CN104017069A - 含醛基羟乙基淀粉衍生物修饰的牛血清白蛋白偶联物及其制备方法 - Google Patents

含醛基羟乙基淀粉衍生物修饰的牛血清白蛋白偶联物及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104017069A
CN104017069A CN201410284597.7A CN201410284597A CN104017069A CN 104017069 A CN104017069 A CN 104017069A CN 201410284597 A CN201410284597 A CN 201410284597A CN 104017069 A CN104017069 A CN 104017069A
Authority
CN
China
Prior art keywords
hydroxyethylamyle
derivative
bovine serum
serum albumin
amino
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201410284597.7A
Other languages
English (en)
Inventor
杨钊
郑家晴
王凤山
张燕
周星彤
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong Qidu Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Shandong Qidu Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong Qidu Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Shandong Qidu Pharmaceutical Co Ltd
Priority to CN201410284597.7A priority Critical patent/CN104017069A/zh
Publication of CN104017069A publication Critical patent/CN104017069A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种含醛基羟乙基淀粉衍生物修饰的牛血清白蛋白偶联物及其制备方法。所述偶联物的结构式如下：

Description

含醛基羟乙基淀粉衍生物修饰的牛血清白蛋白偶联物及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种含醛基羟乙基淀粉衍生物修饰的牛血清白蛋白偶联物及其制备方法。
背景技术
牛血清白蛋白(BSA)，又称第五组分，是牛血清中的一种球蛋白，包含583个氨基酸残基，分子量为66.430kDa，等电点为4.7。牛血清白蛋白在生化实验中有广泛的应用，同时考虑到牛血清白蛋白价格便宜、成本较低、易于检测等优点，本发明使用牛血清白蛋白作为目标蛋白进行偶联实验，探索羟乙基淀粉修饰蛋白质类药物的可行性。
羟乙基淀粉(hydroxyethyl starch，HES)是用糯玉米淀粉(支链淀粉)生产的天然改性聚合物，以玉米或土豆淀粉中的支链淀粉为原料，经过适度的水解、糊化、羟乙基化并经进一步加工精制而成，具有很好的亲水性和分支结构，并且易于实现稳定的大规模生产。羟乙基淀粉作为修饰剂具有如下优点：(1)通过调节分子量、乙基化比例(MS)和C2/C6三大关键属性，可以使得羟乙基淀粉在体内具有不同的代谢效果。(2)HES，如130，具有极高的安全性。(3)与其他同类产品相比具有更低的抗原性。(4)HES的粘度小。
羟乙基淀粉共价修饰蛋白质类药物可以解决或缓解蛋白质或多肽在药用过程中存在的诸多缺点，同时保持合适的天然活性。蛋白质分子中用于与HES进行偶联最常见的基团有氨基，巯基和羧基。由于氨基(多为赖氨酸的e-NH2)往往位于蛋白质分子表面，加之具有较高的亲核反应活性，是目前蛋白质HES修饰中最常用的被修饰基团。本发明即是选择牛血清白蛋白上的氨基作为HES修饰的目标基团。
发明内容
本发明的目的是提供一种含醛基羟乙基淀粉修饰的牛血清白蛋白偶联物，其采用牛血清白蛋白为实验对象，为药物的羟乙基淀粉修饰奠定了基础；本发明同时提供其制备方法。
本发明所述的含醛基羟乙基淀粉衍生物修饰的牛血清白蛋白偶联物，其结构式如下：
其中R1为氢，R2为羟乙基，HES’为不包含末端糖单元的羟乙基淀粉，蛋白质’为除去N端氨基的其余部分的蛋白质。
所述的含醛基羟乙基淀粉衍生物修饰的牛血清白蛋白偶联物的制备方法是将牛血清白蛋白N端氨基通过还原氨化作用与羟乙基淀粉衍生物的末端醛基相连得到共价偶联物，其中，含末端醛基的羟乙基淀粉衍生物按照以下制备：羟乙基淀粉经氧化反应得到含羧基的羟乙基淀粉衍生物，含羧基的羟乙基淀粉衍生物再与两个含双官能团的化合物反应制得。
所述的两个含双官能团的化合物，其中化合物之一优选为两端具有氨基，最优选1,4-二氨基丁烷；化合物之二优选为一端具有醛基，一端具有羧基，最优选4-甲酰基苯甲酸。
1,4-二氨基丁烷结构式如下：
4-甲酰基苯甲酸结构式如下：
所述的制备方法具体包括以下步骤：
(1)羟乙基淀粉经氧化剂氧化制得含羧基羟乙基淀粉衍生物，含羧基羟乙基淀粉衍生物与1,4-二氨基丁烷的一端氨基通过酰胺键偶联，得含有氨基的羟乙基淀粉衍生物；
(2)含有氨基的羟乙基淀粉衍生物通过氨基与4-甲酰基苯甲酸的羧基通过酰胺键偶联，得含有醛基的羟乙基淀粉衍生物；
(3)含有醛基的羟乙基淀粉衍生物通过末端醛基与蛋白质中的氨基经还原胺化作用偶联。
步骤(1)中，含羧基羟乙基淀粉衍生物与1,4-二氨基丁烷按摩尔比1:150进行反应；氧化剂与羟乙基淀粉摩尔比为1～30:1，氧化反应温度为80～100℃；羟乙基淀粉的分子量为40～200kDa；优选130kDa。氧化剂为碘试液、新制氢氧化铜溶液或菲林试液。
步骤(2)中，含有氨基的羟乙基淀粉衍生物与4-甲酰基苯甲酸按摩尔比1:20进行反应。
步骤(3)中，还原胺化反应采用的还原剂为硼氢化钠、硼氰化钾或氰基硼氢化钠，优选氰基硼氢化钠，还原剂与含有醛基的羟乙基淀粉衍生物的摩尔比为15:1。
本发明的有益效果如下：
本发明采用牛血清白蛋白为实验对象，制备得到含醛基羟乙基淀粉衍生物修饰的牛血清白蛋白偶联物，为药物的羟乙基淀粉修饰奠定了基础，本发明的制备方法简单易行，易于实现。
附图说明
图1实施例3制备的偶联物电泳谱图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述。
实施例中偶联结果经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和凝胶排阻色谱-多角度激光光散射(SEC-MALLS)两种方法进行检测。
实施例1
含羧基的羟乙基淀粉衍生物制备：
称量羟乙基淀粉130/0.4(HES130/0.4)10g，于30ml去离子水中溶解后，加入20ml新制氢氧化铜溶液，混匀后，在温度90±5℃下加热10min，此时溶液中有砖红色沉淀生成。然后将反应混合物用流水冷却，以此终止反应。于4000r/min离心10min，取上清液得浅蓝色溶液。向该浅蓝色溶液中加入1mol/L HCl溶液至溶液变为浅黄色，超滤(赛多利斯超滤装置，配备Masterflex蠕动泵，Sartorius VIVAFLOW50超滤膜包，膜包规格为5000MWCOPES)，过阳离子交换树脂，冻干溶液，得含羧基的羟乙基淀粉衍生物。
实施例2
含醛基的羟乙基淀粉衍生物制备：
(1)称量实施例1制备的含羧基的羟乙基淀粉衍生物2.6g于100ml圆底烧瓶中，加入30ml二甲亚砜使其溶解，加热至35℃。量取0.3ml1,4-二氨基丁烷加二甲亚砜稀释至10ml后，将1,4-二氨基丁烷溶液滴加到含羧基的羟乙基淀粉衍生物溶液中，继续在35℃下加热搅拌反应30小时后，将反应物加入到80ml丙酮-乙醇(v/v1:1)混合溶液中析出白色沉淀，于4-7℃下离心，5000r/min，离心10min，倾去上清液得白色沉淀，用30ml去离子水溶解，透析48小时(联合碳化透析袋，MWCO8000-14000，直径：35mm，压平宽度：55mm)，冻干，得含有氨基的HES衍生物。
(2)称量上述制备的含有氨基的HES衍生物1.3g溶于20ml N,N-二甲基甲酰胺中，分别称量30mg4-甲酰基苯甲酸和27mg1-羟基苯并三唑一水合物溶于10ml N，N-二甲基甲酰胺后，加入到上述HES衍生物溶液中，搅拌混匀，加入30微升N,N'-二异丙基碳二亚胺。室温下震荡30小时后，将其加入到60ml乙醇和丙酮(v/v1:1)混合溶液中，4-7℃下离心，5000r/min，离心10min，得白色沉淀，用30ml去离子水溶解，透析48小时(联合碳化透析袋，MWCO8000-14000，直径：35mm，压平宽度：55mm)，冻干，得含醛基的羟乙基淀粉衍生物。
实施例3
将实施例2制备的含醛基的羟乙基淀粉衍生物与牛血清白蛋白偶联：
称量实施例2制备的含醛基的羟乙基淀粉衍生物0.26g溶于10ml0.02M pH5.0乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，再称量6.7mg牛血清白蛋白溶于10ml0.02M pH5.0乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，将上述两个溶液混合并搅拌混匀。在室温下(21±0.5℃)向其中加入1ml氰基硼氢化钠水溶液(2mg/ml)，搅拌反应24小时，取粗产物电泳分析，并应用SEC-MALLS测定分子量。
结果：由电泳图谱(图1)可以观测到偶联反应发生，经凝胶成像计算偶联程度为25.86％；制备的偶联物(泳道1：牛血清白蛋白0.15mg/ml；泳道2：氧化HES；泳道3：偶联样品；泳道4：氧化HES与牛血清白蛋白混合物；泳道5：Marker，分子量分别为200kDa、150kDa、120kDa、100kDa、85kDa、70kDa、60kDa、50kDa)
由SEC-MALLS测定分子量(表1)，偶联后产物分子量稍增大，进一步说明偶联发生。
表1

Claims (9)

1.一种含醛基羟乙基淀粉衍生物修饰的牛血清白蛋白偶联物，其特征在于：其结构式如下：
其中R1为氢，R2为羟乙基，HES’为不包含末端糖单元的羟乙基淀粉，蛋白质’为除去N端氨基的其余部分的蛋白质。
2.一种权利要求1所述的含醛基羟乙基淀粉衍生物修饰的牛血清白蛋白偶联物的制备方法，其特征在于：将牛血清白蛋白N端氨基通过还原氨化作用与羟乙基淀粉衍生物的末端醛基相连得到共价偶联物，其中，含末端醛基的羟乙基淀粉衍生物按照以下制备：羟乙基淀粉经氧化反应得到含羧基的羟乙基淀粉衍生物，含羧基的羟乙基淀粉衍生物再与两个含双官能团的化合物反应制得。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的两个含双官能团的化合物，其中化合物之一为两端具有氨基，化合物之二为一端具有醛基，一端具有羧基。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的两个含双官能团的化合物为1,4-二氨基丁烷和4-甲酰基苯甲酸。
5.根据权利要求2、3或4所述的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)羟乙基淀粉经氧化剂氧化制得含羧基羟乙基淀粉衍生物，含羧基羟乙基淀粉衍生物与1,4-二氨基丁烷的一端氨基通过酰胺键偶联，得含有氨基的羟乙基淀粉衍生物；
(2)含有氨基的羟乙基淀粉衍生物通过氨基与4-甲酰基苯甲酸的羧基通过酰胺键偶联，得含有醛基的羟乙基淀粉衍生物；
(3)含有醛基的羟乙基淀粉衍生物通过末端醛基与蛋白质中的氨基经还原胺化作用偶联。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，含羧基羟乙基淀粉衍生物与1,4-二氨基丁烷按摩尔比1:150进行反应；氧化剂与羟乙基淀粉摩尔比为1～30:1，氧化反应温度为80～100℃；羟乙基淀粉的分子量为40～200kDa；氧化剂为碘试液、新制氢氧化铜溶液或菲林试液。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，含有氨基的羟乙基淀粉衍生物与4-甲酰基苯甲酸按摩尔比1:20进行反应。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，还原胺化反应采用的还原剂为硼氢化钠、硼氰化钾或氰基硼氢化钠，还原剂与含有醛基的羟乙基淀粉衍生物的摩尔比为15:1。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：还原剂为氰基硼氢化钠。
CN201410284597.7A 2014-06-23 2014-06-23 含醛基羟乙基淀粉衍生物修饰的牛血清白蛋白偶联物及其制备方法 Pending CN104017069A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410284597.7A CN104017069A (zh) 2014-06-23 2014-06-23 含醛基羟乙基淀粉衍生物修饰的牛血清白蛋白偶联物及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410284597.7A CN104017069A (zh) 2014-06-23 2014-06-23 含醛基羟乙基淀粉衍生物修饰的牛血清白蛋白偶联物及其制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104017069A true CN104017069A (zh) 2014-09-03

Family

ID=51434108

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410284597.7A Pending CN104017069A (zh) 2014-06-23 2014-06-23 含醛基羟乙基淀粉衍生物修饰的牛血清白蛋白偶联物及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104017069A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023120903A1 (ko) * 2021-12-23 2023-06-29 주식회사 에스엠엘제니트리 다당류에 단백질이 포합된 폴리머, 그 제조 방법, 이를 포함하는 효소 안정화 조성물 및 이를 이용한 표적 핵산 분자 검출 방법

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1638808A (zh) * 2002-03-06 2005-07-13 弗雷泽纽斯卡比德国有限公司 蛋白质与修饰多糖的偶联
CN1832762A (zh) * 2003-08-08 2006-09-13 弗雷泽纽斯卡比德国有限公司 羟烷基淀粉与g－csf的偶联物

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1638808A (zh) * 2002-03-06 2005-07-13 弗雷泽纽斯卡比德国有限公司 蛋白质与修饰多糖的偶联
CN1832762A (zh) * 2003-08-08 2006-09-13 弗雷泽纽斯卡比德国有限公司 羟烷基淀粉与g－csf的偶联物

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023120903A1 (ko) * 2021-12-23 2023-06-29 주식회사 에스엠엘제니트리 다당류에 단백질이 포합된 폴리머, 그 제조 방법, 이를 포함하는 효소 안정화 조성물 및 이를 이용한 표적 핵산 분자 검출 방법

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10583175B2 (en) Rapid-acting insulin formulation comprising a substituted anionic compound
CN105055319B (zh) 一种氟苯尼考可溶性粉及其制备方法
US6410050B1 (en) Cellulose capsule using mixed solution of pectin and glycerin and the manufacturing process thereof
Jindal et al. Synthesis of thiolated alginate and evaluation of mucoadhesiveness, cytotoxicity and release retardant properties
CN102863553B (zh) 一种可交联聚合且含药物配体的壳聚糖衍生物
CN103524750B (zh) 聚乙二醇壳聚糖自组装纳米粒的制备方法
US20130231281A1 (en) Rapid acting insulin formulation comprising an oligosaccharide
CN103804700B (zh) 一种颜色可调的化学交联的光子晶体水凝胶的制备方法
CN103525360A (zh) 一种疏水性骨胶的制备方法
CN101780282B (zh) 一种壳聚糖载丝裂霉素纳米靶向制剂及其制备方法
CN105664175B (zh) 用于活化和缀合生物分子的方法
CN101781373B (zh) 沙丁胺醇修饰胍基化壳聚糖与制备方法和应用
CN104017069A (zh) 含醛基羟乙基淀粉衍生物修饰的牛血清白蛋白偶联物及其制备方法
CN104072608A (zh) 含羧基羟乙基淀粉衍生物修饰的牛血清白蛋白偶联物及其制备方法
CN111388411A (zh) 一种缓解鼻炎的温敏型原位凝胶剂及其制备方法
CN105273076A (zh) 一种聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的制备方法及其药物组合物
CN106068127B (zh) 蛋白质的硫醚缀合方法
CN101361976B (zh) 一种透明质酸修饰聚氰基丙烯酸烷基酯纳米粒及其制备方法和应用
CN102850422A (zh) 地塞米松小分子水凝胶药物传输体系及其制备方法
Barbosa de Souza et al. Hyaluronic Acid in the Intestinal Tract: Influence of Structure, Rheology, and Mucoadhesion on the Intestinal Uptake in Rats
CN103877585B (zh) 壳聚糖衍生物纳米粒子和载药纳米粒子及制备方法
CN111617029A (zh) 洛索洛芬钠凝胶及其制备方法
Hopkins et al. The fractionation of potato starch
US11834524B2 (en) Method for preparing chitin highly dispersible in aqueous phase and chitin prepared thereby
CN113018255B (zh) 一种羧基麦芽糖铁注射液的制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20140903