CN1832762A - 羟烷基淀粉与g－csf的偶联物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及羟烷基淀粉与粒细胞集落刺激因子蛋白质(G－CSF)的偶联物，其中该偶联物由羟烷基淀粉或羟烷基淀粉的衍生物与蛋白质通过共价键形成。本发明还涉及制备这种偶联物的方法，以及这种偶联物的用途。

Description

羟烷基淀粉与G-CSF的偶联物

技术领域

本发明涉及羟烷基淀粉与粒细胞集落刺激因子蛋白质(G-CSF)的偶联物，其中这些偶联物由羟烷基淀粉或羟烷基淀粉的衍生物与蛋白质通过共价键形成。本发明还涉及制备这些偶联物的方法，以及这些偶联物的用途。

背景技术

通常已知当这些蛋白质与聚合分子偶联时，可改善蛋白质的稳定性并且对抗这些蛋白质的免疫应答降低。WO 94/28024揭示经聚乙二醇(PEG)修饰的生理活性蛋白质具有低的免疫原性和抗原性，并且在血液循环中的寿命显著高于未偶联的蛋白质，即清除率降低。

G-CSF是一种21kDa的糖蛋白，其利用两个链内二硫键稳定，并且包含单一O-连接的碳水化合物部分。成熟的G-CSF具有174个氨基酸。动物体中的G-CSF由骨髓基质细胞、巨噬细胞和成纤维细胞合成。其主要功能是作为嗜中性粒细胞及其前体细胞的生长和分化因子。然而，本领域也已知G-CSF可活化成熟的嗜中性粒细胞。此外，它还刺激多种其它造血祖细胞的生长/分化(与其它造血生长因子协同作用)，并且促进内皮细胞的增殖和迁移。临床上，G-CSF用于给药治疗嗜中性粒细胞水平的缺乏(例如由再生障碍性贫血、脊髓发育不良、AIDS或化疗引起的)。

WO 02/09766特别公开了生物相容性蛋白质-聚合物化合物，它是由生物活性蛋白质与生物相容性聚合物衍生物偶联制成的。所使用的生物相容性聚合物是高度反应性分支聚合物，所得的偶联物在聚合物衍生物与蛋白质之间包含一个长接头。作为生物相容性聚合物，描述了通式(P-OCH₂CO-NH-CHR-CO-)_n-L-Q_k-A的聚合物，其中P和Q为聚合残基，k可为1或0。P和Q提到的有聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧乙烯、聚三亚甲基二醇(polytrimethyleneglycol)、聚乳酸及其衍生物、聚丙烯酸及其衍生物、聚氨基酸、聚乙烯醇、聚氨基甲酸酯、聚磷腈、聚(L-赖氨酸)、聚亚烷基氧化物、聚丙烯酰胺和水溶性聚合物，如葡聚糖或多糖。蛋白质中特别提到α-、β-和γ-干扰素、血液因子、细胞因子，如白介素、G-CSF、GM-CSF。WO 02/09766的实施例中仅公开了仅与干扰素和表皮生长因子和人类生长激素偶联的单-、二-和三-聚乙二醇衍生物。

WO 94/01483公开了由无生物活性聚合物或聚合物衍生物与药学上纯的合成亲水性聚合物通过特定类型的化学键共价结合形成的生物相容性聚合物偶联物。其中公开的天然聚合物及其衍生物有多糖类如透明质酸、蛋白聚糖如硫酸软骨素A、B和C、几丁质、肝素、硫酸肝素、葡聚糖如环糊精、羟乙基纤维素、纤维素醚和淀粉、脂质如甘油三酯和磷脂。提到的合成聚合物有平均分子量约100至约100,000的聚乙烯及其衍生物。提到的与聚合物或聚合物衍生物连接的蛋白质有细胞因子和生长因子，包括干扰素、肿瘤坏死因子、白介素、集落刺激因子、生长因子如成骨因子提取物、表皮生长因子、转化生长因子、血小板衍生生长因子、酸性成纤维细胞生长因子，等等。WO 94/01483的所有实施例中都使用聚乙二醇衍生物作为聚合物。

WO 96/11953公开了N-末端化学修饰的蛋白质化合物及其制备方法。具体来说，其中描述了由水溶性聚合物与G-CSF的N末端偶联形成的G-CSF组合物。WO 96/11953中也公开了N-末端与水溶性聚合物偶联的组合干扰素。虽然WO 96/11953中列出许多种水聚合物(例如乙二醇与丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二噁茂烷、聚-1，3，6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)、聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/环氧乙烷共聚物或聚氧乙基化多元醇)，但WO 96/11953的实施例中仅描述了PEG基化的G-CSF或组合IFN组合物。

US 6,555,660B2公开的多肽偶联物包含具有G-CSF活性的多肽，其氨基酸序列与人类G-CSF氨基酸序列的不同之处在于至少一个特异性引入的和/或去除的氨基酸残基，其中该偶联物包含连接非多肽部分的基团，并且还包含至少一个附接在多肽该连接基团上的非多肽部分。该非多肽部分可为聚合物，如聚乙二醇或寡糖。US 6,555,660 B2中明确说明PEG是目前最优选的聚合物分子，因为与多糖类如葡聚糖相比，其仅具有极少的可以进行交联的反应性基团。

WO 97/30148涉及变应原性降低的多肽偶联物，其包含与两个或多个多肽分子偶联的聚合载体分子。这些偶联物优选地是个人护理用品市场上所使用组合物的一部份。该偶联物的制备方法包括：活化聚合载体分子，两个或多个多肽分子与活化的聚合载体分子反应，并阻断偶联物上残留的活性基团。WO 97/30148中列出多种聚合载体分子，包括如天然或合成均聚物的不同类别的化合物，如多元醇、聚胺、聚羧酸和包含至少两个不同连接基团的杂聚物。其给出的实例包括星形PEGs、分支PEGs、聚乙烯醇、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮和聚-D，L-氨基酸。其中还公开了葡聚糖，如羧甲基葡聚糖，纤维素，如羟乙基纤维素或羟丙基纤维素，壳聚糖的水解物，淀粉，如羟乙基淀粉或羟丙基淀粉，糖原、琼脂糖、瓜尔胶、菊糖、支链淀粉、黄原胶、角叉菜胶、果胶、藻酸，等等。至于多肽，其中仅明确公开了几种酶。

Baldwin，J.E.等人，Tetrahedron，vol.27(1981)，pp.1723-1726中描述了葡聚糖与羟乙基淀粉的化学修饰，产生的醛取代的聚合物可与血红蛋白反应，产生可溶性的与聚合物结合的血红蛋白。其显示可与氧结合，但心脏灌注实验清楚地证实，该与聚合物结合的血红蛋白不适宜用作血液代用品。

WO 99/49897描述了由多糖类如葡聚糖或羟乙基淀粉与血红蛋白的氨基反应形成的血红蛋白偶联物。使用经氧化反应打开糖环所产生的醛基作为多糖的官能团。公开了硼烷二甲胺作为优选使用的还原剂。此外，WO 99/49897仅限于血红蛋白。

WO 03/074087涉及一种偶联蛋白质与淀粉衍生的修饰多糖的方法。蛋白质与多糖(羟烷基淀粉)之间的结合作用是共价连接，此共价连接是在羟烷基淀粉分子的末端醛基或该末端醛基经化学修饰后所得的官能团与蛋白质的官能团之间形成的。公开了氨基、硫基和羧基作为蛋白质的反应性基团，但未提及蛋白质的醛基。此外，虽然其中列出不同连接的多种可能性，包括不同官能团，理论上合适的不同接头分子和不同的化学方法，但是实施例只给出两种选择：第一，使用氧化的羟乙基淀粉，采用乙基二甲基氨基丙基碳二亚胺(EDC)活化作用，直接与蛋白质偶联，或采用未氧化的羟乙基淀粉，直接与蛋白质偶联形成希夫氏碱(Schiff’s base)，其接着还原成各自的胺。因此，WO 03/074087的实施例既未公开通过蛋白质的硫基或羧基偶联的单一偶联物，也未描述包含羟乙基淀粉、蛋白质和一种或多种接头分子的偶联物。此外，其实施例中也未使用G-CSF分子。

因此，本发明的一个目的在于提供现有技术中未曾描述的羟烷基淀粉，优选羟乙基淀粉，与G-CSF的偶联物。

本发明的另一个目的是提供制备这些偶联物的方法。

发明内容

因此，本发明涉及一种制备包含蛋白质和聚合物或其衍生物的偶联物的方法，其中该聚合物为羟烷基淀粉(HAS)，且该蛋白质为粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，该方法包括由聚合物或其衍生物的至少一个官能团A与蛋白质的至少一个官能团Z反应，由此形成共价连接，其中Z选自氨基、硫醇基、醛基和酮基，并且

-其中，若Z为醛基或酮基时，A包含与Z形成该连接的氨基，或

-其中，若Z为氨基时，A选自反应性羧基和醛基、酮基或半缩醛基，

--其中，若A为醛基、酮基或半缩醛基时，该方法还包括向聚合物中引入A，形成聚合物衍生物

---由聚合物与一种至少双官能化合物反应，其中一个官能团可与聚合物反应，其中至少另一个官能团为醛基、酮基或半缩醛基，或者是经进一步化学修饰可产生醛基、酮基或半缩醛基的官能团，或

---氧化该聚合物，产生至少一个，特别是至少两个醛基，或

--其中，若A为反应性羧基时，该方法还包括向聚合物中引入A，形成聚合物衍生物

---选择性氧化聚合物的还原端，并活化所得的羧基，或

---聚合物的未氧化还原端与碳酸二酯反应，或

-其中，若Z为硫醇基时，A包含

--马来酰亚胺基或

--卤乙酰基

与Z形成所述连接。

因此，本发明也涉及利用上述方法制得的偶联物。

G-CSF可通过化学合成法制备，或者可来自任何人类(参见例如，Burgess，A.W.等人1977，Stimulation by human placentalconditioned  medium of hemopoietic colony formation by humanmarrow cells.Blood 49(1977)，573-583；Shah，R.G.等人1977，Characterization of colony-stimulating activity produced by humanmonocytes and phytohemagglutinin-stimulated lymphocytes.Blood50(1977)，811)或另一种哺乳动物来源，并且可由诸如人类胎盘、人类血液或人类尿液等天然来源纯化获得。此外，有许多上皮癌、急性骨髓性白血病细胞和多种肿瘤细胞系(膀胱癌、髓母细胞瘤)能够表达该因子。

此外，G-CSF的表述还包括G-CSF变体，其中一个或多个氨基酸(例如1至25个，优选1至10个，更优选1至5个，最优选1或2个)已被置换为另一种氨基酸，并且显示G-CSF活性(参见例如：Riedhaar-Olson，J.F.等人1996，Identification of residuescritical to the activity of human granulocyte colony-stimulating factor.Biochemistry 35：9034-9041 1996；美国专利Nos.5,581476；5,214,132；5,362,853；4,904,584)。G-CSF活性的测定法在本领域中有叙述(G-CSF活性的体外测定法参见例如：Shirafuji，N.等人1989，A new bioassay for human granulocyte colony-stimulating factor(hG-CSF)using murine myeloblastic NFS-60 cells as targets andestimation of its levels in sera from normal healthy persons andpatients with infectious and hematological disorders，Exp.Hematol.1989，17，116-119；G-CSF活性的体内测定法参见例如：Tanaka，H.等人1991，Pharmacokinetics ofrecombinant human granulocytecolony-stimulating factor conjugated to polyethylene glycol in rats，Cancer Research 51，3710-3714，1991)。其它有关测定G-CSF活性的方法的文献为美国专利No.6,555,660；Nohynek，G.J.等人，1997，Comparison of the potency of glycosylated and nonglycosylatedrecombinant human granulocyte colony-stimulating  factors inneutropenic and nonneutropenic CD rats.Cancer ChemotherPharmacol(1997)39；259-266。

优选重组产生G-CSF。其包括由原核或真核宿主表达通过基因组或cDNA克隆或DNA合成得到的外源性DNA序列。合适的原核宿主包括多种细菌，如大肠杆菌(E.coli)。合适的真核宿主包括酵母，如酿酒酵母(S.cerevisiae)，和哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢细胞和猴细胞。

本领域已知蛋白质的重组产生方法。通常，其包括用适当表达载体转染宿主细胞，在可以产生蛋白质的条件下培养宿主细胞，并从宿主细胞中纯化蛋白质。有关详细资料参见例如：Souza，L.M.等人1986，Recombinant human granulocyte colony-stimulatingfactors：effects on normal and leukemic myeloid cells.Science 1986232：61-65，1986；Nagata，S.等人1986，Molecular cloning andexpression of cDNA for human granulocyte colony-stimulatingfactors.Nature 319：415-418，1986；Komatsu，Y.等人1987，Cloning ofhuman granulocyte colony-stimulating factors cDNA from humanmacrophages and its expression in Escherichia coli，Jpn J Cancer Res.198778(11)：1179-1181。

在一个优选实施方案中，G-C SF具有人类成熟G-CSF的氨基酸序列(参见例如：Nagata，S.等人1986，Molecular cloning andexpression of cDNA for human granulocyte colony-stimulatingfactors.Nature 319：415-418，1986)，且可进一步在其氨基末端包含一个甲硫氨酸，形成175个氨基酸的蛋白质。此外，G-CSF可包含丝氨酸或苏氨酸残基来代替甲硫氨酸。

用于本发明方法和根据本发明的偶联物中的G-CSF可包含一个碳水化合物侧链，该侧链通过在Thr 133位置上O-连接的糖基化作用连接到G-CSF，即G-CSF被糖基化(V.Gervais等人，Eur.J.Biochem.1997，247，386-395)。碳水化合物侧链的结构可以是NeuNAc(α2-3)Gal(β1-3)[NeuNAc(α2-6)]GalNAc和(α2-3)Gal(β1-3)GalNAc(NeuNAc＝N-乙酰神经氨酸，GalNAc＝N-乙酰半乳糖胺)。

曾有人建议修饰G-CSF和其它多肽，以便与天然多肽相比，再引入至少另一个碳水化合物链(美国专利No.5,218,092)。根据所使用的宿主不同，G-CSF表达产物可被哺乳动物或其它真核生物碳水化合物糖基化。通常，当G-CSF在真核细胞中产生时，该蛋白质在翻译后糖基化。结果，碳水化合物侧链可在哺乳动物特别是人类、昆虫或酵母细胞中的生物合成期间与G-CSF连接。

重组人G-CSF(rhG-CSF)通常用于治疗多种类型的白细胞减少症。因此，可获得名称为非格司亭(filgrastim)(Gran^和Neupogen^)、来格司亭(lenograstim)(Neutrogin^和Granocyte^)和那托司亭(nartograstim)(Neu-up^)的商品rhG-CSF制剂。Gran^和Neupogen^为非糖基化，在重组大肠杆菌细胞中产生。Neutrogin^和Granocyte^为糖基化，在重组CHO细胞中产生，Neu-up^为非糖基化，其在完整rhG-CSF的N-末端区有5个氨基酸置换，在重组大肠杆菌细胞中产生。

可使用任何糖基化G-CSF，如Granocyte^，作为糖基化蛋白质。根据本发明的方法和偶联物中，可使用任何非糖基化G-CSF，如Neupogen^，作为非糖基化G-CSF。

此外，在1-位上，G-CSF可包含一个甲硫氨酸氨基酸残基、丝氨酸残基或苏氨酸残基。

在本发明内容中，术语″羟烷基淀粉″(HAS)意指被至少一个羟基烷基取代的淀粉衍生物。本发明的一种优选羟烷基淀粉具有根据式(I)的结构

其中淀粉分子的还原端呈非氧化型，末端糖单位显示为缩醛型，根据如溶剂的不同，该缩醛型可能与醛型平衡。

本发明使用的术语”羟烷基淀粉”不限于末端碳水化合物部分包含如式(I)中为了简便起见所示羟基烷基R₁、R₂和/或R₃的化合物，也指其中在末端碳水化合物部分和/或淀粉分子HAS′中其余部份的任何位置的至少一个羟基被羟基烷基R₁、R₂或R₃取代的化合物。

羟烷基淀粉也可能包含两个或多个不同羟基烷基。

包含在HAS中的至少一个羟基烷基可包含两个或多个羟基。根据一个优选实施方案，包含在HAS中的至少一个羟基烷基包含一个羟基。

术语″羟烷基淀粉″也包括其中烷基被单-或多取代的衍生物。本文中，优选的是烷基被卤素，特别是氟取代，或被芳基取代。此外，羟基烷基的羟基可被酯化或醚化。

此外，也可使用直链或分支的取代或未取代的烯基代替烷基。

羟烷基淀粉是淀粉的醚衍生物。除了所述醚衍生物外，本发明中也可使用其它淀粉衍生物。例如，可用包含酯化羟基的衍生物。这些衍生物可以是，例如含2-12个碳原子的未取代一元或二元羧酸的衍生物或其取代的衍生物。特别有用的是含2-6个碳原子的未取代一元羧酸的衍生物，特别是乙酸的衍生物。本文中，优选乙酰基淀粉、丁基淀粉和丙基淀粉。

此外，优选含2-6个碳原子的未取代二元羧酸的衍生物。

对于二元羧酸衍生物，适用的是该二元羧酸的第二个羧基也被酯化的衍生物。此外，二元羧酸的单烷基酯衍生物也适用于本发明。

取代的一元或二元羧酸中，取代基优选地可与上述取代烷基残基的取代基相同。

淀粉的酯化技术是本领域公知的(参见例如：Klemm D.等人，Comprehensive Cellulose Chemistry Vol.2，1998，Whiley-VCH，Weinheim，New York，特别是第4.4章，“纤维素的酯化(Esterification of Cellulose)”(ISBN 3-527-29489-9)。

根据本发明的一个优选实施方案，使用根据式(I)的羟烷基淀粉。式(I)中，明确说明的糖环和以HAS′表示的残基共同代表优选羟烷基淀粉分子。HAS′中包含的其它糖环结构可以与明确说明的糖环相同或不同。

根据式(I)的残基R₁、R₂和R₃没有明确限制。根据一个优选实施方案，R₁、R₂和R₃分别独立为氢或各烷基中具有2至10个碳原子的羟基烷基、羟基芳基、羟基芳烷基或羟基烷芳基。优选氢和具有2至10个碳原子的羟基烷基。更优选具有2至6个碳原子的羟基烷基，更优选具有2至4个碳原子的羟基烷基，甚至更优选具有2至4个碳原子。因此″羟烷基淀粉″优选包括羟乙基淀粉、羟丙基淀粉和羟丁基淀粉，其中特别优选羟乙基淀粉和羟丙基淀粉，最优选羟乙基淀粉。

烷基、芳基、芳烷基和/或烷芳基可以是直链或分支的，并且被适当取代。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法，其中R₁、R₂和R₃分别独立为氢或含1至6个碳原子的直链或分支羟基烷基。

因此，R₁、R₂和R₃优选地可以是羟基己基、羟基戊基、羟基丁基、羟基丙基，如2-羟基丙基、3-羟基丙基、2-羟基异丙基、羟基乙基，如2-羟基乙基，特别优选氢和2-羟基乙基。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中R₁、R₂和R₃分别独立为氢或2-羟基乙基，特别优选其中R₁、R₂和R₃中至少一个残基为2-羟基乙基的实施方案。

羟乙基淀粉(HES)对于本发明所有实施方案都是最优选的。

因此，本发明涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中聚合物为羟乙基淀粉，并且聚合物衍生物为羟乙基淀粉衍生物。

羟乙基淀粉(HES)是天然支链淀粉的衍生物，可被体内α-淀粉酶降解。HES是碳水化合物聚合物支链淀粉的取代衍生物，其在玉米淀粉中的含量浓度高达95重量％。HES具有有利的生物性质，在临床上用作血容量置换剂及用于血液稀释疗法(Sommermeyer等人，1987，Krankenhauspharmazie，8(8)，271-278；和Weidler等人，1991，Arzneim.-Forschung/Drug Res.，41，494-498)。

支链淀粉由葡萄糖单位组成，其中主链中含有α-1，4-糖苷键，并且在分支位置处可见α-1，6-糖苷键。该分子的物理化学性质主要由糖苷键的类型决定。由于存在切口(nicked)α-1，4-糖苷键，因此产生每一圈约6个葡萄糖单体的螺旋结构。聚合物的物理化学性质及生化性质可通过取代改变。利用碱性羟乙基化作用可引入羟基乙基。通过调节反应条件可能使未取代的葡萄糖单体中各羟基对羟乙基化作用具有不同反应性。基于此事实，本领域技术人员可以在有限范围内改变取代模式。

HES的主要特征在于分子量分布和取代程度。表述取代程度有两种可能的方式：

1.取代程度可表示为取代的葡萄糖单体相对于所有葡萄糖部分的比例。

2.取代程度可表示为摩尔取代程度，其中表示每个葡萄糖部分的羟基乙基数。

在本发明内容中，以DS表示的取代程度涉及如上所述的摩尔取代程度。

HES溶液呈现为多分散组合物，其中各分子在聚合度、分支位置的数量和模式及取代模式上彼此不同。因此，HES是不同分子量的化合物的混合物。因此，特定的HES溶液由借助统计方式得到的平均分子量来决定。本文中，M_n计算为根据分子数量的算术平均值。或者，平均重量M_w(或MW)代表取决于HES质量的单位。

在本发明内容中，羟乙基淀粉可优选具有1至300kD的平均分子量(平均重量)。羟乙基淀粉可进一步显示0.1至0.8的优选摩尔取代程度，羟基乙基的C₂∶C₆取代的优选比例范围为2至20。

本发明中使用的术语″平均分子量″涉及根据Sommermeyer等人，1987，Krankenhauspharmazie，8(8)，271-278；和Weidler等人，1991，Arzneim.-Forschung/Drug Res.，41，494-498确定的重量。

根据本发明的一个优选实施方案，所使用羟乙基淀粉的平均分子量为1至300kD，更优选2至200kD，更优选4至130kD，更优选4至70kD。

平均分子量约130kD的HES的一个实例为来自Fresenius公司的Voluven^。Voluven^是一种人造胶体，其用于例如在医疗上进行容量置换，供治疗和预防低血容量症。Voluven^的特征为平均分子量为130,000+/-20,000D，摩尔取代程度为0.4，C2∶C6比例约9∶1。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中羟烷基淀粉为平均分子量4至70Kd的羟乙基淀粉。

平均分子量的优选范围是例如：4至70kD或10至70kD或12至70kD或18至70kD或50至70kD或4至50kD或10至50kD或12至50kD或18至50kD或4至18kD或10至18kD或12至18kD或4至12kD或10至12kD或4至10kD。

根据本发明特别优选的实施方案，所使用羟乙基淀粉的平均分子量范围在4kD 以上及70kD以下，例如：约10kD，或在9至10kD或10至11kD或9至11kD的范围内，或约12kD，或在11至12kD或12至13kD或11至13kD的范围内，或约18kD，或在约17至18kD或18至19kD或17至19kD的范围内，或约50kD，或在49至50kD或50至51kD或49至51kD的范围内。

关于取代程度(DS)，DS优选为至少0.1，更优选至少0.2，更优选至少0.4。DS的优选范围是0.1至0.8，更优选0.2至0.8，更优选0.3至0.8，甚至更优选0.4至0.8，再更优选0.1至0.7，更优选0.2至0.7，更优选0.3至0.7，更优选0.4至0.7。特别优选的DS值为例如：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7或0.8，更优选0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7或0.8，甚至更优选0.3、0.4、0.5、0.6、0.7或0.8，再更优选0.4、0.5、0.6、0.7或0.8，特别优选例如0.4和0.7。

羟烷基淀粉，优选羟乙基淀粉的分子量和其取代程度DS的特别优选组合是例如：10kD和0.4或10kD和0.7或12kD和0.4或12kD和0.7或18kD和0.4或18kD和0.7或50kD和0.4或50kD和0.7。

在本发明另一个优选实施方案中，羟乙基淀粉(所使用以及包含在本文所述偶联物中)的分子量为约20kD至约130kD(即约40kD、约50kD、约60kD、约70kD、约80kD、约90kD、约100kD、约110kD、约120kD、约130kD)，优选平均分子量为约30kD至约100kD，更优选约40至约70kD，取代程度为0.4至0.8，更优选0.5至0.8。

本文中术语″约30kD″理解为是指平均分子量在25kD至34kD的范围内，即也包括平均分子量为26、27、28、29、31、32、33或34kD的淀粉。

本文中术语″约40kD″理解为是指平均分子量在35kD至44kD的范围内，即也包括平均分子量为36、37、38、39、41、42、43或44kD的淀粉。

本文中术语″约50kD″理解为是指平均分子量在45kD至54kD的范围内，即也包括平均分子量为46、47、48、49、51、52、53或54kD的淀粉。

本文中术语″约60kD″理解为是指平均分子量在55kD至64kD的范围内，即也包括平均分子量为56、57、58、59、61、62、63或64kD的淀粉。

本文中术语″约70kD″理解为是指平均分子量在65kD至74kD的范围内，即也包括平均分子量为66、67、68、69、71、72、73或74kD的淀粉。

本文中术语″约80kD″理解为是指平均分子量在75kD至84kD的范围内，即也包括平均分子量为76、77、78、79、81、82、83或84kD的淀粉。

本文中术语″约90kD″理解为是指平均分子量在85kD至94kD的范围内，即也包括平均分子量为86、87、88、89、91、92、93或94kD的淀粉。

本文中术语″约100kD″理解为是指平均分子量在95kD至104kD的范围内，即也包括平均分子量为96、97、98、99、101、102、103或104kD的淀粉。

本文中术语″约110kD″理解为是指平均分子量在105kD至114kD的范围内，即也包括平均分子量为106、107、108、109、111、112、113或114kD的淀粉。

本文中术语″约120kD″理解为是指平均分子量在115kD至124kD的范围内，即也包括平均分子量为116、117、118、119、121、122、123或124kD的淀粉。

本文中术语″约130kD″理解为是指平均分子量在125kD至134kD的范围内，即也包括平均分子量为126、127、128、129、131、132、133或134kD的淀粉。

因此上述实施方案包括平均分子量约30kD，取代程度为0.4或0.5或0.6或0.7或0.8，优选为0.6、0.7或0.8的羟乙基淀粉(和本文所述包含该羟乙基淀粉的偶联物以及本文所述使用该羟乙基淀粉的方法)。

因此上述实施方案中也包括平均分子量约40kD，取代程度为0.4或0.5或0.6或0.7或0.8，优选为0.6、0.7或0.8的羟乙基淀粉(和本文所述包含该羟乙基淀粉的偶联物以及本文所述使用该羟乙基淀粉的方法)。

因此，上述实施方案也包括平均分子量约50kD，取代程度为0.4或0.5或0.6或0.7或0.8，优选为0.6、0.7或0.8的羟乙基淀粉(和本文所述包含该羟乙基淀粉的偶联物以及本文所述使用该羟乙基淀粉的方法)。

因此，上述实施方案也包括平均分子量约60kD，取代程度为0.4或0.5或0.6或0.7或0.8，优选为0.6、0.7或0.8的羟乙基淀粉(和本文所述包含该羟乙基淀粉的偶联物以及本文所述使用该羟乙基淀粉的方法)。

因此，上述实施方案也包括平均分子量约70kD，取代程度为0.4或0.5或0.6或0.7或0.8，优选为0.6、0.7或0.8的羟乙基淀粉(和本文所述包含该羟乙基淀粉的偶联物以及本文所述使用该羟乙基淀粉的方法)。

因此，上述实施方案也包括平均分子量约80kD，取代程度为0.4或0.5或0.6或0.7或0.8，优选为0.6、0.7或0.8的羟乙基淀粉(和本文所述包含该羟乙基淀粉的偶联物以及本文所述使用该羟乙基淀粉的方法)。

因此，上述实施方案也包括平均分子量约90kD，取代程度为0.4或0.5或0.6或0.7或0.8，优选为0.6、0.7或0.8的羟乙基淀粉(和本文所述包含该羟乙基淀粉的偶联物以及本文所述使用该羟乙基淀粉的方法)。

因此，上述实施方案也包括平均分子量约100kD，取代程度为0.4或0.5或0.6或0.7或0.8，优选为0.6、0.7或0.8的羟乙基淀粉(和本文所述包含该羟乙基淀粉的偶联物以及本文所述使用该羟乙基淀粉的方法)。

因此，上述实施方案也包括平均分子量约110kD，取代程度为0.4或0.5或0.6或0.7或0.8，优选为0.6、0.7或0.8的羟乙基淀粉(和本文所述包含该羟乙基淀粉的偶联物以及本文所述使用该羟乙基淀粉的方法)。

因此，上述实施方案也包括平均分子量约120kD，取代程度为0.4或0.5或0.6或0.7或0.8，优选为0.6、0.7或0.8的羟乙基淀粉(和本文所述包含该羟乙基淀粉的偶联物以及本文所述使用该羟乙基淀粉的方法)。

因此，上述实施方案也包括平均分子量约130kD，取代程度为0.4或0.5或0.6或0.7或0.8，优选为0.6、0.7或0.8的羟乙基淀粉(和本文所述包含该羟乙基淀粉的偶联物以及本文所述使用该羟乙基淀粉的方法)。

平均分子量约130kD的HES的实例是取代程度为0.2至0.8，如0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7或0.8，优选0.4至0.7，如0.4、0.5、0.6或0.7的HES。

关于C₂∶C₆取代比例，该取代比例优选为2至20的范围内，更优选2至15，甚至更优选3至12。

根据本发明另一个实施方案，也可使用平均分子量不同和/或取代程度不同和/或C₂∶C₆取代比例不同的羟乙基淀粉的混合物。因此，所使用的羟乙基淀粉的混合物可具有不同平均分子量和不同取代程度和不同C₂∶C₆取代比例，或具有不同平均分子量和不同取代程度和相同或大约相同的C₂∶C₆取代比例，或具有不同平均分子量和相同或大约相同的取代程度和不同C₂∶C₆取代比例，或具有相同或大约相同的平均分子量和不同取代程度和不同C₂∶C₆取代比例，或具有不同平均分子量和相同或大约相同的取代程度和相同或大约相同的C₂∶C₆取代比例，或具有相同或大约相同的平均分子量和不同取代程度和相同或大约相同的C₂∶C₆取代比例，或具有相同或大约相同的平均分子量和相同或大约相同的取代程度和不同C₂∶C₆取代比例，或具有大约相同的平均分子量和大约相同的取代程度和大约相同的C₂∶C₆取代比例。

根据本发明的不同偶联物和/或不同方法，可使用不同羟烷基淀粉，优选不同羟乙基淀粉和/或不同羟烷基淀粉的混合物，优选不同羟乙基淀粉的混合物。

根据本发明一个实施方案，蛋白质的官能团Z为醛基或酮基。因此，本发明涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中蛋白质的官能团Z为醛基或酮基。

虽然蛋白质中的醛或酮基的位置一般没有限制，但根据本发明优选实施方案，醛或酮基位于蛋白质的碳水化合物侧链。因此，该实施方案采用糖基化蛋白质。

可使用任何糖基化G-CSF，如Granocyte^作为糖基化蛋白质。

在本发明内容中，术语″碳水化合物侧链″是指羟基醛或羟基酮及其化学修饰(参见Rmpp Chemielexikon，Thierne Verlag Stuttgart，Germany，第9版1990，Vol.9，p.2281-2285和其中引用的文献)。此外，其也指天然碳水化合物部分(如半乳糖、N-乙酰神经氨酸和N-乙酰半乳糖胺)等的衍生物。如果使用N-糖基化的G-CSF突变体，其碳水化合物部分可以是甘露糖。

在一个甚至更优选的实施方案中，醛基或酮基是碳水化合物侧链的半乳糖残基的一部份。通过除去末端唾液酸，该半乳糖残基可与包含在聚合物或聚合物衍生物中的官能团A反应，然后如下文所述进行氧化。

在另一个优选实施方案中，包含官能团A的聚合物或聚合物衍生物连接碳水化合物侧链的唾液酸残基，优选碳水化合物侧链的末端唾液酸残基。

末端碳水化合物部分的氧化可通过化学或酶方式进行。

多肽的碳水化合物部分的化学氧化方法在本领域公知，包括用高碘酸盐处理(Chamow等人1992，J.Biol.Chem.，267，15916-15922)。

通过化学氧化，原则上可以氧化位于末端或非末端的任何碳水化合物部分。然而，通过选择温和反应条件，优选地可以氧化碳水化合物侧链的末端唾液酸，产生醛基或酮基。

根据本发明的一个实施方案，所述温和反应条件是指蛋白质与适当高碘酸盐水溶液的反应条件如下：优选高碘酸盐浓度范围在1至50mM，更优选1至25mM，特别优选1至10mM，如约1mM，优选反应温度为0至40℃，特别优选0至21℃，如约0℃，优选反应时间为5分钟至5小时，更优选10分钟至2小时，特别优选10分钟至1小时，如约1小时。高碘酸盐∶蛋白质的优选摩尔比为1∶200至1∶1，更优选1∶50至1∶5，如约15∶1。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中在蛋白质与聚合物或聚合物衍生物反应之前，先由糖基化蛋白质与高碘酸盐溶液反应，产生在氧化的碳水化合物侧链上具有醛基或酮基的蛋白质。

或者，碳水化合物侧链可经酶氧化。用于氧化各碳水化合物侧链的酶在本领域公知，例如：对于半乳糖，其酶为半乳糖氧化酶。如果多肽已在可使唾液酸连接在碳水化合物链上的细胞如哺乳动物细胞中产生，或在基因改造后可使唾液酸连接在碳水化合物链上的细胞中产生，如果需要氧化末端半乳糖部分，则最终必需(部份或完全)除去末端唾液酸。去除唾液酸的化学或酶方法在本领域公知(Chaplin和Kennedy(编辑)，1996，Carbohydrate Analysis：apractical approach，特别是第5章，Montreuill，Glycoproteins，p.175-177；IRL Press Practical approach series(ISBN0-947946-44-3))。

根据本发明另一个优选实施方案，醛基或酮基可位于蛋白质的N末端，并且可进行适当氧化反应。尤其在包含羟基的氨基酸位于蛋白质的N-末端时，如苏氨酸或丝氨酸，可进行该N-末端氨基酸的氧化反应，形成所述酮基或醛基。苏氨酸是人源G-CSF的N-末端氨基酸。另一个N-末端丝氨酸或苏氨酸可通过分子生物学方法引入任何显示G-CSF样活性的蛋白质中。该蛋白质或表达人类氨基酸序列的蛋白质可在原核或真核细胞，如细菌、哺乳动物、昆虫或酵母细胞中表达产生，并且可经或不经糖基化。可采用任何适合的方法作为合适N-末端氨基酸的化学氧化法，优选用高碘酸盐氧化。

根据本发明另一个优选实施方案，所述温和反应条件是指蛋白质与合适的高碘酸盐水溶液的反应条件如下：优选高碘酸盐浓度范围为1至50mM，更优选1至25mM，特别优选1至10mM，如大约1mM，优选反应温度为0至40℃，特别优选0至21℃，如大约0℃，优选反应时间为5分钟至5小时，更优选10分钟至2小时，特别优选10分钟至1小时，如大约1小时。高碘酸盐∶蛋白质的优选摩尔比为1∶200至1∶1，更优选1∶50至1∶5，如大约15∶1。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中醛基或酮基位于蛋白质的碳水化合物侧链和/或蛋白质的N-末端基团处。

因此，在真核细胞中产生的蛋白质的寡糖模式已在翻译后糖基化，与人源蛋白质不同。此外，许多糖基化蛋白质并没有所需数量的末端唾液酸残基来遮蔽其它碳水化合物部分，如半乳糖残基。然而，这些其它碳水化合物部分，如半乳糖残基，如果未被遮蔽，则可能会存在一些缺点，例如，在该蛋白质作为药物的用途中，该蛋白质的血浆半衰期可能会缩短。现已惊人地发现，通过提供一种由羟烷基淀粉聚合物，优选羟乙基淀粉聚合物形成的蛋白质偶联物，该聚合物通过例如下文所述的肟连接，直接或通过至少一个连接化合物，如一个或两个连接化合物，与蛋白质的碳水化合物侧链中碳水化合物部分共价连接，可以克服至少一项上述缺点。因此，认为通过将羟烷基淀粉聚合物或其衍生物，优选羟乙基淀粉聚合物或其衍生物，与糖基化蛋白质的至少一条碳水化合物侧链偶联，可弥补碳水化合物侧链所缺乏的合适末端碳水化合物残基。根据本发明另一方面，提供一种由羟烷基淀粉聚合物或其衍生物，优选羟乙基淀粉聚合物或其衍生物，与如上述氧化的碳水化合物部分偶联的偶联物，不仅可弥补上述缺点，而且所提供的蛋白质偶联物在所需应用领域上，具有比天然蛋白质更好的特性。因此，本发明的各偶联物对蛋白质具有弥补，甚至增效的效果。甚至与人类蛋白质相同或本身是人类蛋白质的蛋白质也可能在天然碳水化合物部分不具有所需数量的合适遮蔽末端碳水化合物残基，如唾液酸残基。此时，所提供由羟烷基淀粉聚合物或其衍生物，优选羟乙基淀粉聚合物或其衍生物与如上所述氧化的碳水化合物部分偶联形成的各偶联物不仅可克服及弥补人工制备的蛋白质的缺点，而且可改善天然蛋白质的特性。关于羟烷基淀粉优选羟乙基淀粉或其衍生物用于与蛋白质的氧化的碳水化合物部分中醛基或酮基偶联的官能团，可提到下文中所揭示的官能团A。该一般概念不仅适用于糖基化G-CSF，原则上也适用于所有缺乏末端碳水化合物残基的糖基化蛋白质。其中可提到促红细胞生成素(EPO)、干扰素β1a(IFN β1a)、ATIII、因子VII、因子VIII、因子IX、α-抗胰蛋白酶(A1AT)、htPA或GM-CSF。

因此，本发明也涉及羟烷基淀粉，优选羟乙基淀粉，或其衍生物在弥补蛋白质中天然或翻译后连接的碳水化合物部分所缺乏的末端碳水化合物残基，优选唾液酸残基上的用途，这是通过将淀粉或其衍生物与具有至少一个酮基或醛基的蛋白质中至少一个氧化的碳水化合物部分共价偶联而实现的。

因此，本发明也涉及一种弥补在蛋白质中天然或翻译后连接的碳水化合物部分上所缺乏的末端碳水化合物残基，优选唾液酸残基的方法，这是通过将羟烷基淀粉，优选羟乙基淀粉或其衍生物与具有至少一个酮基或醛基的蛋白质的至少一个氧化的碳水化合物部分共价偶联，优选通过肟连接共价偶联而实现的。

此外，本发明也涉及一种由羟烷基淀粉，优选羟乙基淀粉，或其衍生物，与蛋白质的至少一个氧化的碳水化合物部分共价连接所形成的偶联物，该蛋白质从天然来源中分离或在真核细胞如哺乳动物、昆虫或酵母细胞中表达产生，该碳水化合物部分具有至少一个酮基或醛基，其中该偶联物在所需领域的用途中，优选作为药物的用途中，具有与各种未修饰的蛋白质相同或更优的特性。

如果蛋白质的官能团Z为醛基或酮基，聚合物或其衍生物的官能团A包含如结构式-NH-的氨基。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中可与聚合物中任选氧化的还原端反应的官能团A包含结构式-NH-的氨基。

根据本发明的一个优选实施方案，该官能团A为具有结构式R′-NH-的基团，其中R′是氢或烷基、环烷基、芳基、芳烷基、芳基环烷基、烷芳基或环烷基芳基残基，其中环烷基、芳基、芳烷基、芳基环烷基、烷芳基或环烷基芳基残基可直接连接NH基团，或根据另一实施方案，可通过氧桥连接NH基团。烷基、环烷基、芳基、芳烷基、芳基环烷基、烷芳基或环烷基芳基残基可被适当取代。优选取代基可以是卤素，如F、Cl或Br。特别优选的残基R′是氢、烷基和烷氧基，甚至更优选的是氢和未取代的烷基和烷氧基。

在烷基和烷氧基中，优选具有1、2、3、4、5或6个碳原子的基团。更优选的是甲基、乙基、丙基、异丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基和异丙氧基。特别优选的是甲基、乙基、甲氧基、乙氧基，特别优选甲基或甲氧基。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中R′是氢或甲基或甲氧基。

根据本发明另一个优选实施方案，官能团A具有结构R′-NH-R″-，其中R″优选包含结构单位-NH-和/或结构单位-(C＝G)-，其中G为O或S，和/或结构单位-SO₂-。根据更优选的实施方案，官能团R″选自：

和

其中如果G出现两次，则分别独立地是O或S。

因此，包含氨基-NH₂的优选官能团A是，例如：

H₂N-

其中G为O或S，并且如果出现两次，则分别独立地是O或S，且R′为甲基。

包含氨基的特别优选的官能团A是氨基氧基

特别优选H₂N-O-，及酰肼基

其中G优选为O。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法，其中蛋白质的官能团Z是醛基或酮基，官能团A是氨基氧基或酰肼基。根据本发明一个特别优选的实施方案，A是氨基氧基。

因此，本发明也涉及一种如上所述的偶联物，其中蛋白质的官能团Z是醛基或酮基，官能团A是氨基氧基或酰肼基。根据本发明一个特别优选的实施方案，A是氨基氧基。

当聚合物或聚合物衍生物的氨基氧基与蛋白质的醛基或酮基反应时，形成肟连接。

因此，本发明也涉及一种如上所述的偶联物，其中蛋白质与聚合物或聚合物衍生物之间的共价连接是蛋白质的官能团Z(该官能团Z为醛基或酮基)与聚合物或聚合物衍生物的官能团A(该官能团A为氨基氧基)反应所形成的肟连接。

当聚合物或聚合物衍生物的酰肼基与蛋白质的醛基或酮基反应时，形成腙连接。

因此，本发明也涉及一种如上所述的偶联物，其中蛋白质与聚合物或其聚合物衍生物之间的共价连接是蛋白质的官能团Z(该官能团Z为醛基或酮基)与聚合物或聚合物衍生物的官能团A(该官能团A为酰肼基)反应所形成的腙连接。

为了向聚合物中引入官能团A，只要产生包含官能团A的聚合物衍生物，没有明确限制。

根据本发明一个优选实施方案，通过使聚合物与至少双官能化合物反应将官能团A引入聚合物中，其中一个官能团可与聚合物中至少一个官能团反应，至少双官能化合物中至少另一个官能团是官能团A或者可经化学修饰形成官能团A。

根据另一个优选实施方案，聚合物与至少双官能化合物在其任选氧化的还原端反应。

如果聚合物与其未氧化还原端反应时，该聚合物优选具有如下结构

其中式(I)中包括未氧化还原端的醛型。

如果聚合物与其氧化的还原端反应时，该聚合物优选具有如式(IIa)的结构

和/或如式(IIb)的结构。

聚合物，优选羟乙基淀粉的还原端的氧化反应可根据产生具有上述结构(IIa)和/或(IIb)的化合物的各方法或方法组合进行。

虽然氧化可根据所有产生羟烷基淀粉的氧化的还原端的合适一种或多种方法进行，但优选利用如DE 196 28 705 A1所述的碱性碘溶液进行，该文献的内容(实施例A，第9栏，第6至24行)在此引入作为参考。

可以使用可与羟烷基淀粉的任选氧化的还原端形成化学键的各官能团作为可与聚合物中任选氧化的还原端反应的至少双官能化合物的官能团。

根据本发明一个优选实施方案，该官能团包含化学结构-NH-。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中至少双官能化合物的官能团(该官能团可与聚合物的任选氧化的还原端反应)包含结构-NH-。

根据本发明一个优选实施方案，所述至少双官能化合物的该官能团是具有结构R′-NH-的基团，其中R′为氢或烷基、环烷基、芳基、芳烷基、芳基环烷基、烷芳基或环烷基芳基残基，其中环烷基、芳基、芳烷基、芳基环烷基、烷芳基或环烷基芳基残基可直接连接NH基团，或者根据另一实施方案，可通过氧桥连接NH基团。该烷基、环烷基、芳基、芳烷基、芳基环烷基、烷芳基或环烷基芳基残基可适当取代。优选的取代基可提及卤素，如F、Cl或Br。特别优选的残基R′是氢、烷基和烷氧基，甚至更优选的是氢和未取代的烷基和烷氧基。

在烷基和烷氧基中，优选含1、2、3、4、5或6个碳原子的基团。更优选的是甲基、乙基、丙基、异丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基和异丙氧基。特别优选的是甲基、乙基、甲氧基、乙氧基，特别优选甲基或甲氧基。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中R′为氢或甲基或甲氧基。

根据本发明另一个优选实施方案，至少双官能化合物的官能团具有结构R′-NH-R″-，其中R″优选包含结构单位-NH-和/或结构单位-(C＝G)-，其中G为O或S，和/或结构单位-SO₂-。根据更优选实施方案，官能团R″选自：

和

其中如果G出现两次，则分别独立地是O或S。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中至少双官能化合物的官能团(该官能团可与聚合物的任选氧化的还原端反应)选自：

H₂N-

其中G为O或S，并且如果出现两次，则分别独立地是O或S，R′为甲基。

根据本发明一个甚至更优选的实施方案，至少双官能化合物的官能团(该官能团可与聚合物的任选氧化的还原端反应，且包含氨基)是氨基氧基

特别优选H₂N-O-，或者是酰肼基

其中G优选为O。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中蛋白质的官能团Z为醛基或酮基，且该至少双官能化合物的官能团(该官能团可与聚合物的任选氧化的还原端反应)为氨基氧基或酰肼基，优选氨基氧基。

因此，本发明也涉及一种如上所述的偶联物，其中蛋白质的官能团Z为醛基或酮基，且该至少双官能化合物的官能团(该官能团可与聚合物的任选氧化的还原端反应)为氨基氧基或酰肼基，优选氨基氧基。

根据本发明另一个优选实施方案，该至少双官能化合物与聚合物的未氧化的还原端反应。

根据本发明另一个优选实施方案，可与聚合物的任选氧化的还原端反应的至少双官能化合物包含官能团A。

该至少双官能化合物可先与聚合物反应，产生的聚合物衍生物继续通过官能团A与蛋白质反应。也可能该至少双官能化合物首先通过官能团A与蛋白质反应，产生的蛋白质衍生物继续通过包含在蛋白质衍生物中至少双官能化合物残基的至少一个官能团与聚合物反应。

根据本发明一个优选实施方案，该至少双官能化合物首先与聚合物反应。

因此，本发明涉及一种如上所述的方法和偶联物，该方法还包括聚合物的未氧化的还原端先与包含可与聚合物的未氧化还原端反应的官能团与基团A的至少双官能连接化合物反应，然后包含A的聚合物衍生物与包含Z的蛋白质反应。

可利用任何合适的间隔基分隔可与聚合物反应的至少双官能连接化合物的官能团与可与蛋白质的官能团Z反应的至少双官能连接化合物的官能团A。其中间隔基可为任选取代的直链、分支和/或环状烃残基。通常，烃残基具有至多60个碳原子，优选至多40个，更优选至多20个，更优选至多10个，更优选至多6个，特别优选至多4个碳原子。如果存在杂原子，该分隔基通常包含1至20个杂原子，优选1至8个，更优选1至6个，更优选1至4个，特别优选1至2个杂原子。优选O作为杂原子。烃残基可包含具有例如5至7个碳原子的任选分支的烷基链或芳基或环烷基，或者是芳烷基、烷芳基，其中烷基部份可以是直链和/或环状烷基。根据本发明一个甚至更优选的实施方案，官能团利用具有4个碳原子的直链烃链分隔。根据本发明另一个优选实施方案，官能团利用具有4个碳原子和至少一个，优选一个杂原子，特别优选一个氧原子的直链烃链分隔。

根据另一优选实施方案，该至少双官能连接化合物是均双官能连接化合物。因此，本发明也涉及一种制备如上所述偶联物的方法，其中该至少双官能连接化合物是均双官能化合物。

因此，对于连接化合物的上述优选官能团，所述均双官能连接化合物优选包含两个氨基氧基H₂N-O-或两个氨基氧基R′-O-NH-或两个酰肼基H₂N-NH-(C＝G)-，优选氨基氧基H₂N-O-和酰肼基H₂N-NH-(C＝O)-，特别优选氨基氧基H₂N-O-。

在含有两个酰肼基H₂N-NH-(C＝O)-的所有可能均双官能化合物中，优选酰肼，其中两个酰肼基利用烃残基分隔，该烃残基具有至多60个，优选至多40个，更优选至多20个，更优选至多10个，更优选至多6个，特别优选至多4个碳原子。更优选地，该烃残基具有1至4个碳原子，如1、2、3或4个碳原子。最优选地，该烃残基具有4个碳原子。因此，优选如下式的均双官能化合物。

根据本发明一个甚至更优选的实施方案，双官能连接化合物是碳酰肼

如上所述，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中该至少双官能连接化合物是均双官能化合物且包含两个氨基氧基。因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中该至少双官能连接化合物是均双官能化合物且包含两个氨基氧基H₂N-O-。

如上所述，聚合物优选地在其反应前未氧化的还原端与双官能连接化合物反应。因此，包含两个氨基氧基H₂N-O-的优选均双官能化合物与聚合物反应，产生包含肟连接的聚合物衍生物。

因此，由于蛋白质的官能团Z是优选与聚合物衍生物的氨基氧基反应的醛或酮基，因此本发明也涉及如上所述的偶联物，该偶联物包含聚合物和蛋白质，分别利用肟或环状缩醛胺连接共价连接连接化合物。

在包含两个氨基氧基H₂N-O-的所有可能的均双官能化合物中，优选如下双官能化合物，其中两个氨基氧基利用烃残基分隔，该烃残基具有1至60个，优选1至40个，更优选1至20个，更优选1至10个，更优选1至6个，特别优选1至4个碳原子。更优选地，该烃残基具有1至4个碳原子，如1、2、3或4个碳原子。最优选地，该烃残基具有4个碳原子。甚至更优选地，该烃残基具有至少一个杂原子，更优选一个杂原子，最优选一个氧原子。特别优选如下式的化合物O-[2-(2-氨基氧-乙氧基)-乙基]羟胺。

因此，本发明涉及一种如上所述的偶联物，该偶联物具有如下式的结构

和/或

HAS′优选为HES′。特别优选的羟乙基淀粉是例如：平均分子量约10kD且DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约10kD且DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约12kD且DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约12kD且DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约18kD且DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约18kD且DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约50kD且DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约50kD且DS约0.7的羟乙基淀粉。

聚合物的未氧化还原端与连接化合物的反应优选在水性系统中进行，特别是在该连接化合物是包含两个氨基氧基H₂N-O-的均双官能连接化合物时。

用于本发明的术语″水性系统″是指溶剂或溶剂混合物中的含水量为占所涉及溶剂重量的至少10％重量比，优选至少50％重量比，更优选至少80％重量比，甚至更优选至少90％重量比，或者可达100％重量比。优选的反应介质是水。

根据另一个实施方案，可以使用至少另一种可溶解HAS，优选HES的溶剂。这些溶剂的实例是例如DMF、二甲基乙酰胺或DMSO。

反应期间所采用的温度没有明确限制，只要反应产生所需的聚合物衍生物即可。

如果聚合物与包含两个氨基氧基H₂N-O-的均双官能连接化合物，优选O-[2-(2-氨基氧-乙氧基)-乙基]羟胺反应，温度优选为0至45℃，更优选4至30℃，特别优选15至25℃。

聚合物与包含两个氨基氧基H₂N-O-的均双官能连接化合物，优选O-[2-(2-氨基氧-乙氧基)-乙基]羟胺的反应时间可根据具体需要调整，通常在1小时至7天的范围内，优选1小时至3天的范围内，更优选2小时至48小时。

聚合物与包含两个氨基氧基H₂N-O-的均双官能连接化合物，优选O-[2-(2-氨基氧-乙氧基)-乙基]羟胺的反应pH值可根据具体需要调整，如反应物的化学性质。pH值优选为4.5至9.5，更优选4.5至6.5。

上述反应条件的具体实例是例如：反应温度约25℃，及pH约5.5。

反应混合物的合适pH值可通过添加至少一种合适缓冲液来调节。优选的缓冲液可提及乙酸钠缓冲液、磷酸盐或硼酸盐缓冲液。

一旦形成包含聚合物和与之连接的双官能连接化合物的聚合物衍生物，即可采用至少一种合适的方法，从反应混合物中分离。必要时，该聚合物衍生物可先沉淀，再采用至少一种合适方法分离。

如果先使聚合物衍生物沉淀，则可能例如在合适温度下，使反应混合物与至少一种不同于反应混合物中溶剂或溶剂混合物的溶剂或溶剂混合物接触。根据本发明一个特别优选的实施方案，其中使用水性介质，优选水作为溶剂，反应混合物与2-丙醇在优选-20至+50℃，特别优选-20至25℃的温度下接触。

聚合物衍生物的分离可以采用可包括一个或多个步骤的合适方法进行。根据本发明一个优选实施方案，首先利用合适的方法，如离心或过滤法，从反应混合物或反应混合物与例如2-丙醇水性混合物的混合物中分离聚合物衍生物。第二步，分离的聚合物衍生物可进一步处理，如透析、离心过滤或加压过滤、离子交换层析、反向层析、HPLC、MPLC、凝胶过滤和/或冷冻干燥等后处理。根据本发明一个甚至更优选的实施方案，首先优选相对于水透析所分离的聚合物衍生物，然后冷冻干燥，直到反应产物的溶剂含量足够低，符合产物所需要求。冷冻干燥可在20至35℃，优选20至30℃的温度下进行。

所分离的聚合物衍生物再进一步通过官能团A与蛋白质的官能团Z反应，其中Z为醛基或酮基。在A是氨基氧基H₂N-O-，可在聚合物衍生物与蛋白质之间产生肟连接的特别优选的例子中，反应优选在水性介质中，优选在水中，优选在0至40℃，更优选4至25℃，特别优选15至25℃的温度下进行。反应介质的优选pH值为4至10，更优选5至9，特别优选5至7。反应时间优选为1至72小时，更优选1至48小时，特别优选4至24小时。

偶联物可进一步处理，如透析、离心过滤或加压过滤、离子交换层析、反向层析、HPLC、MPLC、凝胶过滤和/或冷冻干燥等后处理。

根据本发明另一个实施方案，蛋白质的官能团Z为氨基。因此，本发明涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中蛋白质的官能团Z为氨基。

根据本发明另一个优选实施方案，与作为官能团Z的氨基反应的官能团A是反应性羧基。因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中官能团Z为氨基，聚合物或聚合物衍生物的官能团A是反应性羧基。

根据本发明第一个优选实施方案，反应性羧基通过在还原端选择性氧化聚合物而引入该聚合物中。

因此，要引入反应性羧基的聚合物优选具有如式(IIa)

和/或如式(IIb)的结构。

如式(I)的聚合物，

优选羟乙基淀粉的还原端的氧化可根据产生上述结构(IIa)和/或(IIb)的各方法或方法组合进行。

虽然氧化可根据所有可产生羟烷基淀粉的氧化的还原端的合适一种或多种方法进行，但优选采用如DE 196 28 705 A1所述的碱性碘溶液法进行，其内容(实施例A，第9栏，第6至24行)在此引用作为参考。

可采用所有可行的方法将反应性羧基引入其还原端已选择性氧化的聚合物中。

氧化的聚合物可以这样使用或者作为盐使用，如碱金属盐，优选钠盐和/或钾盐。

根据本发明优选方法，其还原端已选择性氧化的聚合物在氧化的还原端与至少一种醇反应，优选与至少一种酸性醇反应。进一步优选的是25℃的PK_A值为6至12，更优选7至11的酸性醇。酸性醇的分子量优选为80至500克/摩尔，更优选90至300克/摩尔，特别优选100至200克/摩尔。

合适的酸性醇是所有具有酸性质子并且可与氧化的聚合物反应形成各反应性聚合物酯的H-O-R_A醇，其优选如下式

更优选如下式

优选的醇类是N-羟基琥珀酰亚胺类，如N-羟基琥珀酰亚胺或磺基-N-羟基琥珀酰亚胺，适当取代的苯酚类，如对硝基苯酚、邻，对-二硝基苯酚、邻，邻′-二硝基苯酚、三氯苯酚，如2，4，6-三氯苯酚或2，4，5-三氯苯酚、三氟苯酚，如2，4，6-三氟苯酚或2，4，5-三氟苯酚、五氯苯酚、五氟苯酚，或羟基唑类，如羟基苯并三唑。特别优选的是N-羟基琥珀酰亚胺类，特别优选N-羟基琥珀酰亚胺和磺基-N-羟基琥珀酰亚胺。所有醇类均可单独使用或者作为两种或多种的适当组合使用。在本发明内容中，也可能使用例如通过添加碳酸的二酯而释放各醇的化合物。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中还原端被选择性氧化的聚合物通过氧化的聚合物与酸性醇，优选与N-羟基琥珀酰亚胺和/或磺基-N-羟基琥珀酰亚胺反应而活化。

根据本发明另一个优选实施方案，其还原端被选择性氧化的聚合物在氧化的还原端与至少一种碳酸二酯R_B-O-(C＝O)-O-R_C反应，其中R_B与R_C可相同或不同。优选地，该方法产生如下式的反应性聚合物

其中HAS′优选为HES′。

合适的碳酸二酯化合物可使用其醇成分独立地是下列成分的化合物：N-羟基琥珀酰亚胺类，如N-羟基琥珀酰亚胺或磺基-N-羟基琥珀酰亚胺，适当取代的苯酚类，如对硝基苯酚、邻，对-二硝基苯酚、邻，邻′-二硝基苯酚、三氯苯酚，如2，4，6-三氯苯酚或2，4，5-三氯苯酚、三氟苯酚，如2，4，6-三氟苯酚或2，4，5-三氟苯酚、五氯苯酚、五氟苯酚，或羟基唑类，如羟基苯并三唑。特别优选N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯和磺基-N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯，特别优选N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中在还原端被选择性氧化的聚合物通过氧化的聚合物与N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯反应而活化。

酸性醇与氧化的聚合物或氧化的聚合物的盐反应，酸性醇∶聚合物的摩尔比优选为5∶1至50∶1，更优选8∶1至20∶1，反应温度优选为2至40℃，更优选10至30℃，特别优选15至25℃。反应时间优选为1至10小时，更优选2至5小时，更优选2至4小时，特别是2至3小时。

碳酸二酯化合物与氧化的聚合物或氧化的聚合物的盐反应，二酯化合物∶聚合物的摩尔比优选为1∶1至3∶1，更优选1∶1至1.5∶1。反应时间优选为0.1至12小时，更优选0.2至6小时，更优选0.5至2小时，特别是0.75至1.25小时。

根据本发明优选实施方案，氧化的聚合物与酸性醇和/或碳酸二酯的反应在至少一种非质子溶剂中进行，特别优选在水含量不超过0.5％重量比，优选不超过0.1％重量比的无水非质子溶剂中进行。合适的溶剂特别是二甲亚砜(DMSO)、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺(DMA)、二甲基甲酰胺(DMF)和其中两种或多种的混合物。优选反应温度为2至40℃，更优选10至30℃。

氧化的聚合物与至少一种酸性醇的反应中还使用至少一种活化剂。

合适的活化剂特别是羰基二咪唑、碳二亚胺如二异丙基碳二亚胺(DIC)、二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)，特别优选二环己基碳二亚胺(DCC)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中还原端已氧化的聚合物与酸性醇在另一种活化剂的存在下反应，产生反应性聚合物酯。

根据本发明一个特别优选的实施方案，氧化的聚合物与碳酸二酯和/或酸性醇的反应在低碱活性下进行，该活性可通过添加反应混合物至水中来决定，其中水与反应混合物的体积比为10∶1。添加之前，基本上不包含缓冲液的水在25℃下的pH值为7。添加反应混合物后测定pH值，获得反应混合物的碱活性数值优选为不超过9.0，更优选不超过8.0，特别优选不超过7.5。

根据本发明优选实施方案，氧化的聚合物与N-羟基琥珀酰亚胺在无水DMA中，在没有水的存在下，使用EDC反应，选择性产生如下式的聚合物N-羟基琥珀酰亚胺酯

其中HAS′更优选为HES′。

令人惊讶的是，该反应不产生因EDC与HES的OH基团反应而产生的副产物，并且意外地抑制了EDC与氧化聚合物所形成的O-酰基异脲形成各N-酰基脲的重排反应。

根据本发明另一个优选实施方案，氧化的聚合物与N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯在无水DMF中，在没有活化剂的存在下反应，选择性产生如下式的聚合物N-羟基琥珀酰亚胺酯

其中HAS′更优选为HES′。

上述反应性聚合物最好进一步与蛋白质的至少一个氨基反应，产生酰胺键。根据本发明优选实施方案，反应性聚合物与蛋白质的一个氨基反应。

因此，本发明涉及优选具有如下式的结构的偶联物

其中酰胺键的N原子来源于蛋白质的氨基，其中HAS′更优选为HES′，羟乙基淀粉优选为平均分子量约10kD，DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约10kD，DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约12kD，DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约12kD，DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约18kD，DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约18kD，DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约50kD，DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约50kD，DS约0.7的羟乙基淀粉。

反应性聚合物与蛋白质的反应可通过组合制备反应性聚合物的反应混合物与蛋白质的水溶液进行，即不分离反应性聚合物，其中包含至少10％重量比，更优选至少30％，再更优选至少50％重量比的反应性聚合物。优选的蛋白质水溶液包含0.05至10％，更优选0.5至5％，特别优选0.5至2％重量比的蛋白质，优选pH为5.0至9.0，更优选6.0至9.0，特别优选7.5至8.5。

根据本发明，也可能使用至少一种合适的沉淀剂，如无水乙醇、异丙醇和/或丙酮，通过至少一个，优选多重沉淀法纯化反应性聚合物，产生包含至少10％，更优选至少30％，再更优选至少50％重量比反应性聚合物的固体。

纯化的反应性聚合物可加至蛋白质的水溶液中。也可能添加纯化的反应性聚合物溶液至蛋白质的水溶液中。

根据本发明优选实施方案，反应性聚合物与蛋白质产生酰胺键的反应在2至40℃，更优选5至35℃，特别是10至30℃的温度下进行，pH优选为7.0至9.0，优选7.5至9.0，特别优选7.5至8.5，反应时间优选为0.1至12小时，更优选0.5至5小时，更优选0.5至3小时，再更优选0.5至72小时，特别优选0.5至1小时，反应性聚合物酯∶蛋白质的摩尔比优选为1∶1至70∶1，更优选5∶1至50∶1，特别优选10∶1至50∶1。

根据本发明另一个实施方案，还原端选择性氧化的聚合物在其氧化的还原端与唑化物(azolide)如羰基二咪唑或羰基二苯并咪唑反应，产生具有反应性羧基的聚合物。在羰基二咪唑的情况下，产生如下式的反应性聚合物衍生物

其中HAS′优选为HES′。聚合物与唑化物反应产生的咪唑化物(imidazolide)可优先与蛋白质的氨基反应，产生酰胺键。如果蛋白质存在羟基时，也可与羟基反应产生酯键，或者与蛋白质的硫基反应产生硫酯键，或者如果蛋白质存在羧基时，也可能与羧基反应产生-(C＝O)-O-(C＝O)-连接。

根据本发明另一个实施方案，具有由聚合物的选择性氧化的还原端与上述化合物之一，优选与至少一种酸性醇类和/或至少一种碳酸二酯化合物反应产生的反应性羧基A的聚合物，可通过至少一种连接化合物连接到蛋白质的官能团Z。如果使用连接化合物，该化合物为至少双官能化合物，其具有至少一个可与聚合物衍生物的官能团A反应的官能团F₁，以及至少一个可与蛋白质的官能团Z反应的官能团F₂或经化学修饰可与蛋白质的官能团Z反应的官能团F₂。该化学修饰可以是例如官能团F₂与另一种连接化合物的官能团F₃反应，或氧化或还原合适的官能团F₂。如果使用至少一种连接化合物，该反应不限于蛋白质的氨基，而是根据一种或多种连接化合物的官能团的化学性质，其可用于与蛋白质的各合适的官能团如羧基、反应性羧基、醛基、酮基、硫基、氨基或羟基形成连接。如果使用两种连接化合物，所使用的第一种连接化合物具有至少一个可与聚合物的反应性羧基A反应的官能团F₁，如氨基、硫基、羟基或羧基。此外，该第一种连接化合物具有至少另一个可与第二连接化合物的至少一个官能团F₃反应的官能团F₂。官能团F₂尤其可提到下列官能团：

-C-C-双键或C-C-三键或芳香族C-C-键；

-硫基或羟基；

-烷基磺酸酰肼、芳基磺酸酰肼；

-1，2-二元醇；

-1，2-氨基醇类；

-1，2-氨基-硫醇类；

-叠氮化物；

-氨基-NH₂或包含结构单位-NH-的氨基衍生物，如氨基烷基、氨基芳基、氨基芳烷基或烷芳基氨基；

-羟基氨基-O-NH₂，或包含结构单位-O-NH-的羟基氨基的衍生物，如羟基烷基氨基、羟基芳基氨基、羟基芳烷基氨基或羟基烷芳基氨基；

-烷氧基氨基、芳氧基氨基、芳烷氧基氨基或烷芳氧基氨基，其各包含结构单位-NH-O-；

-具有羰基-Q-C(＝G)-M的残基，其中G为O或S，M为例如：

---OH或-SH；

--烷基氧基、芳基氧基、芳烷基氧基或烷芳基氧基；

--烷基硫基、芳基硫基、芳烷基硫基或烷芳基硫基；

--烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、芳烷基羰基氧基、烷芳基羰基氧基；

--活化的酯，如羟胺的酯，其具有如N-羟基琥珀酰亚胺的亚胺结构或具有结构单位O-N，其中N为杂芳基化合物的一部份，或其中G＝O且Q不存在，如具有取代芳基残基如五氟苯基、对硝基苯基或三氯苯基的芳氧基化合物；

其中Q不存在或是NH或杂原子，如S或O；

--NH-NH₂或-NH-NH-；

--NO₂；

-腈基；

-羰基，如醛基或酮基；

-羧基；

--N＝C＝O基团或-N＝C＝S基团；

-乙烯基卤化物基团，如乙烯基碘化物或乙烯基溴化物基团或三氟甲磺酸根(triflate)；

--C≡C-H；

--(C＝NH₂Cl)-O烷基

--(C＝O)-CH₂-Hal基团，其中Hal为Cl、Br或I；

--CH＝CH-SO₂-；

-包含结构-S-S-的二硫化物基团；

-基团

-基团

其中F₃是可与上述基团之一形成化学键的基团，其优选选自上述基团。此外，第二连接化合物具有至少一个可与蛋白质的官能团Z反应的官能团，它是例如氨基、硫基、羧基、反应性羧基、醛基、酮基或羟基。如果使用一种连接化合物共价连接聚合物与蛋白质，则该聚合物可与连接化合物反应，所得聚合物衍生物再与蛋白质反应，或蛋白质可与连接化合物反应，所得蛋白质衍生物再与聚合物反应。如果使用两种连接化合物L1与L2，可由聚合物与L1反应，所得聚合物衍生物再与L2反应，并由所得聚合物衍生物与蛋白质反应，或由蛋白质与L2反应，所得蛋白质衍生物再与L1反应，所得蛋白质衍生物再与聚合物反应。也可由聚合物与L1反应，由蛋白质与L2反应，再由聚合物衍生物与蛋白质衍生物反应。此外，也可由L1与L2反应，所得化合物再与聚合物反应，所得聚合物衍生物再与蛋白质反应。此外，也可由L1与L2反应，所得化合物再与蛋白质反应，所得蛋白质衍生物再与聚合物反应。

根据关于向聚合物中引入反应性羧基的本发明第二个优选实施方案，通过使聚合物的至少一个羟基与碳酸二酯反应，将反应性羧基引入还原端未氧化的聚合物中。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中A是反应性羧基，并且其中通过聚合物的至少一个羟基与至少一种碳酸二酯R_B-O-(C＝O)-O-R_C(其中R_B与R_C可相同或不同)反应，将A引入还原端未氧化的聚合物中。

根据本发明另一个实施方案，还原端未氧化的聚合物中至少一个羟基与唑化物如羰基二咪唑、羰基-二-(1，2，4-三唑)或羰基二苯并咪唑反应，产生具有反应性羧基的聚合物。

适用的碳酸二酯化合物可使用其醇成分分别独立为下列成分的化合物：N-羟基琥珀酰亚胺类，如N-羟基琥珀酰亚胺或磺基-N-羟基琥珀酰亚胺，适当取代的苯酚类，如对硝基苯酚、邻，对-二硝基苯酚、邻，邻′-二硝基苯酚、三氯苯酚，如2，4，6-三氯苯酚或2，4，5-三氯苯酚、三氟苯酚，如2，4，6-三氟苯酚或2，4，5-三氟苯酚、五氯苯酚、五氟苯酚，或羟基唑类，如羟基苯并三唑。

特别优选对称性碳酸二酯化合物，因此R_B与R_C相同。碳酸二酯的醇成分优选选自：N-羟基琥珀酰亚胺、磺酸化N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基苯并三唑和硝基-及卤素-取代的苯酚类。其中优选硝基苯酚、二硝基苯酚、三氯苯酚、三氟苯酚、五氯苯酚和五氟苯酚，特别优选N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯和磺基-N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯，特别优选N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯。

因此，本发明也涉及一种羟烷基淀粉衍生物及其制备方法，优选羟乙基淀粉衍生物，其中该淀粉的至少一个羟基，优选至少两个羟基已与碳酸二酯化合物反应，产生各反应性酯。

根据本发明优选实施方案，还原端未氧化的聚合物与至少一种碳酸二酯化合物的反应在2至40℃，更优选10至30℃，特别是15至25℃的温度下进行，优选反应时间为0.5至5小时，更优选1至3小时，特别优选2至3小时。

碳酸二酯和/或唑化物，优选碳酸二酯化合物∶聚合物的摩尔比取决于聚合物的取代程度，即与碳酸二酯化合物反应的羟基数与未反应的聚合物中羟基数的相对比例。

根据本发明一个优选实施方案，碳酸二酯化合物∶无水葡萄糖单位的摩尔比为1∶2至1∶1000，更优选1∶3至1∶100，特别优选1∶10至1∶50，所产生的取代程度为0.5至0.001，优选0.33至0.01，特别优选0.1至0.02。取代程度通过紫外光谱法测定。

根据本发明优选实施方案，还原端未氧化的聚合物与碳酸二酯的反应在至少一种非质子溶剂中进行，特别优选在水含量不超过0.5％重量比，优选不超过0.1％重量比的无水非质子溶剂中进行。合适的溶剂特别是二甲亚砜(DMSO)、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺(DMA)、二甲基甲酰胺(DMF)和其中两种或多种的混合物。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中还原端未氧化的聚合物中至少一个羟基与碳酸二酯反应产生反应性酯基团A的反应在无水非质子极性溶剂中进行，该溶剂优选为二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺或其混合物。

包含至少一个反应性酯基，优选至少两个反应性酯基的反应性聚合物与蛋白质反应产生至少一个酰胺键，优选至少两个酰胺键的反应可通过组合制备反应性聚合物的反应混合物与蛋白质的水溶液进行，即不分离反应性聚合物，其中包含至少5％重量比，更优选至少10，再更优选至少15％重量比的反应性聚合物。蛋白质的优选水溶液包含0.05至10％，更优选0.5至5％，特别优选0.5至2％重量比的蛋白质，优选pH为7.0至9，更优选7.5至9，特别优选7.5至8.5。

根据本发明，也可能使用至少一种合适的沉淀剂，如无水乙醇、异丙醇和/或丙酮，通过至少一个，优选多重沉淀纯化反应性聚合物，产生包含至少20％，更优选至少50％，再更优选至少80％重量比反应性聚合物的固体。

纯化的反应性聚合物可加至蛋白质的水溶液中。也可能添加纯化的反应性聚合物溶液至蛋白质的水溶液中。

根据本发明优选实施方案，反应性聚合物与蛋白质产生至少一个，优选至少二个酰胺键的反应在2至40℃，更优选5至35℃，特别优选10至30℃的温度下进行，优选pH为7.0至9.0，优选7.5至9.0，特别优选7.5至8.5，优选反应时间为0.5至5小时，更优选0.5至3小时，特别优选0.5至1小时，反应性聚合物酯∶蛋白质的摩尔比优选为1∶1至70∶1，更优选5∶1至50∶1，特别优选10∶1至50∶1。

根据本发明优选实施方案，得到寡-或多蛋白质-取代的聚合物，其中的蛋白质分子通过酰胺键与聚合物连接。

本发明内容中所采用的蛋白质分子的取代程度(PDS)是指连接蛋白质的葡萄糖部分相对于HAS，优选HES中所含所有葡萄糖部分的比例。

PDS范围为0.001至1，优选0.005至0.5，更优选0.005至0.2。

根据本发明另一个实施方案，具有由聚合物的至少一个羟基与上述化合物之一，优选至少一种碳酸二酯反应产生的反应性羧基A的聚合物，可通过至少一种连接化合物连接到蛋白质的官能团Z。如果使用连接化合物，该化合物是至少双官能化合物，其具有至少一个可与聚合物衍生物的官能团A反应的官能团F₁，以及至少一个可与蛋白质的官能团Z反应的官能团F₂或经化学修饰可与蛋白质的官能团Z反应的官能团F₂。该化学修饰可以是例如：由官能团F₂与另一种连接化合物的官能团F₃反应，或氧化或还原合适的官能团F₂。如果使用至少一种连接化合物，该反应不限于蛋白质的氨基，而是根据一种或多种连接化合物的官能团的化学性质，其可用于与蛋白质的各合适官能团如羧基、反应性羧基、醛基、酮基、硫基、氨基或羟基形成连接。如果使用两种连接化合物，所使用的第一种连接化合物具有至少一个可与聚合物的反应性羧基A反应的官能团F₁，如氨基、硫基、羟基或羧基。此外，该第一种连接化合物具有至少另一个可与第二连接化合物的至少一个官能团F₃反应的官能团F₂。官能团F₂尤其可提到下列官能团：

-C-C-双键或C-C-三键或芳香族C-C-键；

-硫基或羟基；

-烷基磺酸酰肼、芳基磺酸酰肼；

-1，2-二元醇；

-1，2-氨基醇类；

-1，2-氨基-硫醇类；

-叠氮化物；

-氨基-NH₂或包含结构单位-NH-的氨基衍生物，如氨基烷基、氨基芳基、氨基芳烷基或烷芳基氨基；

-羟基氨基-O-NH₂，或包含结构单位-O-NH-的羟基氨基的衍生物，如羟基烷基氨基、羟基芳基氨基、羟基芳烷基氨基或羟基烷芳基氨基；

-烷氧基氨基、芳氧基氨基、芳烷氧基氨基或烷芳氧基氨基，其各包含结构单位-NH-O-；

-具有羰基-Q-C(＝G)-M的残基，其中G为O或S，M为例如：

---OH或-SH；

--烷基氧基、芳基氧基、芳烷基氧基或烷芳基氧基；

--烷基硫基、芳基硫基、芳烷基硫基或烷芳基硫基；

--烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、芳烷基羰基氧基、烷芳基羰基氧基；

--活化的酯，如羟胺的酯，其具有如N-羟基琥珀酰亚胺的亚胺结构或具有结构单位O-N，其中N为杂芳基化合物的一部份，或其中G＝O且Q不存在，如具有取代芳基残基如五氟苯基、对硝基苯基或三氯苯基的芳氧基化合物；

其中Q不存在或是NH或杂原子，如S或O；

--NH-NH₂或-NH-NH-；

--NO₂；

-腈基；

-羰基，如醛基或酮基；

-羧基；

--N＝C＝O基团或-N＝C＝S基团；

-乙烯基卤化物基团，如乙烯基碘化物或乙烯基溴化物基团或三氟甲磺酸根；

--C≡C-H；

--(C＝NH₂Cl)-O烷基

--(C＝O)-CH₂-Hal基团，其中Hal为Cl、Br或I；

--CH＝CH-SO₂-；

-包含结构-S-S-的二硫化物基团；

-基团

-基团

其中F₃是可与上述基团之一形成化学键的基团，其优选选自上述基团。此外，第二连接化合物具有至少一个可与蛋白质的官能团Z反应的官能团，它是例如氨基、硫基、羧基、反应性羧基、醛基、酮基或羟基。如果使用一种连接化合物共价连接聚合物与蛋白质，则该聚合物可与连接化合物反应，所得聚合物衍生物再与蛋白质反应，或者蛋白质可与连接化合物反应，所得蛋白质衍生物再与聚合物反应。如果使用两种连接化合物L1与L2，可由聚合物与L1反应，所得聚合物衍生物再与L2反应，并由所得聚合物衍生物与蛋白质反应，或由蛋白质与L2反应，所得蛋白质衍生物再与L1反应，所得蛋白质衍生物再与聚合物反应。也可由聚合物与L1反应，由蛋白质与L2反应，再由聚合物衍生物与蛋白质衍生物反应。此外，也可由L1与L2反应，所得化合物再与聚合物反应，所得聚合物衍生物再与蛋白质反应。此外，也可由L1与L2反应，所得化合物再与蛋白质反应，所得蛋白质衍生物再与聚合物反应。

根据本发明特别优选的实施方案，蛋白质的官能团Z是氨基，聚合物或其衍生物的官能团A是醛基、酮基或半缩醛基。根据特别优选的实施方案，官能团Z与官能团A通过还原性胺化反应进行反应。

根据本发明的还原性胺化反应，其中聚合物或聚合物衍生物通过至少一个醛基或酮基或半缩醛基与蛋白质的至少一个氨基共价连接，该反应优选在0至40℃，更优选0至25℃，特别优选4至21℃的温度下进行。优选反应时间为0.5至72小时，更优选2至48小时，特别优选4至7小时。优选水性介质作为反应溶剂。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中还原性胺化在4至21℃的温度下进行。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中还原性胺化在水性介质中进行。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中还原性胺化在4至21℃的温度下在水性介质中进行。

用于本发明中的术语″水性介质″是指一种溶剂或溶剂混合物，其中水含量占所涉及溶剂重量的至少10％重量比，更优选至少20％重量比，更优选至少30％重量比，更优选至少40％重量比，更优选至少50％重量比，更优选至少60％重量比，更优选至少70％重量比，更优选至少80％重量比，甚至更优选至少90％重量比或者可达100％重量比。优选的反应介质是水。

反应介质的pH值一般为4至9或4至8或4至7.3。

根据本发明优选实施方案，该还原性胺化的反应pH低于7.3，更优选小于或等于7，最优选低于7，即在酸性范围内。因此，优选范围为3至低于7，更优选3.5至6.5，再更优选4至6，再更优选4.5至5.5，特别优选约5.0，即4.6或4.7或4.8或4.9或5.0或5.1或5.2或5.3或5.4。优选范围特别是3至6.9或3至6.5或3至6或3至5.5或3至5或3至4.5或3至4或3至3.5或3.5至6.9或3.5至6.5或3.5至6或3.5至5.5或3.5至5或3.5至4.5或3.5至4或4至6.9或4至6.5或4至6或4至5.5或4至5或4至4.5或4.5至6.9或4.5至6.5或4.5至6或4.5至5.5或4.5至5或5至6.9或5至6.5或5至6或5至5.5或5.5至6.9或5.5至6.5或5.5至6或6至6.9或6至6.5或6.5至6.9。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中还原性胺化在pH 7或以下，更优选在pH 6或以下进行。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中还原性胺化在4至21℃的温度下，在pH 7或以下，优选6或以下进行。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中还原性胺化在pH 7或以下，优选6或以下的水性介质中进行。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中还原性胺化在4至21℃的温度下，在pH 7或以下，优选6或以下的水性介质中进行。

反应所使用的聚合物衍生物∶蛋白质的摩尔比优选为200∶1至5∶1，更优选100∶1至10∶1，特别优选75∶1至20∶1。

已惊人地发现，尤其在上述优选pH范围内，特别在pH低于7且大于或等于4下，可由聚合物衍生物主要与位于蛋白质N末端的氨基反应。用于本发明中的术语″主要″涉及一个实施方案，其中至少80％，优选至少85％的N-末端氨基可用于进行还原性胺化反应。也可能由至少90％或至少95％或至少96％或至少97％或至少98％或至少99％的N-末端氨基反应。虽然无法完全排除除了N-末端氨基以外的氨基进行偶联的可能性，但是认为通过根据本发明在pH低于7，优选低于6下的还原性胺化反应所进行的偶联基本上选择性地在N-末端氨基上进行。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中蛋白质包含N-末端氨基和至少另一个氨基，该偶联物包含的聚合物主要偶联在N-末端氨基上。

根据本发明特别优选的实施方案，本发明涉及一种主要在蛋白质的N-末端氨基上连接经醛或酮基或半缩醛官能化的羟烷基淀粉或经醛或酮基或半缩醛官能化的羟烷基淀粉衍生物的方法，该方法包括该羟烷基淀粉或其衍生物在pH7或以下，优选pH6或以下进行还原性胺化反应，该还原性胺化反应优选在水性介质中进行。

根据本发明，优选经醛官能化的羟烷基淀粉或经醛官能化的羟烷基淀粉衍生物。

根据另一个优选实施方案，本发明涉及一种将醛或酮基或半缩醛官能化的羟烷基淀粉或醛或酮基或半缩醛官能化的羟烷基淀粉衍生物选择性地连接到蛋白质的N-末端氨基上的方法，该方法包括该羟烷基淀粉或其衍生物在pH7或以下，优选pH6或以下进行还原性胺化反应，该还原性胺化反应优选在水性介质中进行，所使用的羟乙基淀粉优选为平均分子量约10kD，DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约10kD，DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约12kD，DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约12kD，DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约18kD，DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约18kD，DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约50kD，DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约50kD，DS约0.7的羟乙基淀粉。

聚合物衍生物与蛋白质在醛基或酮基或半缩醛基与氨基之间的反应是产生希夫氏碱的还原性胺化。该反应后，该碱可用至少一种还原剂还原，在聚合物衍生物与蛋白质之间产生稳定的连接。也可能在至少一种还原剂的存在下进行该反应。根据优选实施方案，该还原性胺化反应在至少一种还原剂的存在下进行。

优选的还原剂是硼氢化钠、氰基硼氢化钠、有机硼烷络合物，如4-(二甲基胺)吡啶硼烷络合物、N-乙基二异丙基胺硼烷络合物、N-乙基吗啉硼烷络合物、N-甲基吗啉硼烷络合物、N-苯基吗啉硼烷络合物、二甲基吡啶硼烷络合物、三乙胺硼烷络合物或三甲胺硼烷络合物。特别优选氰基硼氢化钠。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中还原性胺化在NaCNBH₃的存在下进行。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中还原性胺化在pH7或以下，优选6或以下的水性介质中，在还原剂，优选NaCNBH₃的存在下进行。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中还原性胺化在4至21℃的温度下，在pH7或以下，优选6或以下的水性介质中，在还原剂，优选NaCNBH₃的存在下进行。

反应所使用的聚合物衍生物∶蛋白质的摩尔比优选为200∶1至10∶1，更优选100∶1至10∶1，特别优选75∶1至20∶1。

因此，本发明也涉及一种制备偶联物的方法，该方法包括在还原剂的存在下，包含醛基的聚合物或聚合物衍生物在水性介质中与蛋白质的氨基反应，该还原剂优选为NaCNBH₃。

根据本发明第一个优选实施方案，该聚合物包含至少两个通过开环氧化反应引入聚合物中的醛基，该聚合物优选包含至少一个如下式的结构：

根据本发明该实施方案，可以使用能够氧化聚合物的至少一个糖环形成具有至少一个，优选至少两个醛基的开放糖环的氧化剂或氧化剂组合。该反应用如下反应图说明，该图示出聚合物的糖环经氧化产生具有两个醛基的开放环：

合适的氧化剂特别是高碘酸盐，如碱金属高碘酸盐或其两种或多种的混合物，优选高碘酸钠和高碘酸钾。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中使用高碘酸盐对该聚合物进行开环氧化反应，产生具有至少一个，优选至少两个醛基的聚合物衍生物。

在该氧化反应中，可以使用具有氧化或未氧化型还原端的聚合物，优选未氧化型。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中使用具有未氧化型还原端的聚合物。

该反应温度的优选范围为0至40℃，更优选0至25℃，特别优选0至5℃。反应时间的优选范围为1分钟至5小时，特别优选10分钟至4小时。根据所需的氧化程度，即根据氧化反应产生的醛基数量，可适当选择高碘酸盐∶聚合物的摩尔比。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中开环氧化反应在0至5℃的温度下进行。

聚合物与高碘酸盐的氧化反应优选在水性介质中进行，最优选在水中进行。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中开环氧化反应在水性介质中进行。

反应混合物的合适pH值可通过添加至少一种合适的缓冲液来调节。优选的缓冲液可提到乙酸钠缓冲液、磷酸盐或硼酸盐缓冲液。

进行所述开环氧化反应的羟乙基淀粉优选为平均分子量约10kD，DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约10kD，DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约12kD，DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约12kD，DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约18kD，DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约18kD，DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约50kD，DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约50kD，DS约0.7的羟乙基淀粉。

所得聚合物衍生物可采用至少一种合适的方法从反应混合物中纯化。需要时，聚合物衍生物可先沉淀，之后再采用至少一种合适的方法分离。

如果先使聚合物衍生物沉淀，则可例如将反应混合物与至少一种不同于反应混合物中溶剂或溶剂混合物的溶剂或溶剂混合物在合适的温度下接触。根据本发明特别优选的实施方案，其中使用水性介质，优选水，作为溶剂，反应混合物与2-丙醇或丙酮与乙醇的混合物，优选1∶1混合物(v/v)(表示等体积的所述化合物)，在优选-20至+50℃，特别优选-20至25℃的温度下接触。

聚合物衍生物可采用合适的方法分离，该方法可包括一个或多个步骤。根据本发明优选实施方案，先采用合适的方法，如离心或过滤，从反应混合物或反应混合物与例如2-丙醇水性混合物的混合物中分离聚合物衍生物。第二步骤中，所分离的聚合物衍生物可进一步处理，如透析、离心过滤或加压过滤、离子交换层析、反向层析、HPLC、MPLC、凝胶过滤和/或冻干等后处理。根据甚至更优选的实施方案，所分离的聚合物衍生物先透析，优选用水进行透析，然后冻干，直到反应产物的溶剂含量足够低，符合产物所需的要求。冻干可在20至35℃，优选20至30℃的温度下进行。

根据优选实施方案，氧化反应产生的氧化聚合物采用至少一种合适的方法纯化，如超滤和/或透析，以便例如除去不需要的低分子量盐类和聚合物成分，从而也提供控制氧化聚合物的分子量范围的方法。

氧化的聚合物可直接用于与蛋白质反应或在第一步中适当回收，例如利用冻干法回收，然后再溶于水中，用于在第二步中与蛋白质偶联。关于蛋白质的至少一个氨基与聚合物的至少一个醛基通过还原性胺化进行的偶联，可参见上述有关还原性胺化反应的具体反应参数如pH或温度的详细描述。

根据第二个优选实施方案，聚合物与至少双官能化合物反应，该至少双官能化合物包含至少一个可与聚合物反应的官能团M和至少一个可与蛋白质的氨基进行还原性胺化反应且为醛基或酮基或半缩醛基的官能团Q。

氧化的聚合物可直接用于与蛋白质反应或在第一步中适当回收，例如利用冻干法回收，然后再溶于水中，用于在第二步中与蛋白质偶联。关于蛋白质的至少一个氨基与聚合物的至少一个醛基通过还原性胺化进行的偶联，可参见上述有关还原性胺化反应的具体反应参数如pH或温度的详细描述。根据本发明特别优选的实施方案，还原性胺化优选在0至5℃，如大约4℃的温度下，在约pH 4.5至5.5，如大约5.0下进行，反应时间约20至30小时，如大约24小时。

根据第二个优选实施方案，聚合物与至少双官能化合物反应，该至少双官能化合物包含至少一个可与聚合物反应的官能团M及至少一个可与蛋白质的氨基进行还原性胺化反应且为醛基或酮基或半缩醛基的官能团Q。

优选使用的化合物中除了醛基或酮基或半缩醛基外，还包含至少一个羧基或至少一个反应性羧基，优选一个羧基或一个反应性羧基。该醛基或酮基或半缩醛基与该羧基或反应性羧基可被任何合适的间隔基分隔。其中间隔基可以是任选取代的直链、分支和/或环状烃残基。通常，该烃残基具有1至60个，优选1至40个，更优选1至20个，更优选2至10个，更优选2至6个，特别优选2至4个碳原子。如果存在杂原子，该分隔基通常包含1至20个，优选1至8个，特别优选1至4个杂原子。该烃残基可包含具有例如5至7个碳原子的任选分支的烷基链或芳基或环烷基，或者是芳烷基、烷芳基，其中烷基部份可以是直链和/或环状烷基。根据甚至更优选的实施方案，该烃残基是具有5至7个，优选6个碳原子的芳基残基。该烃残基最优选地是苯残基。根据该优选实施方案，羧基和醛基可位于苯环1，4-位、1，3-位或1，2-位，优选1，4-位。

作为反应性羧基，可提到反应性酯、异硫氰酸酯或异氰酸酯。优选的反应性酯衍生自N-羟基琥珀酰亚胺类，如N-羟基琥珀酰亚胺或磺基-N-羟基琥珀酰亚胺，适当取代的苯酚类，如对硝基苯酚、邻，对-二硝基苯酚、邻，邻′-二硝基苯酚、三氯苯酚，如2，4，6-三氯苯酚或2，4，5-三氯苯酚、三氟苯酚，如2，4，6-三氟苯酚或2，4，5-三氟苯酚、五氯苯酚、五氟苯酚，或羟基唑类，如羟基苯并三唑。特别优选的是N-羟基琥珀酰亚胺类，特别优选N-羟基琥珀酰亚胺和磺基-N-羟基琥珀酰亚胺。所有醇类均可单独使用或两种或多种组合使用。特别优选的反应性酯是五氟苯基酯与N-羟基琥珀酰亚胺酯。

因此，根据优选实施方案，本发明涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中聚合物与甲酰基苯甲酸反应。

根据另一个优选实施方案，本发明涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中聚合物与甲酰基苯甲酸五氟苯基酯反应。

根据另一个优选实施方案，本发明涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中聚合物与甲酰基苯甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯反应。

根据另一个实施方案，本发明涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中聚合物与4-(4-甲酰基-3，5-二甲氧基苯氧基)丁酸反应。

与包含M(其中M优选的是羧基或反应性羧基)和Q(其中Q是醛基或酮基或半缩醛基)的化合物反应的羟乙基淀粉最优选的是平均分子量约10kD，DS约0.7的羟乙基淀粉。也可能是平均分子量约10kD，DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约12kD，DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约12kD，DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约18kD，DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约18kD，DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约50kD，DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约50kD，DS约0.7的羟乙基淀粉。特别优选地使用具有氧化型还原端的羟烷基淀粉，甚至更优选羟乙基淀粉。

所产生的具有醛基或酮基或半缩醛基的聚合物衍生物然后与蛋白质的氨基进行还原性胺化反应。关于蛋白质的至少一个氨基与聚合物的至少一个醛基或酮基或半缩醛基通过还原性胺化进行的偶联，可参见上述有关还原性胺化反应的具体反应参数如pH或温度的详细描述。根据本发明特别优选的实施方案，与蛋白质的氨基的反应优选在0至40℃，更优选0至25℃，特别优选4至21℃的温度下进行。优选反应时间范围为30分钟至72小时，更优选2至48小时，特别优选4小时至17小时。反应溶剂优选水性介质。反应介质的pH值优选为4至9，更优选4至8，特别优选4.5至5.5。

根据第三个优选实施方案，聚合物中任选氧化的还原端与包含氨基M与官能团Q的至少双官能化合物反应，其中该氨基M与聚合物的任选氧化的还原端反应，而官能团Q则经化学修饰，产生醛官能化的聚合物衍生物，该衍生物再与蛋白质的氨基进行还原性胺化反应。

对于官能团Q，特别可提到下列官能团：

-C-C-双键或C-C-三键或芳香族C-C-键；

-硫基或羟基；

-烷基磺酸酰肼、芳基磺酸酰肼；

-1，2-二元醇类；

-1，2-氨基-硫醇类；

-叠氮化物；

-1，2-氨基醇类；

-氨基-NH₂或包含结构单位-NH-的氨基衍生物，如氨基烷基、氨基芳基、氨基芳烷基或烷芳基氨基；

-羟基氨基-O-NH₂，或包含结构单位-O-NH-的羟基氨基的衍生物，如羟基烷基氨基、羟基芳基氨基、羟基芳烷基氨基或羟基烷芳基氨基；

-烷氧基氨基、芳氧基氨基、芳烷氧基氨基或烷芳氧基氨基，其各包含结构单位-NH-O-；

-具有羰基-Q-C(＝G)-M的残基，其中G为O或S，M为例如：

---OH或-SH；

--烷基氧基、芳基氧基、芳烷基氧基或烷芳基氧基；

--烷基硫基、芳基硫基、芳烷基硫基或烷芳基硫基；

--烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、芳烷基羰基氧基、烷芳基羰基氧基；

--活化的酯，如羟胺的酯，其具有如N-羟基琥珀酰亚胺的亚胺结构或具有结构单位O-N，其中N为杂芳基化合物的一部份，或其中G＝O且Q不存在，如具有取代芳基残基如五氟苯基、对硝基苯基或三氯苯基的芳氧基化合物；

其中Q不存在或是NH或杂原子，如S或O；

--NH-NH₂或-NH-NH-；

--NO₂；

-腈基；

-羰基，如醛基或酮基；

-羧基；

--N＝C＝O基团或-N＝C＝S基团；

-乙烯基卤化物基团，如乙烯基碘化物或乙烯基溴化物基团或三氟甲磺酸根；

--C≡C-H；

--(C＝NH₂Cl)-O烷基

--(C＝O)-CH₂-Hal基团，其中Hal为Cl、Br或I；

--CH＝CH-SO₂-；

-包含结构-S-S-的二硫化物基团；

-基团

-基团

根据本发明优选实施方案，术语″官能团Q″是指一种包含化学结构-NH-的官能团Q。

根据本发明一个优选实施方案，官能团M是具有结构R′-NH-的基团，其中R′是氢或烷基、环烷基、芳基、芳烷基、芳基环烷基、烷芳基或环烷基芳基残基，其中环烷基、芳基、芳烷基、芳基环烷基、烷芳基或环烷基芳基残基可直接连接到NH基团，或者根据另一个实施方案，可以通过氧桥连接到NH基团。烷基、环烷基、芳基、芳烷基、芳基环烷基、烷芳基或环烷基芳基残基可以适当取代。优选的取代基可提到卤素，如F、Cl或Br。特别优选的残基R′是氢、烷基和烷氧基，甚至更优选的是氢和未取代的烷基和烷氧基。

在烷基和烷氧基中，优选含1、2、3、4、5或6个碳原子的基团。更优选的是甲基、乙基、丙基、异丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基和异丙氧基。特别优选的是甲基、乙基、甲氧基、乙氧基，特别优选甲基或甲氧基。

根据本发明另一个实施方案，官能团M具有结构R′-NH-R″-，其中R″优选包含结构单位-NH-和/或结构单位-(C＝G)-，其中G为O或S，和/或结构单位-SO₂-。官能团R″的具体实例是

和

其中如果G出现两次，则分别独立地是O或S。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中官能团M选自：

H₂N-

其中G为O或S，并且如果出现两次，则分别独立地是O或S，且R′是甲基。

根据本发明特别优选的实施方案，官能团M是氨基-NH₂。

术语″氨基Q″是指一种包含化学结构-NH-的官能团Q。

根据本发明优选实施方案，官能团Q是具有结构R′-NH-的基团，其中R′是氢或烷基、环烷基、芳基、芳烷基、芳基环烷基、烷芳基或环烷基芳基残基，其中环烷基、芳基、芳烷基、芳基环烷基、烷芳基或环烷基芳基残基可直接连接到NH基团，或者根据另一个实施方案，可利用氧桥连接到NH基团。烷基、环烷基、芳基、芳烷基、芳基环烷基、烷芳基或环烷基芳基残基可适当取代。优选的取代基可提到卤素，如F、Cl或Br。特别优选的残基R′是氢、烷基和烷氧基，甚至更优选的是氢和未取代的烷基和烷氧基。

在烷基和烷氧基中，优选含1、2、3、4、5或6个碳原子的基团。更优选的是甲基、乙基、丙基、异丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基和异丙氧基。特别优选的是甲基、乙基、甲氧基、乙氧基，特别优选甲基或甲氧基。

根据本发明另一个实施方案，官能团Q具有结构R′-NH-R″-，其中R″优选包含结构单位-NH-和/或结构单位-(C＝G)-，其中G为O或S，和/或结构单位-SO₂-。根据更优选的实施方案，官能团R″选自：

和

其中如果G出现两次，则分别独立地是O或S。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中官能团Q选自：

H₂N-

其中G为O或S，如果出现两次，则分别独立地是O或S，且R′为甲基。

根据本发明特别优选的实施方案，官能团Q是氨基-NH₂。

根据本发明另一个优选实施方案，M和Q二者均包含氨基-NH-。根据特别优选的实施方案，M和Q二者均为氨基-NH₂。

根据本发明优选实施方案，包含M和Q的化合物是均双官能化合物，更优选的是最优选包含氨基-NH₂，或者根据其它实施方案，包含羟基氨基-O-NH₂或如下基团作为官能团M和Q的均双官能化合物

G优选为O。这些包含M和Q的化合物的具体实例是

或

或

与包含M(M优选为氨基-NH-，更优选为氨基-NH₂，再更优选M和Q均包含氨基-NH-，特别优选M和Q均包含氨基-NH₂)的化合物反应的羟乙基淀粉优选平均分子量约10kD，DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约10kD，DS约0.7的羟乙基淀粉。也可能是平均分子量分子量约12kD，DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约12kD，DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约18kD，DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约18kD，DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约50kD，DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约50kD，DS约0.7的羟乙基淀粉。

如果M和Q二者都是氨基-NH₂，M和Q可利用任何合适的间隔基分隔。其中间隔基可以是任选取代的直链、分支和/或环状烃残基，通常，该烃残基具有1至60个，优选1至40个，更优选1至20个，更优选2至10个，更优选2至6个，特别优选2至4个碳原子。如果存在杂原子，该分隔基团通常包含1至20个，优选1至8个，特别优选1至4个杂原子。该烃残基可包含具有例如5至7个碳原子的任选分支的烷基链或芳基或环烷基，或者是芳烷基、烷芳基，其中烷基部份可以是直链和/或环状烷基。根据甚至更优选的实施方案，烃残基为1至20个，优选2至10个，更优选为2至6个，特别优选2至4个碳原子的烷基链。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中该聚合物与1，4-二氨基丁烷、1，3-二氨基丙烷或1，2-二氨基乙烷反应，产生聚合物衍生物。

包含M和Q的至少双官能化合物与聚合物的反应优选在0至100℃，更优选4至80℃，特别优选20至80℃的温度下进行；优选反应时间范围为4小时至7天，更优选10小时至5天，特别优选17至4小时。至少双官能化合物∶聚合物的优选摩尔比为10至200，特别是50至100。

至少双官能化合物与聚合物反应的溶剂，优选至少一种非质子溶剂，特别优选水含量不超过0.5％重量比，优选不超过0.1％重量比的无水非质子溶剂。合适的溶剂特别是二甲亚砜(DMSO)、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺(DMA)、二甲基甲酰胺(DMF)和其中两种或多种的混合物。

也可使用水性介质作为至少双官能化合物与聚合物反应的溶剂。

根据优选实施方案，包含聚合物和至少双官能化合物的聚合物衍生物在游离官能团Q处化学修饰，产生包含醛基或酮基或半缩醛基的聚合物衍生物。根据该实施方案，优选使聚合物衍生物与包含可与官能团Q反应的官能团和醛基或酮基或半缩醛基的至少一种至少双官能化合物反应。

各种具有醛基或酮基或半缩醛基和至少一个可与聚合物衍生物的官能团Q形成连接的官能团的化合物适于作为至少双官能化合物。该至少一个官能团选自与Q相同的官能团集合，并且选择为可与Q反应。在Q为氨基-NH₂的优选例子中，优选使用除了醛基或酮基或半缩醛基外，还包含至少一个羧基或至少一个反应性羧基，优选一个羧基或一个反应性羧基的化合物。该醛基或酮基或半缩醛基与该羧基或反应性羧基可利用任何合适的间隔基分隔。其中间隔基可以是任选取代的直链、分支和/或环状烃残基。通常，该烃残基具有1至60个，优选1至40个，更优选1至20个，更优选2至10个，更优选2至6个，特别优选2至4个碳原子。如果存在杂原子，该分隔基通常包含1至20个，优选1至8个，特别优选1至4个杂原子。该烃残基可包含具有例如5至7个碳原子的任选分支的烷基链或芳基或环烷基，或者是芳烷基、烷芳基，其中烷基部份可以是直链和/或环状烷基。根据甚至更优选的实施方案，该烃残基是具有5至7个，优选6个碳原子的芳基残基。该烃残基最优选的是苯残基。根据该优选实施方案，羧基和醛基可位于苯环1，4-位、1，3-位或1，2-位，优选1，4-位。

作为反应性羧基可提到反应性酯、异硫氰酸酯或异氰酸酯。优选的反应性酯衍生自：N-羟基琥珀酰亚胺类，如N-羟基琥珀酰亚胺或磺基-N-羟基琥珀酰亚胺，适当取代的苯酚类，如对硝基苯酚、邻，对-二硝基苯酚、邻，邻′-二硝基苯酚、三氯苯酚，如2，4，6-三氯苯酚或2，4，5-三氯苯酚、三氟苯酚，如2，4，6-三氟苯酚或2，4，5-三氟苯酚、五氯苯酚、五氟苯酚，或羟基唑类，如羟基苯并三唑。特别优选的是N-羟基琥珀酰亚胺类，特别优选N-羟基琥珀酰亚胺和磺基-N-羟基琥珀酰亚胺。所有醇类均可单独使用或两种或多种适当组合使用。特别优选五氟苯基酯和N-羟基琥珀酰亚胺酯作为反应性酯。

因此，根据优选实施方案，本发明涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中包含Q的聚合物衍生物(Q为氨基-NH₂)进一步与甲酰基苯甲酸反应。

根据另一个实施方案，本发明涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中包含Q的聚合物衍生物(Q为氨基)进一步与甲酰基苯甲酸五氟苯基酯反应。

根据另一个实施方案中，本发明涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中包含Q的聚合物衍生物(Q为氨基)进一步与甲酰基苯甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯反应。

根据另一个实施方案，本发明涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中包含Q的聚合物衍生物(Q为氨基)进一步与4-(4-甲酰基-3，5-二甲氧基苯氧基)丁酸反应。

对于包含氨基的聚合物衍生物与例如甲酰基苯甲酸的反应溶剂，优选至少一种非质子溶剂，特别优选水含量不超过0.5％重量比，优选不超过0.1％重量比的无水非质子溶剂。合适的溶剂特别是二甲亚砜(DMSO)、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺(DMA)、二甲基甲酰胺(DMF)和其中两种或多种的混合物。

该反应优选在0至40℃，更优选0至25℃，特别优选15至25℃的温度下进行，反应时间优选为0.5至24小时，特别优选1至17小时。

根据优选实施方案，该反应在活化剂的存在下进行。合适的活化剂特别是碳二亚胺类，如二异丙基碳二亚胺(DIC)、二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)，特别优选二异丙基碳二亚胺(DIC)。

所得聚合物衍生物可以采用至少一种合适的方法从反应混合物中纯化。必要时，该聚合物衍生物可先沉淀，然后再采用至少一种合适的方法分离。

如果先使聚合物衍生物沉淀，则可能例如将反应混合物与至少一种不同于反应混合物中溶剂或溶剂混合物的溶剂或溶剂混合物在合适的温度下接触。根据本发明特别优选的实施方案，其中使用水性介质，优选水作为溶剂，反应混合物与2-丙醇或丙酮与乙醇的混合物，优选1∶1混合物(v/v)(表示等体积的所述化合物)，在优选-20至+50℃，特别优选-20至25℃的温度下接触。

聚合物衍生物的分离可以采用可包括一个或多个步骤的适当方法进行。根据本发明优选实施方案，先利用适当的方法，如离心或过滤，从反应混合物或反应混合物与例如2-丙醇水性混合物的混合物中分离聚合物衍生物。第二步骤中，分离的聚合物衍生物可进一步处理，如透析、离心过滤或加压过滤、离子交换层析、反向层析、HPLC、MPLC、凝胶过滤和/或冻干等后处理。根据本发明甚至更优选的实施方案，先透析所分离的聚合物衍生物，优选相对于水透析，然后冻干，直到反应产物的溶剂含量足够低，符合产物所需的要求。冻干可在20至35℃，优选20至30℃的温度下进行。

所得含醛基或酮基或半缩醛基的聚合物衍生物继续与蛋白质的氨基进行还原性胺化反应。关于蛋白质的至少一个氨基与聚合物的至少一个醛基或酮基或半缩醛基通过还原性胺化进行的偶联，可参见上述有关还原性胺化反应的具体反应参数如pH或温度的详细描述。根据本发明特别优选的实施方案，还原性胺化在0至10℃，如大约1至8℃或2至6℃，如大约4℃的温度下，在pH4.5至5.5，如大约5.0下进行。反应时间约10至20小时，如12至19小时或14至18小时，如大约17小时或大约20至30小时，如大约24小时。

因此，根据上述优选实施方案，当聚合物通过其氧化的还原端反应时，本发明也涉及如下式的偶联物：

根据特别优选的实施方案，该聚合物是羟乙基淀粉，即HAS′是HES′，且n＝2、3或4，最优选4，如上所述。因此，当聚合物通过其氧化的还原端反应时，本发明也涉及如下式的偶联物

根据另一个优选实施方案，当聚合物通过其氧化的还原端反应时，本发明也涉及如下式的偶联物

其中n＝2、3或4，R₄独立地是氢或甲氧基，并且当R₄为氢时，m＝0，当R₄为甲氧基时，m＝1，HAS优选为HES′。

在上述各式中，与蛋白质连接的氮来源于蛋白质的氨基，聚合物衍生物则通过醛基连接。

根据上述实施方案，官能团M和Q包含氨基-NH₂，其中M也可能是氨基-NH₂，并且Q包含β-羟基氨基-CH(OH)-CH₂-NH₂，优选β-羟基氨基。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中包含两个氨基M和Q的化合物中的氨基Q是β-羟基氨基-CH(OH)-CH₂-NH₂。

在这种情况下，M和Q可利用任何合适的间隔基分隔。其中间隔基可以是任选取代的直链、分支和/或环状烃残基。通常，该烃残基具有1至60个，优选1至40个，更优选1至20个，更优选2至10个，更优选1至6个，特别优选1至2个碳原子。如果存在杂原子，该分隔基通常包含1至20个，优选为1至8个，特别优选1至4个杂原子。该烃残基可包含具有例如5至7个碳原子的任选分支的烷基链或芳基或环烷基，或者是芳烷基、烷芳基，其中烷基部份可以是直链和/或环状烷基。根据甚至更优选的实施方案，该烃残基是具有1至20个，优选1至10个，更优选1至6个，更优选1至4个碳原子，特别优选1至2个碳原子的烷基链。更优选地，M和Q通过亚甲基分隔。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中该聚合物与1，3-二氨基-2-羟基丙烷反应。

如果聚合物通过其氧化的还原端反应，则产生如下式的聚合物衍生物

其中特别优选HAS′＝HES′。

包含M和Q的至少双官能化合物，特别优选1，3-二氨基-2-羟基丙烷，与聚合物的反应优选在40至120℃，更优选40至90℃，特别优选60至80℃的温度下进行。优选反应时间范围为17至168小时，更优选17至96小时，特别优选48至96小时。至少双官能化合物∶聚合物的优选摩尔比范围为200∶1至10∶1，特别是50∶1至100∶1。

对于该至少双官能化合物与聚合物的反应溶剂，优选至少一种非质子溶剂，优选水含量不超过0.5％重量比，优选不超过0.1％重量比的无水非质子溶剂。合适的溶剂特别是二甲亚砜(DMSO)、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺(DMA)、二甲基甲酰胺(DMF)和其中两种或多种的混合物。

聚合物衍生物的β-羟基氨基Q通常可与至少双官能化合物反应，后者包含至少一个可与Q反应的官能团，并且还包含至少一个是醛基或酮基或半缩醛基的官能团或可经修饰产生醛基或酮基或半缩醛基的官能团。根据本发明另一个实施方案，该β-羟基氨基经化学氧化直接进行化学修饰，产生醛基。

该氧化反应可使用所有可将β-羟基氨基转化成醛基的合适氧化剂进行。优选的氧化剂是高碘酸盐，如碱金属高碘酸盐。特别优选高碘酸钠，优选用其水溶液。该溶液的优选碘酸根浓度为1至50mM，更优选1至25mM，特别优选1至10mM。该氧化反应在0至40℃，优选0至25℃，特别优选4至20℃的温度下进行。

所得聚合物衍生物可采用至少一种合适的方法从反应混合物中纯化。需要时，聚合物衍生物可先沉淀，然后再采用至少一种合适的方法分离。

如果先使聚合物衍生物沉淀，则可以例如将反应混合物与至少一种不同于反应混合物中溶剂或溶剂混合物的溶剂或溶剂混合物在合适的温度下接触。根据本发明特别优选的实施方案，其中使用水性介质，优选水，作为溶剂，反应混合物与2-丙醇或丙酮与乙醇的混合物，优选1∶1混合物(v/v)(表示等体积的所述化合物)，优选在-20至+50℃，特别优选-20至25℃的温度下接触。

聚合物衍生物的分离可采用可包括一个或多个步骤的适当方法进行。根据本发明优选实施方案，先采用合适的方法，如离心或过滤，从反应混合物或反应混合物与例如2-丙醇水性混合物的混合物中分离聚合物衍生物。第二步骤中，所分离的聚合物衍生物可进一步处理，如透析、离心过滤或加压过滤、离子交换层析、反向层析、HPLC、MPLC、凝胶过滤和/或冻干等后处理。根据甚至更优选的实施方案，所分离的聚合物衍生物先透析，优选相对于水透析，然后冻干，直到反应产物的溶剂含量足够低，符合产物所需的要求。冻干可在20至35℃，优选20至30℃的温度下进行。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中β-羟基氨基Q的氧化用高碘酸盐进行。

因此，本发明也涉及一种制备偶联物的方法，其中当使用的聚合物具有氧化的还原端时，优选使用高碘酸盐氧化具有β-羟基氨基的聚合物衍生物，特别优选

并且特别是HAS′＝HES′，产生具有醛基的聚合物衍生物，特别优选

并且特别是HAS′＝HES′。

所产生的具有醛基A的聚合物衍生物继续与蛋白质反应。因此，本发明也涉及一种制备偶联物的方法，该方法包括具有β-羟基氨基的聚合物衍生物，当所使用的聚合物具有氧化的还原端时，特别优选如下式

并且特别是HAS′＝HES′，与蛋白质的氨基反应。

所产生的具有醛基的聚合物衍生物继续与蛋白质的氨基进行还原性胺化反应。有关蛋白质的至少一个氨基与聚合物的至少一个醛基利用还原性胺化进行的偶联，可参见上文的详细内容。

因此，根据上述优选实施方案，本发明也涉及一种如下式的偶联物

特别是HAS′＝HES′，当所使用的聚合物具有氧化的还原端时。在上式中，与蛋白质连接的氮来源于蛋白质的氨基，聚合物衍生物则通过醛基连接。

根据本发明另一个实施方案，聚合物先与合适的化合物反应，产生包含至少一个反应性羧基的第一聚合物衍生物。该第一聚合物衍生物再与另一种至少双官能化合物反应，其中该另一种化合物的至少一个官能团与聚合物衍生物的至少一个反应性羧基反应，并且该另一种化合物的至少另一个官能团是醛基或酮基或半缩醛基，或者是可经化学修饰产生醛基或酮基或半缩醛基的官能团，其中所产生的包含该醛基或酮基或半缩醛基的聚合物衍生物如上所述，通过还原性胺化，与蛋白质的至少一个氨基反应。也可能改变各化合物的相互反应顺序。

根据该另一个实施方案的第一种替代方案，包含至少一个反应性羧基的聚合物的制备方法包括在聚合物的还原端选择性氧化该聚合物，然后使已成为内酯

和/或羧酸

或羧酸的合适盐，如碱金属盐，优选钠盐和/或钾盐，且HAS′优选为HES′的氧化聚合物，与合适的化合物反应，产生包含至少一个反应性羧基的聚合物。

聚合物，优选羟乙基淀粉的氧化可根据产生具有上述结构(IIa)和/或(IIb)的化合物的各方法或方法组合进行。

虽然氧化反应可根据所有产生羟烷基淀粉的氧化还原端的合适的一种或多种方法进行，但优选采用例如DE 196 28 705 A1所述的碱性碘溶液进行，该文献的内容(实施例A，第9栏，第6至24行)在此引用作为参考。

向还原端已选择性氧化的聚合物中引入反应性羧基可以采用所有可能的方法和所有合适的化合物进行。

根据本发明一个具体方法，还原端已选择性氧化的聚合物在其氧化的还原端与至少一种醇反应，优选与至少一种酸性醇，如25℃下的pK_A值为6至12或7至11的酸性醇反应。该酸性醇的分子量范围可以是80至500克/摩尔，如90至300克/摩尔或100至200克/摩尔。

合适的酸性醇是所有具有酸性质子且可与氧化的聚合物反应形成各反应性聚合物酯的醇H-O-R_A，优选如下式

更优选如下式

优选的醇是N-羟基琥珀酰亚胺类，如N-羟基琥珀酰亚胺或磺基-N-羟基琥珀酰亚胺，适当取代的苯酚类，如对硝基苯酚、邻，对-二硝基苯酚、邻，邻′-二硝基苯酚、三氯苯酚，如2，4，6-三氯苯酚或2，4，5-三氯苯酚、三氟苯酚，如2，4，6-三氟苯酚或2，4，5-三氟苯酚、五氯苯酚、五氟苯酚，或羟基唑类，如羟基苯并三唑。特别优选的是N-羟基琥珀酰亚胺类，特别优选N-羟基琥珀酰亚胺和磺基-N-羟基琥珀酰亚胺。所有醇均可单独使用或其两种或多种适当组合使用。在本发明内容中，也可能使用例如通过添加碳酸的二酯而释放醇的化合物。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法，其中在还原端选择性氧化的聚合物通过该氧化的聚合物与酸性醇，优选与N-羟基琥珀酰亚胺和/或磺基-N-羟基琥珀酰亚胺反应而活化。

根据本发明优选实施方案，还原端选择性氧化的聚合物在其氧化的还原端与至少一种碳酸二酯R_B-O-(C＝O)-O-R_C反应，其中R_B与R_C可相同或不同。优选地，该方法产生如下式的反应性聚合物

其中HAS′优选为HES′。

合适的碳酸二酯化合物可使用其醇成分分别独立为下列基团的化合物：N-羟基琥珀酰亚胺类，如N-羟基琥珀酰亚胺或磺基-N-羟基琥珀酰亚胺，适当取代的苯酚类，如对硝基苯酚、邻，对-二硝基苯酚、邻，邻′-二硝基苯酚、三氯苯酚，如2，4，6-三氯苯酚或2，4，5-三氯苯酚、三氟苯酚，如2，4，6-三氟苯酚或2，4，5-三氟苯酚、五氯苯酚、五氟苯酚，或羟基唑类，如羟基苯并三唑。特别优选N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯和磺基-N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯，特别优选N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法，其中还原端选择性氧化的聚合物通过该氧化的聚合物与N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯反应而活化。

酸性醇与氧化的聚合物或氧化的聚合物的盐反应的摩尔比是酸性醇∶聚合物优选为5∶1至50∶1，更优选8∶1至20∶1，优选反应温度为2至40℃，更优选10至30℃，特别优选15至25℃。优选反应时间为1至10小时，更优选2至5小时，更优选2至4小时，特别是2至3小时。

碳酸二酯化合物与氧化的聚合物或氧化的聚合物的盐反应的摩尔比一般是二酯化合物∶聚合物为1∶1至3∶1，如1∶1至1.5∶1。反应时间一般是0.1至12小时，如0.2至6小时，或0.5至2小时或0.75至1.25小时。

根据本发明优选实施方案，氧化的聚合物与酸性醇和/或碳酸二酯的反应在至少一种非质子溶剂中，如水含量不超过0.5％重量比，优选不超过0.1％重量比的无水非质子溶剂中进行。合适的溶剂特别是二甲基亚砜(DMSO)、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺(DMA)、二甲基甲酰胺(DMF)和其中两种或多种的混合物。优选反应温度为2至40℃，更优选10至30℃。

氧化的聚合物与至少一种酸性醇的反应中使用至少另一种活化剂。

合适的活化剂特别是羰基二咪唑、碳二亚胺，如二异丙基碳二亚胺(DIC)、二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)，特别优选二环己基碳二亚胺(DCC)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中还原端已氧化的聚合物与酸性醇，在另一种活化剂的存在下反应，产生反应性聚合物酯。

根据本发明一个实施方案，氧化的聚合物与碳酸二酯和/或酸性醇的反应在低碱活性下进行，该活性可通过以10∶1的水∶反应混合物体积比将反应混合物添加至水中来确定。添加之前，基本上不包含缓冲液的水在25℃下的pH值为7。添加反应混合物后测定pH值，反应混合物的碱活性值优选不超过9.0，更优选不超过8.0，特别优选不超过7.5。

根据本发明另一个实施方案，氧化的聚合物与N-羟基琥珀酰亚胺在无水DMA中，在没有水的存在下，使用EDC进行反应，选择性产生如下式的聚合物N-羟基琥珀酰亚胺酯

HAS′更优选为HES′。

令人惊讶的是，该反应不产生因EDC与HES的OH基团反应而产生的副产物，并且意外地抑制了EDC与氧化聚合物所形成的O-酰基异脲形成各N-酰基脲的重排反应。

因此，根据本发明另一个优选实施方案，氧化的聚合物与N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯在无水DMF中，在没有水及活化剂的存在下反应，选择性产生如下式的N-羟基琥珀酰亚胺酯

其中HAS′更优选为HES′。

根据本发明另一个实施方案，还原端选择性氧化的聚合物在氧化的还原端处与唑化物如羰基二咪唑或羰基二苯并咪唑反应，产生具有反应性羧基的聚合物。如果使用羰基二咪唑，得到如下式的反应性咪唑化物聚合物衍生物

其中HAS′优选为HES′。

根据本发明该另一个实施方案的第二替代方案，关于向聚合物中引入至少一个反应性羧基，通过聚合物的至少一个羟基与碳酸二酯反应，向还原端未氧化的聚合物中引入该反应性羧基。

因此，本发明也涉及一种方法和偶联物，其中通过聚合物的至少一个羟基与至少一种碳酸二酯R_B-O-(C＝O)-O-R_C(其中R_B与R_C可相同或不同)反应，向还原端未氧化的聚合物中引入反应性羧基。

根据本发明另一个实施方案，还原端未氧化的聚合物在至少一个羟基上与唑化物如羰基二咪唑、羰基-二-(1，2，4-三唑)或羰基二苯并咪唑反应，产生具有反应性羧基的聚合物。

合适的碳酸二酯化合物可以使用其醇成分独立地是下列基团的化合物：N-羟基琥珀酰亚胺类，如N-羟基琥珀酰亚胺或磺基-N-羟基琥珀酰亚胺，适当取代的苯酚类，如对硝基苯酚、邻，对-二硝基苯酚、邻，邻′-二硝基苯酚、三氯苯酚，如2，4，6-三氯苯酚或2，4，5-三氯苯酚、三氟苯酚，如2，4，6-三氟苯酚或2，4，5-三氟苯酚、五氯苯酚、五氟苯酚，或羟基唑类，如羟基苯并三唑。

特别优选对称性碳酸二酯化合物，因此R_B与R_C相同。碳酸二酯的醇成分优选选自：N-羟基琥珀酰亚胺、磺酸化N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基苯并三唑和硝基-及卤素-取代的苯酚类。其中优选硝基苯酚、二硝基苯酚、三氯苯酚、三氟苯酚、五氯苯酚和五氟苯酚。特别优选的是N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯和磺基-N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯，特别优选N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯。

因此，本发明也涉及一种羟烷基淀粉衍生物，优选羟乙基淀粉衍生物，其中该淀粉的至少一个羟基，优选至少两个羟基已与碳酸二酯化合物反应，产生各反应性酯。

根据本发明优选实施方案，还原端未氧化的聚合物与至少一种碳酸二酯化合物的反应在2至40℃，更优选10至30℃，特别是15至25℃的温度下进行，优选反应时间为0.5至5小时，更优选1至3小时，特别优选2至3小时。

碳酸二酯化合物∶聚合物的摩尔比取决于聚合物的取代程度，即与碳酸二酯化合物反应的羟基数与未反应的聚合物中羟基数的相对比例。

根据本发明一个优选实施方案，碳酸二酯化合物∶无水葡萄糖单位的摩尔比为1∶2至1∶1000，更优选1∶3至1∶100，特别优选1∶10至1∶50，所产生的取代程度为0.5至0.001，优选为0.33至0.01，特别优选0.1至0.02。

根据本发明优选实施方案，还原端未氧化的聚合物与碳酸二酯的反应在至少一种非质子溶剂中进行，特别优选在水含量不超过0.5％重量比，优选不超过0.1％重量比的无水非质子溶剂中进行。合适的溶剂特别是二甲亚砜(DMSO)、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺(DMA)、二甲基甲酰胺(DMF)和其中两种或多种的混合物。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中还原端未氧化的聚合物的至少一个羟基与碳酸二酯反应产生反应性羧基的反应在无水非质子性极性溶剂中进行，该溶剂优选为二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺或其混合物。

包含至少一个反应性羧基的反应性聚合物衍生物，优选如上述由聚合物与酸性醇、碳酸酯和/或唑化物反应产生的，进一步与另一种至少双官能化合物反应，其中该另一种化合物的至少一个官能团F₁与聚合物衍生物的至少一个反应性羧基反应。该另一种化合物的至少一个官能团F₁没有明确限制，只要可与聚合物的至少一个反应性羧基反应即可。优选的官能团F₁是例如：氨基或羟基或硫基或羧基。

该另一种至少双官能化合物包含至少另一个为醛基的官能团F₂或可经化学修饰产生醛基的官能团F₂。该化学修饰可以是，例如，官能团F₂与另一种连接化合物的官能团F₃反应，或氧化或还原合适的官能团F₂。

如果F₂与另一种化合物的官能团F₃反应，官能团F₂特别可选自：

-C-C-双键或C-C-三键或芳香族C-C-键；

-硫基或羟基；

-烷基磺酸酰肼、芳基磺酸酰肼；

-1，2-二元醇；

-1，2-氨基醇类；

-1，2-氨基-硫醇类；

-叠氮化物；

-氨基-NH₂或包含结构单位-NH-的氨基衍生物，如氨基烷基、氨基芳基、氨基芳烷基或烷芳基氨基；

-羟基氨基-O-NH₂，或包含结构单位-O-NH-的羟基氨基的衍生物，如羟基烷基氨基、羟基芳基氨基、羟基芳烷基氨基或羟基烷芳基氨基；

-烷氧基氨基、芳氧基氨基、芳烷氧基氨基或烷芳氧基氨基，其各包含结构单位-NH-O-；

-具有羰基-Q-C(＝G)-M的残基，其中G为O或S，M为例如：

---OH或-SH；

--烷基氧基、芳基氧基、芳烷基氧基或烷芳基氧基；

--烷基硫基、芳基硫基、芳烷基硫基或烷芳基硫基；

--烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、芳烷基羰基氧基、烷芳基羰基氧基；

--活化的酯，如羟胺的酯，其具有如N-羟基琥珀酰亚胺的亚胺结构或具有结构单位O-N，其中N为杂芳基化合物的一部份，或其中G＝O且Q不存在，如具有取代芳基残基如五氟苯基、对硝基苯基或三氯苯基的芳氧基化合物；

其中Q不存在或是NH或杂原子，如S或O；

--NH-NH₂或-NH-NH-；

--NO₂；

-腈基；

-羰基，如醛基或酮基；

-羧基；

--N＝C＝O基团或-N＝C＝S基团；

-乙烯基卤化物基团，如乙烯基碘化物或乙烯基溴化物基团或三氟甲磺酸根；

--C≡C-H；

--(C＝NH₂Cl)-O烷基

--(C＝O)-CH₂-Hal基团，其中Hal为Cl、Br或I；

--CH＝CH-SO₂-；

-包含结构-S-S-的二硫化物基团；

-基团

             ；

-基团

其中F₃是可与上述基团之一形成化学键的基团，其优选选自上述基团。此外，第二连接化合物优选具有至少一个可与蛋白质的氨基通过还原性胺化反应的醛基或酮基或半缩醛基。

官能团F₁与该至少双官能连接化合物中与聚合物反应的醛基或酮基或半缩醛基，和/或该至少双官能连接化合物中与聚合物反应的官能团F₁和F₂，和/或该另一种至少双官能连接化合物中的官能团F₃与醛基或酮基或半缩醛基，可分别利用任何合适的间隔基分隔。其中间隔基可以是任选取代的直链、分支和/或环状烃残基。通常，该烃残基具有至多60个，优选至多40个，更优选至多20个，更优选至多10个碳原子。如果存在杂原子，该分隔基通常包含1至20个，优选1至8个，更优选1至6个，更优选1至4个，特别优选1至2个杂原子。优选O作为杂原子。烃残基可包含具有例如5至7个碳原子的任选分支的烷基链或芳基或环烷基，或者是芳烷基、烷芳基，其中烷基部份可以是直链和/或环状烷基。

具有官能团F₁和F₂的化合物的实例有例如：具有2至20个碳原子的任选取代的二氨基烷，特别优选1，2-二氨基乙烷、1，3-二氨基丙烷和1，4-二氨基丁烷。具有官能团F₃和醛基或酮基或半缩醛基的优选化合物实例是例如：甲酰基苯甲酸、4-甲酰基苯甲酸五氟苯基酯、4-甲酰基苯甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和4-(4-甲酰基-3，5-二甲氧基苯氧基)丁酸。

因此，本发明也涉及一种制备偶联物的方法，该方法包括：聚合物，优选羟乙基淀粉，在其任选氧化的还原端与选自下组的化合物反应：酸性醇、碳酸二酯和唑化物，产生包含至少一个反应性羧基的聚合物衍生物，该聚合物衍生物与至少一种至少双官能化合物反应，产生包含醛基或酮基或半缩醛基或可经化学修饰产生醛基或酮基或半缩醛基的官能团的聚合物衍生物，任选地化学修饰该官能团，产生包含醛基或酮基或半缩醛基的聚合物衍生物，再由该包含醛基或酮基或半缩醛基的聚合物衍生物与蛋白质的氨基进行还原性胺化反应。

因此，本发明也涉及一种偶联物，其包含与蛋白质互相共价连接的聚合物，优选羟乙基淀粉，该偶联物可通过制备偶联物的方法获得，该方法包括：聚合物在任选氧化的还原端与选自下组的化合物反应：酸性醇、碳酸二酯和唑化物，产生包含至少一个反应性羧基的聚合物衍生物，该聚合物衍生物与至少一种至少双官能化合物反应，产生包含醛基或酮基或半缩醛基或可经化学修饰产生醛基或酮基或半缩醛基的官能团的聚合物衍生物，任选地化学修饰该官能团，产生包含醛基或酮基或半缩醛基的聚合物衍生物，再由该包含醛基或酮基或半缩醛基的聚合物衍生物与蛋白质的氨基进行还原性胺化反应。

具有官能团F₁和已氧化成醛基的官能团F₂的化合物的一个具体实例是例如：具有氨基作为F₁以及具有β-羟基氨基作为F₂的化合物。特别优选的实例是1，3-二氨基-2-羟基丙烷。该氧化反应可以使用所有可将β-羟基氨基转化成醛基的合适氧化剂进行。优选的氧化剂是高碘酸盐，如碱金属高碘酸盐。特别优选高碘酸钠，优选使用其水溶液。该溶液的优选碘酸根浓度为1至50mM，更优选1至25mM，特别优选1至10mM。该氧化反应在0至40℃，优选0至25℃，特别优选4至20℃的温度下进行。

所产生的聚合物衍生物可采用至少一种合适的方法从反应混合物中纯化。需要时，聚合物衍生物可先沉淀，然后再采用至少一种合适的方法分离。

如果先使聚合物衍生物沉淀，则可例如将反应混合物与至少一种不同于反应混合物中溶剂或溶剂混合物的溶剂或溶剂混合物在合适的温度下接触。根据本发明特别优选的实施方案，其中使用水性介质，优选水，作为溶剂，反应混合物与2-丙醇或丙酮与乙醇的混合物，优选1∶1混合物(v/v)(表示等体积的所述化合物)，在优选-20至+50℃，特别优选-20至25℃的温度下接触。

聚合物衍生物的分离可以采用可包括一个或多个步骤的合适的方法进行。根据本发明优选实施方案，先采用合适的方法，如离心或过滤，从反应混合物或反应混合物与例如2-丙醇水性混合物的混合物中分离聚合物衍生物。第二步中，所分离的聚合物衍生物可进一步处理，如透析、离心过滤或加压过滤、离子交换层析、反向层析、HPLC、MPLC、凝胶过滤和/或冻干等后处理。根据甚至更优选的实施方案，所分离的聚合物衍生物先透析，优选相对于水透析，然后冻干，直到反应产物的溶剂含量足够低，符合产物所需的要求。冻干可在20至35℃，优选20至30℃的温度下进行。

根据本发明另一个优选实施方案，与聚合物或聚合物衍生物的官能团A反应的蛋白质的官能团Z为硫醇基。

该硫醇基可本身存在于蛋白质中。此外，也可能根据合适的方法向蛋白质中引入硫醇基。其中可提到化学方法。如果蛋白质中存在二硫键时，可还原-S-S-结构，得到硫醇基。也可以将多肽中的氨基转化为SH基，其实现方法是多肽通过氨基与具有至少两个不同官能团的化合物反应，其中一个官能团可与氨基反应，另一个则是SH基或SH基的前体，例如N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代丙酸酯或N-琥珀酰亚胺基-3-(吡啶二硫)丙酸酯。也可能利用蛋白质的突变引入SH基，例如向蛋白质中引入另一个半胱氨酸，交换一个氨基酸为半胱氨酸，或者例如从蛋白质中除去一个半胱氨酸，以使蛋白质中另一个半胱氨酸无法形成二硫键。最优选地，聚合物连接到蛋白质的游离半胱氨酸，特别优选Cys 17或Cys 18，其中Cys 17例如存在于Granocyte^中，Cys 18例如存在于Neupogen^中。

根据第一个实施方案，蛋白质的官能团Z为硫醇基，聚合物的官能团A为卤素乙酰基，并且其中A的引入方法包括：聚合物在任选氧化的还原端与具有至少两个官能团且各包含氨基的至少双官能化合物反应，产生具有至少一个包含氨基的官能团的聚合物衍生物，该聚合物衍生物再与单卤素取代的乙酸和/或反应性单卤素取代的乙酸衍生物反应。

对于具有至少两个官能团且各包含氨基的至少双官能化合物，可以是所有可与聚合物的任选氧化的还原端反应产生聚合物衍生物的化合物，该聚合物衍生物包含可与单卤素取代的乙酸和/或反应性单卤素取代的乙酸衍生物反应的氨基。

根据优选实施方案，该至少双官能化合物的一个官能团(该官能团与聚合物的任选氧化的还原端反应)选自：

H₂N-

其中G为O或S，如果出现两次，其分别独立为O或S，R′为甲基。

根据本发明特别优选的实施方案，该至少双官能化合物的官能团(该官能团与任选氧化的还原端反应)是氨基-NH₂。根据另一个优选实施方案，该官能团，最优选氨基，与聚合物的氧化的还原端反应。

根据本发明优选实施方案，该至少双官能化合物的官能团(该官能团与单卤素取代的乙酸和/或反应性单卤素取代的乙酸衍生物反应)是氨基-NH₂。

该至少双官能化合物的官能团，优选均为氨基-NH₂(该官能团与聚合物的任选氧化的还原端，优选氧化的还原端，和单卤素取代的乙酸和/或反应性单卤素取代的乙酸衍生物反应)，可利用任何合适的间隔基分隔。其中间隔基可以是任选取代的直链、分支和/或环状烃残基。合适的取代基特别是烷基、芳基、芳烷基、烷芳基、卤素、羰基、酰基、羧基、羧基酯、羟基、硫基、烷氧基和/或烷硫基。通常，该烃残基具有1至60个，优选1至40个，更优选1至20个，更优选2至10个，更优选2至6个，特别优选2至4个碳原子。如果存在杂原子，该分隔基通常包含1至20个，优选1至8个，特别优选1至4个杂原子。该烃残基可包含具有例如5至7个碳原子的任选分支的烷基链或芳基或环烷基，或者是芳烷基、烷芳基，其中烷基部份可以是直链和/或环状烷基。根据甚至更优选的实施方案，该烃残基是具有1至20个，优选2至10个，特别优选2至8个碳原子的烷基链。因此，优选的至少双官能化合物是双官能团氨基化合物，特别优选1，8-二氨基辛烷、1，7-二氨基庚烷、1，6-二氨基己烷、1，5-二氨基戊烷、1，4-二氨基丁烷、1，3-二氨基丙烷和1，2-二氨基乙烷。

根据另一个优选实施方案，该至少双官能化合物是二氨基聚乙二醇，优选如下式的二氨基聚乙二醇

        H₂N-(CH₂-CH₂-O)_m-CH₂-CH₂-NH₂

其中m是整数，m优选为1、2、3或4。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中聚合物与1，8-二氨基辛烷、1，7-二氨基庚烷、1，6-二氨基己烷、1，5-二氨基戊烷、1，4-二氨基丁烷、1，3-二氨基丙烷和1，2-二氨基乙烷在其氧化的还原端反应，产生如下式的聚合物衍生物

其中n＝2、3、4、5、6、7或8，该聚合物特别优选的是HES。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中聚合物与H₂N-(CH₂-CH₂-O)_m-CH₂-CH₂-NH₂在其氧化的还原端反应，其中m是1、2、3或4，产生如下式的聚合物衍生物

其中m＝1、2、3或4，且聚合物特别优选的是HES。

聚合物，优选羟乙基淀粉的还原端的氧化可根据可产生具有结构(IIa)和/或(IIb)的化合物的各方法或方法组合进行。

虽然氧化可根据所有可产生羟烷基淀粉的氧化的还原端的一种或多种适当方法进行，但优选利用碱性碘溶液进行，例如DE 19628 705 A1所述，其内容(实施例A，第9栏，第6至24行)在此引用作为参考。

聚合物与至少双官能化合物反应产生的聚合物衍生物再与单卤素取代的乙酸和/或反应性单卤素取代的乙酸衍生物反应。

作为单卤素取代的乙酸或反应性酸，优选Cl-取代的、Br-取代的及I-取代的乙酸，特别优选乙酰氯。

如果使用卤素取代的酸本身，优选使酸与聚合物衍生物在活化剂的存在下反应。合适的活化剂特别是碳二亚胺类，如二异丙基碳二亚胺(DIC)、二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)，特别优选二环己基碳二亚胺(DCC)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中聚合物，优选HES，与二氨基化合物，优选含2至8个碳原子的二氨基烷或H₂N-(CH₂-CH₂-O)_m-CH₂-CH₂-NH₂(其中m＝1、2、3或4)反应，所得聚合物衍生物再与Br取代和I取代的乙酸在活化剂，优选EDC的存在下反应。

因此，本发明也涉及一种如下式的聚合物衍生物

其中X＝Cl、Br或I，n＝2、3、4、5、6、7或8，该聚合物特别优选的是HES，或如下式的聚合物衍生物

其中X＝Cl、Br或I，m＝1、2、3或4，该聚合物特别优选的是HES。

聚合物衍生物与卤素取代的乙酸的反应优选在水性系统中，优选在水中，在优选3.5至5.5，更优选4.0至5.0，特别优选4.5至5.0的pH下，在优选4至30℃，更优选15至25℃，特别优选20至25℃的反应温度下进行，优选反应时间为1至8小时，更优选2至6小时，特别优选3至5小时。

包含包括聚合物的聚合物衍生物、至少双官能化合物和卤素取代乙酸的反应混合物可用于与蛋白质本身反应。根据本发明优选实施方案，优选采用超滤，然后沉淀，任选洗涤和真空干燥，从反应混合物中分离聚合物衍生物。

聚合物衍生物与蛋白质的反应优选在水性系统中进行。

聚合物衍生物与蛋白质的反应优选在pH6.5至8.5，更优选7.0至8.5，特别优选7.5至8.5下；在优选4至30℃，更优选15至25℃，特别优选20至25℃的反应温度下进行；反应时间优选为0.5至8小时，更优选1至6小时，特别优选2至5小时。

聚合物衍生物与蛋白质的硫醇基的反应在聚合物衍生物与蛋白质之间产生硫醚键。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中聚合物，优选HES，与二氨基化合物，优选含2至8个碳原子的二氨基烷或H₂N-(CH₂-CH₂-O)_m-CH2-CH₂-NH₂(其中m＝1、2、3或4)反应，所产生的聚合物衍生物再与Br取代和I取代的乙酸在活化剂的存在下，优选在EDC的存在下反应，所产生的聚合物衍生物再与蛋白质的硫醇基反应，产生在蛋白质与聚合物衍生物之间包含硫醚键的偶联物。

因此，本发明也涉及一种如下式的偶联物

其中n＝2、3、4、5、6、7或8，该聚合物特别优选的是HES，或如下式的偶联物

其中m＝1、2、3或4，该聚合物特别优选的是HES。该羟乙基淀粉优选为平均分子量约10kD，DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约10kD，DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约12kD，DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约12kD，DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约18kD，DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约18kD，DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约50kD，DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约50kD，DS约0.7的羟乙基淀粉。

根据第二个实施方案，蛋白质的官能团Z是硫醇基，聚合物的官能团A包含马来酰亚胺基。

根据该实施方案，有数种可能性可产生偶联物。通常，聚合物在其任选氧化的还原端与至少一种至少双官能化合物反应，其中该至少双官能化合物包含一个可与该聚合物中任选氧化的还原端反应的官能团，和至少一个包含马来酰亚胺基或经化学修饰以产生包含马来酰亚胺基的聚合物衍生物的官能团。根据优选实施方案，该官能团经化学修饰，以产生包含马来酰亚胺基的聚合物衍生物。

因此，本发明涉及一种如上所述的方法和偶联物，其通过包含马来酰亚胺基的聚合物衍生物与蛋白质的硫醇基反应产生，该方法包括聚合物在其任选氧化的还原端与包含可与该任选氧化的还原端反应的官能团U的至少双官能化合物反应，该至少双官能化合物还包含可经化学修饰以产生马来酰亚胺基的官能团W，该方法还包括化学修饰官能团W，产生马来酰亚胺基。

官能团U可以是可与聚合物的任选氧化的还原端反应的各官能团。

根据本发明优选实施方案，官能团U包含化学结构-NH-。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中官能团U包含结构-NH-。

根据本发明一个优选实施方案，官能团U是具有结构R′-NH-的基团，其中R′是氢或烷基、环烷基、芳基、芳烷基、芳基环烷基、烷芳基或环烷基芳基残基，其中环烷基、芳基、芳烷基、芳基环烷基、烷芳基或环烷基芳基残基可直接连接到NH基团，或者根据另一个实施方案，可通过氧桥连接到NH基团。该烷基、环烷基、芳基、芳烷基、芳基环烷基、烷芳基或环烷基芳基残基可被适当取代。优选的取代基可以是卤素，如F、Cl或Br。特别优选的残基R′是氢、烷基和烷氧基，甚至更优选的是氢和未取代的烷基和烷氧基。

在烷基和烷氧基中，优选含1、2、3、4、5或6个碳原子的基团。更优选甲基、乙基、丙基、异丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基和异丙氧基。特别优选甲基、乙基、甲氧基、乙氧基，特别优选甲基或甲氧基。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中R′是氢或甲基或甲氧基。

根据本发明另一个优选实施方案，官能团U具有结构R′-NH-R″-，其中R″优选包含结构单位-NH-和/或结构单位-(C＝G)-，其中G为O或S，和/或结构单位-SO₂-。

根据更优选的实施方案，官能团R″选自：

和

其中如果G出现两次，其分别独立为O或S。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中官能团U选自：

H₂N-

其中G为O或S，如果出现两次，其分别独立为O或S，R′是甲基。

根据本发明更优选的实施方案，U包含氨基-NH₂。

根据本发明一个实施方案，通过包含W的聚合物衍生物与另一种包含可与W反应的官能团并且还包含马来酰亚胺基的至少双官能化合物反应，化学修饰该至少双官能化合物的官能团W。

作为官能团W和该另一种至少双官能化合物中可与W反应的官能团，可特别提到下列官能团：

-C-C-双键或C-C-三键或芳香族C-C-键；

-硫基或羟基；

-烷基磺酸酰肼、芳基磺酸酰肼；

-1，2-二元醇；

-1，2-氨基醇类；

-1，2-氨基-硫醇类；

-叠氮化物；

-氨基-NH₂或包含结构单位-NH-的氨基衍生物，如氨基烷基、氨基芳基、氨基芳烷基或烷芳基氨基；

-羟基氨基-O-NH₂，或包含结构单位-O-NH-的羟基氨基的衍生物，如羟基烷基氨基、羟基芳基氨基、羟基芳烷基氨基或羟基烷芳基氨基；

-烷氧基氨基、芳氧基氨基、芳烷氧基氨基或烷芳氧基氨基，其各包含结构单位-NH-O-；

-具有羰基-Q-C(＝G)-M的残基，其中G为O或S，M为例如：

---OH或-SH；

--烷基氧基、芳基氧基、芳烷基氧基或烷芳基氧基；

--烷基硫基、芳基硫基、芳烷基硫基或烷芳基硫基；

--烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、芳烷基羰基氧基、烷芳基羰基氧基；

--活化的酯，如羟胺的酯，其具有如N-羟基琥珀酰亚胺的亚胺结构或具有结构单位O-N，其中N为杂芳基化合物的一部份，或其中G＝O且Q不存在，如具有取代芳基残基如五氟苯基、对硝基苯基或三氯苯基的芳氧基化合物；

其中Q不存在或是NH或杂原子，如S或O；

--NH-NH₂或-NH-NH-；

--NO₂；

-腈基；

-羰基，如醛基或酮基；

-羧基；

--N＝C＝O基团或-N＝C＝S基团；

-乙烯基卤化物基团，如乙烯基碘化物或乙烯基溴化物基团或三氟甲磺酸根；

--C≡C-H；

--(C＝NH₂Cl)-O烷基

--(C＝O)-CH₂-Hal基团，其中Hal为Cl、Br或I；

--CH＝CH-SO₂-；

-包含结构-S-S-的二硫化物基团；

-基团

-基团

其中W和该另一种至少双官能化合物的官能团分别是可与上述一种基团形成化学键的基团。

根据本发明再更优选的实施方案，W包含氨基-NH₂。

根据本发明优选实施方案，W和另一个官能团均是来自上列基团列表的基团。

根据本发明一个实施方案，这些官能团之一是硫基。在这个特别的例子中，该另一个官能团优选选自：

其中Hal是Cl、Br或I，优选Br或I。

根据本发明特别优选的实施方案，这些官能团之一选自反应性酯，如羟胺的酯，其具有亚胺结构如N-羟基琥珀酰亚胺，或具有结构单位O-N，其中N是杂芳基化合物的一部份，或者例如具有取代芳基残基，如五氟苯基、对硝基苯基或三氯苯基的芳氧基化合物，或任选转化成反应性酯的羧基。在该特别的例子中，该另一个官能团包含化学结构-NH-。

根据本发明特别优选的实施方案，W包含结构-NH-，该另一种至少双官能化合物包含反应性酯和马来酰亚胺基。

关于包含结构-NH-的官能团W，可参见上述官能团，其中W可与U相同或不同。根据本发明优选实施方案，U与W相同。更优选地，U和W均包含氨基。特别优选地，U和W均为氨基-NH₂。

根据本发明一个实施方案，聚合物可与包含U和W的至少双官能化合物在其未氧化的还原端在水性介质中反应。根据优选实施方案，其中U和W均为氨基，该反应采用具有氧化型还原端的聚合物，在至少一种非质子溶剂中，特别优选在水含量不超过0.5％重量比，优选不超过0.1％重量比的无水非质子溶剂中进行。合适的溶剂特别是二甲亚砜(DMSO)、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺(DMA)、二甲基甲酰胺(DMF)和其中两种或多种的混合物。

特别在U和W均为氨基-NH₂时，U和W可利用任何合适的间隔基分隔。其中间隔基可以是任选取代的直链、分支和/或环状烃残基。合适的取代基是烷基、芳基、芳烷基、烷芳基、卤素、羰基、酰基、羧基、羧基酯、羟基、硫基、烷氧基和/或烷硫基。通常，该烃残基具有1至60个，优选1至40个，更优选1至20个，更优选2至10个，更优选2至6个，特别优选2至4个碳原子。如果存在杂原子，该分隔基通常包含1至20个，优选1至8个，特别优选1至4个杂原子。该烃残基可包含具有例如5至7个碳原子的任选分支的烷基链或芳基或环烷基，或者是芳烷基、烷芳基，其中烷基部份可以是直链和/或环状烷基。根据甚至更优选的实施方案，该烃残基是具有1至20个，优选2至10个，更优选2至6个，特别优选2至4个碳原子的烷基链。

因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中聚合物在其氧化的还原端与1，4-二氨基丁烷、1，3-二氨基丙烷或1，2-二氨基乙烷反应，产生如下式的聚合物衍生物

其中n＝2、3或4，该聚合物优选为HES。

根据上述优选实施方案，包含氨基的聚合物衍生物再与包含反应性酯基和马来酰亚胺基的至少双官能化合物反应。该反应性酯基和马来酰亚胺基可利用合适的间隔基分隔。关于该间隔基，可参见官能团U与W之间的间隔基。根据本发明优选实施方案，反应性酯基与马来酰亚胺基之间利用具有1至10个，优选1至8个，更优选1至6个，更优选1至4个，更优选1至2个，特别优选1个碳原子的烃链分隔。根据另一优选实施方案，该反应性酯是琥珀酰亚胺酯，根据特别优选的实施方案，该包含马来酰亚胺基和反应性酯基的至少双官能化合物是N-(α-马来酰亚胺基乙酰氧基)琥珀酰亚胺酯。

因此，本发明也涉及一种如下式的聚合物衍生物

其中n＝2、3或4，聚合物优选为HES。

包含马来酰亚胺基的聚合物衍生物进一步与蛋白质的硫醇基反应，产生包含通过硫醚基与蛋白质连接的聚合物衍生物的偶联物。

因此，本发明也涉及包含蛋白质和聚合物的如下式的偶联物

其中n＝2、3或4，优选4，该聚合物优选为HES，其中式中的S原子来源于蛋白质的Cys 17或Cys 18。该羟乙基淀粉优选为平均分子量约10kD，DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约10kD，DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约12kD，DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约12kD，DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约18kD，DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约18kD，DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约50kD，DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约50kD，DS约0.7的羟乙基淀粉。

包含马来酰亚胺基的聚合物衍生物与蛋白质的硫醇基的反应优选在缓冲的水性系统中进行，优选pH为5.5至8.5，更优选6至8，特别优选6.5至7.5，优选反应温度为0至40℃，更优选0至25℃，特别优选4至21℃，优选反应时间为0.5至24小时，更优选1至20小时，特别优选2至17小时。该反应混合物的合适pH值可通过添加至少一种合适的缓冲液来调节。优选的缓冲液可提到乙酸钠缓冲液、磷酸盐或硼酸盐缓冲液，其含有优选浓度为0至8M，更优选2至8M，特别优选4至8M的尿素，并且/或者包含优选浓度为0至1％(w/v)，更优选0.4至1％(w/v)，特别优选0.8至1％(w/v)的SDS。

偶联物可进一步处理，如透析、离心过滤或加压过滤、离子交换层析、反向层析、HPLC、MPLC、凝胶过滤和/或冻干等后处理。

因此，本发明也涉及一种可通过上述方法制得的偶联物。

因此，本发明也涉及一种可通过上述方法制得的偶联物，其中A是反应性羧基，其中通过聚合物的至少一个羟基与碳酸二酯反应，向还原端未氧化的聚合物中引入A，并且其中该偶联物包含一个聚合物分子和至少一个，特别是1至10个通过酰胺键连接到聚合物上的蛋白质分子。

本发明也涉及一种包含蛋白质和聚合物或其衍生物的偶联物，其中该聚合物是羟烷基淀粉(HAS)，该蛋白质是粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，其具有如下式的结构

和/或

其中R₁、R₂和R₃分别独立地是氢或具有1至10个碳原子的羟基烷基、羟基芳基、羟基芳烷基或羟基烷芳基，优选氢或羟基烷基，更优选氢或羟基乙基，

其中G选自O和S，优选O，且

其中L是任选适当取代的直链、分支和/或环状烃残基，其任选包含至少一个杂原子，优选具有2至60个碳原子的烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基残基。

上式中使用的缩写″蛋白质’″是指用于反应的G-CSF分子，它不含作为N＝C双键中肟连接一部份的碳水化合物部分的碳原子。

本发明也涉及一种如上所述的偶联物，其中-L-是-(CH₂)n-，其中n＝2、3、4、5、6、7、8、9、10，优选2、3、4、5、6，更优选2、3、4，特别优选4。

本发明也涉及一种包含蛋白质和聚合物或其衍生物的偶联物，其中该聚合物是羟烷基淀粉(HAS)，该蛋白质是粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，其具有如下式的结构：

和/或

其中R₁、R₂和R₃分别独立地是氢或具有1至10个碳原子的羟基烷基、羟基芳基、羟基芳烷基或羟基烷芳基，优选氢或羟基烷基，更优选氢或羟基乙基，且

其中G选自O和S，优选O。

上式中使用的缩写″蛋白质’″是指用于反应的G-CSF分子，它不含作为N＝C双键中肟连接一部份的碳水化合物部分的碳原子。

本发明也涉及一种包含蛋白质和聚合物或其衍生物的偶联物，其中该聚合物是羟烷基淀粉(HAS)，该蛋白质是粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，其具有如下式的结构：

和/或

其中R₁、R₂和R₃分别独立地是氢或具有1至10个碳原子的羟基烷基、羟基芳基、羟基芳烷基或羟基烷芳基，优选氢或羟基烷基，更优选氢或羟基乙基，且

其中L为任选适当取代的直链、分支和/或环状烃残基，其任选包含至少一个杂原子，优选具有2至60个碳原子的烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基残基。

上式中使用的缩写″蛋白质’″是指用于反应的G-CSF分子，它不含作为N＝C双键中肟连接一部份的碳水化合物部分的碳原子。

上述两种结构说明了这样一种结构：其中交联化合物通过肟连接连接到HAS的还原端，且其中HES的末端糖单位呈开放型，以及一种具有各环状缩醛胺型的结构，其中交联化合物通过氧氨基连接到HES的还原端，且其中HES的末端糖单位呈环状型。这两种结构均可同时以互相平衡的状态存在。

本发明也涉及一种如上所述的偶联物，其中-L-是

         -[(CR_aR_b)_mG]_n[CR_cR_d]_o-

其中R_a、R_b、R_c、R_d分别独立地是氢、烷基、芳基，优选氢，其中G选自O和S，优选O，并且其中

m为1、2、3或4，其中m个CR_aR_b基团中的残基R_a与R_b可相同或不同；

n为0至20，优选0至10，更优选1、2、3、4、5，最优选1或2；

o为0至20，优选0至10，更优选1、2、3、4、5，最优选1或2，其中o个CR_cR_d基团中的残基R_c与R_d可相同或不同。

本发明也涉及一种如上所述的偶联物，其中R_a、R_b、R_c、R_d为氢，m＝2，n＝1，o＝2。

本发明也涉及一种包含蛋白质和聚合物或其衍生物的偶联物，其中该聚合物为羟烷基淀粉(HAS)，该蛋白质为粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，其具有如下式的结构

其中R₁、R₂和R₃分别独立为氢或具有1至10个碳原子的羟基烷基、羟基芳基、羟基芳烷基或羟基烷芳基，优选氢或羟基烷基，更优选氢或羟基乙基。

上式中使用的缩写″蛋白质’″是指用于反应的G-CSF分子，它不含作为酰胺键一部份的氨基的氮原子。

本发明也涉及一种包含蛋白质和聚合物或其衍生物的偶联物，其中该聚合物为羟烷基淀粉(HAS)，该蛋白质为粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，其具有如下式的结构：

其中R₁、R₂和R₃分别独立为氢或具有1至10个碳原子的羟基烷基、羟基芳基、羟基芳烷基或羟基烷芳基，优选氢或羟基烷基，更优选氢或羟基乙基，且

其中连接-O-(C＝O)-通过羧基或反应性羧基与HAS分子的羟基反应形成。

上式中使用的缩写″蛋白质’″是指用于反应的G-CSF分子，它不含作为酰胺键一部份的氨基的氮原子。

本发明也涉及一种包含蛋白质和聚合物或其衍生物的偶联物，其中该聚合物为羟烷基淀粉(HAS)，该蛋白质为粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，其具有如下式的结构：

其中R₁、R₂和R₃分别独立为氢或具有1至10个碳原子的羟基烷基、羟基芳基、羟基芳烷基或羟基烷芳基，优选氢或羟基烷基，更优选氢或羟基乙基，且

其中L是任选取代的直链、分支和/或环状烃残基，其任选含有至少一个杂原子，具有1至60个，优选1至40个，更优选1至20个，更优选1至10个，更优选1至6个，更优选1至2个碳原子，特别优选1个碳原子，L特别是CH₂。

上式中使用的缩写″蛋白质’″是指用于反应的G-CSF分子，它不含作为氨甲基连接一部份的氨基的氮原子。

本发明也涉及一种包含蛋白质和聚合物或其衍生物的偶联物，其中该聚合物为羟烷基淀粉(HAS)，该蛋白质为粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，其具有如下式的结构：

其中R₁、R₂和R₃分别独立为氢或具有1至10个碳原子的羟基烷基、羟基芳基、羟基芳烷基或羟基烷芳基，优选氢或羟基烷基，更优选氢或羟基乙基，且

其中L₁和L₂分别独立为任选取代的直链、分支和/或环状烃残基，其任选包含至少一个杂原子，其包含烷基、芳基、芳烷基杂烷基和/或杂芳烷基部分，该残基具有1至60个，优选1至40个，更优选1至20个，更优选1至10个碳原子，且

其中D为一连接，优选为连接L₁的适当官能团F₂和连接L₂的适当官能团F₃所形成的共价键。

上式中使用的缩写″蛋白质’″是指用于反应的G-CSF分子，它不含作为氨甲基连接一部份的氨基的氮原子。

本发明也涉及一种如上所述的偶联物，其中L₁为-(CH₂)n-，其中n＝2、3、4、5、6、7、8、9、10，优选2、3、4、5、6，更优选2、3、4，特别优选4。

本发明也涉及一种如上所述的偶联物，其中L₂包含任选适当取代的芳基部分，优选包含6个碳原子的芳基部分，L₂特别优选C₆H₄，或其中L₂为-(CH₂)n-，其中n＝2、3、4、5、6、7、8、9、10，优选2、3、4、5、6，更优选2、3、4。

本发明也涉及一种如上所述的偶联物，其中选自：

-C-C-双键或C-C-三键或芳香族C-C-键；

-硫基或羟基；

-烷基磺酸酰肼、芳基磺酸酰肼；

-1，2-二元醇；

-1，2-氨基-硫醇类；

-叠氮化物；

-1，2-氨基醇类；

-氨基-NH₂或包含结构单位-NH-的氨基衍生物，如氨基烷基、氨基芳基、氨基芳烷基或烷芳基氨基；

-羟基氨基-O-NH₂，或包含结构单位-O-NH-的羟基氨基的衍生物，如羟基烷基氨基、羟基芳基氨基、羟基芳烷基氨基或羟基烷芳基氨基；

-烷氧基氨基、芳氧基氨基、芳烷氧基氨基或烷芳氧基氨基，其各包含结构单位-NH-O-；

-具有羰基-Q-C(＝G)-M的残基，其中G为O或S，M为例如：

---OH或-SH；

--烷基氧基、芳基氧基、芳烷基氧基或烷芳基氧基；

--烷基硫基、芳基硫基、芳烷基硫基或烷芳基硫基；

--烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、芳烷基羰基氧基、烷芳基羰基氧基；

--活化的酯，如羟胺的酯，其具有如N-羟基琥珀酰亚胺的亚胺结构或具有结构单位O-N，其中N为杂芳基化合物的一部份，或其中G＝O且Q不存在，如具有取代芳基残基如五氟苯基、对硝基苯基或三氯苯基的芳氧基化合物；

其中Q不存在或是NH或杂原子，如S或O；

--NH-NH₂或-NH-NH-；

--NO₂；

-腈基；

-羰基，如醛基或酮基；

-羧基；

--N＝C＝O基团或-N＝C＝S基团；

-乙烯基卤化物基团，如乙烯基碘化物或乙烯基溴化物基团或三氟甲磺酸根；

--C≡C-H；

--(C＝NH₂Cl)-O烷基

--(C＝O)-CH₂-Hal基团，其中Hal为Cl、Br或I；

--CH＝CH-SO₂-；

-包含结构-S-S-的二硫化物基团；

-基团

-基团

且其中F₃是可与F₂形成化学键的官能团，优选选自上述基团中，F₂优选包含部分-NH-，更优选包含氨基，F₃优选包含部分-(C＝G)-，更优选-(C＝O)-，更优选部分-(C＝G)-G-，再更优选-(C＝O)-G-，特别优选-(C＝O)-O，D特别优选为酰胺键。

本发明也涉及一种包含蛋白质和聚合物或其衍生物的偶联物，其中该聚合物为羟烷基淀粉(HAS)，该蛋白质为粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，其具有如下式的结构：

其中部分-CH₂-N₂-的碳原子来源于通过开环氧化反应引入聚合物中的醛基，其中HAS″是指不含开环氧化反应产生的并与蛋白质中氨基反应的醛基的羟烷基淀粉分子，其中氮原子来源于蛋白质的氨基。

上式中使用的缩写″蛋白质’″是指用于反应的G-CSF分子，它不含作为酰胺键一部份的氨基的氮原子。

本发明也涉及一种包含蛋白质和聚合物或其衍生物的偶联物，其中该聚合物为羟烷基淀粉(HAS)，该蛋白质为粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，其具有如下式的结构：

其中R₁、R₂和R₃分别独立为氢或具有1至10个碳原子的羟基烷基、羟基芳基、羟基芳烷基或羟基烷芳基，优选氢或羟基烷基，更优选氢或羟基乙基，且

其中L为任选取代的直链、分支和/或环状烃残基，其任选包含至少一个杂原子，其包含烷基、芳基、芳烷基杂烷基和/或杂芳烷基部分，该残基具有2至60个，优选2至40个，更优选2至20个，更优选2至10个碳原子，且

其中硫原子来源于蛋白质的半胱氨酸残基或二硫化物基团。

本发明也涉及一种如上所述的偶联物，其中-L-为

          -[(CR_aR_b)_mG]_n[CR_cR_d]_o-

其中R_a、R_b、R_c、R_d分别独立为氢、烷基、芳基，优选氢，其中G选自O和S，优选为O，且其中

m为1、2、3或4，最优选2，其中m个基团CR_aR_b中的残基R_a与R_b可相同或不同；

n为1至20，优选1至10，最优选1、2、3或4；

o为1至20，优选1至10，更优选1、2、3、4、5，更优选1或2，最优选1，其中o个基团CR_cR_d中的残基R_c与R_d可相同或不同；

或

其中

n为0；且

o为2至20，优选2至10，更优选2、3、4、5、6、7或8，其中o个基团CR_cR_d中的残基R_c与R_d可相同或不同。

本发明也涉及一种包含蛋白质和聚合物或其衍生物的偶联物，其中该聚合物为羟烷基淀粉(HAS)，该蛋白质为粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，其具有如下式的结构：

其中R₁、R₂和R₃分别独立为氢或具有1至10个碳原子的羟基烷基、羟基芳基、羟基芳烷基或羟基烷芳基，优选氢或羟基烷基，更优选氢或羟基乙基，且

其中L为任选取代的直链、分支和/或环状烃残基，其任选包含至少一个杂原子，其包含烷基、芳基、芳烷基杂烷基和/或杂芳烷基部分，该残基具有2至60个，优选2至40个，更优选2至20个，更优选2至10个碳原子，且

其中硫原子来源于蛋白质的半胱氨酸残基或二硫化物基团。

本发明也涉及一种如上所述的偶联物，其中-L-为

       -[(CR_aR_b)_mG]_n[CR_cR_d]_o-

其中R_a、R_b、R_c、R_d分别独立为氢、烷基、芳基，优选氢，其中G选自O和S，优选为O，且其中

m为1、2、3或4，最优选2，其中m个基团CR_aR_b中的残基R_a与R_b可相同或不同；

n为1至20，优选1至10，最优选1、2、3或4；

o为1至20，优选1至10，更优选1、2、3、4、5，更优选1或2，最优选1，其中o个基团CR_cR_d中的残基R_c与R_d可相同或不同；

或

其中

n为0；且

o为2至20，优选2至10，更优选2、3、4、5、6、7或8，其中o个基团CR_cR_d中的残基R_c与R_d可相同或不同。

本发明也涉及如上所述的任何偶联物，其中羟烷基淀粉为羟乙基淀粉。

本发明也涉及如上所述的任何偶联物，其中羟乙基淀粉的分子量为2至200kD，优选4至130kD，更优选4至70kD。

根据另一方面，本发明涉及一种如上所述的偶联物，或可通过上述方法制得的偶联物，其用于治疗人体或动物体的方法。

此外，本发明也涉及一种药物组合物，其包含治疗有效量的如上所述的偶联物或可通过上述方法制得的偶联物。

本发明中所使用的术语″治疗有效量″意指其用量可针对特定病症和给药方案提供治疗效果。优选通过给药途径给药。具体的途径根据所治疗的病症选择。优选采用包含合适载体如聚山梨酸酯、合适稀释剂如水和/或合适佐剂如山梨糖醇作为制剂的一部份进行给药。所需剂量取决于所治疗病症的严重性、患者的个别反应、所采用的给药方法等等。

因此，在优选实施方案中，药物组合物还包含至少一种药学上可接受的稀释剂、佐剂和/或载体，特别优选用于G-CSF治疗。

药物组合物优选用于治疗特征在于造血或免疫功能下降的病变或其相关疾病。

因此，本发明也涉及如上所述包含上述偶联物或可通过上述方法制得的偶联物的药物组合物在制备用于治疗特征在于造血或免疫功能下降的疾病的药物中的用途。

根据优选实施方案，特征在于造血或免疫功能下降特征的疾病是化疗、放射疗法、感染性疾病、重度慢性中性粒细胞减少症或白血病所造成的。因此，本发明也涉及如上所述包含上述偶联物或可通过上述方法制得的偶联物的药物组合物在制备用于治疗特征在于造血或免疫功能下降的疾病的药物中的用途，其中该疾病是化疗、放射疗法、感染性疾病、重度慢性中性粒细胞减少症或白血病所造成的。

采用本发明的药物组合物治疗的个体优选经静脉内或皮下途径给药。为此，药物组合物可作为无菌溶液形式给药。

本发明进一步利用下列附图、表格和实施例说明，但并非以任何方式限制本发明的范围。

附图说明

图1a

图1a显示根据实施例2.1(a)制备的HES-G-CSF偶联物Neupogen^的SDS page分析。使用XCell Sure Lock Mini Cell(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)和Consort E143电源(CONSORTnv，Tumhout，B)进行凝胶电泳。根据制造商的说明，使用12％Bis-Tris凝胶和还原条件下的MOPS SDS电泳缓冲液(均来自InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。

泳道A：蛋白质标记物SeeBlue^Plus2(Invitrogen GmbH，

       Karlsruhe，D)。分子量标记物由上至下为：188kD、98

       kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、

       3kD。

泳道B：G-CSF(Neupogen^)按照实施例2.1(a)所述与HES偶联

       后的粗产物。

泳道C：G-CSF初始物。

图1b

图1b显示根据实施例2.1(a)制备的HES-G-CSF偶联物Granocyte^的SDS page分析。采用XCell Sure Lock Mini Cell(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)和Consort E143电源(CONSORTnv，Tumhout，B)进行凝胶电泳。根据制造商的说明，使用12％Bis-Tris凝胶和还原条件下的MOPS SDS电泳缓冲液(均来自InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。

泳道A：蛋白质标记物SeeBlue^Plus2(Invitrogen GmbH，

       Karlsruhe，D)。分子量标记物由上至下为：188kD、98

       kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、

       3kD。

泳道B：G-CSF(Granocyte^)根据实施例2.1(a)所述与HES偶联

       后的粗产物。

泳道C：G-CSF初始物。

图2

图2显示根据实施例2.1(b)制备的HES-G-CSF偶联物的SDSpage分析，G-CSF来自Strathmann Biotec A G，Hamburg，D。采用XCell Sure Lock Mini Cell(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)和Consort E143电源(CONSORTnv，Tumhout，B)进行凝胶电泳。根据制造商的说明，使用12％Bis-Tris凝胶和还原条件下的MOPS SDS电泳缓冲液(均来自Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。

泳道A：蛋白质标记物SeeBlue^Plus2(Invitrogen GmbH，

       Karlsruhe，D)。分子量标记物由上至下为：188kD、98

       kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、

       3kD。

泳道B：G-CSF与HES 10/0.4在0.1M NaOAc缓冲液pH 5.0中

       偶联后的粗产物。

泳道C：G-CSF与HES10/0.7在0.1M NaOAc缓冲液pH 5.0中偶

       联后的粗产物。

泳道D：G-CSF与HES50/0.4在0.1M NaOAc缓冲液pH 5.0中偶

       联后的粗产物。

泳道E：G-CSF与HES50/0.7在0.1M NaOAc缓冲液pH 5.0中偶

       联后的粗产物。

泳道F：G-CSF初始物。

图3

图3显示根据实施例2.2制备的HES-G-CSF偶联物的SDSpage分析，G-CSF来自Strathmann Biotec A G，Hamburg，D。采用XCell Sure Lock Mini Cell(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)和Consort E143电源(CONSORTnv，Tumhout，B)进行凝胶电泳。根据制造商的说明，使用12％Bis-Tris凝胶和还原条件下的MOPS SDS电泳缓冲液(均来自Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。

泳道A：蛋白质标记物SeeBlue^Plus2(Invitrogen GmbH，

       Karlsruhe，D)。分子量标记物由上至下为：188kD、98

       kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、

       3kD。

泳道B：G-CSF与氧化的HES10/0.7在0.1M NaOAc缓冲液pH

       5.0中偶联后的粗产物。

泳道C：G-CSF与氧化的HES50/0.4在0.1M NaOAc缓冲液pH

       5.0中偶联后的粗产物。

泳道D：G-CSF与氧化的HES50/0.7在0.1M NaOAc缓冲液pH

       5.0中偶联后的粗产物。

泳道E：G-CSF初始物。

图4

图4显示根据实施例2.3制备的HES-G-CSF偶联物的SDS page分析，该G-CSF为Neupogen^或Granocyte^。采用XCell Sure LockMini Cell(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)和Consort E143电源(CONSORTnv，Tumhout，B)进行凝胶电泳。根据制造商的说明，使用12％Bis-Tris凝胶和还原条件下的MOPS SDS电泳缓冲液(均来自Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。

泳道A：蛋白质标记物SeeBlue^Plus2(Invitrogen GmbH，

       Karlsruhe，D)。分子量标记物由上至下为：188kD、98

       kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、

       3kD。

泳道B：根据实施例2.3的粗产物(i-N)。

泳道C：根据实施例2.3的粗产物(ii-N)。

泳道D：根据实施例2.3的粗产物(iii-N)。

泳道E：根据实施例2.3的粗产物(iv-N)。

泳道F：根据实施例2.3的粗产物(i-G)。

泳道G：根据实施例2.3的粗产物(ii-G)。

泳道H：根据实施例2.3的粗产物(iii-G)。

泳道I：根据实施例2.3的粗产物(iv-G)。

泳道J：Neupogen^。

图5

图5显示根据实施例2.4制备的HES-G-CSF偶联物的SDSpage分析，G-CSF来自Strathmann Biotec A G，Hamburg，D。采用XCell Sure Lock Mini Cell(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)和Consort E143电源(CONSORTnv，Tumhout，B)进行凝胶电泳。根据制造商的说明，使用12％Bis-Tris凝胶和还原条件下的MOPS SDS电泳缓冲液(均来自Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。

泳道A：蛋白质标记物SeeBlue^Plus2(Invitrogen GmbH，

       Karlsruhe，D)。分子量标记物由上至下为：188kD、98

       kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、

       3kD。

泳道B：根据实施例2.4的粗产物(vi)。

泳道C：根据实施例2.4的粗产物(v)。

泳道D：G-CSF初始物。

泳道E：蛋白质标记物SeeBlue^Plus2(Invitrogen GmbH，

       Karlsruhe，D)。分子量标记物由上至下为：188kD、98

       kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、

       3kD。

泳道F：根据实施例2.4的粗产物(ix)。

泳道G：根据实施例2.4的粗产物(viii)。

泳道H：根据实施例2.4的粗产物(vii)。

泳道I：G-CSF初始物。

图6

图6显示根据实施例2.5制备的HES-G-CSF偶联物的SDSpage分析，G-CSF来自Strathmann Biotec AG， Hamburg，D。采用XCell Sure Lock Mini Cell(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)和Consort E143电源(CONSORTnv，Tumhout，B)进行凝胶电泳。根据制造商的说明，使用10％Bis-Tris凝胶和还原条件下的MOPS SDS电泳缓冲液(均来自Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。

泳道A：蛋白质标记物SeeBlue^Plus2(Invitrogen GmbH，

       Karlsruhe，D)。分子量标记物由上至下为：188kD、98

       kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、

       3kD。

泳道B：根据实施例2.5的粗产物。

泳道C：G-CSF初始物。

图7

图7显示根据实施例3制备的HES-G-CSF偶联物的SDS page分析，该G-CSF为Neupogen^或Granocyte^。采用XCell Sure LockMini Cell(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)和Consort E143电源(CONSORTnv，Tumhout，B)进行凝胶电泳。根据制造商的说明，使用12％Bis-Tris凝胶和还原条件下的MOPS SDS电泳缓冲液(均来自Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。

泳道A：蛋白质标记物SeeBlue^Plus2(Invitrogen GmbH，

       Karlsruhe，D)。分子量标记物由上至下为：188kD、98

       kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、

       3kD。

泳道B：根据实施例3的粗产物(x)。

泳道C：根据实施例3的粗产物(xi)。

泳道D：根据实施例3的粗产物(xii)。

泳道E：根据实施例3的粗产物(xiii)。

泳道F：根据实施例3的粗产物(xiv)。

泳道G：根据实施例3的粗产物(xv)。

图8

图8显示实施例6的体外结果。

图中，x轴表示浓度，以pg/ml为单位，y轴表示细胞数/100,000。该图中，下列缩写是指：

G-CSF/A32  根据实施例2.5制备的G-CSF偶联物

G-CSF/A33  用于实施例2.5的偶联物的G-CSF初始物

G-CSF/A57  未修饰的Neulasta^

G-CSF/A58  未修饰的Neupogen^

G-CSF/A60  根据实施例4.2制备的G-CSF偶联物

图9

图9显示根据实施例4.1的粗偶联反应产物的HPGPC层析图。HPGPC分析中采用下列参数：

柱：Superose 12HR 10/30 300×10mm I.D.(Pharmacia)

洗脱液：27.38mM Na₂HPO₄；12.62mM NaH₂PO₄；0.2M NaCl；0,005％NaN₃的1升去矿物质水溶液

流量：0.24毫升/小时

检测器1：MALLS检测器

检测器2：UV(280nm)

检测器3：RI(折射率检测器)

A代表检测器1的结果，B代表检测器2的结果。

图10

图10显示根据实施例4.1的偶联反应产物的HPGPC层析图，其中反应副产物如未反应的氧代-HES和游离N-羟基琥珀酰亚胺的混合物以及溶剂含量均采用10Kd超滤膜通过低温离心下调。HPGPC分析采用下列参数：

柱：Superose 12HR 10/30 300×10mm I.D.(Pharmacia)

洗脱液：27.38mM Na₂HPO₄；12.62mM NaH₂PO₄；0.2MNaCl；0.005％NaN₃的1升去矿物质水溶液

流量：0.24毫升/小时

检测器1：MALLS检测器

检测器2：UV(280nm)

检测器3：RI(折射率检测器)

A代表检测器1的结果，B代表检测器2的结果。

图11

HPGPC分析采用下列参数：

柱：Superose 12HR 10/30 300×10mm I.D.(Pharmacia)

洗脱液：27.38mM Na₂HPO₄；12.62mM NaH₂PO₄；0.2MNaCl；0.005％NaN₃的1升去矿物质水溶液

流量：0.24毫升/小时

检测器1：MALLS检测器

检测器2：UV(280nm)

检测器3：RI(折射率检测器)

A代表检测器1的结果，B代表检测器2的结果。

图12

HPGPC分析采用下列参数：

柱：Superose 12HR 10/30 300×10mm I.D.(Pharmacia)

洗脱液：27.38mM Na₂HPO₄；12.62mM NaH₂PO₄；0.2MNaCl；0.005％NaN₃的1升去矿物质水溶液

流量：0.24毫升/小时

检测器1：MALLS检测器

检测器2：UV(280nm)

检测器3：RI(折射率检测器)

A代表检测器1的结果，B代表检测器2的结果。

图13

图13显示HES-修饰的G-CSF(A32)在DEAE-Sepharose CL-6B上层析后的流过液(flow-through)和洗出液的SDS-PAGE分析。取1.5％指定级分经超滤脱盐，在SpeedVac中干燥，加至12.5％聚丙烯酰胺凝胶上。

图14

图14显示G-CSF初始物的MALDI/TOF图谱(样品A33)。

图15

图15显示HES-修饰的G-CSF的MALDI/TOF图谱(样品A32)。

图16

图16显示HES-修饰的G-CSF的MALDI/TOF图谱(样品A60)。

图17

图17显示实施例7.2(b)的反应混合物的凝胶电泳。采用XCellSure Lock Mini Cell(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)和ConsortE143电源(CONSORTnv，Tumhout，B)进行凝胶电泳。根据制造商的说明，使用12％Bis-Tris凝胶和还原条件下的MOPS SDS电泳缓冲液(均来自Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。凝胶使用Roti-Blue(Carl Roth GmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)根据制造商的说明染色。

泳道A：蛋白质标记物Roti-Mark STANDARD(Carl Roth GmbH

       +Co.KG，Karlsruhe，D)，分子量标记物由上至下为：200

       KD、119KD、66KD、43KD、29KD、20KD、14.3KD。

泳道B：hG-CSF与实施例7.1(d)制备的HES衍生物偶联后的粗

       产物。

泳道C：hG-CSF与实施例7.1(b)制备的HES衍生物偶联后的粗

       产物。

泳道D：hG-CSF与实施例7.1(j)制备的HES衍生物偶联后的粗产

       物。

泳道E：反应对照：HES 50/07。

图18

图18显示实施例7.2(d)的反应混合物的凝胶电泳。采用XCellSure Lock Mini Cell(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)和ConsortE143电源(CONSORTnv，Tumhout，B)进行凝胶电泳。根据制造商的说明，使用12％Bis-Tris凝胶和还原条件下的MOPS SDS电泳缓冲液(均来自Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)。凝胶使用Roti-Blue(Carl Roth GmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)根据制造商的说明染色。

泳道A：蛋白质标记物Roti-Mark STANDARD(Carl Roth GmbH

       +Co.KG，Karlsruhe，D)，分子量标记物由上至下为：200

       KD、119KD、66KD、43KD、29KD、20KD、14.3KD。

泳道B：如实施例7.2(c)所述进行缓冲液交换后的hG-CSF。

泳道C：hG-CSF与如实施例7.1(f)所述制备的HES衍生物偶联后

       的粗产物。

泳道D：hG-CSF与如实施例7.1(h)所述制备的HES衍生物偶联

       后的粗产物。

图19

图19显示根据实施例7.3的偶联反应产物的HPGPC层析图(MALLS检测器：上图；UV检测器：下图)。HPGPC分析采用下列参数：

柱：Superose 12HR 10/30 300×10mm I.D.(Pharmacia)

洗脱液：27.38mM Na₂HPO₄；12.62mM NaH₂PO₄；0.2M NaCl；0.005％NaN₃的1升去矿物质水溶液

流量：0.24毫升/小时

检测器1：MALLS检测器

检测器2：UV(280nm)

检测器3：RI(折射率检测器)

图20

图20显示实施例7.4的有丝分裂原性测定结果。Y轴代表NFS-60-细胞数/毫升，X-轴代表浓度，以pg/ml为单位。

图21

图21显示实施例7.5的体内测定结果。

实施例

实施例1：醛官能化的羟乙基淀粉的合成

实施例1.1(a)：通过高碘酸盐氧化法选择性氧化羟乙基淀粉的还原端并在0℃下孵育的合成

取100mg氧代-HES10/0.4(MW＝10kD，DS＝0.4，由SupramolParenteral Colloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D制备；根据DE 19628 705 A1)，溶于5ml 20mM磷酸钠缓冲液pH 7.2中，冷却至0℃。取21.4mg高碘酸钠(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)溶于5ml相同缓冲液中，冷却至0℃。混合这两份溶液，在0℃下孵育10分钟后，添加0.73ml甘油，反应混合物在21℃下孵育10分钟。反应混合物相对于水透析24小时(SnakeSkin透析管，阻断值3.5Kd，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并冻干。

实施例1.1(b)：通过高碘酸盐氧化法选择性氧化羟乙基淀粉的还原端并在21℃下孵育的合成

取100mg氧代-HES10/0.4(MW＝10kD，DS＝0.4，由Supramol Parenteral Colloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D制备；根据DE 196 28 705 A1)，溶于5ml 20mM磷酸钠缓冲液pH 7.2中。取21.4mg高碘酸钠(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)溶于5ml相同缓冲液中。混合这两份溶液，在21℃下孵育10分钟后，添加0.73ml甘油，反应混合物在21℃下孵育10分钟。反应混合物相对于水透析24小时(SnakeSkin透析管，阻断值3.5kD，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并冻干。

实施例1.2(a)：采用高碘酸盐氧化羟乙基淀粉的未氧化还原端并在0℃下孵育，合成醛官能化的羟乙基淀粉

取100mg HES10/0.4(MW＝10kD，DS＝0.4，SupramolParenteral Colloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)溶于5ml 20mM磷酸钠缓冲液pH 7.2中，冷却至0℃。取21.4mg高碘酸钠(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)溶于5ml相同缓冲液中，冷却至0℃。混合这两份溶液，在0℃下孵育10分钟后，添加0.73ml甘油，反应混合物在21℃下孵育10分钟。反应混合物相对于水透析24小时(SnakeSkin透析管，阻断值3.5kD，PerbioSciences Deutschland GmbH，Bonn，D)并冻干。

实施例1.2(b)：采用高碘酸盐氧化羟乙基淀粉的未氧化还原端并在21℃下孵育，合成醛官能化的羟乙基淀粉

取100mg HES10/0.4(MW＝10kD，DS＝0.4，由SupramolParenteral Colloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D制备)溶于5ml 20mM磷酸钠缓冲液pH 7.2中。取21.4mg高碘酸钠(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)溶于5ml相同缓冲液中。混合这两份溶液，在21℃下孵育10分钟后，添加0.73ml甘油，反应混合物在21℃下孵育10分钟。反应混合物相对于水透析24小时(SnakeSkin透析管，阻断值3.5kD，Perbio SciencesDeutschland GmbH，Bonn，D)并冻干。

实施例1.3：由氨基官能化的羟乙基淀粉和甲酰基苯甲酸合成醛官能化的羟乙基淀粉

氧代-HES10/0.4(MW＝10kD，DS＝0.4)由Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D制备；根据DE 196 28 705A1。

取5.1g(0.51mmol)氧代-HES10/0.4溶于15ml无水二甲亚砜(DMSO，Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)，在氮气下逐滴加至5.1ml(51mmol)1，4-二氨基丁烷的10ml无水二甲亚砜溶液中，在40℃下搅拌19小时。添加反应混合物至80ml乙醇和80ml丙酮的混合物中。离心分离产生的沉淀，用20ml乙醇和20ml丙酮的混合物洗涤，再溶于80ml水中。该溶液相对于水透析4天(SnakeSkin透析管，阻断值3.5kD，Perbio SciencesDeutschland GmbH，Bonn，D)，然后冻干。得到67％(3.4g)氨基-HES 10/0.4。

取150mg 4-甲酰基苯甲酸和230mg 1-羟基-1H-苯并三唑(均来Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)溶于10ml N，N-二甲基甲酰胺中(肽合成级，Biosolve，Valkenswaard，NL)，添加204μlN，N′-二异丙基碳二亚胺。在21℃下孵育30分钟后，添加1g氨基-HES 10/0.4。在22℃下振荡19小时后，添加反应混合物至84mL冰冷的丙酮和乙醇的1∶1(v/v)混合物中。在4℃下离心收集沉淀产物，再溶于50ml水中，相对于水透析2天(SnakeSkin透析管，阻断值3.5kD，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)，冻干。

实施例1.4：由羟乙基淀粉和甲酰基苯甲酸合成醛官能化的羟乙基淀粉

氧代-HES10/0.7(MW＝10kD，DS＝0.7)由Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D制备；根据DE 196 28 705A1。

取83mg 4-甲酰基苯甲酸和180mg 1-羟基-1H-苯并三唑(均来自Aldrich，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)溶于5mLN，N-二甲基甲酰胺(DMF，肽合成级，Biosolve，Valkenswaard，NL)，添加78μl N，N′-二异丙基碳二亚胺。在21℃下孵育30分钟后，添加0.5g氧代-HES 10/0.7。在22℃下振荡19小时后，添加反应混合物至37.5mL冰冷的丙酮与乙醇的1∶1(v/v)混合物中。在4℃下离心收集沉淀产物，再溶于2.5ml水与2.5ml DMF的混合物中，再如上所述沉淀一次。如上所述离心收集反应产物，再溶于10ml水，相对于水透析2天(SnakeSkin透析管，阻断值3.5kD，PerbioSciences Deutschland GmbH，Bonn，D)，并冻干。

实施例1.5：由羟乙基淀粉和甲酰基苯甲酸合成醛官能化的羟乙基淀粉

HES10/0.7(MW＝10kD，DS＝0.7)由Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D制备。

取50mg 4-甲酰基苯甲酸和108mg 1-羟基-1H-苯并三唑(均来自Aldrich，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)溶于3mLN，N-二甲基甲酰胺(肽合成级，Biosolve，Valkenswaard，NL)，添加47μl N，N′-二异丙基碳二亚胺。在21℃下孵育30分钟后，添加0.3gHES 10/0.7。在22℃下振荡19小时后，添加反应混合物至23mL冰冷的丙酮与乙醇的1∶1(v/v)混合物中。在4℃下离心收集沉淀产物，再溶于1.5ml水与1.5ml DMF的混合物中，再如上所述沉淀一次。如上所述离心收集反应产物，再溶于10ml水，相对于水透析2天(SnakeSkin透析管，阻断值3.5kD，Perbio SciencesDeutschland GmbH，Bonn，D)，并冻干。

实施例1.6：由氨基官能化的羟乙基淀粉和甲酰基苯甲酸五氟苯基酯合成醛官能化的羟乙基淀粉

氧代-HES10/0.7(MW＝10kD，DS＝0.7)由Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D制备；根据DE 196 28 705 A1。

取6.0g(0.6mmol)氧代-HES10/0.7溶于20ml无水二甲亚砜(DMSO，Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)，在氮气下逐滴加至6ml(60mmol)1，4-二氨基丁烷的11ml无水二甲亚砜溶液中，在40℃下搅拌19小时。添加反应混合物至80ml乙醇与80ml丙酮的混合物中。离心分离产生的沉淀，用20ml乙醇与20ml丙酮的混合物洗涤，再溶于80ml水中，该溶液相对于水透析4天(SnakeSkin透析管，阻断值3.5kD，Perbio SciencesDeutschland GmbH，Bonn，D)，然后冻干。得到52％(3.15g)氨基-HES 10/0.7。

4-甲酰基苯甲酸五氟苯基酯如J.S.Lindsey等人，Tetrahedron50(1994)pp.8941-68，特别是p.8956中所述合成。取50mg氨基-HES 10/0.7溶于0.5ml N，N-二甲基甲酰胺中(肽合成级，Biosolve，Valkenswaard，NL)，添加15.3mg 4-甲酰基苯甲酸五氟苯基酯。在22℃下振荡22小时后，添加反应混合物至3.5ml冰冷的2-丙醇中。在4℃下离心收集沉淀产物，用4ml冰冷的2-丙醇洗涤，再溶于50ml水中，相对于水透析2天(SnakeSkin透析管，阻断值3.5kD，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)，并冻干。

实施例1.7：由羟乙基淀粉和甲酰基苯甲酸五氟苯基酯合成醛官能化的羟乙基淀粉

氧代-HES10/0.7(MW＝10kD，DS＝0.7)由Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D制备；根据DE 196 28 705 A1。

4-甲酰基苯甲酸五氟苯基酯如J.S.Lindsey等人，Tetrahedron50(1994)pp.8941-68，特别是p.8956所述合成。取200mg氧代-HES10/0.7溶于2ml N，N-二甲基甲酰胺中(肽合成级，Biosolve，Valkenswaard，NL)，添加61.2mg 4-甲酰基苯甲酸五氟苯基酯。在22℃下振荡22小时后，添加反应混合物至15ml冰冷的丙酮与乙醇的1∶1(v/v)混合物中。在4℃下离心收集沉淀产物，再溶于1.4ml水与0.7ml DMF的混合物中，再如上所述沉淀一次。如上所述离心收集反应产物，再溶于10ml水，相对于水透析2天(SnakeSkin透析管，阻断值3.5kD，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)，并冻干。

实施例1.8：由氨基官能化的羟乙基淀粉和4-(4-甲酰基-3，5-二甲氧基苯氧基)丁酸合成醛官能化的羟乙基淀粉

氧代-HES10/0.4(MW＝10kD，DS＝0.4)由Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D制备；根据DE 196 28 705 A1。

取5.1g(0.51mmol)氧代-HES 10/0.4溶于15ml无水二甲亚砜(DMSO，Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)，在氮气下逐滴加至5.1ml(51mmol)1，4-二氨基丁烷的10ml无水二甲亚砜溶液中，在40℃下搅拌19小时。添加反应混合物至80ml乙醇与80ml丙酮的混合物中。离心分离产生的沉淀，用20ml乙醇与20ml丙酮的混合物洗涤，再溶于80ml水中。该溶液相对于水透析4天(SnakeSkin透析管，阻断值3.5kD，Perbio SciencesDeutschland GmbH，Bonn，D)，然后冻干。得到67％(3.4g)氨基-HES 10/0.4。

取80.5mg 4-(4-甲酰基-3，5-二甲氧基苯氧基)丁酸(Calbiochem-Novabiochem，Laufelfingen，CH)和61mg 1-羟基-1H-苯并三唑(Aldrich，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)溶于3ml N，N-二甲基甲酰胺中(肽合成级，Biosolve，Valkenswaard，NL)，添加45.4μl N，N′-二异丙基碳二亚胺。在21℃下孵育30分钟后，添加0.3g氨基-HES 10/0.4。在22℃下振荡22小时后，添加反应混合物至23ml冰冷的丙酮与乙醇的1∶1(v/v)混合物中。在4℃下离心收集沉淀产物，再溶于2ml水与1ml DMF的混合物中，再如上所述沉淀一次。如上所述离心收集反应产物，再溶于10ml水，相对于水透析1天(SnakeSkin透析管，阻断值3.5kD，PerbioSciences Deutschland GmbH，Bonn，D)，并冻干。

实施例2：通过还原性胺化合成G-CSF偶联物

实施例2.1(a)：通过还原性胺化，使用含未氧化的还原端的羟乙基淀粉在pH＝7.4下合成G-CSF-偶联物(对比实施例)

在实施例2.1中，试图采用WO 03/074087(实施例12，p.22-23)的合成法制备HES-G-CSF偶联物。

向3.33μl G-CSF(Neupogen^，来自Amgen，Munchen，D或Granocyte^，来自Aventis Pharma AG，Zurich，CH，分别为3mg/ml)的0.1M磷酸钠缓冲液pH 7.4水溶液中添加3.33μl HES 10/0.4(MW＝10kD，DS＝0.4，Suprarnol Parenteral Colloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D，79mg/ml)的相同缓冲液的溶液。向该混合物中添加3.33μl 60mM氰基硼氢化钠的相同缓冲液的溶液，所得混合物在22℃下孵育4小时。然后，再添加3.33μl新鲜制备的60mM氰基硼氢化钠溶液。在30小时孵育期间，共添加5份3.33μl新鲜制备的60mM氰基硼氢化钠溶液。通过凝胶电泳分析反应混合物。未观察到反应。

实施例2.1(b)：通过还原性胺化，使用含未氧化的还原端的羟乙基淀粉在pH＝5.0至9.2下合成G-CSF-偶联物(对比实施例)

向3.33μL G-CSF(G-CSF来自Strathmann Biotec A G，Hamburg，D，3mg/mL)的指定缓冲液水溶液中添加3.33μl HES(300mg/ml)的相同缓冲液溶液。混合物冷却至4℃，在4℃下添加3.33μL 60mM氰基硼氢化钠的相同缓冲液溶液，所得混合物在4℃下孵育20小时。

使用下列HES制剂和缓冲液：

a)缓冲液：0.1M乙酸钠缓冲液pH 5.0

-HES 10/0.4(MW＝10kD，DS＝0.4，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)

-HES 10/0.7(MW＝10kD，DS＝0.7，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)

-HES50/0.4(MW＝50kD，DS＝0.4，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)

-HES50/0.7(MW＝50kD，DS＝0.7，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Pvodheim，D)

b)缓冲液：0.1M磷酸钠缓冲液pH 7.2

-HES 10/0.7(MW＝10kD，DS＝0.7，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)

c)缓冲液：0.1M硼酸钠缓冲液pH 8.3

-HES 10/0.7(MW＝10kD，DS＝0.7，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)

d)缓冲液：0.2M硼酸钾缓冲液pH 9.2

-HES10/0.7(MW＝10kD，DS＝0.7，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)

通过凝胶电泳分析各反应混合物。偶联反应未观察到或几乎可以忽略(未显示反应b)至d)的凝胶扫瞄结果)。

实施例2.2：通过还原性胺化，使用含氧化的还原端的羟乙基淀粉，在pH5.0至9.2下合成G-CSF-偶联物(对比实施例)

向3.33μL G-CSF(G-CSF来自Strathmann Biotec A G，Hamburg，D，3mg/mL)的指定缓冲液水溶液中添加3.33μl氧代-HES(300mg/ml)的相同缓冲液溶液。混合物冷却至4℃，在4℃下添加3.33μL60mM氰基硼氢化钠的相同缓冲液溶液，所得混合物在4℃下孵育17小时。

使用下列HES制剂和缓冲液：

a)缓冲液：0.1M乙酸钠缓冲液pH 5.0

-氧代-HES10/0.7(MW＝10kD，DS＝0.7，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)

-氧代-HES50/0.4(MW＝50kD，DS＝0.4，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)

-氧代-HES50/0.7(MW＝50kD，DS＝0.7，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)

b)缓冲液：0.1M磷酸钠缓冲液pH 7.2

-HES10/0.7(MW＝10kD，DS＝0.7，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)

c)缓冲液：0.1M硼酸钠缓冲液pH 8.3

-HES10/0.7(MW＝10kD，DS＝0.7，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)

d)缓冲液：0.2M硼酸钾缓冲液pH 9.2

-HES10/0.7(MW＝10kD，DS＝0.7，Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)

采用凝胶电泳分析各反应混合物。偶联反应未观察到或几乎可以忽略(未显示反应b)至d)的凝胶扫瞄结果)。

HES10/0.4(MW＝10kD，DS＝0.4)的氧化由SupramolParenteral Colloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D进行；根据DE 19628 705 A1。

实施例2.3：通过还原性胺化，使用经高碘酸盐氧化合成的醛官能化的羟乙基淀粉合成G-CSF-偶联物

向3.33μl G-CSF(Granocyte^，来自Aventis Pharma AG，Zurich，CH和Neupogen^，来自Amgen，Munchen，D，分别3mg/mL)的0.1M乙酸钠缓冲液pH 5.0水溶液中添加3.33μl醛基-HES(79mg/mL)的相同缓冲液溶液。向混合物中添加3.33μL 60mM氰基硼氢化钠的相同缓冲液溶液，混合物在21℃下孵育25小时。通过凝胶电泳分析反应混合物。

使用下列醛官能化的HES偶联物：

(i-N)使用Neupogen^根据上述实施例1.1(a)制备；

(ii-N)使用Neupogen^根据上述实施例1.1(b)制备；

(iii-N)使用Neupogen^根据上述实施例1.2(a)制备；

(iv-N)使用Neupogen^根据上述实施例1.2(b)制备；

(i-G)使用Granocyte^根据上述实施例1.1(a)制备；

(ii-G)使用Granocyte^根据上述实施例1.1(b)制备；

(iii-G)使用Granocyte^根据上述实施例1.2(a)制备；

(iv-G)使用Granocyte^根据上述实施例1.2(b)制备。

实施例2.4：通过还原性胺化，使用由羟乙基淀粉与甲酰基羧酸偶联合成的醛官能化的羟乙基淀粉合成G-CSF-偶联物

向3.33μl G-CSF(G-CSF来自Strathmann Biotec AG，Hamburg，D，3mg/ml)的0.1M乙酸钠缓冲液pH 5.0水溶液中添加3.33μl醛基-HES(118.5mg/mL)的相同缓冲液溶液，冷却至4℃。在4℃下，向混合物中添加3.33μl 60mM氰基硼氢化钠的相同缓冲液溶液，混合物在4℃下孵育17小时。通过凝胶电泳分析反应混合物。

使用下列醛官能化的HES偶联物：

(v)根据上述实施例1.4制备；

(vi)根据上述实施例1.5制备；

(vii)根据上述实施例1.6制备；

(viii)根据上述实施例1.7制备；

(ix)根据上述实施例1.8制备。

实施例2.5：通过还原性胺化，使用由羟乙基淀粉与甲酰基羧酸偶联成的醛官能化的羟乙基淀粉合成G-CSF-偶联物

向2.5ml G-CSF(G-CSF来自Strathmann Biotec AG，Hamburg，D，2.27mg/ml)的0.1M乙酸钠缓冲液pH 5.0水溶液中添加136mg如上述实施例1.3所述制备的醛基-HES 10/0.4，溶液冷却至0℃。向混合物中添加2.5ml冰冷的40mM氰基硼氢化钠的相同缓冲液溶液，混合物在4℃下孵育17小时。通过凝胶电泳分析反应混合物。

实施例3：通过SH烷化合成G-CSF偶联物

氧代-HES10/0.7(MW＝10kD，DS＝0.7)由Supramol ParenteralColloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D制备；根据DE 196 28 705A1。

取6.0g(0.6mmol)氧代-HES10/0.7溶于20ml无水二甲亚砜(DMSO，Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)中，在氮气下逐滴加至6ml(60mmol)1，4-二氨基丁烷的11ml无水二甲亚砜溶液中，在40℃下搅拌19小时。添加反应混合物至含80ml乙醇与80ml丙酮的混合物中。离心分离所得沉淀，以含20ml乙醇与20ml丙酮的混合物洗涤，再溶于80ml水中。溶液相对于水透析4天(Snake Skin透析管，阻断值3.5kD，Perbio SciencesDeutschland GmbH，Bonn，D)，然后冻干。得到52％(3.15g)氨基-HES 10/0.7。

取132μg氨基-HES 10/0.7溶于100μl磷酸钠缓冲液(0.1M，0.15M NaCl，50mM EDTA，pH 7.2)中，添加10μl 17.5mg/mlN-α(马来酰亚胺基乙酰氧基)琥珀酰亚胺酯(AMAS)的无水DMSO溶液(均来自Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)，该澄清溶液在25℃下孵育80分钟，然后在40℃下孵育20分钟。使用VIVASPIN 0.5ml浓缩器，5KD MWCO(VIVASCIENCE，Hannover，D)，在13,000rpm下离心过滤除去过量AMAS，以450μl磷酸盐缓冲液洗涤2次30分钟，以450μl缓冲液B洗涤一次。向残留溶液中添加10μg G-CSF(Neupogen^，来自Amgen，Munchen，D和Granocyte^来自Aventis Pharma AG，Zurich，CH，分别3μg/μl，溶于磷酸盐缓冲液中)，混合物在25℃下孵育16小时。真空浓缩后，通过凝胶电泳分析反应混合物。

选用下列方法：

(x)G-CSF(Granocyte^)采用磷酸钠缓冲液(0.1M，0.15MNaCl，50mM EDTA，pH 7.2)作为缓冲液B。

(xi)G-CSF(Neupogen^)采用磷酸钠缓冲液(0.1M，0.15MNaCl，50mM EDTA，pH 7.2)作为缓冲液B。

(xii)G-CSF(Granocyte^)采用磷酸钠缓冲液(0.1M，0.15MNaCl，50mM EDTA，pH 7.2)与8M尿素，1％SDS，pH 7.4的1∶1(v/v)混合物作为缓冲液B。

(xiii)G-CSF(Neupogen^)采用磷酸钠缓冲液(0.1M，0.15MNaCl，50mM EDTA，pH 7.2)与8M尿素，1％SDS，pH 7.4的1∶1(v/v)混合物作为缓冲液B。

(xiv)G-CSF(Granocyte^)采用8M尿素，1％SDS，pH 7.4作为缓冲液B。

(xv)G-CSF(Neupogen^)采用8M尿素，1％SDS，pH 7.4作为缓冲液B。

实施例4：通过具有反应性酯基的羟乙基淀粉与G-CSF反应合成G-CSF偶联物

实施例4.1：

氧代-HES10/0.4(MW＝10,559 D，DS-0.4)由SupramolParenteral Colloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D制备；根据DE 19628 705 A1。氧代-HES的氧化度为95％。

取66mg氧代-HES10/0.4溶于0.5ml无水DMF中。向该溶液中添加3.4mg N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯，混合物在室温下搅拌2小时。所得溶液的反应性HES浓度为13％重量比。

取浓度约0.5mg G-CSF/ml的G-CSF的溶液(Strathmann BiotecAG，Hamburg，D)，采用冷却离心机，在阻断值10kD下进行超速离心，浓缩至10mg/ml的浓度。

向0.5ml该浓缩G-CSF溶液中添加180μl碳酸氢钠溶液。然后，分3份(每次100μl)滴加反应性HES溶液至蛋白质溶液中，直到约30分钟后反应结束为止。因此，反应性HES∶G-CSF的总摩尔比为20∶1。然后，使用0.1N HCl调节混合物的pH至4.0。

HPGPC分析(高效凝胶渗透层析)得到约70％的产率。该结果示于图9。

混合物可在pH 4.0下和4℃下贮存4天，根据HPGPC分析，仍保持稳定，即没有变化。

可以采用10Kd超滤膜，在冷却离心机中，没有困难地降低混合物中反应副产物，如未反应的氧代-HES和游离N-羟基琥珀酰亚胺及溶剂的含量。该降低含量实验的结果示于图10。

实施例4.2：

氧代-HES10/0.4(MW＝10,559D，DS＝0.4)由SupramolParenteral Colloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D制备；根据DE 19628 705 A1。氧代-HES的氧化度为95％。

取400mg氧代-HES10/0.4溶于1ml无水DMF中。向该溶液中添加21mg N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯，混合物在室温下搅拌2小时。所得溶液的反应性HES浓度为40％重量比。

取浓度约0.5mg G-CSF/ml的G-CSF的溶液(Strathmann BiotecAG，Hamburg，D)，采用冷却离心机，在阻断值10kD下进行超速离心，浓缩至10mg/ml的浓度。

向0.5ml该浓缩G-CSF溶液中添加180μl碳酸氢钠溶液。然后，分3份(每次100μl)滴加反应性HES溶液至蛋白质溶液中，直到约30分钟后反应结束为止。因此，反应性HES∶G-CSF的总摩尔比约为50∶1。然后，使用0.1N HCl调节混合物的pH至4.0。

HPGPC分析(高效凝胶渗透层析)得到大于95％的产率。没有检测到未反应的G-CSF。该结果示于图11。

混合物可采用超滤技术，没有困难地纯化。该结果示于图12。

实施例5

5.1.纯化

获得基本上具有与商品Neupogen^(Amgen)相同特性的纯化G-CSF，取其中一份保留不修饰，作为对照。

5.2 HES与G-CSF的偶联物合成

基本上如实施例4.2所述，但是其中改用氧代-HES50/0.7(样品编号A60)，或如实施例2.5所述(样品编号A32)合成偶联物，并用于进一步的缓冲液交换和纯化。

5.3 G-CSF与HES-修饰的G-CSF样品在纯化前使用阴离子交换层析进行的缓冲液交换

取HES-修饰的G-CSF样品或未修饰的G-CSF(作为对照)(0.5-5mg蛋白质)使用Vivaspin 6浓缩器单元(10.000 MWCO PES，Vivascience，目录编号VS0602)进行缓冲液交换。样品浓缩至0.5-0.7ml，用10mM磷酸钠缓冲液pH 7.2稀释至5ml。各样品进行该浓缩/缓冲液交换循环共3次。

5.4 G-CSF与其HES-修饰型在DEAE-Sepharose柱上进行的阴离子交换层析

纯化HES-修饰后的G-CSF样品及用于对照的未修饰的G-CSF样品，在室温下采用AKTA explorer10系统通过离子交换层析进行分析。取HES化之前或之后的等份G-CSF，通过超滤相对于所述缓冲液A(10mM磷酸钠，pH 7.2)透析，或使用约13倍体积的缓冲液A稀释。柱中含有2ml DEAE-Sepharose(DEAE-SepharoseCL-6B，Pharmacia目录编号17-0710-01)，经添加5.0倍柱体积(CV)的6.5M胍/HCl、5.0CV缓冲液A、5.0CV缓冲液C(1.5MNaCl，含于10mM磷酸钠溶液，pH 7.2)，然后10CV缓冲液A进行再生。然后以0.6ml/min的流速注射样品(0.8-4.5ml，含于10mM磷酸钠缓冲液pH 7.2)。然后用10ml(使用2ml样品环管时)或20ml(使用5ml样品环管时)缓冲液A洗涤样品环管，根据添加的样品，柱再用0-22CV的缓冲液A洗涤(流速＝0.8ml/min)。采用5CV的线性梯度0-100％缓冲液B和2.5CV等浓度100％缓冲液B，以0.6ml/min的流速进行洗脱。柱子用5CV缓冲液A再平衡，如上所述采用1ml/min的流速再生。

需要时，样品采用Vivaspin浓缩器浓缩并如上所述进行缓冲液交换。样品在使用0.2μm过滤单位(Corning，目录编号431215)进行无菌过滤之前或之后贮存在0-8℃的10mM乙酸钠缓冲液pH4.0中。制备下列样品用于体外生物分析和进一步分析。蛋白质浓度如下文第6.1节所述测定：

I.0401-15/A33，0.44mg/ml，体积＝500μl

G-CSF(大肠杆菌(E.coli))

II.0402-03/A60，0.35mg/ml，体积＝600μl

H-G-CSF(G-CSF HES修饰，10/0.4)

III.0401-13/A32，0.28mg/ml，体积＝900μl

G-CSF(大肠杆菌)HES修饰，10/0.4

IV.0401-28/A58，0.60mg/ml，体积＝350μl

Neupogen

V.0401-28/A57，0.50mg/ml，体积＝400μl

Neulasta

5.5.G-CSF样品的进一步分析

取样品等份分析其蛋白质含量及进行修饰。

5.5(a)通过RP-HPLC进行G-CSF蛋白质定量

样品的G-CSF蛋白质含量采用未修饰的蛋白质制剂(浓度：0.453mg/ml)作为标准进行定量。

采用Dionex HPLC系统，其包括泵P 680 A HPG、脱气单元Degasys DG 1210、自动取样器和注射器ASI-100、样品环管250μL、柱恒温器TCC 100和UV/Vis-检测器UVD 170U，其中装有软件Chromeleon层析管理系统。使用预置柱CC 8/4 Nucleosil 120-5 C4，Macherey-Nagel，目录编号No.721889和分离柱40C-4 NucleosilMPN，5μm，125×4mm RP-柱(Macherey-Nagel，订购编号720045.40)。溶剂A为H₂O加0.06％(v/v)三氟乙酸，溶剂B为90％乙腈的水溶液，其中含0.06％(v/v)三氟乙酸，流速：1ml/min。在214、221、260和280nm波长下进行UV检测。

将约10-20μg样品注射至RP-HPLC柱中。采用下列梯度：

0-5分钟：0-10％B

-17分钟：10-45％B

-35分钟：45-80％B

-36分钟：80-100％B

-38分钟：100％B

-39分钟：10％B

-45分钟：10％B

采用标准G-CSF制剂的洗脱位置所得波峰面积，与约29分钟处在280nm波长下所得波峰的参考标准比较。

5.5(b)G-CSF蛋白质的还原+羧酰氨甲基化

取G-CSF蛋白质样品等份，如文献所述进行还原和羧酰氨甲基化(Guillermina Forno，Mariela Bollati Fogolin，Marcos Oggero，Ricardo Kratje，Marina Etcheverrigaray，Harald S.Conradt，ManfredNimtz(2004)N-and O-linked carbohydrates and glycosylation siteoccupancy in recombinant human granulocyte-macrophagecolony-stimulating factor secreted by a Chinese hamster ovary cellline；European J.Biochem，273(5)，907-919)。羧酰氨甲基化反应产生修饰的半胱氨酸残基。羧酰氨甲基化的蛋白质在含1M尿素，pH 7.8的25mM NH₄HCO₃中以0.2∶10的酶/底物比进行内切蛋白酶Glu-C消化18-24小时。

5.5(c)通过RP-HPLC分离内切-Glu-C肽

内切Endo-Glu-C消化产生的肽在Dionex HPLC系统上分离，该系统包括泵P 680 A HPG、脱气单元Degasys DG 1210、自动取样器和注射器ASI-100、样品环管250μL、柱恒温器TCC 100和UV/Vis-检测器UVD170U，其中装有软件Chromeleon层析管理系统。使用预置柱CC 8/4 Nucleosil 120-5C4，Macherey-Nagel，目录编号No.721889和分离柱40C-4 Nucleosil MPN，5μm，125×4mmRP-柱(Macherey-Nagel，订购编号7200 45.40)。溶剂A为H₂O加0.06％(v/v)三氟乙酸，溶剂B为90％乙腈的水溶液，含0.06％(v/v)三氟乙酸，流速：1ml/min。采用下列梯度：

0-5分钟：10％B

-17分钟：45％B

-65分钟：100％B

-67分钟：100％B

-69分钟：10％B

-75分钟：10％B

在214、221、260和280nm波长下进行UV检测。分离内切-Glu-C消化产生的肽(未示出数据)。

5.5(d)通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法分析蛋白质水解的肽

采用质谱法检测所制备的不同样品中G-CSF的完整N-末端。还原且羧酰氨甲基化的蛋白质样品经内切蛋白酶Glu-C消化产生的样品(3-5μg)直接用于MS-分析(不包括步骤6.3的RP-HPLC)，采用含C18反向物质的ZipTip吸管尖端，根据制造商的说明进行纯化。用0.1％(v/v)甲酸洗涤后，以10μl 0.1％(v/v)甲酸的60％(v/v)乙腈溶液进行肽的洗脱。

蛋白质水解(内切-Glu-C)的肽片段用Bruker ULTRAFLEX飞行时间(TOF/TOF)仪器以线性正离子模式进行分析，采用22.4mg3，5-二甲氧基-4-羟基-肉桂酸在400μL乙腈和600μl 0.1％(v/v)三氟乙酸水溶液中的溶液作为基质；并采用含19mgα-氰基-4-羟基肉桂酸在相同溶剂混合物中的溶液作为基质，使用反射器(reflectron)加强解析度，测定(糖基)-肽。取1μL浓度约1-10pmol-μl^-1的样品溶液与等量各基质混合。将混合物点样在不锈钢目标上，在室温下干燥后进行分析。在质量范围900-5000道尔顿下记录质谱。下表显示预期质量与各G-CSF肽的相关性。

表：由XM02产生的内切-Glu-C肽的理论(单同位素)质量

质量(道耳顿)	本研究的观测值	aa位置	人工修饰	肽序列
					2132.11	+	1-20	Cys_CAM：pos 18m/z 2189.13	MTPLGPASSLPQSFLLKCLE
1512.81	+	21-34	-----	QVRKIQGDGAALQE
					1534.74	+	35-47	Cys_CAM：pos 37，43m/z 1648.78	KLCATYKLCHPEE
4942.63	-	48-94	Cys_CAM：pos 65，75m/z 5056.68	LVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALE
					502.25	-	95-99	-----	GISPE
2835.37	-	100-124	-----	LGPTLDTLQLDVADFATTIWQQMEE
					4026.08	+	125-163	-----	LGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLE
1438.83	+	164-175	-----	VSYRVLRHLAQP

半胱氨酸残基被羧酰氨甲基化；以脂肪标记的肽在未修饰的G-CSF的MALDI/TOF图谱上检测。

包括蛋白质位点1-20的N-末端内切-Glu-C肽(MTPLGPASSLPQSFLLKCLE；m/z 2189.1)，在如上所述使用内切蛋白酶Glu-C蛋白水解处理G-CSF后，在样品的MALDI/TOF-MS图谱上检测。

5.6.结果

5.6(a)G-CSF和HES修饰的变体的纯化

A32、A60和未修饰的G-CSF采用DEAE-Sepharose CL-6B柱如A4所述进行纯化。

对于未修饰的样品0401-15/A33，流过液在280nm处未检测到显著吸收，以40-50％缓冲液B(0.16-0.20M NaCl)，体积6ml洗脱的蛋白质在280nm处的特定波峰面积为660mAU×ml×mg^-1。

样品0401-14/A32(来源于0401-15/A33；使用醛基HES10/0.4进行HES化)在浓度20-80％(0.08-0.32M NaCl)缓冲液B的大梯度范围和12ml体积下进行洗脱。在280nm处，在流过液中检测到约90％的总波峰面积，其中包含约50％的总蛋白质，通过如上述图13所示的SDS-PAGE分析进行检测，其分子量显然稍高于洗脱出的蛋白质。

样品0402-03/A60(用HES 10/0.4HES化，按照实施例4.2的完整程序)在类似浓度的20-80％缓冲液B下洗脱出，体积为10.5ml。此时，在280nm处，在流过液中检测到约35％的总波峰面积，然而，通过SDS-PAGE分析，该级分未检测到未结合的蛋白质。与样品0401-15/A33的特定波峰面积相比，样品0402-03/A60的洗出液中蛋白质含量比加至柱中的指定蛋白质量高45％。

蛋白质的回收率根据洗脱级分的波峰面积(A280nm)与未修饰的G-CSF蛋白质相比较来计算。

表1：280nm检测的波峰面积的比较

DEAE-Sepharose操作序号	说明	所计算的蛋白质注射量	洗出液面积[280nm](mAU×ml)	与DS01 A33的洗出液相比，洗出液的收率**
					DS01 A33	G-CSF	0.5mg	330	(0.50mg)
DS03 A32	Hes化HES 10/0.4	4.0mg	1560	2.36mg
					DS04 A60	Hes化HES 10/0.4	0.9mg	870	1.32mg

^**蛋白质的RP-HPLC定量证实了这些结果

5.6(b)通过内切蛋白酶Glu-C处理后的肽图谱和MALDI/TOF MS的蛋白质分析

通过MALDI/TOF-MS清楚地检测羧酰氨甲基化的未修饰G-CSF(图14)和市售产品Neupogen(未显示数据)二者经内切蛋白酶Glu-C消化产生的N-末端肽(MTPLGPASSLPQSFLLKC^*LE，m/z2189.1；半胱氨酸被羧酰氨甲基化)。该信号在通过还原性胺化进行HES-修饰的样品(图15)和Neulasta(未显示数据)中不存在，表示该肽被修饰。对于HES-修饰的G-CSF，其中通过活化酯化学法进行修饰，以相对于未修饰的初始物A32的相对信号强度来检测N-末端肽(图16)，表示该衍生物的HES修饰已在不同氨基酸侧链上实现。

HES修饰的G-CSF(样品A33和市售产品Neulasta)的N-末端测序显示其N-末端已封闭，提示该蛋白质衍生物的N-末端甲硫氨酸残基被HES衍生物修饰。由于在样品A60中未检测到相当于包含氨基酸残基位点35-47的肽(KLCATYKLCHPEE；两个半胱氨酸残基均被羧酰氨甲基化，m/z 1648.78)的信号，因此其结论是其中一个或两个赖氨酸残基(位点35和41)可能被HES修饰。

参考文献：

Guillermina Forno，Mariela Bollati Fogolin，Marcos Oggero，Ricardo Kratje，Marina Etcheverrigaray，Harald S.Conradt，ManfredNimtz(2004)N-and O-linked carbohydrates and glycosylation siteoccupancy in recombinant human granulocyte-macrophagecolony-stimulating factor secreted by a Chinese hamster ovary cellline；European J.Biochem，271(5)，907-919

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实施例6：在实施例2.5和4.2中制得的并且按照实施例5纯化的G-CSF-偶联物的体外结果：G-CSF变体对小鼠NFS-60细胞的有丝分裂原性

已知G-CSF对嗜中性粒细胞系的造血细胞的增殖、分化和活化具有特定影响。采用小鼠NFS-60细胞(N.Shirafuji等人，Exp.Hematol.1989，17，116-119)测试G-CSF变体的促有丝分裂能力。细胞在含有5-10％WEHI-3B(DSMZ，Braunschweig，D；如DSMZ所述培养)条件培养基作为外源性IL-3来源的含10％胎牛血清的RPMI培养基(Gibco INVITROGEN GmbH，Karlsruhe)中生长，离心收集，洗涤，在24-孔板中分成每孔100,000个细胞。使细胞在不含WEHI-3B条件培养基的RPMI培养基中37℃适应1小时，然后添加用相同培养基稀释的G-CSF生长因子样品。在37℃下，使NFS-60细胞接触纯化的G-CSF变体3天，然后电子计数细胞(Casy TT细胞计数器，Scharfe System，Reutlingen，D)。结果示于图12。由图12可见，与未添加生长因子的培养基相比，不同G-CSF变体(0.5-50pg/ml)可在3天后刺激细胞数增加。

未修饰的对照蛋白质G-CSF/A33和G-CSF/A58对细胞的刺激程度非常类似(ED₅₀＝5-10pg/ml)，而G-CSF偶联物G-CSF/A60G-CSF/A32和G-CSF/A57比未修饰型只显示活性稍微降低(ED₅₀＝10-25pg/ml)(参见图8)。

实施例7 G-CSF-偶联物的合成

实施例7.1.醛基-HES衍生物的合成

实施例7.1(a)氨基HES10/0.4的合成

取5.12g氧代-HES10/0.4(MW＝10000D，DS＝0.4，SupramolParenteral Colloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D，根据DE 196 28705 A1)在80℃真空下加热过夜，在氮气下溶于25mL无水二甲亚砜(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)中，添加5.13mL 1，4-二氨基丁烷。在40℃下搅拌17小时后，添加反应混合物至150mL丙酮与乙醇的冰冷1∶1(v/v)混合物中。在4℃下离心收集沉淀产物，以40mL丙酮与乙醇的冰冷1∶1(v/v)混合物洗涤，离心收集。粗产物溶于80mL水中，相对于水透析4天(SnakeSkin透析管，阻断值3.5kD，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)，然后冻干。分离产物的产率为67％。

实施例7.1(b)醛基HES 10/0.4的合成

取105mg 4-甲酰基苯甲酸和135mg 1-羟基-1H-苯并三唑(均来自Aldrich，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)溶于7mL N，N-二甲基甲酰胺中(肽合成级，Biosolve，Valkenswaard，NL)，添加135μL N，N′-二异丙基碳二亚胺(Fluka，Sigma-Aldrich ChemieGmbH，Taufkirchen，D)。在21℃下孵育30分钟后，添加0.7g氨基HES10/0.4(如1.1所述合成)。在22℃下振荡18小时后，添加反应混合物至42mL丙酮与乙醇的冰冷1∶1(v/v)混合物中。在4℃下离心收集沉淀产物，再溶于5mL DMF中，如上所述使用42mL乙醇/丙酮沉淀。离心后，所收集的沉淀溶于水中，相对于水透析1天SnakeSkin透析管，阻断值3.5kD，Perbio Sciences DeutschlandGmbH，Bonn，D)，然后冻干。分离产物的产率为95％。

实施例7.1(c)氨基HES10/0.7的合成

取6.02g氧代-HES10/0.7(MW＝10000D，DS＝0.7，SupramolParenteral Colloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D，根据DE 196 28705)在氮气下溶于32mL无水二甲亚砜(Fluka，Sigma-AldrichChemie GmbH，Taufkirchen，D)中，添加6.03mL 1，4-二氨基丁烷。在40下搅拌17小时后，添加反应混合物至150mL丙酮与乙醇的冰冷1∶1(v/v)混合物中。在4℃下离心收集沉淀产物，以40mL丙酮与乙醇的冰冷1∶1(v/v)混合物洗涤，离心收集。粗产物溶于80mL水中，相对于水透析4天(SnakeSkin透析管，阻断值3.5kD，PerbioSciences Deutschland GmbH，Bonn，D)，然后冻干。分离产物的产率为52％。

实施例7.1(d)醛基HES10/0.7的合成

取150mg 4-甲酰基苯甲酸和230mg 1-羟基-1H-苯并三唑(均来自Aldrich，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)溶于10mL N，N-二甲基甲酰胺(肽合成级，Biosolve，Valkenswaard，NL)，添加204μL N，N′-二异丙基碳二亚胺(Fluka，Sigma-Aldrich ChemieGmbH，Taufkirchen，D)。在21℃下孵育30分钟后，添加1g氨基HES10/0.7(如1.3所述合成)。在22℃下振荡19小时后，添加反应混合物至84mL冰冷2-丙醇中。在4℃下离心收集沉淀产物，再溶于50mL水中，相对于水透析2天(SnakeSkin透析管，阻断值3.5kD，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)，然后冻干。分离产物的产率为83％。

实施例7.1(e)氨基HES30/0.4的合成

取5g氧代-HES30/0.4(MW＝30000D，DS＝0.4，SupramolParenteral Colloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D，采用根据DE 19628 705 A1的成分摩尔比)在80℃真空下加热过夜，然后在氮气下溶于28mL无水二甲亚砜(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)中，添加1.67mL 1，4-二氨基丁烷。在40℃下搅拌17小时后，添加反应混合物至175mL丙酮与乙醇的冰冷1∶1(v/v)混合物中。在4℃下离心收集沉淀产物。粗产物溶于40mL水中，相对于水透析2天(SnakeSkin透析管，阻断值3.5kD，PerbioSciences Deutschland GmbH，Bonn，D)，然后冻干。未测定分离产物的产率。

实施例7.1(f)醛基HES30/0.4的合成

取130mg 4-甲酰基苯甲酸和153mg 1-羟基-1H-苯并三唑(均来自Aldrich，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)溶于36mL N，N-二甲基甲酰胺(肽合成级，Biosolve，Valkenswaard，NL)中，添加110μL N，N′-二异丙基碳二亚胺(Fluka，Sigma-Aldrich ChemieGmbH，Taufkirchen，D)。在21℃下孵育30分钟后，添加2.61g氨基HES30/0.4(如1.5所述合成)。在22℃下振荡22.5小时后，添加反应混合物至160mL丙酮与乙醇的冰冷1∶1(v/v)混合物中。在4℃下离心收集沉淀产物，以丙酮与乙醇的冰冷1∶1(v/v)混合物洗涤。离心后，沉淀溶于30mL水中，相对于水透析1天(SnakeSkin透析管，阻断值3.5kD，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)，然后冻干。分离产物的产率为81％。

实施例7.1(g)氨基HES30/0.7的合成

取5g氧代-HES 30/0.7(MW＝30000D，DS＝0.7，SupramolParenteral Colloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D，采用根据DE 19628 705 A1的成分摩尔比)在80℃真空下加热过夜，然后在氮气下溶于28mL无水二甲亚砜(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)中，添加1.67mL 1，4-二氨基丁烷。在40℃下搅拌17小时后，添加反应混合物至175mL丙酮与乙醇的冰冷1∶1(v/v)混合物中。在4℃下离心收集沉淀产物。粗产物溶于40mL水中，相对于水透析2天(SnakeSkin透析管，阻断值3.5kD，PerbioSciences Deutschland GmbH，Bonn，D)，然后冻干。未测定分离产物的产率。

实施例7.1(h)醛基HES30/0.7的合成

取122mg 4-甲酰基苯甲酸和144mg 1-羟基-H-苯并三唑(均来自Aldrich，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)溶于34mLN，N-二甲基甲酰胺(肽合成级，Biosolve，Valkenswaard，NL)中，添加103μL N，N′-二异丙基碳二亚胺(Fluka，Sigma-Aldrich ChemieGmbH，Taufkirchen，D)。在21℃下孵育30分钟后，添加2.46g氨基HES30/0.7(如1.7所述合成)。在22℃下振荡22.5小时后，添加反应混合物至160mL丙酮与乙醇的冰冷1∶1(v/v)混合物中。在4℃下离心收集沉淀产物，以丙酮与乙醇的冰冷1∶1(v/v)混合物洗涤。离心后，沉淀溶于30mL水中，相对于水透析1天(SnakeSkin透析管，阻断值3.5kD，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)，然后冻干。分离产物的产率为87％。

实施例7.1(i)氨基HES50/0.7的合成

取6.09g氧代-HES50/0.7(MW＝50000D，DS＝0.7，SupramolParenteral Colloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D，采用根据DE 19628 705 A1的成分摩尔比)在80℃真空下加热过夜，然后在氮气下溶于32mL无水二甲亚砜(Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)中，添加1.22mL 1，4-二氨基丁烷。在40℃下搅拌17小时后，添加反应混合物至150mL丙酮与乙醇的冰冷1∶1(v/v)混合物中。在4℃下离心收集沉淀产物。以丙酮与乙醇的冰冷1∶1(v/v)混合物洗涤，离心收集。粗产物溶于80mL水中，相对于水透析4天(SnakeSkin透析管，阻断值3.5kD，Perbio SciencesDeutschland GmbH，Bonn，D)，然后冻干。分离产物的产率为82％。

实施例7.1(i)醛基HES50/0.7的合成

取125mg 4-甲酰基苯甲酸和174mg 1-羟基-1H-苯并三唑(均来自Aldrich，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)溶于38mL N，N-二甲基甲酰胺(肽合成级，Biosolve，Valkenswaard，NL)中，添加155μL N，N′-二异丙基碳二亚胺(Fluka，Sigma-Aldrich ChemieGmbH，Taufkirchen，D)。在21℃下孵育30分钟后，添加3.8g氨基HES50/0.7(如1.9所述合成)。在22℃下振荡19小时后，添加反应混合物至160mL丙酮与乙醇的冰冷1∶1(v/v)混合物中。在4℃下离心收集沉淀产物，再溶于20mL N，N-二甲基甲酰胺中，如上所述以80mL丙酮与乙醇的冰冷1∶1(v/v)混合物沉淀。离心后，沉淀溶于50mL水中，相对于水透析2天(SnakeSkin透析管，阻断值3.5kD，Perbio Sciences Deutschland GmbH，Bonn，D)，然后冻干。分离产物的产率为77％。

实施例7.2通过还原性胺化合成HES-G-CSF偶联物

实施例7.2(a)缓冲液交换A：

取33mL 0.454mg/mL hG-CSF(XM02，BioGeneriX AG，Mannheim，D)的10mM乙酸钠溶液、50mg/mL山梨糖醇和0.004％Tween 80，pH 4.0，在0℃下，使用Vivaspin 15R浓缩器(VS15RH11，5KD MWCO，Vivascience AG，Hannover，D)通过渗滤浓缩至4mL，再使用0.1M乙酸钠缓冲液，pH 5.0稀释至15mL。重复该渗滤2次。该最后渗滤步骤的最终浓度为3mg/mL。

实施例7.2(b)hG-CSF与实施例7.1(b)、7.1(d)和7.1(i)的醛基HES衍生物的反应

经过缓冲液交换成0.1M乙酸钠缓冲液，pH 5.0(如以上7.2(a)所述)之后，向1.67mL hG-CSF溶液中添加1.67mL HES-衍生物和1.67mL 60mM氰基硼氢化钠在相同缓冲液中的溶液，该溶液在4℃下孵育15.5小时。所有溶液均冷却至0℃后才混合。

采用下列最终HES浓度：

39.4mg/mL 根据实施例7.1(b)和7.1(d)制备的HES衍生物。

197mg/mL 根据实施例7.1(j)制备的HES衍生物。

197mg/mL HES50/0.7(MW＝50000D，DS＝0.7，SupramolParenteral Colloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)作为反应对照。

通过凝胶电泳分析反应混合物(参见图17)。

实施例7.2(c)缓冲液交换B：

取20mL 0.454mg/mL hG-CSF(XM02，BioGeneriX AG，Mannheim，D)的10mM乙酸钠溶液、50mg/mL山梨糖醇和0.004％Tween 80，pH 4.0，在15℃下，使用Vivaspin 15R浓缩器(VS 15RH11，5KD MWCO，Vivascience AG，Hannover，D)通过渗滤浓缩至4mL，再使用0.1M乙酸钠缓冲液，pH 5.0稀释至15mL。重复该渗滤2次。该最后渗滤步骤中的最终浓度为1.5mg/mL。

实施例7.2(d)hG-CSF与实施例7.1(f)和7.1(h)的醛基HES衍生物的反应

经过缓冲液交换成0.1M乙酸钠缓冲液，pH 5.0(如以上7.2(c)所述)之后，向3.3mL hG-CSF溶液中添加3.3mL 789mg HES-衍生物和3.3mL 60mM氰基硼氢化钠在相同缓冲液中的溶液，该溶液在4℃下孵育30小时。所有溶液均冷却至0℃后才混合。

17小时后取样用作反应对照。通过凝胶电泳分析反应混合物(参见图18)。

实施例7.3通过N，N′-琥珀酰亚胺基碳酸酯偶联合成HES-GCFS偶联物

实施例7.3(a)通过具有反应性酯基的羟乙基淀粉与G-CSF的反应合成G-CSF偶联物

取400mg氧代-HES10/0.7(由Supramol Parenteral ColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D制备；根据DE 196 28 705 A1，氧代-HES的氧化度为95％)溶于1ml无水DMF中。向该溶液中添加21mg N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯，在室温下搅拌该混合物2小时。所得溶液的反应性HES浓度为40％重量比。

取浓度约0.5mg G-CSF/ml的G-CSF溶液(Strathmann BiotecAG，Hamburg，D)用冷却离心机以阻断值100kD超速离心浓缩至浓度为10mg/ml。

向0.5ml该浓缩G-CSF溶液中添加180μl碳酸氢钠溶液。然后分3份(每次各100μl)滴加反应性HES溶液至蛋白质溶液中，直到约30分钟后反应已结束为止。因此反应性HES∶G-CSF的总摩尔比为约50∶1。然后使用0.1N HCl调节混合物pH至4.0。

HPGPC分析(高效凝胶渗透层析)得到的产率超过95％。没有检测到未反应的G-CSF。此结果示于图19。

实施例7.4体外测定

G-CSF变体对小鼠NFS-60细胞的有丝分裂原性

已知G-CSF对嗜中性粒细胞系的造血细胞的增殖、分化和活化作用具有特定影响。采用小鼠NFS-60细胞(N.Shirafuji等人，Exp.Hematol.1989，17，116-119)测试G-CSF变体的促有丝分裂能力。细胞在含5-10％WEHI-3B(DSMZ，Braunschweig，D；如DSMZ所述培养)条件培养基作为外源性IL-3来源的含10％胎牛血清的RPMI培养基(Gibco INVITROGEN GmbH，Karlsruhe，D)中生长，离心收集，洗涤，在24-孔板中分成每孔100,000个细胞。使细胞在不含WEHI-3B条件培养基的RPMI培养基中37℃适应1小时，然后添加用相同培养基稀释的G-CSF生长因子样品。在37℃下，使NFS-60细胞接触纯化的G-CSF变体3天(根据实施例5.3、5.4进行纯化，根据实施例5.5(a)进行蛋白质定量)：

Neupogen^、Neulasta^均来自Amgen，

″HES-GCFS10/0.4偶联物″按照实施例7.2(b)制备，

″HES-GCFS10/0.7偶联物″按照实施例7.2(b)制备，

″HES-GCFS30/0.4偶联物″按照实施例7.2(d)制备，

″HES-GCFS30/0.7偶联物″按照实施例7.2(d)制备，

″HES-GCFS50/0.7偶联物″按照实施例7.2(b)制备，

″HES-GCFS10/0.7偶联物(Supramol)″按照实施例7.3(a)制备，

″伪孵育″(＝反应对照，197mg/ml HES 50/0.7，MW 50000D，DS7，Supramol Parenteral Colloids GmbH，Rosbach Rodheim，Germany)，

然后电子计数细胞(Casy TT细胞计数器，Scharfe System，Reutlingen，D)。其结果示于表2和图20。在所有情况下，表2和图20所示蛋白质含量仅代表偶联物的G-CSF含量，并且以GlycoThera所测定的浓度为基础。由图20可见，与未添加生长因子的培养基相比，不同G-CSF变体(2.5-250pg/ml)可在3天后刺激细胞数增加。所有变体均在250pg/ml的浓度下达到相同的最高刺激水平。

表2：由G-CSF变体诱导的小鼠NF S-60细胞的增殖

浓度[pg/ml]	0	2.5	2.8	5	5.7	10	11.3	25	28.4	50	56.7	250	283.5
														Neupogen	0.44	0.86		1.20		1.69		2.33		2.49		2.41
HES-GCSF10/0.7	0.44	0.72		0.93		1.44		2.14		2.41		2.41
														HES-GCSF10/0.4	0.44	0.72		0.97		1.40		2.17		2.67		2.75
HES-GCSF50/0.7	0.44	0.62		0.70		0.97		1.68		2.15		2.32
														伪孵育	0.44	0.85		1.31		1.91		2.38		2.47		2.41
HES-GCSF30/0.4	0.44	0.82		1.21		1.62		2.28		2.50		2.60
														HES-GCSF30/0.7	0.44	0.80		1.09		1.66		2.20		2.35		2.44
Neulasta	0.44	063		0.80		1.12		1.83		2.25		2.33
														HES-GCSF10/0.7(Supramol)	0.44		0.73		1.13		1.58		2.24		2.48		2.46

实施例7.5hG-CSF偶联物在大鼠中的体内生物效应

大鼠抵达时[雄性CRL：CD^大鼠(7周大)，Charles RiverDeutschland GmbH，Sanghofer Weg 7，D-97633 Sulzfeld]随机分成每组5只。适应7天后，淘汰状态较差的大鼠，换成备用动物。大鼠抵达时的体重为181-203g。

每组随机选出的5只大鼠经静脉内施用下列未偶联或偶联的G-CSF样品(根据实施例5.3、5.4纯化，根据实施例5.5(a)进行蛋白质定量)，每公斤体重施用100μg蛋白质(注射速度15秒/剂量，载体：5ml PBS/公斤体重)：

Neupogen^、Neulasta^均来自Amgen，

″HES-GCFS10/0.4偶联物″(10/0.4)根据实施例7.2(b)制备，

″HES-GCFS10/0.7偶联物″(10/0.7)根据实施例7.2(b)制备，

″HES-GCFS30/0.4偶联物″(30/0.4)根据实施例7.2(d)制备，

″HES-GCFS30/0.7偶联物″(30/0.7)根据实施例7.2(d)制备，

″HES-GCFS50/0.7偶联物″(50/0.7)根据实施例7.2(b)制备，

″HES-GCFS10/0.7偶联物(Supramol)″(S10-0.7)根据实施例7.3(a)制备，

″伪孵育″(＝反应对照，197mg/ml HES50/0.7，MW 50000D，DS7，Supramol Parenteral Colloids GmbH，Rosbach Rodheim，Germany)，和

载体对照

在轻乙醚麻醉下，所有动物从眼球后静脉丛抽出约200μLEDTA全血的血样。在试验前5天，在早晨对已禁食一夜的所有动物采血一次。试验第1至8天，每天采血2次，其间间隔12小时。第一天的第一份血样在施用G-CSF/GCSF-偶联物之前采集。

白细胞(WBC)计数用Bayer ADVIA^TM 120(德国Fernwald)进行。其结果示于图21。

Claims (78)

1.一种制备包含蛋白质和聚合物或其衍生物的偶联物的方法，其中该聚合物为羟烷基淀粉(HAS)且蛋白质为粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，该方法包括聚合物或其衍生物的至少一个官能团A与蛋白质的至少一个官能团Z反应，由此形成共价连接，其中Z选自氨基、硫醇基、醛基和酮基，且

-其中，如果Z为醛基或酮基，A包含与Z形成该连接的氨基，或

-其中，如果Z为氨基，A选自反应性羧基和醛基、酮基或半缩醛基，

--其中，如果A为醛基、酮基或半缩醛基，该方法还包括向聚合物中引入A，以产生聚合物衍生物

---由聚合物与至少双官能化合物反应，其中一个官能团可与聚合物反应，并且至少另一个官能团为醛基、酮基或半缩醛基，或者是进一步化学修饰可产生醛基、酮基或半缩醛基的官能团，或

---氧化该聚合物，形成至少一个，特别至少两个醛基，或

--其中，如果A为反应性羧基，该方法还包括向聚合物中引入A，产生聚合物衍生物

---选择性氧化聚合物的还原端，并活化所产生的羧基，或

---由聚合物的未氧化的还原端与碳酸二酯反应，或

-其中，如果Z为硫醇基，A包含

--马来酰亚胺基或

--卤乙酰基

与Z形成所述连接。

2.根据权利要求1的方法，其中所述羟烷基淀粉为羟乙基淀粉。

3.根据权利要求2的方法，其中所述羟乙基淀粉的分子量为2至200kD，优选4至130kD，更优选4至70kD。

4.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中Z为醛基或酮基。

5.根据权利要求4的方法，其中所述醛基或酮基位于蛋白质的碳水化合物侧链和/或蛋白质的N-末端基团。

6.根据权利要求5的方法，其还包括氧化蛋白质的碳水化合物侧链和/或氧化蛋白质的N-末端基团，产生醛基或酮基。

7.根据权利要求6的方法，其中所述氧化反应是采用酶法或用高碘酸盐进行的，需要时，其分别可在除去末端唾液酸之后进行。

8.根据权利要求4至7中任一项的方法，其还包括在包含基团A的聚合物衍生物与包含基团Z的蛋白质反应之前，先由聚合物的未氧化的还原端与包含可与聚合物的未氧化还原端反应的官能团和基团A的至少双官能连接化合物反应。

9.根据权利要求4至8中任一项的方法，其中A为氨基氧基或酰肼基。

10.根据权利要求8或9的方法，其中所述至少双官能连接化合物为均双官能化合物。

11.根据权利要求10的方法，其中所述均双官能化合物包含两个氨基氧基。

12.根据权利要求11的方法，其中所述均双官能化合物为O-[2-(2-氨基氧-乙氧基)-乙基]羟胺。

13.根据权利要求8至12中任一项的方法，其中所述聚合物与所述至少双官能连接化合物的反应在水性介质中进行。

14.根据权利要求11至13中任一项的方法，其中所述聚合物与所述至少双官能连接化合物的反应产生肟连接和/或氧氨基连接。

15.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中Z为氨基。

16.根据权利要求15的方法，其还包括选择性氧化聚合物的还原端，并由氧化的聚合物与N，N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯在其氧化的还原端上反应，产生包含反应性羧基A的聚合物衍生物。

17.根据权利要求15的方法，其还包括由还原端未氧化的聚合物的至少一个羟基与碳酸二酯反应，产生反应性羧基A。

18.根据权利要求17的方法，其中所述碳酸二酯为对称性二酯。

19.根据权利要求17或18的方法，其中酯的醇成分选自：N-羟基琥珀酰亚胺、磺酸化N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基苯并三唑和硝基或卤素取代的苯酚。

20.根据权利要求19的方法，其中所述卤素取代的苯酚选自：硝基苯酚、二硝基苯酚、三氯苯酚、三氟苯酚、五氯苯酚和五氟苯酚。

21.根据权利要求17至20中任一项的方法，其中还原端未氧化的聚合物的至少一个羟基与碳酸二酯反应产生反应性酯基A的反应在无水非质子极性溶剂中进行。

22.根据权利要求21的方法，其中所述溶剂为二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺或其混合物。

23.根据权利要求15的方法，其中A为醛基、酮基或半缩醛基，该方法还包括由聚合物与至少双官能化合物的官能团M反应，产生聚合物衍生物，该至少双官能化合物还包含至少另一个为醛基，酮基或半缩醛基A的官能团Q。

24.根据权利要求23的方法，其中M包含氨基。

25.根据权利要求23的方法，其中A为醛基、酮基或半缩醛基，该方法还包括由聚合物与至少双官能化合物的官能团M反应，产生聚合物衍生物，该至少双官能化合物还包含至少一个不是醛基、酮基或半缩醛基的其它官能团Q，该方法还包括由官能团Q与至少一种合适的化合物反应，产生包含醛基、酮基或半缩醛基A的聚合物衍生物。

26.根据权利要求24的方法，其中M和Q包含氨基。

27.根据权利要求25或26的方法，其中所述至少一种合适的化合物包含羧基和醛基、酮基或半缩醛基。

28.根据权利要求27的方法，其中所述至少一种合适的化合物为甲酰基苯甲酸或4-(4-甲酰基-3，5-二甲氧基苯氧基)丁酸。

29.根据权利要求25或26的方法，其中M包含氨基，且Q包含β-羟基氨基。

30.根据权利要求29的方法，其中所述聚合物在其氧化的还原端与至少双官能化合物的官能团M反应。

31.根据权利要求29的方法，其还包括氧化β-羟基氨基，产生醛基。

32.根据权利要求31的方法，其中所述氧化反应使用高碘酸盐进行。

33.根据权利要求15的方法，其中所述聚合物使用高碘酸盐进行开环氧化反应，产生具有至少一个，特别至少两个醛基A的聚合物衍生物。

34.根据权利要求23至33中任一项的方法，其中所述聚合物或聚合物衍生物与蛋白质的反应为还原性胺化。

35.根据权利要求34的方法，其中还原性胺化在NaCNBH₃的存在下进行。

36.根据权利要求34或35的方法，其中还原性胺化在pH7或以下进行。

37.根据权利要求36的方法，其中该pH为6或以下。

38.根据权利要求34至37中任一项的方法，其中还原性胺化在0至25℃的温度下进行。

39.根据权利要求34至38中任一项的方法，其中还原性胺化在水性介质中进行。

40.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中Z为硫醇基。

41.根据权利要求40的方法，其中A包含卤素乙酰基，该方法还包括由聚合物的任选氧化的还原端与具有至少两个各包含氨基的官能团的至少双官能化合物反应，产生具有至少一个包含氨基的官能团的聚合物衍生物，该方法还包括由聚合物衍生物与单卤素取代的乙酸和/或反应性单卤素取代的乙酸衍生物反应。

42.根据权利要求41的方法，其中所述卤素为Br或I。

43.根据权利要求41或42的方法，其中所述至少双官能化合物为具有2至10个碳原子的二氨基烷。

44.根据权利要求41或42的方法，其中所述至少双官能化合物为具有1至5个亚烷基单位的二氨基聚乙二醇。

45.根据权利要求41至44中任一项的方法，其中所述聚合物与所述至少双官能化合物在其氧化的还原端反应。

46.根据权利要求41至45中任一项的方法，其中所述包含卤素乙酰基的聚合物衍生物与蛋白质在包含二甲基甲酰胺与水的混合物的溶剂存在下反应。

47.根据权利要求40的方法，其中A包含马来酰亚胺基，该方法还包括聚合物在其任选氧化的还原端与包含可与该任选氧化的还原端反应的官能团U的至少双官能化合物反应，该至少双官能化合物还包含可经化学修饰产生马来酰亚胺基的官能团W，该方法还包括化学修饰官能团W，产生马来酰亚胺基。

48.根据权利要求47的方法，其中U包含氨基。

49.根据权利要求47或48的方法，其中W包含氨基。

50.根据权利要求47至49中任一项的方法，其中包含W的聚合物衍生物与包含可与W反应的官能团并且还包含马来酰亚胺基的至少双官能化合物反应。

51.根据权利要求50的方法，其中所述至少双官能化合物为N-(α-马来酰亚胺基乙酰氧基)琥珀酰亚胺酯。

52.一种根据权利要求1至51中任一项的方法制得的偶联物。

53.根据权利要求52的偶联物，其中A为反应性羧基，且其中通过聚合物的至少一个羟基与碳酸二酯反应向还原端未氧化的聚合物中引入A，并且其中包含一个聚合物分子和通过酰胺键与该聚合物连接的至少一个，特别是1至10个蛋白质分子。

54.一种包含蛋白质和聚合物或其衍生物的偶联物，其中该聚合物为羟烷基淀粉(HAS)，蛋白质为粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，其具有如下式的结构：

和/或

其中R₁、R₂和R₃分别独立为氢或具有2至10个碳原子的羟基烷基、羟基芳基、羟基芳烷基或羟基烷芳基，优选氢或羟基烷基，更优选氢或羟基乙基，

其中G选自O和S，优选O，并且

其中L为任选适当取代的直链、分支和/或环状烃残基，任选包含至少一个杂原子，优选具有2至60个碳原子的烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基残基。

55.根据权利要求54的偶联物，其中-L-为-(CH₂)n-，其中n＝2、3、4、5、6、7、8、9、10，优选2、3、4、5、6，更优选2、3、4，特别优选4。

56.一种包含蛋白质和聚合物或其衍生物的偶联物，其中该聚合物为羟烷基淀粉(HAS)，蛋白质为粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，其具有如下式的结构：

和/或

其中R₁、R₂和R₃分别独立为氢或具有2至10个碳原子的羟基烷基、羟基芳基、羟基芳烷基或羟基烷芳基，优选氢或羟基烷基，更优选氢或羟基乙基，且

其中G选自O和S，优选O。

57.一种包含蛋白质和聚合物或其衍生物的偶联物，其中该聚合物为羟烷基淀粉(HAS)，蛋白质为粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，其具有如下式的结构：

和/或

其中R₁、R₂与R₃分别独立为氢或具有1至10个碳原子的羟基烷基、羟基芳基、羟基芳烷基或羟基烷芳基，优选氢或羟基烷基，更优选氢或羟基乙基，且

其中L为任选适当取代的直链、分支和/或环状烃残基，任选包含至少一个杂原子，优选具有2至60个碳原子的烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基残基。

58.根据权利要求57的偶联物，其中-L-为

        -[(CR_aR_b)_mG]_n[CR_cR_d]_o-

其中R_a、R_b、R_c、R_d分别独立为氢、烷基、芳基，优选氢，其中G选自O和S，优选O，并且其中

m为1、2、3或4，其中n个基团(CR_aR_b)中的残基R_a和R_b可相同或不同；

n为0至20，优选0至10，更优选1、2、3、4或5，最优选1或2；

o为0至20，优选0至10，更优选1、2、3、4或5，最优选1或2，其中o个基团(CR_cR_d)中的残基R_c和R_d可相同或不同。

59.根据权利要求57或58的偶联物，其中R_a、R_b、R_c、R_d为氢，m＝2；n＝1；且o＝2。

60.一种包含蛋白质和聚合物或其衍生物的偶联物，其中该聚合物为羟烷基淀粉(HAS)，蛋白质为粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，其具有如下式的结构：

其中R₁、R₂和R₃分别独立为氢或具有2至10个碳原子的羟基烷基、羟基芳基、羟基芳烷基或羟基烷芳基，优选氢或羟基烷基，更优选氢或羟基乙基。

61.一种包含蛋白质和聚合物或其衍生物的偶联物，其中该聚合物为羟烷基淀粉(HAS)，蛋白质为粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，其具有如下式的结构：

其中R₁、R₂和R₃分别独立为氢或具有2至10个碳原子的羟基烷基、羟基芳基、羟基芳烷基或羟基烷芳基，优选氢或羟基烷基，更优选氢或羟基乙基，并且

其中连接-O-(C＝O)-由羧基或反应性羧基与HAS分子的羟基反应形成，其中HAS″是指不含所述羟基的HAS分子。

62.一种包含蛋白质和聚合物或其衍生物的偶联物，其中该聚合物为羟烷基淀粉(HAS)，蛋白质为粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，其具有如下式的结构：

和/或

其中R₁、R₂和R₃分别独立为氢或具有2至10个碳原子的羟基烷基、羟基芳基、羟基芳烷基或羟基烷芳基，优选氢或羟基烷基，更优选氢或羟基乙基，并且

其中L为任选取代的直链、分支和/或环状烃残基，任选包含至少一个杂原子，具有1至60个，优选1至40个，更优选1至20个，更优选1至10个，更优选1至6个，更优选1至2个碳原子，尤其优选1个碳原子，L特别为CH₂。

63.一种包含蛋白质和聚合物或其衍生物的偶联物，其中该聚合物为羟烷基淀粉(HAS)，蛋白质为粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，其具有如下式的结构：

其中R₁、R₂和R₃分别独立为氢或具有2至10个碳原子的羟基烷基、羟基芳基、羟基芳烷基或羟基烷芳基，优选氢或羟基烷基，更优选氢或羟基乙基，并且

其中L₁和L₂分别独立为任选取代的直链、分支和/或环状烃残基，任选包含至少一个杂原子，包含烷基、芳基、芳烷基杂烷基和/或杂芳烷基部分，所述残基具有1至60个，优选1至40个，更优选1至20个，更优选1至10个碳原子，并且

其中D为一个连接，优选由连接L₁的合适官能团F₂与连接L₂的合适官能团F₃所形成的共价连接。

64.根据权利要求63的偶联物，其中L₁为-(CH₂)n-，其中n＝2、3、4、5、6、7、8、9、10，优选2、3、4、5、6，更优选2、3、4，特别优选为4。

65.根据权利要求63或64的偶联物，其中L₂包含任选适当取代的芳基部分，优选包含6个碳原子的芳基部分，L₂特别优选为C₆H₄。

66.根据权利要求63至65中任一项的偶联物，其中F₂选自：

-C-C-双键或C-C-三键或芳香族C-C-键；

-硫醇基或羟基；

-烷基磺酸酰肼、芳基磺酸酰肼；

-1，2-二元醇；

-1，2-氨基-硫醇类；

-叠氮化物；

-1，2-氨基醇类；

-氨基-NH₂或包含结构单位-NH-的氨基的衍生物，如氨基烷基、氨基芳基、氨基芳烷基或烷芳基氨基；

-羟基氨基-O-NH₂，或包含结构单位-O-NH-的羟基氨基的衍生物，如羟基烷基氨基、羟基芳基氨基、羟基芳烷基氨基或羟基烷芳基氨基；

-烷氧基氨基、芳氧基氨基、芳烷氧基氨基或烷芳氧基氨基，其各包含结构单位-NH-O-；

-具有羰基-Q-C(＝G)-M的残基，其中G为O或S，M为例如：

---OH或-SH；

--烷基氧基、芳基氧基、芳烷基氧基或烷芳基氧基；

--烷基硫基、芳基硫基、芳烷基硫基或烷芳基硫基；

--烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、芳烷基羰基氧基、烷芳基羰基氧基；

--活化的酯，例如羟胺的酯，其具诸如N-羟基琥珀酰亚胺的亚胺结构或具有结构单位O-N，其中N为杂芳基化合物的一部分，或其中G＝O且Q不存在，如具有取代芳基残基如五氟苯基、对硝基苯基或三氯苯基的芳氧基化合物；

其中Q不存在或为NH或杂原子，如S或O；

--NH-NH₂或-NH-NH-；

--NO₂；

-腈基；

-羰基，如醛基或酮基；

-羧基；

--N＝C＝O基团或-N＝C＝S基团；

-乙烯基卤化物基团，如乙烯基碘化物或乙烯基溴化物基团或三氟甲磺酸根；

--C≡C-H；

--(C＝NH₂C1)-O烷基

--(C＝O)-CH₂-Hal基团，其中Hal为Cl、Br或I；

--CH＝CH-SO₂-；

-包含结构-S-S-的二硫化物基团；

-基团

-基团

其中F₃为可与F₂形成化学键的官能团，优选选自上述基团，F₂优选包含-NH-部分，更优选包含氨基，F₃优选包含-(C＝G)-部分，更优选-(C＝O)-，更优选-(C＝G)-G-部分，更优选-(C＝O)-G-，特别优选-(C＝O)-O，D特别优选为酰胺键。

67.一种包含蛋白质和聚合物或其衍生物的偶联物，其中该聚合物为羟烷基淀粉(HAS)，蛋白质为粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，其具有如下式的结构：

其中-CH₂-N₂-部分中的碳原子来源于通过开环氧化反应引入聚合物中的醛基，其中氮原子来源于蛋白质的氨基。

68.一种包含蛋白质和聚合物或其衍生物的偶联物，其中该聚合物为羟烷基淀粉(HAS)，蛋白质为粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，其具有如下式的结构：

其中R₁、R₂和R₃分别独立为氢或具有2至10个碳原子的羟基烷基、羟基芳基、羟基芳烷基或羟基烷芳基，优选氢或羟基烷基，更优选氢或羟基乙基，并且

其中L为任选取代的直链、分支和/或环状烃残基，任选包含至少一个杂原子，包含烷基、芳基、芳烷基杂烷基和/或杂芳烷基部分，该残基具有2至60个，优选2至40个，更优选2至20个，更优选2至10个碳原子，并且

其中硫原子来源于蛋白质的半胱氨酸残基或二硫化物基团。

69.根据权利要求68的偶联物，其中-L-为

         -[(CR_aR_b)_mG]_n[CR_cR_d]_o-

其中R_a、R_b、R_c、R_d分别独立为氢、烷基、芳基，优选氢，其中G选自O和S，优选O，并且其中

m为1、2、3或4，最优选2，其中m个基团(CR_aR_b)中的残基R_a和R_b可相同或不同；

n为1至20，优选1至10，最优选1、2、3或4；

o为1至20，优选1至10，更优选1、2、3、4、5，更优选1或2，最优选1，其中o个(CR_cR_d)基团中的残基R_c和R_d可相同或不同；

或者，

其中

n为0；且

o为2至20，优选2至10，更优选2、3、4、5、6、7或8，其中o个基团CR_cR_d中的残基R_c和R_d可相同或不同。

70.一种包含蛋白质和聚合物或其衍生物的偶联物，其中该聚合物为羟烷基淀粉(HAS)，蛋白质为粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，其具有如下式的结构：

其中R₁、R₂和R₃分别独立为氢或具有2至10个碳原子的羟基烷基、羟基芳基、羟基芳烷基或羟基烷芳基，优选氢或羟基烷基，更优选氢或羟基乙基，并且

其中L为任选取代的直链、分支和/或环状烃残基，任选包含至少一个杂原子，包含烷基、芳基、芳烷基杂烷基和/或杂芳烷基部分，该残基具有2至60个，优选2至40个，更优选2至20个，更优选2至10个碳原子，并且

其中硫原子来源于蛋白质的半胱氨酸残基或二硫化物基团。

71.根据权利要求70的偶联物，其中-L-为

       -[(CR_aR_b)_mG]_n[CR_cR_d]_o-

其中R_a、R_b、R_c、R_d分别独立为氢、烷基、芳基，优选氢，其中G选自O和S，优选O，且其中

m为1、2、3或4，最优选2，其中m个基团CR_aR_b中的残基R_a和R_b可相同或不同；

n为1至20，优选1至10，最优选1、2、3或4；

o为1至20，优选1至10，更优选1、2、3、4、5，更优选1或2，最优选1，其中o个基团CR_cR_d中的残基R_c和R_d可相同或不同；

或者

其中

n为0；

o为2至20，优选2至10，更优选2、3、4、5、6、7或8，其中o个基团CR_cR_d中的残基R_c和R_d可相同或不同。

72.根据权利要求54至71中任一项的偶联物，其中所述羟烷基淀粉为羟乙基淀粉。

73.根据权利要求72的偶联物，其中所述羟乙基淀粉的分子量为2至200kD，优选4至130kD，更优选4至70kD。

74.根据权利要求52至73中任一项的偶联物，其用于治疗人体或动物体的方法。

75.一种药物组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求52至73中任一项的偶联物。

76.根据权利要求75的药物组合物，其还包含至少一种药学上可接受的稀释剂、佐剂或载体。

77.根据权利要求52至73中任一项的偶联物在制备用于治疗特征在于造血或免疫功能降低的疾病的药物中的用途。

78.根据权利要求77的用途，其中所述疾病是由化疗、放射疗法、感染性疾病、重度慢性中性粒细胞减少症或白血病引起的。

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