CN103536895A - 一种用于蛋白质药物传输的仿生纳米载体系统及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于蛋白质药物传输的仿生纳米载体系统及制备方法，属于纳米药物技术领域。本发明制备方法包括以下步骤：（1）将两亲性磷酸胆碱化壳聚糖衍生物溶解于水中，并用有机溶剂稀释；（2）将蛋白质溶于水或有机溶剂中，配置成溶液；（3）将步骤（2）制备所得溶液加入步骤（1）制备的溶液中，超声分散，并旋转蒸发成膜；（4）将步骤（3）所成膜加入溶剂重新分散，得纳米粒子溶液，经离心、洗涤、干燥，得到包载蛋白质药物的仿生纳米载体系统。本发明提供的仿生纳米载体系统可保持蛋白质药物的活性，提高蛋白质药物稳定性和生物利用度，且制备条件温和，工艺简单，能够在蛋白质药物制备中得到很好的应用。
Description
技术领域
本发明涉及纳米药物技术领域，具体涉及一种用于蛋白质药物传输的仿生纳米载体系统及制备方法。
背景技术
随着生物技术及重组技术的革新，蛋白质、多肽等药物的种类和数量日益增多，用途越来越广，可以用来治疗一些以前无法治疗或疗效较差的疾病，已成为人类攻克癌症、恶性肿瘤、心脑血管疾病等顽疾的有力工具。蛋白质药物大多为内源性物质，具有高活性、低毒性、特异性强、生物功能明确等优点，但其存在的稳定性差、体内酶降解、血液半衰期短、难以穿透细胞膜等缺点，对此类药物的临床应用造成了巨大障碍。
为了提高蛋白质药物的生物利用度和治疗效果，人们发展了一系列蛋白质药物载体技术，如蛋白质及其载体的聚乙二醇（PEG）化，以聚乳酸、葡聚糖、壳聚糖等可降解型高分子及其衍生物为基材构建的微球、微囊及凝胶等作为蛋白质药物传输载体[1.S.Salmaso,P.Caliceti,Self assembling nanocomposites forprotein delivery:Supramolecular interactions of soluble polymers with protein drugs.Int.J.Pharmaceut.2013,440,111-123；2.H.Bysell,R.
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近年来，人们发现仿细胞膜结构的两性离子磷酸胆碱（PC）基团改性技术可抑制源于非特异性蛋白吸附导致的机体防御机制激活，包括单核吞噬细胞系统的清除作用，改善载体的血液相容性；而且聚两性离子链段可增强蛋白质药物的稳定性而不损失其生物活性[1.R.Matsuno,K.Ishihara,Integrated functionalnanocolloids covered with artificial cell membranes for biomedical applications,Nano Today,6,61～74(2011)；2.A.J.Keefe,S.Jiang,Poly(zwitterionic)proteinconjugates offer increased stability without sacrificing binding affinity or bioactivity.Nat.Chem.2012,4,59-63.]。因此，利用两亲性磷酸胆碱化壳聚糖衍生物负载蛋白质药物形成仿生载体系统，可以克服蛋白质药物载体现有技术的不足，实现蛋白质、多肽等蛋白质药物的有效包载及高效化利用。
发明内容
为克服上述现有技术的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种用于蛋白质药物传输的仿生纳米载体系统的制备方法。
本发明的另一目的在于提供上述制备方法获得的用于蛋白质药物传输的仿生纳米载体系统，实现蛋白质药物的高效化利用。
本发明的再一目的在于提供上述用于蛋白质药物传输的仿生纳米载体系统的应用。
本发明的目的是通过下述技术方案实现的：一种用于蛋白质药物传输的仿生纳米载体系统的制备方法，具体步骤如下：
（1）将两亲性磷酸胆碱化壳聚糖衍生物溶于水，用有机溶剂稀释，配制成两亲性磷酸胆碱化壳聚糖衍生物溶液；
（2）将蛋白质药物溶解于溶剂中，配制成蛋白质药物溶液；
（3）将步骤（2）配制的蛋白质药物溶液缓慢加入步骤（1）配制的两亲性磷酸胆碱化壳聚糖衍生物溶液中，超声分散，并旋转蒸发成膜；
（4）将步骤（3）所成膜加水搅拌重新分散，得纳米粒子溶液，经离心、沉淀洗涤、干燥，得到用于蛋白质药物传输的仿生纳米载体系统。
本发明的优选方案如下：
步骤（1）中所述两亲性磷酸胆碱化壳聚糖衍生物，其特征在于分子结构如式I所示：
其中，R为疏水基团，包括但不仅限于：脱氧胆酰基、去羟基胆酰基、胆酰基、胆固醇半琥珀酰基、辛酰基、癸酰基、肉豆蔻酰、棕榈酰基、油酰基和亚油酰基，R的取代度为0.8%～12%，磷酸胆碱基团的取代度为20%～90%。
所述的两亲性磷酸胆碱化壳聚糖衍生物通过下述方法制备获得：
1）将壳聚糖改性得到6-O-三苯基甲醚化壳聚糖，溶于反应介质；加入双取代胆碱膦酸酯，其中6-O-三苯基甲醚化壳聚糖中的氨基与膦酸酯的摩尔比为1：2～10，于0～40℃搅拌反应12～24小时；旋干溶剂，加入甲酸，室温搅拌0.5～2小时；旋干甲酸，加入碱性水溶液，水解0.5～4小时，用去离子水透析，冷冻干燥，得到磷酸胆碱化壳聚糖衍生物；
2）将磷酸胆碱化壳聚糖衍生物溶于pH=2～7的酸性或中性水溶液中，利用N-酰化反应引入疏水基团，控制反应温度在10～40℃，反应24～72小时，控制疏水化试剂与磷酸胆碱化壳聚糖衍生物中氨基的摩尔比为0.05～0.6：1；产物经纯化，干燥，得到两亲性磷酸胆碱化壳聚糖衍生物。
步骤1）所述壳聚糖选用脱乙酰度为70％～100％、平均分子质量为5000～100W的壳聚糖；
步骤1）中所述的将壳聚糖改性得到6-O-三苯基甲醚化壳聚糖的改性方法为壳聚糖先后通过N-邻苯二甲酰化和6-OH的三苯基氯甲烷醚化，再用水合肼脱去邻苯二甲酰基得到；
步骤1）所述反应介质优选为二甲基乙酰胺、三乙胺和四氯化碳的混合溶液；其中每100mL二甲基乙酰胺中含有1～10g的6-O-三苯基甲醚化壳聚糖，其中三乙胺、四氯化碳与6-O-三苯基甲醚化壳聚糖的氨基摩尔比例优选为6：4：1；
步骤1）所述双取代胆碱膦酸酯由氯化胆碱和对苯氧基膦酸酯按摩尔比2：1在二甲亚砜/吡啶混合溶剂中反应2小时制得；
步骤1）所述的碱性水溶液优选氨水、氢氧化钾或氢氧化钠水溶液中的一种；pH值优选10～13。
步骤2）所述的酸性水溶液优选乙酸或盐酸水溶液中的一种；
步骤2）所述的磷酸胆碱化壳聚糖衍生物的浓度为5～20g/L。
步骤2）所述的N-酰化反应优选1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）作为偶联剂，将疏水化试剂上的疏水基团通过酰胺键偶联在氨基上。
步骤2）所述的疏水基团为脱氧胆酰基、去羟基胆酰基、胆酰基、胆固醇半琥珀酰基、辛酰基、癸酰基、肉豆蔻酰、棕榈酰基、油酰基或亚油酰基中的至少一种；
步骤2）所述的疏水化试剂优选为脱氧胆酸或胆固醇琥珀酸单酯中的一种；
步骤2）所述的反应温度优选室温。
步骤2）所述的磷酸胆碱化壳聚糖衍生物中氨基、疏水化试剂的羧基和偶联剂的摩尔比优选为—NH2（磷酸胆碱化壳聚糖衍生物）：—COOH（疏水化试剂）：EDC摩尔比为1:0.05～0.6：0.15～0.9。
步骤2）所述的纯化方法优选透析。
步骤2）所述的干燥方法优选冷冻干燥。
步骤（1）中所述的两亲性磷酸胆碱化壳聚糖衍生物溶于水形成的水溶液浓度为0.05～10mg/mL；
步骤（1）中所述的有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈或丙酮中的至少一种，有机溶剂与水之体积比为1:1～19:1；
步骤（2）中所述蛋白质药物为亲水性小肽、疏水性小肽、多肽或蛋白质中的至少一种；
步骤（2）中所述的溶剂为水或适于溶解疏水性蛋白质药物的有机溶剂；所述的适于溶解疏水性蛋白质药物的有机溶剂优选为甲醇、乙醇或乙腈中的至少一种；
步骤（2）中所述的蛋白质药物溶液的浓度优选为0.05～10mg/mL；
步骤（3）中所述加入的两亲性磷酸胆碱化壳聚糖衍生物溶液与蛋白质药物溶液中两亲性磷酸胆碱化壳聚糖衍生物与蛋白质药物质量之比为在1:1～5:1；
步骤（3）中所述的旋转蒸发温度为30～60℃，更高温度容易使蛋白质变性失活；
步骤（3）中所述的旋转蒸发成膜的转速优选为50～300rpm；
步骤（4）中所述的搅拌的时间优选为10～20min；
步骤（4）中所述的离心的转速优选12000～20000rpm；离心时间优选为15～60min；离心处理中温度要求低温，有利于保护蛋白质，优选4℃；
步骤（4）中所述的洗涤优选为去离子水洗涤，洗涤次数为三次，以除去上层清液中未包覆的蛋白质；
步骤（4）中所述的干燥优选为冷冻干燥；
采用上述方法可将蛋白质药物有效地负载到两亲性壳聚糖磷酸胆碱化衍生物中，形成用于蛋白质药物传输的仿生纳米载体系统。
一种用于蛋白质药物传输的仿生纳米载体系统由上述制备方法获得，实现蛋白质药物的高效化利用。
上述用于蛋白质药物传输的仿生纳米载体系统在蛋白质药物制备中应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.本发明根据两亲性壳聚糖仿生衍生物的特点，可与蛋白质药物自组装形成纳米粒子，且制备条件温和，工艺简单。
2.得到的仿生纳米载体系统含有仿细胞膜结构的两性离子磷酸胆碱（PC）基团，可抑制源于非特异性蛋白吸附导致的机体防御机制激活，包括单核吞噬细胞系统的清除作用，改善血液相容性，且有利于保持蛋白质的活性。
附图说明
图1为实施例1制备所得脱氧胆酸-磷酸胆碱-壳聚糖（DCA-PCCs）负载牛血清白蛋白纳米粒子粒径分布图。
图2为实施例2制备所得脱氧胆酸-磷酸胆碱-壳聚糖（DCA-PCCs）负载牛血清白蛋白纳米粒子透射电镜图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1脱氧胆酸-磷酸胆碱-壳聚糖负载牛血清白蛋白的仿生纳米载体系统制备
本实施例以脱氧胆酸-磷酸胆碱-壳聚糖（DCA-PCCs）为原料，其中DCA取代度为1.8%，PC取代度为26%，以牛血清白蛋白（BSA）为模型蛋白药物，制备仿生纳米载体系统，具体步骤如下所示：
其中，所述DCA取代度为1.8%，PC取代度为26%的脱氧胆酸-磷酸胆碱-壳聚糖（DCA-PCCs）的制备方法如下：
1.取1g壳聚糖与2.72g邻苯二甲酸酐在100mL无水二甲基甲酰胺中，氮气保护下，130℃反应8小时，过滤后，清液用冰水沉淀，干燥，获得邻苯二甲酰化壳聚糖。取1g邻苯二甲酰化壳聚糖与9.58g三苯基氯甲烷在25mL无水吡啶中，氮气保护下，90℃反应24小时，用乙醇沉淀，洗涤，加入100mL水合肼，氮气保护，80℃反应16小时，旋干过量水合肼，依次用去离子水、乙醇、乙醚洗涤，干燥得到6-O-三苯基甲醚化壳聚糖（CsTr）。
2.取100mg6-O-三苯基甲醚化壳聚糖（CsTr）溶于8mL无水二甲基乙酰胺，同时加入0.21mL的三乙胺和0.095mL的CCl4；缓慢加入0.38g双取代胆碱膦酸酯，其中CsTr中的氨基与膦酸酯的摩尔比为1：2，室温搅拌反应12小时；旋干溶剂，加入甲酸，室温搅拌2小时；旋干甲酸，加入pH=10的氨水溶液，水解4小时，用去离子水透析，冷冻干燥，得到磷酸胆碱化壳聚糖衍生物（PCCs）；
3.取50mg磷酸胆碱化壳聚糖衍生物溶于8mL1%（w/v）的乙酸溶液中配制溶液A，同时将47.1mg脱氧胆酸和34.5mg1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）溶于20mL甲醇溶液配制溶液B。
4.将B滴入A中，常温反应48小时。
5.分别在甲醇溶液透析1天，在去离子水溶液中透析3天。
6.冻干得脱氧胆酸磷酸胆碱化壳聚糖衍生物（DCA-PC-Cs），其中DCA的取代度为1.8%，PC的取代度为26%。
脱氧胆酸-磷酸胆碱-壳聚糖负载牛血清白蛋白的仿生纳米载体系统制备步骤如下：
（1）称取10mg上述制备的脱氧胆酸-磷酸胆碱-壳聚糖衍生物，分散于10ml超纯水中，电磁搅拌，并超声分散，制备浓度为1mg/mL的溶液，并加入40ml无水乙醇稀释；
（2）称取10mg BSA溶解于10mL超纯水中，电磁搅拌，配置成浓度1mg/ml的BSA溶液；
（3）取2.5mL步骤（2）中制备的溶液，加入步骤（1）制备的溶液中，超声分散1min，溶液旋转蒸发成膜，工艺条件为：温度35℃，转速120rpm，时间约30min；
（4）将步骤（3）中所成膜加入5mL超纯水，常温下电磁搅拌10min得纳米粒子溶液，经20000rpm，30min，4℃离心，沉淀用去离子水洗涤三次，于-46℃下冷冻干燥24h后得到包载蛋白质药物的仿生纳米载体系统。
对上述制备的仿生纳米载体系统加入超纯水分散，采用马尔文激光粒度仪（Malvern3000HSA，英国Malvern公司）对其粒径和电位表征，平均粒径约198nm，Zeta电位9.36mV，如图1所示。
实施例2脱氧胆酸-磷酸胆碱-壳聚糖负载牛血清白蛋白仿生纳米载体系统制备
本实施例以脱氧胆酸-磷酸胆碱-壳聚糖（DCA-PCCs）为原料，其中DCA取代度为6.3%，PC取代度为32%，以牛血清白蛋白（BSA）为模型蛋白药物，制备仿生纳米系统，具体步骤如下所示：
其中，所述DCA取代度为6.3%，PC取代度为32%的脱氧胆酸-磷酸胆碱-壳聚糖（DCA-PCCs）的制备方法如下：
1.取1g壳聚糖与2.72g邻苯二甲酸酐在100mL无水二甲基甲酰胺中，氮气保护下，130℃反应8小时，过滤后，清液用冰水沉淀，干燥，获得邻苯二甲酰化壳聚糖。取1g邻苯二甲酰化壳聚糖与9.58g三苯基氯甲烷在25mL无水吡啶中，氮气保护下，90℃反应24小时，用乙醇沉淀，洗涤，加入100mL水合肼，氮气保护，80℃反应16小时，旋干过量水合肼，依次用去离子水、乙醇、乙醚洗涤，干燥得到6-O-三苯基甲醚化壳聚糖（CsTr）。
2.取100mg6-O-三苯基甲醚化壳聚糖（CsTr）溶于6mL无水二甲基乙酰胺，同时加入0.21mL的三乙胺和0.095mL的CCl4；缓慢加入0.76g双取代胆碱膦酸酯，其中CsTr中的氨基与膦酸酯的摩尔比为1：4，室温搅拌反应12小时；旋干溶剂，加入甲酸，室温搅拌2小时；旋干甲酸，加入pH=10的氨水溶液，水解4小时，用去离子水透析，冷冻干燥，得到磷酸胆碱化壳聚糖衍生物（PCCs）；
3.取50mg磷酸胆碱化壳聚糖衍生物溶于8mL1%（w/v）的乙酸溶液中配制溶液A，同时将51.6mg脱氧胆酸和37.8mg1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）溶于20mL甲醇溶液配制溶液B。
4.将B滴入A中，常温反应48小时。
5.分别在甲醇溶液透析1天，在去离子水溶液中透析3天。
6.冻干得脱氧胆酸磷酸胆碱化壳聚糖衍生物（DCA-PC-Cs），其中DCA的取代度为6.3%，PC的取代度为32%。
脱氧胆酸-磷酸胆碱-壳聚糖负载牛血清白蛋白的仿生纳米载体系统制备步骤如下：
（1）称取10mg上述制备的脱氧胆酸-磷酸胆碱-壳聚糖衍生物，分散于2mL去离子水中，制备浓度为5mg/mL的溶液，并加入6mL无水乙醇稀释；
（2）称取10mg BSA溶解于5ml去离子水中，配置成浓度为2mg/mL的溶液；
（3）取1mL步骤（2）中的溶液,加入到步骤（1）中制备的溶液，超声分散1min，溶液旋转蒸发成膜，工艺条件为：温度40℃，转速120rpm，时间约30min；
（4）将步骤（3）所成膜加1mL去离子水，电磁搅拌10min，得到纳米粒子溶液，经20000rpm，30min，4℃离心，沉淀用去离子水洗涤三次，于-80℃下冷冻干燥24h后得到包载蛋白质药物的仿生纳米载体系统。对上述制备的仿生纳米载体系统加入超纯水分散，采用透射电镜（TECNAI10型，荷兰Philips）观察粒子尺寸和形态，如图2所示，粒子粒径分布在170～380nm之间，近似为球形。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于蛋白质药物传输的仿生纳米载体系统的制备方法，其特征在于具体步骤如下：
（1）将两亲性磷酸胆碱化壳聚糖衍生物溶于水，用有机溶剂稀释，配制成两亲性磷酸胆碱化壳聚糖衍生物溶液；
（2）将蛋白质药物溶解于溶剂中，配制成蛋白质药物溶液；
（3）将步骤（2）配制的蛋白质药物溶液缓慢加入步骤（1）配制的两亲性磷酸胆碱化壳聚糖衍生物溶液中，超声分散，并旋转蒸发成膜；
（4）将步骤（3）所成膜加水搅拌重新分散，得纳米粒子溶液，经离心、沉淀洗涤、干燥，得到用于蛋白质药物传输的仿生纳米载体系统；
步骤（1）中所述两亲性磷酸胆碱化壳聚糖衍生物的分子结构如式I所示：
其中，R为脱氧胆酰基、去羟基胆酰基、胆酰基、胆固醇半琥珀酰基、辛酰基、癸酰基、肉豆蔻酰、棕榈酰基、油酰基或亚油酰基疏水基团中的至少一种；R的取代度为0.8%～12%，磷酸胆碱基团的取代度为20%～90%。
2.根据权利要求1所述的用于蛋白质药物传输的仿生纳米载体系统的制备方法，其特征在于：所述的两亲性磷酸胆碱化壳聚糖衍生物通过下述方法制备获得：
1）将壳聚糖改性得到6-O-三苯基甲醚化壳聚糖，溶于反应介质；加入双取代胆碱膦酸酯，其中6-O-三苯基甲醚化壳聚糖中的氨基与膦酸酯的摩尔比为1：2～10，于0～40℃搅拌反应12～24小时；旋干溶剂，加入甲酸，室温搅拌0.5～2小时；旋干甲酸，加入碱性水溶液，水解0.5～4小时，用去离子水透析，冷冻干燥，得到磷酸胆碱化壳聚糖衍生物；
2）将磷酸胆碱化壳聚糖衍生物溶于pH=2～7的酸性或中性水溶液中，利用N-酰化反应引入疏水基团，控制反应温度在10～40℃，反应24～72小时，控制疏水化试剂与磷酸胆碱化壳聚糖衍生物中氨基的摩尔比为0.05～0.6：1；产物经纯化，干燥，得到两亲性磷酸胆碱化壳聚糖衍生物。
3.根据权利要求2所述的用于蛋白质药物传输的仿生纳米载体系统的制备方法，其特征在于：
步骤1）所述壳聚糖为脱乙酰度70％～100％、平均分子质量5000～100W的壳聚糖；
步骤1）所述的将壳聚糖改性得到6-O-三苯基甲醚化壳聚糖的改性方法为壳聚糖先后通过N-邻苯二甲酰化和6-OH的三苯基氯甲烷醚化，再用水合肼脱去邻苯二甲酰基得到；
步骤1）所述反应介质为二甲基乙酰胺、三乙胺和四氯化碳的混合溶液；其中每100mL二甲基乙酰胺中含有1～10g的6-O-三苯基甲醚化壳聚糖，其中三乙胺、四氯化碳与6-O-三苯基甲醚化壳聚糖的氨基摩尔比为6：4：1；
步骤1）所述双取代胆碱膦酸酯由氯化胆碱和对苯氧基膦酸酯按摩尔比2：1在二甲亚砜/吡啶混合溶剂中反应2小时制得；
步骤1）所述的碱性水溶液为氨水、氢氧化钾或氢氧化钠水溶液中的一种；pH值为10～13。
4.根据权利要求2所述的用于蛋白质药物传输的仿生纳米载体系统的制备方法，其特征在于：步骤2）所述的酸性水溶液为乙酸或盐酸水溶液中的一种；
步骤2）所述的磷酸胆碱化壳聚糖衍生物的浓度为5～20g/L；
步骤2）所述的N-酰化反应为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐作为偶联剂，将疏水化试剂上的疏水基团通过酰胺键偶联在氨基上；
步骤2）所述的疏水基团为脱氧胆酰基、去羟基胆酰基、胆酰基、胆固醇半琥珀酰基、辛酰基、癸酰基、肉豆蔻酰、棕榈酰基、油酰基或亚油酰基中的至少一种；
步骤2）所述的反应温度为室温；
步骤2）所述的磷酸胆碱化壳聚糖衍生物中氨基、疏水化试剂的羧基和偶联剂的摩尔比为1:0.05～0.6：0.15～0.9；
步骤2）所述的纯化方法为透析；
步骤2）所述的干燥方法为冷冻干燥。
5.根据权利要求1所述的用于蛋白质药物传输的仿生纳米载体系统的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述的两亲性磷酸胆碱化壳聚糖衍生物溶于水形成的水溶液浓度为0.05～10mg/mL；
步骤（1）中所述的有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈或丙酮中的至少一种，有机溶剂与水之体积比为1:1～19:1。
6.根据权利要求1所述的用于蛋白质药物传输的仿生纳米载体系统的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述蛋白质药物为亲水性小肽、疏水性小肽、多肽或蛋白质中的至少一种；
步骤（2）中所述的溶剂为水或适于溶解疏水性蛋白质药物的有机溶剂；所述的适于溶解疏水性蛋白质药物的有机溶剂为甲醇、乙醇或乙腈中的至少一种；
步骤（2）中所述的蛋白质药物溶液的浓度为0.05～10mg/mL。
7.根据权利要求1所述的用于蛋白质药物传输的仿生纳米载体系统的制备方法，其特征在于：步骤（3）中所述加入的两亲性磷酸胆碱化壳聚糖衍生物溶液与蛋白质药物溶液中两亲性磷酸胆碱化壳聚糖衍生物与蛋白质药物质量之比为在1:1～5:1；
步骤（3）中所述的旋转蒸发温度为30～60℃；
步骤（3）中所述的旋转蒸发成膜的转速为50～300rpm。
8.根据权利要求1所述的用于蛋白质药物传输的仿生纳米载体系统的制备方法，其特征在于：步骤（4）中所述的搅拌的时间为10～20min；
步骤（4）中所述的离心的转速为12000～20000rpm；离心时间为15～60min；离心温度为4℃；
步骤（4）中所述的洗涤为去离子水洗涤，洗涤次数为三次；
步骤（4）中所述的干燥为冷冻干燥。
9.一种用于蛋白质药物传输的仿生纳米载体系统由权利要求1～8中任一项所述的制备方法获得。
10.权利要求9所述的用于蛋白质药物传输的仿生纳米载体系统在蛋白质药物制备中应用。
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| CN104119479A (zh) * | 2014-07-16 | 2014-10-29 | 四川大学 | 具有细胞膜结构仿生的两亲性接枝聚合物及其制备方法 |
| CN104119479B (zh) * | 2014-07-16 | 2017-01-18 | 四川大学 | 具有细胞膜结构仿生的两亲性接枝聚合物及其制备方法 |
| CN110791798A (zh) * | 2019-11-28 | 2020-02-14 | 中国人民解放军西部战区总医院 | 一种在仿生多孔钛合金表面构建壳聚糖-多聚胆碱磷酸/明胶涂层的方法 |
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| CN103536895B (zh) | 2015-09-09 |
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