CN109575325A - 香草醛交联壳寡糖单胍盐酸盐在制备抗氧化药物中的应用 - Google Patents

香草醛交联壳寡糖单胍盐酸盐在制备抗氧化药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开香草醛交联壳寡糖单胍盐酸盐在制备抗氧化药物中的应用，以壳寡糖产品为原料，以过氧化氢和浓硫酸的双重作用下对氧化得到的三氧化硫脲为胍基化试剂，以香草醇为交联剂，在微波条件下进行液相合成反应，得到由香草醛交联的带有单胍基团的壳寡糖盐酸盐衍生物，再用乙醇多次洗涤至中性，最后将固体放入真空干燥器内于40～80℃下干燥至物料含水量小于0.5％～10％。本发明方法具有简便易行，副反应少等优点，同时将胍基和交联结构引入生物兼容性好的壳寡糖中，使得壳寡糖的生物活性、稳定性和溶解性均得到了显著提高，表现出在制备抗氧化药物中的应用。

Description

香草醛交联壳寡糖单胍盐酸盐在制备抗氧化药物中的应用
技术领域
本发明属于生物化学及医药领域，更加具体地说，具体涉及一种新型壳寡糖衍生物—香草醛交联壳寡糖单胍盐酸盐及其微波合成方法和在制备抗氧化药物中的应用。
背景技术
壳寡糖，化学名称为β-1,4-寡糖-葡萄糖胺，是壳聚糖经物理、化学或酶降解得到的聚合度为2～20的低分子量产物，是自然界中唯一带有正电荷的碱性氨基寡糖。壳寡糖的分子量小，易吸潮，溶解性好，具有防腐抑菌、调节人体pH值等作用，可生物降解，无毒，不会引起过敏的独特优势，其逐渐成为具有潜在应用价值的生物活性材料。然而，壳寡糖分子上的氨基(-NH2)或羟基(-OH)间氢键的相互作用使得壳寡糖不溶于普通有机溶剂，其应用受到限制。因而，考虑通过化学改性，在壳寡糖的重复单元上引入不同基团，改善壳寡糖的溶解性，赋予壳寡糖更多的功能。目前，国内外的研究大多集中在改进壳寡糖的制备工艺上，对于壳寡糖本身改性的研究较少。在进行对壳寡糖改性时，一般是壳寡糖结构上的氨基和羟基参与反应，进行酰化、酯化、醚化、羧基化、烷基化、金属盐、胍基及接枝共聚反应等。其中壳聚糖的胍基化改性近几年更是成为研究中的热点。胍类化合物是一类广泛存在于自然界中兼具多种生物活性的化合物，指含有NH2C(＝NH)NH-基团的化合物或其衍生物。国内外已有一些关于壳聚糖胍的研究，但有关壳寡糖胍的研究则相对较少。Richard F.Stockel最先提出了用一系列氰基胍对壳聚糖结构上游离氨基进行胍基化的设想，反应在酸性介质中进行，要求壳聚糖的脱乙酰度高于50％，粘度低至可以扩散进入混合反应试剂中，进而获得高转化率的壳聚糖胍(Stockel R F.Aminosaccharide biguanides:US,US 5637681A[P].1997.)。潘志信等对壳聚糖中的氨基用三氧化硫脲进行胍基化，合成了甲壳胍盐，合成方法简单，成本较低，但只研究了其吸湿与保湿性(潘志信.甲壳胍的合成及吸湿保湿性能[J].应用化学,2003,20(4):376-378.)。杜予民等利用不同分子量的壳聚糖与甲脒磺酸反应得到壳聚糖胍亚硫酸氢盐衍生物，再在与盐酸反应，得到壳聚糖胍盐酸盐，因其结构中含多个氨基，且孤基质子化后得到一个非常稳定的胍离子，具有更广的抑菌活性和抗菌范围(杜予民,胡瑛,胡振.壳聚糖胍盐衍生物及其制备方法[P].湖北：CN1944467,2007-04-11.)；如果将不同分子量的壳聚糖与双氰胺反应，得到的是壳聚糖双胍盐酸盐，与壳聚糖相比，具有更好的水溶性与抗菌性(杜予民,胡瑛.壳聚糖双胍盐酸盐及其制备方法和用途[P].湖北：CN101033264,2007-09-12.)。与壳聚糖相比，壳寡糖分子量较低，能完全溶于水，生物活性高，在基础上引入胍基基团，由于其稳定的胍离子，能够使之在较大pH值范围内保持正电性，既能克服壳聚糖水溶性差的问题，又能改善胍本身分子量小、不稳定的缺点，进一步提高产物的生物活性。
目前，糖基胍类化合物的合成主要是以双氰胺、甲脒磺酸和氰胍等为胍基化试剂反应，此方法的优点是一步反应、操作简便、条件温和、转化率高，缺点是反应环境一般为盐酸水溶液，产物为混合物不好提纯，后处理困难，而且为提高反应程度，胍基化试剂需大大过量，更为目标产物的分离增加了难度。因此，就目前的工艺而言，其大多以混合物水溶液的形式用于纺织品的后整理等，显然无法应用于生物医药行业。
为进一步将壳寡糖用于生物医药领域，目前常采用的制备糖基类生物材料的方法是化学交联法，一般以戊二醛、甲醛、三聚磷酸钠为交联剂制备而成。王征科等采用戊二醛作为交联剂增强改性壳聚糖凝胶棒材，增强后的弯曲强度和弯曲模量可达186.3MPa、5.2GPa，能满足骨折内固定的临床使用要求(王征科,胡巧玲.戊二醛交联增强改性三维壳聚糖棒材的方法:,CN 101601873 A[P].2009.)；钟芳等以三聚磷酸钠为交联剂制备了一种壳聚糖-三聚磷酸钠纳米粒子，其所获得可食用性膜结构更加致密，阻水性和阻氧性得到明显改善(王征科,胡巧玲.戊二醛交联增强改性三维壳聚糖棒材的方法:,CN 101601873 A[P].2009.)。但由于戊二醛、甲醛对人体有较大的毒性作用，三聚磷酸钠制备的材料结构较为松散，控释效果不好。
发明内容
本发明的目的就在于为解决现有技术的不足而提供提一种香草醛交联的壳寡糖单胍盐酸盐的微波合成方法，该方法操作简便，反应时间短，微波效率高，有望用于工业化生产。本发明依据壳寡糖生物活性，胍基的质子化效应和香草醛的天然无毒性，利用微波合成法制备新型壳寡糖衍生物——香草醛交联壳寡糖单胍盐酸盐，大大增强了壳寡糖本身的生物活性、稳定性和溶解性，在制备抗氧化药物中的应用。
本发明的目的是以下述技术方案实现的：
香草醛交联壳寡糖单胍盐酸盐，壳寡糖和三氧化硫脲在盐酸中进行微波反应，形成与壳寡糖NH键接单胍基团的壳寡糖单胍盐酸盐，再与香草醛进行微波反应，实现交联，如下化学式所示：
壳寡糖是自然界中唯一带有正电荷的碱性氨基寡糖，它的分子量小，溶解性很好，容易被生物体吸收利用，重均分子量为5000以下，优选1500—3000(KDa)，脱乙酰度在97％以上，优选97—99％。
香草醛交联壳寡糖单胍盐酸盐中，单胍取代度为40％～90％，优选70—90％。
上述化学式中，m和n分别为壳寡糖中乙酰化单元和脱乙酰化单位的聚合度，使用香草醛交联后重均分子量可达10～300kDa，在香草醛交联时，一方面香草醛与壳寡糖中(剩余)氨基进行反应，另一方面香草醛与壳寡糖中羟基形成氢键。
上述香草醛交联壳寡糖单胍盐酸盐的制备方法，按照下述步骤进行：
步骤1，将壳寡糖均匀分散在盐酸中形成壳寡糖盐酸溶液，向壳寡糖盐酸溶液中滴加三氧化硫脲水溶液中并同时进行第一步微波反应，滴加完毕后向反应溶液中加入浓盐酸以使反应溶液的pH值为0.5—1，进行第二步微波反应，以合成壳寡糖单胍盐酸盐；
在步骤1中，盐酸中氯化氢的浓度为0.2—0.8mol/L。
在步骤1中，滴加三氧化硫脲水溶液的时间即为第一步微波反应时间，为5～40min，微波反应功率在80～800w，反应温度为40～80℃，搅拌速度100～400r/min，优选第一步微波反应时间为10～30min，微波反应功率在100～500w，反应温度为60～80℃，搅拌速度200～300r/min。
在步骤1中，三氧化硫脲和壳寡糖中氨基的摩尔比为(0.5—5)：1，优选(1—3)：1。
在步骤1中，进行第二步微波反应时，浓盐酸中氯化氢的质量百分数为30—37％。
在步骤1中，进行第二步微波反应时，微波(反应)功率为200～600w，反应时间为5～40min，反应温度为40～80℃，优选微波(反应)功率为300～500w，反应时间为10～30min，反应温度为60～80℃。
步骤2，将壳聚糖单胍盐酸盐均匀分散在醋酸水溶液中形成壳聚糖单胍盐酸盐溶液，与香草醛的乙醇溶液混合均匀后进行微波反应，以使香草醛和壳聚糖单胍盐酸盐反应并形成香草醛交联壳寡糖单胍盐酸盐；其中：
在步骤2中，在醋酸水溶液中，醋酸的浓度为0.1～0.8mol/L。
在步骤2中，在香草醛的乙醇溶液中，香草醛的浓度为0.01～0.50g/mL。
在步骤2中，香草醛和壳聚糖单胍盐酸盐中氨基的摩尔比为(1—20)：1，优选(5—12)：1。在本发明中可通过分子量以及脱乙酰度计算出壳寡糖中氨基的数量，形成壳聚糖单胍盐酸盐后，根据单胍取代度计算出剩余氨基数量，即为壳聚糖单胍盐酸盐中氨基的数量。
在步骤2中，反应时间5～40min，微波反应功率在200～800w，反应温度为40～80℃，搅拌速度200～500r/min，优选反应时间10～30min，微波反应功率在300～600w，反应温度为60～80℃，搅拌速度300～400r/min。
在步骤2中，反应结束后再加入氢氧化钠水溶液(0.5—1mol/L)，调节pH为7，继续加热1～4h，自然冷却至室温后，减压抽滤，多次用乙醇洗、水洗至中性，最后将固体放入真空干燥器内于40～80℃下干燥至物料含水量小于0.5％～10％，研磨成粉，得到产物，即香草醛交联壳寡糖单胍盐酸盐粉末。
与现有技术相比，本发明方法操作简单，反应时间短，微波效率高，有望产业化；本发明所得香草醛交联壳寡糖单胍盐酸盐，通过以香草醛为交联剂制备，对人体无毒，使用安全，有望用作一种新型糖基类生物材料。本发明所得香草醛交联壳寡糖单胍盐酸盐结合了壳胍糖和胍基化合物的生物活性，表现出更强的稳定性、溶解性与生物活性，在微波辐射条件下，对壳寡糖进行胍基化改性，一方面可以克服传统壳寡糖的使用局限性，提高其在有机溶剂中的溶解性，另一方面也可以改善低分子量胍基盐的稳定性较差的缺点，具有重要的经济意义。
附图说明
图1是本发明中原料壳寡糖(COS)和壳寡糖单胍盐酸盐(COSG)的红外光谱对照图。
图2是本发明中香草醛交联壳寡糖单胍盐酸盐(V-COSG)的红外光谱图。
图3是本发明中香草醛交联壳寡糖单胍盐酸盐(V-COSG)的核磁共振谱图。
图4是DPPH-乙醇溶液以及加入2.0mg/mL香草醛交联壳寡糖单胍盐酸盐和抗坏血酸溶液后的DPPH自由基体系的紫外扫描谱图。
图5是不同浓度的DPPH溶液的稳定性分析测试图。
图6是不同浓度的壳寡糖单胍盐酸盐(V-COSG)和抗坏血酸溶液的自由基清除率测试曲线图。
图7是不同取代度的壳寡糖单胍盐酸盐(V-COSG)和抗坏血酸溶液自由基清除率的自由基清除率测试曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。在本发明中合成三氧化硫脲，参考文献——潘志信.三氧化硫脲的合成[J].应用化学,2001,(01):62-63.[2017-09-13]。壳寡糖选择重均分子量为1500—3000(KDa)，脱乙酰度在97—99％。
实施例1
a.合成三氧化硫脲：将过氧化氢溶液与浓硫酸溶液混合，于40～80℃条件下搅拌10～30min，然后交替加入二氧化硫脲固体和过氧化氢硫酸混合液，于3～7h内投料完毕，再保温搅拌1～3h，生成大量颗粒状白色晶体后停止反应，待反应液冷却至室温，沉淀、抽滤、烘干，得到三氧化硫脲的白色晶体；
b.合成壳寡糖单胍盐酸盐：
(1)称取2g壳寡糖溶解于0.8mol/L的盐酸溶液配置成壳寡糖盐酸溶液，调节pH值至1，再称取0.5倍氨基摩尔的三氧化硫脲溶解于蒸馏水中配置成三氧化硫脲溶液，将三氧化硫脲溶液滴加入壳寡糖盐酸溶液中进行微波液相合成，控制滴加时间15min，微波反应功率在80w，反应温度为50℃，搅拌速度300r/min；
(2)向上述反应液中加入质量百分数为30％浓盐酸，调节pH至1继续反应，控制反应功率为240w，反应时间为10min，反应温度为50℃；
(3)反应结束后，将反应液静置冷却至室温，减压抽滤，采用无水乙醇多次洗涤沉淀后，放入真空干燥器内，于50～100℃下干燥，得到壳寡糖单胍盐酸盐粉末；
c.合成香草醛交联壳寡糖单胍盐酸盐：称取上述壳寡糖单胍盐酸盐2.5g溶解于0.8mol/L的醋酸溶液中配置成0.05g/mL的壳聚糖单胍盐酸盐溶液，按照上述壳寡糖单胍盐酸盐剩余氨基摩尔数的5倍，称取相应质量的香草醛溶解在25mL无水乙醇中配置成香草醇的乙醇溶液，将两者的混合液放置于微波反应器中，控制反应时间15min，微波反应功率在400w，反应温度为50℃，搅拌速度300r/min，反应结束后再加入氢氧化钠水溶液(1mol/L)调节pH为7，继续加热4h，自然冷却至室温后，减压抽滤，多次用乙醇洗、水洗至中性，最后将固体放入真空干燥器内于40～80℃下干燥至物料含水量小于0.5％～10％，研磨成粉，得到产物，即香草醛交联壳寡糖单胍盐酸盐粉末，最终产物的单胍取代度为47.37％，分子量为70kDa。
实施例2
a.合成三氧化硫脲：将过氧化氢溶液与浓硫酸溶液混合，于40～80℃条件下搅拌10～30min，然后交替加入二氧化硫脲固体和过氧化氢硫酸混合液，于3～7h内投料完毕，再保温搅拌1～3h，生成大量颗粒状白色晶体后停止反应，待反应液冷却至室温，沉淀、抽滤、烘干，得到三氧化硫脲的白色晶体；
b.合成壳寡糖单胍盐酸盐：
(1)称取2g壳寡糖溶解于0.2mol/L的盐酸溶液配置成壳寡糖盐酸溶液，调节pH值至1再称取2倍氨基摩尔的三氧化硫脲溶解于蒸馏水中配置成三氧化硫脲水溶液，将三氧化硫脲溶液滴加入壳寡糖盐酸溶液中进行微波液相合成，控制滴加时间15min，微波反应功率在320w，反应温度为50℃，搅拌速度300r/min；
(2)向上述反应液中加入质量百分数35％浓盐酸继续反应，调节pH至0.5，继续反应，控制反应功率为240w，反应时间为10min，反应温度为50℃；
(3)反应结束后，将反应液静置冷却至室温，减压抽滤，采用无水乙醇多次洗涤沉淀后，放入真空干燥器内，于50～100℃下干燥，得到壳寡糖单胍盐酸盐粉末；
c.合成香草醛交联壳寡糖单胍盐酸盐：称取上述壳寡糖单胍盐酸盐2.5g溶解于0.1mol/L的醋酸溶液中配置成0.05g/mL的壳聚糖单胍盐酸盐溶液，按照上述壳寡糖单胍盐酸盐剩余氨基摩尔数的10称取相应质量的香草醛溶解在25mL无水乙醇中配置成香草醇的乙醇溶液，将两者的混合液置于微波反应器中，控制反应时间15min，微波反应功率在400w，反应温度为50℃，搅拌速度300r/min，反应结束后再加入氢氧化钠溶液(1mol/L)调节pH为7，，继续加热1h，自然冷却至室温后，减压抽滤，多次用乙醇洗、水洗至中性，最后将固体放入真空干燥器内于40～80℃下干燥至物料含水量小于0.5％～10％，研磨成粉，得到产物，即香草醛交联壳寡糖单胍盐酸盐粉末，最终产物的单胍取代度为63.22％，分子量为180kDa。
为了对本发明中的微波合成反应效率进行检测，本发明采用测定胍取代度(DS)作为判断标准，操作如下(电位滴定法测单胍取代度)：将0.1g左右的壳寡糖单胍盐酸盐溶于25mL水中，使用0.1mol·L-1的NaOH标准溶液滴定，通过得到单胍取代度DS。NaOH和壳寡糖单胍盐酸盐中的＝NH2 +Cl-基团反应，滴定到某点时，pH会发生突跃，NaOH摩尔数与产物中的＝NH2 +Cl-摩尔数相等。壳寡糖胍盐酸盐的胍取代度DS采用下列公式计算：
式中：
n1——被单胍取代的结构单元摩尔数；
n2——未被单胍取代的结构单元摩尔数；
ΔV——到达突越点消耗NaOH的体积/mL；
cNaOH——NaOH标准溶液的浓度/mol·L-1；
G——测试产物质量/g；
239.5——被单胍取代的结构单元的相对摩尔质量/g·mol-1；
161——未被单胍取代的结构单元的相对摩尔质量/g·mol-1；
DS——胍取代度/％。
采用本发明实施例2制备的单胍取代度为63.22％，分子量为180kDa的香草醛交联的壳寡糖单胍盐酸盐进行表征，测试仪器为美国Perkin-Elmer公司的傅里叶红外光谱仪Spectrum 100，美国瓦里安公司的液体核磁共振谱仪VARIAN INOVA。
取本发明实施例2获得的壳寡糖单胍盐酸盐2mg，干燥的KBr200mg，置于玛瑙研钵中，混合均匀，研成粉末。取适量混合物转移至压片模具中，加压成透明或半透明薄片，置于红外分光光度计中检测，测试范围4000～400cm-1。
图1是原料壳寡糖(COS)与壳寡糖单胍盐酸盐(COSG)的红外光谱对照图，其中壳寡糖单胍盐酸盐为本发明实施例2中制得。分析：壳寡糖的红外光谱图中，3400cm-1附近的强吸收峰为缔合氢键的O-H和N-H伸缩振动吸收峰部分重叠而增宽的多重吸收峰，2890cm-1左右为C-H的伸缩振动吸收峰，1620～1640cm-1附近处为仲胺的N-H伸缩振动峰。此外，指纹区1060cm-1附近处为仲胺的N—H面内弯曲振动吸收峰，壳寡糖脱乙酰化并不完全，分子中含有少量的-NH-CO-结构，故在该处有吸收峰；600cm-1附近处对应着N-H的面外摇摆振动吸收带。图1中壳寡糖单胍红外光谱图线和壳寡糖红外光谱图线的变化趋势大致相同，对比可看出，壳寡糖单胍衍生物在1620～1640cm-1处、1060cm-1附近处吸收峰明显增强，这两个峰都是仲胺基团的特征峰，说明分子内仲胺类基团增多，表明壳寡糖氨基上发生了胍基化反应。此外，3400cm-1附近处吸收峰为缔合氢键的O-H和N-H伸缩振动吸收峰部分重叠而增宽的多重吸收峰，由于壳寡糖分子中存在大量的分子间、分子内氢键，且氢键的长短、强弱也不尽相同，因此其伸缩振动峰出现在较宽的频率范围内，而壳寡糖单胍相对于壳寡糖，该峰明显增强，同样说明分子内N-H含量增多，表明了壳寡糖氨基上发生了胍化反应。
图2是香草醛交联壳寡糖单胍盐酸盐(V-COSG)的红外光谱图，分析：香草醛交联壳寡糖单胍盐酸盐的红外图谱中，除壳寡糖单胍的特征峰外，还出现了一些新峰，其中1644cm-1处出现了希夫碱-C＝N的特征吸收峰，1515cm-1处出现了苯环的特征峰，1467cm-1处为-OCH3的-CH3吸收峰，1290cm-1处是酚羟基的弯曲振动峰，665cm-1～903cm-1处则为苯环中C-H吸收带。这些新峰的出现都表明香草醛与壳寡糖单胍发生反应生成了新的产物──香草醛交联壳寡糖单胍盐酸盐。图3是香草醛交联壳寡糖单胍盐酸盐(V-COSG)的13C NMR谱图，其中香草醛交联壳寡糖单胍盐酸盐为本发明实施例2中制得。据相关文献报告，壳聚糖环上各个C的化学位移为：C1：97.03，C4：76.03，C5：75.01，C3：71.49，C6：60.23，C2：56.23。壳寡糖是壳聚糖降解后得到的，因此，其糖环上各个C化学环境，化学位移也应与壳聚糖一致。用13C NMR分析技术进一步确定壳寡糖改性后的结构变化，香草醛交联壳寡糖单胍盐酸盐的化学位移分别为：C7：165.21，C8：155.13，C1：98.91，C4：78.17，C5：77.03，C3：69.13，C6：60.17，C2：56.43。其中C7：165.21和C8：155.13处新出现的碳的化学位移确定了单胍基团的存在。
DPPH自由基体系的吸收光谱的测定
准确称取0.0197g DPPH，溶解于无水乙醇，并在250mL容量瓶子中定容，制得浓度为0.20mM的DPPH-乙醇溶液。配制好的DPPH溶液低温避光保存。
香草醛交联壳寡糖单胍盐酸盐溶液：准确称取0.020g本发明制备的香草醛交联壳寡糖单胍盐酸盐产物(取代度为63.22％)置于25mL锥形瓶中，并向其中加入10mL蒸馏水将其振荡溶解，得到2.0mg/mL香草醛交联壳寡糖单胍盐酸盐溶液，并将其稀释成一定浓度梯度的溶液，取DPPH溶液1mL，向其中加入2mL香草醛交联壳寡糖单胍盐酸盐溶液，加样时从最低浓度开始加，同时观察溶液褪色情况，记录下溶液颜色刚好褪去是样品液的浓度，此即为样品液的最大浓度，在此浓度的基础上，将样品稀释成一定浓度梯度的溶液备用。
抗坏血酸溶液：准确称取0.020g抗坏血酸置于25mL锥形瓶中，并向其中加入10mL蒸馏水将其振荡溶解，得到2.0mg/mL的抗坏血酸溶液，留作母液以备后续实验使用。
本实施例准确量取3mL 2.0mg/mL香草醛交联壳寡糖单胍盐酸盐溶液、壳寡糖溶液、抗坏血酸溶液，使用UV-4802紫外可见分光光度计在250-800nm处分别进行全波长扫描，观察相应的紫外可见光吸收光谱。
图4为DPPH-乙醇溶液以及加入2.0mg/mL香草醛交联壳寡糖单胍盐酸盐和抗坏血酸溶液后的DPPH自由基体系的紫外扫描谱图。从图中可以看出，DPPH-乙醇溶液在517nm处有很明显的吸收峰，从而可以得出其最大吸收波长为517nm。此外，将DPPH-乙醇溶液与香草醛交联壳寡糖单胍盐酸盐溶液或抗坏血酸溶液均匀混合后，DPPH在517nm处的吸收峰被很大幅度的削弱，即在此波长下进行壳寡糖胍衍生物对DPPH自由基的清除效果是可行的。
DPPH溶液的稳定性分析
将0.20mM DPPH-乙醇溶液分别稀释为浓度为0.05mM，0.10mM，0.15mM，0.20mM的乙醇溶液。将稀释后的DPPH-乙醇溶液置于阴凉处保存，用UV-4802紫外可见分光光度计分别测定不同浓度的DPPH-乙醇溶液在0min，10min，20min，30min后在λmax(517nm)处的吸光光度值。如图5所示，不同浓度下的DPPH-乙醇溶液在室温下阴凉处静置0，10，20，30min后，分别对其吸光值进行测定，结果发现其吸光值无明显变化，该结果表明DPPH自由基在室温下稳定性较好，其自身不会对测试结果产生影响。
DPPH自由基清除能力分析
本实施例将上述香草醛交联壳寡糖单胍盐酸盐以及抗坏血酸分别配置成以下浓度的溶液，制成样品液：0.01mg/mL，0.02mg/mL，0.05mg/mL，0.2mg/mL，0.4mg/mL，0.6mg/mL，0.8mg/mL，1.0mg/mL，1.5mg/mL。取2mL样品液以及抗坏血酸溶液分别和1mL 0.20mM的DPPH-乙醇溶液充分混合，在阴凉处放置30min，用UV-4802紫外可见分光光度计测定在λmax(517nm)处的吸光值(Asample)，结果如图6所示。本实施例将取代度分别为47.37％、56.21％、63.22％、71.61％、86.10％的香草醛交联壳寡糖单胍盐酸盐配制成0.05mg/mL的样品溶液。取2mL样品溶液以及0.05mg/mL的抗坏血酸溶液分别和1mL0.20mM DPPH-乙醇溶液充分混合，在阴凉处放置30min，用UV-4802紫外可见分光光度计测定在λmax(517nm)处的吸光值(Asample)，结果如图7所示。
取2mL无水乙醇和1mL0.20mMDPPH-乙醇溶液充分混合，在阴凉处放置30min，在λmax处测其吸光值(ADPPH)。取2mL样品溶液和1mL无水乙醇充分混合，避光在室温下放置30min，在最大波长下测其吸光值(Ablank)。以上所配测试溶液各组分含量如表1所示。
表1 DPPH自由基清除率方法各试剂加入量
组别 样品液 纯乙醇 DPPH-乙醇溶液 吸光度
Sample组 2mL 1mL (A<sub>sample</sub>)
DPPH组 2mL 1mL (A<sub>DPPH</sub>)
Blank组 2mL 1mL (A<sub>blank</sub>)
为了对本发明中产物的抗氧化性能进行检测，本发明采用测定DPPH自由基清除活性作为判断标准，其中，DPPH自由基清除活性计算公式如下：
图6是本发明中不同浓度的香草醛交联壳寡糖单胍盐酸盐和抗坏血酸溶液自由基清除活性，分析：香草醛交联壳寡糖单胍盐酸盐溶液对DPPH自由基的清除能力存在着较明显的剂量依赖效应，即随着溶液浓度的增加越来越好，最后趋于稳定。香草醛交联壳寡糖单胍盐酸盐之所以能够清除自由基是因为其上含有的氨基与溶液中的氢离子结合形成-NH3+，游离的铵基可以与DPPH自由基反应形成稳定的大分子自由基，导致溶液的吸光率下降，随着溶液浓度的增加游离的氨基增多，因此自由基清除率上升，在香草醛交联壳寡糖单胍盐酸盐浓度在0.4mg/mL以上，自由基清除率在90％以上。
图7是本发明中不同取代度的香草醛交联壳寡糖单胍盐酸盐对DPPH自由基清除率的影响，分析：可以看出随着取代度的增加，香草醛交联壳寡糖单胍盐酸盐的DPPH自由基清除率也在升高，该现象的原因可能是因为随着胍基含量的增加，氨基含量随之增加，有更多的氨基与DPPH自由基进行配对，因此清除率上升；香草醛交联壳寡糖单胍盐酸盐中，壳寡糖单胍盐酸盐的胍基取代度在70％以上，自由基清除率在86％以上。综上所述，高浓度、高取代度的香草醛交联壳寡糖单胍盐酸盐可以达到与传统抗氧化剂抗坏血酸相似的DPPH自由基清除率，有望用作一种新型抗氧化剂，即香草醛交联壳寡糖单胍盐酸盐在制备抗氧化药物中的应用。
根据本发明内容进行制备工艺参数与的调整，均可实现本发明香草醛交联寡聚糖的制备，且表现出与实施例基本一致的性能。以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

Claims (4)

1.香草醛交联壳寡糖单胍盐酸盐在制备抗氧化药物中的应用，其特征在于，香草醛交联壳寡糖单胍盐酸盐通过壳寡糖和三氧化硫脲进行反应，形成与壳寡糖NH键接单胍基团的壳寡糖单胍盐酸盐，再与香草醛进行交联，如下化学式所示：
m和n分别为壳寡糖中乙酰化单元和脱乙酰化单位的聚合度，在香草醛交联时，一方面香草醛与壳寡糖中氨基进行反应，另一方面香草醛与壳寡糖中羟基形成氢键；在香草醛交联壳寡糖单胍盐酸盐浓度在0.4mg/mL以上，自由基清除率在90％以上。
2.根据权利要求1所述的香草醛交联壳寡糖单胍盐酸盐在制备抗氧化药物中的应用，其特征在于，壳寡糖重均分子量为3000以下，优选1500—3000(KDa)，脱乙酰度在97％以上，优选97—99％。
3.根据权利要求1所述的香草醛交联壳寡糖单胍盐酸盐在制备抗氧化药物中的应用，其特征在于，单胍取代度为40％～90％，优选70—90％，自由基清除率在86％以上。
4.根据权利要求1所述的香草醛交联壳寡糖单胍盐酸盐在制备抗氧化药物中的应用，其特征在于，使用香草醛交联后重均分子量可达10～300kDa。
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