CN104558246B - 一种叶酸/生物素修饰的壳聚糖材料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种叶酸/生物素修饰的壳聚糖材料及其制备方法，所述叶酸/生物素修饰的壳聚糖材料以壳聚糖为载体，叶酸和生物素为配体，利用N‑酰化反应制备叶酸/生物素修饰的壳聚糖材料。本发明通过先后加入活性生物素酯和活性叶酸酯与壳聚糖反应一次合成双配体修饰的壳聚糖材料，接枝率高，反应时间较两步法大大缩短，所制备的叶酸/生物素修饰的壳聚糖材料可用作一种靶向抗癌药物载体材料。

Description

一种叶酸/生物素修饰的壳聚糖材料及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种高分子药物载体领域，具体涉及一种叶酸/生物素修饰的壳聚糖材料及其制备方法。
背景技术
壳聚糖来源于天然的动物甲壳，结构和性质均十分接近天然的多糖，具有良好的生物相容性、天然可降解性及对细胞无毒性，且易溶于酸性环境下的水溶液，因此成为研究的热门，尤其是作为药物控释载体而受到极大的重视。壳聚糖分子链中含有大量的活泼氨基，可与多种亲电试剂进行反应，形成稳定的化学接枝，这种便于改性的特点进一步增强了壳聚糖的实用性，其中利用配体对其进行共轭接枝从而与细胞表面受体形成特异性识别的方法是目前靶向载药研究领域的常用手段。已被较多研究的生物素和叶酸作为上述配体种类中的典型，在应用于壳聚糖抗癌药物载体的靶向改性中各自均能达到较佳的实验效果，由二者之一修饰的壳聚糖纳米载体均在一定程度上对肝癌细胞构成主动靶向，并在载药的情况下主要对病变组织产生药效，而基本上不会伤害正常细胞，但利用生物素与叶酸作为双配体的研究还未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中存在的上述不足，提供一种合成周期短、反应效率高的叶酸/生物素修饰的壳聚糖材料及其制备方法。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：
提供一种叶酸/生物素修饰的壳聚糖材料，所述叶酸/生物素修饰的壳聚糖材料以壳聚糖为载体，叶酸和生物素为配体，利用N-酰化反应制备叶酸/生物素修饰的壳聚糖材料，其结构式如下：
按上述方案，所述壳聚糖分子量为20000-50000，脱乙酰度≥85％。
按上述方案，所述叶酸/生物素修饰的壳聚糖材料中叶酸和生物素的接枝率均≥5％。
本发明叶酸/生物素修饰的壳聚糖材料的制备方法步骤如下：
1)制备壳聚糖溶液：将壳聚糖溶于醋酸溶液中，得到浓度为5-10mg/mL的壳聚糖溶液，并调节pH值至4.7-6.0，备用；
2)制备琥珀酰亚胺基生物素酯：将DCC、NHS与生物素按摩尔比1.2-1.5:1:1混合后于50-60℃条件下反应16-24h，过滤后在冰浴条件下向滤液中滴加乙醚析出沉淀，然后用异丙醇对沉淀进行重结晶，过滤收集结晶并用DMF溶解结晶，过滤后逐滴加入无水乙醚中，冷藏过夜，移走上清液，室温下真空干燥得到琥珀酰亚胺基生物素酯，备用；
3)制备具有氨基反应活性的叶酸活性酯溶液：将叶酸溶于无水DMSO中，并加入EDC.HCl，在避光条件下于25-40℃磁力搅拌反应1-4h，得到叶酸活性酯溶液，浓度以叶酸质量浓度计为26-44mg/mL，备用；
4)将步骤2)所得琥珀酰亚胺基生物素酯溶于DMF中，得到浓度为20-34mg/mL的生物素酯溶液，在磁力搅拌条件下，将生物素酯溶液缓慢加入步骤1)所得壳聚糖溶液中，在室温条件下反应至反应液澄清，然后在搅拌条件下缓慢加入步骤3)所得叶酸活性酯溶液，在室温下继续反应12-24h，反应结束后将反应液移入透析袋(透析袋截留分子量为8000)，于蒸馏水中透析3d，每6h换水一次，透析后经冷冻干燥即得到叶酸/生物素修饰的壳聚糖材料。
按上述方案，步骤3)所述叶酸与EDC.HCl的摩尔比为1:5-10。
按上述方案，步骤4)所述琥珀酰亚胺基生物素酯与壳聚糖的摩尔比为20-30:1；所述叶酸活性酯与壳聚糖的摩尔比为20-30:1。
本发明原理在于：生物素与叶酸分子中均包含羧基结构，可与壳聚糖分子链上的氨基形成稳定的酰胺键，但是羧基的酰化作用较弱，须经过活化生成中间反应物后，方能与氨基进行酰胺化反应。
反应机理如下(式1-3)：
式1琥珀酰亚胺基生物素酯的合成
式2叶酸活性酯的合成
式3叶酸/生物素修饰的壳聚糖材料的合成
本发明的有益效果在于：1、本发明通过先后加入活性生物素酯和活性叶酸酯与壳聚糖反应一次合成双配体(叶酸/生物素)修饰的壳聚糖材料，接枝率高，反应时间较两步法大大缩短；2、本发明制备的叶酸和生物素共同修饰的壳聚糖材料能够满足纳米颗粒载体对癌细胞的靶向性要求，作为一种潜在的靶向抗癌药物载体材料，理论上比具单一配体靶向识别作用的载体对癌细胞表面过量表达的相应糖蛋白受体有更强的特异性识别作用、靶向性更可靠。
附图说明
图1为本发明实施例1所制备的叶酸/生物素修饰的壳聚糖材料(FA-CS-Bio)与壳聚糖(CS)的红外图谱；
图2为实施例1所制备的叶酸/生物素修饰的壳聚糖材料(FA-CS-Bio)的核磁氢谱图。
具体实施方式
为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图对本发明作进一步详细描述。
本发明中：壳聚糖(CS)；叶酸(FA)；生物素(Biotin)；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)；N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)；N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)；琥珀酰亚胺基生物素酯(Biotin-NHS)；二甲基甲酰胺(DMF)；二甲基亚砜(DMSO)。
本发明实施例所用壳聚糖分子量为20000-50000，脱乙酰度≥85％。
实施例1
叶酸/生物素修饰的壳聚糖材料(FA-CS-Bio)的合成：
称取0.1g壳聚糖(Mw＝50000,D.D＝85％)，充分溶解于20mL 1％(v/v)HAc/H2O中，滴加稀释的NaOH溶液，调节pH至4.7，得到壳聚糖溶液；
分别称取DCC、NHS与生物素各2.7g、1.01g、2.11g，加入三颈烧瓶中混合后于60℃条件下反应24h，过滤后在冰浴条件下向滤液中滴加乙醚析出沉淀，然后用异丙醇对沉淀进行重结晶，过滤收集结晶并用DMF溶解结晶，过滤后逐滴加入无水乙醚中，冷藏过夜，移走上清液，室温下真空干燥得到琥珀酰亚胺基生物素酯，备用；
称取26.5mg叶酸与115.0mg EDC.HCl同时溶于1mL无水DMSO中，40℃下避光搅拌活化1h，得到叶酸活性酯溶液；
称取琥珀酰亚胺基生物素酯20.5mg于40-50℃水浴中溶解于1mL DMF，在磁力搅拌下逐滴滴加于上述壳聚糖溶液中，室温下搅拌0.5-1h得到透明反应液；将上述叶酸活性酯溶液逐滴加入透明反应液中，室温下避光持续搅拌12h，待反应结束，将透明反应液移入透析袋(Mw cut-off:8000Da)中，于蒸馏水中透析3d，每6h更换透析液一次。将透析袋中的溶液倒入表面皿，于-10℃冷冻过夜，并于-50℃冷冻干燥机中干燥得终产物。
取终产物进行红外光谱和氢谱核磁共振(600M)分析，结果见附图1-2。图1为叶酸/生物素修饰壳聚糖的红外吸收光谱，如图所示，不同于壳聚糖(CS)只在1590cm-1处存在自由氨基的面内变形振动吸收峰，该双配体修饰的壳聚糖材料(FA-CS-Bio)在1650cm-1和1610cm-1处分别存在酰胺I带与酰胺II带的吸收峰，说明壳聚糖分子链上的部分氨基参与了酰胺化反应；图2为叶酸/生物素修饰壳聚糖的核磁氢谱表征，该图中，1(3.17ppm)、2(4.26ppm)和4.83～5.00ppm等化学位移处对应的一系列质子振动峰归属于壳聚糖分子链的相应化学结构，而3(9.93ppm)、4(8.10ppm)、5(8.82ppm)和6(3.95ppm)、7(3.42ppm)、8(2.68ppm)等各处的质子振动峰则分别对应于叶酸和生物素特有的分子结构(如箭头所示)；结合上述分析，可判断生物素和叶酸均以酰胺键成功接枝于壳聚糖分子链，产物结构式为：
同时，根据2、3、6对应的峰形积分面积27.92、1.32、3.50计算可知，双配体的接枝率分别为D.S.Biotin＝3.50/25.83*100％＝13.6％，D.S.Folic Acid＝1.32/25.83*100％＝5.1％。
实施例2
叶酸/生物素修饰的壳聚糖材料(FA-CS-Bio)的合成：
称取0.1g壳聚糖(Mw＝20000,D.D＝91％)，充分溶解于10mL 1％(v/v)HAc/H2O中，滴加稀释的NaOH溶液，调节pH至6，得到壳聚糖溶液；
分别称取DCC、NHS与生物素各2.16g、1.01g、2.11g，加入三颈烧瓶中混合后于50℃条件下反应16h，过滤后在冰浴条件下向滤液中滴加乙醚析出沉淀，然后用异丙醇对沉淀进行重结晶，过滤收集结晶并用DMF溶解结晶，过滤后逐滴加入无水乙醚中，冷藏过夜，移走上清液，室温下真空干燥得到琥珀酰亚胺基生物素酯，备用；
称取44.1mg叶酸与95.9mg EDC.HCl同时溶于1mL无水DMSO中，25℃下避光搅拌活化4h，得到叶酸活性酯溶液，备用；
称取琥珀酰亚胺基生物素酯34.1mg于40-50℃水浴中溶解于1mL DMF，在磁力搅拌下逐滴滴加于上述壳聚糖溶液中，室温下搅拌4h得到透明反应液；将叶酸活性酯溶液逐滴加入上述透明反应液中，室温下避光持续搅拌20h，待反应结束，将透明反应液移入透析袋中，于蒸馏水中透析3d，每6h更换透析液一次。将透析袋中的溶液倒入表面皿，于-10℃冷冻过夜，并于-50℃冷冻干燥机中干燥得终产物。
经过氢谱核磁共振(600M)分析计算可知，双配体接枝率分别为D.S.Biotin＝14.5％，D.S.Folic Acid＝7.6％。

Claims (6)

1.一种叶酸/生物素修饰的壳聚糖材料，其特征在于，所述叶酸/生物素修饰的壳聚糖材料以壳聚糖为载体，叶酸和生物素为配体，利用N-酰化反应制备叶酸/生物素修饰的壳聚糖材料；其制备方法步骤如下：
1)制备壳聚糖溶液：将壳聚糖溶于醋酸溶液中，得到浓度为5-10mg/mL的壳聚糖溶液，并调节pH值至4.7-6.0，备用；
2)制备琥珀酰亚胺基生物素酯：将DCC、NHS与生物素按摩尔比1.2-1.5:1:1混合后于50-60℃条件下反应16-24h，过滤后在冰浴条件下向滤液中滴加乙醚析出沉淀，然后用异丙醇对沉淀进行重结晶，过滤收集结晶并用DMF溶解结晶，过滤后逐滴加入无水乙醚中，冷藏过夜，移走上清液，室温下真空干燥得到琥珀酰亚胺基生物素酯，备用；
3)制备具有氨基反应活性的叶酸活性酯溶液：将叶酸溶于无水DMSO中，并加入EDC.HCl，在避光条件下于25-40℃磁力搅拌反应1-4h，得到叶酸活性酯溶液，浓度以叶酸质量浓度计为26-44mg/mL，备用；
4)将步骤2)所得琥珀酰亚胺基生物素酯溶于DMF中，得到浓度为20-34mg/mL的生物素酯溶液，在磁力搅拌条件下，将生物素酯溶液缓慢加入步骤1)所得壳聚糖溶液中，在室温条件下反应至反应液澄清，然后在搅拌条件下缓慢加入步骤3)所得叶酸活性酯溶液，在室温下继续反应12-24h，反应结束后将反应液移入透析袋，于蒸馏水中透析3d，每6h换水一次，透析后经冷冻干燥即得到叶酸/生物素修饰的壳聚糖材料。
2.根据权利要求1所述的叶酸/生物素修饰的壳聚糖材料，其特征在于：所述壳聚糖分子量为20000-50000，脱乙酰度≥85％。
3.根据权利要求1所述的叶酸/生物素修饰的壳聚糖材料，其特征在于：所述叶酸/生物素修饰的壳聚糖材料中叶酸和生物素的接枝率均≥5％。
4.一种叶酸/生物素修饰的壳聚糖材料的制备方法，其特征在于步骤如下：
1)制备壳聚糖溶液：将壳聚糖溶于醋酸溶液中，得到浓度为5-10mg/mL的壳聚糖溶液，并调节pH值至4.7-6.0，备用；
2)制备琥珀酰亚胺基生物素酯：将DCC、NHS与生物素按摩尔比1.2-1.5:1:1混合后于50-60℃条件下反应16-24h，过滤后在冰浴条件下向滤液中滴加乙醚析出沉淀，然后用异丙醇对沉淀进行重结晶，过滤收集结晶并用DMF溶解结晶，过滤后逐滴加入无水乙醚中，冷藏过夜，移走上清液，室温下真空干燥得到琥珀酰亚胺基生物素酯，备用；
3)制备具有氨基反应活性的叶酸活性酯溶液：将叶酸溶于无水DMSO中，并加入EDC.HCl，在避光条件下于25-40℃磁力搅拌反应1-4h，得到叶酸活性酯溶液，浓度以叶酸质量浓度计为26-44mg/mL，备用；
4)将步骤2)所得琥珀酰亚胺基生物素酯溶于DMF中，得到浓度为20-34mg/mL的生物素酯溶液，在磁力搅拌条件下，将生物素酯溶液缓慢加入步骤1)所得壳聚糖溶液中，在室温条件下反应至反应液澄清，然后在搅拌条件下缓慢加入步骤3)所得叶酸活性酯溶液，在室温下继续反应12-24h，反应结束后将反应液移入透析袋，于蒸馏水中透析3d，每6h换水一次，透析后经冷冻干燥即得到叶酸/生物素修饰的壳聚糖材料。
5.根据权利要求4所述的叶酸/生物素修饰的壳聚糖材料的制备方法，其特征在于：步骤3)所述叶酸与EDC.HCl的摩尔比为1:5-10。
6.根据权利要求4所述的叶酸/生物素修饰的壳聚糖材料的制备方法，其特征在于：步骤4)所述琥珀酰亚胺基生物素酯与壳聚糖的摩尔比为20-30:1；所述叶酸活性酯与壳聚糖的摩尔比为20-30:1。
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