CN102423304B - N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/n,o-羧甲基壳聚糖新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法 - Google Patents

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N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N，O-羧甲基壳聚糖新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法，它涉及新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法。方法：一、向N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶液中滴加新城疫L-系病毒液，获得溶液A；二、溶液A搅拌后滴加N，O-羧甲基壳聚糖溶液，获得溶液B；三、溶液B离心，沉淀用去离子水洗涤后真空冷冻干燥，即得。本发明制备的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N，O-羧甲基壳聚糖新城疫减毒活疫苗纳米粒，粒径容易控制、粒径分布均匀，最大包封率可达98％，载药量大；具有良好的相容性和生物黏附性，制备方法简单易行，条件温和，药物毒副作用低，缓释时间长，生产成本较低、易于规模化生产。

Description

N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N,O-羧甲基壳聚糖新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法
技术领域
本发明涉及新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法。 
背景技术
新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的一种急性、高度接触性、致死性禽类传染病，该病在雏鸡、火鸡、鸽、鹤、鹌鹑和鹦鹉等其它鸟类中能引起100％发病和死亡。该病的主要特征是呼吸困难、下痢、神经紊乱、黏膜和浆膜出血，发病急、致死率高，是危害养禽业的最严重传染病之一。目前，该病的预防和控制的最重要和最有效的手段是接种疫苗。但是，现有疫苗的普遍缺点是免疫原性较弱，需用较强的免疫佐剂或合适的黏膜免疫传递系统才能有效诱导免疫应答。纳米疫苗是一种运用可降解生物材料和纳米技术改进现有疫苗的剂型和投递方式，从而保护抗原、简化接种程序、提高免疫效果的新型缓释疫苗，而且也解决了传统给药方式所带来的给药不便和药物浓度不稳定的问题，降低了药物的毒性，提高了药物的疗效。 
目前，疫苗黏膜免疫递送系统的研究日益得到广泛关注，然而，疫苗具有在体内降解和消除快、生物利用度低，体内半衰期短、需要佐剂和反复注射接种，副作用大、程序繁琐等缺点。另外，目前，大部分动物病毒病(如鸡新城疫、禽流感等)的灭活疫苗虽然能诱导产生高水平的血清循环抗体IgG，但不能诱导黏膜免疫应答，也就不能阻止病毒的感染。 
利用可生物降解高分子材料纳米粒对疫苗进行包裹，不仅可以保护疫苗完成投递过程，避免体内酸碱环境和酶类对抗原的破坏，而且能使抗原的释放方式、速度、部位等具有一定的选择性和可控性，利于实现疫苗的控制释放和靶向传输，为疫苗剂型和免疫途径的多样化提供了广阔的前景。同时，纳米粒还具有佐剂作用，能增强疫苗的抗原性，并优化免疫应答的类型，从而提高接种效率、增强免疫效果。但是，作为黏膜免疫的递送载体，需具备永久正电性和生理环境下的水溶性，因为这样可有效地降低跨上皮细胞电阻，打开上皮细胞的紧密连接，通过细胞旁路增加亲水性载药纳米粒子的转运，提高纳米粒的摄取率。 
壳聚糖作为自然界唯一带有阳离子的天然多糖，具有良好的生物活性、生物相容性、可降解性以及抗菌等特殊功能，然而，壳聚糖只能溶于酸性溶液的性能缺陷使其在这一领域的应用受到了极大限制。因此，对壳聚糖进行化学改性，在壳聚糖分子上接入某些特殊基团改变其水溶性，可以极大扩展壳聚糖的应用范围。在更为理想的纳米载药粒子制备的设计中，寻求壳聚糖的水溶性途径已成为能否将其成功用作纳米载药粒子基质物质的关键。 
发明内容
本发明的目的是提供N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N，O-羧甲基壳聚糖新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法。 
N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N，O-羧甲基壳聚糖新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法，按以下步骤实现： 
一、取5mL浓度为0.5～20mg/mL的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶液，然后向其中滴加1.25～7.5mL新城疫L-系病毒液，磁力搅拌3min，获得溶液A； 
二、溶液A在室温、无菌条件下以900～1300r/min磁力搅拌10～40min，然后滴加2mL浓度为0.5～3.0mg/mL的N，O-羧甲基壳聚糖溶液，获得溶液B； 
三、将溶液B于4℃、12000r/min离心2min，取沉淀并用去离子水洗三次，然后真空冷冻干燥24h，即得N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N，O-羧甲基壳聚糖新城疫减毒活疫苗纳米粒(简称为NDV-N-2-HACC/N，O-CMC-NPs)； 
其中步骤一中新城疫L-系病毒液为经过去离子化处理的新城疫L-系病毒液，病毒含量为108.5EID50。 
本发明制备的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N，O-羧甲基壳聚糖新城疫减毒活疫苗纳米粒，粒径容易控制、粒径分布均匀(120～500nm)，Zeta电位为15～60mV，最大包封率可达98％，载药量大(65％～80％)。 
本发明制备的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N，O-羧甲基壳聚糖新城疫减毒活疫苗纳米粒，具有良好的相容性和生物黏附性，克服了传统注射疫苗造成的顺应性差、注射器和针头导致感染、减活疫苗在储存和运输过程中易失活等缺点，且制备方法简单易行，条件温和，药物毒副作用低，缓释时间长，生产成本较低、易于规模化生产。 
本发明制备的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N，O-羧甲基壳聚糖新城疫减毒活疫苗纳米粒，其中病毒含量为108.5EID50/0.1mL，符合《中华人民共和国兽用生物制品规程》中新城疫低毒力活疫苗制苗用毒液标准。本发明制备的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N，O-羧甲基壳聚糖新城疫减毒活疫苗纳米粒可用于鸡新城疫免疫，经口服给药，NDV-N-2-HACC/N，O-CMC-NPs(500羽/瓶)，25倍稀释，给药量为每只鸡0.05mL。 
附图说明
图1是实施例中制备的NDV-N-2-HACC/N，O-CMC-NPs的释放曲线图；图2是实施例中制备的NDV-N-2-HACC/N，O-CMC-NPs的透射电镜图；图3是实施例中制备的NDV-N-2-HACC/N，O-CMC-NPs的Zeta电位图；图4是是实施例中制备的 NDV-N-2-HACC/N，O-CMC-NPs的粒径分布图。 
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。 
具体实施方式一：本实施方式N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N，O-羧甲基壳聚糖新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法，按以下步骤实现： 
一、取5mL浓度为0.5～20mg/mL的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶液，然后向其中滴加1.25～7.5mL新城疫L-系病毒液，磁力搅拌3min，获得溶液A； 
二、溶液A在室温、无菌条件下以900～1300r/min磁力搅拌10～40min，然后滴加2mL浓度为0.5～3.0mg/mL的N，O-羧甲基壳聚糖溶液，获得溶液B； 
三、将溶液B于4℃、12000r/min离心2min，取沉淀并用去离子水洗三次，然后真空冷冻干燥24h，即得N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N，O-羧甲基壳聚糖新城疫减毒活疫苗纳米粒(简称为NDV-N-2-HACC/N，O-CMC-NPs)； 
其中步骤一中新城疫L-系病毒液为经过去离子化处理的新城疫L-系病毒液，病毒含量为108.5EID50。 
本实施方式中N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖，来自名称为“N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成及其负载新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法(申请号：201110333845.9，申请日：2011年10月28日)”的专利，所述N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成方法按以下步骤实现： 
一、将50g脱乙酰度为85％的壳聚糖分散在200mL NaOH的异丁醇溶液中，在90～120℃下回流搅拌反应1h，去除上清液后沉淀用去离子水洗至中性，然后分散在200mL NaOH的异丁醇溶液中，继续回流搅拌反应1.5～8h，去除上清液后沉淀用去离子水洗至中性，获得脱乙酰处理的壳聚糖； 
二、将2～3g脱乙酰处理的壳聚糖溶于100～150mL体积浓度为1～3％乙酸溶液中，搅拌溶解，真空抽滤，滤去不溶物，获得壳聚糖溶液，然后在500～1000r/min搅拌条件下逐滴加入浓度为0.1～2mol/L的NaOH溶液，调节壳聚糖溶液pH值至8～9并有白色沉淀析出，浸泡8h后抽滤，去离子水洗至滤液呈中性，抽干水分，然后向滤饼中加入15～20mL异丙醇，搅拌30min后倒入三口烧瓶，完成壳聚糖的浸泡处理； 
三、在N2保护条件下，将步骤二中的三口烧瓶升温至75～85℃，每隔2h逐滴加入2，3-环氧丙基三甲基氯化铵的异丙醇溶液，每次滴定时间30min，共滴加三次，反应8～14h后将 烧瓶冷却至室温，加入150～300mL冷藏处理的无水乙醇，浸泡0.5h后抽滤，冷冻干燥24h，完成壳聚糖与2，3-环氧丙基三甲基氯化铵开环反应，获得粗制N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖； 
四、将粗制N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶于去离子水，应用3G砂芯漏斗过滤后将滤液在5倍体积冷藏处理的丙酮中沉淀，然后真空抽滤，滤饼分散后冷冻干燥24h，即完成N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成； 
其中步骤一中NaOH的异丁醇溶液中NaOH的质量分数为15％～40％，异丁醇的量为每克壳聚糖加入10～30mL异丁醇；步骤三中2，3-环氧丙基三甲基氯化铵的异丙醇溶液中2，3-环氧丙基三甲基氯化铵与异丙醇溶液的质量体积比为1g∶2mL；步骤三中2，3-环氧丙基三甲基氯化铵的总加入量为2～27g；步骤四中粗制N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖与去离子水的质量体积比为1g∶25mL。 
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同是步骤一中取5mL浓度为1mg/mL的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶液，然后向其中滴加2mL新城疫L-系病毒液。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。 
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一的不同是步骤二中溶液A在室温、无菌条件下以1200r/min磁力搅拌30min，然后滴加2mL浓度为1mg/mL的N，O-羧甲基壳聚糖溶液。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。 
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一的不同是步骤二中N，O-羧甲基壳聚糖的合成方法按以下步骤实现： 
一、将5g粉末状壳聚糖置于250mL三口烧瓶中，加入40mL异丙醇并搅拌，浸泡1～12h后加入60mL浓度为10～40mol/L的NaOH溶液，搅匀后浸泡2～24h，得碱化壳聚糖； 
二、将20g氯乙酸水浴加热溶于10mL的异丙醇中，在搅拌状态下分5次加入到碱化壳聚糖中，每次间隔10min，然后在40～80℃下反应2～8h，制得羧甲基壳聚糖混合物，然后加入20mL蒸馏水，用体积浓度为1％的盐酸调pH至7.0，再用布氏漏斗抽滤，滤液中加入4倍量的无水乙醇充分沉淀，过滤，然后依次用体积浓度为95％的乙醇和无水乙醇洗涤，再置于30～60℃下真空干燥6～24h，得精制品，即完成N，O-羧甲基壳聚糖的合成。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。 
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一的不同是步骤一中滴加的速度为0.05mL/s。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。 
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一的不同是步骤二中滴加的速度为 0.05mL/s。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。 
实施例： 
N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N，O-羧甲基壳聚糖新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法，按以下步骤实现： 
一、取5mL浓度为1mg/mL的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶液，然后向其中滴加2mL新城疫L-系病毒液，磁力搅拌3min，获得溶液A； 
二、溶液A在室温、无菌条件下以1200r/min磁力搅拌30min，然后滴加2mL浓度为1mg/mL的N，O-羧甲基壳聚糖溶液，获得溶液B； 
三、将溶液B于4℃、12000r/min离心2min，取沉淀并用去离子水洗三次，然后真空冷冻干燥24h，即得N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N，O-羧甲基壳聚糖新城疫减毒活疫苗纳米粒(简称为NDV-N-2-HACC/N，O-CMC-NPs)； 
其中步骤一中新城疫L-系病毒液为经过去离子化处理的新城疫L-系病毒液，病毒含量为108.5EID50。 
本实施例制备所得NDV-N-2-HACC/N，O-CMC-NPs的释放曲线图如图1所示，可见在60h之前NDV-N-2-HACC/N，O-CMC-NPs病毒累积释放量迅速提高，之后释放逐渐平稳； 
本实施例制备所得NDV-N-2-HACC/N，O-CMC-NPs的透射电镜图如图2所示，可见有粒径大小均一、形态规则、外形圆整、分散性好等优点； 
本实施例制备所得NDV-N-2-HACC/N，O-CMC-NPs的Zeta电位图如图3所示，可见有电位为正值，且电位值较大，有利于吸附在细胞表面； 
本实施例制备所得NDV-N-2-HACC/N，O-CMC-NPs的粒径分布图如图4所示，可见有粒径分布均匀、尺寸适中，为120～500nm。 

Claims (6)

1.N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N,O-羧甲基壳聚糖新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法，其特征在于它按以下步骤实现：
一、取5mL浓度为0.5～20mg/mL的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶液，然后向其中滴加1.25～7.5mL新城疫L-系病毒液，磁力搅拌3min，获得溶液A；
二、溶液A在室温、无菌条件下以900～1300r/min磁力搅拌10～40min，然后滴加2mL浓度为0.5～3.0mg/mL的N,O-羧甲基壳聚糖溶液，获得溶液B；
三、将溶液B于4℃、12000r/min离心2min，取沉淀并用去离子水洗三次，然后真空冷冻干燥24h，即得N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N,O-羧甲基壳聚糖新城疫减毒活疫苗纳米粒；
其中步骤一中新城疫L-系病毒液为经过去离子化处理的新城疫L-系病毒液，病毒含量为108.5EID50。
2.根据权利要求1所述的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N,O-羧甲基壳聚糖新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法，其特征在于步骤一中取5mL浓度为1mg/mL的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶液，然后向其中滴加2mL新城疫L-系病毒液。
3.根据权利要求1所述的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N,O-羧甲基壳聚糖新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法，其特征在于步骤二中溶液A在室温、无菌条件下以1200r/min磁力搅拌30min，然后滴加2mL浓度为1mg/mL的N,O-羧甲基壳聚糖溶液。
4.根据权利要求1所述的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N,O-羧甲基壳聚糖新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法，其特征在于步骤二中N,O-羧甲基壳聚糖的合成方法按以下步骤实现：
一、将5g粉末状壳聚糖置于250mL三口烧瓶中，加入40mL异丙醇并搅拌，浸泡1～12h后加入60mL浓度为10～40mol/L的NaOH溶液，搅匀后浸泡2～24h，得碱化壳聚糖；
二、将20g氯乙酸水浴加热溶于10mL的异丙醇中，在搅拌状态下分5次加入到碱化壳聚糖中，每次间隔10min，然后在40～80℃下反应2～8h，制得羧甲基壳聚糖混合物，然后加入20mL蒸馏水，用体积浓度为1%的盐酸调pH至7.0，再用布氏漏斗抽滤，滤液中加入4倍量的无水乙醇充分沉淀，过滤，然后依次用体积浓度为95%的乙醇和无水乙醇洗涤，再置于30～60℃下真空干燥6～24h，得精制品，即完成N,O-羧甲基壳聚糖的合成。
5.根据权利要求1所述的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N,O-羧甲基壳聚糖新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法，其特征在于步骤一中滴加的速度为0.05mL/s。
6.根据权利要求1所述的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N,O-羧甲基壳聚糖新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法，其特征在于步骤二中滴加的速度为0.05mL/s。
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