/0.4的分子量为8500D，DS为0.41。
实施例3.2ATIII偶联物的合成
实施例3.2(a)ATIII的氧化
所使用的ATIII为重组人ATIII(GTC Biotherapeutics的ATryn_)。
氧化基本如实施例7.2，然后进行实施例7.3所述的缓冲交换。
实施例3.2(b)实施例3.2(a)的氧化ATIII与实施例3.1(a)-3.1(i)的HES衍生物的反应
向4μL氧化ATIII的0.1M醋酸钠缓冲溶液，pH 5.5，中加入3μL HES衍生物的0.1M醋酸钠缓冲溶液，pH 5.5，并将溶液在22℃反应16.5h。用以下方式浓缩：
(i)按照实施例3.1(a)、3.1(b)、3.1(e)、3.1(f)、3.1(g)、3.1(h)的方法制备57mg/ml的HES衍生物
(ii)按照实施例1.1(c)的方法制备287mg/ml的HES衍生物。
(iii)按照实施例1.1(d)的方法制备103mg/ml的HES衍生物
各反应混合物通过凝胶电泳分析(见图4)。
实施例3.3ATIII偶联物的合成
实施例3.3(a)由氨基HES10/0.4和4-甲酰苯甲酸合成醛基HES10/0.4
醛基HES10/0.4按照实施例1.3(a)的方法制备。
实施例3.3(b)由氨基HES10/0.4和4-甲酰苯甲酸合成醛基HES10/0.4
醛基HES10/0.4按照实施例1.3(b)的方法制备。
实施例3.4通过还原氨化实施例3.3(a)和3.3(b)合成的醛官能化羟乙基淀粉，合成ATIII偶联物
所使用的ATIII为重组人ATIII(GTC Biotherapeutics的ATryn_)。
将6.67μL的ATIII的0.1M醋酸钠缓冲溶液pH 5.0(3mg/ml)加入1.73μL的HES衍生物(按照实施例3.1(a)和3.2(b)所述的方法制备)的相同的缓冲溶液(200mg/ml)中。将混合物冷却至4℃，加入4℃的120mM氰基硼氢化钠的相同缓冲溶液1.68μL，混合物在4℃反应24h。粗反应混合物用凝胶电泳分析。可发现成功的偶联物，由于蛋白质带位移至更高的分子量位置显像(见图3)。增加的带宽与使用的HES衍生物分子量分布和连接到蛋白质上的HES衍生物的数量有关。
实施例3.5通过具有活性酯基官能团的羟乙基淀粉与AT III反应合成ATIII偶联物
用于本实施例的ATIII的溶液浓度约25mg/ml，含有5mM柠檬酸钠缓冲溶液，66mM甘油，67mM NaCl，pH约为7。
所使用的ATIII为重组人ATIII(GTC Biotherapeutics的ATryn_)。
用pH 7.2的磷酸盐缓冲液，通过超滤法，将ATIII从不希望的甘油中释放，膜截留为10kD。所得的纯化溶液最终浓度为约25mg/1.25ml。蛋白质的质量通过HPGPC分析控制(见图6)。
以下参数用于HPGPC分析：
柱：Superose 12HR 10/30 300×10mm I.D.(Pharmacia)
洗脱液：27.38mM Na2HPO4；12.62mM NaH2PO4；0.2MnaCl；0，005％NaN3的11软化水。
流速：0，24ml/h
检波器1：MALLS检波器
检波器2：UV(280nm)
检波器3：RI
氧代HES10/0.4(MW＝10，559D，DS＝0.4)按照DE19628705A1的方法，由Supramol Parenteral Colloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D制备。氧代HES的氧化度为95％。
将52mg的氧代HES10/0.4溶解于0.2ml无水DMF中。向该溶液中加入2.6mg的N，N’-二琥珀酰亚胺羧酸盐，室温下搅拌混合物2h。
将0.5ml的1M碳酸氢钠溶液加入到0.5ml的ATIII溶液中，生成浓度约为10mg/ml的ATIII溶液，pH 8.2。向该溶液中，加入如上文所述制备的含有活性氧代HES的溶液，直至50μL，大约30min后，反应结束。然后，使用0.1N的HCl调节混合物ph为7，-18℃冷冻直至进行HPGPC分析(高效凝胶渗透色谱法)，得到产率为60％的偶联物。
该结果显示在图7中。
以下参数用于HPGPC分析：
柱：Superose 12HR 10/30300×10mm I.D.(Pharmacia)
洗脱液：27.38mM Na2HPO4；12.62mM NaH2PO4；0.2MnaCl；0，005％NaN3的11软化水。
流速：0，24ml/h
检波器1：MALLS检波器
检波器2：UV(280nm)
检波器3：RI
实施例4合成GM-CSF偶联物
实施例4.1羟氨基官能化羟乙基淀粉衍生物的合成
实施例4.1(a)羟氨基HES10/0.4的合成
将2g HES 10/0.4(MW＝10000D，DS＝0.4，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)溶解于17mL0.1M醋酸钠缓冲液中，pH 5.2，加入20mmol的O-[2-(2-氨氧基-乙氧基)-乙基]-羟基胺。22℃下振摇19小时，将反应混合物加入100mL冰冷的1∶1混合的丙酮和乙醇(v/v)中。4℃下离心收集沉淀产物，再溶解于50mL水中，水中透析21h(蛇皮透析袋，3.5kD截留，Perbio SciencesDeutschl和GmbH，Bonn，D)，冻干。
用LALLS-GPC测量，HES10/0.4的分子量为8500D，DS为0.41。
实施例4.1(b)羟氨基HES10/0.7的合成
将2g HES 10/0.7(MW＝10000D，DS＝0.7，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)溶解于18mL 0.1M醋酸钠缓冲液中，pH 5.2，加入20mmol的O-[2-(2-氨氧基-乙氧基)-乙基]-羟基胺。22℃下振摇19小时，将反应混合物加入100mL冰冷的1∶1混合的丙酮和乙醇(v/v)中。4℃下离心收集沉淀产物，再溶解于50mL水中，水中透析21h(蛇皮透析袋，3.5kD截留，Perbio SciencesDeutschl和GmbH，Bonn，D)，冻干。
用LALLS-GPC测量，HES10/0.7的分子量为10500D，DS为0.76。
实施例4.1(c)羟氨基HES50/0.7的合成
将2g HES 50/0.7(MW＝50000D，DS＝0.7，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)溶解于20mL 0.1M醋酸钠缓冲液中，pH 5.2，加入4mmol的O-[2-(2-氨氧基-乙氧基)-乙基]-羟基胺。22℃下振摇19小时，将反应混合物加入100mL冰冷的1∶1混合的丙酮和乙醇(v/v)中。4℃下离心收集沉淀产物，再溶解于50mL水中，水中透析21h(蛇皮透析袋，3.5kD截留，Perbio SciencesDeutschl和GmbH，Bonn，D)，冻干。
用LALLS-GPC测量，HES50/0.7的分子量为47000D，DS为0.76。
实施例4.1(d)羟氨基HES50/0.4的合成
将2g HES 50/0.4(MW＝50000D，DS＝0.4，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)溶解于20mL 0.1M醋酸钠缓冲液中，pH 5.2，加入4mmol的O-[2-(2-氨氧基-乙氧基)-乙基]-羟基胺。22℃下振摇17.5小时，将反应混合物加入70mL冰冷的1∶1混合的丙酮和乙醇(v/v)中。0℃下离心收集沉淀产物，用30mL冰冷的1∶1混合的丙酮和乙醇(v/v)冲洗，再溶解于50mL水中，水中透析19.5h(蛇皮透析袋，3.5kD截留，Perbio Sciences Deutschl和GmbH，Bonn，D)，冻干。
用LALLS-GPC测量，HES50/0.4的分子量为56000D，DS为0.41。
实施例4.1(e)羟氨基HES18/0.4的合成
按照DE19628705A1的描述制备氧化HES。将200mg氧化HES18/0.4(MW＝18000D，DS＝0.4)80℃真空加热17h，溶解于2ml干燥DMSO(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)。向溶液中加入2mmol的O-[2-(2-氨氧基-乙氧基)-乙基]-羟基胺。65℃反应5d后，将反应混合物加入20mL冰冷的2-丙醇中，-20℃反应1h。4℃下离心收集沉淀产物，用42mL冰冷的2-丙醇冲洗，再溶解于10mL水中，水中透析27h(蛇皮透析袋，3.5kD截留，PerbioSciences Deutschl和GmbH，Bonn，D)，冻干。
用LALLS-GPC测量，HES18/0.4的分子量为18000D，DS为0.41。
实施例4.1(f)酰肼基HES10/0.4的合成
按照DE19628705A1的描述制备氧化HES。将200mg氧化HES10/0.4(MW＝10000D，DS＝0.4)80℃真空加热17h，溶解于2ml干燥DMSO(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)。向溶液中加入2mmol的脂肪二酰肼(Lancaster Synthesis GmbH，Frankfurt/Main D)。65℃反应5d后，将反应混合物加入20mL冰冷的2-丙醇中，-20℃反应1h。4℃下离心收集沉淀产物，用42mL冰冷的2-丙醇冲洗，再溶解于10mL水中，水中透析27h(蛇皮透析袋，3.5kD截留，Perbio Sciences Deutschl和GmbH，Bonn，D)，冻干。
用LALLS-GPC测量，HES10/0.4的分子量为11000D，DS为0.41。
实施例4.1(g)碳酰肼基HES10/0.4的合成
按照DE19628705A1的描述制备氧化HES。将200mg氧化HES10/0.4(MW＝10000D，DS＝0.4，Supramol Parenteral ColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D)80℃真空加热17h，溶解于2ml干燥DMSO(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)。向溶液中加入2mmol的碳酰肼(Lancaster Synthesis GmbH，Frankfurt/Main D)。65℃反应5d后，将反应混合物加入20mL冰冷的2-丙醇中，-20℃反应1h。4℃下离心收集沉淀产物，用42mL冰冷的2-丙醇冲洗，再溶解于10mL水中，水中透析27h(蛇皮透析袋，3.5kD截留，Perbio Sciences Deutschl和GmbH，Bonn，D)，冻干。
用LALLS-GPC测量，HES10/0.4的分子量为11000D，DS为0.41。
实施例4.1(h)酰肼基HES10/0.4的合成
将200mg的HES10/0.4(MW＝10000D，DS＝0.4，SupramolParenteral Colloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)溶解于2mL 0.1M醋酸钠缓冲液中，pH 5.2，加入2mmol的脂肪二酰肼(LancasterSynthesis GmbH，Frankfurt/Main D)。22℃下搅拌19小时后，将反应混合物加入21mL冰冷的2-丙醇中，-20℃反应1h。4℃下离心收集沉淀产物，用42mL冰冷的2-丙醇冲洗，再溶解于10mL水中，水中透析27h(蛇皮透析袋，3.5kD截留，Perbio Sciences Deutschl和GmbH，Bonn，D)，冻干。
用LALLS-GPC测量，HES10/0.4的分子量为8500D，DS为0.41。
实施例4.1(i)碳酰肼基HES10/0.4的合成
将200mg的HES10/0.4(MW＝10000D，DS＝0.4，SupramolParenteral Colloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)溶解于2mL 0.1M醋酸钠缓冲液中，pH 5.2，加入2mmol的碳酰肼(Lancaster SynthesisGmbH，Frankfurt/Main D)。22℃下搅拌19h后，将反应混合物加入21mL冰冷的2-丙醇中，-20℃反应1h。4℃下离心收集沉淀产物，用42mL冰冷的2-丙醇冲洗，再溶解于10mL水中，水中透析27h(蛇皮透析袋，3.5kD截留，Perbio Sciences Deutschl和GmbH，Bonn，D)，冻干。
用LALLS-GPC测量，HES10/0.4的分子量为8500D，DS为0.41。
实施例4.2GM-CSF偶联物的合成
实施例4.2(a)GM-CSF的氧化
GM-CSF按照实施例8.1的描述进行纯化。氧化基本如实施例8.2，然后进行实施例8.3所述的缓冲交换。
实施例4.2(b)实施例4.2(a)的氧化GM-CSF与实施例4.1(a)-4.1(i)的HES衍生物的反应
向27μL氧化GM-CSF的0.1M醋酸钠缓冲溶液，pH 5.5，中加入3.81μL HES衍生物的0.1M醋酸钠缓冲溶液，pH 5.5，并将溶液在22℃反应16.5h。用以下方式浓缩：
(i)按照实施例4.1(a)、4.1(b)、4.1(f)、4.1(g)、4.1(h)、4.1(i)的方法制备78.9mg/ml的HES衍生物
(ii)按照实施例4.1(c)、4.1(d)的方法制备395mg/ml的HES衍生物。
(iii)按照实施例4.1(e)的方法制备142mg/ml的HES衍生物
各反应混合物通过凝胶电泳分析(见图8)。
实施例4.3GM-CSF偶联物的合成
实施例4.3(a)由氨基HES10/0.4和4-甲酰苯甲酸合成醛基HES10/0.4
醛基HES10/0.4按照实施例1.3(a)的方法制备。
实施例4.3(b)由氨基HES10/0.4和4-甲酰苯甲酸合成醛基HES10/0.4
醛基HES10/0.4按照实施例1.3(b)的方法制备。
实施例4.4通过还原氨化实施例4.3(a)和4.3(b)的醛官能化羟乙基淀粉，合成GM-CSF偶联物
将20μl的GM-CSF的0.1M醋酸钠缓冲溶液pH 5.0(1mg/ml)加入1.91μL的HES衍生物(按照实施例3.1(a)和3.2(b)所述的方法制备)的相同的缓冲溶液(200mg/ml)中。将混合物冷却至4℃，加入4℃的120mM氰基硼氢化钠的相同缓冲溶液4.38μL，混合物在4℃反应24h。粗反应混合物用凝胶电泳分析。可发现成功的偶联物，由于蛋白质带位移至更高的分子量位置显像(见图9)。增加的带宽与使用的HES衍生物分子量分布和连接到蛋白质上的HES衍生物的数量有关。
实施例5用含有羟氨基功能团的羟乙基性淀粉合成ATIII、IFNβ和GM-CSF偶联物
实施例5.1羟氨基功能化的羟乙基淀粉的合成
(a)羟氨基HES10/0.4按照在上文实施例1.1(a)所述的方法合成
(b)羟氨基HES50/0.7按照在上文实施例1.1(c)所述的方法合成
实施例5.2以实施例5.1(b)所述的羟氨基HES50/0.7合成IFNβ偶联物
向1190μl的氧化IFNβ 0.1M醋酸钠缓冲溶液，pH 5.5，(由之后的实验步骤6.3获得)，加入81.4mg羟氨基HES50/0.7的200μl的0.1M醋酸钠缓冲溶液，pH 5.5。溶液22℃下反应19h。反应混合物用凝胶电泳分析(见图10)。
实施例5.3以实施例5.1(a)所述的羟氨基HES10/0.4合成ATIII偶联物
向500l的氧化ATIII 0.1M醋酸钠缓冲溶液，pH 5.5，(由之后的实验步骤7.3获得)，加入21.6mg羟氨基HES10/0.4的1500μl的0.1M醋酸钠缓冲溶液，pH 5.5。溶液22℃下反应20.5h。
实施例5.4以实施例5.1(a)所述的羟氨基HES10/0.4合成GM-CSF偶联物
向720μl的氧化GM-CSF 0.1M醋酸钠缓冲溶液，pH 5.5，(由之后的实验步骤8.3获得)，加入14.0mg羟氨基HES10/0.4的180μl的0.1M醋酸钠缓冲溶液，pH 5.5。溶液22℃下反应18h。
实施例6IFNβ1a偶联物的进一步表征
实施例6.1(a)人重组干扰素β的纯化和分析
重组人干扰素β1a与市售产品AVONEXTM(BIOGEN)和Rebif(Serono)含有完全相同的氨基酸序列，提取自如(dittmar et al.，1989)描述的转染的CHO细胞系。IFNβ通过三个步骤进行纯化，包括培养物上清吸附至蓝琼脂糖，用含有0.7M NaCl+60％乙二醇的0.05MpH7.0磷酸钠缓冲溶液洗脱，然后在环境温度下在10ml FF Zn-螯合柱中色谱层析。色谱柱用30ml的含0.3M NaCl的20mM pH7.4磷酸钠缓冲溶液预平衡。用15ml的20mM磷酸钠，pH7.2-7.5，1∶2稀释样品后，给样。然后用25ml 20mM磷酸钠，0.3M NaCl，pH 7.4，冲柱。然后用洗脱液I(20ml 0.1M醋酸钠，0.5M NaCl，pH 5.9)和洗脱液II(15ml 0.1M醋酸钠，0.5M NaCl，pH 4.7)洗脱。最终纯化通过Vydac C4柱的RP-HPLC进行，用0.1％TFA(溶剂A)平衡，使用0-100％溶剂B(80％乙腈溶解于0.1％TFA)梯度洗脱。
实施例6.1(b)
使用的IFNβ1a为＞95％纯度(基于SDS-PAGE和RP-HPLC分析并含有＜5％的二聚物，非还原条件)。制剂的碳水化合物结构基本与AVONEXTM的相同，表现为42％的双触角结构，16％的双触角阴性近端盐皮质激素，12％三触角，7％四触角以及9％三触角与1N-乙酰乳糖胺重复存在(剩余的12％为无乳(agalacto)结构和少量含有外周岩藻糖的链)。基于HPAEC-PAD应答，约14％的低聚糖链为脱唾液酸的，21％为单唾液酸的，35％为二唾液酸的及19％为三唾液酸的。存在少量的四唾液酸结构。绝大多数唾液酸以N-乙酰神经氨酸的形式存在，且在制剂中存在＜5％的N-羟乙酰基神经氨酸，因此，所用制剂更类似于AVONEXTM市售产品，由于Rebif(Serono产品)含有＞15％的N-羟乙酰基神经氨酸(数据未提供)。
实施例6.2高碘酸氧化经过CHO细胞所得IFNβ1a弱高碘酸处理的N-乙酰神经氨酸残基
向500μl/ml的IFNβ溶液(在0.1M醋酸钠缓冲溶液pH 5.5，预冷却并保持在0℃)加入冰冷的10mM偏高碘酸钠溶液，生成最终浓度为1mM的偏高碘酸钠。混合物在暗处冰浴中0℃反应1小时。加入20μl甘油并进一步反应5分钟后，反应终止。随后，IFBβ样品用如下所述的Vivaspin浓缩器单元进行浓缩。
实施例6.3高碘酸氧化IFBβ缓冲交换用于以后的HES化
缓冲交换使用0.5ml Vivaspin 2浓缩器单元(Vivaspin AG，Hannover，Germany)和聚醚砜(PES)膜和10Kda截留进行。首先，加入0.5ml的0.1M醋酸钠缓冲溶液pH5.5冲洗浓缩器单位，并在Megafuge 1.0R(Kendro Laboratory Equipment，Osterode，Germany)中6℃下4000rpm离心。随后，向浓缩器单元中加入0.5ml的高碘酸氧化IFNβ溶液，4000rpm下离心25min，直至至少到达5倍浓缩。向浓缩物中加入0.1M的醋酸钠缓冲溶液pH5.5，至体积为0.5ml，如上述离心溶液。离心循环重复3次，移出最终浓缩物，移入2ml的塑料瓶中(Eppendorff，德国)，冰中保存，直至用于HAS修饰反应。
实施例6.4HAS和IFNβ偶联物的合成
按照上述实施例5.2的方法进行合成。
实施例6.5由高碘酸盐氧化蛋白质和羟氨基HES50/0.7中分离HES化IFN-β和过量的HAS衍生物
摘要：室温下运行RP-HPLC Runs，使用AKTA探测10设备，流速为1.25ml/min。含有400μg IFNβ的反应混合物的等份试样上样于250mm×10mm C18-phase柱子，所述柱子用1.25CV的11％溶剂B(0.1％TFA，90％乙腈)和89％溶剂A(0.1％TFA)平衡。然后注入样品(ca.1.25ml)，样品环用11ml的11％溶液B冲洗。然后用0.2CV的11％溶剂B冲柱，提供自11％至90％线性梯度的2CV溶剂B。未完的柱洗脱物使用0.8CV的90％溶剂B，最终柱子使用1.0CV的11％溶剂B重新平衡。
IFNβ蛋白质洗脱至体积为7.5ml的溶剂B中，浓度为62％。蛋白质的回收率为60％(HES IFN-βCHO)，基于用标准IFNβ制剂通过同样的仪器在C4-相柱上获得的790mAU×ml×mg-1的特殊峰面积。
实施例6.5的原料和方法
仪器和原料
仪器：AKTA探测10(Amersham Pharmacia Biotech)，与：
泵P-903
混合器M-925，具有0.6ml槽
监控器UV-900，具有10mm流动池
监控器pH/C-900
分段收集器Frac-900
样品环2ml
软件Unicorn版本3.21
柱；250mm×10mm，Macherey-Nagel 250-1/2″-10Nucleosil 7C18，Cat.No.715002，Lot-No.4020854
柱体积：20ml
流量：1.25ml/min
溶剂A：0.1％TFA的HPLC-水
溶剂B：90％乙腈，0.1％TFA的HPLC-水
实施例6.5的RP-HPLC运行方法
| 体积 | 步骤 | 溶液A | 溶液B |
| 0.25CV | 平衡 | 89％ | 11％ |
| 11ml | 进样 | 89％ | 11％ |
| 分级 | 89％ | 11％ | |
| 0.20CV | 冲洗出未结合样品 | 89％ | 11％ |
| 2.00CV | 线性梯度 | 89-10％ | 11-90％ |
| 0.80CV | 等度 | 10％ | 90％ |
| 末尾级分 | 10％ | 90％ | |
| 1.00CV | 重新平衡 | 89％ | 11％ |
检测：A 280nm
A 221nm
A 206nm
导电性
分级：1.25ml/级分
实施例6.6分析实验
实施例6.6(a)N链低聚糖的重组多肽N糖苷酶(Roche，Penzberg，Germany)释放
向100-200μg的天然、高碘酸氧化或HAS修饰的IFNβ1a50mM磷酸钠缓冲溶液，pH 7.2，加入25μl重组多肽N糖苷酶(Roche，Penzberg，Germany；250units/2501 lot：101610420)。反应混合物在37℃反应12-18小时，低聚糖N糖苷键的释放通过SDS-PAGE在还原条件下分析3-5μg的蛋白质进行检验，之后，用考马斯蓝(CarlRoth GmbH Karlsruhe，Germany)将蛋白质带染色，检测IFNβ蛋白质带相对于至脱-N-糖基化形式位移位置的特定位移。
实施例6.6(b)
释放的N-多聚糖通过加入3体积-20℃的100％乙醇从多肽中分离出来，在-20℃的反应进行至少2小时。沉淀的蛋白质通过在4℃以13000rpm离心10分钟分离。片状沉淀物然后用两份50μl冰冷的70％乙醇冲洗。反应池中的低聚糖超浮游物在真空离心机中干燥(Speed Vac浓缩器，Savant InstrumentsInc.，USA)。聚糖样品使用Hypercarb柱如下去盐：使用前，柱用500μl含0.1％(v/v)TFA的80％(v/v)乙腈冲洗三次，然后用500μl水冲洗三次。在载入柱中之前，样品用水稀释至最终体积至少为300μl。用水猛烈冲洗。低聚糖用1.2ml含0.1％(v/v)TFA的25％乙腈洗脱。洗脱出的寡糖用2M NH4OH中和，在Speed Vac浓缩器中干燥。-20℃下水中储存。
实施例6.6(c)弱酸水解
低聚糖的弱酸水解(由N多糖中释放唾液酸和HAS修饰唾液酸衍生物)进行如下：等份的除盐低聚糖或HAS修饰低聚糖与相同体积的10mM的H2SO4混合，80℃反应90分钟。用50mM NaOH中和后，脱唾液酸聚糖混合物在Speed Vac浓缩器中干燥，调节至适当的浓度用于在HPAEC-PDA(带有脉冲电流检测的高pH阴离子交换柱色谱)中分析。为以后的MALDI/TOF MS分析，中性低聚糖样品(0.05-1nmol)，使用通过将25-40μl的石墨化碳加入200μl的球管尖端制备的小型Hypercarb柱脱盐。
实施例6.6(d)由HPAEC-PDA(带有脉冲电流检测的高pH阴离子交换柱色谱)对低聚糖绘图
BioLC系统(Dionex，Sunhyvale)，包括AS50自动采样器，AS50热间隔，ED50电化学检波器，GS50梯度泵，软件为Chromeleon色谱处理系统，与CarboPac PA-100分离柱(4×250mm)和CarboPacPA-100前柱(4×50mm)一同使用。两种不同的模式用于低聚糖绘图和定量。
I)脱唾液酸模式：
中性低聚糖，用HPAEC-PAD使用梯度溶剂A(200mM NaOH)和溶剂B(200mM NaOH加600mM醋酸钠)绘图，如下表所述：
表：中性低聚糖绘图的梯度
| 时间(min) | 溶剂A(％) | 溶剂B(％) |
| 0 | 100 | 0 |
| 5 | 100 | 0 |
| 35 | 80 | 20 |
| 45 | 70 | 30 |
| 47 | 0 | 100 |
| 52 | 0 | 100 |
| 53 | 100 | 0 |
| 60 | 100 | 0 |
流速：1ml/min
电化学检测器的检测电位为：
表：低聚糖的监测电位
| 时间(ms) | 电位(mV) |
| 0 | 50 |
| 200 | 50 |
| 400 | 50 |
| 410 | 750 |
| 600 | 750 |
| 610 | -150 |
| 1000 | -150 |
II)低聚糖模式
天然低聚糖，用HPAEC-PAD使用梯度溶剂C(100mM NaOH)和溶剂D(100mM NaOH加600mM醋酸钠)绘图，如下表所述：
表：天然(唾液酸化)低聚糖梯度绘图
| 时间(min) | 溶剂C(％) | 溶剂D(％) |
| 0 | 100 | 0 |
| 2 | 100 | 0 |
| 50 | 65 | 35 |
| 60 | 0 | 100 |
| 63 | 0 | 100 |
| 64 | 100 | 0 |
| 70 | 100 | 0 |
流速：1ml/min
电化学检测器的检测电位为：
表：低聚糖的监测电位
| 时间(ms) | 电位(mV) |
| 0 | 50 |
| 200 | 50 |
| 400 | 50 |
| 410 | 750 |
| 600 | 750 |
| 610 | -150 |
| 1000 | -150 |
特殊峰面积(nC×min×nmol-1)通过定义低聚糖标准获得的应答因子计算(含有或者不含重复N乙酰乳糖胺的二唾液酸化双触角、三唾液酸化三触角以及四唾液酸化四触角结构(Nimtz et al.，1993，Schroeter et al.，1999，Grabenhorst et al.，1999)。
HAS修饰IFN-β的结果
使用RP-HPLC的C-18 phase检测HAS修饰IFBβ的32-37级分。计算HAS-IFNβ的回收率。
附图11中的箭头显示未修饰IFNβ的位移，其有可能与结构缺乏末端唾液酸衍生物，然而，HAS修饰的IFNβ显示出较宽的弥散性库马斯染色区，跨越35Kda-120Kda的分子量范围。
RP-HPLC中洗脱的32-37级分合并，中和后在spe-ed Vac浓缩器中浓缩。典型地，100-200μg的等份的IFNβ样品干燥并溶解于50mM pH7.2的磷酸钠加0.05％的吐温20中，37℃下与多肽N糖苷酶反应20-30小时。生成的低聚糖在弱酸处理前后用HPAEC-PAD分析(实施例6.6d)。
如图12所述，由HAS修饰IFNβ洗脱52分钟后得到的低聚糖物质分别来自柱，其条件为在16-20min，21-26min，28-33min和34-38min检测脱唾液酸化、单、双、三唾液化。在唾液酸完全释放的条件下用弱酸处理低聚糖样品后，在HPAEC-PDA中检测到所预期的中性复合型IFNβ的N多糖，并且所释放的HAS衍生物在46-49min的保留时间检测到(使用梯度脱唾液酸模式，见实施例6.6.dI)。与所预期的相同，这表明HAS已经与IFNβN链多聚糖形成酸性稳定链。
实施例7偶联物ATIII的进一步表征
实施例7.1人ATIII
所应用的ATIII为重组人ATIII(GTC Biotherapeutics的ATryn_)
实施例7.2高碘酸盐氧化N乙酰神经氨酸残基，通过弱高碘酸处理ATIII
高碘酸氧化基本按照实施例6.2所描述处理IFNβ的方法进行。
实施例7.3高碘酸氧化ATIII缓冲交换用于之后的Hes化
缓冲交换基本按照实施例6.3所描述处理IFNβ的方法进行。
实施例7.4HAS和ATIII的偶联物的合成
合成已在上文实施例5.3中描述。
实施例7.5ATIII离子交换色谱用于将HAS修饰的ATIII从过量的HAS反应物中分离出来
7.5.1.抗凝血酶III样品的缓冲交换在Vivaspin浓缩器(10.000MWCO PES，Vivascience Cat.No.VS0602，Lot-No.03VS0633)中完成，用于之后通过离子交换柱纯化。HAS修饰反应(1.6ml的2mg ATIII)所得的样品用缓冲液A(20mM N-吗啉代丙磺酸，用NaOH调节至pH8.0，MOPS)稀释至5ml。按照制造者的建议将样品透滤至大约0.4-0.6ml，稀释/浓缩的步骤重复两次。最终，将蛋白质样品由浓缩器单元中冲洗出来。
7.5.2.ATIII样品的纯化在室温下进行，使用AKTA探测器10系统(Amersham Pharmacia Biotech)完成，该系统含有泵P-903，含有0.6ml空间的混合器M-925，检测器UV-900及其共同使用的10mm流动相腔，检测器pH/C-900，进样泵P-950和5ml样品环。AKTA系统在Software Unicorn Version 3.21下运行。缓冲液A(20mM MOPS，pH8.0)中的反应混合物以0.6ml/min的流速施加于，含有2ml Q琼脂胶快速流动相(Amersham，code no.17-0510-01，lot no.254665)的柱(Amersham Biosciences C 10/10)。柱子用流速为1ml/min的6CV缓冲液A平衡。柱子用流速为0.8ml/min的6CV缓冲溶液A冲洗，用流速为0.6ml/min的4CV缓冲溶液B(含0.5M NaCI的20mM磷酸钠，pH 6.5)洗脱。柱子用流速为0.6ml/min的4CV缓冲液C(含1.5M NaCI的20mM磷酸钠，pH 6.5)再生，用缓冲液A重新平衡。由柱中洗脱出大约4ml ATIII蛋白质。
方法
| 体积 | 步骤 | 缓冲液 | 流速 |
| 1CV | 平衡 | 100％缓冲液A | 1.0ml/min |
| 开始分级 | 100％缓冲液A | 1.0ml/min | |
| 10ml | 上样 | 缓冲液A中的样品 | 0.6ml/min |
| 6CV | 洗出未结合样品 | 100％缓冲液A | 0.8ml/min |
| 4CV | 洗脱 | 100％缓冲液B | 0.6ml/min |
| 4CV | 再生(洗脱2) | 100％缓冲液C | 0.6ml/min |
| 结束分级 | 100％缓冲液C | 0.6ml/min | |
| 5CV | 重新平衡 | 100％缓冲液A | 1.0ml/min |
缓冲液A：20mM MOPS/NaOH，pH 8.0；缓冲溶液B：含0.5MNaCI的20mM磷酸钠，pH 6.5；缓冲液C：含1.5M NaCI的20mM磷酸钠，pH 6.5。蛋白质洗脱液在A280nm检测并收集到1ml级分。
实施例7.6实验分析
实施例7.6(a)未修饰、高碘酸盐氧化及HAS修饰的AT III样品中N多糖的释放通过重组进行
300-600μg ATIII样品，在90℃pH8.1及0.6％SDS存在下，用5mM二硫代苏糖醇还原10min。其后，加入NP40至最终浓度为0.6％。向0.3-0.6mg天然、高碘酸氧化或HAS修饰的ATIII 50mM pH7.2磷酸钠缓冲溶液中加入，40μl重组多胎N糖苷酶(Roche，Penzberg，Germany；250units/250μl lot：101610420)。反应混合物在37℃下反应12-18小时，低聚糖链的N糖苷释放通过SDS-PAGE分析在还原条件下的5-10蛋白质进行检验，之后将蛋白质带用考马斯蓝(Carl Roth GmbH Karlsruhe，Germany)着色，检测AT III与脱N糖基化蛋白质形式之间的特殊位移。
实施例7.6(b)
通过加入3体积-20℃ 100％的乙醇在-20℃反应至少2小时，将释放的N糖苷从多肽中分离出来。4℃下13000rpm离心10分钟，将沉淀的蛋白质移出。小球用500μl冰冷的70％乙醇另冲洗两次。漂浮在反应池表面的低聚糖用真空离心机干燥(Speed Vac浓缩器，Savant Instruments Inc.，USA)。多糖样品用Hypercarb柱(100或200mg)按照以下方法脱盐：使用前，柱用500μl含0.1％(v/v)TFA的80％(v/v)乙腈冲洗三次，然后用500μl水冲洗三次。在载入柱中之前，样品用水稀释至最终体积至少为300μl。用水猛烈冲洗。低聚糖用1.2ml含0.1％(v/v)TFA的25％乙腈洗脱。洗脱出的寡糖用2M NH4OH中和，在Speed VacSpeed Vac浓缩器中干燥。-20℃下水中储存。
实施例7.6(c)弱酸水解
低聚糖的弱酸水解(N聚糖的唾液酸释放和)进行如下：等份的除盐低聚糖或HAS修饰低聚糖与相同体积的10mM的H2SO4混合，80℃反应90分钟。用50mM NaOH中和聚糖混合物后，在Speed Vac浓缩器中干燥，调节至适当的浓度用于在HPAEC-PDA(带有脉冲电流检测的高pH阴离子交换柱色谱)中分析。为以后的MALDI/TOF MS分析中性低聚糖样品(0.05-1nmol)，使用同过将25-40μl的石墨化碳加入200μl的球管尖端制备的小型Hypercarb柱脱盐。
实施例7.6(d)由HPAEC-PDA(带有脉冲电流检测的高pH阴离子交换柱色谱)对低聚糖绘图
BioLC系统(Dionex，Sunhyvale)，包括AS50自动采样器，AS50热间隔，ED50电化学检波器，GS50梯度泵，软件为Chromeleon色谱处理系统，与CarboPac PA-100分离柱(4×250mm)和CarboPacPA-100前柱(4×50mm)一同使用。用两种不同的方法对低聚糖绘图和定量。
I)脱唾液酸模式：
中性低聚糖，用HPAEC-PAD使用梯度溶剂A(200mM NaOH)和溶剂B(200mM NaOH加600mM醋酸钠)绘图，如下表所述：
表：中性低聚糖绘图的梯度
| 时间(min) | 溶剂A(％) | 溶剂B(％) |
| 0 | 100 | 0 |
| 5 | 100 | 0 |
| 35 | 80 | 20 |
| 45 | 70 | 30 |
| 47 | 0 | 100 |
| 52 | 0 | 100 |
| 53 | 100 | 0 |
| 60 | 100 | 0 |
流速：1ml/min
电化学检测器的检测电位为：
表：低聚糖的监测电位
| 时间(ms) | 电位(mV) |
| 0 | 50 |
| 200 | 50 |
| 400 | 50 |
| 410 | 750 |
| 600 | 750 |
| 610 | -150 |
| 1000 | -150 |
II)低聚糖模式
天然低聚糖，用HPAEC-PAD使用梯度溶剂C(100mM NaOH)和溶剂D(100mM NaOH加600mM醋酸钠)绘图，如下表所述：
表：天然(唾液酸化)低聚糖梯度绘图
| 时间(min) | 溶剂C(％) | 溶剂D(％) |
| 0 | 100 | 0 |
| 2 | 100 | 0 |
| 50 | 65 | 35 |
| 60 | 0 | 100 |
| 63 | 0 | 100 |
| 64 | 100 | 0 |
| 70 | 100 | 0 |
流速：1ml/min
电化学检测器的检测电位为：
表：低聚糖的监测电位
| 时间(ms) | 电位(mV) |
| 0 | 50 |
| 200 | 50 |
| 400 | 50 |
| 410 | 750 |
| 600 | 750 |
| 610 | -150 |
| 1000 | -150 |
特殊峰面积(nC×min×nmol-1)通过定义低聚糖标准获得的应答因子计算(含有或者不含重复N乙酰乳糖胺的二唾液酸化双触角、三唾液酸化三触角以及四唾液酸化四触角结构(Nimtz et al.，1993，Schroeter et al.，1999，Grabenhorst et al.，1999)。
结果
HAS修饰的ATIII导致SDS-PAGE中的明显分子量位移，指示HAS与蛋白质的共价结合(见附图14a)。
经HAS修饰的的ATIII的离子交换色谱提供了ATIII级分(＞85％回收率，基于与未处理ATIII的比较)。
由Q琼脂胶阴离子交换获得的未处理ATIII、高碘酸处理ATIII及HAS修饰ATIII的脱N糖基化导致SDS-PAGE中可比较的分子量位移，如附图14B所述。
ATIII样品释放的N多糖通过Hypercarb柱吸收并洗脱后分离，用于HPAEC-PAD分析。由HAS修饰ATIII得到的天然N多糖显示存在所有的在对照样品中的中性低聚糖峰值(见附图15的轨迹1)。经弱酸处理，所有三种N聚糖制备物显示与中性低聚糖非常相似的图案，指示HAS修饰的酸不稳定本性，其与低聚糖唾液酸衍生物的HAS修饰是一致的(附图16比较)。脱唾液酸结构的相似性已通过MALDI/TOF分析证明(数据未示出)。
实施例8GM-CSF偶联物的进一步表征
实施例8.1GM-CSF描述
人重组GM-CSF，在由CHO K1细胞表达后，基本按照F或no etal.，2004，的方法制备(Guillermina F或no，Mariela Bollati Fogolin，Marcos Oggero，RicardoKratje，MarinaEtcheverrigaray，Harald S.Conradt，Manfred Nimtz(2004)N-and O-linkedcarbohydrates andglycosylation site occupancy in recombinant humangranμlocyte-macrophage colony-stimulating factor secreted by a Chinesehamster ovary cell line；Eur J BiocAIem，271(5)，907-919)，并具有其中描述的碳水化合物结构。
重组GM-CSF同样可以通过常规色谱步骤进行纯化，例如Okamoto，M.，Nakai，M.，Nalcayama，C.，Yanagi，H.，Matsui，H.，Noguchi，H.，Namiki，M.，Sakai，J.，Kadota，K.，Fukui，M.&Hara，H.(1991)所述。三种形式的不同糖基化重组人粒细胞-巨噬细胞-集落-刺激因子的表征。生物化学和生物物理学档案(Archives of Biochemistry and Biophysics)286，562-568。
人GM-CSF氨基酸序列用于以下研究：
1APA RSPSPSTQPW EHVNAIQEAR RLLMLSRDTAAEMNETVEVI SEMFDLQEPT CLQTRLELYK QGLRGSLTKLKGPLTMMASH YKQHCPPTPE TSCATQIITF ESFKEMLKDFLLVIPFDCWE PVQE127(依照上述Foron et al.的参考文献)。
实施例8.2高碘酸氧化由弱高碘酸处理重组GM-CSF获得的N-乙酰神经氨酸残基
向0.80mg/ml的GM-CSF的0.1M pH 5.5醋酸钠缓冲溶液，保持在0℃，加入冰冷的10mM偏高碘酸钠溶液，生成最终浓度为1mM的偏高碘酸钠。混合物在暗处冰浴中0℃反应1小时。加入20μl甘油并进一步反应5分钟后，反应终止。
实施例8.3高碘酸氧化GM-CSF缓冲交换用于以后的HAS修饰
缓冲交换使用5ml Vivaspin 6浓缩器(Vivaspin AG，Hannover，Germany)和聚醚砜(PES)膜进行。加入5ml的0.1M醋酸钠缓冲溶液pH5.5冲洗浓缩器单元，并在Megafuge 1.0R(Kendro LaboratoryEquipment，Osterode，Germany)中6℃下4000rpm离心。随后，向浓缩器单元中加入1-5ml的高碘酸氧化GM-CSF溶液，4000rpm下离心25min，直至至少到达5倍浓缩。向浓缩物中加入4ml pH5.5的0.1M的醋酸钠缓冲溶液如上述被离心。离心循环重复3次，移出最终浓缩物，移入2.0ml的塑料瓶中。用150μl pH5.5醋酸钠冲洗容器单元两次后，蛋白质的体积用pH5.5的醋酸钠调至
实施例8.4HAS和GM-CSF偶联物的合成
按照上述实施例5.4的方法进行合成。
实施例8.5HAS修饰后GM-CSF的纯化
从过量活化HES衍生物中分离HAS修饰的GM-CSF，其中过量活化HES衍生物来自高碘酸氧化蛋白质同羟胺HES10/0.7的温育。完成的。
摘要：室温下运行RP-HPLC Runs，使用AKTA探测10设备，流速为1.25ml/min。含有400μg IFNβ的等份反应混合物上样于250mm×10mm C18-phase柱子，柱子用1.25CV的11％洗脱液B(0.1％TFA，90％乙腈)和89％洗脱液A(0.1％TFA)平衡。然后注入样品(ca.1.25ml)，样品环用11ml的11％洗脱液B冲洗。然后用0.2CV的11％洗脱液B冲柱，提供自11％至90％线性梯度的2CV洗脱液B。使用0.8CV的90％洗脱液B继续洗脱柱子，最终柱子使用1.0CV的11％洗脱液B重新平衡。
GM-CSF蛋白质洗脱至体积为7.5ml的洗脱液B中，浓度为％。蛋白质的回收率为60％(HES GM-CSF)，基于标准GM-CSF产品在相同梯度条件下冲柱。
实施例8.5的原料和方法
仪器和原料
仪器：AKTA探测10(Amersham Pharmacia Biotech)，包括：
泵P-903
混合器M-925，与0.6ml槽
监控器UV-900，与10mm流动池
监控器pH/C-900
分段收集器Frac-900
样品环2ml
软件Unicorn版本3.21
柱：250mm×10mm，Macherey-Nagel 250-1/2″-10Nucleosil 7C18，Cat.No.715002，Lot-No.4020854
柱体积：20ml
流量：1.25ml/min
溶剂A：0.1％TFA的HPLC-水
溶剂B：90％乙腈，0.1％TFA的HPLC-级水
实施例8.5的RP-HPLC运行方法
| 体积 | 步骤 | 溶液A | 溶液B |
| 0.25CV | 平衡 | 89％ | 11％ |
| 11ml | 进样品 | 89％ | 11％ |
| 分级 | 89％ | 11％ | |
| 0.20CV | 冲洗出未结合样品 | 89％ | 11％ |
| 2.00CV | 线性梯度 | 89-10％ | 11-90％ |
| 0.80CV | 等度 | 10％ | 90％ |
| 末尾分级 | 10％ | 90％ | |
| 1.00CV | 重新平衡 | 89％ | 11％ |
检测：280nm
221nm
206nm
导电性
分馏体积：1.25ml/级分
实施例8.5的结果
RP-HPLC从过量的HAS(10Kda)衍生物中分离GS-CSF(实施例8.5)，提供26-32级分，含有所有柱中洗脱出的HAS修饰GM-CSF。HAS修饰后的蛋白质SDS-PAGE模式显示在分子量35-90Kda区域为宽散射带，然而未修饰的GM-CSF显示模式为非糖基化、单N糖基化和双N糖基化形式(附图17，cf.Reference forno et.al.，2004的比较)。
实施例8.6实验分析
(a)N链低聚糖的重组多肽N糖苷酶释放
向200μg-1mg的天然、高碘酸氧化或HAS修饰的GM-CSF50mM磷酸钠缓冲溶液，pH 7.2，加入25μl重组多肽N糖苷酶(Roche，Penzberg，Germany；250units/2501 lot：101610420)。反应混合物在37℃反应12-18小时，低聚糖N糖苷键的释放通过SDS-PAGE在还原条件下分析5-10μg的蛋白质进行检验，之后，用库马斯蓝(CarlRoth GmbH Karlsruhe，Germany)将蛋白质带染色，检测GM-CSFa蛋白质带相对脱-N-糖基化形式位移位置的特殊位移(附图18比较)。
(b)酶释放N多糖和HAS修饰N多糖的分离和脱盐
释放的N聚糖通过加入3体积-20℃的100％乙醇从多肽中分离出来，在-20℃的反应进行至少2小时。沉淀的蛋白质通过在4℃以13000rpm离心10分钟分离。片状沉淀物然后用两份50μl冰冷的70％乙醇冲洗。反应池中的低聚糖超浮游物在真空离心机中干燥(Speed Vac浓缩器，Savant InstrumentsInc.，USA)。聚糖样品使用下述的Hypercarb柱(100或200mg)脱盐：使用前，柱用500μl含0.1％(v/v)TFA的80％(v/v)乙腈冲洗三次，然后用500μl水冲洗三次。在载入柱中之前，样品用水稀释至最终体积至少为300μl。用83柱体积的水猛烈冲洗。低聚糖用1.2ml含0.1％(v/v)TFA的25％乙腈洗脱。洗脱后的寡糖用2M NH4OH中和，在Speed Vac浓缩器中干燥。-20℃下水中储存直至进-步使用。
(c)低聚糖弱酸水解(从多聚糖中去除唾液酸和HAS修饰唾液酸衍生物)
等份的除盐低聚糖或HAS修饰低聚糖与相同体积的10mM的H2SO4混合，80℃反应90分钟。用50mM NaOH中和聚糖混合物后，在Speed Vac浓缩器中干燥，调节至适当的浓度用于在HPAEC-PDA(带有脉冲电流检测的高pH阴离子交换柱色谱)中分析。为以后的MALDI/TOF MS分析，使用含有20-30μl的Hypercarb原料的球管尖端用于吸收，使用25％乙腈的0.1％三氟醋酸水溶液冲洗和洗脱，将N多糖脱盐。
(d)由HPAEC-PDA(带有脉冲电流检测的高pH阴离子交换柱色谱)对低聚糖绘图
低聚糖的绘图和定量基本按照实施例7.6.d描述的方式进行。
结果
实施例8.5的RP-HPLC纯化原料用于证明使用HAS衍生物修饰的蛋白质，在其经过氧化唾液酸处理的碳水化合物链。单糖化合物用气相色谱分析其三甲基唾液酸衍生物显示，存在葡萄糖、单-和双-羟乙基化葡萄糖衍生物，以及甘露糖、半乳糖和N乙酰基葡萄糖胺和少量N乙酰半乳糖胺。
释放自HAS修饰GM-CSF的天然低聚糖的HPAEC-PAD分析显示，有与HAS修饰的复合型低聚糖一致的峰(见附图19)。
经弱酸处理后，GM-CSF的中性N多糖提取物，在HAS修饰蛋白质以及修饰的HAS衍生物样品中检测到，在47-49分钟洗脱出。
实施例9ATIII偶联物的合成
实施例9.1羟氨基HAS衍生物的合成
实施例9.1(a)羟氨基HES10/0.4的合成
将0.8HES 10/0.4(MW＝10000D，DS＝0.4，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)溶解于8mL 0.1M醋酸钠缓冲液中，pH 5.5，加入8mmol的O-[2-(2-氨氧基-乙氧基)-乙基]-羟基胺。22℃下振摇19小时，将反应混合物加入40mL-20℃的2-丙醇中。4℃下离心收集沉淀产物，再溶解于50mL水中，水中透析45h(蛇皮透析袋，3.5kD截留，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)，冻干。产率为73％。
用LALLS-GPC测量，HES10/0.4的分子量为8500D，DS为0.41。
实施例9.1(b)羟氨基HES10/0.7的合成
将1.06g HES 10/0.7(MW＝10000D，DS＝0.7，SupramolParenteral Colloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)溶解于10mL 0.1M醋酸钠缓冲液中，pH 5.5，加入10.9mmol的O-[2-(2-氨氧基-乙氧基)-乙基]-羟基胺。22℃下振摇19小时，将反应混合物加入40mL-20℃的2-丙醇中。4℃下离心收集沉淀产物，再溶解于50mL水中，水中透析45h(蛇皮透析袋，3.5kD截留，Perbio Sciences DeutschlandGmbH，Bonn，D)，冻干。产率为60％。
用LALLS-GPC测量，HES10/0.7的分子量为10500D，DS为0.76。
实施例9.1(c)羟氨基HES30/0.4的合成
将2g HES 30/0.4(MW＝30000D，DS＝0.4，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)溶解于18mL 0.1M醋酸钠缓冲液中，pH 5.5，加入6.67mmol的O-[2-(2-氨氧基-乙氧基)-乙基]-羟基胺。22℃下振摇15.5小时，将反应混合物加入80mL-20℃的2-丙醇中。4℃下离心收集沉淀产物，再溶解于50mL水中，水中透析45h(蛇皮透析袋，3.5kD截留，Perbio Sciences Deutschl和GmbH，Bonn，D)，冻干。产率为83％。
用LALLS-GPC测量，HES 30/0.4的分子量为33000D，DS为0.41。
实施例9.1(d)羟氨基HES30/0.7的合成
将2g HES 30/0.7(MW＝30000D，DS＝0.7，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)溶解于18mL 0.1M醋酸钠缓冲液中，pH 5.5，加入6.67mmol的O-[2-(2-氨氧基-乙氧基)-乙基]-羟基胺。22℃下振摇15小时，将反应混合物加入80mL-20℃的2-丙醇中。4℃下离心收集沉淀产物，再溶解于50mL水中，水中透析45h(蛇皮透析袋，3.5kD截留，Perbio Sciences Deutschl和GmbH，Bonn，D)，冻干。产率为86％。
用LALLS-GPC测量，HES 30/0.7的分子量为31000D，DS为0.76。
实施例9.1(e)羟氨基HES 50/0.4的合成
将2g HES 50/0.4(MW＝50000D，DS＝0.4，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)溶解于20mL 0.1M醋酸钠缓冲液中，pH 5.5，加入4mmol的O-[2-(2-氨氧基-乙氧基)-乙基]-羟基胺。22℃下振摇19.5小时，将反应混合物加入80mL-20℃的2-丙醇中。4℃下离心收集沉淀产物，再溶解于50mL水中，水中透析45h(蛇皮透析袋，3.5kD截留，Perbio Sciences Deutschl和GmbH，Bonn，D)，冻干。产率为94％。
用LALLS-GPC测量，HES 50/0.4的分子量为56000D，DS为0.41。
实施例9.1(f) 羟氨基HES 50/0.7的合成
将2g HES 50/0.7(MW＝50000D，DS＝0.7，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)溶解于25mL 0.1M醋酸钠缓冲液中，pH 5.5，加入5mmol的O-[2-(2-氨氧基-乙氧基)-乙基]-羟基胺。22℃下振摇19.5小时，将反应混合物加入80mL-20℃的2-丙醇中。4℃下离心收集沉淀产物，再溶解于50mL水中，水中透析45h(蛇皮透析袋，3.5kD截留，Perbio Sciences Deutschl和GmbH，Bonn，D)，冻干。产率为85％。
用LALLS-GPC测量，HES50/0.7的分子量为47000D，DS为0.76。
实施例9.1(g)羟氨基HES 10/0.7的合成
将2g HES 10/0.7(MW＝10000D，DS＝0.7，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)溶解于18mL 0.1M醋酸钠缓冲液中，pH 5.2，加入20mmol的O-[2-(2-氨氧基-乙氧基)-乙基]-羟基胺。22℃下振摇19小时，将反应混合物加入100mL冰冷的1∶1混合的丙酮和乙醇(v/v)中。4℃下离心收集沉淀产物，再溶解于50mL水中，水中透析21h(蛇皮透析袋，3.5kD截留，Perbio SciencesDeutschl和GmbH，Bonn，D)，冻干。产率未测。
用LALLS-GPC测量，HES10/0.7的分子量为10500D，DS为0.76。
实施例9.2醛基HES衍生物的合成
实施例9.2(a)合成氨基HES10/0.7
将6.02g氧代HES10/0.7(MW＝10000D，DS＝0.7，SupramolParenteral Colloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D，按照DE19628705A1的方式制备)氮气保护下加入32mL干燥的二甲亚砜(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)，加入6.03ml 1，4-二氨丁烷，40℃下搅拌17h。将反应混合物加入150ml冰冷的1∶1混得的乙醇和丙酮(v/v)中，离心收集。粗产品溶解于80ml水中。水中透析4天(蛇皮透析袋，3.5kD截留，Perbio SciencesDeutschl和GmbH，Bonn，D)，随后冻干。产率为52％。
用LALLS-GPC测量，HES10/0.7的分子量为15000D，DS为0.76。
实施例9.2(b)合成醛基HES10/0.7
将150mg的4-甲酰苯甲酸和230mg的1-羟基-1H-苯并三唑(均为Aldrich，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)溶解于10ml的N，N-二甲基甲酰胺(peptide synthesis grade，Biosolve，Valkenswaard，ML)并加入204μL的N，N’-二异丙基碳化二亚胺。21℃反应30min后，加入1g氨基HES10/0.7。在22℃振摇19h，将反应混合物加入84mL冰冷的1∶1混合的丙酮和乙醇(v/v)中。4℃下离心收集沉淀产物，再溶解于50mL水中，水中透析2天(蛇皮透析袋，3.5kD截留，Perbio Sciences Deutschl和GmbH，Bonn，D)，冻干。产率为83％。
实施例9.2(c)合成氨基HES50/0.7
将6.09g氧代HES50/0.7(MW＝50000D，DS＝0.7，SupramolParenteral Colloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D，适应成分的摩尔比，按照DE19628705A1的方式制备)氮气保护下加入32mL干燥的二甲亚砜(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)，加入1.22ml 1，4-二氨丁烷，40℃下搅拌17h。将反应混合物加入150ml冰冷的1∶1混得的乙醇和丙酮(v/v)中，4℃下离心收集沉淀产物。用40ml冰冷的1∶1乙醇和丙酮(v/v)混合溶液冲洗，离心收集。粗产品溶解于80ml水中。水中透析4天(蛇皮透析袋，3.5kD截留，Perbio Sciences Deutschl和GmbH，Bonn，D)，随后冻干。产率为67％。
用LALLS-GPC测量，HES50/0.7的分子量为57000D，DS为0.76。
实施例9.2(d)合成醛基HES50/0.7
将124mg的4-甲酰苯甲酸和174mg的1-羟基-1H-苯并三唑(均为Aldrich，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)溶解于38ml的N，N-二甲基甲酰胺(peptide synthesis grade，Biosolve，Valkenswaard，ML)并加入155μL的N，N’-二异丙基碳化二亚胺。21℃反应30min后，加入3.8g氨基HES50/0.7(按照实施例9.2(c)所述方法制备)。在22℃振摇19h，将反应混合物加入160mL冰冷的1∶1混合的丙酮和乙醇(v/v)中。4℃下离心收集沉淀产物，再溶解于20ml N，N-二甲基甲酰胺，如上文所述，用80ml冰冷的1∶1混合的丙酮和乙醇(v/v)沉淀。离心后，沉淀物溶解于50mL水中，水中透析2天(蛇皮透析袋，3.5kD截留，Perbio Sciences Deutschl和GmbH，Bonn，D)，冻干。产率为77％。
实施例9.3通过多糖途径合成ATIII偶联物
实施例9.3(a)实施例9.1(a)至9.1(g)产物同氧化ATIII的反应
向685μl氧化ATIII在0.1M醋酸钠缓冲溶液pH5.5的溶液(GlycoThera，B52perj-ox STM LJ2-366，4.375mg/ml，见实施例3.2.)，加入814μl 0.1M醋酸钠缓冲溶液pH 5.5和1.5mLHES衍生物溶液的0.1M醋酸钠缓冲溶液pH 5.5，溶液在22℃下反应26h。
采用以下最终HES浓度：
按照实施例9.1(a)和9.1(b)制备的0.46mg/ml HES衍生物；
按照实施例9.1(c)和9.1(d)制备的1.38mg/ml HES衍生物；
按照实施例9.1(e)制备的9.1mg/ml HES衍生物；
按照实施例9.1(f)制备的10.5mg/ml HES衍生物；
按照实施例9.1(g)制备的17.25mg/ml HES衍生物；
9mg/ml HES 50/0.7(Supramol Parenteral Colloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)作为反应对照。用LALLS-GPC测量，HES50/0.7的分子量为47000D，DS为0.76。
各自的反应混合物用凝胶电泳进行分析(见附图20)。
实施例9.4通过还原氨化作用合成ATIII偶联物
实施例9.4(a)缓冲交换
ATIII(Atryn，GTC Biotherapeutics，Framingham，MA，USA)溶解至10ml水中，生成含25mg/ml ATIII的溶液，其中含有5mM柠檬酸钠、67mM甘氨酸和68mM氯化钠。PH 7的0.1ml该溶液用冷的0.1M的醋酸钠缓冲溶液稀释，pH5.0，使用Vivaspin 20mL浓缩器(VS2001，10KD MWCO，PES膜，Vivascience AG，Hannover，D)，在4℃下透滤法浓缩至4ml。用缓冲液重稀释至20ml。透滤法重复两次。最后透滤步骤的最终浓度为3mg/ml。
实施例9.4(b)ATIII同实施例9.2(b)和9.2(d)反应产物的反应：
向1ml经缓冲交换为0.1M pH5.0醋酸钠缓冲溶液的ATIII溶液中，加入1mL HES衍生物的0.1M pH5.0醋酸钠缓冲溶液，和1ml pH5.0在相同缓冲溶液中的60mM氰基硼氢化钠。溶液在4℃反应15.5h。所有溶液在混合前均冷却至0℃。
使用以下最终HES浓度：
按照实施例9.2(b)制备的13mg/ml HES衍生物；
按照实施例9.2(d)制备的64.7mg/ml HES衍生物；
64.7mg/ml HES 50/0.7(Supramol Parenteral Colloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)作为反应对照。
各自的反应混合物用凝胶电泳进行分析。
实施例10经活化醛糖酸合成IFNα偶联物
所用的IFNα为重组人干扰素α-2b，通过重组DNA技术使用埃希氏菌属大肠杆菌(E.coli)人工合成。其由165个氨基酸组成并表现出与天然人干扰素α-2b(hIFN-α2b)同样的氨基酸序列。
实施例10.1氧化HES(氧代HES)的合成
按照DE19628705A1所述，由HES(MW＝57kD，DS＝0.76，Supramol Parenteral Colloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)制备氧代HES。
实施例10.2NHS活化的氧代HES的合成
按照实施例10.1制备的4.81g氧代HES50/0.7在80℃烤箱中干燥过夜。
氧代HES溶解于80℃的干燥DMF中冷却至室温。
由102.1mg N，N′-二琥珀酰亚胺羧酸盐(Aldrich)的1ml干燥DMF溶液，400ml搅拌下滴加至反应容器中，室温下搅拌2小时。
反应混合物滴加至50ml干燥丙酮中，通过离心过滤收集沉淀物，用4×50ml干燥丙酮冲洗，其中复悬浮产物再次离心。室温下真空中去除残余溶剂。
实施例10.3经活化醛糖糖酸合成IFNα偶联物(AAA)
在冷却离心分离机(4℃)中使用Amicon超滤模块4(5kDa分子量截留(MWCO))将蛋白质浓缩至最终浓度10mg/ml。
在该阶段缓冲液被交换为磷酸等张缓冲液，pH8。
为连接，将9mg蛋白质溶液与20倍分子量的实施例10.1制备的NHS活化氧代HES，室温下反应2小时。在冷却离心分离机(4℃)中使用Amicon超滤模块4(5kDa(MWCO))，通过超滤将反应混合物从NHS中纯化。在步骤中缓冲也被交换为25mM磷酸钠、30mM氯化钠、0.3mMEDTA，pH7.5。
按照SEC检测，该实验的反应产率＞90％(见图22)。
实施例10.4IFNαHES的纯化
在室温下使用AKTA探测器10系统(Amersham PharmaciaBiotech)完成。
含有5ml Q琼脂胶快速流动相的柱用5CV缓冲液A1(20mM Tris/HCl，pH 8.0)平衡。样品用缓冲液A1∶16稀释，使用进样泵以6ml/min的速率进样。然后用20ml缓冲液A1冲洗进样泵，进一步用15ml缓冲液A1以流速1.0ml/min冲柱。用线性梯度为0-100％的缓冲液B1(含0.3M NaCl的20mM Tris/HCl，pH 8.0)经37.5min进行洗脱，用缓冲液B经12.5min以流速0.8ml/min平衡柱子。柱通过使用15ml缓冲液B2(含1.5M NaCl的20mM Tris/HCl，pH 8.0)，然后用5ml缓冲溶液B以流速0.8ml/min进行再生。新一轮的平衡步骤通过使用25ml缓冲液A1以流速1.0ml/min完成。
仪器：AKTA探测10(Amersham Pharmacia Biotech)，与：
泵P-903
混合器M-925，与0.6ml槽
监控器UV-900，带10mm流动池
监控器pH/C-900
泵P-950(进样泵)
软件Unicorn版本3.21
柱：Amersham Bioscience C 10/10；
柱材料：Q-快速流动性琼脂胶，Lot No.OD 06453
柱体积：5ml
程序：Q Seph 5ml无注射IFN-α
洗脱液A1：20mM Tris/HCl，pH 8，0(PL0935)
洗脱液B1：含0.3M NaCI的20mMTris/HCl，pH 8，0(PL0938)
洗脱液B2：含1.5M NaCI的20mMTris/HCl，pH 8，0(PL0937)
方法
| 体积 | 步骤 | 洗脱液 | 流速 |
| 25ml | 平衡 | 100％缓冲液A1 | 1ml/min |
| 40ml | 上样 | 缓冲液A1中的样品 | 6ml/min |
| 20ml | 洗进样泵 | 100％缓冲液A1 | 6ml/min |
| 15ml | 冲柱 | 100％缓冲液A1 | 1ml/min |
| 30ml | 洗脱(梯度) | 0-100％缓冲液B1 | 0.8ml/min |
| 10ml | 洗脱(等动力) | 100％缓冲液B1 | 0.8ml/min |
| 15ml | 再生 | 100％缓冲液B2 | 0.8ml/min |
| 5ml | 再生 | 100％缓冲液B1 | 0.8ml/min |
| 25ml | 重新平衡 | 100％缓冲液A1 | 1.0ml/min |
检测：280nm，206nm，220nm
PH
导电性
分级：1ml级分
实施例11IFNα的抗病毒活性生物测定描述
在细胞培养基中预稀释测试系统后，进行连续两倍稀释。在96孔微量滴定板，加入稀释的干扰素-每个稀释4份-至新鲜的胰蛋白酶处理的MDBK细胞(40,000细胞/孔)。反应在37℃进行24小时(每孔总体积：150μl(实施例11.1)或175μl(实施例11.2))。
然后，向每孔中加入50μl稀释的VSV存储溶液(阳性对照孔除外)，导致0.1的复合感染值。
每一测定包括以下对照：经过病毒替代干扰素的阳性细胞培养基得到的12孔(阴性对照)和细胞培养基代替干扰素和病毒得到的12孔(阳性对照)。37℃培养42小时后进行测定。
在潜伏期最后，每一孔的细胞培养浮游物用50μl的MTT溶液复位(在细胞培养基中的浓度至少为2mg/ml)。细胞培养三小时。增生细胞生成的甲紫染料(purple formazan)在加入100μl异丙醇/HCl溶液(含有40mM HCl的异丙醇)后溶解。随后，溶液的吸光值在微量感光读数器中570/630nm处测量。
在干扰素和VSV存在下，MDBK细胞生长的增长活性在每一稀释的干扰素中计算如下：
干扰素α的抗病毒活性通过4个独立的测试项目的分别分析而确定。
实施例11.1Intron_A与NIH标准相比的抗病毒活性
在所有实验中，依照NIH-标准rhIFN-α2a(NIAID，NIH，Bethesda，USA，GxaOl-901-535)定标的Intron_A(IFN-α2b，Schering-Plongh)，作为内部试验参考。NIH标准具有特定的9000IU/ml的活性。内部试验参照的Intron_A在上述实施例11中描述的测试中特定活性为8487000IU/ml(参见附图23)。
实施例11.2IFNαHES与Intron_A相比的抗病毒活性
在实施例11所述的分析系统中，实施例10.4所得的偶联物进行与Intron_A相比测试。两个材料的CPE50浓度均计算出来。IFNαHES的活性较Intron_A高出25％(见附图24)。
实施例12IFN-α-HES的体内生物学活性(小鼠中的PK研究)
实施例12.1实施例11所述的分析系统对小鼠血清的影响
稀释的干扰素α在细胞培养基(对照)和小鼠血清(1∶40稀释和1∶80稀释)中制备。按照实施例11所述的方法进行分析。
对照、小鼠血清1∶40稀释以及小鼠血清1∶80稀释的干扰素α的抗病毒活性用两种单独的方法进行测定。结果显示，小鼠血清1∶40稀释和小鼠血清1∶80稀释并不影响干扰素α的抗病毒活性。
实施例12.2小鼠体内实验
储存血清的抗病毒活性已经在抗病毒分析中进行了测试。血清每次采自两只小鼠(雌性BALB/c小鼠，8周龄)，采血是在i.v.-注射30μg/kg(基于蛋白质含量)的IFNα或其偶联物后的2h、4h、12h和24h进行。
融合血清样品并通过涡流充分均匀加工处理。在细胞培养基中制备两倍稀释的血清。融合一小瓶Intron_A并通过涡流充分均匀加工处理。在细胞培养基中制备两倍稀释的血清。
CPE分析中的EC-50经1∶2稀释，由实施例11中所述的血清剂量反应曲线确定。
原料的半衰期与未修饰的起始原料和Pegasys比较后确定。半衰期由EC-50稀释与注射时间的半对数图表计算得到(见附图25)。
测定IFNα-HES至24h的抗病毒活性。可发现由带有HES的IFNα引起的半衰期延长(半衰期达到5h)。对未修饰的IFNα而言，血清抗病毒活性太低而无法计算半衰期。
实施例13通过还原氨化反应合成A1AT(α1AT，α1aT)偶联物
实施例13.1由氧化HES合成氨基HES(A)
将6.09g氧代HES(MW＝57000D，DS＝0.76，SupramolParenteral Colloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D，按照DE19628705A1的方式制备)真空中加热至80℃过夜。氮气保护下加入32mL干燥的二甲亚砜(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)，加入1.22ml 1，4-二氨丁烷，40℃下搅拌17h。将反应混合物加入150ml冰冷的1∶1混和的乙醇和丙酮(v/v)中，4℃离心收集沉淀产物，用40ml冰冷的1∶1混和的乙醇和丙酮(v/v)沉淀，离心收集。粗产品溶解于80ml水中。水中透析4天(蛇皮透析袋，3.5kD截留，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)，随后冻干。产率为82％。
实施例13.2由实施例13.1的氨基HES(A)合成醛基HES(A)
将124mg的4-甲酰苯甲酸和174mg的1-羟基-1H-苯并三唑(均为Aldrich，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)溶解于38ml的N，N-二甲基甲酰胺(peptide synthesis grade，Biosolve，Valkenswaard，ML)并加入155μL的N，N’-二异丙基碳化二亚胺。21℃反应30min后，加入3.8g氨基HES(A)(按照实施例13.1描述的方法制备)。在22℃振摇19h，将反应混合物加入160mL冰冷的1∶1混合的丙酮和乙醇(v/v)中。4℃下离心收集沉淀产物，再溶解于20mlN，N-二甲基甲酰胺中，用80ml实施例13.1所述的冰冷的1∶1混合的丙酮和乙醇(v/v)沉淀。离心后，再溶解于50mL水中，水中透析2天(蛇皮透析袋，3.5kD截留，Perbio Sciences DeutschlandGmbH，Bonn，D)，冻干。产率为77％。
实施例13.3由氧化HES合成氨基HES(B)
将10g氧化HES(MW＝57kD，DS＝0.76，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D，按照DE19628705A1的方式制备)真空中加热至80℃过夜。氮气保护下溶解在52mL无水二甲亚砜(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)，加入2ml 1，4-二氨丁烷，40℃下搅拌17h。将反应混合物加入350ml冰冷的2-丙醇中，4℃离心收集沉淀产物，用80ml冰冷的2-丙醇沉淀，离心收集。粗产品溶解于80ml水中。水中透析2天(蛇皮透析袋，3.5kD截留，Perbio Sciences Deutschl和GmbH，Bonn，D)，随后冻干。产率为85％。
实施例13.4由实施例13.3的氨基HES(B)合成醛基HES(B)
将153mg的4-甲酰苯甲酸和241mg的1-羟基-1H-苯并三唑(均为Aldrich，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufjirchen，D)溶解于51ml的N，N-二甲基甲酰胺(peptide synthesis grade，Biosolve，Valkenswaard，ML)并加入170μL的N，N’-二异丙基碳化二亚胺。21℃反应30min后，加入5.1g氨基HES(B)(按照实施例13.3描述的方法制备)。在22℃振摇16h，将反应混合物加入360mL冰冷的1∶1混合的丙酮和乙醇(v/v)中。4℃下离心收集沉淀产物，再溶解于50ml水中，用360ml实施例13.1所述的冰冷的1∶1混合的丙酮和乙醇(v/v)沉淀。离心后，再溶解于50mL水中，水中透析2天(蛇皮透析袋，3.5kD截留，Perbio Sciences Deutschl和GmbH，Bonn，D)，冻干。独立产率为87％。
实施例13.5通过还原氨化，将醛基HES(A)和(B)偶联至A1AT
189mg醛基HES(B)(按照实施例13.4所述方法制备)和172mg醛基HES(A)(按照实施例13.2所述方法制备)的混合物，溶解于2.88ml反应缓冲液中(0.1M磷酸钠缓冲溶液，150mM氯化钠，pH7.2)。在20℃，加入1.67ml含有60mM氰基硼氢化钠的相同缓冲溶液，跟着加入0.455ml的A1AT溶液(c(A1AT)＝11.0mg/ml的0.1M磷酸钠缓冲溶液，含150mM氯化钠，pH7.2，A1AT＝rhA1AT，由GTC Biotherapeutics Inc.，Framingham，MA，lotNo.080604A提供)。混合物在20℃反应。17h后，另外加入含6.7mg氰基硼氢化钠的200μl反应缓冲液，在相同温度下，混合物再反应24h。总反应时间25h后，取10μl该溶液进行凝胶电泳分析。
实施例13.6通过还原氨化，将HES偶联至A1AT(对照反应)
362mgHES(MW＝42kD，DS＝0.41，Supramol Parenteral ColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D)溶解于2.88ml反应缓冲液中(0.1M磷酸钠缓冲溶液，150mM氯化钠，pH7.2)。在20℃，加入1.67ml含有60mM氰基硼氢化钠的相同缓冲溶液，跟着加入0.455ml的A1AT溶液(c(A1AT)＝11.0mg/ml的0.1M磷酸钠缓冲溶液，150mM氯化钠，pH7.2，A1AT＝rhA1AT，由GTC Biotherapeutics Inc.，Framingham，MA，lotNo.080604A提供)。混合物在20℃反应。17h后，另外加入含6.7mg氰基硼氢化钠的200μl反应缓冲液，在相同温度下，混合物再反应24h。总反应时间25h后，取10μl该溶液进行凝胶电泳分析(见附图27)。
实施例13.7用离子交换色谱(IEC)纯化HES-A1AT偶联物
A1AT偶联物用离子交换色谱纯化，在Hitrap Q HP柱，使用AKTA探测色谱系统(均来自Amersham Biosciences)。纯化过程与A1AT从人血浆中的分离一致，如“Chen，Hammond，Lang and Lebiμg，通过离子交换色谱，从人血浆级分IV-1中纯化α1蛋白酶抑制剂，VoxSanguinis，1998，74，232-241”。
样品制备：在HiPrep 26/10脱盐柱(Amersham Biosciences)中进行离子交换，与AKTA探测色谱系统结合，使用20mM磷酸钠，20mM氯化钠，pH8作为洗脱液。
稀释粗产物混合物(如实施例13.5所述制备，大概5ml)后，与去离子水进行缓冲交换，至最终体积为10ml，使用以下参数：
柱：HiPrep26/10脱盐
流速：10ml/min
洗脱液：20mM磷酸钠，20mM氯化钠，pH8
样品体积：10ml
洗脱级分：2.5ml
平衡：5柱体积
洗脱长度：2柱体积
前14ml洗脱液合并，加入结合缓冲液至最终体积为20ml。该溶液，含有接近5mg蛋白质，用以下条件的IEC纯化：
柱：Hitrap Q HP 1ml
流速：1ml/min
结合缓冲液(BB)：20mM磷酸钠，20mM氯化钠，pH8
洗脱缓冲液(EB)：20mM磷酸钠，1mM氯化钠，pH8
样品体积：20ml
流动槽级分：2ml
洗脱级分：1ml
起始浓度EB：0％
平衡：5柱体积
洗出未结合样品：15ml
目标浓度EB：15％
梯度长度：20ml
色谱收集的级分用SDS-PAGE进行分析。将含有HES-A1AT的级分合并(洗脱体积从40至47ml，与级分B1-C6对应，见附图27)。在某些合并的级分中，可检测到少量的未反应A1AT。合并后级分的初始化浓度为170μg/ml，其测定是在BCA色谱测定之后(Pierce Cat，No.23225)，使用A1AT(由GTC生物试剂公司，Framiμgham，MA，lot No.080604A)为参照标准)。稀释后，缓冲交换至20mM磷酸钠，150mM氯化钠，pH7.2，所得蛋白质浓度为54.5μg/ml(BCA(Pierce，用来自GTC的A1AT作为参照标准))。最终溶液用于检测偶联物的抑制效率。
实施例13.8检测HES-A1AT偶联物对人粒细胞弹性蛋白酶的体外抑制作用
偶联物的弹性蛋白酶抑制活性测试，按照Castillo et al.，Anal.Biochem.1979，99，53-64的方法进行，使用TecanUV-VIS-Platereader Model Sunrise。
该分析基于弹性蛋白酶引起N-Met-O-succinyl-Ala-Ala-Pro-Val-p-NO2-苯胺的P-硝基苯胺释放。水解伴随着405nm吸收的增强。最初水解速率与酶活性非常相关。在不存在或存在不同浓度待测试的抑制因子条件下，进行分析。按照测试物质的抑制活性，酶活性的降低表现在A405对时间图表显示的倾斜。以某一特定抑制因子浓度下的残余弹性蛋白酶活性，通过抑制曲线除以未抑制曲线的斜率得到。在残余酶活性与抑制剂浓度之间具有线性相关性。通过利用线性回归，可以得到平滑直线，并可以算出对于给定抑制剂浓度的残余酶活性。通过这种方法，可以比较不同抑制剂相同浓度下的抑制活性(＝1-残余酶活性)(见图28)。
使用以下条件：
培养基浓度：1.5mM
弹性蛋白酶活性：7.5mU
波长：405nm
温度：20℃
时间间隔：15s
动态循环：25
测量模式：中心
测试溶液含有300μl缓冲溶液(0.1M肝素，0.5M NaCl，0.05％(m/v)TritonX-100，pH7.5)含有10％DMSO，1.5mM N-Met-O-琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Val-p-NO2苯胺，7.5mU弹性蛋白酶和不同数量的抑制剂。
弹性蛋白酶购买自Electrophoresis GmbH，Heidelberg。其它原料购买自Sigma Aldrich，Taufkirchen。
测试按照实施例13.5所述合成的偶联物的抑制活性，与作为参考的Prolastin_HS(Bayer Vital GmbH，Leverlcusen，Germany Lot No.PR4HA43)比较，并与作为偶联物起始原料的A1AT(GTCBiotherapeutics Inc.，Framingham，MA，lot No.080604A)比较。
残留酶活性vs.浓度的图在附图28中给出。所有曲线的线性关系为R2＞0.98。在下面，给出了IC50和弹性蛋白酶对c(抑制因子)＝1μg/ml的抑制，以及起始原料和参照偶联物的抑制活性。下表的数据明确显示了，A1AT在与HES偶联之后，主要活性依然保留。
实施例13.8的表
| 抑制剂 | 曲线的线性关系 | IC50(μg/ml) | 弹性蛋白酶抑制c(抑制因子)＝1μg/ml | 相对Prolastin的抑制活性[％] |
| Prolastin | Y＝-0.6754x+0.9627 | 0.685 | 71.3 | |
| A1AT | Y＝-0.5046x+0.9558 | 0.903 | 54.9 | 77.0 |
| HES -A1AT偶联物 | Y＝-0.3757x+0.9627 | 1.232 | 41.3 | 57.9 |
实施例13.9与rhαAT和得自血浆的hαAT比较，进行体内HES-rhαAT半衰期测定
8-10周龄的雌性小鼠(BALB/cOlaHsd，Harlan GmbH，Borchen，Germany)作为测试机体(42只，每组14只)。每只动物的“体重是”为注射不同样品溶液前的测量值。下述100μl的50μl/ml的在pH7.2缓冲溶液(20mmol磷酸钠，150mmol氯化钠)中的样品溶液，通过小鼠的尾静脉，进行静脉注射。
样品1：rhα1AT(GTC Biotherapeutics Inc.，Framiμgham，MA，lot No.080604A)
样品2：实施例13.5制备的rhα1AT-HES
样品3：得自血浆的hα1AT(SERVAElectrophoresis GmbH，Heidelberg，Germany)
在注射后的1、2、4、10、24、31.5和48小时，杀死每组中的两只小鼠，从动物的心脏中取出整个血液样品(～500μl)。用Microvette_500Z-Gel(Sarstedt，Niimbrecht，Germany)制备血清。在-80℃存储血清直至进行αAT浓度测定。
A利用市售的α1AT-ELISA(Immundiagnostik，Bensheim，Germany)，根据生产商的建议，测定αAT浓度。
获得的结果证明，rhαAT-HES偶联物的血浆半衰期较未修饰的rhαAT起始原料明显延长。测得得偶联物的半衰期与得自血浆的αAT在同样范围内，如下表所示：
实施例13.9的表：样品1-3的血浆半衰期
| 样品号 | 小鼠的血浆半衰期(h) |
| 1 | 1.2 |
| 2 | 3.6 |
| 3 | 3.2 |
实施例14通过还原氨化反应合成HES-IFNα
所用的IFNα为重组人干扰素α-2b，由重组DNA技术使用大肠埃希氏菌(E.coli)人工合成。其由165个氨基酸组成并表现出与天然人干扰素α-2b(hIFN-α2b)同样的氨基酸序列。
实施例14.1氧代HES的合成
如下所述得还原末端被氧化的HES(氧代HES)，由HES使用碱性碘溶液制备，按照DE19628705A1所述，其相应内容(实施例A，第9栏，6至24行)，引入作为参考。
实施例14.2HES衍生物的合成
在两个步骤中，实施例14.1的氧代HES，在其还原末端被氨基修饰，并在第二步反应引入醛基，在其还原末端进行修饰。如实施例14.3所述，所得醛基HES，通过，还原氨化反应制备IFN-α-HES偶联物。
实施例14.2.1由实施例14.1的氧代HES合成氨基HES
将5.12g实施例14.1的氧代HES(MW＝14.5kD，DS＝0.41，Supramol Parenteral Colloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)真空中加热至80℃过夜。氮气保护下溶解在25mL干燥的二甲亚砜(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)，加入5.13ml 1，4-二氨丁烷。40℃下搅拌17h后，将反应混合物加入150ml冰冷的1∶1混和的乙醇和丙酮(v/v)中。4℃离心收集沉淀产物，用40ml冰冷的1∶1混和的乙醇和丙酮(v/v)冲洗，离心收集。粗产品溶解于80ml水中。水中透析4天(蛇皮透析袋，3.5kD截留，Perbio SciencesDeutschland GmbH，Bonn，D)，随后冻干。产率为67％。
实施例14.2.2由实施例14.2.1的氨基HES合成醛基HES
将105mg的4-甲酰苯甲酸和135mg的1-羟基-1H-苯并三唑(均为Aldrich，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)溶解于7ml的N，N-二甲基甲酰胺(peptide synthesis grade，Biosolve，Valkenswaard，ML)并加入135μL的N，N’-二异丙基碳化二亚胺。21℃反应30min后，加入0.7g氨基HES(按照实施例14.2.1描述的方法制备)。在22℃振摇18h，将反应混合物加入42mL冰冷的1∶1混合的丙酮和乙醇(v/v)中。4℃下离心收集沉淀产物，再溶解于5mlN，N-二甲基甲酰胺中，用上述的42ml冰冷的1∶1混合的丙酮和乙醇(v/v)沉淀。离心后，将所收集的沉淀物溶于水，水中透析4天(蛇皮透析袋，3.5kD截留，Perbio Sciences Deutschl和GmbH，Bonn，D)，冻干。产率为95％。
实施例14.2.3由实施例14.1的氧代HES合成氨基HES
将6.02g实施例14.1的氧代HES(MW＝14.7kD，DS＝0.76，Supramol Parenteral Colloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)真空中加热至80℃过夜。氮气保护下溶解在32mL干燥的二甲亚砜(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)，加入6.03ml 1，4-二氨丁烷。40℃下搅拌17h后，将反应混合物加入150ml冰冷的1∶1混和的乙醇和丙酮(v/v)中。4℃离心收集沉淀产物，用40ml冰冷的1∶1混和的乙醇和丙酮(v/v)沉淀，离心收集。粗产品溶解于80ml水中。水中透析4天(蛇皮透析袋，3.5kD截留，Perbio SciencesDeutschl和GmbH，Bonn，D)，随后冻干。产率为52％。
实施例14.2.4由实施例14.2.3的氨基HES合成醛基HES
将150mg的4-甲酰苯甲酸和230mg的1-羟基-1H-苯并三唑(均为Aldrich，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)溶解于10ml的N，N-二甲基甲酰胺(peptide synthesis grade，Biosolve，Valkenswaard，ML)并加入240μL的N，N’-二异丙基碳化二亚胺。21℃反应30min后，加入1g氨基HES(按照实施例14.2.3描述的方法制备)。在22℃振摇19h，将反应混合物加入84mL冰冷的2-丙醇中。4℃下离心收集沉淀产物，再溶解于50ml水，水中透析2天(蛇皮透析袋，3.5kD截留，Perbio Sciences Deutschl和GmbH，Bonn，D)，冻干。产率为83％。
实施例14.2.5由实施例14.1的氧代HES合成为氨基HES
将5g实施例14.1的氧代HES(MW＝28kD，DS＝0.41，SupramolParenteral Colloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)真空中加热至80℃过夜。氮气保护下溶解在28mL干燥的二甲亚砜(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)，加入1.67ml 1，4-二氨丁烷。40℃下搅拌17h后，将反应混合物加入175ml冰冷的1∶1混和的乙醇和丙酮(v/v)中。4℃离心收集沉淀产物，用40ml冰冷的1∶1混和的乙醇和丙酮(v/v)沉淀，离心收集。粗产品溶解于40ml水中。水中透析2天(蛇皮透析袋，3.5kD截留，Perbio SciencesDeutschl和GmbH，Bonn，D)，随后冻干。产率未测。
实施例14.2.6由实施例14.2.5的氨基HES合成醛基HES
将130mg的4-甲酰苯甲酸和153mg的1-羟基-1H-苯并三唑(均为Aldrich，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkrchen，D)溶解于36ml的N，N-二甲基甲酰胺(peptide synthesis grade，Biosolve，Valkenswaard，ML)并加入110μL的N，N’-二异丙基碳化二亚胺。21℃反应30min后，加入2.61g氨基HES(按照实施例14.2.5描述的方法制备)。在22℃振摇22.5h，将反应混合物加入160mL冰冷的1∶1混合的丙酮和乙醇(v/v)中。4℃下离心收集沉淀产物，用冰冷的1∶1混合的丙酮和乙醇(v/v)冲洗。离心后，将所收集的沉淀物溶于30ml水，水中透析1天(蛇皮透析袋，3.5kD截留，Perbio SciencesDeutschl和GmbH，Bonn，D)，冻干。产率为81％。
实施例14.2.7由实施例14.1的氧代HES合成氨基HES
将5g实施例14.1的氧代HES(MW＝30.8kD，DS＝0.76，Supramol Parenteral Colloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)真空中加热至80℃过夜。氮气保护下溶解在28mL干燥的二甲亚砜(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)，加入1.67ml 1，4-二氨丁烷。40℃下搅拌17h后，将反应混合物加入175ml冰冷的1∶1混和的乙醇和丙酮(v/v)中。4℃离心收集沉淀产物。粗产品溶解于40ml水中。水中透析2天(蛇皮透析袋，3.5kD截留，Perbio SciencesDeutschl和GmbH，Bonn，D)，随后冻干产率未测。
实施例14.2.8由实施例14.2.7的氨基HES合成醛基HES
将122mg的4-甲酰苯甲酸和144mg的1-羟基-1H-苯并三唑(均为Aldrich，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)溶解于34ml的N，N-二甲基甲酰胺(peptide synthesis grade，Biosolve，Valkenswaard，ML)并加入103μL的N，N’-二异丙基碳化二亚胺。21℃反应30min后，加入2.46g氨基HES(按照实施例14.2.7描述的方法制备)。在22℃振摇22.5h，将反应混合物加入160mL冰冷的1∶1混合的丙酮和乙醇(v/v)中。4℃下离心收集沉淀产物，用冰冷的1∶1混合的丙酮和乙醇(v/v)冲洗。离心后，将所收集的沉淀物溶于30ml水，水中透析4天(蛇皮透析袋，3.5kD截留，Perbio SciencesDeutschl和GmbH，Bonn，D)，冻干。产率为87％。
实施例14.2.9由实施例14.1的氧代HES合成氨基HES
将10g氧代HES(MW＝42.1kD，DS＝0.41，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)真空中加热至80℃两天。氮气保护下溶解在53mL干燥的二甲亚砜(Fluka，Sigma-AldrichChemie GmbH，Taufkirchen，D)，加入2.01ml 1，4-二氨丁烷。40℃下搅拌17h后，将反应混合物加入350ml冰冷的2-丙醇(Carl RothGmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)中。4℃离心收集沉淀产物，用80ml冰冷的2-丙醇冲洗，离心收集。粗产品溶解于80ml水中，水中透析2天(蛇皮透析袋，3.5kD截留，Perbio Sciences Deutschl和GmbH，Bonn，D)，随后冻干。产率76％。
实施例14.2.10由实施例14.2.9的氨基HES合成醛基HES
将900mg的4-甲酰苯甲酸和1053mg的1-羟基-1H-苯并三唑(均为Aldrich，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)溶解于30ml的N，N-二甲基甲酰胺(peptide synthesis grade，Biosolve，Valkenswaard，ML)并加入930μL的N，N’-二异丙基碳化二亚胺。21℃反应30min后，加入3g氨基HES(按照实施例14.2.9描述的方法制备，并溶解于20mlN，N-二甲基甲酰胺)。在22℃振摇22.5h，将反应混合物加入210mL冰冷的1∶1混合的丙酮和乙醇(v/v)中。4℃下离心收集沉淀产物，用冰冷的1∶1混合的丙酮和乙醇(v/v)冲洗。离心后，将所收集的沉淀物溶于30ml水，水中透析2天(蛇皮透析袋，3.5kD截留，Perbio Sciences Deutschl和GmbH，Bonn，D)，冻干。产率为97％。
实施例14.2.11由实施例14.1的氧代HES合成为氨基HES
将6.09g氧代HES(MW＝56.8kD，DS＝0.76，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)真空中加热至80℃过夜。氮气保护下溶解在32mL干燥的二甲亚砜(Fluka，Sigma-AldrichChemie GmbH，Taufkirchen，D)，加入1.22ml 1，4-二氨丁烷。40℃下搅拌17h后，将反应混合物加入150ml冰冷的1∶1混和的乙醇和丙酮(v/v)中。4℃离心收集沉淀产物，用40ml冰冷的1∶1混合的丙酮和乙醇(v/v)沉淀冲洗，离心收集。粗产品溶解于80ml水中。水中透析4天(蛇皮透析袋，3.5kD截留，Perbio Sciences Deutschl和GmbH，Bonn，D)，随后冻干。产率82％。
实施例14.2.12由实施例14.2.11的氨基HES合成醛基HES
将125mg的4-甲酰苯甲酸和174mg的1-羟基-1H-苯并三唑(均为Aldrich，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)溶解于38ml的N，N-二甲基甲酰胺(peptide synthesis grade，Biosolve，Valkenswaard，ML)并加入155μL的N，N’-二异丙基碳化二亚胺。21℃反应30min后，加入3.8g氨基HES(按照实施例14.2.11描述的方法制备)。在22℃振摇19h，将反应混合物加入160mL冰冷的1∶1混合的丙酮和乙醇(v/v)中。4℃下离心收集沉淀产物，重新溶解于20mlN，N-二甲基甲酰胺中，用上述的80ml冰冷的1∶1混合的丙酮和乙醇(v/v)沉淀。离心后，将所收集的沉淀物溶于50ml水，水中透析2天(蛇皮透析袋，3.5kD截留，Perbio Sciences Deutschl和GmbH，Bonn，D)，冻干。产率为77％。
实施例14.2.13由实施例14.1的氧代HES合成氨基HES
将10g氧代HES(MW＝56.8kD，DS＝0.76，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)真空中加热至80℃两天。氮气保护下溶解在53mL干燥的二甲亚砜(Fluka，Sigma-AldrichChemie GmbH，Taufkirchen，D)，加入2ml 1，4-二氨丁烷。40℃下搅拌17h后，将反应混合物加入350ml冰冷的2-丙醇(Carl RothGmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)中。4℃离心收集沉淀产物，用80ml冰冷的2-丙醇冲洗，离心收集。粗产品溶解于80ml水中，水中透析2天(蛇皮透析袋，3.5kD截留，Perbio Sciences Deutschl和GmbH，Bonn，D)，随后冻干。产率85％。
实施例14.2.14由实施例14.2.13的氨基HES合成醛基HES
将153mg的4-甲酰苯甲酸和241mg的1-羟基-1H-苯并三唑(均为Aldrich，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)溶解于51ml的N，N-二甲基甲酰胺(peptide synthesis grade，Biosolve，Valkenswaard，ML)并加入170μL的N，N’-二异丙基碳化二亚胺。21℃反应30min后，加入5.1g氨基HES(按照实施例14.2.13描述的方法制备)。在22℃振摇16h，将反应混合物加入360mL冰冷的1∶1混合的丙酮和乙醇(v/v)中。4℃下离心收集沉淀产物，重溶解于50ml水，用冰冷的上述1∶1混合的丙酮和乙醇(v/v)沉淀。离心后，将所收集的沉淀物溶于50ml水，水中透析2天(蛇皮透析袋，3.5kD截留，Perbio Sciences Deutschl和GmbH，Bonn，D)，冻干。独立产率为87％。
实施例14.2.15由实施例14.1的氧代HES合成氨基HES
将5g氧代HES(MW＝29.3kD，DS＝0.86，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)真空中加热至80℃过夜。氮气保护下溶解在20mL干燥的二甲亚砜(Fluka，Sigma-AldrichChemie GmbH，Taufkirchen，D)，加入1.67ml 1，4-二氨丁烷(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)。40℃下搅拌30.5h后，将反应混合物加入175ml冰冷的1∶1(v/v)混和的丙酮(Carl RothGmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)和乙醇(Sonnenberg，DAB，Braunschweig，D)中。4℃，离心120min收集沉淀产物，溶解于40ml水中，水中透析2天(蛇皮透析袋，10kD截留，Perbio Sciences Deutschl和GmbH，Bonn，D)，随后冻干。产率87％。
实施例14.2.16由实施例14.2.15的氨基HES合成醛基HES
将150mg的4-甲酰苯甲酸和230mg的1-羟基-1H-苯并三唑(均为Aldrich，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)溶解于10ml的N，N-二甲基甲酰胺(peptide synthesis grade，Biosolve，Valkenswaard，ML)并加入166μL的N，N’-二异丙基碳化二亚胺。21℃反应30min后，加入3.02g氨基HES(按照实施例14.2.15描述的方法制备)的20ml DFM溶液。在22℃振摇16h，将反应混合物加入215mL冰冷的1∶1(v/v)混和的丙酮(Carl Roth GmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)和乙醇(Sonnenberg，DAB，Braunschweig，D)中。4℃下离心收集沉淀产物，重新溶解于20ml水中，用上述的丙酮/乙醇溶液沉淀。离心后，将所收集的沉淀物溶于30ml水，水中透析2.5天(蛇皮透析袋，10kD截留，Perbio Sciences Deutschl和GmbH，Bonn，D)，冻干。产率为87％。
实施例14.2.17由实施例14.1的氧代HES合成为氨基HES
将5g氧代HES(MW＝97.9kD，DS＝0.76，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)真空中加热至80℃过夜。氮气保护下溶解在20mL干燥的二甲亚砜(Fluka，Sigma-AldrichChemie GmbH，Taufkirchen，D)，加入0.5ml 1，4-二氨丁烷(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)。40℃下搅拌30.5h后，将反应混合物加入175ml冰冷的1∶1(v/v)混和的丙酮(Carl RothGmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)和乙醇(Sonnenberg，DAB，Braunschweig，D)中。4℃，离心120min收集沉淀产物，溶解于40ml水中，水中透析2天(蛇皮透析袋，10kD截留，Perbio Sciences Deutschl和GmbH，Bonn，D)，随后冻干。产率90％。
实施例14.2.18由实施例14.2.17的氨基HES合成醛基HES
将73mg的4-甲酰苯甲酸和112mg的1-羟基-1H-苯并三唑(均为Aldrich，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)溶解于10ml的N，N-二甲基甲酰胺(peptide synthesis grade，Biosolve，Valkenswaard，ML)并加入81.3μL的N，N’-二异丙基碳化二亚胺。21℃反应30min后，加入3.09g氨基HES(按照实施例14.2.17描述的方法制备)的20ml DFM溶液。在22℃振摇16h，将反应混合物加入215mL冰冷的1∶1(v/v)混和的丙酮(Carl Roth GmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)和乙醇(Sonnenberg，DAB，Braunschweig，D)中。4℃下离心收集沉淀产物，重新溶解于20ml水中，用上述的丙酮/乙醇溶液沉淀。离心后，将所收集的沉淀物溶于30ml水，水中透析2.5天(蛇皮透析袋，10kD截留，Perbio Sciences Deutschl和GmbH，Bonn，D)，冻干。产率为96％。
实施例14.3通过还原氨化反应合成IFNα偶联物
实施例14.3.120μg等级的IFNα偶联
向溶解于0.375ml的25mM磷酸钠缓冲溶液pH7.5，含150mMNaCl和0.3mM EDTA的0.675mg IFNα溶液，加入4ml反应缓冲液(0.1M醋酸钠缓冲溶液pH5.0)。在Vivaspin6浓缩器(Viva Science，5kD MWCO，Hannover，Germany)中，以3939xg将溶液离心30min。将残留溶液用反应缓冲液稀释至6ml后用于冲洗步骤，重复两次。IFNα溶液的最终体积极为0.236ml，与之相对应，IFNα的最终浓度为2.86mg/ml。蛋白质浓度未进行实验核实。
向冷却至0℃得7μl的上述IFNα溶液中，加入10μl(50当量)的相应醛基HES(见下表)溶液和11.3μl的60mM氰化硼氢化钠，均在同一缓冲液中(醋酸钠，pH5.0)并冷却至0℃。混合物在0℃反应17h。反应混合物用凝胶电泳分析。使用以下浓度的醛基HES溶液：
实施例14.3.1的表
| 条目 | HES衍生物 | 浓度(mg/ml) |
| A | 醛基HES(实施例14.2.2) | 52 |
| B | 醛基HES(实施例14.2.4) | 52 |
| C | 醛基HES(实施例14.2.6) | 156 |
| D | 醛基HES(实施例14.2.8) | 156 |
| E | 醛基HES(实施例14.2.10) | 260 |
| F | 醛基HES(A)(实施例14.2.12) | 260 |
| G | 无HES衍生物，含NaCNBH3 | - |
| I | 无HES衍生物，且无NaCNBH3 | - |
| J | 未氧化HES(Mw7.6kD，DS＝0.41)，含NaCNBH3 | 52 |
| K | 未氧化HES(Mw7.6kD，DS＝0.41)，无NaCNBH3 | 52 |
偶联物的SDS-PAGE分析见附图29。
实施例14.3.2 3mg等级的IFNα偶联
向溶解于25ml的25mM磷酸钠缓冲溶液pH7.5，含150mM NaCl和0.3mM EDTA的20mg IFNα溶液，加入8ml反应缓冲液(0.1M醋酸钠缓冲溶液pH5.0)，在Vivaspin 15R浓缩器(Viva Science，5kDMWCO，Hannover，Germany)中，以3939xg将溶液离心99min。将残留溶液用反应缓冲液稀释至18ml后用于冲洗步骤，重复两次。如所述方法离心。IFNα溶液用反应缓冲液稀释至6.66ml，生成最终浓度为3mg/ml的IFNα。蛋白质浓度未进行实验核实。
向冷却至0℃的1ml的上述制备的IFNα溶液，加入1ml(75当量)的醛基HES溶液和1ml的60mM氰化硼氢化钠，均在同一缓冲液中(醋酸钠，pH5.0)并冷却至0℃。混合物在0℃反应22h。反应混合物用凝胶电泳分析后纯化。条目G所述的反应，仅使用0.666μl的相应溶液。使用以下浓度的醛基HES溶液：
实施例14.3.2的表
| 条目 | HES衍生物 | 浓度(mg/ml) |
| A | 醛基HES(实施例14.2.2) | 117 |
| B | 醛基HES(实施例14.2.4) | 117 |
| C | 醛基HES(实施例14.2.6) | 350 |
| D | 醛基HES(实施例14.2.8) | 350 |
| E | 醛基HES(实施例14.2.10) | 584 |
| F | 醛基HES(A)(实施例14.2.12) | 584 |
| G | 未氧化HES(Mw7.6kD，DS＝0.41) | 117 |
偶联物的SDS-PAGE分析见附图30。
实施例14.3.3 3mg等级的IFNα偶联
14.3.3.1按照实施例14.2.16制备的醛基HES与IFNα通过还原氨化生成偶联物
向溶解于25mM磷酸钠缓冲溶液pH7.5，含150mM NaCl和0.3mM EDTA的10mg IFNα溶液，加入8ml反应缓冲液(0.1M醋酸钠缓冲溶液pH5.0)，在Vivaspin 15R浓缩器(Viva Science，5kDMWCO，Hannover，Germany)中，以3939xg将溶液离心30min。将残留溶液用反应缓冲液稀释至18ml后用于冲洗步骤，重复两次。如所述方法离心。IFNα溶液用反应缓冲液稀释至3.33ml，生成最终浓度为3mg/ml的IFNα。蛋白质浓度未进行实验核实。
向冷却至0℃的1ml的上述制备的IFNα溶液，加入1ml按照实施例14.2.16制备的(75当量，352mg/ml)的醛基HES溶液和1ml的60mM氰化硼氢化钠，均在同一缓冲液中(醋酸钠，pH5.0)并冷却至0℃。混合物在0℃反应22h。反应混合物用凝胶电泳分析后纯化。在凝胶电泳时使用XCell Sure Lock Mini Cell(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)和ConsortE143供电系统(CONSORTnv，Turnhout，B)。按照生产商建议，在还原条件下，使用12％Bis-Tris凝胶与MOPSSDS跑板缓冲液(均为Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。
14.3.3.2按照实施例14.3.18制备的醛基HES与IFNα通过还原氨化生成偶联物
向冷却至0℃的1ml 14.3.3.1制备的IFNα溶液，加入1ml按照实施例14.3.18制备的(75当量，369mg/ml)的醛基HES溶液和1.5ml的60mM氰化硼氢化钠，均在同一缓冲液中(醋酸钠，pH5.0)并冷却至0℃。混合物在0℃反应22h。反应混合物用凝胶电泳分析后纯化。在凝胶电泳时使用XCell Sure Lock Mini Cell(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)和Consort E143供电系统(CONSORTnv，Turnhout，B)。按照厂商建议，在还原条件下，使用12％Bis-Tris凝胶与MOPSSDS跑板缓冲液(均为Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。
14.3.3.3对照反应：HES10/.04(Mw7.6kD，DS＝0.41)与IFNα通过还原氨化生成偶联物
向冷却至0℃的1ml的14.3.3.1制备的IFNα溶液，加入1mlHES10/.04(75当量，117mg/ml)溶液和1ml的60mM氰化硼氢化钠，均在同一缓冲液中并冷却至0℃。混合物在0℃反应22h。反应混合物用凝胶电泳分析后纯化。在凝胶电泳时使用XCell Sure Lock Mini Cell(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)和ConsortE143供电系统(CONSORTnv，Turnhout，B)。按照厂商建议，在还原条件下，使用12％Bis-Tris凝胶与MOPS SDS跑板缓冲液(均为InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。
偶联物的SDS-PAGE分析显示于附图31。
实施例14.3.4 16mg等级的IFNα偶联
按照实施例14.3.2的方法将20mg IFNα缓冲溶液进行交换。最终IFNα溶液用反应缓冲液稀释至6.37ml，生成最终浓度为3.14mg/ml的IFNα。100μl该溶液用900μl反应缓冲液稀释，在279nm用分光光度计检测，蛋白质浓度为3.01mg/ml，基于18000的摩尔消光系数。与用于蛋白质浓度检测的原料结合后，最终体积为7.0ml，其中蛋白质浓度为2.74mg/ml。
向冷却至0℃的上述方法制备的5.91ml IFNα溶液(16.2mg)，加入按照实施例14.2.14制备的(75当量)的3.152g醛基HES在5ml反应缓冲液中的溶液和6ml的60mM氰化硼氢化钠，均在同一缓冲液中(醋酸钠，pH5.0)并冷却至0℃。混合物在0℃反应22h(见附图32，道A)。
作为对照实验，1.09ml预冷的IFNα溶液(3mg)与1ml含122mg未氧化HES(Mw7.6kD，DS＝0.41)的反应缓冲溶液和1ml的60mM氰化硼氢化钠混合，均在同一缓冲液中(醋酸钠，pH5.0)并冷却至0℃(见附图32，道B)。
偶联物的SDS-PAGE分析显示于附图32。
实施例14.4IFNαHES偶联物的纯化
14.4.1纯化由还原氨化蛋白质和活化HES衍生物制备的HESIFNα(由HES衍生物中分离修饰和未修饰的蛋白质)
所有样品的纯化，使用AKTA探测器10仪器，在室温下进行。含有3ml Q琼脂胶快速流动相的柱子用10CV缓冲液A(20mM Tris/HCl，pH 8.0)平衡。样品用缓冲液A1∶10稀释，用进样泵以1ml/min的流速进样。然后用10ml缓冲液A冲洗进样泵。柱子进一步用6CV缓冲液A以流速1.0ml/min冲洗。洗脱步骤优选使用线性梯度为0-100％的缓冲液B(含0.3M NaCI的20mM Tris/HCl，pH 8.0)2CV进行，以0.8ml/min流速的0.5CV缓冲液B等压运行。柱子用流速为0.8ml/min的2CV缓冲液C(含1.5M NaCI的20mM Tris/HCl，pH8.0)，接着用0.5CV的缓冲液B活化，用流速为1.0ml/min的6CV缓冲液A进行重新平衡，以用于下一轮使用。
14.4.2材料和方法
仪器：AKTA探测10(Amersham Pharmacia Biotech)，与：
泵P-903
混合器M-925，与0.6ml槽
监控器UV-900，带10mm流动池
监控器pH/C-900
分段收集器Frac-900
泵P-950(进样泵)
软件Unicorn版本3.21
柱：Amersham Bioscience C 10/10；
柱材料：Q-快速流动性琼脂胶，Code no.17-0510-01，Lot No.OD06453
柱体积：3ml
洗脱液A：20mM Tris/HCl，pH 8，0 Lot-Nr.PL0746
洗脱液B：含0.3M NaCI的20mMTris/HCl，pH 8.0，Lot-Nr.PL0747
洗脱液C：含1.5M NaCI的20mMTris/HCl，pH 8.0，Lot-Nr.PL0748
方法
| 体积 | 步骤 | 缓冲液 | 流速 |
| 1CV | 平衡 | 100％缓冲液A | 1.0ml/min |
| 5-28ml | 上样 | 缓冲液A中的样品1∶10 | 1.0ml/min |
| 10ml | 冲洗进样泵 | 100％缓冲液A | 1.0ml/min |
| 5CV | 洗出未结合样品 | 100％缓冲液A | 1.0ml/min |
| 开始分级分离 | 100％缓冲液A | 1.0ml/min | |
| 6CV | 洗脱，线性梯度 | 0-100％缓冲液B | 0.8ml/min |
| 2CV | 洗脱，等动力 | 100％缓冲液B | 0.8ml/min |
| 2CV | 活化 | 100％缓冲液C | 0.8ml/min |
| 0.5CV | 活化 | 100％缓冲液B | 0.8ml/min |
| 停止分级分离 | 100％缓冲液B | 0.8ml/min | |
| 5CV | 重新平衡 | 100％缓冲液A | 1.0ml/min |
检测：280nm，206nm，220nm
PH
导电性
分级：1ml级分
14.4.3结果
14.4.3.1实施例14的样品
样品组分：1mg EP2001(rhIFN-a2b)的25mM磷酸钠，0.13MNaCl和0.3mM EDTA，pH 7.5±0.2
起始体积：0.5ml，缓冲液A1∶10稀释＝5ml
流动-通过/冲洗：9.3ml
运行日期：2004-09-29
运行no.：QS24D39(见实施例14.4.4.1的表格
14.4.3.2实施例14.3.2的样品(条目A)
样品组分：2.5mg EP2001+97.5mg醛基HES10/0.4(NZA256)的0.1M醋酸钠，20mM氰基硼氢酸钠，pH5.0
起始体积：2.5ml，缓冲液A1∶10稀释＝25ml
流动-通过/冲洗：44ml
运行日期：2004-09-29
运行no.：QS25D56(见实施例14.4.4.1的表格)
14.4.3.3实施例14.3.2的样品(条目B)
样品组分：2.5mg EP2001+97.5mg醛基HES10/0.7(NZA235A)的0.1M醋酸钠，20mM氰基硼氢酸钠，pH5.0
起始体积：2.5ml，缓冲液A1∶10稀释＝25ml
流动-通过/冲洗：41ml
运行日期：2004-09-30
运行no.：QS26D57(见实施例14.4.4.1的表格)
14.4.3.4实施例14.3.2的样品(条目C)
样品组分：2.5mg EP2001+292mg醛基HES30/0.4(NZA328)的0.1M醋酸钠，20mM氰基硼氢酸钠，pH5.0
起始体积：2.5ml，缓冲液A1∶10稀释＝25ml
流动-通过/冲洗：42ml
运行日期：2004-09-30
运行no.：QS27D58(见实施例14.4.4.1的表格)
14.4.3.5实施例14.3.2的样品(条目D)
样品组分：2.5mg EP2001+292mg醛基HES30/0.7(NZA329)的0.1M醋酸钠，20mM氰基硼氢酸钠，pH5.0
起始体积：2.5ml，缓冲液A1∶10稀释＝25ml
流动-通过/冲洗：40ml
运行日期：2004-09-30
运行no.：QS28D59(见实施例14.4.4.1的表格)
14.4.3.6实施例14.3.2的样品(条目E)
样品组分：2.5mg EP2001+487mg醛基HES50/0.4(NZA303)的0.1M醋酸钠，20mM氰基硼氢酸钠，pH5.0
起始体积：2.7ml，缓冲液A1∶10稀释＝27ml
流动-通过/冲洗：50ml
运行日期：2004-09-30
运行no.：QS29D60(见实施例14.4.4.1的表格)
14.4.3.7实施例14.3.2的样品(条目F)
样品组分：2.5mg EP2001+487mg醛基HES50/0.7(NZA309)的0.1M醋酸钠，20mM氰基硼氢酸钠，pH5.0
起始体积：2.6ml，缓冲液A1∶10稀释＝26ml
流动-通过/冲洗：50ml
运行日期：2004-09-30
运行no.：QS30D61(见实施例14.4.4.1的表格)
14.4.3.8实施例14.3.2的样品(条目G)
样品组分：1.7mg EP2001+98mg醛基HES10/0.4(SupramolLot.407B)的0.1M醋酸钠，20mM氰基硼氢酸钠，pH5.0
起始体积：2.5ml，缓冲液A1∶10稀释＝25ml
流动-通过/冲洗：42ml
运行日期：2004-10-01
运行no.：QS31D62(见实施例14.4.4.1的表格)
14.4.4结果比较
14.4.4.1IFNα洗脱峰的SDS-PAGE分析
实施例14.4.4.1的表格：在280nm检测Q-琼脂糖色谱分析HES化的IFNα时，峰面积比较
| 运行no. | 计算出的未修饰IFNα使用量 | 洗脱面积(280nm)[mAU×ml] | 洗脱面积(280nm)/mg未修饰蛋白质[mAU×ml×mg-1] | 计算出的总蛋白质产率[mg](在280nm*，HPLC-量化) |
| QS-24D39 | 1.0mg | 961 | 961 | 0.42 |
| QS-25D56 | 2.5mg | 4370 | 1748 | 1.20 |
| QS-26D57 | 2.5mg | 5669 | 2268 | 1.64 |
| QS-27D58 | 2.5mg | 3350 | 1340 | 1.60 |
| QS-28D59 | 2.5mg | 2854 | 1142 | 1.54 |
| QS-29D60 | 2.5mg | 2255 | 902 | 1.52 |
| QS-30D61 | 2.5mg | 9278 | 3711 | 3.44 |
| QS-31D62 | 1.7mg | 1918 | 1128 | 1.40 |
*由RP-HPLC-3得到的量化分析数据
实施例15 IFNα的抗病毒活性生物测定描述
测试步骤描述：干扰素α的抗病毒活性
在细胞培养基中预稀释测试系统后，进行连续两倍稀释。在96孔微量皿，加入洗脱的干扰素-每稀释重复4次-新鲜的胰蛋白酶处理的MDBK细胞(40,000细胞/孔)。反应在37℃进行24小时(每孔总体积：150μl(实施例15.1)或175μl(实施例15.2、15.3、15.4、15.5、16.2、16.3))。
然后，向每孔中加入50μl稀释的VSV存储溶液(阳性对照孔除外)，导致0.1的复合感染值。
每一测定包括以下对照：经过病毒替代干扰素的阳性细胞培养基得到的12孔(
阴性对照)和细胞培养基代替干扰素和病毒得到的12孔(
阳性对照)。
37℃培养42小时后进行测定。
在潜伏期最后，每一孔的细胞培养浮游物用50μl的MTT溶液复位(在细胞培养基中的浓度至少为2mg/ml)。细胞培养三小时。增生细胞生成的甲紫染料在加入100μl异丙醇/HCl溶液(含有40mM HCl的异丙醇)后溶解。随后，溶液的吸光值在微量感光读数器中在570/630nm处测量。
在干扰素和VSV存在下，MDBK细胞生长的增长活性在每一稀释的干扰素中计算如下：
干扰素α的抗病毒活性通过4个独立的测试项目的分别分析而确定。
实施例15.1 Intron_A与NIH标准相比的抗病毒活性
在所有实验中，依照NIH-标准rhIFN-α2a(NIAID，NIH，Bethesda，USA，GxaOl-901-535)定标的Intron_A(IFN-α2b，Schering-Plough)，作为内部试验参考。NIH标准具有特定的9000IU/ml的活性。内部试验参照的Intron_A在上述实施例15中描述的特定活性为8487000IU/ml。
与NIH-标准rhIFN-α2a相比，Intron_A的增生活性显示在附图33中。
实施例15.2模拟反应的IFNαHES与未修饰起始原料相比的抗病毒活性
如实施例14.3.4所述的模拟反应的IFNαHES(实施例14.3.2所述，条目G)作为反应对照。原料的抗病毒活性与未修饰起始原料比较，以研究偶联和纯化步骤对生物活性的影响。模拟反应不影响IFNα的体外生物活性。
模拟反应的IFNα-HES与未修饰起始原料相比的体外活性显示在附图34中。
实施例15.3 IFNα-HES偶联物与Intron_A相比的抗病毒活性
在实施例15所述的分析系统中，偶联物(实施例14.3.2条目A、B、C、D、E，按照实施例14.4纯化)与未修饰的IFNα起始原料、Intron_A和Pegasys(Roche)进行对比测试。计算原料的CPE50浓度。所有的IFNαHES偶联物保留了明显高于Pegasys的抗病毒活性。
IFNα-HES偶联物与未修饰的IFNα起始原料、Intron_A和Pegasys的体外活性对比显示于附图35中。
实施例15.4 IFNαHES偶联物与Intron_A相比的抗病毒活性
在实施例15所述的分析系统中，实施例14.3.4的偶联物按照实施例14.4纯化后与Intron_A进行对比测试。计算原料的CPE50浓度。IFNαHES偶联物与Intron_A相比，保留了高出约25％的抗病毒活性。
IFNαHES偶联物与Intron_A的体外活性对比显示于附图36中。
实施例15.5 IFNαHES偶联物与Intron_A相比的抗病毒活性
在实施例15所述的分析系统中，实施例14.3.3的偶联物按照实施例14.4纯化后与Intron_A和PegIntron_进行对比测试。计算原料的CPE50浓度。IFNαHES偶联物与Intron_A相比，保留了高出约25％的抗病毒活性，与PegIntron的体外活性在同一水平。
IFNαHES偶联物与Intron_A的体外活性对比显示于附图37。
实施例16 IFN-α-HES的体内生物学活性(小鼠中的PK研究)
实施例16.1实施例9所述的分析系统对小鼠血清的影响
稀释的干扰素α在细胞培养基(对照)和小鼠血清(1∶40稀释和1∶80稀释)中制备。按照实施例15所述的方法进行分析。
对照、小鼠血清1∶40稀释以及小鼠血清1∶80稀释的干扰素α的抗病毒活性用两种单独的方法进行测定。结果显示，小鼠血清1∶40稀释和小鼠血清1∶80稀释并不影响干扰素α的抗病毒活性。
实施例12.2小鼠体内研究(I)
储存血清的抗病毒活性已经在抗病毒分析中进行了测试。血清每次采自两只小鼠(雌性BALB/c小鼠，8周龄)，采血是在i.v.-注射30μg/kg(基于蛋白质含量)的IFNα或IFNαHES偶联物后的2h、4h、12h和24h进行。
融合血清样品并通过涡流充分均匀加工处理(并稀释)。在细胞培养基中制备两倍稀释的血清。融合一小瓶Intron_A(稀释)并通过涡流充分均匀加工处理。在细胞培养基中制备两倍稀释的血清。
CPE分析中的EC-50经1∶2稀释，由实施例15中所述的血清剂量反应曲线确定。
原料的半衰期与未修饰的起始原料和Pegasys比较后确定。半衰期由EC-50稀释与注射时间的半对数图表计算得出。
测定以下抗病毒活性：(i)IFN-α-HES(实施例14.3.2，表中的条目B)，(ii)IFN-α-HES(实施例14.3.2，表中的条目D)，(iii)IFN-α-HES(实施例14.3.4)直到24h。如附图38所示，半衰期由(i)(约3h)经(ii)(约5h)至(iii)(约7h)增长。
对未修饰的IFNα，血清抗病毒活性太低而无法计算半衰期。在KR.Reddy et al.Advanced Drug Delivery Reviews 54(2002)571-586中，检测到IFN-α在大白鼠中的血清半衰期为2h。
实施例16.3实施例12.2小鼠体内研究(II)
储存血清的抗病毒活性已经在抗病毒分析中进行了测试。血清每次采自两只小鼠(雌性BALB/c小鼠，8周龄)，采血是在i.v.-注射30μg/kg(基于蛋白质含量)的IFNα或IFNαHES偶联物后的2h、4h、12h和24h进行。
融合血清样品并通过漩涡振荡充分均一化(并稀释)。在细胞培养基中制备两倍稀释的血清。融合一小瓶Intron_A(稀释)并通过漩涡振荡充分均一化。在细胞培养基中制备两倍稀释的血清。
CPE分析中的EC-50经1∶2稀释，由实施例15中所述的血清剂量反应曲线确定。
原料的半衰期与未修饰的起始原料和Pegasys比较后确定。半衰期由EC-50稀释与注射时间的半对数图表计算得出。
测定以下抗病毒活性：(i)PegIntron，(ii)IFN-α-HES(实施例14.3.3.1)和(iii)IFN-α-HES(实施例14.3.3.2)直至24h。如附图39所示，半衰期由(i)(约3.6h)至(ii)和(iii)(约6.5和6.8h)增长。
实施例17 IFNαHES偶联物的体内生物活性(兔中PK研究)
实施例17.1 IFN-α和IFN-α-HES偶联物的放射性标记
用氯胺-T法对用于PK研究的样品进行125I标记。
氯胺-T用碘化物进行反应，形成内卤素物(I-Cl)。内卤素与酪氨素的芳环反应，在其o-位取代。
实施例17.2参考实验：用125I标记氧代H ES50/0.4
在反应条件下第一个实验组中，研究能否检测出痕量的碘，例如，与HES形成复合物的碘、多碘和多碘化合物。在对比中，氧代HES(Mw 42.1kD，DS＝0.41)和IFN-α-HES(实施例14.3.2，表中的条目E)在相同条件下标记，经纯化步骤后，测量样品中的放射性。依照文献记载，当螺旋结构含有至少11个去水葡萄糖单元，支链淀粉能够与碘、多碘和多碘化合物形成复合物。
仅在IFN-α-HES样品中，可检测到放射性。该结果证明，放射性是专有的，通过IFN-α中酪氨酸残基的共价修饰引起，而不是由潜在的物理结合的碘引起，其并未在纯化过程中去除。氧代HES 50/0.4(Mw 42.1kD，DS＝0.41)可认为是阴性对照。由于该氧代HES的高分子量和低取代性质，若有的话，就会出现预期的最长螺旋结构。因此，这种情况下，碘络合具有最高的风险。
实施例17.3用非放射性碘标记干扰素α(“冷碘化作用”)
用与IFN-α-HES偶联物的标记和纯化相同的步骤，用非放射性碘标记干扰素α。在活性分析中，活性仍保留。然而，未进行量化，因为在标记和纯化步骤中浓度发生变化，由于活性原料数量少而无法测定。
实施例17.4IFN-α-HES偶联物的放射性标记
按照实施例17.1的方法用放射性125I标记样品。样品为IFN-α起始原料、IFN-α-HES(实施例14.3.2，表中的条目D)。样品具有特殊活性：38μCi/μg(IFN-α起始原料)，41μCi/μg(IFN-α-HES30/0.7)。
实施例17.5兔体内PK研究
实施例17.5.1实验步骤
实验项目使用稀释法。制备4μCi/ml的溶液。稀释缓冲液为PBS。
四只新西兰白兔HsdIf：NZW.Source Harlan Winkelmann GmbH，D-33178Borchen。性别：雌性；研究开始时的体重：＞2.5kg。所有的动物用放射性标记的测试物质静脉内给药。注射体积为1ml/kg体重，其为4μCi/kg体重的等效剂量。在定义的时间点取出血液样品。再进一步研究中，由动物的耳静脉，在每个取样点取大约600μl血。
常规麻醉(氯胺酮/甲苯噻嗪)后，将一静脉滞留插管置入耳静脉中，用于取血样。停止麻醉，在血液取样点应用前，应用本身和应用开始后的前三个取血样(0.5小时，1小时和2小时)。插管留在动物中用于之后的取样点；直至他们被动物自身弄掉。通过耳静脉的不同区域插管进行血样的进一步测试。
血液采样之后，对血样进行进一步处理。为测试血液中的放射性标记测试项目，按照特殊的溶化规程，处理所收集的血液样品。为此，250μl的血液样品转移至一个新的小瓶中，加入相等体积的SolvableTM。样品在摇摆水浴中，50℃下，反应1小时。反应时间过后，样品冷却至室温，加入100μl的EDTA溶液[100mM]。然后加入300μl的H2O2[30％]，再次振摇样品在摇摆水浴中，50℃下，反应1小时。在下一步骤前收集样品。
在血液收集和溶解的末期，样品转移至20ml闪光小瓶中，加入10ml闪光Ultima Gold鸡尾酒。样品在2-8℃避光存贮，直至在闪烁计数器中测量同位素125I(加入鸡尾酒后大约72小时)。
在数据处理和分析之前，在特殊实验条件下的活性猝灭检测进行测定。回归系数(r2＝0.9970)为线的适应性计量。发现猝灭因子[pCi/cpm]为3.315938。
结果(见附图40)：
IFN-α-HES与起始原料相比，显示出半衰期明显延长。超过24h(约＜1000pCi/ml)后，未修饰原料的曲线变平，且几乎未观察到活性增长。所有样品的已测量放射活性的小标准偏差，证明了本实验的质量。
通过血液样品中的IFNα浓度计算出半衰期。在附图41的评价中，仅考虑4至24h之间的血液样品数据。对于未修饰原料，计算出半衰期为7h。由于IFN-α-HES，可观察到半衰期明显增长(接近33h)。
按照附图42a和b(中止0-12h)的图中显示的不同房室模型，进行数据的统计评价。在一室模型中，明显的，注射后2小时，IFNα的浓度飞快下降。对IFNαHES，半衰期明显延长。统计计算的半衰期，IFNα为0.26h，IFNαHES为7.7h。按照非房室模型，半衰期统计评价结果为，未修饰IFNα为147h(基于24-120h的数据)，IFNαHES为42.7h(基于36-120h的数据)。如上文所述，未修饰IFNα的半衰期被明显地延长了，因为超过24h后曲线变平。
两个样品的半衰期概述于下表，基于所述的计算模型。
实施例17.5.1的表：
根据不同模型计算的IFNα和IFNαHES的半衰期
| IFNα起始原料t1/2 | IFNαHESt1/2 | |
| 非房室模型 | (147.0*) | 42.7** |
| 一房室模型 | 0.26 | 7.7 |
| 半对数表(见图40，4-24h) | 7 | 33 |
*24-130h数据评价
**36-120h数据评价
实施例18.1合成氨基官能化羟乙基淀粉
氧代HES(Mw＝41,000D，DS＝0.760)由Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D制备，依照DE 196 28705A1。
向0.51g氧代HES(19.15μmol)的干燥二甲亚砜(DMSO，DMSO，AcrosOrganics Geel，B)溶液中，氮气保护下滴加200μl(19.9mmol)1，4-二氨丁烷(AcrosOrganics BVBA，Geel，B)，70℃下搅拌24h。将反应混合物加入20ml冷的丙酮(0℃)中。过滤分离生成的沉淀物，用40ml丙酮冲洗，再溶解于20ml水中。水中透析1天(蛇皮透析袋，4-6kD截留，Perbio Sciences Deutschl和GmbH，Bonn，D)，随后冻干。产率为80％(0.41g)氨基HES。
在HiPrep26/10脱盐柱(100mm，Amersham Biosciences)中，使用AKAT检测系统(Amersham Biosciences)，完成产物的纯化。因此，用0.1M NaCl溶液(10ml/min)平衡HiPrep26/10脱盐柱，使用氨基HES的0.1M NaCl(5g/ml，注射体积10ml)。集中后的氨基HES级分加入用水(注射体积10ml)平衡的HiPrep26/10脱盐柱。集中后的HES级分再运用于同样条件的柱中。冻干纯化产物，胺数量通过2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBSA(Pierce)，Instructions TNBSA product number28997)衍生化后测定，用Boc-Lys-OH定标。发现胺数量为34.02nmol/mg(92％)。
实施例18.2合成碘乙酰官能化的羟乙基淀粉
向101.9mg氨基功能化羟乙基淀粉(按照实施例18.1制备的氨基HESμmol)的5ml 0.1M Na2CO3溶液(pH＝8.3)中，加入12.63mg碘乙酰N羟基琥珀酰亚胺酯(44.65μmol，Sigma，Taufkirchen，Germany)。氮气保护，闭光，室温下搅拌混合物15h。向水溶液中加入15ml水，通过HiPrep 26/10脱盐柱(Amersham Biosciences)完成纯化步骤。因此，HiPrep 26/10脱盐柱(100mm)用0.1M NaCl溶液(10ml/min)平衡，然后提供碘乙酰官能化的羟乙基淀粉(注射体积10ml)。集中后的碘乙酰HES级分加入用水平衡的HiPrep 26/10脱盐柱，集中的级分再运用于相同条件的柱。将纯化产物冻干，碘乙酰基含量，通过上文所述的2，4，6-三硝基苯磺酸进行胺量化，间接测定。发现胺含量为1.65nmol/mg，与之相对应的碘乙酰基含量为32.37nmol/mg(95％)。
实施例18.3由实施例18.1的氨基HES合成马来酰亚胺基HES
计算氨基含量为～29nmolmg-1的25mg氨基HES(按照实施例18.1制备)，溶解于450μl反应缓冲液中(0.1M磷酸钠，150mMNaCl，5.0M EDTA，pH 7.0)。另外，9mgN[a-马来酰亚胺乙酰氧基]琥珀酰亚胺酯(AMAS，Aldrich，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)溶解于200μl干燥DMSO(AcrosOrganics BVBA，Geel，B)中。将两种溶液集中在一起。
将最终溶液在22℃搅拌100min，，并再在40℃搅拌20min。然后将所得溶液稀释至5ml，用AKTA探测系统(Amersham Biosciences)进样于脱盐柱，以去除未反应的AMAS、NHS和DMSO。
因此，HiPrep 26/10脱盐柱(100mm，Amersham Biosciences)用反应缓冲溶液(0.1M磷酸钠，150mMNaCl，5.0M EDTA，pH 7.0)平衡，然后注入马来酰亚胺HES溶液(注射体积5ml)，分级。纯化参数选择如下：
柱：HiPrep26/10脱盐
流速：10ml/min
洗脱液：0.1M磷酸钠缓冲溶液，150mM氯化钠，5mM EDTA，pH＝7.0
样品体积：5.0ml
洗脱级分：2.5ml
平衡：0.5柱体积
洗脱长度：2.0柱体积
集中后的HES级分(7ml)在相同条件下再次注入，以确保最终溶液中不存在AMAS、NHS和DMSO。二次纯化得到10ml的纯马来酰亚胺HES可用于与αAT偶联。
洗脱聚合物随后在相同缓冲溶液中浓缩至最终体积为250μl。
实施例18.4a用DL-二硫苏糖醇(DTT)还原αAT
向αAT溶液(c(α1AT)＝5.0mg的0.5ml0.1M磷酸钠缓冲溶液，150mM氯化钠，pH 7.2，α1AT＝rh α1AT由GTCBiotherapeutics Inc.，Framingham，MA，提供，lot No.080604A)中，加入4ml反应缓冲液(0.1M磷酸钠，150mMNaCl，5.0 M EDTA，pH 7.0)和68.77mgDTT(Sigma Taufkirchen，Germany)。混合物在20℃反应2h，还原蛋白质通过体积排斥色谱(SEC)用AKTA探测系统(Amersham Biosciences)纯化。因此，HiPrep 26/10脱盐柱(100mm，Amersham Biosciences)用0.1M磷酸钠，150mM NaCl，5.0M EDTA，pH＝7.0的溶液平衡，加入还原蛋白质溶液(注射体积4.5ml)，分级。纯化条件的选择如下所列：
柱：HiPrep26/10脱盐
流速：10ml/min
洗脱液：0.1M磷酸钠缓冲溶液，150mM氯化钠，5mM EDTA，pH＝7.0
样品体积：4.5ml
洗脱级分：2.5ml
平衡：0.5柱体积
洗脱长度：2.0柱体积
集中后的蛋白质级分(8ml)在相同条件下再次注入，以确保蛋白质溶液中不存在DTT。二次纯化得到10ml的纯还原α1AT溶液，其大约浓度为0.5mg/ml，用于与实施例18.5所述的马来酰亚胺HES偶联。
实施例18.4b用固定三-(2-羧基乙基)-亚磷酸基-盐酸盐(TCEP)预处理α1AT以及分离含巯基蛋白质
α1AT(GTC Biotherapeutics Inc.，Framiμgham，MA，lot No.080604A)用固定TCEP(Pierce77712，2ml凝胶浆每mg蛋白质)新鲜处理，以还原潜在的二硫键。固定TCEP，按照描述，使用缓冲液pH＝7.0(0.1M磷酸钠，150mMNaCl，5.0M EDTA)制备。按照生产商的指示，进行还原。还原蛋白质与巯活性琼脂糖(AmershamBiosciences71-7106-00；0.15g胶每mg蛋白质)反应，以共价结合含有巯基的蛋白质。未结合的蛋白质用含100m M磷酸钠，150mMNaCl，5.0M EDTA，pH＝7.0的缓冲液冲洗，直至洗脱液中检测无蛋白质。为蛋白质检测，使用BCA-分析(Pierce)。用pH＝7.0(100mM磷酸钠，150mMNaCl，5.0M EDTA)含20mMTCEP的缓冲液，将结合至柱的蛋白质释放洗脱。
实施例18.5由实施例18.3的马来酰亚胺HES经半胱氨酸偶联制备HES-α1AT偶联物
725mmol马来酰亚胺HES(按照实施例18.3制备)溶解于250μl的反应缓冲液(0.1M磷酸钠，150mMNaCl，pH＝7.0)，加至同样缓冲液的1540μl的0.5mgml-1α1AT溶液中。蛋白质按照实施例18.4a的方法与DTT预反应。反应在22℃搅拌18h，在液氮中冷冻以停止反应，-80℃贮存。反应混合物用凝胶电泳分析(见附图43)。
实施例18.6由实施例18.2的碘乙酰胺基HES经半胱氨酸偶联制备HES-α1AT偶联物
96mg的碘乙酰胺HES(按照实施例18.2制备)，其碘含量为～16nmolmg-1，溶解于1.0ml的反应缓冲液(1.0M碳酸钠，2.0M EDTA，pH＝8.3)和2.5ml蒸馏水。500μl的3mgml-1的α1AT(按照实施例18.4b的方法预处理)溶液的0.1M磷酸钠缓冲液，150mM NaCl(pH7.0)，与聚合物溶液混合，最终，加入500μl含有7.2mg的TCEP(Aldrich，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)的溶液，产生还原剂的最终浓度为5mM。反应可在避光下进行，室温搅拌18h。之后，在液氮中冷冻以停止反应，-80℃贮存。
实施例18.7纯化由实施例18.2的碘乙酰胺HES经半胱氨酸偶联制备HES-α1AT偶联物
样品制备：缓冲交换在HiPrep 26/10脱盐柱(Amershambiosciences)进行，用AKTA检测色谱系统，使用20mM磷酸钠，20mM氯化钠，pH8作为洗脱液。
用粗产物混合物进行缓冲交换(按照实施例18.6制备，约4ml)，使用一下参数：
柱：HiPrep26/10脱盐
流速：10ml/min
洗脱液：20mM磷酸钠缓冲溶液，20mM氯化钠，pH8
样品体积：10ml
洗脱级分：2.5ml
平衡：5柱体积
洗脱长度：2柱体积
集中6至16ml的级分。过量的HES衍生物通过IEC除去，使用以下参数：
柱：HiTrap Q HP 1ml
流速：1ml/min
结合缓冲液(BB)：20mM磷酸钠，20mM氯化钠，pH8
洗脱缓冲液(EB)：20mM磷酸钠，1mM氯化钠，pH8
空循环：12ml
流动槽级分：2ml
洗脱级分：1ml
起始浓度EB：0％
平衡：5柱体积
冲洗未结合样品：15ml
目标浓度EB：15％
梯度长度：50ml
收集43至73ml的级分，通过超速离心浓缩至最终体积为10ml。按照上述方法脱盐后(样品体积10ml，收集最初14ml的级分)，用于从未结合蛋白质中分离偶联物的第二IEC，用以下参数进行：
柱：HiTrap Q HP 1ml
流速：1ml/min
结合缓冲液(BB)：20mM磷酸钠，20mM氯化钠，pH8
洗脱缓冲液(EB)：20mM磷酸钠，1mM氯化钠，pH8
空循环：15ml
流动槽级分：2ml
洗脱级分：1ml
起始浓度EB：0％
平衡：1柱体积
冲洗未结合样品：2ml
梯度：5-15％
梯度长度：100ml
收集以下级分，用SDS-Page分析(见附图44)：
A：26-32ml
B：37-45ml
C：55-65m
Claims (86)
1、一种制备含有蛋白质和聚合物或其衍生物的偶联物的方法，其中聚合物为羟烷基淀粉(HAS)，该方法包括使聚合物或其衍生物的至少一个官能团A与蛋白质的至少一个官能团Z反应从而形成共价键，其中Z选自氨基、巯基、醛基和酮基，并且
-其中，当Z为醛基或酮基时，A包含一个氨基以与Z形成所述的键，蛋白质选自IFN-β、GM-CSF、APC、tPA、A1AT、ATIII、因子VII、因子VIII和因子IX；
-其中，当Z为氨基时，A选自活性羧基和醛基、酮基或半缩醛基，且其中蛋白质选自IFN-α、IFN-β、GM-CSF、APC、tPA、A1AT、ATIII、因子VII、因子VIII和因子IX；
——其中，当A为醛基、酮基或半缩醛基时，该方法进一步包括在聚合物中引入A以获得聚合物衍生物
———通过聚合物与一个至少双官能化合物反应，其一个官能团与聚合物反应，其至少另一个官能团为醛基、酮基或半缩醛基，或是进一步化学修饰后形成醛基、酮基或半缩醛基的官能团；或
———通过氧化聚合物获得至少一个，尤其是至少两个醛基；或
——其中，当A为活性羧基时，本方法进一步包括在聚合物中引入A以获得聚合物衍生物
———通过选择性氧化聚合物的还原末端并活化所得的羧基，或
———通过聚合物的非-氧化还原末端与碳酸二酯反应，或
-其中，当Z为巯基时，蛋白质选自IFN-α、IFN-β、、tPA、A1AT、APC、因子VII和因子IX，并且A含有
——马来酰亚胺基或
——卤代乙酰基
与Z形成所述的键。
2、权利要求1所述的方法，其中羟烷基淀粉为羟乙基淀粉。
3、权利要求2所述的方法，其中羟乙基淀粉的分子量为2至200kD，优选4至130kD，更优选4至70kD。
4、权利要求1-3任意一项所述的方法，其中Z为醛基或酮基，且蛋白质选自IFN-β、GM-CSF、APC、tPA、A1AT、ATIII、因子VII、因子VIII和因子IX。
5、权利要求4所述的方法，其中醛基或酮基位于蛋白质的碳水化合物侧链和/或蛋白质的N-末端上。
6、权利要求5所述的方法，进一步包括氧化蛋白质的碳水化合物侧链和/或氧化蛋白质的N端，以形成醛基或酮基。
7、权利要求6所述的方法，其中氧化反应通过酶促反应或使用高碘酸盐实现，如有必要，在去除末端唾液酸之后进行。
8、权利要求4-7任意一项所述的方法，它还包括，聚合物的非-氧化还原末端与一个至少二官能团化合物反应，所述化合物含有能够与聚合物非氧化还原末端反应的官能团和基团A，然后包含A的聚合物衍生物同包含Z的蛋白质反应。
9、权利要求4-8任意一项所述的方法，其中A为氨氧基或肼基。
10、权利要求8或9所述的方法，其中至少二官能团化合物为同型双官能化合物。
11、权利要求10所述的方法，其中同型双官能化合物含有两个氨氧基。
12、权利要求11所述的方法，其中同型双官能化合物为O-[2-(氨氧基-乙氧基)-乙基]羟基胺。
13、权利要求8-12中任意一项所述的方法，其中聚合物与至少二官能键化合物的反应在水性介质中进行。
14、权利要求11-13中任意一项所述的方法，其中聚合物与至少二官能键化合物的反应形成肟键和/或氧氨键。
15、权利要求1-3任意一项所述的方法，其中Z为氨基，并且蛋白质选自IFN-α，IFN-β，GM-CSF、APC、tPA、A1AT、ATIII、因子VII、因子VIII和因子IX。
16、权利要求15所述的方法，它进一步包括，聚合物还原末端的选择性氧化，并且氧化的聚合物与N，N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯的氧化还原末端反应，获得含有活性羧基A的聚合物衍生物。
17、权利要求15所述的方法，进一步包括，还原末端未被氧化的聚合物的至少一个羟基与碳酸二酯反应，形成活性羧基A。
18、权利要求17所述的方法，其中碳酸二酯为对称二酯。
19、权利要求17或18所述的方法，其中酯的醇部分选自N-羟基琥珀酰亚胺，N-羟基琥珀酰亚胺磺酸盐，N-羟基苯并三唑，以及硝基-和卤代-苯酚。
20、权利要求19所述的方法，其中卤代苯酚选自硝基苯酚、二硝基苯酚、三氯苯酚、三氟苯酚、五氯苯酚和五氟苯酚。
21、权利要求17至20任意一项所述方法，其中还原末端未被氧化的聚合物的至少一个羟基与碳酸二酯反应形成活性羧基A的反应在无水且质子惰性的极性溶剂中进行。
22、权利要求21中所述的方法，其中溶剂为二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺或其混合物。
23、权利要求15所述的方法，其中A为醛基、酮基或半缩醛基，该方法进一步包括聚合物同至少二官能团化合物中的官能团M反应生成聚合物衍生物，至少二官能团化合物还包含至少另一个官能团Q，官能团Q为A的醛基、酮基或半缩醛基。
24、权利要求23所述的方法，其中M含有氨基。
25、权利要求23所述的方法，其中A为醛基、酮基或半缩醛基，该方法进一步包括聚合物与至少二官能团化合物中的官能团M反应生成聚合物衍生物，至少二官能团化合物还包含至少另一个官能团Q，官能团Q不为醛基、酮基或半缩醛基，该方法进一步包括官能团Q与至少一个适当化合物反应生成含有醛基、酮基或半缩醛基A的聚合物衍生物。
26、权利要求24所述的方法，其中M和Q含有氨基。
27、权利要求25或26所述的方法，其中至少一个适当的化合物含有羧基，以及醛基、酮基或半缩醛基。
28、权利要求27所述的方法，其中至少一个适当的化合物为甲酰苯甲酸或4-(4-甲酰-3，5-二甲氧苯氧基)丁酸。
29、权利要求25或26所述的方法，其中M含有氨基并且Q含有β-羟氨基。
30、权利要求29所述的方法，其中聚合物在其氧化还原末端与至少二官能团化合物的官能团M反应。
31、权利要求29所述的方法，进一步包括氧化β羟氨基以形成醛基。
32、权利要求31所述的方法，其中通过使用高碘酸盐实现氧化反应。
33、权利要求15所述的方法，其中可以使用高碘酸盐使聚合物进行开环氧化反应以获得含有至少一个，优选至少两个醛基A的聚合物衍生物。
34、权利要求23至33任意一项所述的方法，其中聚合物或聚合物衍生物同蛋白质的反应为还原性氨化。
35、权利要求34所述的方法，其中在NaCNBH3的存在下进行还原性氨化。
36、权利要求34或35所述的方法，其中在pH7或更低的条件下进行还原性氨化。
37、权利要求36所述的方法，其pH为6或更低。
38、权利要求34至37任意一项所述的方法，其中还原性氨化在温度为0至25℃条件下进行。
39、权利要求34至38任意一项所述的方法，其中在水性介质中进行还原性氨化。
40、权利要求1至3任意一项所述的方法，其中Z为巯基，并且蛋白质选自IFN-α、IFN-β、tPA、A1AT、APC、因子VII和因子IX。
41、权利要求40所述的方法，其中A含有卤代乙酰基，该方法进一步包括，聚合物的任意氧化还原末端同含有至少两个均含氨基官能团的至少二官能团化合物反应，生成至少一个官能团含有氨基的聚合物衍生物，该方法进一步包括聚合物衍生物同单卤代乙酸和/或活性单卤代乙酸衍生物反应。
42、权利要求41所述的方法，其中卤素为Br或I。
43、权利要求41或42所述的方法，其中至少二官能团化合物为含有2至10个碳原子的二氨基烷烃。
44、权利要求41或42所述的方法，其中至少二官能团化合物为含有1至5个亚烷基单元的二氨基聚乙二醇。
45、权利要求41或44中任意一项所述的方法，其中聚合物在其氧化还原末端同至少二官能团化合物进行反应。
46、权利要求41至45中任意一项所述的方法，其中含卤乙酰基的聚合物衍生物同蛋白质的反应在含有二甲基甲酰胺和水的混合物的溶剂中进行。
47、权利要求40所述的方法，其中A含有马来酰亚胺基，该方法进一步包括聚合物的任意氧化还原末端同含有能够与任意氧化还原末端反应的官能团U的至少二官能团化合物反应，所述至少二官能团化合物进一步含有能够被化学修饰形成马来酰亚胺基的官能团W，该方法进一步包括化学修饰W以形成马来酰亚胺基。
48、权利要求47所述的方法，其中U含有氨基。
49、权利要求47或48所述的方法，其中W含有氨基。
50、权利要求47至49任意一项所述的方法，其中含有W的聚合物衍生物同至少二官能团化合物反应，其中至少二官能团化合物含有能够与W反应的官能团，并且还含有马来酰亚胺基。
51、权利要求50中所述的方法，其中至少二官能团化合物为N-(α-马来酰亚胺乙酸基)琥珀酰亚胺酯。
52、一种通过权利要求1至51任意一项所述方法获得的偶联物。
53、权利要求52所述的偶联物，其中A为活性羧基，并且其中通过聚合物的至少一个羟基与碳酸二酯反应，将A引入还原末端未被氧化的聚合物，并且其中所述偶联物含有一个聚合物分子和至少一个，优选1至10个蛋白质分子经酰胺键连接至聚合物，并且其中蛋白质选自IFN-α、IFN-β、GM-CSF、APC、tPA、A1AT、ATIII、因子VII、因子VIII和因子IX。
54、一种含有蛋白质和聚合物或其衍生物的偶联物，其中聚合物为羟烷基淀粉(HAS)且蛋白质选自IFN-β、GM-CSF、APC、tPA、A1AT、ATIII、因子VII、因子VIII和因子IX，所述偶联物结构如下式所示
和/或
其中，R1，R2，R3独立地为氢或含有2至10个碳原子的羟烷基、羟芳基、羟芳烷基或羟烷芳基，优选氢或羟烷基，更优选氢或羟乙基，且
其中，G选自O或S，优选O，且
其中，L为任选适当的取代、直链、支链和/或环状烃残基，任选的含有至少一个杂原子，优选含有2至60个碳原子的烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂烷芳基的残基。
55、权利要求54所述的偶联物，其中-L-为-(CH2)n-，n＝2、3、4、5、6、7、8、9、10，优选2、3、4、5、6，更优选2、3、4，尤其优选4。
56、一种含有蛋白质和聚合物或其衍生物的偶联物，其中聚合物为羟烷基淀粉(HAS)，且蛋白质选自IFN-β、GM-CSF、APC、tPA、A1AT、ATIII、因子VII、因子VIII和因子IX，所述偶联物结构如下式所示
其中，R1，R2，R3独立地为氢或含有2至10个碳原子的羟烷基、羟芳基、羟芳烷基或羟烷芳基，优选氢或羟烷基，更优选氢或羟乙基，
其中，G选自O或S，优选O。
57、一种含有蛋白质和聚合物或其衍生物的偶联物，其中聚合物为羟烷基淀粉(HAS)，且蛋白质选自IFN-β、GM-CSF、APC、tPA、A1AT、ATIII、因子VII、因子VIII和因子IX，所述偶联物结构如下式所示
和/或
其中，R1，R2，R3独立地为氢或含有2至10个碳原子的羟烷基、羟芳基、羟芳烷基或羟烷芳基，优选氢或羟烷基，更优选氢或羟乙基，且
其中，L为任选适当的取代、直链、支链和/或环状烃残基，任选的含有至少一个杂原子，优选含有2至60个碳原子的烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂烷芳基的残基。
58、权利要求57中所述的偶联物，其中-L-为
-[(CRaRb)mG]n[CRcRd]o-
其中Ra、Rb、Rc、Rd独立地为氢、烷基、芳基，优选氢，
其中，G选自O或S，优选O，且其中
m为1、2、3或4，其中在m个CRaRb基团中，残基Ra、Rb可以相同或不同；
n为0至20，优选0至10，更优选1、2、3、4、5，最优选1或2；
o为0至20，优选0至10，更优选1、2、3、4、5，最优选1或2；其中在o个CRcRd基团中，Rc和Rd残基可以相同或不同；
其中，n和o的整数由上述结构式选出，无过氧部分的结果，例如n和o不能同时为0。
59、权利要求57或58所述的偶联物，其中Ra、Rb、Rc、Rd为氢，m＝2，n＝1，且o＝2。
60、一种含有蛋白质和聚合物或其衍生物的偶联物，其中聚合物为羟烷基淀粉(HAS)，且蛋白质选自IFN-β、GM-CSF、APC、tPA、A1AT、ATIII、因子VII、因子VIII和因子IX，所述偶联物结构如下式所示
其中，R1，R2，R3独立地为氢或含有2至10个碳原子的羟烷基、羟芳基、羟芳烷基或羟烷芳基，优选氢或羟烷基，更优选氢或羟乙基。
61、一种含有蛋白质和聚合物或其衍生物的偶联物，其中聚合物为羟烷基淀粉(HAS)，且蛋白质选自IFN-α、IFN-β、GM-CSF、APC、tPA、A1AT、ATIII、因子VII、因子VIII和因子IX，所述偶联物结构如下式所示
其中，R1，R2，R3独立地为氢或含有2至10个碳原子的羟烷基、羟芳基、羟芳烷基或羟烷芳基，优选氢或羟烷基，更优选氢或羟乙基，且
其中-O-(C＝O)-键通过羧基或活性羧基同HAS分子的羟基反应形成，并且其中HAS”指没有所述羟基的HAS分子。
62、一种偶联物，含有蛋白质和聚合物或其衍生物，其中聚合物为羟烷基淀粉(HAS)，且蛋白质选自IFN-α，IFN-β，GM-CSF、APC、tPA、A1AT、AT III、因子VII、因子VIII和因子IX，所述偶联物结构如下式所示
和/或
其中R1，R2，R3独立地为氢或含有2至10个碳原子的羟烷基、羟芳基、羟芳烷基或羟烷芳基，优选氢或羟烷基，更优选氢或羟乙基，且
其中L为任选适当的取代、直链、支链和/或环状烃残基，任选的含有至少一个杂原子，含有1至60，优选1至40，更优选1至20，更优选1至10，更优选1至6，更优选1至2个碳原子，尤其优选1个碳原子，L尤其为CH2。
63、一种偶联物，含有蛋白质和聚合物或其衍生物，其中聚合物为羟烷基淀粉(HAS)且蛋白质选自IFN-α，IFN-β，GM-CSF、APC、tPA、A1AT、ATIII、因子VII、因子VIII和因子IX，所述偶联物结构如下式所示
其中R1，R2，R3独立地为氢或含有2至10个碳原子的羟烷基、羟芳基、羟芳烷基或羟烷芳基，优选氢或羟烷基，更优选氢或羟乙基，且
其中L1和L2是独立的任选适当的取代、直链、支链和/或环状烃残基，任选的含有至少一个杂原子，含有烷基、芳基、芳烷基、杂芳基和/或杂烷芳基部分，所述残基含有1至60，优选1至40，更优选1至20，更优选1至10个碳原子，且
其中D为键，优选为由连接到L1上的适当官能团F2同连接到L2上的适当官能团F3形成的共价键。
64、权利要求63所述的偶联物，其中L1为-(CH2)n-，n＝2、3、4、5、6、7、8、9、10，优选2、3、4、5、6，更优选2、3、4，尤其优选4。
65、权利要求63或64所述的偶联物，其中L2包括任选适当的取代芳基部分，优选含有6个碳原子的芳基部分，L2尤其优选C6H4。
66、权利要求63至65中任意一项所述的偶联物，其中F2选自下列官能团，包括
-C-C双键或C-C三键或芳族C-C键；
-硫代基或羟基；
-烷基磺酸酰肼，芳基磺酸酰肼；
-1，2-二醇；
-1，2氨基巯；
-叠氮化物；
-1，2氨基醇；
-氨基-NH2，或含有-NH-结构单元，例如氨烷基、氨芳基、氨基烷芳基或烷芳基氨基的氨基衍生物；
-羟氨基-O-NH2，或含有-O-NH-结构单元的羟氨基衍生物，例如羟烷氨基、羟芳胺基、羟芳烷氨基或羟烷芳氨基；
-烷氧基氨基、芳氧基氨基、芳烷氧基氨基或烷芳氧基氨基，均含有-NH-O-结构单元；
-含有羰基的残基，-Q-C(＝G)-M，其中G为O或S，M为，例如，
——-OH或-SH；
——烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、或烷芳氧基；
——烷硫基、芳硫基、芳烷硫基或烷芳硫基；
——烷羰氧基、芳羰氧基、芳烷羰氧基或烷芳羰氧基；
——活化酯，例如羟胺的酯，其具有酰亚胺结构例如N-羟基琥珀酰亚胺，或具有O-N结构单元，其中N为杂环芳烃化合物的一部分，或者，G＝O且不存在Q，例如含有五氟苯基、对硝基苯基或三氯苯基等取代芳基残基的芳氧基化合物；
其中Q不存在，或是NH或一个杂原子例如S或O；
- -NH-NH2或-NH-NH-；
- -NO2；
-腈基；
-羰基例如醛基或酮基；
-羧基；
- -N＝C＝O基或-N＝C＝S基；
-乙烯基卤化物基，例如乙烯基碘化物或乙烯基溴化物基，或三氟磺酸盐；
- -C≡C-H；
- -(C＝NH2Cl)-O烷基；
- -(C＝O)-CH2-Hal基，其中Hal为Cl、Br或I；
- -CH＝CH-SO2-；
-包含-S-S-的二硫基；
并且其中，F3为能够与F2形成化学键的官能团，并优选自上述官能团，F2优选含有-NH-部分，更优选含有氨基，F3优选含有-(C＝G)-部分，更优选含有-(C＝O)-部分，更优选含有-(C＝G)-G-部分，更优选含有-(C＝O)-G-，尤其优选含有-(C＝O)-O，D尤其优选酰胺键。
67、一种偶联物，含有蛋白质和聚合物或其衍生物，其中聚合物为羟烷基淀粉(HAS)且蛋白质选自IFN-α，IFN-β，GM-CSF、APC、tPA、A1AT、ATIII、因子VII、因子VIII和因子IX，所述偶联物结构如下式所示
其中，-CH2-NH-部分中的碳原子衍生自通过开环氧化反应引入聚合物的醛基，且其中氮原子衍生自蛋白质的氨基，其中HAS”为不包括上述反应中所涉及的醛基碳原子的HAS分子。
68、一种偶联物，含有蛋白质和聚合物或其衍生物，其中聚合物为羟烷基淀粉(HAS)，且蛋白质选自IFN-α，IFN-β，tPA、A1AT、因子VII和因子IX，所述偶联物结构如下式所示
其中R1，R2，R3独立地为氢或含有2至10个碳原子的羟烷基、羟芳基、羟芳烷基或羟烷芳基，优选氢或羟烷基，更优选氢或羟乙基，且
其中L为任选适当的取代、直链、支链和/或环状烃残基，任选的含有至少一个杂原子，含有烷基、芳基、芳烷基、杂芳基(heteroalkyl)和/或杂烷芳基部分，所述残基含有2至60，优选2至40，更优选2至20，更优选2至10个碳原子，且
其中硫原子衍生自蛋白质的半胱氨酸残基或二硫基。
69、权利要求68中所述的偶联物，其中-L-为
-[(CRaRb)mG]n[CRcRd]o-
其中Ra、Rb、Rc、Rd独立地为氢、烷基、芳基，优选氢，
其中，G选自O或S，优选O，且其中
m 为1、2、3或4，最优选2，其中在m个CRaRb基团中，残基Ra、Rb可以相同或不同；
n 1至20，优选1至10，最优选1、2、3或4；
o 1至20，优选1至10，更优选1、2、3、4、5，更优选1或2，最优选1，其中在o个CRcRd基团中，残基Rc和Rd可以相同或不同；
或
其中
n 0，且
o 2至20，优选2至10，更优选2、3、4、5、6、7或8，其中在o个CRcRd基团中，残基Rc和Rd可以相同或不同。
70、一种偶联物，含有蛋白质和聚合物或其衍生物，其中聚合物为羟烷基淀粉(HAS)，且蛋白质选自IFN-α，IFN-β，tPA、A1AT、APC、因子VII和因子IX，所述偶联物结构如下式所示
其中R1，R2，R3独立地为氢或含有2至10个碳原子的羟烷基、羟芳基、羟芳烷基或羟烷芳基，优选氢或羟烷基，更优选氢或羟乙基，且
其中L为任选适当的取代、直链、支链和/或环状烃残基，任选的含有至少一个杂原子，含有烷基、芳基、芳烷基、杂芳基(heteroalkyl)和/或杂烷芳基部分，所述残基含有2至60优选2至40，更优选2至20，更优选2至10个碳原子，且
其中硫原子衍生自蛋白质的半胱氨酸残基或二硫基。
71、权利要求70中所述的偶联物，其中-L-为
-[(CRaRb)mG]n[CRcRd]o-
其中Ra、Rb、Rc、Rd独立地为氢、烷基、芳基，优选氢，
其中，G选自O或S，优选O，且其中
m 为1、2、3或4，最优选2，其中在m个CRaRb基团中残基Ra、Rb可以相同或不同；
n 1至20，优选1至10，最优选1、2、3或4；
o 1至20，优选1至10，更优选1、2、3、4、5，更优选1或2，最优选1，其中在o个CRcRd基团中残基Rc和Rd可以相同或不同；
或
其中
n 0，且
o 2至20，优选2至10，更优选2、3、4、5、6、7或8，其中在o个CRcRd基团中，残基Rc和Rd可以相同或不同。
72、权利要求54至71任意一项所述的偶联物，其中羟烷基淀粉为羟乙基淀粉。
73、权利要求72中所述的偶联物，其中羟乙基淀粉的分子量为2至200kD，优选4至130kD，更优选4至70kD。
74、权利要求52至73任意一项所述的偶联物，在用于治疗人类或动物身体的方法中的用途。
75、一种药物组合物，含有治疗有效量的权利要求52至73任意一项所要求保护的偶联物。
76、权利要求75所述的药物组合物，进一步含有至少一种药学上可接受的稀释剂、辅料或载体。
77、如权利要求52至73任意一项所要求保护的HAS-蛋白质偶联物在制备用于治疗下述疾病药物中的用途，其中HAS-蛋白质偶联物优选为HES-蛋白质偶联物，其中蛋白质为IFNα，其用于治疗白血病，例如毛细胞白血病、慢性粒细胞性白血病、多发性骨髓瘤、滤泡性淋巴瘤，癌症，例如类癌瘤、恶性黑素瘤，和肝炎，例如慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎。
78、如权利要求52至73任意一项所要求保护的HAS-蛋白质偶联物的用途，优选HES-蛋白质偶联物，其中蛋白质为IFNβ，用于制备治疗多发性硬化症，优选复发感染型多发性硬化症的药物。
79、如权利要求52至73任意一项所要求保护的HAS-蛋白质偶联物的用途，优选HES-蛋白质偶联物，其中蛋白质为GM-CSF，用于制备药物，其用于骨髓移植或患有急性骨髓性白血病老年人诱导性化学疗法，骨髓移植植入失败或延迟，动员以及在移植自体周边血液祖细胞之后的骨髓恢复。
80、如权利要求52至73任意一项所要求保护的HAS-蛋白质偶联物的用途，优选HES-蛋白质偶联物，其中蛋白质为APC，用于制备药物，其用于治疗严重型败血症、血栓症、血栓栓塞或闭塞型疾病，特别是闭塞型动脉疾病。
81、如权利要求52至73任意一项所要求保护的HAS-蛋白质偶联物的用途，优选HES-蛋白质偶联物，其中蛋白质为tPA，用于制备药物，其用于治疗心肌梗塞(心脏病发作)、血栓症、血栓栓塞或闭塞型疾病，特别是闭塞型动脉疾病。
82、如权利要求52至73任意一项所要求保护的HAS-蛋白质偶联物的用途，优选HES-蛋白质偶联物，其中蛋白质为A1AT，用于制备药物，其用于治疗肺气肿、囊性纤维化、遗传性过敏性皮炎和/或支气管炎。
83、如权利要求52至73任意一项所要求保护的HAS-蛋白质偶联物的用途，优选HES-蛋白质偶联物，其中蛋白质为ATIII，用于制备药物，其用于治疗遗传缺陷、静脉闭塞型疾病、烧伤和在冠状动脉旁路移植(CABG)手术中肝素抗凝，预防供氧治疗中形成微血凝块，治疗创伤或胃肠手术引起的内脏穿孔；弥散性血管内凝血(DIC)和/或败血症。
84、如权利要求52至73任意一项所要求保护的HAS-蛋白质偶联物的用途，优选HES-蛋白质偶联物，其中蛋白质为因子VII，用于与因子VIII和因子IX抑制剂一起制备药物，其用于治疗发病期的A或B型血友病患者。
85、如权利要求52至73任意一项所要求保护的HAS-蛋白质偶联物在用于制备治疗A型血友病的药物中的用途，优选HES-蛋白质偶联物，其中蛋白质为因子VIII。
86、如权利要求52至73任意一项所要求保护的HAS-蛋白质偶联物的用途，优选HES-蛋白质偶联物，其中蛋白质为和因子IX，用于制备药物，其用于控制和预防具有B型血友病，优选先天性因子IX缺乏或B型血友病的患者出血发作，包括控制和预防手术过程中出血。
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