CN104072608A - 含羧基羟乙基淀粉衍生物修饰的牛血清白蛋白偶联物及其制备方法 - Google Patents

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杨钊
郑家晴
王凤山
张燕
周星彤
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种含羧基羟乙基淀粉衍生物修饰的牛血清白蛋白偶联物及其制备方法。所述的羟乙基淀粉衍生物修饰的牛血清白蛋白偶联物，其结构式如下：

Description

含羧基羟乙基淀粉衍生物修饰的牛血清白蛋白偶联物及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种含羧基羟乙基淀粉衍生物修饰的牛血清白蛋白偶联物及其制备方法。
背景技术
牛血清白蛋白(BSA)，又称第五组分，是牛血清中的一种球蛋白，包含583个氨基酸残基，分子量为66.430kDa，等电点为4.7。牛血清白蛋白在生化实验中有广泛的应用，同时考虑到牛血清白蛋白价格便宜、成本较低、易于检测等优点，本发明使用牛血清白蛋白作为目标蛋白进行偶联实验，探索羟乙基淀粉修饰蛋白质类药物的可行性。
羟乙基淀粉(hydroxyethyl starch，HES)是用糯玉米淀粉(支链淀粉)生产的天然改性聚合物，以玉米或土豆淀粉中的支链淀粉为原料，经过适度的水解、糊化、羟乙基化并经进一步加工精制而成，具有很好的亲水性和分支结构，并且易于实现稳定的大规模生产。羟乙基淀粉作为修饰剂具有如下优点：(1)通过调节分子量、乙基化比例(MS)和C2/C6三大关键属性，可以使得羟乙基淀粉在体内具有不同的代谢效果。(2)HES，如130，具有极高的安全性。(3)与其他同类产品相比具有更低的抗原性。(4)HES的粘度小。
羟乙基淀粉共价修饰蛋白质类药物可以解决或缓解蛋白质或多肽在药用过程中存在的诸多缺点，同时保持合适的天然活性。蛋白质分子中用于与HES进行偶联最常见的基团有氨基，巯基和羧基。由于氨基(多为赖氨酸的e-NH2)往往位于蛋白质分子表面，加之具有较高的亲核反应活性，是目前蛋白质HES修饰中最常用的被修饰基团。本发明即是选择牛血清白蛋白上的氨基作为HES修饰的目标基团。
发明内容
本发明的目的是提供一种含羧基羟乙基淀粉衍生物修饰的牛血清白蛋白偶联物，其采用牛血清白蛋白为实验对象，为药物的羟乙基淀粉修饰奠定了基础；本发明同时提供其制备方法。
本发明所述的含羧基羟乙基淀粉衍生物修饰的牛血清白蛋白偶联物，其结构式如下：
其中R1为氢，R2为羟乙基，HES’为不包含末端糖单元的羟乙基淀粉，蛋白质’为除去N端氨基的其余部分的蛋白质。
所述的含羧基羟乙基淀粉衍生物修饰的牛血清白蛋白偶联物的制备方法，是将牛血清白蛋白N端氨基通过酰胺键与羟乙基淀粉衍生物的羧基偶联形成共价连接物，其中，所述的羟乙基淀粉衍生物是羟乙基淀粉经氧化反应制得。
所述的羟乙基淀粉，其分子量为40kDa～200kDa，优选130kDa。
所述的氧化反应采用的氧化剂包括碘试液、新制氢氧化铜溶液、菲林试液，优选新制氢氧化铜溶液，所述的氧化剂与羟乙基淀粉摩尔比为1～30:1，氧化反应温度为80～100℃。
新制氢氧化铜溶液按照以下物质比例和步骤进行：取等体积5.4％的NaOH溶液和1.5％的CuSO4溶液混匀。
所述的方法具体包括以下步骤：
(1)含羧基的羟乙基淀粉衍生物的制备：
将羟乙基淀粉于去离子水中溶解后，加入氧化剂，混匀后，在温度80～100℃下加热10min，当溶液中有砖红色沉淀生成时，用水冷却终止反应，离心，取上清液得浅蓝色溶液，向浅蓝色溶液中加入HCl溶液至溶液变为浅黄色，超滤，过阳离子交换树脂，冻干溶液，得含羧基的羟乙基淀粉衍生物；
(2)羟乙基淀粉衍生物修饰的牛血清白蛋白偶联物的制备：
将步骤(1)得到的含羧基的羟乙基淀粉衍生物溶于水后，再将牛血清白蛋白加入到上述羟乙基淀粉衍生物溶液中，搅拌溶解，加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，室温搅拌，过夜，透析得到羟乙基淀粉衍生物修饰的牛血清白蛋白偶联物。
反应在1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)存在下进行反应，两者的摩尔比为1:1。EDC在酰胺的生成反应中活化羧基，促使反应进行；NHS与EDC同时使用，可以提高反应产率，并减少副反应的发生。
本发明的有益效果如下：
本发明采用牛血清白蛋白为实验对象，制备得到含羧基羟乙基淀粉衍生物修饰的牛血清白蛋白偶联物，为药物的羟乙基淀粉修饰奠定了基础，本发明的制备方法简单易行，易于实现。
附图说明
图1是实施例2制备的偶联物的电泳谱图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述。
实施例中偶联结果经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和凝胶排阻色谱-多角度激光光散射(SEC-MALLS)两种方法进行检测。
实施例1
含羧基的羟乙基淀粉衍生物制备：
称量羟乙基淀粉130/0.4(HES130/0.4)10g，于30ml去离子水中溶解后，加入20ml新制氢氧化铜溶液，混匀后，在温度90±5℃下加热10min，此时溶液中有砖红色沉淀生成。然后将反应混合物用流水冷却，以此终止反应。于4000r/min离心10min，取上清液得浅蓝色溶液。向该浅蓝色溶液中加入1mol/L HCl溶液至溶液变为浅黄色，超滤(赛多利斯超滤装置，配备Masterflex蠕动泵，Sartorius VIVAFLOW50超滤膜包，膜包规格为5000MWCOPES)，过阳离子交换树脂，冻干溶液，得含羧基的羟乙基淀粉衍生物。
实施例2
将实施例1制备的羟乙基淀粉衍生物与牛血清白蛋白偶联：
称量实施例1制备的羟乙基淀粉衍生物1g溶于10ml水中后，称量50mg牛血清白蛋白加入到上述羟乙基淀粉衍生物溶液中，搅拌溶解，加入15mg NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)和25mg EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)，室温(21±0.5℃)搅拌过夜(24小时)，透析后(联合碳化透析袋，MWCO8000-14000，直径：35mm，压平宽度：55mm)，取粗产物电泳检测，并通过SEC-MALLS检测分子量。
结果：由电泳图谱(图1)可以观测到偶联反应发生，电泳图谱中增加的带宽是由于HES有一定的分子量分布；经凝胶成像计算偶联程度，偶联程度达到93.19％；制备的偶联物(泳道1：Marker，分子量分别为200kDa、150kDa、120kDa、100kDa、85kDa、70kDa、60kDa、50kDa；泳道二：牛血清白蛋白0.1mg/ml；泳道3：氧化HES；泳道4：偶联样品，浓度0.05mg/ml，泳道5：偶联样品，浓度0.1mg/ml，泳道6：偶联样品，浓度0.2mg/ml)。
由SEC-MALLS测定分子量(表1)，偶联后产物分子量增大，也进一步验证了偶联成功。
表1

Claims (8)

1.一种含羧基羟乙基淀粉衍生物修饰的牛血清白蛋白偶联物，其特征在于：其结构式如下：
其中R1为氢，R2为羟乙基，HES’为不包含末端糖单元的羟乙基淀粉，蛋白质’为除去N端氨基的其余部分的蛋白质。
2.一种权利要求1所述的含羧基羟乙基淀粉衍生物修饰的牛血清白蛋白偶联物的制备方法，其特征在于：将牛血清白蛋白N端氨基通过酰胺键与羟乙基淀粉衍生物的羧基偶联形成共价连接物，其中，所述的羟乙基淀粉衍生物是羟乙基淀粉经氧化反应制得。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的羟乙基淀粉的分子量为40～200kDa。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的氧化反应采用的氧化剂为碘试液、新制氢氧化铜溶液或菲林试液。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的氧化剂为新制氢氧化铜溶液。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的氧化剂与羟乙基淀粉摩尔比为1～30:1，氧化反应温度为80～100℃。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)含羧基的羟乙基淀粉衍生物的制备：
将羟乙基淀粉于去离子水中溶解后，加入氧化剂，混匀后，在温度80～100℃下加热10min，当溶液中有砖红色沉淀生成时，用水冷却终止反应，离心，取上清液得浅蓝色溶液，向浅蓝色溶液中加入HCl溶液至溶液变为浅黄色，超滤，过阳离子交换树脂，冻干溶液，得含羧基的羟乙基淀粉衍生物；
(2)羟乙基淀粉衍生物修饰的牛血清白蛋白偶联物的制备：
将步骤(1)得到的含羧基的羟乙基淀粉衍生物溶于水后，再将牛血清白蛋白加入到上述羟乙基淀粉衍生物溶液中，搅拌溶解，加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，室温搅拌，过夜，透析得到羟乙基淀粉衍生物修饰的牛血清白蛋白偶联物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1:1。
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KR102454254B1 (ko) * 2021-12-23 2022-10-14 주식회사 에스엠엘제니트리 다당류에 단백질이 포합된 폴리머, 그 제조 방법, 이를 포함하는 효소 안정화 조성물 및 이를 이용한 표적 핵산 분자 검출 방법

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