TWI580432B - 藥物組成物及其製法 - Google Patents

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Description

藥物組成物及其製法
本發明係關於一種藥物組成物及其製法，尤是關於一種以雙性幾丁聚醣包覆疏水性藥物及親水性藥物的藥物組成物及其製法。
幾丁質(chitin)在自然界中分佈很廣，除了存在於甲殼類動物(如蝦、蟹、昆蟲的外殼)之外，還包括了微生物界(細菌的細胞壁或菇類)及植物界的藻類等。幾丁聚醣(chitosan)[聚(β-1,4-葡萄糖胺)][poly(β-1,4-glucosamine)]又稱殼醣素，是由幾丁質經由不同程度的脫乙醯基反應而得的非均一性聚合體。幾丁聚醣為N-乙醯葡萄糖胺與N-葡萄糖胺為結構單元之共聚合體，而N-葡萄糖胺結構單元在聚合體中之含量通常高於60%以上。由於幾丁聚醣良好的生物相容性(biocompatibility)、無毒性、可生物體內分解(溶菌酶)、價格便宜以及生產原料不虞匱乏等優點，使得幾丁聚醣成為近年來高分子生醫材料中頗受重視的材料。
在習知藥物載體包覆技術中，皆以多殼層的方式包覆兩種以上的抗癌藥物(例如，親水性藥物及疏水性藥物)以 形成奈米粒子，或在此奈米粒子上連結具專一性辨識的抗體/蛋白質/胜肽/多醣類，或加入可以顯影的物質，使該奈米粒子在癌症治療上具有多功能。然而，以多殼層的方式包覆兩種藥物容易產生藥物滲漏、包覆率不佳、製程繁複等問題。另外，如欲以高分子自組裝方式包覆藥物，則難以同時包覆親水性與疏水性的藥物。
因此，如何解決習知之奈米粒子包覆多種藥物需要多個步驟及多種環境的製程問題，提供一個於單一步驟同時包覆親水性與疏水性藥物，以製備載藥粒子，實為一重要課題。
本發明提供一種藥物組成物之製法，係包括：將雙性幾丁聚醣衍生物、至少一種疏水性藥物、至少一種親水性藥物分散於溶劑中，以形成混合溶液，其中，該雙性幾丁聚醣衍生物係經複數親水基和複數疏水基改質，且調配該混合溶液的pH在該親水性藥物及該疏水性藥物不沉澱的範圍；以及攪拌該混合溶液至少12小時後，待該混合溶液的pH介於6至7時，收取該藥物組成物。
本發明進一步提供一種藥物組成物，係包括：雙性幾丁聚醣衍生物，係經複數親水基和複數疏水基改質；至少一種親水性藥物，係包埋於該雙性幾丁聚醣衍生物中，且該至少一種親水性藥物係藉由靜電力吸引該複數親水基；以及至少一種疏水性藥物，係包埋於該雙性幾丁聚醣衍生物中，且集中於該複數疏水基之間。
由上可知，本發明使用具有高度生物相容性的雙性幾丁聚醣高分子作為基底，藉由調整該雙性幾丁聚醣高分子自組裝的溶液環境，達到同時包覆一種或多種相同/不同親疏水性的藥物的目的，並且透過交聯劑將抗體等具有專一性辨識的標靶物質修飾在該藥物粒子的表面，或可以在包覆藥物的同時，包覆具有顯影效果的化合物，使該奈米粒子成為有辨識，顯影及治療等多功能的醫療平台，有效毒殺癌症細胞。
第1圖顯示在不同pH(pH 7.5、pH 8.5、pH 9.5、pH 10.5及pH 11)溶液下之包覆雙藥之奈米粒子的順鉑(CDDP)及去氧甲基薑黃素(DMC)包覆率；第2圖顯示在不同pH(pH 8、pH 8.5及pH 9)溶液下之包覆雙藥之奈米粒子的順鉑及去氧甲基薑黃素包覆率；第3圖顯示包覆雙藥之奈米粒子之穿透式電子顯微鏡圖；第4圖顯示以自由態DMC-CDDP組合、CHC/DMC-CDDP奈米粒子以及CHC/DMC-CDDP/抗-CD133奈米粒子三種不同藥物/載體組合對細胞存活率的影響；以及第5圖顯示以CHC/DMC-CDDP奈米粒子以及CHC/DMC-CDDP/抗-CD133奈米粒子對細胞存活率的影響，其中，X軸係顯示奈米粒子中之DMC及CDDP含量。
以下係藉由特定的具體實施例說明本發明之實施方式，熟習此專業之人士可由本說明書所揭示之內容輕易地瞭解本發明之優點及功效。本發明亦可藉由其它不同之實施方式加以施行或應用，本說明書中的各項細節亦可基於不同觀點與應用，在不悖離本發明所揭示之精神下賦予不同之修飾與變更。
於本說明書中，術語「一鍋合成法(one-pot synthesis)」意指在一個自組裝反應中，使反應物(例如：雙性幾丁聚醣)包覆親水性與疏水性藥物，以提高反應效率，此法可以避免冗長的分離和純化後處理過程，從而節省時間與資源並且提高收率。
本發明提供一種藥物組成物之製法，係包括：將雙性幾丁聚醣衍生物、至少一種疏水性藥物、至少一種親水性藥物分散於例如水之溶劑中，以形成混合溶液，其中，該雙性幾丁聚醣衍生物係經複數親水基和複數疏水基改質，且調配該混合溶液的pH在該親水性藥物及該疏水性藥物不沉澱的範圍；以及攪拌該混合溶液12小時後，且待該混合溶液的pH介於6至7時，收取該藥物組成物。
根據本發明之一具體實施例，係攪拌該混合溶液12至24小時。
根據本發明之一具體實施例，本發明製法中，雙性幾丁聚醣衍生物之重量百分比範圍為0.01wt%至2wt%，所使用之疏水性藥物之濃度範圍為大於0至3mM，所使用之親水性藥物之濃度範圍為大於0至3mM。
幾丁聚醣之羥基(-OH)及胺基(-NH2)官能基是一個相當容易進行修飾的區塊。通常，係以幾丁聚醣為骨架(backbone)，將其羥基端修飾成具有親水性，將其胺基端修飾成具有疏水性。由於修飾改質的技術係為習知，故不再贅述其改質方法。
於前述製法之一實施例中，係調配該混合溶液的pH在該親水性藥物及疏水性藥物不沉澱的範圍。通常，係令該混合溶液微鹼性，具體而言，藉由添加鹼性水溶液，亦即添加pH在8以上之鹼性水溶液，例如，pH在8.5至12.5，其中，以pH在9至10的範圍為佳，以調配該混合溶液的pH在該親水性藥物及該疏水性藥物不沉澱的範圍。
於前述製法之一實施例中，係先將疏水性藥物加入雙性幾丁聚醣衍生物之水溶液，再加入鹼性水溶液，最後加入親水性藥物，以調配該混合溶液的pH在該親水性藥物及該疏水性藥物不沉澱的範圍，其中，該鹼性水溶液pH在8.5至12.5的範圍，以pH在9.0至10.0的範圍為佳。
調配該混合溶液在鹼性下，或添加鹼可使該雙性幾丁聚醣衍生物結構上之親水基上之H+游離出，而該雙性幾丁聚醣衍生物結構上之親水基，例如，COO-會因靜電力吸引而連結帶正電荷之藥物，例如親水性藥物順鉑，同時，因該靜電力吸引親水性藥物，相對地，則由該雙性幾丁聚醣衍生物結構上之疏水基，例如，己醯基團包覆如去甲氧基薑黃素之疏水性藥物；最後，根據此自組裝反應形成複數粒子形式之藥物組成物。
在包覆藥物完成後，整體溶液的pH值為6至7，較佳為pH 6.7，所製備之藥物載體粒子為中性，不須額外進行中和反應或純化步驟即可使用。根據本發明之一具體實施例，該藥物組成物係為複數粒子。此外，本發明之製法復可包括使用交聯劑連接標靶物質於該複數粒子表面。在非限制性實例中，該標靶物質係可選自抗體、胜肽及蛋白質所組成群組之至少一者。
於一具體實施例中，該交聯劑係可選自下列所組成群組之至少一種化合物：1-乙基-(3-二甲基胺基丙基)碳醯二亞胺(EDC)及羥基琥珀亞胺。
根據本發明製法之一具體實施例，復包括使顯影化合物分散於該溶液中，而該顯影化合物係螢光化合物或有機金屬顯影劑。
根據本發明之一具體實施例，該雙性幾丁聚醣衍生物係具有下式(I)結構之複數重複單元：
其中，R1各自獨立為氫、C1至C4烷基或C1至C6羧基，R2各自獨立為氫、C1至C12烷基、C1至C6羧基或C2至C12醯基，且m為介於100至2000間之整數。
其中，具有R1選自C1至C4烷基及C1至C6羧基的重複單元數量為20至2000；具有R2選自C1至C12烷基、C1至C6羧基或C2至C12醯基的重複單元數量為20至 2000。
根據本發明之一具體實施例，本發明所使用之幾丁聚醣衍生物係為如下式(II)所示：
其中，R3係各自獨立為C5~C11烷基，且x、y、z、n、及p係各自獨立為介於20至2000之整數。
根據本發明之一具體實施例，本發明所使用之疏水性藥物係選自，但不限於，下列所組成群組之至少一者：紫杉醇(Taxol)、喜樹鹼(Camptothecin)、去甲氧基薑黃素(Demethoxycurcumin，DMC)、托普樂肯(Topotecan)、環孢靈素(Cyclosporine A)、泛艾黴素(Epirubicin)及雷帕霉素(Rapamycin)。
根據本發明之一具體實施例，本發明所使用之親水性藥物係選自，但不限於，下列所組成群組之至少一者：順鉑(Cisplatin，CDDP)、阿黴素(Doxorubicin)、奧沙利鉑(Oxaliplatin)、卡鉑(Carboplatin)、奈達鉑(Nedaplatin)及賽特鉑(Satrapiatin)。
本發明復提供一種藥物組成物，係包括：雙性幾丁聚醣衍生物，係經複數親水基和複數疏水基改質；至少一種親水性藥物，係包埋於該雙性幾丁聚醣衍生物中，且該至 少一種親水性藥物係藉由靜電力吸引該複數親水基；以及至少一種疏水性藥物，係包埋於該雙性幾丁聚醣衍生物中，且集中於該複數疏水基之間。
根據本發明之一具體實施例，該藥物組成物係為複數粒子。根據本發明之另一具體實施例，該複數粒子之粒徑大小係於50nm至300nm範圍內。
根據本發明之一具體實施例，本發明之藥物組成物係用於抑制癌細胞生長，其中，係用於抑制非小細胞肺癌細胞、卵巢癌細胞、睪九癌細胞、膀胱癌細胞、子宮頸癌細胞及肺癌細胞所組成群組之至少一種癌細胞生長。
根據本發明之一具體實施例，本發明之藥物組成物可使用冷凍乾燥、減壓濃縮、真空乾燥的方式去除溶劑及水分。
本發明將以下述實施例來作進一步說明，但應了解到該等實施例僅為例示說明之用，而不應被解釋為限制本發明的實施。
實施例 實施例1：製備疏水性己醯基修飾及親水性羧甲酸修飾之雙性幾丁聚醣衍生物
首先，於室溫下將5克(g)幾丁聚醣(Mw=215,000g/mol，去乙醯度為80至90%，係購自Adrich-Sigma)懸浮於異丙醇(50毫升(mL))中，並攪拌30分鐘。將所得之懸浮液緩慢地與氫氧化鈉水溶液(12.5mL)混合得一混合溶 液，且藉由調整混合溶液中氫氧化鈉濃度可控制親水性官能基之嫁接量。在此，混合溶液中含有13.3M之氫氧化鈉。接著，將此混合溶液與氯乙酸(chloroacetic acid)反應，以製得水溶性之親水性羧甲酸修飾之幾丁聚醣(carboxymethyl-modified chitosan)，並乾燥之。
取2g乾燥之親水性羧甲酸修飾之幾丁聚醣溶解於純水(50mL)中，並攪拌24小時。接著，將所得之溶液與甲醇(50mL)混合，再添加0.2M之己酸酐得一反應溶液。於室溫下反應20小時後，收集反應溶液並以乙醇水溶液(25% v/v)透析24小時，乾燥後收集產物可得到疏水性己醯基修飾及親水性羧甲酸修飾雙性之雙性幾丁聚醣衍生物，其結構如下式(II)所示。同時，利用1H NMR光譜及N含量之元素分析，以確認幾丁聚醣衍生物中取代基之位置及己醯基嫁接量。於本實施例中，己醯基嫁接量為13%。
實施例2 利用雙性幾丁聚醣衍生物包覆藥物
秤取0.5毫克(mg)之實施例1所製備之雙性幾丁聚醣粉末，加入200微升(μL)0.1%的去氧甲基薑黃素(溶於甲 醇)，利用震盪器稍做混合後，加入540μL的二次水，再加入60μL之pH 10.5的二次水，最後加入200μL之0.1%的順鉑(cisplatin)(溶於水)，攪拌12個小時以製備包覆雙藥(包含去氧甲基薑黃素以及順鉑)之奈米粒子。
實施例3 包覆雙藥之奈米粒子的包覆率測試
將合成好之包覆雙藥之奈米粒子放入濃縮離心管中，以轉速4000rpm離心30分鐘。
(1).順鉑包覆率
將濃縮離心管下清液稀釋20倍，與0.14%鄰苯二胺的二甲基甲醯胺溶液以1：1的比例混合，以攝氏100℃加熱30分鐘後，放入-20℃冰箱10分鐘進行冷卻，最後將溶液以UV-可見光檢測波長705nm處的峰值，換算後得知未包覆的順鉑含量，進而得知順鉑包覆率。
(2).去氧甲基薑黃素包覆率測試
將濃縮離心管濾膜上的奈米粒子以二次水回溶，將此溶液和甲醇以1：1的比例混合，利用HPLC進行分析。在流速1mL/min下利用C18做為固定相，乙腈和0.3%FA(50：50,v/v)做為流動相，在波長為425nm的條件下進行檢測，並且換算去氧甲基薑黃素的濃度來得知包藥率。
如第1圖所示，其結果顯示當混合有雙性幾丁聚醣衍生物、親水性藥物及該疏水性藥物的水溶液的pH值越高，增加順鉑的包覆率，但去氧甲基薑黃素的包覆率則隨pH值越高，包覆率則降低。由於去氧甲基薑黃素在鹼性環境 下容易失去藥物活性而沉澱，因此，將水溶液的pH值調配在pH 8.0至9.0之間為佳。
如第2圖所示，其結果顯示當水溶液的pH值在9.0時有最佳的雙藥包覆率，並且測量在包覆完成後整個溶液的pH值為6.7。
實施例4 連結抗體於包覆雙藥之奈米粒子
將適量抗體(抗-CD133)與0.01% 50μL交聯劑(EDC)加入上述包覆雙藥之奈米粒子溶液中，攪拌五小時，將抗體連結至上述包覆雙藥之奈米粒子表面上，所製備完成之包覆雙藥之奈米粒子的直徑為190nm。如下表1所示為雙性幾丁聚醣奈米粒子(以下簡稱CHC)、包覆雙藥之奈米粒子(以下簡稱CHC/DMC-CDDP)以及連接抗體之包覆雙藥之奈米粒子(以下簡稱CHC/DMC-CDDP-抗體)的直徑大小以及表面電位(zeta potential)。
如第3圖所示，進一步以穿透式電子顯微鏡觀察連接抗體之包覆雙藥之奈米粒子。
實施例5 以本發明之CHC/DMC-CDDP以及CHC/DMC-CDDP-抗體之奈米粒子毒殺癌細胞之細胞存活率試驗
培養肺癌幹細胞(A549-ON)於24孔盤，每孔有1×105個細胞，並將配置好不同劑量的自由態DMC-CDDP組合(free drug)(第4圖中由左至右之劑量為：3.25-75g/mL、7.5-150g/mL、7.5-300g/mL、15-300g/mL及20-600g/mL)、CHC/DMC-CDDP奈米粒子(第4圖中由左至右之劑量為：1.25-95g/mL、3-125g/mL、5-200g/mL、6-250g/mL及9-265g/mL)及CHC/DMC-CDDP/抗-CD133奈米粒子(第4圖中由左至右之劑量為：1.25-95g/mL、3-125g/mL、5-200g/mL、6-250g/mL及9-265g/mL)給予肺癌幹細胞並培養24小時之後，以3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四氮唑(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)，以下簡稱MTT)分析細胞存活率。第4圖為三種不同藥物/載體組合對細胞存活率的影響，如第4圖所示，Y軸為組合指數(combination index，以下簡稱CI)，當該CI值小於1時，代表有協同效應；Fa代表細胞死亡率，當數值越接近1時代表細胞死亡率越高，可以達到更好的毒殺癌細胞效果。由第4圖可知，沒有經過CHC包覆的藥物(亦即自由態DMC-CDDP組合)並沒有協同效應，無法同時使用雙藥來提升毒殺癌細胞的效果；再經由CHC包覆的雙藥，明顯在部分劑量(CHC/DMC-CDDP：6-250g/mL及9-265g/mL；CHC/DMC-CDDP/抗-CD133：5-200g/mL、6-250 g/mL及9-265g/mL)上有雙藥協同效應出現，並且提供好的毒殺癌細胞效果。第5圖為以CHC/DMC-CDDP奈米粒子以及CHC/DMC-CDDP/抗-CD133奈米粒子對細胞存活率的影響，亦即，以CHC包覆雙藥有接上/未接上抗體奈米粒子毒殺肺癌幹細胞的效果；由第5圖可知，以CHC/DMC-CDDP/抗-CD133奈米粒子(嫁接上抗體)可以有效地降低肺癌幹細胞存活率。
上述實施例僅例示性說明本發明之原理及其功效，而非用於限制本發明。任何熟習此項專業之人士均可在不違背本發明之精神及範疇下，對上述實施例進行修飾與改變。因此，舉凡所屬技術領域中具有此項專業知識者，在未脫離本發明所揭示之精神與技術原理下所完成之一切等效修飾或改變，仍應由後述之申請專利範圍所涵蓋。

Claims (15)

  1. 一種藥物組成物之製法，係包括：將雙性幾丁聚醣衍生物、至少一種疏水性藥物、至少一種親水性藥物分散於溶劑中，以形成混合溶液，其中，該雙性幾丁聚醣衍生物係經複數親水基和複數疏水基改質，且調配該混合溶液的pH在該親水性藥物及該疏水性藥物不沉澱的範圍；以及攪拌該混合溶液至少12小時後，待該混合溶液的pH介於6至7時，收取該藥物組成物，使該藥物組成物之該疏水性藥物及該親水性藥物係包埋於該雙性幾丁聚醣衍生物中；其中，經該複數親水基和複數疏水基改質之該雙性幾丁聚醣衍生物係為如下式(II)所示： 其中，R3係各自獨立為C5~C11烷基，且x、y、z、n、及p係各自獨立為介於20至2000之整數。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之製法，其中，藉由添加pH在8.5至12.5之水溶液以調配該混合溶液的pH在該親水性藥物及該疏水性藥物不沉澱的範圍。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之製法，其中，藉由添加pH在9.0至10.0之水溶液以調配該混合溶液的pH在 該親水性藥物及該疏水性藥物不沉澱的範圍。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之製法，其中，該藥物組成物係為複數粒子。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之製法，復包括使用交聯劑連接標靶物質於該複數粒子表面。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之製法，其中，該標靶物質係選自抗體、胜肽及蛋白質所組成群組之至少一者。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之製法，復包括使顯影化合物分散於該溶液中。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之製法，其中，該顯影化合物係螢光化合物或有機金屬顯影劑。
  9. 一種藥物組成物，包含：雙性幾丁聚醣衍生物，係經複數親水基和複數疏水基改質，而為如下式(II)所示： 其中，R3係各自獨立為C5~C11烷基，且x、y、z、n、及p係各自獨立為介於20至2000之整數；至少一種親水性藥物，係包埋於該雙性幾丁聚醣衍生物中，且該至少一種親水性藥物係藉由靜電力吸引該複數親水基；以及至少一種疏水性藥物，係包埋於該雙性幾丁聚醣 衍生物中，且集中於該複數疏水基之間。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之藥物組成物，其中，該藥物組成物係為複數粒子。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之藥物組成物，其中，該複數粒子之粒徑大小係於50nm至300nm範圍。
  12. 如申請專利範圍第10項所述之藥物組成物，復包括交聯劑及藉由交聯劑連接於該複數粒子表面之標靶物質。
  13. 如申請專利範圍第12項所述之藥物組成物，該標靶物質係選自抗體、胜肽及蛋白質所組成群組之至少一者。
  14. 如申請專利範圍第9項所述之藥物組成物，其係用於抑制癌細胞生長。
  15. 如申請專利範圍第14項所述之藥物組成物，其係用於抑制非小細胞肺癌細胞、卵巢癌細胞、睪丸癌細胞、膀胱癌細胞、子宮頸癌細胞及肺癌細胞所組成群組之至少一種癌細胞生長。
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