CN104119479B

CN104119479B - 具有细胞膜结构仿生的两亲性接枝聚合物及其制备方法

Info

Publication number: CN104119479B
Application number: CN201410338238.5A
Authority: CN
Inventors: 刘公岩; 罗泉清; 陈媛; 卫星; 张宗才
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Chengdu Dexin Anchuang New Medical Technology Co ltd
Priority date: 2014-07-16
Filing date: 2014-07-16
Publication date: 2017-01-18
Anticipated expiration: 2034-07-16
Also published as: CN104119479A

Abstract

本发明公开了一种具有细胞膜结构仿生的两亲性接枝共聚物,所述共聚物的主链为壳聚糖，侧链分别为亲水的磷酸胆碱和疏水的脂肪酸;本发明所制备的两亲接枝共聚物具有细胞膜结构仿生的特点：磷酸胆碱分子模拟细胞膜中磷脂分子的头部，壳聚糖的糖单元模拟细胞膜上糖脂分子的头部，疏水的脂肪酸则模拟磷脂和糖脂分子的疏水碳链。所述共聚物具有良好的生物相容性和亲水性。在作为纳米药物载体时，既能够阻抗蛋白质的非特异性粘附，又能容易地被病灶细胞内吞。此外，该接枝共聚物能够稳定的分散在高盐度和广泛pH条件下。本发明同时还提供了制备所述共聚物的方法，操作简单，成本低，反应条件温和，产率较高。

Description

具有细胞膜结构仿生的两亲性接枝聚合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及两亲性接枝聚合物制备领域，尤其涉及一种细胞膜结构仿生的接枝共聚物及其制备方法。

背景技术

两亲性高分子聚合物作为纳米药物载体在抗癌领域有着十分光明的应用前景。理想情况下，纳米药物载体经静脉注射进入血液循环后，首先应能够携带药物随血液稳定且长效的循环，最终有效地富集在肿瘤组织处；然后纳米药物载体能够容易被细胞内吞，携带药物进入细胞；最后药物载体在细胞内降解，从而将药物释放。在血液循环过程中，血液中的各种蛋白质如果在药物载体表面产生非特异性粘附不仅会造成药物载体聚集和不稳定，还会引起人体免疫系统将药物载体识别，将药物载体从人体清除；因此这就要求构成药物载体的两亲性聚合物要具有十分良好的生物相容性，能够有效阻抗血液中蛋白质的非特异性粘附。进入肿瘤组织后，两亲性聚合物又需要具有良好的细胞相容性，能够被肿瘤细胞内吞。最后两亲性聚合物要具有生物可降解性，最终在细胞内释放抗癌药物。

壳聚糖是一种天然的高分子材料，具有良好的生物相容性和可降解性，可溶解于中性或偏酸性水溶液中；疏水分子接枝改性后的两亲性壳聚糖已被广泛地应用于制备纳米药物载体。由于壳聚糖含有大量的氨基，因此容易被细胞内吞，在作为药物载体方面具有一定的优势。胡富强等在“Polymeric Micelles with Glycolipid-like Structure andMultiple Hydrophobic Domains for Mediating Molecular Target Delivery ofPaclitaxel. (Biomacromolecules, 2004, 25: 2450-2456) 中就利用天然大分子壳聚糖来模拟细胞膜糖脂的多糖结构，疏水性硬脂酸模拟糖脂的脂肪链，制备了两亲性接枝共聚物并用来构建纳米胶束作为载体传输紫杉醇药物。由于壳聚糖带有大量正电荷以及硬脂酸与细胞膜的双分子层中脂肪链的相容性，该聚合物可以容易地被细胞内吞。但也正因为单一的壳聚糖表面具有大量的正电荷，会造成一定的细胞毒性以及在血液循环中容易引起蛋白质粘附和免疫反应，限制了这类具有仿生结构聚合物的体内应用。其次，单一的正电荷为壳聚糖提供亲水性，也会使壳聚糖比较容易地受到水溶液中其他离子和pH影响，造成聚合物的不稳定性。这些缺陷都限制了基于壳聚糖的两亲性共聚物作为药物载体的使用。

对壳聚糖进行进一步的仿生修饰以弥补其缺陷成为必要的选择。人们通过对血液中血红细胞进行研究发现，构成血红细胞膜的主要成分为磷脂、糖脂、胆固醇和糖蛋白等。其中磷脂分子构成了细胞膜和细胞内部各个细胞器的双分子层，磷酸胆碱则是磷脂分子的极性亲水部分。已有研究表明，具有等离子性的磷酸胆碱基团具有良好的生物相容性、抗蛋白质粘附性和强亲水性，因此在生物医用领域具有很高的应用价值。磷酸胆碱因其两性离子特点，可以通过静电作用在其周围形成水合层，不易被溶液中的离子和蛋白质所影响，具有良好的稳定性，因此成为构建生物材料的理想选择。计剑等人就设计了聚甲基丙烯磷酸胆碱酯为亲水段、胆固醇为疏水段两亲性聚合物，并制备了一种仿细胞膜的聚合物胶束载药体系（仿细胞膜的聚合物胶束载药体系，ＣＮ１６７９９６１Ａ）。虽然该仿生胶束可以有效的阻抗蛋白质粘附，但是单一的磷酸胆碱胶束表面也会造成不易被目标细胞内吞的缺陷。因此利用磷酸胆碱对壳聚糖进一步细胞膜仿生修饰，则有可能赋予壳聚糖对蛋白质的阻抗能力及良好的溶液稳定性，同时不会影响壳聚糖被细胞内吞的能力。

发明内容

本发明通过分别将亲水性磷酸胆碱分子和疏水性脂肪酸共价接枝到壳聚糖骨架上，制备了一种具有高度细胞膜仿生结构的两亲性接枝共聚物。所述的聚合物由亲水性磷酸胆碱和疏水性脂肪酸接枝在壳聚糖主链上接枝共聚而成。具有如下通式：

式中，m为1-20，n为1-20，壳聚糖的重复单元数为30-300，脱乙酰度>60%；磷酸胆碱分子的接枝率为壳聚糖重复单元的5%-50%；脂肪链的接枝率为壳聚糖重复单元的5%-50%。

本发明有机地将磷脂分子和糖脂分子的仿生结构结合起来。其中磷酸胆碱分子模拟细胞膜磷脂分子的磷酸胆碱，壳聚糖的糖单元模拟糖脂分子的多糖结构，疏水性脂肪链模拟细胞膜磷脂和糖脂分子的水性碳链。使聚合物具有优异的生物相容性、抗蛋白粘附性和溶液稳定性，可以用来制备理想的纳米药物载体。本发明所述壳聚糖为天然大分子线型多糖，原料廉价，来源广泛，是一种海洋资源，绿色环保；其具有良好的生物相容性和生物可降解性的生物材料，脱乙酰度>60%，重复单元为30-300，其糖单元具有丰富的氨基，有利于进行多种化学修饰，从而赋予其多功能性，化学结构式为：

本发明中所述磷酸胆碱分子是一种带有双键的两性分子，与磷脂分子的极性基团具有相同的化学结构，具有良好的亲水性、生物相容性和抗蛋白质粘附等特点；由于其独特的等离子结构，在水性溶液中可以静电作用形成水合层，不容易受到pH值和离子浓度的影响，具有较高的溶液稳定性；对壳聚糖进行接枝改性后可以结合磷酸胆碱和壳聚糖两者的优点；其所带的双键结构可以和氨基进行迈克尔加成反应，从而进行化学修饰带有氨基的材料。所述磷酸胆碱结构式如下所示：

n=1-20

脂肪酸是一种末端带有羧基的脂肪链，具有疏水性。一定碳链长度的脂肪酸与细胞膜中磷脂和糖脂的疏水碳链类似，因此可以用来模拟细胞膜的疏水部分，并且与细胞膜有良好的生物相容性，有利于材料被细胞摄取；所述脂肪酸的结构式如下所示：

m=1-20

本发明还提供一种制备具有细胞膜仿生结构的接枝共聚物的方法，包括如下步骤：

1）将1 mmol壳聚糖分散到50-500 mL去离子水中，搅拌使壳聚糖溶解完全；溶解完全后再滴加稀碱溶液调节壳聚糖溶液pH值为7.0-10.0；本步骤中，稀碱溶液浓度最佳为2-10%（w/w）；

2）向步骤1）所得溶液中加入摩尔量为壳聚糖氨基摩尔数的5%-50%的带有双键官能团的磷酸胆碱单体，然后在氮气保护下迈克尔加成反应至少12小时，反应温度为20-50℃；反应结束后溶液透析冻干，得到聚合物A，其分子结构式为：

式中，壳聚糖重复单元数为30-300，n为1-20；

3）将1 mmol聚合物A充分溶解于50-500 ml去离子水中，得聚合物A溶液；称取摩尔量为聚合物A中未接枝氨基摩尔量的5%-50%的脂肪酸，溶解于40-80℃的20-100 mL热乙醇中，再加入与脂肪酸等摩尔量的小分子活化剂1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）的热乙醇溶液；

4）将所述热乙醇溶液快速加入聚合物A溶液中反应至少2小时，反应温度为40-80℃；反应结束后，反应溶液经透析冻干，得到聚合物B，其分子结构式为：

式中，壳聚糖重复单元数为30-300，m为1-20，n为1-20。

优选的，步骤2)中迈克尔加成反应的时间为12-72小时。

优选的，步骤4）反应时间为2-24小时。

除上述方法外，本发明还提供了另一种制备细胞膜仿生两亲性接枝共聚物的方法，其特征在于，步骤如下：

（1）将1 mmol壳聚糖分散到50-500 mL去离子水中，搅拌使壳聚糖溶解完全，得到壳聚糖溶液；

（2）称取摩尔量为壳聚糖氨基摩尔量5%-50%的脂肪酸，溶解于温度40-80℃的20-100 mL热乙醇中，再加入与脂肪酸等摩尔量小分子活化剂1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC），得热乙醇溶液；上述热乙醇溶液快速倾倒入步骤（1）中的壳聚糖溶液中反应至少2小时，反应温度为40-80℃；反应结束后，反应溶液透析冻干后得到聚合物C，其分子结构式为：

（3）取1 mmol聚合物C超声分散于50-500 mL去离子水中，然后加入摩尔量为聚合物C中未接枝氨基摩尔数5%~50%的磷酸胆碱；然后在氮气保护下，迈克尔加成反应至少12小时，反应温度为20-50℃；反应结束后，反应溶液透析冻干后得到聚合物B，其分子结构式为：

优选的，步骤2)中反应时间为2-24小时。

优选的，步骤3）中迈克尔加成反应的时间为12-72小时。

本发明采用两步法将亲水分子磷酸胆碱和疏水脂肪酸分别接枝到壳聚糖主链上，制备了一种具有高度细胞膜结构仿生的接枝共聚物，该聚合方法工艺简单、条件温和、原料来源广泛且价格低廉。

本发明制备的细胞膜仿生两亲接枝共聚物，能够有效阻抗非特异性蛋白粘附，且在水环境中表现良好的稳定性、抗水溶液中离子的破坏能力、生物可降解性和良好的生物相容性。该细胞膜仿生两亲接枝共聚物可以用来制备纳米药物载体。当磷酸胆碱的接枝率控制在50%以下时，两亲接枝共聚物制备的纳米药物载体既能够有效的阻抗非特异性蛋白粘附，又不会因为取代过多的氨基造成纳米载体不易被细胞内吞。

本发明的优点是：

1. 制备过程中所采用的溶剂为去离子水和乙醇等都是十分廉价且常见的溶剂，并不引入有机溶剂，毒性小；

2. 接枝共聚物的主要构成材料为天然大分子壳聚糖，是一种绿色资源，具有良好的生物相容性和可降解性，具有广阔的应用前景；

3. 本发明中的聚合物结构设计更接近于细胞膜的结构，有机结合了磷脂和糖脂分子的结构，超越了目前文献报道中的生物仿生材料，更容易实现细胞膜的生物相容性、阻抗非特异性蛋白粘附和溶液稳定性等功能特点，有利于制备理想的纳米药物载体；

4.磷酸胆碱与脂肪酸在壳聚糖上的接枝改性都是可控的，通过调控接枝率可以使得两亲性聚合物既能有效地阻抗非特异性蛋白粘附和高度稳定，又能具有进入细胞的能力；

5. 聚合物制备工艺和后处理工艺简便高效、条件温和、而且产率较高，因此便于进行工业化的大批量生产。

附图说明

图1 为实施例1制备聚合物过程中2-丙烯酰氧基磷酸胆碱、壳聚糖和聚合物D的核磁共振氢谱图；

图2为实施例1制备聚合物过程中壳聚糖和聚合物D的红外谱图；

图3为实施例1制备聚合物E的核磁共振氢谱图；

图4 为实施例1 制备聚合物E的工艺示意图；

图5为实施例1 制备聚合物E的细胞活性图；

图6为利用实施例1中合成的聚合物E所制备的纳米胶束载体TEM图；

图7为应用例1纳米胶束载体在含有蛋白质介质中的粒径变化图；

图8为应用例1纳米胶束载体在高盐度和各种pH条件下的粒径图。

具体实施方式

实施例1

将1 mmol分子量为10000的壳聚糖分散到100 mL去离子水中，滴加浓度为2-10%的稀盐酸调节溶液pH为5.0，搅拌使壳聚糖溶解完全。再滴加浓度为5%的氢氧化钠溶液调节壳聚糖溶液pH值为8.0。在氮气保护下，向壳聚糖溶液中直接加入2-丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱（APC），加入量为壳聚糖氨基摩尔数的10%，APC的双键与壳聚糖氨基进行迈克尔加成反应，反应温度为35℃，反应时间为48 h。反应结束后用截留分子量为3500的透析袋除去未反应的小分子APC，溶液冻干后得到修饰了磷酸胆碱的壳聚糖粉末固体D。产物化学结构式如下：

磷酸胆碱修饰后的壳聚糖D水溶性良好，能够溶解在各种pH条件的水溶液中。

1 mmol聚合物D充分溶解于50 ml去离子水中，备用；称取一定量的硬脂酸（十八烷基酸，SA），摩尔量为聚合物D中剩余氨基摩尔量的20%，然后溶解于温度80℃的40 mL热乙醇中，再加入与硬脂酸等摩尔量小分子活化剂1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）；上述热乙醇溶液快速倾倒入聚合物D溶液中进行反应，反应温度为80℃，反应时间为6小时。反应结束后用截留分子量为3500的透析袋除去未反应的硬脂酸，溶液冻干后得到修饰了磷酸胆碱和硬脂酸接枝的壳聚糖产物E。产物化学结构式如下：

实施例1中的合成工艺过程如下所示：

图1为本实施例制备聚合物过程中2-丙烯酰氧基磷酸胆碱、壳聚糖和聚合物D的核磁共振氢谱图；图2为实施例1制备聚合物过程中壳聚糖和聚合物D的红外谱图；证明APC接枝壳聚糖成功，磷酸胆碱分子修饰后壳聚糖的亲水性和生物相容性进一步提高。

图3为本实施例制备聚合物E的核磁共振氢谱图；证明疏水性硬脂酸成功地接枝在壳聚糖上，合成了两亲性的接枝共聚物。

图4为本实施例1制备聚合物E的工艺示意图。

图5为实施例1 制备聚合物E的细胞活性图；证明聚合物E对细胞的毒性很小。

实施例2

操作步骤如实施例1，磷酸胆碱分子为2-丙烯酰氧基丙基磷酸胆碱，制备过程如下式所示：

实施例3

操作步骤如实施例1，磷酸胆碱分子为2-丙烯酰氧基丁基磷酸胆碱，制备过程如下式所示：

实施例4

操作步骤如实施例1，磷酸胆碱分子为2-丙烯酰氧基戊基磷酸胆碱，制备过程如下式所示：

实施例5

操作步骤如实施例1，磷酸胆碱分子为2-丙烯酰氧基己基磷酸胆碱，制备过程如下式所示：

实施例6

操作步骤如实施例1，磷酸胆碱分子为2-丙烯酰氧基庚基磷酸胆碱，制备过程如下式所示：

实施例7

操作步骤如实施例1，磷酸胆碱分子为2-丙烯酰氧基辛基磷酸胆碱，制备过程如下式所示：

实施例8

操作步骤如实施例1，磷酸胆碱分子为2-丙烯酰氧基壬基磷酸胆碱，制备过程如下式所示：

实施例9

操作步骤如实施例1，磷酸胆碱分子为2-丙烯酰氧基葵基磷酸胆碱，制备过程如下式所示：

实施例10

操作步骤如实施例1，磷酸胆碱分子为2-丙烯酰氧基已基磷酸胆碱，脂肪酸为十六烷基羧酸制备过程如下式所示：

应用例1

将实施例1中制备的聚合物10 mg直接分散在20 ml水溶液中，超声溶解5分钟后可制备得到纳米胶束。

图7为应用例1纳米胶束载体在含有蛋白质介质中的粒径变化图；证明所制备胶束具有较强的阻抗非特异性蛋白粘附的功能。

图8为应用例1纳米胶束载体在高盐度和各种pH条件下的粒径图；证明所制备胶束具有较强的溶液稳定性。

Claims

1.一种具有细胞膜仿生结构的两亲接枝共聚物，其特征在于具有如下通式：

式中，壳聚糖的重复单元数为30-300，脱乙酰度＞60％；磷酸胆碱分子的接枝率为壳聚糖重复单元的5％-50％；脂肪酸的接枝率为壳聚糖重复单元的5％-50％；所述磷酸胆碱分子通过迈克尔加成反应接枝到壳聚糖上。

2.制备细胞膜仿生两亲性接枝共聚物的方法，其特征在于，步骤如下：

1)将1mmol壳聚糖分散到50-500mL去离子水中，搅拌使壳聚糖溶解完全；溶解完全后再滴加稀碱溶液调节壳聚糖溶液pH值为7.0-10.0；

2)向步骤1)所得溶液中加入摩尔量为壳聚糖氨基摩尔数的5％-50％的带有双键官能团的磷酸胆碱单体，然后在氮气保护下迈克尔加成反应至少12小时，反应温度为20-50℃；反应结束后溶液透析冻干，得到聚合物A，其分子结构式为：

式中，壳聚糖重复单元数为30-300，n为1-20；

3)将1mmol聚合物A充分溶解于50-500mL去离子水中，得聚合物A溶液；称取摩尔量为聚合物A中未接枝氨基摩尔量的5％-50％的脂肪酸，溶解于40-80℃的20-100mL热乙醇中，再加入与脂肪酸等摩尔量的小分子活化剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的热乙醇溶液；

4)将所述热乙醇溶液快速加入聚合物A溶液中反应至少2小时，反应温度为40-80℃；反应结束后，反应溶液经透析冻干，得到聚合物B，其分子结构式为：

式中，壳聚糖重复单元数为30-300，m为1-20，n为1-20。

3.根据权利要求2所述的制备细胞膜仿生两亲性接枝共聚物的方法，其特征在于：步骤2)中迈克尔加成反应的时间为12-72小时。

4.根据权利要求2所述的制备细胞膜仿生两亲性接枝共聚物的方法，其特征在于：步骤4)反应时间为2-24小时。

5.制备细胞膜仿生两亲性接枝共聚物的方法，其特征在于，步骤如下：

1)将1mmol壳聚糖分散到50-500mL去离子水中，搅拌使壳聚糖溶解完全，得到壳聚糖溶液；

2)称取摩尔量为壳聚糖氨基摩尔量5％-50％的脂肪酸，溶解于温度40-80℃的20-100mL热乙醇中，再加入与脂肪酸等摩尔量小分子活化剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，得热乙醇溶液；上述热乙醇溶液快速倾倒入步骤1)中的壳聚糖溶液中反应至少2小时，反应温度为40-80℃；反应结束后，反应溶液透析冻干后得到聚合物C，其分子结构式为：

3)取1mmol聚合物C超声分散于50-500mL去离子水中，然后加入摩尔量为聚合物C中未接枝氨基摩尔数5％～50％的磷酸胆碱；然后在氮气保护下，迈克尔加成反应至少12小时，反应温度为20-50℃；反应结束后，反应溶液透析冻干后得到聚合物B，其分子结构式为：

6.根据权利要求5所述的制备细胞膜仿生两亲性接枝共聚物的方法，其特征在于：步骤2)中反应时间为2-24小时。

7.根据权利要求5所述的制备细胞膜仿生两亲性接枝共聚物的方法，其特征在于：步骤3)中迈克尔加成反应的时间为12-72小时。