CN104324372A - 新城疫弱毒苗o-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒缓释剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
新城疫弱毒苗O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒缓释剂的制备方法,涉及一种新城疫弱毒苗纳米粒缓释剂的制备方法。是要解决现有壳聚糖纳米粒聚合物存在药物包封率低、稳定性差、释药时间短的问题。方法:一、O-2′-HACC的合成:A、N-苯亚甲基壳聚糖的合成;B、O-季铵盐-N-苯亚甲基壳聚糖的合成;C、O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成;D、样品精制;二、NDV/La Sota-O-2′-HACC-NPs的制备。本发明制备的NDV/La Sota-O-2′-HACC-NPs粒径容易控制,平均粒径为303.5nm,平均电位为+46.36mv,包封率可达95.68%。用于生物医药领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种新城疫弱毒苗纳米粒缓释剂的制备方法。
背景技术
壳聚糖以其独特的结构使壳聚糖及其壳聚糖衍生物在医药、农业、食品及非食品工业方面都有广泛的用途,被认为是一种新型的发挥高超功能的生理学材料所有这些用途源于它们多样的生物学功能特别是生物相容性和完整的降解能力及降解过程中代谢产物极低的毒性。
近年来,对载药可降解生物材料壳聚糖微胶囊的研究取得了重大进展,成为了蛋白类和核酸类等药物递送领域研究的重要发展方向,但此类递送载体仍存在下列问题。壳聚糖的溶解性较差,不溶于水和有机溶剂,仅在稀酸中少量溶解,而在酸性条件制备壳聚糖纳米药物势必对蛋白类和核酸类等药物的生物活性产生影响,这一定程度上限制了纳米药物的产业化制备。因此,对壳聚糖予以改性,改善壳聚糖的水溶性,在适宜(或不影响药物生物活性)条件下制备纳米药物急需研究的课题。壳聚糖是一种亲水性物质,它仅能包裹一些亲水性大分子,而对于疏水性药物,壳聚糖要作为载体还存在难度。
疏水性强的纳米粒易与肠上皮细胞进行生物粘附,而离子化和具有强亲水链表面的纳米粒不易被胃肠道粘膜粘附。疏水性强的纳米粒易于被摄取,因为疏水性纳米粒易于被生物粘附。
发明内容
本发明是要解决现有壳聚糖纳米粒聚合物存在药物包封率低、稳定性差、释药时间短的问题,提供一种新城疫弱毒苗O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒缓释剂的制备方法。
本发明新城疫弱毒苗O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒缓释剂的制备方法,按以下步骤进行:
一、O-2′-HACC的合成:
A、N-苯亚甲基壳聚糖的合成
将3-6g壳聚糖粉末溶于100-200mL体积百分浓度5%~15%的醋酸溶液中,在室温下加入30-80mL无水乙醇,边滴加边搅拌,然后逐滴加入10-20g苯甲醛,30min内加完,边滴加边搅拌,得溶液;向溶液中滴加1.0~2.0mol/L NaOH溶液将溶液调至中性,真空抽滤析出沉淀,然后用甲醇多次洗涤沉淀除去未反应的苯甲醛,将沉淀于35~50℃烘箱中放置20h,得纤维状浅黄色固体N-苯亚甲基壳聚糖;
B、O-季铵盐-N-苯亚甲基壳聚糖的合成
将30-80mL异丙醇和6-18g 2,3-环氧丙基三甲基氯化铵(ETA)混合制成ETA的异丙醇溶液,取1.5-5.6g N-苯亚甲基壳聚糖置于圆底烧瓶中,然后逐滴加入ETA的异丙醇溶液,在N2保护条件下于60~85℃水浴搅拌反应12~20h,过滤,依次用甲醇和丙酮洗涤沉淀,得乳白色固状物O-季铵盐-N-苯亚甲基壳聚糖;
C、O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成
向40-60mL 0.2-0.5mol/L氯化氢乙醇溶液中加入2-5g O-季铵盐-N-苯亚甲基壳聚糖,室温搅拌24h后,减压蒸馏20min,得胶状物;然后向胶状物中加入10-30mL蒸馏水充分溶解,再用丙酮沉淀,过滤,得固体,固体于80℃烘箱中烘干,得浅灰色固状物O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖(O-2′-HACC);
D、样品精制
取O-2′-HACC溶于去离子水中,用足量的丙酮进行沉淀,3G砂芯漏斗抽滤,所得沉淀溶于蒸馏水中,置于透析袋中透析48h,每隔6h更换一次蒸馏水,待浓缩到2mL时,加入足量的丙酮重新沉淀,抽滤,所得固体真空干燥,得到精制的样品O-2′-HACC;
二、NDV/La Sota-O-2′-HACC-NPs的制备:
a、取O-2′-HACC溶于去离子水中配制成浓度为0.5-2mg/mL的O-2′-HACC溶液,然后取5mL O-2′-HACC溶液并滴加1.25-7.5mL新城疫La Sota株病毒液,磁力搅拌3min,获得溶液A;
b、溶液A在室温、无菌条件下以900-1300r/min磁力搅拌30s,然后滴加3.5mL浓度为0.5-3mg/mL的三聚磷酸钠,维持在5min内匀速滴完,继续磁力搅拌5-30min,再滴加1mL的PBS,维持在5min内匀速滴完,继续磁力搅拌5-30min,然后滴加1mL的司班-80,维持在5min内匀速滴完,继续磁力搅拌5-30min,获得溶液B;
c、将溶液B于4℃、8000-13000r/min离心10-30min,取沉淀并用PBS洗三次,然后加入浓度为0.01mol/L的PBS悬浮,获得NDV/La Sota-O-2′-HACC-NPs悬液;
d、在NDV/La Sota-O-2′-HACC-NPs悬液中加入质量浓度为5%的蔗糖脱脂奶,真空冷冻干燥24h,获得新城疫弱毒苗O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒缓释剂。
本发明的目的是提供一种采用氨基保护法将壳聚糖N上的氨基保护,2,3-环氧丙基三甲基氯化铵(ETA)与壳聚糖O上的氨基开环反应合成O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖(O-2′-hydroxypropyltrimcthyl ammonium chloride chitosan,O-2′-HACC),并利用O-2′-HACC负载新城疫La Sota株病毒液,制备新城疫La Sota弱毒苗O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒缓释剂(NDV/La Sota-O-2′-HACC-NPs)。
与壳聚糖纳米粒子相比,本发明制备的NDV/La Sota-O-2′-HACC-NPs粒径容易控制,平均粒径为303.5nm,平均电位为+46.36mv,包封率可达95.68%。
本发明所使用的壳聚糖来源丰富,季铵化原料2,3-环氧丙基三甲基氯化铵(ETA)已有工业化生产,生产成本低,适宜大规模生产。使用本方法合成的O-2′-HACC水溶性良好。
本发明对壳聚糖进行了改性,得到了带有正电荷的壳聚糖季铵盐O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖(O-2′-hydroxypropyltrimcthyl ammonium chloride chitosan,O-2′-HACC)作为制备载药微胶囊的生物材料。O-2′-HACC在水中及醇溶剂中均具有良好的水溶性,且与模型药物新城疫病毒(NDV)La Sota株病毒液通过离子交联的方法进行更好的结合,得到了新城疫La Sota弱毒苗O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒缓释剂(NDV/LaSota-O-2′-HACC-NPs)。NDV/La Sota-O-2′-HACC-NPs制备工艺简便,易操作,制备过程中所需溶剂均为常用试剂,容易获得,成本低,后续处理也较为简单。O-2′-HACC-NPs带正电荷具有黏膜渗透性和生物黏附性,可以使抗原穿过黏膜屏障与黏膜下的淋巴细胞产生作用,也可以延长其抗原与黏膜的作用时间,延缓抗原被清除。
本发明的创新点是将带有正电荷的壳聚糖季铵盐O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖制成缓释纳米粒,并包裹新城疫病毒。壳聚糖纳米粒聚合物具有药物包封率高、稳定性强、释药时间长等优点。药物通过溶解和包裹位于材料内部,或通过吸附和附着作用位于材料表面。本发明的合成方法方便、可塑性好,具有弱碱性,可减少药物对肠胃的刺激;同时也增加了壳聚糖表面的亲水性,延长了纳米粒子在体内的循环时间,从而达到缓释目的,此结果也在体外释放实验中得到证明。
附图说明
图1为接枝季铵化改性法合成O-2′-HACC的主要反应过程;
图2为实施例1中壳聚糖和O-2′-HACC的傅立叶转换红外线光谱分析;
图3为实施例1中合成的O-2′-HACC的1H NMR谱图;
图4为实施例1中合成的O-2′-HACC的XRD谱图;
图5为实施例1中合成的O-2′-HACC的取代度测定;
图6为实施例1中合成的O-2′-HACC和壳聚糖溶液的透光率对pH的依赖关系;
图7为实施例1制备的NDV/La Sota-O-2′-HACC-NPs的释放曲线图;
图8为实施例1制备的NDV/La Sota-O-2′-HACC-NPs的透射电镜图;
图9为实施例1制备的NDV/La Sota-O-2′-HACC-NPs的Zeta电位图;
图10为实施例1制备的NDV/La Sota-O-2′-HACC-NPs的粒径分布图。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式,还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一:本实施方式新城疫弱毒苗O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒缓释剂的制备方法,按以下步骤进行:
一、O-2′-HACC的合成:
A、N-苯亚甲基壳聚糖的合成
将3-6g壳聚糖粉末溶于100-200mL体积百分浓度5%~15%的醋酸溶液中,在室温下加入30-80mL无水乙醇,边滴加边搅拌,然后逐滴加入10-20g苯甲醛,30min内加完,边滴加边搅拌,得溶液;向溶液中滴加1.0~2.0mol/L NaOH溶液将溶液调至中性,真空抽滤析出沉淀,然后用甲醇多次洗涤沉淀除去未反应的苯甲醛,将沉淀于35~50℃烘箱中放置20h,得纤维状浅黄色固体N-苯亚甲基壳聚糖;
B、O-季铵盐-N-苯亚甲基壳聚糖的合成
将30-80mL异丙醇和6-18g 2,3-环氧丙基三甲基氯化铵(ETA)混合制成ETA的异丙醇溶液,取1.5-5.6g N-苯亚甲基壳聚糖置于圆底烧瓶中,然后逐滴加入ETA的异丙醇溶液,在N2保护条件下于60~85℃水浴搅拌反应12~20h,过滤,依次用甲醇和丙酮洗涤沉淀,得乳白色固状物O-季铵盐-N-苯亚甲基壳聚糖;
C、O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成
向40-60mL 0.2-0.5mol/L氯化氢乙醇溶液中加入2-5g O-季铵盐-N-苯亚甲基壳聚糖,室温搅拌24h后,减压蒸馏20min,得胶状物;然后向胶状物中加入10-30mL蒸馏水充分溶解,再用丙酮沉淀,过滤,得固体,固体于80℃烘箱中烘干,得浅灰色固状物O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖(O-2′-HACC);
D、样品精制
取O-2′-HACC溶于去离子水中,用足量的丙酮进行沉淀,3G砂芯漏斗抽滤,所得沉淀溶于蒸馏水中,置于透析袋中透析48h,每隔6h更换一次蒸馏水,待浓缩到2mL时,加入足量的丙酮重新沉淀,抽滤,所得固体真空干燥,得到精制的样品O-2′-HACC;
二、NDV/La Sota-O-2′-HACC-NPs的制备:
a、取O-2′-HACC溶于去离子水中配制成浓度为0.5-2mg/mL的O-2′-HACC溶液,然后取5mL O-2′-HACC溶液并滴加1.25-7.5mL新城疫La Sota株病毒液,磁力搅拌3min,获得溶液A;
b、溶液A在室温、无菌条件下以900-1300r/min磁力搅拌30s,然后滴加3.5mL浓度为0.5-3mg/mL的三聚磷酸钠,维持在5min内匀速滴完,继续磁力搅拌5-30min,再滴加1mL的PBS,维持在5min内匀速滴完,继续磁力搅拌5-30min,然后滴加1mL的司班-80,维持在5min内匀速滴完,继续磁力搅拌5-30min,获得溶液B;
c、将溶液B于4℃、8000-13000r/min离心10-30min,取沉淀并用PBS洗三次,然后加入浓度为0.01mol/L的PBS悬浮,获得NDV/La Sota-O-2′-HACC-NPs悬液;
d、在NDV/La Sota-O-2′-HACC-NPs悬液中加入质量浓度为5%的蔗糖脱脂奶,真空冷冻干燥24h,获得新城疫弱毒苗O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒缓释剂。
该发明采取新城疫病毒La Sota株病毒液作为模型药物。
具体实施方式二:本实施方式与具体实施方式一不同的是:步骤一A中壳聚糖的脱乙酰度大于85%。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三:本实施方式与具体实施方式一或二不同的是:步骤二a中新城疫La Sota株病毒液的病毒含量为200μg/mL。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四:本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是:步骤二d中NDV/La Sota-O-2′-HACC-NPs悬液与蔗糖脱脂奶的体积比为1∶1。其它与具体实施方式一至三之一相同。
实施例1:
本实施例新城疫弱毒苗O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒缓释剂的制备方法,按以下步骤进行:
一、O-2′-HACC的合成:
A、N-苯亚甲基壳聚糖的合成
将3.0g壳聚糖粉末溶于120mL体积百分浓度10%的醋酸溶液中,在室温下缓慢加入60mL无水乙醇,边滴加边搅拌,然后逐滴加入15.8g苯甲醛,30min内加完,边滴加边搅拌,得溶液;向溶液中缓慢滴加1.2mol/L NaOH溶液将溶液调至中性,真空抽滤析出沉淀,然后用甲醇多次洗涤沉淀除去未反应的苯甲醛,将沉淀于40℃烘箱中放置20h,得纤维状浅黄色固体N-苯亚甲基壳聚糖;
B、O-季铵盐-N-苯亚甲基壳聚糖的合成
将50mL异丙醇和9.0g 2,3-环氧丙基三甲基氯化铵(ETA)混合制成ETA的异丙醇溶液,取2.75g N-苯亚甲基壳聚糖置于圆底烧瓶中,然后逐滴加入ETA的异丙醇溶液,在N2保护条件下于70℃水浴搅拌反应16h,过滤,依次用甲醇和丙酮洗涤沉淀,得乳白色固状物O-季铵盐-N-苯亚甲基壳聚糖;
C、O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成
向50mL 0.25mol/L氯化氢乙醇溶液中加入3.0g O-季铵盐-N-苯亚甲基壳聚糖,室温搅拌24h后,减压蒸馏20min,得胶状物;然后向胶状物中加入15mL蒸馏水充分溶解,再用丙酮沉淀,过滤,得固体,固体于80℃烘箱中烘干,得浅灰色固状物O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖(O-2′-HACC);
D、样品精制
取1.0g O-2′-HACC溶于20mL去离子水中,用足量的丙酮进行沉淀,3G砂芯漏斗抽滤,沉淀溶于10mL蒸馏水中,置于透析袋中透析48h,每隔6h更换一次蒸馏水,待浓缩到2mL时,加入足量的丙酮重新沉淀,抽滤,所得固体真空干燥,得到精制的样品O-2′-HACC;
二、NDV/La Sota-O-2′-HACC-NPs的制备:
1)取O-2′-HACC溶于去离子水中配制成浓度为1.2mg/mL的O-2′-HACC溶液,然后取5mL O-2′-HACC溶液并滴加6mL新城疫La Sota株病毒液,磁力搅拌3min,获得溶液A;
2)溶液A在室温、无菌条件下以1200r/min磁力搅拌30s,然后滴加3.5mL浓度为1.5mg/mL的三聚磷酸钠(TPP),维持在5min内匀速滴完,继续磁力搅拌15min,再滴加1mL的PBS,维持在5min内匀速滴完,继续磁力搅拌15min,然后滴加1mL的司班-80,维持在5min内匀速滴完,继续磁力搅拌15min,获得溶液B;
3)将溶液B于4℃、12000r/min离心20min,取沉淀并用PBS洗三次,然后加入浓度为0.01mol/L的PBS悬浮,获得NDV/La Sota-O-2′-HACC-NPs悬液;
4)在NDV/La Sota-O-2′-HACC-NPs悬液中加入质量浓度为5%的蔗糖脱脂奶,真空冷冻干燥24h,获得新城疫弱毒苗O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒缓释剂。NDV/LaSota-O-2′-HACC-NPs悬液与蔗糖脱脂奶的体积比为1∶1。所述蔗糖脱脂奶中含1%(质量浓度)海藻糖。
步骤二1)中新城疫La Sota株病毒液的病毒含量为200μg/mL,新城疫La Sota株病毒液中病毒粒子为20-300nm。
与壳聚糖纳米粒子相比,本实施例制备的NDV/La Sota-O-2′-HACC-NPs粒径容易控制,平均粒径为303.5nm,平均电位为+46.36mv,包封率可达95.68%。
步骤一合成O-2′-HACC的主要反应过程如图1所示。
壳聚糖和O-2′-HACC的傅立叶转换红外线光谱分析结果如图2所示,图2中a为壳聚糖,b为O-2′-HACC,C在1432cm-1处出现-CH2-,-CH3的C-H弯曲振动强吸收峰,说明在O上引入了季铵盐侧链。壳聚糖中C2上的氨基及C3和C6上的羟基理论上均可发生取代反应,但C2上的羟基为仲醇羟基,不活泼,亲核取代反应不容易进行。C2上氨基又与苯甲醛形成Schiff碱受到保护。C6-OH为伯醇羟基,故取代反应主要发生在C6羟基上,生成了C6氧上取代的季铵盐壳聚糖。
步骤一合成的O-2′-HACC的1H NMR谱图如图3所示,图3中δ=3.226ppm与季铵盐氮上三个甲基质子对应,低场δ=4.550ppm与吡喃苷杂环C1上质子对应,高场δ=2.527、3.580、3.630、3.645ppm分别对应于杂环C2、C3、C4和C5质子,δ=3.715ppm与C6质子对应。δ=2.672、3.414ppm分别与C和C质子对应。δ=4.223ppm与C质子及羟基质子对应。δ=2.214ppm与-NH2中的质子对应,而其余δ=2.049ppm与壳聚糖中可能残留的少量乙酰基质子对应。
步骤一合成的O-2′-HACC的XRD谱图如图4所示,图4中a为壳聚糖,b为O-2′-HACC。图4中在2θ为20.86°附近,衍射吸收峰强度明显降低,在2θ为10°左右的衍射峰几乎消失。说明由于季铵盐基团的引入削弱了壳聚糖分子的氢键的作用,使壳聚糖原有的晶态结构遭到破坏,因而结晶峰消失,然而水分子更容易接近这种松散的无定形状态的大分子,改性后的壳聚糖衍生物中含有的亲水基团可以与水分子再次形成氢键,因而溶解度增加,因此具有较好的水溶性。
步骤一合成的O-2′-HACC的取代度测定如图5所示,图5中,根据Ag++Cl-→AgCl原理,用AgNO3溶液滴定O-2′-HACC溶液中的Cl-,记录AgNO3体积V及电导率k,由于反应生成AgCl沉淀使Cl-逐渐减少导致电导率k也减小,当Cl-完全转化成AgCl时,电导率k降到最低点,然后继续滴加AgNO3,电导率k由于Ag+和NO3 -的增加而增大,以电导率k对AgNO3体积V作滴定曲线。
O-2′-HACC和壳聚糖溶液的透光率对pH的依赖关系如图6所示。图6中,壳聚糖溶液的透光率在pH>6时突然下降,pH在8以上逐渐下降趋于平缓;而O-2′-HACC溶液的透光率一直比较稳定,当pH=7.5时才略有所下降,此后pH继续升高透光率也几乎不变。结果表明壳聚糖的水溶性受pH的影响较大,而O-2′-HACC几乎能在所有pH条件下存在,极大扩展了其应用。
本实施例制备的NDV/La Sota-O-2′-HACC-NPs的释放曲线图如图7所示。图7,在释药初期(0h~24h),O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒的NDV释放速度较为迅速,释放量达到(58.7±5.03)%(n=3);在21h后,NDV释放速度逐渐趋于平缓,到240h释放总量达到(73.43±3.37%)(n=3)。试验结果表明,构建的NDV/La Sota-O-2′-HACC-NPs具有较明显的缓慢释放特性。
NDV/La Sota-O-2′-HACC-NPs的透射电镜图如图8所示,可见微球整体形态十分规则,而且外形圆整,没有明显的粘连现象发生,均一性也比较好,比较符合对药物缓释微球的要求。
NDV/La Sota-O-2′-HACC-NPs的Zeta电位图如图9,NDV/LaSota-O-2′-HACC-NPs的粒径分布图如图10。图9和图10可以看出,在本试验得出的最优条件下制备的NDV-La Sota-O-2′-HACC-NPs微球的粒径范围在199.42-317.05nm之间,而且较集中,平均粒径为303.5nm,Zeta电位为+46.36mV。由于NDV的粒径大多在100-200nm之间,所以微球不能太小,否则无法对模型药物进行包裹或者释放速度过快,无法达到理想的缓释效果,而微球过大也同样不能倒到理想的载药和缓释效果。本试验所得的载药微球的平均粒径为303.5nm,Zeta电位为+46.36mV,不仅有利于载药微球长效而均匀释放药物,而且说明所得的载药微球具有较好的稳定性。
Claims (4)
1.新城疫弱毒苗O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒缓释剂的制备方法,其特征在于该方法按以下步骤进行:
一、O-2′-HACC的合成:
A、N-苯亚甲基壳聚糖的合成
将3-6g壳聚糖粉末溶于100-200mL体积百分浓度5%~15%的醋酸溶液中,在室温下加入30-80mL无水乙醇,边滴加边搅拌,然后逐滴加入10-20g苯甲醛,30min内加完,边滴加边搅拌,得溶液;向溶液中滴加1.0~2.0mol/L NaOH溶液将溶液调至中性,真空抽滤析出沉淀,然后用甲醇多次洗涤沉淀除去未反应的苯甲醛,将沉淀于35~50℃烘箱中放置20h,得纤维状浅黄色固体N-苯亚甲基壳聚糖;
B、O-季铵盐-N-苯亚甲基壳聚糖的合成
将30-80mL异丙醇和6-18g 2,3-环氧丙基三甲基氯化铵混合制成ETA的异丙醇溶液,取1.5-5.6g N-苯亚甲基壳聚糖置于圆底烧瓶中,然后逐滴加入ETA的异丙醇溶液,在N2保护条件下于60~85℃水浴搅拌反应12~20h,过滤,依次用甲醇和丙酮洗涤沉淀,得乳白色固状物O-季铵盐-N-苯亚甲基壳聚糖;
C、O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成
向40-60mL 0.2-0.5mol/L氯化氢乙醇溶液中加入2-5g O-季铵盐-N-苯亚甲基壳聚糖,室温搅拌24h后,减压蒸馏20min,得胶状物;然后向胶状物中加入10-30mL蒸馏水充分溶解,再用丙酮沉淀,过滤,得固体,固体于80℃烘箱中烘干,得浅灰色固状物O-2′-HACC;
D、样品精制
取O-2′-HACC溶于去离子水中,用足量的丙酮进行沉淀,3G砂芯漏斗抽滤,所得沉淀溶于蒸馏水中,置于透析袋中透析48h,每隔6h更换一次蒸馏水,待浓缩到2mL时,加入足量的丙酮重新沉淀,抽滤,所得固体真空干燥,得到精制的样品O-2′-HACC;
二、NDV/La Sota-O-2′-HACC-NPs的制备:
a、取O-2′-HACC溶于去离子水中配制成浓度为0.5-2mg/mL的O-2′-HACC溶液,然后取5mL O-2′-HACC溶液并滴加1.25-7.5mL新城疫La Sota株病毒液,磁力搅拌3min,获得溶液A;
b、溶液A在室温、无菌条件下以900-1300r/min磁力搅拌30s,然后滴加3.5mL浓度为0.5-3mg/mL的三聚磷酸钠,维持在5min内匀速滴完,继续磁力搅拌5-30min,再滴加1mL的PBS,维持在5min内匀速滴完,继续磁力搅拌5-30min,然后滴加1mL的司班-80,维持在5min内匀速滴完,继续磁力搅拌5-30min,获得溶液B;
c、将溶液B于4℃、8000-13000r/min离心10-30min,取沉淀并用PBS洗三次,然后加入浓度为0.01mol/L的PBS悬浮,获得NDV/La Sota-O-2′-HACC-NPs悬液;
d、在NDV/La Sota-O-2′-HACC-NPs悬液中加入质量浓度为5%的蔗糖脱脂奶,真空冷冻干燥24h,获得新城疫弱毒苗O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒缓释剂。
2.根据权利要求1所述的新城疫弱毒苗O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒缓释剂的制备方法,其特征在于步骤一A中壳聚糖的脱乙酰度大于85%。
3.根据权利要求1所述的新城疫弱毒苗O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒缓释剂的制备方法,其特征在于步骤二a中新城疫La Sota株病毒液的病毒含量为200μg/mL。
4.根据权利要求1所述的新城疫弱毒苗O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒缓释剂的制备方法,其特征在于步骤二d中NDV/La Sota-O-2′-HACC-NPs悬液与蔗糖脱脂奶的体积比为1∶1。
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