CN107661504A - 一种树枝状大分子修饰的金纳米粒子及其制备方法和应用 - Google Patents
一种树枝状大分子修饰的金纳米粒子及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种树枝状大分子修饰的金纳米粒子及其制备方法和应用。该方法包括如下操作:将壳聚糖叠氮化修饰,然后与含炔基树枝状聚酰胺‑胺通过点击反应合成为聚糖偶联树枝状聚酰胺‑胺(CS‑PAMAM),然后没有添加其它还原剂条件下,使用CS‑PAMAM充当稳定剂和还原剂一步合成粒径均一的金纳米粒子,获得的树枝状大分子修饰的金纳米粒子粒径的相对较小,有利于降低产物的细胞毒性外,其稳定性高、生物相容性好,表面含大量胺基官能团,可赋予其靶向性,在基因传递、肿瘤诊疗一体化方面显示出重要的应用前景,且具备良好的转染效果,可以作为药物控释载体,在药物共传递领域有潜在的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医学工程材料领域,特别涉及一种树枝状大分子修饰的金纳米粒子及其制备方法和应用。
背景技术
基因治疗是目前用于癌症及先天性免疫系统疾病治疗的一种有效方法。该技术实施的关键是选择合适的基因载体及基因导入方法,进而使基因能够在细胞中获得安全、高效、可控且稳定的表达。病毒载体因其高风险性、机体免疫反应、不能大规模生产等缺陷在临床应用方面受到限制,因此具有高转染效率的脂质体及其它阳离子聚合物日益受到重视。
金纳米粒子是金属纳米颗粒中最早研究的一大类别,是指尺寸在1nm至100nm范围内的金纳米颗粒。金纳米粒子具有较大的比表面积、特有的光电性质、低的细胞毒性并且生物相容和表面易修饰,因此纳米金在肿瘤成像、药物递送等生物医学工程领域具有良好的应用前景。Mirkin利用寡聚核苷酸修饰的金纳米粒子对其互补DNA分子进行比色分析法,将金纳米粒子表面功能化修饰其中一种DNA,使之选择性对目标DNA进行响应引起金纳米粒子的聚集,通过肉眼观测即可用于检验目标DNA的存在(Science,1997,277(5329):1078-81)。Wang等利用抗原抗体间相互作用对两种不同形态纳米颗粒进行可控组装,并结合表面增强拉曼光谱进行特定蛋白质的检测(Analytical Chemistry,2013,85)。然而,稳定性以及良好的分散性成为纳米金在生物学领域上的主要阻碍,以及在大量还原剂和稳定剂存在条件下还原氯金酸合成纳米金粒子等复杂繁琐的合成手段,使其在生物材料的实际应用中受到限制。
树枝状大分子是近年发展起来的一类具有三维规整结构、高度支化和纳米尺度的单分散性高分子材料,凭借其独特的分子结构、无免疫原性、可生物降解、易于修饰等特性在基因载体方面显示出重要应用前景。1993年,Haensler等首次尝试将聚酰胺—胺(PAMAM)用于基因转染实验(Bioconjugate Chemistry 1993,4:372-379)。然而,PAMAM在较高代数或高浓度下仍显示出明显的细胞毒性,且其降解产物也有较大的毒性,使其在体内实际应用中受到限制。
因此,如何极大的改善纳米金制备方法、稳定性、材料的生物相容性,作为一种安全高效的生物载体材料,便成为当前生物医学工程领域亟待解决的重要课题。迄今为止,未发现在没有添加其它还原剂条件下,利用点击化学将叠氮化壳聚糖与含炔基的树枝状聚酰胺-胺偶联成为一种生物相容性好、且可降解的壳聚糖基聚酰胺-胺树枝状大分子充当稳定剂和还原剂一步合成金纳米粒子,获得了稳定、生物相容性好的可降解的金纳米复合材料及其应用尚未报道。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足,提供一种树枝状大分子修饰的金纳米粒子。该纳米粒子粒径均一、分散性良好、生物相容性好、可生物降解,将会在在基因传递、肿瘤诊疗一体化方面显示出重要的应用前景。
本发明的另一目的在于提供所述树枝状大分子修饰的金纳米粒子的制备方法。该方法首先通过取代反应合成叠氮基团修饰的壳聚糖CS;然后通过点击化学的方法将叠氮基团修饰的壳聚糖CS与含炔基聚酰胺-胺PAMAM偶联,合成得到可作为基因载体、肿瘤诊疗的新型树枝状大分子修饰的金纳米粒子。
本发明的又一目的在于提供所述树枝状大分子修饰的金纳米粒子的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现:一种树枝状大分子修饰的金纳米粒子,具体为壳聚糖接枝树枝状聚酰胺-胺修饰的金纳米粒子,其分子式如下所示:
其中,圆形表示金纳米粒子;m:n=5:1。
所述的树枝状大分子修饰的金纳米粒子的制备方法,包括如下步骤:
(1)叠氮化壳聚糖(CS-N3)的合成
将叠氮乙酸(N3-CH2-COOH)溶于N-N-二甲基甲酰胺(DMF)中,然后依次加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)进行活化,再加入壳聚糖(CS)溶于水获得的壳聚糖溶液进行反应,透析,冷冻干燥,得到CS-N3(叠氮化壳聚糖);
(2)壳聚糖接枝树枝状聚酰胺-胺(CS-PAMAM)的合成
将含炔基树枝状聚酰胺-胺(PAMAM)溶解到水中,然后加入步骤(1)中得到的CS-N3(叠氮化壳聚糖),再加入五水硫酸铜和抗坏血酸钠,于40~75℃进行反应,透析,冻干,得到CS-PAMAM(壳聚糖接枝树枝状聚酰胺-胺);
(3)壳聚糖接枝树枝状聚酰胺-胺(CS-PAMAM)修饰的金纳米粒子(Au@CS-PAMAM)的合成
将步骤(2)中得到的CS-PAMAM(壳聚糖接枝树枝状聚酰胺-胺)溶解到超纯水中,逐滴加入氯金酸(HAuCl4),室温搅拌,透析,冷冻干燥,得到树枝状大分子修饰的金纳米粒子(Au@CS-PAMAM)。
步骤(1)中所述的叠氮乙酸的用量按每毫升DMF(N-N-二甲基甲酰胺)配比0.1~0.5g叠氮乙酸计算。
步骤(1)中所述的壳聚糖的分子量为1000~20000,脱乙酰度为40~85%。
步骤(1)中所述的壳聚糖的用量按每毫升水配比0.05~0.5g壳聚糖计算。
步骤(1)中所述的壳聚糖、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和叠氮乙酸的摩尔比为1:1~10:1~10:1~10;优选为1:1.5~10:1.5~10:2~10。
步骤(1)所述的反应优选为在5~35℃条件下进行反应。
步骤(1)所述的活化的时间优选为0.5~4h。
步骤(1)中所述的反应的时间优选为12~24h。
步骤(1)中所述的透析为在纯水中进行透析;优选为在纯水中透析2~3天。
步骤(2)中所述的含炔基树枝状聚酰胺-胺(PAMAM,含炔基的3代聚酰胺-胺树枝状分子)为依据申请号为201610356643.9、名称为“一种装载一氧化氮的阳离子聚合物及其制备方法和应用”的中国专利申请中的实施例4制备得到。
步骤(2)中所述的叠氮壳聚糖、含炔基树枝状聚酰胺-胺、五水硫酸铜和抗坏血酸钠的摩尔比为1:1~12:1~6:2.5~18。
步骤(2)中所述的含炔基树枝状聚酰胺-胺(PAMAM)的用量按每毫升水配比0.05~0.15g含炔基树枝状聚酰胺-胺计算。
步骤(2)中所述的透析为采用透析袋进行透析;优选为采用截留分子量为2000~20000的透析袋进行透析;更优选为用截留分子量为2000~20000的透析袋透析2~4天。
步骤(2)中所述的反应为在惰性气体保护下进行反应。
所述的惰性气体优选为氮气。
步骤(2)中所述的反应的时间优选为24~48h。
步骤(2)中所述的壳聚糖接枝树枝状聚酰胺-胺(CS-PAMAM)分子式如下所示:
其中,m:n=5:1。
步骤(3)中所述的溶解优选为超声溶解。
步骤(3)中所述的室温搅拌的时间优选为0.5~24h。
步骤(3)中所述的透析为采用透析袋进行透析;优选为采用截留分子量为100~10000的透析袋进行透析;更优选为用截留分子量为100~10000的透析袋透析1~3天。
步骤(3)中所述的CS-PAMAM(壳聚糖接枝树枝状聚酰胺-胺)与氯金酸的摩尔比为1:1~10。
步骤(3)中所述的CS-PAMAM的用量为按每毫升超纯水配比1~8mg CS-PAMAM计算。
所述的树枝状大分子修饰的金纳米粒子在制备药物载体或基因载体中的应用。
所述的药物包括基因药物和抗肿瘤药物。
所述的肿瘤优选为人乳腺癌。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
(1)首先与传统的化学方法制备纳米金相比,本发明不添加其它还原剂,只利用CS-PAMAM(充当稳定剂和还原剂)一步合成稳定性好、生物相容性好的金纳米粒子。
(2)本发明的金纳米粒子外层为含大量胺基官能团的高代数聚酰胺-胺,可进行不同的化学修饰,将会在在基因传递、肿瘤诊疗一体化方面显示出重要的应用前景。
(3)本发明采用天然的壳聚糖为修饰材料,不仅可以改善纳米金的稳定性,而且极大的降低了阳离子聚合物聚酰胺-胺的生物毒性。
(4)本发明采用点击化学方法将树枝状聚聚酰胺-胺与壳聚糖偶联,反应效率高、结构易于精确调控,分子量分布单一。
(5)本发明的材料粒径的相对较小,除有利于降低产物的细胞毒性外,其作为药物控释载体,在药物共传递领域有潜在的应用价值。
附图说明
图1为壳聚糖基聚酰胺胺树枝状大分子及其修饰的金纳米粒子的紫外可见光谱图。
图2为壳聚糖基聚酰胺-胺树枝状大分子及其修饰的金纳米粒子红外光谱图;其中,a为Au@CS-PAMAM,b为CS-PAMAM。
图3为Au@CS-PAMAM与聚乙烯亚胺(PEI)基因转染效果比较图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
1、以下实施例所使用的乙二胺和丙烯酸甲酯为无水乙二胺和无水丙烯酸甲酯,其制备方法按照以下操作步骤:
(1)将无水氢氧化钾加入到乙二胺中,搅拌6~24小时,然后减压蒸馏,得到无水乙二胺,所述无水氢氧化钾的加入量以每500mL乙二胺中加入1~2克计;
(2)将无水硫酸钠加入到丙烯酸甲酯中,搅拌6~24小时,然后常压蒸馏,得到无水丙烯酸甲酯,所述无水硫酸钠的加入量以每500mL丙烯酸甲酯中加入1~2克计。
2、以下实施例所使用的炔丙胺为干燥的炔丙胺,其制备方法按照以下操作步骤:将氢化钙加入到炔丙胺中,搅拌6~24小时,然后减压蒸馏,得到干燥的炔丙胺;所述氢化钙的加入量以每10mL炔丙胺中加入0.1~0.2克计。
3、以下实施例所使用的无水甲醇的制备方法按照以下操作步骤:将氢化钙加入到乙醇中,搅拌6~24小时,然后常压蒸馏,得到无水乙醇,所述氢化钙的加入量以每500mL乙醇中加入1~2克计。
4、如无特别说明,本发明中的室温为5~35℃。
实施例1
(1)叠氮基团修饰的壳聚糖(CS-N3)的合成
将叠氮乙酸(N3-CH2-COOH)溶于N-N-二甲基甲酰胺(DMF)中,然后依次加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化30min,得到叠氮乙酸混合溶液中;活化结束后将壳聚糖(CS分子量为2000,脱乙酰度85%)溶解于纯水,然后缓慢加入到上述叠氮乙酸混合溶液中,室温35℃下反应12h。产物在纯水中透析2天,冷冻干燥,得到产物叠氮化壳聚糖;其中,所述壳聚糖、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和叠氮乙酸的摩尔比为1:1.5:1.5:2;所述的N,N-二甲基甲酰胺以每10毫升中加入5g叠氮酸计;所述的纯水以每10ml中加入5g壳聚糖计。
(2)含炔基的聚酰胺-胺树枝状分子(PAMAM)的合成
参照专利申请:一种装载一氧化氮的阳离子聚合物及其制备方法和应用(专利号申请为201610356643.9)中的方法合成PAMAM。其中,所述无水甲醇的制备方法按照以下操作步骤:将氢化钙加入到甲醇中,搅拌6~24小时,然后常压蒸馏,得到无水甲醇,所述氢化钙的加入量以每500mL甲醇中加入1克计;所述的干燥处理的丙烯酸甲酯和乙二胺的制备方法按照以下操作步骤:将无水硫酸钠加入到丙烯酸甲酯中搅拌6小时,然后常压蒸馏,得到无水丙烯酸甲酯,所述无水硫酸钠的加入量以每500mL丙烯酸甲酯中加入1~2克计;将无水氢氧化钾加入到乙二胺中搅拌6小时,然后减压蒸馏,得到无水乙二胺,所述无水氢氧化钾的加入量以每500mL乙二胺中加入1克计;所述干燥的炔丙胺的制备方法按照以下操作步骤:将氢化钙加入到炔丙胺中搅拌6小时,然后减压蒸馏,得到干燥的炔丙胺;所述氢化钙的加入量以每10mL炔丙胺中加入0.1克计。
实施例2
(1)叠氮基团修饰的壳聚糖(CS-N3)的合成
将叠氮乙酸(N3-CH2-COOH)溶于N-N-二甲基甲酰胺(DMF)中,然后依次加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化4h,得到叠氮乙酸混合溶液中;活化结束后将壳聚糖(CS分子量为20000,脱乙酰度40%)溶解于纯水,然后缓慢加入到上述叠氮乙酸混合溶液中,室温下反应24h。产物在纯水中透析3天,冷冻干燥,得到产物叠氮化壳聚糖。其中,所述壳聚糖、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和叠氮乙酸的摩尔比为1:10:10:10;所述的N,N-二甲基甲酰胺以每10毫升中加入1g叠氮酸计;所述的纯水以每10ml中加入0.5g壳聚糖计。
(2)含炔基的聚酰胺-胺树枝状分子(PAMAM)的合成
参照专利申请:一种装载一氧化氮的阳离子聚合物及其制备方法和应用(专利号申请为201610356643.9)中的方法合成PAMAM。其中,所述的干燥处理的丙烯酸甲酯和乙二胺的制备方法按照以下操作步骤:将无水硫酸钠加入到丙烯酸甲酯中搅拌24小时,然后常压蒸馏,得到无水丙烯酸甲酯,所述无水硫酸钠的加入量以每500mL丙烯酸甲酯中加入2克计;将无水氢氧化钾加入到乙二胺中搅拌24小时,然后减压蒸馏,得到无水乙二胺,所述无水氢氧化钾的加入量以每500mL乙二胺中加入2克计;所述干燥的炔丙胺的制备方法按照以下操作步骤:将氢化钙加入到炔丙胺中搅拌24小时,然后减压蒸馏,得到干燥的炔丙胺;所述氢化钙的加入量以每10mL炔丙胺中加入0.2克计。
实施例3
(1)叠氮基团修饰的壳聚糖(CS-N3)的合成
将叠氮乙酸(N3-CH2-COOH)溶于N-N-二甲基甲酰胺(DMF)中,然后依次加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化2h,得到叠氮乙酸混合溶液中;活化结束后将壳聚糖(CS分子量为10000,脱乙酰度60%)溶解于纯水,然后缓慢加入到上述叠氮乙酸混合溶液中,室温下反应16h。产物在纯水中透析2天,冷冻干燥,得到产物叠氮化壳聚糖。其中,所述壳聚糖、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和叠氮乙酸的摩尔比为1:5:5:5;所述的N,N-二甲基甲酰胺以每10毫升中加入3g叠氮酸计;所述的纯水以每10ml中加入3g壳聚糖计。
(2)含炔基的聚酰胺-胺树枝状分子(PAMAM)的合成
参照专利申请:一种装载一氧化氮的阳离子聚合物及其制备方法和应用(专利号申请为201610356643.9)中的方法合成PAMAM。其中,所述的干燥处理的丙烯酸甲酯和乙二胺的制备方法按照以下操作步骤:将无水硫酸钠加入到丙烯酸甲酯中搅拌12小时,然后常压蒸馏,得到无水丙烯酸甲酯,所述无水硫酸钠的加入量以每500mL丙烯酸甲酯中加入2克计;将无水氢氧化钾加入到乙二胺中搅拌12小时,然后减压蒸馏,得到无水乙二胺,所述无水氢氧化钾的加入量以每500mL乙二胺中加入2克计;所述干燥的炔丙胺的制备方法按照以下操作步骤:将氢化钙加入到炔丙胺中搅拌12小时,然后减压蒸馏,得到干燥的炔丙胺;所述氢化钙的加入量以每10mL炔丙胺中加入0.15克计。
实施例4壳聚糖接枝树枝状聚酰胺-胺(CS-PAMAM)的合成
将实施例1步骤(2)中得到的树枝状聚酰胺-胺(PAMAM)溶解到纯水中,然后加入实施例1步骤(1)中得到的叠氮化壳聚糖,通入氮气半个小时。然后再加入五水硫酸铜和抗坏血酸钠,继续通氮气,于40℃反应24h。反应液用透析袋(截留分子量为2000)进行透析2天,冻干得到产物壳聚糖接枝树枝状聚酰胺-胺(CS-PAMAM)。其中,所述叠氮化壳聚糖、含炔基树枝状聚酰胺-胺、五水硫酸铜和抗坏血酸钠的摩尔比为1:1:1:2.5;所述纯水中溶解树枝状聚酰胺-胺的使用量以每100毫升加入5克树枝状聚酰胺-胺计。
实施例5壳聚糖接枝树枝状聚酰胺-胺(CS-PAMAM)的合成
将实施例2中步骤(2)中得到的树枝状聚酰胺-胺(PAMAM)溶解到纯水中,然后加入实施例2步骤(1)中得到的叠氮化壳聚糖,通入氮气半个小时。然后再加入五水硫酸铜和抗坏血酸钠,继续通氮气,于75℃反应48h。反应液用透析袋(截留分子量为20000)进行透析4天,冻干得到产物壳聚糖接枝树枝状聚酰胺-胺(CS-PAMAM);其中,所述叠氮化壳聚糖、含炔基树枝状聚酰胺-胺、硫酸铜和抗坏血酸钠的摩尔比为1:12:6:18;所述纯水中溶解树枝状聚酰胺-胺的使用量以每100毫升加入15克树枝状聚酰胺-胺计。
实施例6壳聚糖接枝树枝状聚酰胺-胺(CS-PAMAM)的合成
将实施例3中步骤(2)中得到的树枝状聚酰胺-胺(PAMAM)溶解到纯水中,然后加入实施例3步骤(1)中得到的叠氮化壳聚糖,通入氮气半个小时。然后再加入五水硫酸铜和抗坏血酸钠,继续通氮气,于65℃反应36h。反应液用透析袋(截留分子量为10000)进行透析3天,冻干得到产物壳聚糖接枝树枝状聚酰胺-胺(CS-PAMAM);其中,所述叠氮化壳聚糖、含炔基树枝状聚酰胺-胺、五水硫酸铜和抗坏血酸钠的摩尔比为1:6:3:9;所述纯水中溶解树枝状聚酰胺-胺的使用量以每100毫升加入10克树枝状聚酰胺-胺计。
实施例7壳聚糖接枝树枝状聚酰胺-胺(CS-PAMAM)修饰的金纳米粒子(Au@CS-PAMAM)的合成
称取一定质量的实施例4所得到的壳聚糖接枝树枝状聚酰胺-胺(CS-PAMAM)溶于超纯水中,超声溶解,氯金酸和树状大分子一定的摩尔比逐滴加入氯金酸(HAuCl4),室温搅拌30min。反应结束后,将反应溶液转移至截留分子量为100的透析袋中,透析1天,冷冻干燥,得到最终产物Au@CS-PAMAM。其中,所述CS-PAMAM与氯金酸的摩尔比为1:1;所述超纯水以每10ml中加入10mg CS-PAMAM计。
实施例8壳聚糖接枝树枝状聚酰胺-胺(CS-PAMAM)修饰的金纳米粒子(Au@CS-PAMAM)的合成
称取一定质量的实施例5所得到的壳聚糖接枝树枝状聚酰胺-胺(CS-PAMAM)溶于超纯水中,超声溶解,氯金酸和树状大分子一定的摩尔比逐滴加入氯金酸(HAuCl4),室温搅拌24h。反应结束后,将反应溶液转移至截留分子量为10000的透析袋中,透析3天,冷冻干燥,得到最终产物Au@CS-PAMAM。其中,所述CS-PAMAM与氯金酸的摩尔比为1:10;所述超纯水以每10ml中加入80mg CS-PAMAM计。
实施例9壳聚糖接枝树枝状聚酰胺-胺(CS-PAMAM)修饰的金纳米粒子(Au@CS-PAMAM)的合成
称取一定质量的实施例6所得到的壳聚糖接枝树枝状聚酰胺-胺(CS-PAMAM)溶于超纯水中,超声溶解,氯金酸和树状大分子一定的摩尔比逐滴加入氯金酸(HAuCl4),室温搅拌12h。反应结束后,将反应溶液转移至截留分子量5000的透析袋中,透析2天,冷冻干燥,得到最终产物Au@CS-PAMAM。其中,所述CS-PAMAM与氯金酸的摩尔比为1:5;所述超纯水以每10ml中加入40mg CS-PAMAM计。
实施例10
将取0.5mg实施例8中制备好的Au@CS-PAMAM溶解于1ml纯水中,超声10min,进行紫外分光光度计进行测试,实验结果如图1所示,球形金纳米粒子在紫外-可见光谱中SPR吸收带为500~550nm,Au@CS-PAMAM在536nm处有吸收峰,说明Au@CS-PAMAM中有金粒子存在,所以可以说明在没有添加其他还原剂的条件下,使氯金酸被还原成金纳米粒子。
实施例11红外光谱分析
将实施例8所得Au@CS-PAMAM、实施例6得到的CS-PAMAM通过溴化钾压片法进行红外光谱表征。结果如图2所示,对于CS-PAMAM(a,红色曲线),在3279cm-1为N-H的吸收峰;2937cm-1和2845cm-1为-CH2-的不对称伸缩振动和对称伸缩振动吸收峰;1649cm-1和1555cm-1是酰胺基的特征谱带,分别称为酰胺I和酰胺II谱带,前者为羧基伸缩振动引起的,后者是-CONH-中的N-H键弯曲变形振动和C-N键的伸缩振动引起的;1121cm-1和1036cm-1分别为伯胺和叔胺的伸缩振动峰,这两个吸收峰均较弱。红外光谱的分析结果表明,该样品中含有-NH2、-CH2-、-CONH-等特征基团,与CS-PAMAM结构特征相符。而Au@CS-PAMAM同样有3279cm- 1N-H的吸收峰,1649cm-1和1555cm-1的酰胺基的特征谱带;1121cm-1和1036cm-1伯胺和叔胺的伸缩振动峰,说明合成的金纳米粒子表面修饰有CS-PAMAM。
实施例12基因转染
取对数期生长的MCF-7细胞(人乳腺癌细胞,安徽青志生物科技有限公司),调整细胞浓度以每孔105个接种于24孔细胞培养板中,在37℃、5%(v/v)CO2条件下培养至细胞融合度为70%。接着换Opti-MEM I(1X)无血清细胞培养基(Gibco)孵育2小时,将实施例实施例8中制备好的Au@CS-PAMAM按照质量比50:1与EGFP(质粒,上海碧云天提供)复合,然后将复合物的无血清培养液铺加到培养皿中,确保每孔中DNA的含量为1μg。以PEI-25k/DNA复合物作为阳性对照组,裸DNA作为阴性对照组。然后将24孔板置于培养箱中,在37℃、5%(v/v)CO2的环境下培养4小时后,将培养液换掉,加入含血清的培养液继续培养24小时。在荧光显微镜下定性研究绿色荧光蛋白的表达情况。然后吸出培养液,加入胰酶消化细胞,并加入培养基终止胰酶作用,细胞样品经离心后重新悬浮于PBS中,采用流式细胞仪定量分析细胞转染个数,即样品的基因转染效率。实验结构如图3所示,发现Au@CS-PAMAM具备良好的转染效果,有望成为基因治疗的新型材料。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种树枝状大分子修饰的金纳米粒子的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)叠氮化壳聚糖的合成
将叠氮乙酸溶于N-N-二甲基甲酰胺中,然后依次加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺进行活化,再加入壳聚糖溶于水获得的壳聚糖溶液进行反应,透析,冷冻干燥,得到CS-N3;
(2)壳聚糖接枝树枝状聚酰胺-胺的合成
将含炔基树枝状聚酰胺-胺溶解到水中,然后加入步骤(1)中得到的CS-N3,再加入五水硫酸铜和抗坏血酸钠,于40~75℃进行反应,透析,冻干,得到CS-PAMAM;
(3)壳聚糖接枝树枝状聚酰胺-胺修饰的金纳米粒子的合成
将步骤(2)中得到的CS-PAMAM溶解到超纯水中,逐滴加入氯金酸,室温搅拌,透析,冷冻干燥,得到树枝状大分子修饰的金纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的树枝状大分子修饰的金纳米粒子的制备方法,其特征在于:
步骤(1)中所述的壳聚糖、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和叠氮乙酸的摩尔比为1:1~10:1~10:1~10;
步骤(2)中所述的CS-N3、含炔基树枝状聚酰胺-胺、五水硫酸铜和抗坏血酸钠的摩尔比为1:1~12:1~6:2.5~18;
步骤(3)中所述的CS-PAMAM与氯金酸的摩尔比为1:1~10。
3.根据权利要求1所述的树枝状大分子修饰的金纳米粒子的制备方法,其特征在于:
步骤(1)中所述的叠氮乙酸的用量按每毫升N-N-二甲基甲酰胺配比0.1~0.5g叠氮乙酸计算;
步骤(1)中所述的壳聚糖的用量按每毫升水配比0.05~0.5g壳聚糖计算;
步骤(2)中所述的含炔基树枝状聚酰胺-胺的用量按每毫升水配比0.05~0.15g含炔基树枝状聚酰胺-胺计算;
步骤(3)中所述的CS-PAMAM的用量为按每毫升超纯水配比1~8mgCS-PAMAM计算。
4.根据权利要求1所述的树枝状大分子修饰的金纳米粒子的制备方法,其特征在于,所述的壳聚糖接枝树枝状聚酰胺-胺分子式如下所示:
其中,m:n=5:1。
5.根据权利要求1所述的树枝状大分子修饰的金纳米粒子的制备方法,其特征在于:
步骤(1)中所述的壳聚糖的分子量为1000~20000,脱乙酰度为40~85%。
6.根据权利要求1所述的树枝状大分子修饰的金纳米粒子的制备方法,其特征在于:
步骤(1)中所述的透析为在纯水中透析2~3天;
步骤(2)中所述的透析为用截留分子量为2000~20000的透析袋进行透析;
步骤(3)中所述的透析为用截留分子量为100~10000的透析袋进行透析。
7.根据权利要求1所述的树枝状大分子修饰的金纳米粒子的制备方法,其特征在于:
步骤(1)所述的活化的时间为0.5~4h;
步骤(1)中所述的反应的时间为12~24h;
步骤(2)中所述的反应为在惰性气体保护下进行反应;
步骤(2)中所述的反应的时间为24~48h;
步骤(3)中所述的室温搅拌的时间为0.5~24h。
8.一种树枝状大分子修饰的金纳米粒子,其特征在于:通过权利要求1~7任一项所述的方法制备得到。
9.权利要求8所述的树枝状大分子修饰的金纳米粒子在制备药物载体或基因载体中的应用。
10.根据权利要求9所述的树枝状大分子修饰的金纳米粒子在制备药物载体和基因载体中的应用,其特征在于:所述的药物为抗肿瘤药物。
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