CN109970881A - 3d打印可控释一氧化氮纳米支架材料及制备方法与应用 - Google Patents

3d打印可控释一氧化氮纳米支架材料及制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医学工程材料领域，特别涉及一种NO存储载体，一种可控释NO纳米支架材料及其制备方法与应用。所述材料具有三维网状结构，由BSA‑Au NSs@CS‑PLLD/NONOate@PCL/PLA材料作为支架；其中按质量计，PCL：PLA：CS‑PLLD/NONOate＝1：0.5‑1.5：0.1‑1；所述BSA‑Au NSs中Au和CS‑PLLD/NONOate的质量比为2×10‑5‑6×10‑5。该材料孔洞之间高度相互连通，孔径规整均匀，有利于支架内部材料的均匀分布，材料性能明显，且能够快速吸收伤口渗出液，保持伤口干燥，极大地改善了感染伤口的愈合环境。

Description

3D打印可控释一氧化氮纳米支架材料及制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物医学工程材料领域，特别涉及一种基于3代树枝状聚赖氨酸修饰的壳聚糖的一氧化氮(NO)载体(CS-PLLD)，以及其负载NO后(CS-PLLD/NONOate)进一步与以聚乳酸/聚己内酯(PLA/PCL)、牛血清蛋白修饰的金纳米星(BSA-Au NSs)结合并利用3D打印技术制得的纳米支架材料及其制备方法，以及其作为生物医用材料的应用。
背景技术
细菌感染引起的疾病严重危及人类公众健康。在临床上，常规的对抗细菌的方式是使用抗生素，然而抗生素的滥用易促使细菌耐药性的产生及超级细菌的出现，导致抗生素治疗效果并不理想。因此，新型抗菌材料的研发意义重大。近期研究发现，NO气体对多种细菌有理想的抑制效果，特别是在对抗细菌耐药性方面显示出良好的应用前景。比如：Thuy-Khanh Nguyen等在2016年开发一种能够储存NO和现阶段临床大量使用的庆大霉素，具有双重功效的新型聚合物纳米粒子(Chem.Sci.,2016,7,1016)，该纳米粒子能够释放NO从而导致生物膜内细菌分散变成对抗生素敏感的浮游状态的细菌，从而导致耐药细菌大量的死亡；
目前临床上用于治疗手术、烧伤、创伤及慢性疾病引起的皮肤细菌感染问题时，不仅要求抗菌材料具有优良的抗菌性能，同时需要其具有良好的伤口修复愈合功能。例如Hasan Nurhasni等在2015年开发一种由聚(乳酸-羟基乙酸)(PLGA)和聚乙烯亚胺(PEI)作为NO供体制备出的可延长释放NO的纳米粒子，研究结果表明负载了NO的缓释纳米粒子具有优良的抗菌效果和促伤口愈合的性质。例如Xin Zhou等在2017年以壳聚糖为NO供体材料(CS-NO)混合涂布到聚己内酯(PCL)基底材料表面，制备出一种由β-半乳糖酶催化释放NO的新型的伤口敷料。结果显示，PCL/CS-NO伤口敷料相比较于未负载NO而言能够显著增强伤口再上皮化和肉芽的形成，有效的改善了由缺血引起的慢性伤口愈合状况。然而，目前NO抗菌材料应用于皮肤伤口的抗菌和修复依然比较少。一方面，作为气体分子，如何实现NO分子的高效负载和可控释放，是实现其高效抗菌的关键。另一方面粉末状的纳米抗菌材料容易从皮肤伤口部位脱落，无法实现长期稳定给药，达不到应有的治疗效果，同时直接使用也会导致皮肤伤口部位炎症加剧，不利于伤口愈合。
3D打印技术的发展已成为一种新兴技术，其在医学上的应用效果也日益明显，3D打印技术在制备生物医用材料特别是组织工程支架材料方面取得了诸多成就。然而，目前还缺乏利用3D打印制得的可高效可控释放NO的支架材料。
发明内容
为解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种NO存储载体。该载体材料结构性能稳定，NO负载及储存量大，释放时间长，生物相容性好，抑菌效果明显。
本发明的另一目的在于提供一种可控释NO纳米支架材料及其制备方法。该支架材料具有大小适中、相互联通的三维空洞结构，孔径规整均匀，具有抗创伤感染组织黏连的效果，对皮肤细胞和新生组织在支架上的生长具有明显的促进作用，在抗菌方面和生物医学领域中显示出重要的应用前景。制备方法可参见图1。
本发明的再一目的在于提供所述可控释NO纳米支架材料在抗菌/促伤口愈合方面的应用，具体应用原理可参见图2。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种NO存储载体，其具有如下所示的分子式：
其中m：n＝5：1。
优选的，所述NO存储载体中壳聚糖基团的分子量为1000-20000，脱乙酰度为40-85％。
一种NO存储载体的制备方法，包括如下步骤：
将含有叠氮基团修饰的壳聚糖(CS-N3)和含炔基的树枝状聚赖氨酸(PLLD)的水溶液通入N2保护20-30分钟后，加入硫酸铜和抗坏血酸钠，升温至40-50℃反应24-48小时；反应结束后，将产物置于透析袋中透析2-3天，冷冻干燥，得到所述NO存储载体，即3代树枝状赖氨酸修饰的壳聚糖(CS-PLLD)。
其中，所述叠氮基团修饰的壳聚糖(CS-N3)可参照专利“磁控释放一氧化氮的复合膜材料及其制备方法和应用”(申请号为CN 201711008529.8)合成；所述含炔基的树枝状聚赖氨酸(PLLD)可参照专利“含树枝状聚赖氨酸基元的星型阳离子聚合物及其制备方法”(专利号为ZL 201210005079.8)合成。
优选的，所述CS-N3、PLLD、硫酸铜和抗坏血酸钠的摩尔比为1：1-12：1-6：2.5-18；所述水溶液中PLLD浓度为0.05-0.15g/L；所述透析袋的截留分子量为2000-20000。
进一步的，所述NO存储载体可通过任意常规方式负载NO得到NO供体材料CS-PLLD/NONOate，具体的也可通过如下方法负载NO：
将所述NO存储载体溶于无水甲醇和四氢呋喃混合溶液中，溶解5min-30min后加入干燥的甲醇钠继续溶解，稳定30min-60min后放置于高压反应釜密封并检测气密性；反应釜内通高纯氮气(20psi-50psi)10min-20min，排除反应釜内的空气，然后通入NO气体(80psi-120psi)，室温下反应3-7天。反应结束后，用20psi-50psi的高纯氮气将NO排出，并继续通气30min-60min后打开反应釜，取出反应产物。用无水乙醚沉降洗涤2-3次，真空干燥，得到NO供体材料CS-PLLD/NONOate。
其中，所述CS-PLLD和甲醇钠质量比为1：1-2；所述无水甲醇与四氢呋喃体积比为1：0.5-2；所述无水甲醇和CS-PLLD的用量比为10mL：1-2g。
CS-PLLD/NONOate的NO负载量为1.0-5.0μmoL/mg，负载量大小与负载过程中NO反应时间、催化剂用量、反应过程中NO压强大小等因素有关。
一种可控释NO纳米支架材料，其具有三维网状结构，由BSA-Au NSs@CS-PLLD/NONOate@PCL/PLA材料作为支架；其中按质量计，PCL：PLA：CS-PLLD/NONOate＝1：0.5-1.5：0.1-1；所述BSA-Au NSs中Au和CS-PLLD/NONOate的质量比为2×10-5-6×10-5。
优选的，所述PCL相对分子质量为3000-80000；所述PLA相对分子质量为10000-80000，所述Au NSs尺寸为30nm-60nm。
优选的，所述可控释NO纳米支架材料的支架孔径大小为200-400μm，支架层间距为150-200μm。
所述BSA-Au NSs@CS-PLLD/NONOate@PCL/PLA材料由聚己内酯(PLA)和聚乙烯醇(PCL)包覆牛血清蛋白修饰的金纳米星(BSA-Au NSs)材料和所述CS-PLLD/NONOate材料而成，其中所述BSA-Au NSs材料可由现有方法制得，具体的也可通过如下方式制得：
向HAuCl4溶液中加入HCl溶液，然后加入种子液，超声5-10min后快速加入AgNO3溶液，再加入抗坏血酸钠，超声30s-2min后加入牛血清蛋白(BSA)形成反应体系，持续搅拌反应30min-120min，最后4000rpm-8000rpm下离心并用纯水洗涤2-3次，分散于5-10mL纯水中得到BSA-Au NSs溶液；所述HAuCl4、HCl、AgNO3、抗坏血酸钠和牛血清蛋白的摩尔比为1：5-15：0.05-0.15：1-3；所述反应体系中HAuCl4和水的用量比为1-2g：30L；所述种子液与所述反应体系的体积比为1：200-500；
所述种子液通过将四氯金酸(HAuCl4)溶液煮沸冷凝回流，然后加入柠檬酸钠溶液反应4-60min后冷却得到；其中，所述HAuCl4和柠檬酸钠质量比为1：2-5；所述种子液中柠檬酸钠和水的用量比为1-3g：1L。
一种可控释NO纳米支架材料的制备方法，包括如下步骤：
(1)将所述NO存储载体负载NO得到(CS-PLLD/NONOate)；
(2)将含有所述CS-PLLD/NONOate和BSA-Au NSs的聚乙烯醇(PVA)水溶液以0.5-5mL/min的速度加入PCL/PLA三氯甲烷溶液中，超声反应后得到BSA-Au NSs@CS-PLLD/NONOate@PCL/PLA纳米乳液；
(3)以所述纳米乳液为原料进行3D打印即得到所述可控释NO纳米支架材料；
其中所述PCL、PLA、CS-PLLD/NONOate和PVA质量比为1：0.5-1.5：0.1-1：0.01-0.1，所述三氯甲烷和PCL的用量比为1L：25-100g；所述PVA水溶液中水和PVA的用量比为10L：0.1-1g；所述BSA-Au NSs溶液中Au的浓度为0.02-0.06mg/mL。
优选的，所述PCL相对分子质量为3000-80000；所述PLA相对分子质量为10000-80000；所述PVA相对分子质量为15000-100000，醇解度86％-98％，所述金纳米星尺寸为30nm-60nm。
优选的，所述3D打印使用内径为0.1-1mm的打印喷头，打印压强为0.2-1k Pa，打印温度为5-30℃。
优选的，所述PVA溶液温度为0-5℃，所述超声反应具体为在50-250W功率下超声反应30s-10min。
优选的，步骤(2)制得的纳米乳液在500r/min-1500r/min下离心1-5min除去气泡后再进行步骤(3)。
所述可控释NO纳米支架材料抗菌和促伤口愈合方面的应用。
本发明原理是：由于NO可破坏细菌的细胞膜以及基因信息、并阻止细菌获得能量，能够有效地杀死细菌且不易产生细菌耐药性，同时研究表明NO能够促进细胞再生作用，对创伤病灶处具有愈合修复作用，使其在抗菌修复领域的应用受到越来越多的关注，基于NO的抗菌修复材料快速发展起来。因此，设计合适的载体材料实现对NO的负载，并且能够通过近红外光照射控制释放出达到杀菌水平的NO浓度并且长时间释放NO进一步修复创面，成为NO抗菌修复领域的研究热点。本发明就是利用PCL/PLA可降解材料将生物相容性良好的NO供体材料(CS-PLLD/NONOate)和光热转换良好的金纳米星(Au NSs)包裹在一起，形成纳米乳液，然后使用3D生物打印技术得到一种可控释NO的新型纳米支架材料，用于皮肤伤口的高效抗菌及修复愈合。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)壳聚糖不仅水溶性好、生物相容性好、可生物降解，而且其代谢产物毒性小，对细菌具有一定的杀伤效果；
(2)采用高代数聚赖氨酸作为NO供体，极大的提高了NO负载量，对于细菌生物膜的影响具有明显的抑制效果，且对带负电的细菌能够很好的吸附和具有一定的杀伤效果；
(3)采用点击化学方法将树枝状聚赖氨酸与壳聚糖偶联，反应效率高、结构易于精确调控，分子量分布单一，有效地改善了树枝状材料的毒副作用；
(4)CS-PLLD/NONOate聚合物极大的改善了Au NSs稳定性和分散性，保证后期在打印过程中Au NSs分布均匀，从而使光热转换能力稳定，受热均匀。
(5)使用可降解PCL/PLA作为包裹CS-PLLD/NONOate和Au NSs和3D打印的材料，不仅能够有效地将CS-PLLD/NONOate和Au NSs包裹在材料内部，极大地提升了NO控制效果，而且PCL/PLA材料熔点较低，能够快速响应Au NSs温度变化，实现精准控制。
(6)使用3D生物打印的工艺方式制备创伤敷料具有三维孔洞结构，孔洞之间高度相互连通，孔径规整均匀，有利于CSP-PLLD/NONOate和Au NSs在支架内部均匀分布，材料性能明显。
(7)3D打印制备的抗菌敷料内部形貌控制与力学性能上都有独特的优势，三维结构能够快速吸收伤口渗出液，保持伤口干燥，极大地改善了感染伤口的愈合环境。PLC/PLA疏水材料能够有效地防止材料与伤口黏连，防止二次伤害，加速伤口愈合效果。
附图说明
图1为本发明可控释NO纳米支架材料的制备过程示意图；
图2为本发明可控释NO纳米支架材料在抗菌和促伤口愈合方面应用的示意图；
图3为实施例1步骤一所得CS-N3、PLLD和CS-PLLD的红外光谱图；
图4为实施例2步骤三制得的BSA-Au NSs的透射电镜图和局部放大图；
图5为实施例1制得的BSA-Au NSs@CS-PLLD/NONOate@PCL/PLA纳米乳液光学图像；
图6为实施例1试打印得到的可控释NO纳米支架材料形貌图；
图7为实施例2制得可控释NO纳米支架材料在近红外808nm光照射条件下的NO释放情况；
图8为实施例2制得可控释NO纳米支架材料在近红外808nm光照射与不经近红外808nm光照射后体外抑菌效果；
图9为实施例2制得可控释NO纳米支架材料对老鼠创面修复效果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
一、NO存储载体的制备
将含有叠氮基团修饰的壳聚糖(CS-N3)和含炔基的树枝状聚赖氨酸(PLLD)的水溶液通入N2保护20分钟后，加入硫酸铜和抗坏血酸钠，升温至40℃反应24小时；反应结束后，将产物置于透析袋中透析2天，冷冻干燥，得到所述NO存储载体，即3代树枝状赖氨酸修饰的壳聚糖(CS-PLLD)。
其中，所述叠氮基团修饰的壳聚糖(CS-N3)参照专利“磁控释放一氧化氮的复合膜材料及其制备方法和应用”(申请号为CN 201711008529.8)中的实施例1合成，所用壳聚糖分子量为1000，脱乙酰度40％；所述含炔基的树枝状聚赖氨酸(PLLD)参照专利“含树枝状聚赖氨酸基元的星型阳离子聚合物及其制备方法”(专利号为ZL 201210005079.8)中的实施例5合成。
其中，所述CS-N3、PLLD、硫酸铜和抗坏血酸钠的摩尔比为1：1：1：2.5；所述水溶液中PLLD浓度为0.05g/L；所述透析袋的截留分子量为2000。
对所得CS-N3、PLLD和CS-PLLD进行红外表征，红外光谱图如图3所示，CS-PLLD中出现了CS-N3和PLLD的特征吸收峰，进一步证明聚合物CS-PLLD成功合成。且原本出现在CS-N3样品图谱中2100cm-1处叠氮基团的特征吸收峰在CS-PLLD的图谱中完全消失，说明CS-N3的叠氮基团与PLLD反应，得到了聚合物CS-PLLD。
二、NO供体材料CS-PLLD/NONOate的制备
将步骤一得到的干燥的3代树枝状赖氨酸修饰的壳聚糖(CS-PLLD)溶于无水甲醇和四氢呋喃混合溶液中，溶解30min加入干燥的甲醇钠继续溶解，稳定60min后放置于高压反应釜密封并检测气密性。反应釜内通入高纯氮气(50psi)维持20min以排除反应釜内的空气，然后通入NO气体(120psi)反应7天。反应结束后，通入50psi的高纯氮气排出NO并继续维持60min后打开反应釜，取出反应产物。用无水乙醚沉降洗涤3次，真空干燥，得NO供体材料CS-PLLD/NONOate并在-20℃下低温保存。
其中，所述CS-PLLD和甲醇钠质量比为1：2；所述无水甲醇与四氢呋喃体积比为1：2；所述无水甲醇和CS-PLLD的用量比为10mL：2g。
三、牛血清蛋白修饰金纳米星的制备(BSA-Au NSs)
25℃下向HAuCl4溶液中加入HCl溶液，然后加入种子液，超声5min后快速加入AgNO3溶液，再加入抗坏血酸钠，超声30s后加入牛血清蛋白(BSA)形成反应体系，持续搅拌反应30min，最后4000rpm下离心并用纯水洗涤2次，分散于5mL纯水中得到BSA-Au NSs溶液；所述HAuCl4、HCl、AgNO3、抗坏血酸钠和牛血清蛋白的摩尔比为1：5：0.05：1；所述反应体系中HAuCl4和水的用量比为1g：30L；所述种子液与所述反应体系的体积比为1：500；
所述种子液通过将四氯金酸(HAuCl4)溶液煮沸冷凝回流，然后加入柠檬酸钠溶液反应30min后冷却得到；其中，所述HAuCl4和柠檬酸钠质量比为1：2；所述种子液中柠檬酸钠和水的用量比为1g：1L。所述BSA-Au NSs浓度为0.3mg/mL。
四、BSA-Au NSs@CS-PLLD/NONOate@PCL/PLA纳米乳液的制备
25℃条件下将聚己内酯(PCL)和聚乳酸(PLA)溶于三氯甲烷中，恒温磁力搅拌5h，保证PCL和PLA充分溶解得到PCL/PLA混合溶液；将步骤二得到的CS-PLLD/NONOate和步骤三得到的BSA-Au NSs溶液同时加入5℃聚乙烯醇(PVA)水溶液中，以5mL/min的速度加入到上述PCL/PLA混合溶液中，25℃条件下，使用超声探针在250W下超声反应30s后，最终得到分散性良好且稳定的BSA-Au NSs@CS-PLLD/NONOate@PCL/PLA纳米乳液；
其中PCL相对分子质量为80000；PLA相对分子质量为80000；PVA相对分子质量为100000，醇解度98％；所述PCL、PLA、CS-PLLD/NONOate和PVA质量比为1：1.5：1：0.1；所述三氯甲烷和PCL的用量比为1L：100g；所述PVA水溶液中水和PVA的用量比为10L：1g；所述BSA-Au NSs中Au和CS-PLLD/NONOate的质量比为6×10-5。
将所得纳米乳液取20μL置于载玻片上盖上盖玻片，自然晾干之后置于光学显微镜上进行观察；从图5中可以看出大量的分散相粒子且粒子分布密集且均匀，由此可以看到所制备得到的乳液稳定，能够满足下一步3D生物打印应用的需要。
五、可控释NO纳米支架材料的制备
将步骤四所得纳米乳液转移到5mL的打印挤出筒中，放入低速离心机中500r/min下离心1min除去纳米乳液中的气泡。将3D模型(由3ds Max设计)导入电脑，利用软件Bioplotter RP进行打印模型切片处理，并且使用打印机的控制软件Visual Machines设计工程支架内部结构；将一个直径为9cm的培养皿放置在温控平台上，使用内径为0.5mm的打印喷头，设置打印温度为10℃。首先进行线条试打印，根据打印效果调节打印压力和喷头移动速度，待打印结束后放入干燥箱中充分干燥12h，得到所述可控释NO纳米支架材料。所述支架孔径大小为200μm,支架层间距为150μm，打印压强0.2kPa。
将所述试打印所得材料进行拍照观察，如图6所示，材料结构规整，3维结构明显。
实施例2
一、NO存储载体的制备
将含有叠氮基团修饰的壳聚糖(CS-N3)和含炔基的树枝状聚赖氨酸(PLLD)的水溶液通入N2保护30分钟后，加入硫酸铜和抗坏血酸钠，升温至50℃反应48小时；反应结束后，将产物置于透析袋中透析3天，冷冻干燥，得到所述NO存储载体，即3代树枝状赖氨酸修饰的壳聚糖(CS-PLLD)。
其中，所述叠氮基团修饰的壳聚糖(CS-N3)参照专利“磁控释放一氧化氮的复合膜材料及其制备方法和应用”(申请号为CN 201711008529.8)中的实施例2合成，所用壳聚糖分子量为20000，脱乙酰度85％；所述含炔基的树枝状聚赖氨酸(PLLD)参照专利“含树枝状聚赖氨酸基元的星型阳离子聚合物及其制备方法”(专利号为ZL 201210005079.8)中的实施例6合成。
其中，所述CS-N3、PLLD、硫酸铜和抗坏血酸钠的摩尔比为1：12：6：18；所述水溶液中PLLD浓度为0.15g/L；所述透析袋的截留分子量为20000。二、NO供体材料CS-PLLD/NONOate的制备
将步骤一得到的干燥的3代树枝状赖氨酸修饰的壳聚糖(CS-PLLD)溶于无水甲醇和四氢呋喃混合溶液中，溶解5min加入干燥的甲醇钠继续溶解，稳定30min后放置于高压反应釜密封并检测气密性。反应釜内通入高纯氮气(20psi)维持10min以排除反应釜内的空气，然后通入NO气体(80psi)反应3天。反应结束后，通入20psi的高纯氮气排出NO并继续维持30min后打开反应釜，取出反应产物。用无水乙醚沉降洗涤2次，真空干燥，得NO供体材料CS-PLLD/NONOate并在-4℃下低温保存。
其中，所述CS-PLLD和甲醇钠质量比为1：1；所述无水甲醇与四氢呋喃体积比为1：1；所述无水甲醇和CS-PLLD的用量比为10mL：1g。
三、牛血清蛋白修饰金纳米星的制备(BSA-Au NSs)
30℃下向HAuCl4溶液中加入HCl溶液，然后加入种子液，超声10min后快速加入AgNO3溶液，再加入抗坏血酸钠，超声2min后加入牛血清蛋白(BSA)形成反应体系，持续搅拌反应120min，最后8000rpm下离心并用纯水洗涤3次，分散于10mL纯水中得到BSA-Au NSs溶液；所述HAuCl4、HCl、AgNO3、抗坏血酸钠和牛血清蛋白的摩尔比为1：15：0.15：3；所述反应体系中HAuCl4和水的用量比为2g：30L；所述种子液与所述反应体系的体积比为1：200；
所述种子液通过将四氯金酸(HAuCl4)溶液煮沸冷凝回流，然后加入柠檬酸钠溶液反应60min后冷却得到；其中，所述HAuCl4和柠檬酸钠质量比为1：5；所述种子液中柠檬酸钠和水的用量比为3g：1L。所述BSA-Au NSs浓度为0.1mg/mL。
将制得的BSA-Au NSs超声溶解30min后，取200μl缓慢滴加到透射电镜专用铜网上，自然干燥后进行透射电镜观察；透射电镜图如图4所示，通过TEM测定金纳米星尺寸为50nm左右，可见BSA-Au NSs已成功制备。
四、BSA-Au NSs@CS-PLLD/NONOate@PCL/PLA纳米乳液的制备
5℃条件下将聚己内酯(PCL)和聚乳酸(PLA)溶于三氯甲烷中，恒温磁力搅拌2h，保证PCL和PLA充分溶解得到PCL/PLA混合溶液；将步骤二得到的CS-PLLD/NONOate和步骤三得到的BSA-Au NSs溶液同时加入0℃聚乙烯醇(PVA)水溶液中，以0.5mL/min的速度加入到上述PCL/PLA混合溶液中，0℃条件下，使用超声探针在50W下超声反应10min后，最终得到分散性良好且稳定的BSA-Au NSs@CS-PLLD/NONOate@PCL/PLA纳米乳液；
其中PCL相对分子质量为3000；PLA相对分子质量为10000；PVA相对分子质量为15000，醇解度86％；所述PCL、PLA、CS-PLLD/NONOate和PVA质量比为1：0.5：0.1：0.01；所述三氯甲烷和PCL的用量比为1L：25g；所述PVA水溶液中水和PVA的用量比为10L：0.1g；所述BSA-Au NSs中Au和CS-PLLD/NONOate的质量比为2×10-5。
五、可控释NO纳米支架材料的制备
将步骤四所得纳米乳液转移到30mL的打印挤出筒中，放入低速离心机中1500r/min下离心5min除去纳米乳液中的气泡。将3D模型(由3ds Max设计)导入电脑，利用软件Bioplotter RP进行打印模型切片处理，并且使用打印机的控制软件Visual Machines设计工程支架内部结构；将一个直径为9cm的培养皿放置在温控平台上，使用内径为1mm的打印喷头，设置打印温度为20℃。首先进行线条试打印，根据打印效果调节打印压力和喷头移动速度，待打印结束后放入干燥箱中充分干燥48h，得到所述可控释NO纳米支架材料。所述通过软件设计组织支架的内部结构模型，支架孔径大小为400μm,支架层间距为200μm，打印压强1K Pa。
光热转换释放NO能力测试
为了探究制得的可控释NO纳米支架材料的光热转换释放NO的能力，其被置于直径为3cm的培养皿中，然后加入1mL Gress试剂(NO释放能力参照：Advanced HealthcareMaterials 2016,5：2019-2024；International Journal of Nanomedicine 2015，103065-3080等)，静止浸泡5min，然后用去离子洗涤2次后再次置于Gress试剂中。重复多次分别得到实验组和对照组，对实验组进行808nm近红外照射30s，对照组不进行照射，观察实验现象。实验结果如图5所示，首先将可控释NO纳米支架材料置于Gress试剂5min后，发现溶液变为玫瑰红色，有亚硝酸盐还原，反应为阳性，证明有部分NO从工程支架中释放出来。对实验组进行808nm近红外刺激后发现有大量的NO释放，说明CS-PLLD/NONOate供体被PCL/PLA材料大量包裹在内部，且近红外光对所述可控释NO纳米支架材料内NO的控释效果明显，继续光照一定时间后待溶液颜色没有变化后测定NO的含量为4.7μmol/mg。
杀菌性能测试
将所得可控释NO纳米支架材料置于1mL生理盐水，并向其中加入50μL(吸光度OD600＝0.1)金黄色葡萄球菌(ATCC29213)和大肠杆菌(ATCC25922)作为实验组。对实验组进行近红外照射30min后于试管中继续培养培育4h，取各组试管中100μL菌液稀释涂布于琼脂平板上继续培养12h。另制备不加入可控释NO纳米支架材料的空白组及不经近红外照射的对照组，其余条件与实验组相同。如图6所示，相比于对照组和空白组，实验组经近红外光照射后的细菌数量明显减少，表现出明显的杀伤效果，这一结果充分的说明了PCL/PLA能够很好地将NO供体材料包裹起来，且经近红外照射后有大量的NO释放出来，对细菌起到明显的杀伤效果。
促伤口愈合性能测试
构建大鼠皮肤伤口感染模型，同样将经近红外照射30min的所述可控释NO纳米支架材料每隔2天用10mm×10mm对大鼠伤口进行处理，共14天，连续治疗10天后，利用数码相机对大鼠皮肤伤口部位进行拍照，测定伤口大小，分析纳米支架材料对伤口的愈合性能。另用未经过近红外光照射的所述可控释NO纳米支架材料在相同条件下处理的大鼠伤口愈合速率作为对照。实验结果如图7所示，在未治疗之前可以清楚看到大鼠伤口感染处出现黄色脓水和组织水肿，在对各个伤口持续给药10天后，观察伤口恢复的整个过程，与未经过近红外光照射的所述可控释NO纳米支架材料治疗的伤口相比较发现，经过近红外光照射的所述可控释NO纳米支架材料的伤口已经有大量的肉芽组织出现，伤口愈合率达到90％左右，证明该所述可控释NO纳米支架材料经近红外照射后具有高效的体内外抗菌效果和显著的伤口愈合效果，有望成为一种新型的智能抗菌敷料。
实施例3
一、NO存储载体的制备
将含有叠氮基团修饰的壳聚糖(CS-N3)和含炔基的树枝状聚赖氨酸(PLLD)的水溶液通入N2保护25分钟后，加入硫酸铜和抗坏血酸钠，升温至45℃反应36小时；反应结束后，将产物置于透析袋中透析2天，冷冻干燥，得到所述NO存储载体，即3代树枝状赖氨酸修饰的壳聚糖(CS-PLLD)。
其中，所述叠氮基团修饰的壳聚糖(CS-N3)参照专利“磁控释放一氧化氮的复合膜材料及其制备方法和应用”(申请号为CN 201711008529.8)中的实施例3合成，所用壳聚糖分子量为10000，脱乙酰度50％；所述含炔基的树枝状聚赖氨酸(PLLD)参照专利“含树枝状聚赖氨酸基元的星型阳离子聚合物及其制备方法”(专利号为ZL 201210005079.8)中的实施例5合成。
其中，所述CS-N3、PLLD、硫酸铜和抗坏血酸钠的摩尔比为1：6：3：9；所述水溶液中PLLD浓度为0.1g/L；所述透析袋的截留分子量为10000。
二、NO供体材料CS-PLLD/NONOate的制备
将步骤一得到的干燥的3代树枝状赖氨酸修饰的壳聚糖(CS-PLLD)溶于无水甲醇和四氢呋喃混合溶液中，溶解15min加入干燥的甲醇钠继续溶解，稳定40min后放置于高压反应釜密封并检测气密性。反应釜内通入高纯氮气(25psi)维持15min以排除反应釜内的空气，然后通入NO气体(100psi)反应5天。反应结束后，通入25psi的高纯氮气排出NO并继续维持40min后打开反应釜，取出反应产物。用无水乙醚沉降洗涤2次，真空干燥，得NO供体材料CS-PLLD/NONOate并在-10℃下低温保存。
其中，所述CS-PLLD和甲醇钠质量比为1：1.5；所述无水甲醇与四氢呋喃体积比为1：1.5；所述无水甲醇和CS-PLLD的用量比为10mL：1.5g。
三、牛血清蛋白修饰金纳米星的制备(BSA-Au NSs)
30℃下向HAuCl4溶液中加入HCl溶液，然后加入种子液，超声8min后快速加入AgNO3溶液，再加入抗坏血酸钠，超声1min后加入牛血清蛋白(BSA)形成反应体系，持续搅拌反应60min，最后6000rpm下离心并用纯水洗涤2次，分散于8mL纯水中得到BSA-Au NSs溶液；所述HAuCl4、HCl、AgNO3、抗坏血酸钠和牛血清蛋白的摩尔比为1：10：0.1：2；所述反应体系中HAuCl4和水的用量比为1.5g：30L；所述种子液与所述反应体系的体积比为3：1000；
所述种子液通过将四氯金酸(HAuCl4)溶液煮沸冷凝回流，然后加入柠檬酸钠溶液反应4min后冷却得到；其中，所述HAuCl4和柠檬酸钠质量比为1：3；所述种子液中柠檬酸钠和水的用量比为2g：1L。
四、BSA-Au NSs@CS-PLLD/NONOate@PCL/PLA纳米乳液的制备
35℃条件下将聚己内酯(PCL)和聚乳酸(PLA)溶于三氯甲烷中，恒温磁力搅拌3h，保证PCL和PLA充分溶解得到PCL/PLA混合溶液；将步骤二得到的CS-PLLD/NONOate和步骤三得到的BSA-Au NSs溶液同时加入3℃聚乙烯醇(PVA)水溶液中，以2.5mL/min的速度加入到上述PCL/PLA混合溶液中，15℃条件下，使用超声探针在50W下超声反应10min后，最终得到分散性良好且稳定的BSA-Au NSs@CS-PLLD/NONOate@PCL/PLA纳米乳液；
其中PCL相对分子质量为40000；PLA相对分子质量为40000；PVA相对分子质量为80000，醇解度86％；所述PCL、PLA、CS-PLLD/NONOate和PVA质量比为1：1：0.5：0.05；所述三氯甲烷和PCL的用量比为1L：50g；所述PVA水溶液中水和PVA的用量比为10L：0.5g；所述BSA-Au NSs中Au和CS-PLLD/NONOate的质量比为4×10-5。
五、可控释NO纳米支架材料的制备
将步骤四所得纳米乳液转移到15mL的打印挤出筒中，放入低速离心机中1000r/min下离心3min除去纳米乳液中的气泡。将3D模型(由3ds Max设计)导入电脑，利用软件Bioplotter RP进行打印模型切片处理，并且使用打印机的控制软件Visual Machines设计工程支架内部结构；将一个直径为9cm的培养皿放置在温控平台上，使用内径为0.5mm的打印喷头，设置打印温度为15℃。首先进行线条试打印，根据打印效果调节打印压力和喷头移动速度，待打印结束后放入干燥箱中充分干燥36h，得到所述可控释NO纳米支架材料。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种NO存储载体，其特征在于，具有如下所示的分子式：
其中m：n＝5：1。
2.根据权利要求1所述的NO存储载体，其特征在于，所述NO存储载体中壳聚糖基团的分子量为1000-20000，脱乙酰度为40-85％，且其NO负载量为1.0-5.0μmoL/mg。
3.一种NO存储载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将含有叠氮基团修饰的壳聚糖(CS-N3)和含炔基的树枝状聚赖氨酸(PLLD)的水溶液通入N2保护20-30分钟后，加入硫酸铜和抗坏血酸钠，升温至40-50℃反应24-48小时；反应结束后，将产物置于透析袋中透析2-3天，冷冻干燥，得到所述NO存储载体，即3代树枝状赖氨酸修饰的壳聚糖(CS-PLLD)；
其中所述CS-N3、PLLD、硫酸铜和抗坏血酸钠的摩尔比为1：1-12：1-6：2.5-18。
4.根据权利要求3所述的一种NO存储载体的制备方法，其特征在于，所述水溶液中PLLD浓度为0.05-0.15g/L；所述透析袋的截留分子量为2000-20000。
5.一种可控释NO纳米支架材料，其特征在于，具有三维网状结构，由BSA-Au NSs@CS-PLLD/NONOate@PCL/PLA材料作为支架；其中按质量计，PCL：PLA：CS-PLLD/NONOate＝1：0.5-1.5：0.1-1。
6.根据权利要求5所述的一种可控释NO纳米支架材料，其特征在于，所述PCL相对分子质量为3000-80000；所述PLA相对分子质量为10000-80000；所述Au NSs尺寸为30nm-60nm；所述BSA-Au NSs中Au和CS-PLLD/NONOate的质量比为2×10-5-6×10-5。
7.根据权利要求5所述的一种可控释NO纳米支架材料，其特征在于，所述可控释NO纳米支架材料的支架孔径大小为200-400μm，支架层间距为150-200μm。
8.一种可控释NO纳米支架材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将所述NO存储载体负载NO得到(CS-PLLD/NONOate)；
(2)将含有所述CS-PLLD/NONOate和BSA-Au NSs的聚乙烯醇(PVA)水溶液以0.5-5mL/min的速度加入PCL/PLA三氯甲烷溶液中，超声反应后得到BSA-Au NSs@CS-PLLD/NONOate@PCL/PLA纳米乳液；
(3)以所述纳米乳液为原料进行3D打印即得到所述可控释NO纳米支架材料；
其中所述PCL、PLA、CS-PLLD/NONOate和PVA质量比为1：0.5-1.5：0.1-1：0.01-0.1；所述三氯甲烷和PCL的用量比为1L：25-100g；所述PVA水溶液中水和PVA的用量比为10L：0.1-1g；所述BSA-Au NSs溶液中Au的浓度为0.02-0.06mg/mL。
9.根据权利要求8所述的一种可控释NO纳米支架材料的制备方法，其特征在于，所述PCL相对分子质量为3000-80000；所述PLA相对分子质量为10000-80000；所述PVA相对分子质量为15000-100000，醇解度86％-98％；所述PVA溶液温度为0-5℃，所述超声反应具体为在50-250W功率下超声反应30s-10min；
所述3D打印使用内径为0.1-1mm的打印喷头，打印压强为0.2-1kPa，打印温度为5-30℃。
10.权利要求5-7任一项所述可控释NO纳米支架材料在抗菌和促伤口愈合方面的应用。
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