CN102924625B

CN102924625B - 主动肿瘤靶向壳聚糖衍生物及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN102924625B
Application number: CN201210484182.5A
Authority: CN
Inventors: 张灿; 瞿鼎; 曲国威; 林海娇; 宗莉
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2012-11-26
Filing date: 2012-11-26
Publication date: 2015-11-04
Anticipated expiration: 2032-11-26
Also published as: CN102924625A

Abstract

本发明涉及医药领域，具体涉及主动肿瘤靶向壳聚糖衍生物（I）及其制备方法和用途。本发明用可生物降解的天然来源的壳聚糖作为原料，利用无毒或毒性小的原料摸索出易进行大规模生产的制备工艺，使其形成具有两亲性的聚合物分子，即一端含亲水基、另一端含疏水基和助溶基团，并且通过化学特异性反应共价连接上可被肿瘤细胞表面特异性识别的靶基团，以适合用于药物、与药物组配或作为靶向药物载体，尤其是作为毒性小、不会产生溶血反应的可静脉注射给药的靶向药物载体。

Description

主动肿瘤靶向壳聚糖衍生物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及以天然且可生物降解的壳聚糖为原料进行肿瘤靶向配体修饰和两亲性衍生化及其制备方法，以及其作为药物载体在制备药物中的应用。

背景技术

纳米技术与可生物降解材料均为当前药物传输系统发展的热点研究领域。聚合物胶束研究融合两者的优势，既可生物降解，又可形成药物纳米载体。聚合物胶束由亲水壳和疏水核组成，既具备形成亲水胶体的药用性能，又适合疏水药物的增溶和包裹。聚合物胶束所具有的由亲水壳和疏水核组成特征使其可以达到体内长循环、减少网状内皮细胞吞噬的目的。将聚合物载体表面共价连接上可被肿瘤细胞表面过表达受体特异性识别的配体，可以显著提高制剂的主动靶向功能。

壳聚糖是可生物降解的天然来源的聚合物，具有良好的生物相容性，且来源广泛，价格便宜。发明人前期研究N-辛基-O-磺酸基壳聚糖（NOSC）（见平其能；张灿.壳聚糖衍生物及其制备方法与在制药中的应用，CN03112981.1)、N-辛基-N-邻苯二甲酸-O-（2-羟丙基）壳聚糖（OPHPC）（见张灿；瞿鼎.两亲性壳聚糖衍生物及其制备方法与在药物制剂中的应用,CN201210054657.7）均有应用于紫杉烷类载药胶束的报道。此外CN 200610037810.X还公开了一种难溶药物增溶载体N-辛基-O-羧甲基壳聚糖（OCC）。

磷酸化壳聚糖已报道可以作为骨骼替换和药物控制释放材料；经磷酸化反应后能增加壳聚糖螯合的特性和改变其溶解度，具有抑制磷酸钙沉淀，促进钙吸收的能力。引入α，β-不饱和醛酮双键，可以特异性连接诸如叶酸、生物素、奥曲肽、茴香酰胺、cRGD等主动肿瘤靶向配体，进一步增加和丰富功能化壳聚糖的药学和生物学应用。

发明内容

本发明用可生物降解的天然来源的壳聚糖作为原料，利用无毒或毒性小的原料摸索出易进行大规模生产的制备工艺，使其形成具有两亲性的聚合物分子，即一端含亲水基、另一端含疏水基和助溶基团，并且通过化学特异性反应共价连接上可被肿瘤细胞表面特异性识别的靶基团，以适合用于药物、与药物组配或作为靶向药物载体，尤其是作为毒性小、不会产生溶血反应的可静脉注射给药的靶向药物载体。

本发明的两亲性质的壳聚糖衍生物具备以下几个特性：一、可用于难溶药物的增溶和包裹，控制药物释放并在水中形成纳米级胶束；二、中间体和终产物在有机溶剂，诸如DMF、DMSO、甲醇或乙醇中有优良的溶解性，使得反应充分，保证较高的产率；三、终产物在制备过程中可以从体系中沉淀出，减少生产周期和成本，并能够在相当长时间内保持化学性质的稳定性；四、可以特异性地共价连接上高密度的可被肿瘤细胞表面特异性识别的靶基团。该递药系统首先由亲水的壳和疏水的核组成的纳米胶束，由此可以延长体内循环、减少网状内皮细胞的吞噬，并通过肿瘤细胞增强渗透滞留效应（enhanced permeability and retentioneffect，EPR)和高密度的靶基团大幅度增强细胞对药物摄取，最终提高治疗效果。其次终产物优良的有机溶剂溶解性为更多载药方式提供了可行性操作依据；五、磷酸化壳聚糖-药物复合物在酸性介质中能增加药物释放，具备pH敏感能力。

本发明的两亲性壳聚糖衍生物如下：

其中R=-(CH₂)_n，n=6～18；

R’代表

R’还代表在上引入肿瘤靶向配体，所述肿瘤靶向配体选自叶酸、生物素、奥曲肽或cRGD；

x＝50％～60％；y＝8％～10％；z＝20％～30％。

其中x表示N-辛基取代度；y表示N-乙酰化取代度；z表示不同酸酐的酰化取代度。

x优选60％；y优选10％；z优选30％。

n优选=12

本发明的壳聚糖衍生物也可称为N-长链烷基-N-酰化-O-磷酸化壳聚糖，其制备方法依次包括下列步骤：

1)取壳聚糖加入甲醇或乙醇中，室温搅拌，加入6-18C的长链烷基醛，反应12-18小时后，加入KBH₄水溶液，继续搅拌8-12小时，生成N-长链烷基壳聚糖；

2)取N-长链烷基壳聚糖加入N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中搅拌8-12小时，再加入马来酸酐（或其他酸酐）的DMF溶液，在130℃和N₂保护下反应12-18小时，制得N-长链烷基N-酰化壳聚糖；

3)取N-长链烷基-N-酰化壳聚糖加入多聚磷酸的DMF溶液中，50℃机械搅拌8-12小时，制得N-长链烷基-N-酰化-O-磷酸化壳聚糖（AMPC）。

携带靶基团的AMPC（tumor-targeted AMPC）制备方法包括（此部分酸酐化以马来酸化为例叙述，柠槺酸酐化方法类似）：

1)取壳聚糖加入甲醇中室温搅拌，加入6-18C的长链烷基醛，反应14-16小时后，加入KBH₄水溶液，继续搅拌10小时，生成N-长链烷基壳聚糖；

2)取N-长链烷基壳聚糖加入DMF中搅拌9-10小时，再加入马来酸酐DMF溶液，在110-130℃和N₂保护下反应14-16小时，制得N-长链烷基-N-马来酰壳聚糖。

3)取N-长链烷基-N-马来酰壳聚糖加入多聚磷酸的DMF溶液中，50℃机械搅拌10小时，制得N-长链烷基-N-马来酰-O-磷酸化壳聚糖(AMPC)。

4)取AMPC溶于pH 8的水相介质中，加入带巯基的茴香酰胺、叶酸、生物素、奥曲肽、cRGD-SH等可被肿瘤细胞表面特异性识别的配体，制得具备肿瘤主动靶向的AMPC。

更优选地，生成的N-长链烷基壳聚糖的反应液用稀盐酸液中和，用丙酮沉淀，过滤，乙醚冲洗后干燥后再进入第二步反应。生成N-长链烷基-N-马来酰壳聚糖的反应液，过滤，用大量水与DMF混合溶液冲洗后干燥后再进入第三步反应。AMPC在中性水相中沉淀，过滤，滤饼大量水洗，用pH 8的去离子水溶解，过滤。滤液冷冻干燥。最后在弱碱体系中与上述各种具备靶向的化学实体搅拌制得tumor-targeted AMPC。

最优选的AMPC以及茴香酰胺修饰的AMPC(anisamide-conjugated AMPC)的制备方法（以茴香酰胺为靶基团为例，其他靶基团修饰类似）包括：

1）N-长链烷基壳聚糖的制备

取壳聚糖加入甲醇中室温搅拌24小时，加入6-18C的长链烷基醛，反应14-16小时后，加入KBH₄的水溶液，继续搅拌10小时，即生成N-长链烷基壳聚糖，反应液用稀盐酸液中和，用甲醇沉淀，过滤，滤饼即为N-长链烷基壳聚糖，干燥后，得到浅黄色粉末。

2）N-长链烷基-N-马来酰壳聚糖的制备

取N-长链烷基壳聚糖加入DMF中搅拌8-12小时，再加入马来酸酐的DMF溶液，在130℃和N₂保护下反应12-18小时，反应液倾倒在去离子水中，过滤，滤饼用大量水+DMF冲洗，制得N-长链烷基-N-马来酰壳聚糖。

3）N-长链烷基-N-马来酰-O-磷酸化壳聚糖（AMPC）的制备

取N-长链烷基-N-马来酰壳聚糖加入到多聚磷酸的DMF溶液中，50℃机械搅10小时，制得AMPC。反应液倾入5倍体积水中，用稀盐酸液中和pH至7，过滤，滤饼大量水冲洗，并用pH8的水溶解，再过滤，滤液冷冻干燥，得淡黄色AMPC。

4）茴香酰胺修饰的N-长链烷基-N-马来酰-O-磷酸化壳聚糖（anisamide-conjugated AMPC）的制备

取N-长链烷基-N-马来酰-O-磷酸化壳聚糖（AMPC）溶于弱碱水相体系中，室温下加入有巯基修饰茴香酰胺搅拌，反应液倾入5倍体积水中，透析，滤液冻干得淡黄色anisamide-conjugated AMPC。

本发明的壳聚糖衍生物（I）在水、甲醇、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)等溶剂中均有良好的溶解性，在化学结构修饰过程中的溶剂选择和在聚合物胶束进行包裹难溶性药物的方式上有了很大程度的选择性。

合成反应式如下（烷基链长度以8个C为例，其余长度碳链方法类似；酰化以马来酰为例，其他酰化方法类似；肿瘤靶基团以茴香酰胺为例，其余靶配体方法类似）：

其中n表示相应重复单元的聚合度。在壳聚糖的2-NH₂接入疏水长链烷基(链长为6-18C)，剩余氨基上接入马来酸酐，在6-OH进行磷酸化(引入亲水基)，最后在酸酐的不饱和双键上特异性引入靶基团。

为了获得能够形成聚合物胶束以及能够包裹药物尤其是难溶性药物的聚合物胶束，除了考虑毒性、溶血反应以外，必须筛选合适的能够接入的疏水及亲水性基团。并不是所有只要形成亲水亲脂性的两亲性壳聚糖衍生物都适合作为药物配体或药物载体的，亲水、亲脂都有一个度，且亲水、亲脂基团之间必须有一平衡，这平衡既与基团亲水、亲脂程度有关，亦与其所带电荷有关，还与其体积甚至立体结构有关。再者，除了亲水亲油基团外，加入适当比例的助溶基团，可以有效调节载体的临界胶束浓度（critical micelle concentration，CMC）和共价连接活性基团。本发明在壳聚糖结构上引入马来酰基团，很好地调节了亲水亲油基团之间的平衡，保证了材料良好水溶性的同时也使得临界胶束浓度较低，同时，α，β-不饱和醛酮双键为特异性连接活性基团提供了可能。

本发明的两亲性质的壳聚糖衍生物，不但可用于难溶药物的增溶和包裹，控制药物释放，而且可以在水中形成纳米级胶束。由于由亲水的壳和疏水的核组成的纳米胶束，可以延长体内循环、减少网状内皮细胞的吞噬，并通过EPR和主动靶向功能，最终提高治疗效果。

本发明的两亲性壳聚糖衍生物适合用于药物、与药物组配或作为药物载体，尤其是作为毒性小、不会产生溶血反应的可静脉注射给药的药物载体。同时可作为肿瘤组织主动靶向的药物的载体，进一步提高药效。

胶束的制备方法方法如下：

按每mL水中溶解4-20mg的AMPC的比例，或每mL水中溶解10-20mg的AMPC，亦可以每mL水中溶解12-16mg的AMPC，将制得的AMPC溶于水中，制备成粒径为90-150nm的AMPC胶束。

本发明的壳聚糖衍生物可作为载体制备的药物组合物，对难溶药物有增溶作用。所述难溶药物优选：紫杉醇(PTX)、环孢素A、替尼铂甙、羟基喜树碱、喜树碱、长春酰胺、依托泊甙、尼莫地平、阿霉素、多烯紫杉醇，灯盏花素、银杏内酷、水飞蓟素、柔红霉素、丝裂霉素、氨甲喋吟，尤其是对紫杉醇、多烯紫杉醇、环孢素A、替尼泊甙、羟基喜树碱、喜树碱、长春酰胺、依托泊甙或尼莫地平。

N-长链烷基-N-马来酰-O-磷酸化壳聚糖胶束对难溶性药物如紫杉醇、多烯紫杉醇、环孢素A具有较好增溶作用，尤其是AMPC对紫杉醇和多烯紫杉醇有明显的增溶效果，当其水溶液浓度为0.6％时，提高紫杉醇的溶解度达2.2-3.5mg/mL。

本发明的壳聚糖衍生物作为载体较原料壳聚糖毒性低，且溶血反应符合静脉注射药用辅料标准。

实施例6和7对于小鼠静脉注射的急性毒性和溶血试验数据表明：AMPC急性毒性较原料壳聚糖有明显降低。下述溶血实验表明：AMPC在用生理盐水稀释至适当浓度，进行静脉注射给药，不会引起机体的溶血反应。

附图说明

图1是紫杉醇胶束对PC-3细胞的肿瘤主动靶向效率考察

图2是紫杉醇胶束对MCF-7细胞的肿瘤主动靶向效率考察

图3是PTX-OMPC在不同pH下的药物释放比例测定

具体实施方式

实施例1

1、N-辛基壳聚糖的制备（参见CN 03112981.1）

壳聚糖(1.0g)悬浮在50mL甲醇中室温搅拌，加入辛醛(1.02g)，继续反应24小时后，加入KBH₄(0.5g)的5mL水溶液，继续搅拌过夜，反应液用2N的盐酸溶液中和，用甲醇沉淀，过滤，滤渣用甲醇和水重复洗涤3次，用真空烘箱于60℃下干燥过夜，得浅黄色粉末N-辛基壳聚糖1.0g。

相同方法可以制备N-癸基壳聚糖、N-月桂化壳聚糖、N-十八烷基、N-胆固醇化壳聚糖等N-烷基化壳聚糖。

2、N-辛基-N-马来酰壳聚糖的制备（参照CN201210054657.7）

N-辛基壳聚糖(1.5g)悬浮在DMF(40mL)中机械搅拌过夜，N₂保护和搅拌下，慢慢加入马来酸酐0.6g，缓慢升温至130℃，继续搅拌15小时。反应完毕将反应液倒入大量去离子水中，过滤，滤饼用大量水洗。红外干燥得淡黄色粉末1.9g。相同方法可以制备N-辛基-N-柠槺酰壳聚糖、N-辛基-N-邻苯二甲酰壳聚糖、N-辛基-N-丁二酰壳聚糖等酸酐化壳聚糖。

3、N-辛基-N-马来酰-O-磷酸化壳聚糖（OMPC）的制备

N-辛基-N-马来酰壳聚糖（1g）加入1.9g多聚磷酸的10mL DMF溶液中，50℃机械搅10小时，制得OMPC。反应液倾入50mL去离子水中，过滤，滤饼大量水洗，用pH 8的水相溶解，过滤，滤液无须透析，直接冷冻干燥，得金黄色絮状物1.6g。

FT IR：2860，1386，1287，908，718cm^-1(长链烷基)，2952，1482，1240，1051cm^-1(磷酰基团)，1701cm^-1(马来酰).

′H-NMR(D₂O)：δ(ppm)：0.6-1.8(m，15H)(-NH-CH₂-(CH₂)₆-CH₃)；2.5-2.8(m,2H)(-NH-CH_{2_}-(CH₂)₆-CH₃)；3.6(m，4H)；4.3-4.7(d，2H)(-CO-CH＝CH-CO-).

¹³C-NMR(D₂O)：δ(ppm)：13.5-13.7(-NH-CH₂-(CH₂)₆-CH3)；21.9-31.4(-NH-CH₂-(CH₂)6-CH₃)；48.3(-NH-CH₂-(CH₂)₆-CH₃)；55(C2)；61.4(C6)；66.8(C3)；75.4(C5)；76.4(C4)；97(C1).137.1-165.2(-CO-CH=CH-CO-).

4、茴香酰胺化N-辛基-N-马来酰-O-磷酸化壳聚糖（anisamide-conjugated OMPC）的制备

OMPC(1g)溶于10mL弱碱性水溶液中，室温搅拌至溶解，加入对甲氧基苯甲酰半胱氨酸(0.5g)，继续搅拌10h。反应液倾入50mL去离子水中，透析，过滤，滤液冷冻干燥，得金黄色絮状物0.78g。

FT IR：2860，1386，1287，908，718cm^-1(长链烷基)，2952，1482，1240，1051cm^-1(磷酰基团)，1701cm^-1(马来酰)，1610cm^-1(茴香酰胺苯环).

′H-NMR(D₂O)：δ(ppm)：0.6-1.8(m，15H)(-NH-CH₂-(CH₂)₆-CH₃)；2.5-2.8(m,2H)(-NH-CH_{2_}-(CH₂)₆-CH₃)；3.6(m，4H)；4.3-4.7(d，2H)(-CO-CH＝CH-CO-)；7.1-7.5(d，4H).

¹³C-NMR(D₂O)：δ(ppm)：13.5-13.7(-NH-CH₂-(CH₂)₆-CH3)；21.9-31.4(-NH-CH₂-(CH₂)6-CH₃)；48.3(-NH-CH₂-(CH₂)₆-CH₃)；55(C2)；61.4(C6)；66.8(C3)；75.4(C5)；76.4(C4)；97(C1).127.2(Ar)；137.1-165.2(-CO-CH=CH-CO-).

元素分析测得脱乙酰化度为91.5％，N-辛基取代度为的取代度为50％，马来酰的取代度为51.7％。茴香酰胺取代度为40％。OMPC元素分析结果为：N，2.98；C,36.89；H,5.41；anisamide-conjugated OMPC元素分析结果为：N，3.08；C,42.89；H,5.82。

相同方法可以制备N-辛基-N-柠槺酰-O-磷酸化壳聚糖、N-辛基-N-邻苯二甲酰-O-磷酸化壳聚糖、N-辛基-N-丁二酰-O-磷酸化壳聚糖以及叶酸、奥曲肽、生物素、cRGD-SH修饰的上述各类两亲性壳聚糖。

实施例2

1，N-癸基壳聚糖的制备

用癸醛和壳聚糖反应，制备方法同N-辛基壳聚糖。

2，N-癸基-N-马来酰壳聚糖的制备

用N-癸基壳聚糖和马来酸酐反应制备，方法同N-辛基-N-马来酰壳聚糖。相同方法可以制备N-癸基-N-柠槺酰壳聚糖、N-癸基-N-丁二酰壳聚糖、N-癸基N-邻苯二甲酰壳聚糖等酸酐化壳聚糖。

3，N-癸基-N-马来酰-O-磷酸化壳聚糖的制备

用N-癸基-N-马来酰壳聚糖和多聚磷酸（PPA）反应，制备方法同OMPC。

′H-NMR(D₂O)：δ(ppm)：0.6-1.7(m，19H)(-NH-CH₂-(CH₂)₈-CH₃)；2.5-2.8(m,2H)(-NH-CH_{2_}-(CH₂)₆-CH₃)；3.6(m，4H)；4.3-4.7(d，2H)(-CO-CH＝CH-CO-).

¹³C-NMR(D₂O)：δ(ppm)：12.7-14.2(-NH-CH₂-(CH₂)₈-CH3)；21.1-31.8(-NH-CH₂-(CH₂)₈-CH₃)；48.3(-NH-CH₂-(CH₂)₈-CH₃)；55(C2)；61.4(C6)；66.8(C3)；75.4(C5)；76.4(C4)；97(C1).137.1-165.2(-CO-CH=CH-CO-).

4、茴香酰胺化N-癸基-N-马来酰-O-磷酸化壳聚糖的制备

将N-癸基-N-马来酰-O-磷酸化壳聚糖与对甲氧基苯甲酰半胱氨酸混合搅拌，方法同于anisamide-conjugated OMPC。

′H-NMR(D₂O)：δ(ppm)：0.6-1.7(m，19H)(-NH-CH₂-(CH₂)₈-CH₃)；2.5-2.8(m,2H)(-NH-CH_{2_}-(CH₂)₆-CH₃)；3.6(m，4H)；4.3-4.7(d，2H)(-CO-CH＝CH-CO-)；7.1-7.5(d，4H).

¹³C-NMR(D₂O)：δ(ppm)：12.7-14.2(-NH-CH₂-(CH₂)₈-CH3)；21.1-31.8(-NH-CH₂-(CH₂)₈-CH₃)；48.3(-NH-CH₂-(CH₂)₈-CH₃)；55(C2)；61.4(C6)；66.8(C3)；75.4(C5)；76.4(C4)；97(C1)；127.2(Ar)；137.1-165.2(-CO-CH=CH-CO-).

元素分析测得脱乙酰化度为91.5％，N-辛基取代度为的取代度为50％，马来酰的取代度为51.7％。茴香酰胺取代度为40％。N-癸基-N-马来酰-O-磷酸化壳聚糖元素分析结果为：N，2.92；C,39.89；H,5.81；茴香酰胺修饰的N-癸基-N-马来酰-O-磷酸化壳聚糖元素分析结果为：N，3.08；C,44.89；H,5.98。

相同方法可以制备N-癸基-N-柠槺酰-O-磷酸化壳聚糖、N-癸基-N-邻苯二甲酰-O-磷酸化壳聚糖、N-癸基N-丁二酰-O-磷酸化壳聚糖以及叶酸、奥曲肽、生物素、cRGD-SH修饰的上述各类两亲性壳聚糖。

实施例3

1，N-十八烷基壳聚糖的制备

用十八碳醛和壳聚糖反应，制备方法同N-辛基壳聚糖。

2，N-十八碳烷基-N-马来酰壳聚糖的制备

用N-十八碳烷基壳聚糖和马来酸酐反应制备，方法同N-辛基-N-马来酰壳聚糖。相同方法可以制备N-十八烷基-N-柠槺酰壳聚糖、N-十八烷基-N-邻苯二甲酰壳聚糖、N-十八烷基-N-丁二酰)壳聚糖等酸酐化壳聚糖。

3，N-十八碳烷基-N-马来酰-O-磷酸化壳聚糖的制备

用N-十八碳烷基-N-马来酰壳聚糖和多聚磷酸反应，制备方法同OMPC。

FT IR：2863，1381，1290，907，721cm^-1(长链烷基)，2952，1482，1240，1051cm^-1(磷酰基团)，1701cm^-1(马来酰).

′H-NMR(D₂O)：δ(ppm)：0.6-1.7(m，35H)(-NH-CH₂-(CH₂)₁₆-CH₃)；2.7-2.8(m,2H)(-NH-CH_{2_}-(CH₂)₆-CH₃)；3.6(m，4H)；4.3-4.7(d，2H)(-CO-CH＝CH-CO-).

¹³C-NMR(D₂O)：δ(ppm)：12.7-14.2(-NH-CH₂-(CH₂)₁₆-CH3)；21.1-31.8(-NH-CH₂-(CH₂)₁₆-CH₃)；48.3(-NH-CH₂-(CH₂)₁₆-CH₃)；55(C2)；61.4(C6)；66.8(C3)；75.4(C5)；76.4(C4)；97(C1).137.1-165.2(-CO-CH=CH-CO-).

4、茴香酰胺化N-癸基-N-马来酰-O-磷酸化壳聚糖的制备

FT IR：2863，1381，1290，907，721cm^-1(长链烷基)，2952，1482，1240，1051cm^-1(磷酰基团)，1701cm^-1(马来酰)，1610cm^-1(茴香酰胺苯环)..

′H-NMR(D₂O)：δ(ppm)：0.6-1.7(m，35H)(-NH-CH₂-(CH₂)₁₆-CH₃)；2.7-2.8(m,2H)(-NH-CH_{2_}-(CH₂)₆-CH₃)；3.6(m，4H)；4.3-4.7(d，2H)(-CO-CH＝CH-CO-)；7.1-7.5(d，4H).

¹³C-NMR(D₂O)：δ(ppm)：12.7-14.2(-NH-CH₂-(CH₂)₁₆-CH3)；21.1-31.8(-NH-CH₂-(CH₂)₁₆-CH₃)；48.3(-NH-CH₂-(CH₂)₁₆-CH₃)；55(C2)；61.4(C6)；66.8(C3)；75.4(C5)；76.4(C4)；97(C1)；127.2(Ar)；137.1-165.2(-CO-CH=CH-CO-).

元素分析测得脱乙酰化度为91.5％，N-十八基取代度为的取代度为50％，马来酰的取代度为51.7％。茴香酰胺取代度为40％。N-十八基-N-马来酰-O-磷酸化壳聚糖元素分析结果为：N，2.96；C,45.89；H,6.81；茴香酰胺修饰的N-十八基-N-马来酰-O-磷酸化壳聚糖元素分析结果为：N，3.08；C,47.11；H,6.01。

相同方法可以制备N-十八基-N-柠槺酰-O-磷酸化壳聚糖、N-十八基-N-邻苯二甲酰-O-磷酸化壳聚糖、N-十八基-N-丁二酰-O-磷酸化壳聚糖以及叶酸、奥曲肽、生物素、cRGD-SH修饰的上述各类两亲性壳聚糖。

实施例4

1、叶酸化N-辛基-N-马来酰-O-磷酸化壳聚糖的制备

将100mg N-辛基-N-马来酰-O-磷酸化壳聚糖与100mg巯基化叶酸混合搅拌于弱碱（pH<8）水相体系中，室温搅拌9-24h，体系倾入3eq体积的水中，透析12h，滤液冻干得取代度不同的叶酸化OMPC。

2.生物素化N-辛基-N-马来酰-O-磷酸化壳聚糖的制备

将100mg N-辛基-N-马来酰-O-磷酸化壳聚糖与80mg巯基化生物素混合搅拌于弱碱（pH<8）水相体系中，室温搅拌6-14h，体系倾入3eq体积的水中，透析12h，滤液冻干得取代度不同的生物素化OMPC。

3.奥曲肽修饰的N-辛基-N-马来酰-O-磷酸化壳聚糖的制备

将100mg N-辛基-N-马来酰-O-磷酸化壳聚糖与120mg巯基化奥曲肽混合搅拌于弱碱（pH<8）水相体系中，室温搅拌6-14h，体系倾入3eq体积的水中，透析12h，滤液冻干得取代度不同的奥曲肽修饰的OMPC。

FT IR：2863，1381，1290，907，721cm^-1(长链烷基)，2952，1482，1240，1051cm^-1(磷酰基团)，1701cm^-1(马来酰)，1610，1650，1710cm^-1(叶酸、生物素、奥曲肽等结构芳环)..

元素分析测得脱乙酰化度为91.5％，N-辛基取代度为的取代度为50％，马来酰的取代度为51.7％。功能基团取代度约为40％。以叶酸修饰为例，叶酸化N-辛基-N-马来酰-O-磷酸化壳聚糖元素分析结果为：N，3.26；C,44.19；H,5.91。

该功能化合成路线为通用方法，具备-SH的功能化基团均可以在室温下接入N-辛基-N-马来酰-O-磷酸化壳聚糖和-辛基-N-柠槺酰-O-磷酸化壳聚糖中，具有氨基的功能化基团可以在稍高温度下被接入上述壳聚糖衍生物中。相同方法可以制备cRGD-SH、半胱氨酸修饰的N-辛基-N-柠槺酰-O-磷酸化壳聚糖、N-辛基-N-马来酰-O-磷酸化壳聚糖。

实施例5

1.N-烷基化-N-酰化-O-磷酰化壳聚糖（AMPC）的CMC测定

分别精确配置1-1000μg/mL的15个不同浓度的AMPC和OPHPC、NOSC水溶液，测定表面张力，结果如表2所示。

表2表面张力法测定材料CMC值

通过本发明制备的AMPC和NOSC的CMC值对比，本发明壳聚糖衍生物明显小于NOSC，和OPHPC相比，CMC值相当。预示着耐稀释性能优越，体内胶束的稳定性好，不易粒子松散药物泄露。

实施例6

OMPC小鼠急性毒性考察

1.载体静脉注射溶液配置：

正确称取OMPC 500mg，先用20mL生理盐水将其溶解，得20mL浓度为25mg/mL的OMPC注射溶液，以25mg/mL的药液作为本次实验的最高浓度，并以1∶0.8的比例依此作递减稀释，配制20，16，12.8和10.24mg/mL共5个浓度的药液，给药体积为0.2mL/10g，单次iv给药。将原料壳聚糖对照(400mg/kg)，同上体积，单次iv给药。

2.受试动物选择

昆明种小白鼠，雌雄各半，18-22g，由东大医学院动物中心提供，合格证为苏动(质)91058。动物数为：OMPC尾静脉给药组，10只/组，5个剂量组。原料壳聚糖对照1个剂量组。

3.给药方案

(1)OMPC静脉给药对小鼠的急性毒性：小鼠50只，随机分为5组，10只/组，受试前禁食12小时。根据预试，确定本次实验最高剂量为300mg/kg，并以1∶0.8的剂距依此递减为240，192，153和122mg/kg共5个剂量组。

(2).壳聚糖原料对照300mg/kg，1个剂量组。

相同方法考察N-烷基-N-柠槺酰-O-磷酸化壳聚糖、N-烷基-N-邻苯二甲酰-O-磷酸化壳聚糖、N-烷基-N-丁二酰-O-磷酸化壳聚糖等材料的急性毒性。

结果表明，OMPC静脉给药对小鼠的急性毒性在较高剂量给药后即进入挣扎、昏迷窒息而迅速死亡，中、低剂量给药后多有短暂的呼吸抑制，呼吸困难、急促，部分小鼠最终也因肺部的病变死亡。死亡小鼠剖体检查可见肺部不规则得出血性改变，稍晚死亡小鼠除肺部出血性改变外，部分可见肝脏脂肪样变，余未见明显异常。壳聚糖原料对照300mg/kg，在给药后8小时即全部死亡。死亡原因可能系主要系肺部出血所致。本品小鼠静脉给药的死亡情况，LD50及95％可信限见表3，OMPC的小鼠静脉注射的LD50及95％可信限分别为186.94(168.65-207.21)mg/kg，较原料壳聚糖有明显降低。

其他部分材料：N-烷基-N-柠槺酰-O-磷酸化壳聚糖、N-烷基-N-邻苯二甲酰-O-磷酸化壳聚糖、N-烷基-N-丁二酰-O-磷酸化壳聚糖以及分别用茴香酰胺、叶酸、cRGD-SH、生物素、奥曲肽修饰的上述载体最大溶解度给药，100mg/kg给药后观察14天内，小鼠食量没有变化，活动活动和其他行为如常，毛色光亮。实验结果表明，材料iv小鼠最大耐受剂量大于300mg/kg，观察14天未见急性毒性反应。表明该材料毒性很低，基本无毒。

表3LD50软件计算OMPC小鼠静脉注射的LD50和95％置信限

实施例7

载体溶血试验

N-辛基-N-马来酰-O-磷酸化壳聚糖作为考察对象，常规制备2％的兔红细胞悬液适量备用。进行A，B，C三次溶血试验，A，B，C三次试验内容相同，但在A试验中N-辛基-N-马来酰-O-磷酸化壳聚糖浓度为l0mg/mL，C试验中载体浓度为1mg/mL(稀释用0.9％生理盐水)，实验按表4数据进行。

表4、载体10mg/mL，3mg/mL，1mg/mL三组溶液溶血试验

由表5可知，在N-辛基-N-马来酰-O-磷酸化壳聚糖试验中，1h观察现象发现，10mg/mL第一组第一、二管均发生完全溶血和部分溶血现象，其余各管以及3mg/mL (除第一管部分溶血外)与l mg/mL组均无溶血现象。

表5、载体10mg/mL，3mg/mL，1mg/mL三组溶液溶血试验结果

相同方法测试N-烷基-N-邻苯二甲酰-O-磷酸化壳聚糖、N-烷基-N-柠槺酰-O-磷酸化壳聚糖中、低浓度均未出现溶血现象，高浓度均发生部分溶血现象。N-烷基-N-丁二酰-O-磷酸化壳聚糖高中低浓度均未出现溶血现象。所有结果与NOSC高、中浓度均出现溶血现象相比，溶血现象有较大改善，与OPHPC的溶血实验结果相比，亦有一定程度的改善趋势。

实施例8

胶束的制备及胶束粒径的测定

将OMPC 40mg溶解在7mL水中于50℃搅拌30min，然后室温超声30min后，用Zetasizer3000 HS instrument(Malvern Instruments，Malvern，UK)在633nm，25℃,He-Ne激光测定胶束粒径为90-150nm。

实施例9

1、包含紫杉醇的OMPC胶束的制备

(1).透析法：

OMPC 40mg溶解在7mL水中于50℃搅拌30min。紫杉醇50mg溶解在1mL乙醇中。然后二者溶液混合，在室温超声30min后，用透析袋(MWCO 10000)在蒸馏水中室温透析过夜，离心(3000rpm×5min)，用0.22μm滤膜过滤，冷冻干燥。

(2).溶剂挥发法：

OMPC 40mg溶解在7mL水中于50℃搅拌30min，紫杉醇30mg溶解在1mL二氯甲烷中。然后在室温搅拌下将二者溶液混合，继续搅拌过夜，使二氯甲烷挥发，离心(3000rpm×5min)，用0.22μm滤膜过滤，冷冻干燥。

(3).搅拌法：

OMPC 40rng溶解在7mL水中于50℃搅拌30min后，加入30mg紫杉醇，继续室温搅拌2小时，离心(3000rpm×5min)，用0.22μm滤膜过滤，冷冻干燥。

2、OMPC胶束中紫杉醇含量的测定

用HPLC(LC-6A，Shimadzu，Japan)流动相为甲醇∶乙睛∶水=30∶40∶30(v/v)。色谱柱为DiamohsilTM C18(250×4.6mm)，柱子粒径为5μm，流速为1.0mL/min，检测波长为227nm(SPD-10A，UV detector，Shimadzu，Japan)，柱温为30℃。进样体积为20μL。

结果见表6。

实施例10

1、包含多烯紫杉醇的OMPC胶束的制备

(1).透析法

OMPC 40mg溶解在7mL水中于50℃搅拌30min。多烯紫杉醇50mg溶解在1mL乙醇中。然后二者溶液混合，在室温超声30min后，用透析袋(MWCO 10000)在蒸馏水中室温透析过夜，离心(3000rpm×5min)，用0.22μm滤膜过滤，冷冻干燥。

(2).溶剂挥发法

OMPC 40mg溶解在7mL水中于50℃搅拌30min，多烯紫杉醇30mg溶解在2mL氯仿中。然后在室温搅拌下将二者溶液混合，继续搅拌过夜，使氯仿挥发，离心(3000rpm×5min)，用0.22μm滤膜过滤，冷冻干燥。

(3).搅拌法

OMPC 40mg溶解在7mL水中于50℃搅拌30min后，加入30mg多烯紫杉醇，继续室温搅拌2小时，离心(3000rpm×5min)，用0.22μm滤膜过滤，冷冻干燥。

载体溶液浓度选用几个梯度，相同方法制备胶束。

2、OMPC胶束中多烯紫杉醇含量的测定

用HPLC(LC-6A，Shimadzu，Japan)流动相为甲醇∶水∶磷酸=350∶140∶1(v/v).色谱柱为Spherisorb C8(150×4.6μm)，柱子粒径为5μm.流速为1.0mL/min，检测波长为210nm(SPD-10A，UV detector Shimadzu，Japan)，柱温为30℃，注射样品体积为20μL。结果见表6

表6不同胶束溶液中药物含量

实施例11

1、包含紫杉醇的anisamide-conjugated OMPC胶束的制备

(1)透析法：

Anisamide-conjugated OMPC 40mg溶解在7mL水中于50℃搅拌30min。紫杉醇50mg溶解在1mL乙醇中。然后二者溶液混合，在室温超声30min后，用透析袋(MWCO 10000)在蒸馏水中室温透析过夜，离心(3000rpm×5min)，用0.22μm滤膜过滤，冷冻干燥。

(2).溶剂挥发法：

Anisamide-conjugated OMPC 40mg溶解在7mL水中于50℃搅拌30min，紫杉醇30mg溶解在1mL二氯甲烷中。然后在室温搅拌下将二者溶液混合，继续搅拌过夜，使二氯甲烷挥发，离心(3000rpm×5min)，用0.22μm滤膜过滤，冷冻干燥。

(3).搅拌法：

Anisamide-conjugated OMPC 40rng溶解在7mL水中于50℃搅拌30min后，加入30mg紫杉醇，继续室温搅拌2小时，离心(3000rpm×5min)，用0.22μm滤膜过滤，冷冻干燥。

2、Anisamide-conjugated OMPC胶束中紫杉醇含量的测定

结果见表7。

实施例12

1、包含多烯紫杉醇的anisamide-conjugated OMPC胶束的制备

(1).透析法

Anisamide-conjugated OMPC 40mg溶解在7mL水中于50℃搅拌30min。多烯紫杉醇50mg溶解在1mL乙醇中。然后二者溶液混合，在室温超声30min后，用透析袋(MWCO 10000)在蒸馏水中室温透析过夜，离心(3000rpm×5min)，用0.22μm滤膜过滤，冷冻干燥。

(2).溶剂挥发法

Anisamide-conjugated OMPC 40mg溶解在7mL水中于50℃搅拌30min，多烯紫杉醇30mg溶解在2mL氯仿中。然后在室温搅拌下将二者溶液混合，继续搅拌过夜，使氯仿挥发，离心(3000rpm×5min)，用0.22μm滤膜过滤，冷冻干燥。

(3).搅拌法

Anisamide-conjugated OMPC 40mg溶解在7mL水中于50℃搅拌30min后，加入30mg多烯紫杉醇，继续室温搅拌2小时，离心(3000rpm×5min)，用0.22μm滤膜过滤，冷冻干燥。

载体溶液浓度选用几个梯度，相同方法制备胶束。

2、Anisamide-conjugated OMPC胶束中多烯紫杉醇含量的测定

用HPLC(LC-6A，Shimadzu，Japan)流动相为甲醇∶水∶磷酸=350∶140∶1(v/v).色谱柱为Spherisorb C8(150×4.6μm)，柱子粒径为5μm.流速为1.0mL/min，检测波长为210nm(SPD-10A，UV detector Shimadzu，Japan)，柱温为30℃，注射样品体积为20μL。结果见表7

表7不同胶束溶液中药物含量

实施例13

1.包含环孢素A的OMPC胶束（CyA-OMPC）的制备

（1）.透析法：OMPC 50mg溶解在10mL水中，超声30min，使其分散均匀。环孢素A 30mg溶解在1mL乙醇中。然后二者溶液混合，在室温超声30min后，用透析袋(MWCO10000)在蒸馏水中室温透析过夜，用0.22μm滤膜过滤，冷冻干燥。

（2）溶剂挥发法：OMPC 50mg溶解在10mL水中，超声30min，使其分散均匀，环孢素A 30mg溶解在1mL氯仿中。然后在室温搅拌下将二者溶液混合，继续搅拌过夜，使氯仿挥发，离心(3000rpm×5min)，用0.22μm滤膜过滤，冷冻干燥。

（3）搅拌法：OMPC 50mg溶解在10mL水中，超声30min，使其分散均匀。环孢素A 30mg溶解在1mL乙醇中。磁力搅拌条件下，将环孢素A乙醇溶液逐滴滴加到OMPC水溶液中，继续室温搅拌1小时，离心(3000rpm×5min)，用0.22μm滤膜过滤，冷冻干燥。2、OMPC胶束中环孢素A含量的测定

用HPLC(LC-6A，Shimadzu，Japan)流动相为乙腈/水=90∶10(v/v).色谱柱为Spherisorb C8(150×4.6μm)，柱子粒径为5μm.流速为1.0mL/min，检测波长为237nm(SPD-10A，UVdetector Shimadzu，Japan)，柱温为30℃，注射样品体积为20μL。结果见表8

表8不同胶束溶液中环孢素A含量

实施例14

OMPC与anisamide-conjugated OMPC对MCF-7和PC-3细胞摄取考察（靶效率）

1、MCF-7和PC-3细胞培养

将MCF-7（PC-3）细胞用DMEM（F-12）完全培养基培养至24孔板中，待细胞长满至80％，进行给药。

2、细胞给药

将PTX-OMPC和PTX-anisamide-conjugated OMPC制剂稀释至PTX浓度为50、100、150μg/mL，每孔吸取200μL，每浓度和制剂平行给药4次，培养2h。

3、细胞摄取药量测定

移去每孔药液，磷酸缓冲盐（PBS）500μL×3次冲洗，加入200μL 0.1％ SDS细胞裂解液，吹打后离心。吸取100μL混入100μL甲醇，离心后HPLC进样测定PTX含量；另吸取20μL进行BCA测定蛋白含量。肿瘤细胞的PTX摄取量为所测定的药量与蛋白量的比值。结果见图1、图2。

结果表明，通过简单有效地共价连接大量主动肿瘤靶向配体，制剂被肿瘤细胞摄取的能力相对比没有靶配体修饰的对照组有了极显著的增加。

实施例15

1、包含紫杉醇的N-癸基-N-马来酰-O-磷酸化化壳聚糖（DMPC）胶束的制备

(1)透析法

DMPC 40mg溶解在10mL水中于50℃搅拌30min。紫杉醇50mg溶解在1mL乙醇中。然后二者溶液混合，在室温超声30min后，用透析袋(MWCO 12000)在蒸馏水中室温透析过夜，离心(3000rpm×5min)，用0.22μm滤膜过滤，冷冻干燥。

(2).溶剂挥发法

DMPC 40mg溶解在10mL水中于50℃搅拌30min，紫杉醇30mg溶解在0.8mL氯仿中。然后在室温搅拌下将二者溶液混合，继续搅拌过夜，使氯仿挥发，离心(3000rpm×5min)，用0.22μm滤膜过滤，冷冻干燥。

(3).搅拌法

DMPC 40mg溶解在10mL水中于50℃搅拌30min后，加入30mg紫杉醇，继续室温搅拌2小时，离心(3000rpm×5min)，用0.22μm滤膜过滤，冷冻干燥。

载体溶液浓度选用几个梯度，相同方法制备胶束。

2、DMPC胶束中紫杉醇含量的测定

用HPLC(LC-6A，Shimadzu，Japan)流动相为甲醇∶水∶磷酸=350∶140∶1(v/v).色谱柱为Spherisorb C8(150×4.6μm)，柱子粒径为5μm.流速为1.0mL/min，检测波长为210nm(SPD-10A，UV detector Shimadzu，Japan)，柱温为30℃，注射样品体积为20μL。结果见表9

表9不同胶束溶液中药物含量

实施例16

1、包含紫杉醇的N-十八烷基-N-马来酰-O-磷酸化壳聚糖胶束的制备

(1).透析法

N-十八烷基-N-马来酰-O-磷酸化壳聚糖40mg溶解在10mL水中于50℃搅拌30min。紫杉醇50mg溶解在1mL乙醇中。然后二者溶液混合，在室温超声30min后，用透析袋(MWCO12000)在蒸馏水中室温透析过夜，离心(3000rpm×5min)，用0.22μm滤膜过滤，冷冻干燥。

(2).溶剂挥发法

N-十八烷基-N-马来酰-O-磷酸化壳聚糖40mg溶解在10mL水中于50℃搅拌30min，紫杉醇30mg溶解在0.8mL氯仿中。然后在室温搅拌下将二者溶液混合，继续搅拌过夜，使氯仿挥发，离心(3000rpm×5min)，用0.22μm滤膜过滤，冷冻干燥。

(3).搅拌法

N-十八烷基-N-马来酰-O-磷酸化壳聚糖40mg溶解在10mL水中于50℃搅拌30min后，加入30mg紫杉醇，继续室温搅拌2小时，离心(3000rpm×5min)，用0.22μm滤膜过滤，冷冻干燥。

载体溶液浓度选用几个梯度，相同方法制备胶束。

2、N-十八烷基-N-马来酰-O-磷酸化壳聚糖胶束中紫杉醇含量的测定

用HPLC(LC-6A，Shimadzu，Japan)流动相为甲醇∶水∶磷酸=350∶140∶1(v/v).色谱柱为Spherisorb C8(150×4.6μm)，柱子粒径为5μm.流速为1.0mL/min，检测波长为210nm(SPD-10A，UV detector Shimadzu，Japan)，柱温为30℃，注射样品体积为20μL。结果见表10

表10不同胶束溶液中药物含量

实施例17

1.包含紫杉醇的N-辛基-N-马来酰-O-磷酸化壳聚糖（OMPC）胶束的制备

N-辛基-N-马来酰-O-磷酸化壳聚糖40mg溶解在10mL水中于50℃搅拌30min后，加入30mg紫杉醇，继续室温搅拌2小时，离心(3000rpm×5min)，用0.22μm滤膜过滤，备用。

2.不同pH下PTX-OMPC释药行为考察

将制备的PTX-OMPC制剂至于溶出仪中，介质选为1％吐温80磷酸缓冲盐，pH 7.4、pH 6.5、pH 5.5三种pH梯度，溶出温度设定为37℃，取样时间设为1h、2h、4.5h、6h、9h、12h、24h、48h 9个时间点。每次取样1mL，用1mL甲醇稀释HPLC进样。结果见图3

结果表明，通过磷酸化修饰的壳聚糖衍生物，不仅仅增加了其水中溶解性，并且在构建递药系统时，制剂有着pH敏感行为，在酸性条件下，伴随着磷酸化壳聚糖的溶解度降低而导致的PTX-OMPC的结构不稳定，药物快速从胶束中释放，对在肿瘤部位（微酸环境）的治疗行为有着积极意义。

Claims

1.一种结构式(I)的壳聚糖衍生物：

其中R代表-(CH₂)_n-1CH₃，n＝6～18；

-NH-R’代表

-NH-R’还代表在上引入肿瘤靶向配体，所述肿瘤靶向配体选自叶酸、生物素、奥曲肽或cRGD；

x＝50％～60％；y＝8％～10％；z＝20％～30％。

2.权利要求1的壳聚糖衍生物，其中x＝60％；y＝10％；z＝30％。

3.权利要求1的壳聚糖衍生物，其中n＝12。

4.一种药物组合物，含有药物和权利要求1的壳聚糖衍生物，其中药物为紫杉醇、环孢素A、替尼铂甙、羟基喜树碱、喜树碱、长春酰胺、依托泊甙、尼莫地平、阿霉素、多烯紫杉醇，灯盏花素、银杏内酷、水飞蓟素、柔红霉素、丝裂霉素或氨甲喋呤。

5.权利要求4的药物组合物，其中药物和壳聚糖衍生物的摩尔比为2:10～12:10。

6.权利要求5的药物组合物，其中药物和壳聚糖衍生物的摩尔比为6:10～10:10。