CN114451399A - 两亲性壳聚糖衍生物在离体供肾质量维护中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了两亲性壳聚糖衍生物在离体供肾质量维护中的应用，属于材料医学和生物医药领域。本发明发现两亲性的N‑烷基化‑O‑(2‑羟基)丙基‑3‑三甲基氯化铵壳聚糖(N‑Alkyl‑O‑HTCC)可以在水中自组装成球形纳米颗粒，并可将疏水性药物Alda‑1包封入核，大大提高了Alda‑1在水中的溶解度，且缓释行为不受低温环境的影响；N‑Alky‑O‑HTCC具有良好生物相容性和抗菌活性，还具有抗氧化活性，包载Alda‑1的N‑Alkyl‑O‑HTCC用于HMP灌注液中，在维护器官质量上有很好的应用前景。

Description

两亲性壳聚糖衍生物在离体供肾质量维护中的应用
技术领域
本发明属于材料医学和生物医药领域，涉及两亲性壳聚糖衍生物在离体供肾质量维护中的应用。
背景技术
器官短缺是一个世界性的难题，心脏死亡后器官捐献(DCD)是扩大供者库的重要策略。然而，与脑死亡后器官捐献(DBD)相比，DCD的肾脏在移植后的存活率较低，受者易出现更多的并发症，如移植物功能延迟恢复(DGF)和急性排斥反应，这主要是由长时间的热缺血(WI)引起。近年研究表明低温机械灌注(HMP)是比传统静态冷储存(SCS)更好的DCD器官保存方式。灌注过程可以冲洗血管中的废物，减少储存过程中的能量消耗，并提供细胞代谢所需的营养。这可以促进WI后器官功能的恢复，并减轻随后的再灌注损伤。目前国际标准的肾脏HMP灌注液是KPS-1，但其缺乏高能磷酸化合物和脂质代谢底物。不能满足HMP期间肾脏的营养需求，保存效果有限。因此，改进HMP灌注液具有重要的意义和临床价值。另一方面，移植的器官可能来自无症状感染的捐赠者，或者可能在获取或植入过程中受到污染，将灌注液携带天然的抗菌特性是非常有临床应用前景的。
线粒体损伤是移植细胞损伤的主要原因之一。缺血时氧化磷酸化不能有效进行，再灌注时会产生大量活性氧(ROS)，导致脂质过氧化时脂肪酸氧化，导致线粒体结构和功能严重受损。此外，4-羟基-2-壬烯醛(4-HNE)和丙二醛(MDA)是引起肾脏缺血再灌注损伤(IRI)的关键物质，这些反应性醛类比ROS具有更强的细胞毒性。
N-(1,3-苯并二恶唑-5-基甲基)-2,6-二氯苯甲酰胺(Alda-1)是通过高通量筛选的方法筛选出的线粒体乙醛脱氢酶2(ALDH2)的小分子激活剂，可通过变构激活能够使ALDH2的活性增加30-60％，激活野生型ALDH2并恢复近似野生型活性至ALDH2*2，并减少4-HNE和其他醛类的蓄积，减少ROS产生、抑制炎症反应，在多种器官相关疾病中发挥着重要的保护作用，具备临床转化价值和成药潜力。但目前临床转化面临困难，Alda-1不溶于水，在大多数有机溶剂中溶解度也不佳，Alda-1在二甲基亚砜(DMSO)中溶解性最好。实践中Alda-1在无水乙醇和聚乙二醇400(PEG400)中溶解度欠佳，也有使用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解的，但是，DMSO、DMF均具有毒性，根据2015版《中国药典》是无法应用于人体的，这导致临床应用和转化困难，更无法应用于HMP系统。
壳聚糖是甲壳素的脱乙酰产物，具有高度生物相容性、潜在的抗氧化性能和抗菌性能，以及易修饰的表面化学结构。壳聚糖是两亲性的，但质子氨基的存在有时会导致聚集体的不稳定。大量的活性氨基和羟基使其改性和功能化成为可能，即使在温和的条件下也是如此。与亲水和疏水基团连接等修饰可以提高壳聚糖的溶解性，使壳聚糖衍生物具有更稳定的两亲性特质，并可以形成具有核壳结构的自组装纳米球，从而提高不溶于水的药物在水中的溶解度，并作为向体内有效传递药物。季铵基团的修饰可以显着增加壳聚糖的正电荷，大大提高其水溶性，并增加体内和体外的抗菌活性。
然而目前壳聚糖衍生物的医学应用主要集中在以下几个方面：壳聚糖纳米粒子作为抗肿瘤的药物载体发挥抗肿瘤作用；作为基因载体提高基因的转染效率；壳聚糖水凝胶作为组织工程的骨架进行细胞的3D培养或者促进组织再生；壳聚糖为基础制成的抗菌膜或者敷料促进感染伤口的愈合，尚无壳聚糖在器官质量维护方面的应用研究。
发明内容
本发明的首要目的在于解决Alda-1难溶及现有溶解方法无法应用于临床的问题，提供一种新的增加Alda-1溶解性的方法。
本发明的另一目的在于提供一种改进的HMP灌注液。
本发明的再一目的在于提供所述的HMP灌注液在离体器官质量维护中的应用。
本发明利用壳聚糖为原料设计了一种具有良好生物相容性和抗菌活性的聚合物载体，即两亲性的N-烷基化-O-(2-羟基)丙基-3-三甲基氯化铵壳聚糖(N-Alkyl-O-HTCC)。该化合物可以在水中自组装成球形纳米颗粒，并可将疏水性药物Alda-1包封入核，N-Alky-O-HTCC表现出良好的载药能力，从而大大提高了Alda-1在水中的溶解度。且缓释行为不受低温环境的影响，这为其在离体肾脏HMP系统中的应用奠定了基础。纳米球自带较高的正电荷，且其平均粒径在低浓度时小于肾小球基底膜内皮窗孔，使其更容易穿过肾小球基底膜并到达肾小管上皮。N-Alkyl-O-HTCC包载Alda-1溶解于KPS-1中，递送Alda-1至肾小管上皮细胞，作用于线粒体，成功激活了肾脏的ALDH2，加速了醛类的清除。并且，N-Alkyl-O-HTCC本身也表现出优异的抗氧化活性，它和Alda-1协同作用，减轻了肾脏的氧化应激，从而减轻了缺血性损伤，更好地维护了离体肾脏质量。此外，N-Alky-O-HTCC在体外良好的抗菌活性也被证实，它在HMP中的应用不仅为Alda-1的临床转化带来了希望，还可以减少供体来源的感染，减轻器官的氧化损伤，在维护器官质量上有很好的应用前景，为壳聚糖的临床转化提供了更多的可能性，为DCD移植修复和HMP溶液的改进提供了指导。
本发明提供的增加Alda-1溶解性的方法，为使用N-Alky-O-HTCC包载Alda-1，增加Alda-1在含水溶液中的溶解度。
本发明提供的改进的HMP灌注液，含有Alda-1-N-Alky-O-HTCC，Alda-1-N-Alky-O-HTCC为包载Alda-1的N-Alky-O-HTCC。
进一步地，所述的改进的HMP灌注液为含有Alda-1-N-Alky-O-HTCC的KPS-1。其中，Alda-1、N-Alky-O-HTCC的含量分别优选为20-40μg/mL、10-20μg/mL。
基于N-Alkyl-O-HTCC包载Alda-1上述特性，含有Alda-1-N-Alky-O-HTCC的HMP灌注液在离体器官质量维护中有很好的应用前景。所述的离体器官包括离体肾脏。
上述N-Alky-O-HTCC的制备方法，包括如下步骤：首先利用苯甲醛与壳聚糖反应生成壳聚糖席夫碱(Schiff-Chitosan)，从而保护壳聚糖活泼的C-2位的氨基，再通过与3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵反应，使壳聚糖上的羟基接枝季铵基，并在酸性条件下还原席夫碱形成O-季铵化壳聚糖(O-HTCC)。然后，O-HTCC与癸醛反应，并在硼氢化钠的还原作用下，在壳聚糖C-2位的氨基上接枝长链烷基。
上述Alda-1-N-Alky-O-HTCC的制备方法，包括如下步骤：将N-Alky-O-HTCC和Alda-1溶于无水乙醇，装入透析袋中，在磷酸盐缓冲液(PBS)中透析，然后离心去除未包载的Alda-1，上清即Alda-1-N-Alky-O-HTCC可以直接使用，或冻干以备用。其中，N-Alky-O-HTCC与Alda-1的质量比优选为1:2；所述的透析袋的截留分子量(MWCO)优选为1000；所述的离心的条件优选为5000rpm/min离心10min。
本发明的优点和有益效果：本发明使用N-Alky-O-HTCC包载Alda-1，大大提高了Alda-1在水中的溶解度，且其缓释行为不受低温环境的影响。N-Alky-O-HTCC具有良好生物相容性和抗菌活性，还具有抗氧化活性，其与Alda-1协同作用，能更好地维护离体肾脏质量。
附图说明
图1是N-Alkyl-O-HTCC的合成过程示意图。
图2是N-Alkyl-O-HTCC的红外光谱(FTIR)图。
图3是N-Alkyl-O-HTCC的核磁氢谱(1H NMR)图。
图4是N-Alkyl-O-HTCC包载Alda-1前后的的形态表征。
图5是N-Alkyl-O-HTCC包载Alda-1前后的粒径表征。
图6是N-Alkyl-O-HTCC包载Alda-1前后的电位表征。
图7是N-Alkyl-O-HTCC对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的细胞相容性结果。
图8是N-Alkyl-O-HTCC的溶血率结果。
图9是N-Alkyl-O-HTCC对大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)的抗菌活性结果。
图10是Alda-1在不同溶剂中的溶解情况。
图11是Alda-1在不同溶剂体系中透过率。
图12是N-Alkyl-O-HTCC包载Alda-1的包封率(EE)和载药率(DLR)结果。
图13是N-Alkyl-O-HTCC包载Alda-1后药物的释放特征。
图14是实施例3中透射电镜下观察各组超微结构变化及纳米颗粒的分布，含N-Alkyl-O-HTCC及Alda-1-N-Alkyl-O-HTCC的灌注液减轻肾脏线粒体损伤，并可在肾小管上皮细胞中观察到球形纳米颗粒。
图15是实施例3中ALDH2活性、氧化应激损伤及靶基因表达水平检测结果。A、B和C，Alda-1-N-Alkyl-O-HTCC激活肾脏的ALDH2，减少4-HNE和MDA的蓄积；D，Alda-1-N-Alkyl-O-HTCC可以上调肾脏组织中ALDH2的mRNA水平；E和F，含N-Alkyl-O-HTCC及Alda-1-N-Alkyl-O-HTCC的灌注液可以上调肾脏组织中SOD2的mRNA表达，并增加总SOD的活力，减轻肾脏的氧化应激；G，含N-Alkyl-O-HTCC及Alda-1-N-Alkyl-O-HTCC的灌注液可以减轻肾脏的热缺血病理损伤；H，含N-Alkyl-O-HTCC及Alda-1-N-Alkyl-O-HTCC的灌注液可以减少肾脏中的ROS含量。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1 N-Alkyl-O-HTCC的合成及表征
1.N-Alkyl-O-HTCC的合成(合成过程示意图见图1)
首先制备壳聚糖亚胺席夫碱以保护壳聚糖上的氨基，防止发生季铵化反应。将壳聚糖(6g)溶解在120mL 10％(v/v)冰醋酸溶液中。然后在1小时内滴加苯甲醛(31.2g)。混合溶液在室温下搅拌1小时，然后加热到60℃保持20小时。产物用1M氢氧化钠调至中性pH，得到白色沉淀。提取并搅拌沉淀物，用乙醇洗涤数次，干燥过夜。得到壳聚糖亚胺席夫碱，再用40％氢氧化钠溶液碱化。将碱化后的壳聚糖亚胺席夫碱分散在异丙醇中，加入7倍壳聚糖原料的3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵，室温搅拌0.5h，然后加热至70℃保温16h。冷却后真空过滤收集产物，用乙醇洗涤数次，干燥即得O季铵化壳聚糖席夫碱。然后将O季铵化壳聚糖席夫碱加入到0.25M盐酸乙醇溶液中并在室温下搅拌24小时。通过旋转蒸发除去大部分乙醇并在去离子水中透析三天，冷冻干燥后获得O-HTCC。
将O-HTCC溶于100mL水中并以加入6倍壳聚糖原料摩尔量的癸醛。70℃回流反应4小时。反应结束后，将pH调至中性。在冰浴中缓慢加入NaBH4碱性溶液至pH>12，搅拌过夜，然后用大量水淬灭NaBH4，过滤收集残渣，用80％乙醇漂洗多次，冻干得N-Alkyl-O-HTCC。
2.N-Alkyl-O-HTCC化学结构的表征
在FTIR仪上使用KBr压片法检测样品的光谱变化(结果见图2)。利用NMR检测样品的氢谱(结果见图3)，样品溶解于氘代水和氘代乙酸。通过热重分析(TGA)检测样品的热稳定性。使用透射电镜(TEM)观察N-Alkyl-O-HTCC及其载Alda-1前后的形态特征。使用Zeta电位仪检测N-Alkyl-O-HTCC及其载Alda-1前后的粒径大小和ζ-电位。
N-Alkyl-O-HTCC的季铵化程度通过电位测定法测定，用0.01mol/L的AgNO3溶液滴定O-HTCC水溶液的氯离子。季铵基团的取代度(DSQ)由方程(1)计算：
方程：
Figure BDA0003467202810000051
其中V(mL)为AgNO3溶液的体积，c(mol/L)为AgNO3溶液的浓度，ω1(g)为样品质量，162g/mol为氨基葡萄糖的摩尔质量，ω2(g)是取代样品的质量，ω2＝V×c×314÷1000，314g/mol是O-HTCC单元的摩尔质量，DD是壳聚糖的脱乙酰度。
N-Alkyl-O-HTCC中C/N的质量比通过元素分析仪测定，再由C/N的质量比根据方程(2)计算烷基的取代度(DSA)：
方程：
Figure BDA0003467202810000052
结果表明，季铵基成功接在了壳聚糖单元6位碳原子相连的羟基上，烷基长链成功地接在了壳聚糖单元2位碳原子相连的氨基上，DSQ为26.75％，DSA为128.11％，N-Alkyl-O-HTCC的合成是成功的。且其在水中会稳定分散，自组装成均一的球形纳米粒子(图4)，粒径133±8.48nm，载Alda-1后粒径增加到221±3.70nm(图5)，N-Alkyl-O-HTCC的水溶液ζ-电位为43.9±2.06mV，载Alda-1后ζ-电位也增加到45.6±0.64mV(图6)。
3.N-Alkyl-O-HTCC生物相容性检测
人脐静脉内皮细胞(HUVECs)与不同浓度的N-Alkyl-O-HTCC(从0.063mg/mL到1.0mg/mL)孵育24h、48h和72h，正常培养的细胞作为对照组，采用浸提法和CCK8法评估N-Alkyl-O-HTCC对细胞增殖的影响。
N-Alkyl-O-HTCC的血液相容性采用溶血率检测，获取新鲜兔血，将2％红细胞悬液与不同浓度的N-Alkyl-O-HTCC(0.008至1.0mg/mL)一起孵育，酶标仪检测545nm波长处的吸光度，计算溶血率。
结果(图7)表明，在共培养24h后，不同浓度的N-Alkyl-O-HTCC均可以促进HUVECs的增殖，是对照组的180％，而延长共培养时间至72h，≤0.5mg/mL的N-Alkyl-O-HTCC对细胞增殖无明显影响，1mg/mL的N-Alkyl-O-HTCC会抑制HUVECs的增殖，细胞活性为对照组的46％。溶血实验的结果(图8)表明当1mg/mL的N-Alkyl-O-HTCC与红细胞共同孵育后，溶血率达到最高，为4.8％，符合国际标准值＜5％。N-Alkyl-O-HTCC具有良好的生物相容性。
4.N-Alkyl-O-HTCC抗菌性能验证
E.coli和S.aureus在LB培养基上37℃培养。分别挑取单个菌落置于装有5mL液体肉汤培养基的无菌离心管中，然后将这两种微生物在恒温振荡培养箱中培养24小时，增殖至对数生长期，然后将细菌菌液在PBS中稀释至2×105CFU/mL。同时，制备浓度为5ng/mL至500μg/mL的N-Alkyl-O-HTCC，将微生物悬浮液加入N-Alkyl-O-HTCC溶液中，然后将混合物在37℃振荡培养12h。取100μL混合液均匀涂布在LB培养基上，37℃培养24h，最后对所得微生物菌落拍照，根据估计的菌落数评估N-Alkyl-O-HTCC的体外抗菌活性。
结果(图9)表明，≥5μg/mL的N-Alkyl-O-HTCC呈现出良好的抗菌活性，可以完全抑制S.aureus的生长，并且抑制了绝大部分E.coli的生长。高于此浓度的N-Alkyl-O-HTCC应用于HMP灌注液中，将发挥良好的抗感染功能。
实施例2 N-Alkyl-O-HTCC包载Alda-1，在水中增溶及释放
1.增溶
为了评估Alda-1的溶解度，将Alda-1(1mg/mL)分散在ddH2O、DMSO/ddH2O(体积比为1：4)、DMSO、N-Alkyl-O-HTCC(N-Alkyl-O-HTCC水溶液，浓度0.5mg/mL)四种不同的溶剂体系中，通过肉眼观察和比较溶解度，再利用紫外-可见分光光度计(UV-vis)扫描不同体系200-800nm的全波长，检测其透过率。
结果(图10)表明，Alda-1在ddH2O和DMSO/ddH2O(体积比为1：4)中都有明显的团聚，白色药物不溶且很快沉淀。相比之下，同剂量的Alda-1可以在DMSO和N-Alkyl-O-HTCC中形成透明溶液。透过率结果(图11)显示Alda-1在ddH2O、DMSO/ddH2O和N-Alkyl-O-HTCC这三种体系中，在285nm处具有明显的药物特征吸收峰。然而，DMSO在紫外区有很强的吸收，覆盖了Alda-1的吸收峰，不能反映在透射率上。同时，在可见光区不同体系的透过率顺序为DMSO>N-Alkyl-O-HTCC>ddH2O>DMSO/ddH2O，表明N-Alkyl-O-HTCC可以明显增加Alda-1在水中的溶解度。
2.包载
1mg N-Alky-O-HTCC和2mg Alda-1，或2mg N-Alky-O-HTCC和2mg Alda-1，或2mgN-Alky-O-HTCC和1mg Alda-1溶于1ml无水乙醇，用MWCO为1000透析袋在PBS中透析，然后5000rpm/min离心10min以沉淀游离的Alda-1。取200μL上清液并用DMSO稀释至600μL以溶出上清液中的Alda-1。上清液中Alda-1的浓度通过285nm处的吸光度测定，然后使用标准曲线校准。N-Alky-O-HTCC对Alda-1包载的包封率(EE)和载药率(DLR)计算如下：
方程:EE＝(M1-M2)/M1×100％ (3)
方程:DLR＝(M1-M2)/(M3+M1-M2)×100％ (4)
其中M1是最初加入的Alda-1的质量，M2是游离Alda-1的质量，M3是最初加入的N-Alky-O-HTCC的质量。
结果(图12)表明当N-Alky-O-HTCC和Alda-1的质量比1:2时载药效果最好，此时EE为36.44±1.59％，DLR为42.14±1.07％。
3.释放
2mg N-Alky-O-HTCC、4mg Alda-1和2mL无水乙醇充分混合后放入透析袋中，分别置于PBS中4℃和37℃恒温透析。每隔一段时间取出3mL透析液并加入3mL新鲜PBS。取200μL透析液并用DMSO稀释至600μL，在285nm处通过UV-vis测量吸光度。通过标准曲线计算释放量，然后制作释放曲线并通过Origin拟合。
结果(图13)表明在不同温度下，Alda-1的释放方式相似，释放效率也没有明显差别。Alda-1在前2h有一个突释阶段，随后缓慢释放，24h内可以释放85％左右，并且其缓释规律符合Weibull模型，如下表所示，其中“Mt”代表药物在“t”时间的累计释放率。
Figure BDA0003467202810000071
Figure BDA0003467202810000081
实施例3 N-Alkyl-O-HTCC以及Alda-1-N-Alkyl-O-HTCC应用于兔肾离体HMP
1.家兔DCD及肾脏离体HMP模型建立
将健康雄性家兔随机分为5组，分别为假手术(Sham)组；WI组；KPS-1灌注(KPS)组；KPS-1加N-Alky-O-HTCC灌注(KPS-N)组；KPS-1加Alda-1-N-Alky-O-HTCC灌注(KPS-N-A)组。实验前动物禁食12小时，戊巴比妥充分麻醉后开腹，分离肾周筋膜，分离肾动脉、肾静脉和输尿管，用小血管夹夹住左侧肾蒂，体温维持在38.5±0.5℃，经过35min的热缺血时间(WIT)后，切断肾静脉，并用留置针将20mL KPS-1缓慢灌注到肾动脉中，然后切除左肾并准备进行后续的HMP。Sham组仅行分离手术后获取肾脏，WI组在经历35min的WIT后进行获取肾脏，未行HMP。
HMP系统建立如下，肾动脉中留置针连接到压力感受器，压力感受器连接到蠕动泵的软管，装有250mL KPS-1的烧杯置于冰盘上，将肾脏置于烧杯中，灌注液经软管泵入肾动脉，经肾静脉流出，可通过蠕动泵调节流量参数，连续灌注压力由生物传感器收集并由计算机监测。KPS-N组的灌注液中含有5mg N-Alky-O-HTCC透析后的PBS溶液，KPS-N-A组的灌注液中含有5mg N-Alky-O-HTCC和10mg Alda-1透析后的PBS溶液。经历4h HMP后，收集肾组织和灌注液样品用于进一步测试。
结果表明，N-Alky-O-HTCC和Alda-1的加入对肾脏灌注阻力没有影响，三个灌注组的肾脏灌注阻力在4h灌注过程中均稳定下降。
2.肾脏组织学检测
4％多聚甲醛固定的肾组织用石蜡包埋，苏木精-伊红(H&E)染色后切成5μm薄片进行组织学分析，光镜下观察。对于每个组织切片，在200倍视野下选择包含至少1个肾小球的10个随机肾皮质区域，并对下列五个指标进行评分(0-3分制：无，0；轻度，0-30％；中度，30-60％；和严重，>60％)，缺血性损伤相关的五个指标为：肾小管细胞坏死、刷状缘缺失、水肿、肾小管管型形成和细胞空泡化，通过将所有指标的分数相加来计算总损伤分数。
小块肾组织用2.5％预冷戊二醛固定，洗涤后用1％的OsO4固定，将组织脱水并包埋在环氧树脂中，然后切成60-80nm的超薄切片，并在带有Formvar薄膜的150目铜网上捞出。样品分别用2％醋酸铀饱和酒精溶液和2.6％柠檬酸铅染色，透射电镜下观察各组超微结构变化及纳米颗粒的分布。
结果表明，三个灌注组的肾脏病理损伤都较WI组轻，KPS-N组的肾脏病理改变和KPS组无明显差异，且KPS-N-A组的肾脏病理评分比KPS组明显降低(图15G)。此外，TEM的结果(图14)显示，三个灌注组的肾小管上皮细胞的线粒体损伤较WI组减轻，并且在KPS-N组和KPS-N-A组中，可以发现细胞质和线粒体中散在分布有球形纳米颗粒，尺寸为20-110nm，与N-Alky-O-HTCC在体外TEM下的形态和尺寸相符。
3.ALDH2活性测定及氧化应激损伤检测
使用ALDH2活性测定试剂盒测量ALDH2活性，ALDH2催化乙醛和NAD+转化为乙酸和NADH，NADH在340nm处的吸光度变化可用于计算ALDH2的活性。
使用SOD检测试剂盒和MDA检测试剂盒检测肾组织中超氧化物歧化酶(SOD)的活性和MDA含量。使用ELISA试剂盒测量组织4-HNE的水平。
使用ROS荧光探针观察新鲜组织中的ROS水平：二氢乙锭(DHE)每组单独处理后，将载玻片在37℃下孵育30分钟，然后获取并分析荧光图像。通过用DAPI标记，细胞核呈蓝色。荧光素标记的ROS阳性细胞呈红色，平均荧光强度由ImageJ软件评估。
结果表明，KPS-N-A组肾脏组织中ALDH2活性较其他组明显升高(图15A)，4-HNE和MDA的含量比KPS组要低(图15B、C)，ROS水平也明显下降(图15H)。并且，只添加了N-Alky-O-HTCC灌注的KPS-N组肾脏也表现出了低的ROS水平以及较高的SOD含量(图15E)，下降的MDA和4-HNE含量，与KPS-N-A组无明显差异。
4.逆转录-荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)
使用Trizol试剂从50mg冷冻肾组织中提取总RNA，然后使用逆转录试剂盒逆转录(RT)成cDNA。RT在42℃下进行1小时，然后在75℃下孵育5分钟。热循环条件如下：50℃2分钟，95℃10分钟，然后是95℃10秒和60℃30秒的40个循环。随后使用荧光定量PCR试剂盒及仪器检测靶基因(ALDH2、SOD2和β-actin)的表达水平。使用2-ΔΔCT方法计算相对表达量，并以β-actin的表达为参照进行归一化。所有引物序列如下：
Figure BDA0003467202810000091
Figure BDA0003467202810000101
结果表明，ALDH2的mRNA表达水平在KPS-N-A组明显升高(图15D)，与其他组有显著差异，SOD2的mRNA表达水平在KPS-N组和KPS-N-A组均有明显升高(图15F)。
序列表
<110> 武汉大学中南医院
<120> 两亲性壳聚糖衍生物在离体供肾质量维护中的应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctgctatgat gtgtttgggg c 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gctttctggc caatctgttg a 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gttcaacggt ggaggtcaca 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccacacatca atccccagca 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tggctctaac agtccgccta g 21
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agtgcgacgt ggacatccg 19

Claims (9)

1.一种增加Alda-1溶解性的方法，其特征在于：所述的方法为使用N-烷基化-O-(2-羟基)丙基-3-三甲基氯化铵壳聚糖N-Alky-O-HTCC包载Alda-1，增加Alda-1在含水溶液中的溶解度。
2.根据权利要求1所述的增加Alda-1溶解性的方法，其特征在于：所述的N-Alky-O-HTCC通过包括如下步骤的方法制备：首先利用苯甲醛与壳聚糖反应生成壳聚糖席夫碱，再通过与3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵反应，使壳聚糖上的羟基接枝季铵基，并在酸性条件下还原席夫碱形成O-季铵化壳聚糖；O-季铵化壳聚糖与癸醛反应，并在硼氢化钠的还原作用下，在壳聚糖C-2位的氨基上接枝长链烷基，得到N-Alky-O-HTCC。
3.一种HMP灌注液，其特征在于：含有Alda-1-N-Alky-O-HTCC，Alda-1-N-Alky-O-HTCC为包载Alda-1的N-Alky-O-HTCC。
4.根据权利要求3所述的HMP灌注液，其特征在于：N-Alky-O-HTCC包载Alda-1的方法包括如下步骤：将N-Alky-O-HTCC和Alda-1溶于无水乙醇，装入透析袋中，在磷酸盐缓冲液中透析，然后离心取上清。
5.根据权利要求4所述的HMP灌注液，其特征在于：N-Alky-O-HTCC与Alda-1的质量比为1:2。
6.根据权利要求3所述的HMP灌注液，其特征在于：为含有Alda-1-N-Alky-O-HTCC的KPS-1。
7.根据权利要求3所述的HMP灌注液，其特征在于：Alda-1、N-Alky-O-HTCC的含量分别为20-40μg/mL、10-20μg/mL。
8.权利要求3-7任一项所述的HMP灌注液在离体器官质量维护中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的离体器官包括离体肾脏。
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Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1760213A (zh) * 2005-11-16 2006-04-19 中国药科大学 季铵化壳聚糖衍生物、其制备方法及含其的药物制剂
CN102241790A (zh) * 2011-06-13 2011-11-16 中山大学 一种两亲性壳聚糖衍生物及其制备方法和应用
CN102416000A (zh) * 2011-12-13 2012-04-18 张维芬 一种用于肺吸入的壳聚糖季铵盐大孔微球及其制备方法
CN102641245A (zh) * 2011-11-02 2012-08-22 中国科学院过程工程研究所 一种装载难溶性药物的壳聚糖-壳聚糖衍生物纳米球、制备方法及其作为口服制剂的应用
CN103191103A (zh) * 2013-04-15 2013-07-10 中南大学 乙醛脱氢酶激活物alda-1的合成方法及其用途
CN104324372A (zh) * 2014-10-27 2015-02-04 黑龙江大学 新城疫弱毒苗o-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒缓释剂的制备方法
CN104672348A (zh) * 2015-02-14 2015-06-03 滨州医学院 具有良好水溶性和抗菌活性的壳聚糖季铵盐衍生物及其制备方法
CN104906116A (zh) * 2015-06-04 2015-09-16 湘潭大学 一种寡糖的应用
CN106496358A (zh) * 2016-11-09 2017-03-15 深圳大学 双亲性壳聚糖季铵盐衍生物及其制备和应用
CN111150704A (zh) * 2020-01-10 2020-05-15 山东大学齐鲁医院 Alda-1溶液及其制备方法和应用

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1760213A (zh) * 2005-11-16 2006-04-19 中国药科大学 季铵化壳聚糖衍生物、其制备方法及含其的药物制剂
CN102241790A (zh) * 2011-06-13 2011-11-16 中山大学 一种两亲性壳聚糖衍生物及其制备方法和应用
CN102641245A (zh) * 2011-11-02 2012-08-22 中国科学院过程工程研究所 一种装载难溶性药物的壳聚糖-壳聚糖衍生物纳米球、制备方法及其作为口服制剂的应用
CN102416000A (zh) * 2011-12-13 2012-04-18 张维芬 一种用于肺吸入的壳聚糖季铵盐大孔微球及其制备方法
CN103191103A (zh) * 2013-04-15 2013-07-10 中南大学 乙醛脱氢酶激活物alda-1的合成方法及其用途
CN104324372A (zh) * 2014-10-27 2015-02-04 黑龙江大学 新城疫弱毒苗o-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒缓释剂的制备方法
CN104672348A (zh) * 2015-02-14 2015-06-03 滨州医学院 具有良好水溶性和抗菌活性的壳聚糖季铵盐衍生物及其制备方法
CN104906116A (zh) * 2015-06-04 2015-09-16 湘潭大学 一种寡糖的应用
CN106496358A (zh) * 2016-11-09 2017-03-15 深圳大学 双亲性壳聚糖季铵盐衍生物及其制备和应用
CN111150704A (zh) * 2020-01-10 2020-05-15 山东大学齐鲁医院 Alda-1溶液及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JOANNA STEFAN: "Biomedical activities of cationically modified chitosan studies in vitro and in a mice model of atherosclerosis", 《PHARMACOLOGICAL REPORTS》 *

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