CN101781373B - 沙丁胺醇修饰胍基化壳聚糖与制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种沙丁胺醇修饰胍基化壳聚糖与制备方法和应用。采用促进载体跨膜的胍基和具有靶向性的沙丁胺醇双重修饰的方法,通过环氧氯丙烷将沙丁胺醇耦联到壳聚糖分子上,然后利用三氧化硫脲对壳聚糖氨基进行胍基化。对原始壳聚糖载体进行改性,提高其转染效率和对于呼吸道细胞的靶向性。合成方法简便,条件温和。这种改性后的壳聚糖用作基因载体,转染效率较未改性之前有显著提高。对于呼吸道疾病尤其是哮喘的基因治疗具有潜在的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种沙丁胺醇修饰胍基化壳聚糖与制备方法和应用,可以作为高效靶向非病毒基因载体在基因治疗中的应用。
背景技术
载体系统的选择直接影响基因治疗的效率和安全性。常用的基因递送方法主要分为两类,即病毒载体和非病毒载体导入技术。病毒载体转染效率高,是目前体内基因治疗的主要工具。尽管病毒载体具有很高的转染效率,但其存在基因携带能力低、免疫原性和潜在致瘤性等安全性隐患。非病毒载体为基因递送提供了另一条途径,目前非病毒载体主要有脂质体、阳离子高聚物等。但是,因缺少病毒载体天然的基因递送机制,非病毒基因载体的效率低下,极大地限制了其实际应用。
壳聚糖是一种被报道最多的聚合物转基因载体,也是唯一的一种天然阳离子多糖。它具有良好的生物相容性,生物可降解性,低毒性,高阳离子电位。然而,同其他非病毒载体一样,壳聚糖的转染效率低,细胞靶向性差,需要对其进行修饰,以提高其转染效率和特异性。而壳聚糖分子上的羟基和氨基官能团为其联接靶向配体提高转染效率提供了可行性。
1.壳聚糖基因载体的特异性修饰
细胞膜表面存在着大量的受体蛋白,一些特异性基团会和某些细胞膜上的受体发生相互作用而内化吸收。因而将这些特殊基团接到壳聚糖上,有助于增强壳聚糖与细胞膜的作用,提高载体的跨膜转运效率,进而提高转染效率。同时由于这些基团特异性地针对某些细胞上高表达的受体,实现高效率的同时有望实现靶向治疗。这种改性方法已经被广泛的研究。半乳糖改性后的壳聚糖能够特异性地提高HepG2细胞的转染效率;转铁蛋白修饰的壳聚糖在转染HEK293 cells和HeLa细胞时,效率比未修饰时要高出4倍;叶酸修饰的壳聚糖对癌细胞的转染效率明显要高于未改性的壳聚糖;甘露糖修饰的壳聚糖,用于转染抗原呈递细胞(APCs)Raw264.7巨噬细胞,效率也得到了显著提高。
呼吸道上皮细胞,平滑肌细胞,肥大细胞,II型肺泡细胞的细胞膜表面富含β2肾上腺能受体。β2受体激动剂如沙丁胺醇、沙美特罗、福美特罗等,能够和气道平滑肌和肥大细胞膜表面的β2受体相结合,并起到舒张气道平滑肌、减少肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒及其介质的释放、降低微血管的通透性、增加气道上皮纤毛的摆动等效果。这几种β2肾上腺能受体配体被广泛的用作哮喘治疗药物。因此通过将β2肾上腺能受体激动剂(沙丁胺醇)作为靶向配体,用化学方法耦联到壳聚糖上,一方面,可以利用其特异的和呼吸道细胞表面受体结合能力,促进细胞膜对其吸收,实现对呼吸道细胞的高效靶向转染。另一方面,利用这些药物的药理作用,同时起到药物协同治疗的作用。这种改性后的壳聚糖基因载体,对哮喘病及其他呼吸道疾病的治疗具有重大的应用价值。
2.壳聚糖基因载体的胍基化修饰
细胞对载体/DNA复合物的内吞吸收是制约壳聚糖载体转染效率的一个重要原因,因此针对非病毒基因载体跨膜的研究也十分广泛。1988年,Green等证实人免疫缺损病毒(HIV)-1的反式激活蛋白TAT能跨膜转移到细胞质和细胞核内。接着,其他一系列多肽如单纯疱疹病毒(HSV)-1的VP22转录因子,核定位信号(NLS)也陆续被证实具有跨膜能力。人们把此类能携带大分子物质进入细胞,具有穿膜能力的短肽称为细胞穿膜肽(cell penetrating peptide)。细胞穿膜肽能作为生物大分子的有效载体,可提高各种生物大分子,包括寡核苷、肽段、蛋白质、纳米颗粒和脂质体等进入细胞质或细胞核内的能力。Wender等发现,精氨酸在细胞穿膜肽的跨膜中起到关键的作用。于是,可以推测相对于电荷或主链结构来说,精氨酸中的特征基团胍基对于促进细胞内吞影响更显著。胍基可以与RNA主链上的磷酸盐形成氢键,也可以和磷脂双分子层中的磷酸脂形成氢键。胍基的这种氢键作用和本身的强碱性(pKa为~12.5)可能成为控制这些富含精氨酸多肽跨膜的关键因素。Wender课题组合成了一系列聚胍基类肽衍生物,实验发现部分衍生物体现出和精氨酸十聚物相当的细胞摄取效率。同时,他们还提出了将多肽中的氨基进行胍基化的改性方法减少多肽合成的费用。因此对非病毒基因载体进行具有跨膜能力的胍基修饰,有望提高细胞对载体的内吞吸收,从而提高载体的转染效率。我们采取这种方法,对原有壳聚糖进行胍基修饰。结果表明,和未修饰的壳聚糖相比,转染效率得到显著提高。经过胍基修饰的壳聚糖,水溶性极大改善,解决了壳聚糖载体在中性条件下溶解困难的问题。此外,有研究表明胍基化还有助于提高壳聚糖的天然抗菌效果。
与本发明有关的参考文献如下:
Calnan B.J.,Tidor B.,Biancalana S.,et al.Arginine-mediated RNA recognition:thearginine fork.Science.1991;252;1167-1171.
Ying Hu,Yumin Du,Jianhong Yang,et al.Synthesis,characterization and antibacterialactivity of guanidinylated chitosan.Carbohydrate Polymers.2007;67;66-72.
发明内容
本发明的目的在于提供一种沙丁胺醇修饰胍基化壳聚糖与制备方法和应用。采用促进载体跨膜的胍基和具有靶向性的沙丁胺醇双重修饰的方法,通过环氧氯丙烷将沙丁胺醇耦联到壳聚糖分子上,然后利用三氧化硫脲对壳聚糖氨基进行胍基化。对原始壳聚糖载体进行改性,提高其转染效率和对于呼吸道细胞的靶向性。合成方法简便,条件温和。这种改性后的壳聚糖用作基因载体,转染效率较未改性之前有显著提高。
本发明提供一种沙丁胺醇修饰胍基化壳聚糖糖的结构式表示为:
其中,壳聚糖Mw=50kDa;沙丁胺醇(Sal)接枝率5%;胍基(Gua)取代度17.5%;
本发明提供一种沙丁胺醇修饰胍基化壳聚糖糖的制备方法包括以下步骤:
1)二氧化硫脲与双氧水的浓硫酸溶液在50-60℃下反应100min,4℃冷却,静置2h,加入过量无水乙醇沉淀出白色晶体,乙醇重结晶三次。最后再用无水乙醇洗涤,室温下用P2O5干燥,产物三氧化硫脲于4℃密封保存。30%双氧水∶浓硫酸的体积比=1∶2。
2)壳聚糖在盐酸溶液中50-80℃搅拌4h溶解,加入过量的NaOH溶液,絮状沉淀产物离心,10000r/min离心10min,倒掉上清液,得到胶状碱处理过的壳聚糖。
3)将沙丁胺醇溶于DMSO,加入环氧氯丙烷搅拌至均匀。迅速加入一定量NaOH(1M);室温反应4.5h,然后加入胶状碱处理过的壳聚糖;继续反应4.5h,反应液在透析去离子水中透析5天(透析袋截留分子量3500),冻干。其中,沙丁胺醇、环氧氯丙烷壳聚糖单元摩尔数相等。
4)将冻干后的壳聚糖溶于水中,加入4倍于壳聚糖单元摩尔数的三氧化硫脲,50℃反应半小时,得透明澄清溶液,反应液在去离子水中透析5天(透析袋截留分子量3500),冻干。
本发明沙丁胺醇胍基双重修饰壳聚糖可以作为高效靶向非病毒基因载体在基因治疗中的应用。用于转基因载体,实现提高壳聚糖载体基因转染效率的作用,以及对于呼吸道细胞的靶向作用,尤其是作为哮喘病的基因治疗的载体的应用。
本发明合成了沙丁胺醇胍基双重修饰壳聚糖,合成方法简便,条件温和。这种改性后的壳聚糖用作基因载体,转染效率较未改性之前有显著提高。同时,改性后的壳聚糖水溶性的得到极大改善,能够溶解于中性水溶液中,克服了普通壳聚糖在中性水中难以溶解的缺陷,减少了对组织和细胞的刺激。由于β2能受体配体沙丁胺醇的存在,这种载体对于呼吸道上皮细胞,平滑肌细胞,肥大细胞等具有靶向效果,对于呼吸道疾病尤其是哮喘的基因治疗具有潜在的应用价值。
附图说明
图1是荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达。
具体实施方式
实施例1:
烧杯中加入0.1M的HCl(150ml),加入壳聚糖(Mw=50kDa,0.161g,1mmol),然后搅拌并加热至80℃,待壳聚糖完全溶解后停止加热,冷却至室温。加入2M NaOH溶液(150ml,过量),立即产生大量白色絮状沉淀,10000r/min离心5min,倒掉上清液。得碱液处理后的壳聚糖白色胶状沉淀物。
将沙丁胺醇硫酸盐(0.288g,1mmol)溶于DMSO(20ml)加入三口瓶中,然后滴加环氧氯丙烷(78.3μl,1mmol)搅拌至均匀。迅速加入1MNaOH(20ml),室温反应4.5h。
加入经碱液处理过的壳聚糖,继续反应4.5h。反应液加水稀释后于去离子水中透析5天(透析袋截留分子量3500),每8小时换一次水,然后冻干得沙丁胺醇修饰壳聚糖。
H-NMR分析产物结构:沙丁胺醇接枝率约为5%。
将得到的最终产物1mg溶于1ml醋酸溶液中(0.1M),滤菌。与pGL3质粒DNA溶液混合配制成S-CS/DNA复合物,复合质量比为10/1,静置30分钟后,将复合物溶液加入到已培养至指数生长期的COS-7细胞含血清培基中,转染24h后,换液,继续培养24h。裂解细胞,测定其中的荧光素酶活性为:1.55×104RLU/mg protein。
实施例2
称取二氧化硫脲(10.8g,0.1mol),取少量加入三口烧瓶中,量取双氧水(30%,0.15mol,17ml)和浓硫酸(98%,34ml)先在小烧杯中按比例混合,配成双氧水酸性溶液。冷却至室温后,将混合溶液加入到恒压滴液漏斗中。控制反应器内温度在50-60℃,边搅拌边缓慢滴加双氧水酸性溶液,同时不断少量加入二氧化硫脲,在1h内投完料,继续反应40min,停止加热,将反应液倒入烧杯中,4℃冷却静置2h。加入过量的乙醇至反应液,生成颗粒状白色晶体。过滤取沉淀,加少量水溶解,加入过量乙醇使其重结晶。如此反复三次。最后再用无水乙醇反复洗涤3次,用P2O5干燥,于4℃密封保存备用(三氧化硫脲)。
烧杯中加入0.1M的HCl(150ml),加入壳聚糖(Mw=50kDa,1g),然后搅拌并加热至80℃,充分溶解壳聚糖,用纱布滤掉不溶壳聚糖。将滤液于去离子水中透析(透析袋截留分子量3500)内透析5天,每8小时换一次水,然后冻干得海绵状蓬松壳聚糖。
取上一步产物(壳聚糖,0.161g,1mmol),加入到三口瓶中,加入25ml去离子水,恒温搅拌50℃使其分散,加入三氧化硫脲(0.5g,4mmol),反应30min,得透明澄清溶液,于去离子水中透析5天(透析袋截留分子量3500),每8小时换一次水,然后冻干得胍基化壳聚糖。
C-NMR分析产物结构,元素分析计算取代度:胍基取代度约为17.5%。
将得到的最终产物1mg溶于1ml超纯水中,滤菌,与pGL3质粒DNA溶液混合配制成G-CS/DNA复合物,复合质量比为10/1,静置30分钟后,将复合物溶液加入到已培养至指数生长期的COS-7细胞含血清培基中,转染24h后,换液,继续培养24h。裂解细胞,测定其中的荧光素酶活性为3.55×104RLU/mg protein。
实施例3
称取二氧化硫脲(10.8g,0.1mol),取少量加入三口烧瓶中,量取双氧水(30%,0.15mol,17ml)和浓硫酸(98%,34ml)先在小烧杯中按比例混合,配成双氧水酸性溶液。冷却至室温后,将混合溶液加入到恒压滴液漏斗中。控制反应器内温度在50-60℃,边搅拌边缓慢滴加双氧水酸性溶液,同时不断少量加入二氧化硫脲,在1h内投完料,继续反应40min,停止加热,将反应液倒入烧杯中,4℃冷却静置2h。加入过量的乙醇至反应液,生成颗粒状白色晶体。过滤取沉淀,加少量水溶解,加入过量乙醇使其重结晶。如此反复三次。最后再用无水乙醇反复洗涤3次,用P2O5干燥,于4℃密封保存备用(三氧化硫脲)。
烧杯中加入0.1M的HCl(150ml),加入壳聚糖(Mw=50kDa,0.161g,1mmol),然后搅拌并加热至80℃,待壳聚糖完全溶解后停止加热,冷却至室温。加入2M NaOH溶液(150ml,过量),立即产生大量白色絮状沉淀,10000r/min离心5min,倒掉上清液。得碱液处理后的壳聚糖白色胶状沉淀物。
将沙丁胺醇硫酸盐(0.288g,1mmol)溶于DMSO(20ml)加入三口瓶中,然后滴加环氧氯丙烷(78.3μl,1mmol)搅拌至均匀。迅速加入1M NaOH(20ml),室温反应4.5h。
加入经碱液处理过的壳聚糖,继续反应4.5h。反应液加水稀释后于去离子水中透析5天(透析袋截留分子量3500),每8小时换一次水,然后冻干得沙丁胺醇修饰壳聚糖。
取上一步产物(沙丁胺醇修饰壳聚糖,0.161g,1mmol),加入到三口瓶中,加入25ml去离子水,50℃恒温搅拌使其分散,加入三氧化硫脲(0.5g,4mmol),反应30min,得透明澄清溶液,于去离子水中透析5天(透析袋截留分子量3500),每8小时换一次水,然后冻干得沙丁胺醇修饰胍基化壳聚糖。
将得到的最终产物1mg溶于1ml超纯水中,滤菌,与pGL3质粒DNA溶液混合配制成SG-CS/DNA复合物,复合质量比为10/1,静置30分钟后,将复合物溶液加入到已培养至指数生长期的COS-7细胞含血清培基中,转染24h后,换液,继续培养24h。裂解细胞,测定其中的荧光素酶活性为:2.95×105RLU/mg protein。
实施例4:
称取二氧化硫脲(10.8g,0.1mol),取少量加入三口烧瓶中,量取双氧水(30%,0.15mol,17ml)和浓硫酸(98%,34ml)先在小烧杯中按比例混合,配成双氧水酸性溶液。冷却至室温后,将混合溶液加入到恒压滴液漏斗中。控制反应器内温度在50-60℃,边搅拌边缓慢滴加双氧水酸性溶液,同时不断少量加入二氧化硫脲,在1h内投完料,继续反应40min,停止加热,将反应液倒入烧杯中,4℃冷却静置2h。加入过量的乙醇至反应液,生成颗粒状白色晶体。过滤取沉淀,加少量水溶解,加入过量乙醇使其重结晶。如此反复三次。最后再用无水乙醇反复洗涤3次,用P2O5干燥,于4℃密封保存备用(三氧化硫脲)。
烧杯中加入0.1M的HCl(150ml),加入壳聚糖(Mw=50kDa,0.161g,1mmol),然后搅拌并加热至80℃,待壳聚糖完全溶解后停止加热,冷却至室温。加入2M NaOH溶液(150ml,过量),立即产生大量白色絮状沉淀,10000r/min离心5min,倒掉上清液。得碱液处理后的壳聚糖白色胶状沉淀物。
将沙丁胺醇硫酸盐(0.288g,1mmol)溶于DMSO(20ml)加入三口瓶中,然后滴加环氧氯丙烷(78.3μl,1mmol)搅拌至均匀。迅速加入1M NaOH(20ml),室温反应4.5h。
加入经碱液处理过的壳聚糖,继续反应4.5h。反应液加水稀释后于去离子水中透析5天(透析袋截留分子量3500),每8小时换一次水,然后冻干得沙丁胺醇修饰壳聚糖。
取上一步产物(沙丁胺醇修饰壳聚糖,0.161g,1mmol),加入到三口瓶中,加入25ml去离子水,恒温搅拌50℃使其分散,加入三氧化硫脲(0.5g,4mmol),反应30min,得透明澄清溶液,于去离子水中透析5天(透析袋截留分子量3500),每8小时换一次水,然后冻干得沙丁胺醇修饰胍基化壳聚糖。
将得到的最终产物1mg溶于1ml超纯水中,滤菌,与GFP质粒DNA溶液混合配制成SG-CS/DNA复合物,复合质量比为10/1,静置30分钟后,将复合物溶液加入到已培养至指数生长期的HEK293细胞含血清培基中,转染24h后,换液,继续培养24h。用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达(如下图1-b所示,同未经修饰壳聚糖相比绿色荧光蛋白能表达显著增加)。
对比例1:
将原始壳聚糖(Mw=50kDa,1mg)溶于1ml醋酸溶液中(0.1M),滤菌。与pGL3质粒DNA溶液混合配制成CS/DNA复合物,复合质量比为10/1,静置30分钟后,将复合物溶液加入到已培养至指数生长期的COS-7细胞含血清培基中,转染24h后,换液,继续培养24h。裂解细胞,测定其中的荧光素酶活性为:3.67×103RLU/mg protein
对比例2:
将原始壳聚糖(Mw=50kDa,1mg)溶于1ml醋酸溶液中(0.1M),滤菌.与GFP质粒DNA溶液混合配制成CS/DNA复合物,复合质量比为10/1,静置30分钟后,将复合物溶液加入到已培养至指数生长期的HEK293细胞含血清培基中,转染24h后,换液,继续培养24h。用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达(如图1-a所示)。
Claims (7)
1.一种沙丁胺醇修饰胍基化壳聚糖,其特征在于它的结构式为:
其中,壳聚糖Mw≈50kDa;沙丁胺醇接枝率5%;胍基取代度17%。
2.一种权利要求1所述的沙丁胺醇修饰胍基化壳聚糖的制备方法,其特征在于它包括以下步骤:
1)二氧化硫脲与含有双氧水的98%的浓硫酸溶液在50-60℃下反应100min,4℃冷却,静置2h,加入过量无水乙醇沉淀出白色晶体,乙醇重结晶三次;最后再用无水乙醇洗涤,室温用P2O5干燥,产物三氧化硫脲于4℃密封保存;双氧水∶浓硫酸的体积比=1∶2;
2)壳聚糖在盐酸溶液中50-80℃搅拌4h溶解,加入过量的NaOH溶液,絮状沉淀产物离心,10000r/min离心10min,倒掉上清液,得到胶状碱处理过的壳聚糖;
3)将沙丁胺醇溶于DMSO,加入环氧氯丙烷搅拌至均匀,迅速加入等体积1M的NaOH,室温反应4.5h,然后加入胶状碱处理过的壳聚糖,继续反应4.5h,反应液于去离子水中透析5天,冻干;
4)将冻干后的壳聚糖溶于水中,加入4倍于壳聚糖单元摩尔数的三氧化硫脲,50℃反应半小时,得透明澄清溶液,反应液在去离子水中透析5天,冻干。
3.按照权利要求2所述的制备方法,其特征在于步骤3)中所述的沙丁胺醇,环氧氯丙烷与壳聚糖摩尔数相等。
4.按照权利要求2所述的制备方法,其特征在于步骤4)中所述的三氧化硫脲与壳聚糖摩尔数比为4∶1。
5.按照权利要求2所述的制备方法,其特征在于所述的透析袋的截留分子量3500。
6.权利要求1所述的沙丁胺醇修饰胍基化壳聚糖的应用,其特征在于作为高效靶向非病毒基因载体。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于它作为哮喘病的基因治疗的载体。
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CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
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