CN102327228A - 壳聚糖新城疫疫苗纳米粒的制备方法 - Google Patents

Abstract

壳聚糖新城疫疫苗纳米粒的制备方法，涉及一种壳聚糖新城疫疫苗纳米粒的制备方法。方法：一、将壳聚糖分散于灭菌的蒸馏水中，在磁力搅拌下，加入乙酸搅拌，过滤，静置至气泡消去，即得到壳聚糖溶液；二、取壳聚糖溶液，向其中滴加新城疫L-系病毒液，搅拌混合均匀后，再滴加交联剂，然后在常温、无菌条件下搅拌得溶液A；三、将溶液A离心取沉淀，将沉淀经无菌水洗涤，然后真空冷冻干燥，即得到壳聚糖新城疫疫苗纳米粒。本发明的疫苗纳米粒稳定性强、释药时间长，在保证药物作用的前提下，减少了给药剂量、减轻或避免了毒副反应、可延长免疫保护期。

Description

壳聚糖新城疫疫苗纳米粒的制备方法

技术领域

本发明涉及一种壳聚糖新城疫疫苗纳米粒的制备方法。

背景技术

新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的鸡和火鸡的一种急性、高度接触性、致死性传染病，常呈败血症，是危害养禽业的最重要传染病之一，被国际兽医局定为I类传染病。控制ND最根本的措施是进行有效的疫苗接种，目前常用的疫苗是弱毒活疫苗和灭活疫苗，但二者在实际应用中均存在一定的局限性。ND油乳剂灭活疫苗通过注射免疫鸡体后可产生较高水平的血液循环抗体，但在抵抗呼吸道和消化道病原感染的黏膜系统中却有局限性，很难阻止病原通过黏膜组织侵入动物体内，且对已经进入细胞的病毒很难发挥作用；ND弱毒活疫苗虽然可以产生一定的黏膜免疫和体液免疫，但受免疫方法和途径影响，产生的循环抗体较低，维持期短。饮水免疫很容易造成疫苗被消化道降解，导致疫苗吸收效率低；滴鼻点眼也只能使疫苗在鼻腔内存在15min，致使疫苗不能有效进入机体激发有效的黏膜免疫；气雾免疫产生的黏膜免疫效果较好，但容易诱导慢性呼吸道疫病，且弱毒苗均不能产生较高的血清抗体等。因此，如何提高新城疫疫苗的免疫效果，研制出既能产生较强的体液免疫抗体又能产生高效的局部黏膜免疫的新型疫苗已成为ND疫苗研究的焦点。

近年来随着新型材料学和制剂新技术的发展，迫切需要一种新的疫苗递送方法以降低传染病的死亡率。目前，国内外尚未有利用NDV进行纳米疫苗研究的报道。

发明内容

本发明提供一种壳聚糖新城疫疫苗纳米粒的制备方法。

本发明壳聚糖新城疫疫苗纳米粒的制备方法，按以下步骤进行：一、将壳聚糖分散于灭菌的蒸馏水中，在磁力搅拌下，加入体积浓度为36％乙酸，继续搅拌5～15min，用0.22μm滤器过滤，静置至气泡消去，即得到壳聚糖溶液；二、取5mL步骤一制备的壳聚糖溶液，向其中滴加2～3mL病毒含量为10^8.5EID₅₀的新城疫L-系病毒液，搅拌混合均匀后，再滴加2～3mL浓度为1.0mg/mL的交联剂三聚磷酸钠，然后在常温、无菌条件下于1000～1400r/min磁力搅拌10～15min，得溶液A；三、将溶液A于4℃、10000～15000r/min离心30～40min，取沉淀，将沉淀经无菌水洗3～5次，然后真空冷冻干燥22～25h，即得到壳聚糖新城疫疫苗纳米粒(NDV-CS-NPs)；其中步骤一中壳聚糖的质量与蒸馏水的体积比为1g∶900～920mL，步骤一中壳聚糖的质量与乙酸的体积比为1g∶80～85mL。

本发明壳聚糖新城疫疫苗纳米粒具有巨大的应用潜力，本发明制备的壳聚糖新城疫疫苗纳米粒(NDV-CS-NPs)与传统疫苗相比，其优势在于稳定性强、释药时间长；同时，在保证药物作用的前提下，减少了给药剂量、减轻或避免了毒副反应、可延长免疫保护期，避免了多次反复给药，且载体材料壳聚糖本身无毒，生物相容性好，可生物降解，可通过体内的水解或酶解反应，最终降解为水和CO₂，被人体吸收或排出体外，因而是一种具有广阔应用前景的新型载体疫苗。本发明制备的壳聚糖纳米粒疫苗的免疫途径不受限制，可肌注、点眼，也可口服，且能提高机体免疫力，延长药物在体内作用时间，减少给药次数。另外，本发明也为新城疫疫苗在临床上广泛应用提供了一个免疫效果好和安全性能高的递药系统；在此基础上可将该研究成果应用到更多的动物疫苗和药物体系中，促进疫苗的在畜牧业和临床的实际应用。

经透射电子显微镜观察本发明制备的NDV-CS-NPs形态规则、外形圆整、表面光滑、分散性好，无明显粘连、破损、塌陷等现象(如图1所示)，NDV-CS-NPs粒径为147.72～594.4nm，平均粒径为371.1nm，粒径分布较窄，Zeta电位为+2.84mV。本发明制备的NDV-CS-NPs经黏膜免疫能显著增强T细胞的免疫效果，产生较强的体液免疫和局部的黏膜免疫，且与La Sota活疫苗组相比，NDV-CS-NPs组抗体水平持续时间明显延长，NDV-CS-NPs在鸡体内起到了缓释作用；同时克服了常规疫苗在储存和运输过程中易失活等缺点，且用本发明方法所制备处的NDV-CS-NPs易于保存，稳定性高、包封率高、毒性小、药物生物利用度高、成本低、易于工业化生产。

使用本发明方法制备的DNA疫苗纳米粒在保证DNA疫苗稳定性的条件下具有较高的包封率，包封率为74.0±3.7％，可以保持体内最佳的药物浓度，并且延长药物作用的时间。因此，本发明方法制备的DNA疫苗纳米粒可实现药物的缓释。

本发明方法具有工艺简便、制备成本低、工艺重现性好、样品需要量少，较好保持了ND病毒结构蛋白的抗原性等优点，试验筛选的NDV-CS-NPs制备方法也可放大到生产应用，因而对产业化的应用具有指导意义。

本发明制备的NDV-CS-NPs中病毒含量为10^8.5EID₅₀/0.1mL，符合《中华人民共和国兽用生物制品规程》中新城疫低毒力活疫苗制苗用毒液标准。NDV-CS-NPs可用于鸡新城疫免疫，经口服给药，给药量为每只鸡0.25mL

附图说明

图1为本发明NDV-CS-NPs的透射电子显微镜观察图；图2为具体实施方式一制备的NDV-CS-NPs的粒径分布图；图3为具体实施方式一制备的NDV-CS-NPs的Zeta电位图；图4为具体实施方式一中通过Western-blotting分析比较包裹前后纳米粒中NDV体外免疫原性图；其中M为蛋白marker，1为NDV原液，2为从纳米粒中回收的NDV。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式壳聚糖新城疫疫苗纳米粒的制备方法，按以下步骤进行：一、将壳聚糖分散于灭菌的蒸馏水中，在磁力搅拌下，加入体积浓度为36％乙酸，继续搅拌5～15min，用0.22μm滤器过滤，静置至气泡消去，即得到壳聚糖溶液；二、取5mL步骤一制备的壳聚糖溶液，向其中滴加2～3mL病毒含量为10^8.5EID₅₀的新城疫L-系病毒液，搅拌混合均匀后，再滴加2～3mL浓度为1.0mg/mL的交联剂三聚磷酸钠(TPP)，然后在常温、无菌条件下于1000～1400r/min磁力搅拌10～15min，得溶液A；三、将溶液A于4℃、10000～15000r/min离心30～40min，取沉淀，将沉淀经无菌水洗3～5次，然后真空冷冻干燥22～25h，即得到壳聚糖新城疫疫苗纳米粒；其中步骤一中壳聚糖的质量与蒸馏水的体积比为1g∶900～920mL，步骤一中壳聚糖的质量与乙酸的体积比为1g∶80～85mL。

本实施方式步骤二所述新城疫L-系病毒液中病毒为La Sota株。

本实施方式制备的壳聚糖新城疫疫苗纳米粒(NDV-CS-NPs)在-20℃条件下可保存3个月，经透射电镜观察，本实施方式方法制备的NDV-CS-NPs粒径为147.72～594.4nm，平均粒径为371.1nm(如图2所示)，粒径分布较窄，Zeta电位为+2.84mV(如图3所示)。

取5mL本实施方式制备的NDV-CS-NPs溶液在4℃、13000r/min条件下离心10min，取上清液，记录体积后，采用考马斯亮蓝法(CBB法)测定上清中游离病毒蛋白浓度，计算NDV-CS-NPs包封率：

EE(％)＝[(W₀-W₁)/W₀]×100％，其中W₀为加入的总病毒中的蛋白总量；W₁为上清中游离的病毒中的蛋白总量。

本实施方式制备的NDV-CS-NPs的包封率为74.0±3.7％。

本实施方式制备的NDV-CS-NPs中病毒含量测定：

通过测定鸡胚半数感染量(EID₅₀)来计算病毒含量。取冻干NDV-CS-NPs 100μg，加入至10mL pH7.2的PBS缓冲液中，再加入2mL质量浓度为0.25％的胰酶，置2～8℃冰箱处理72h。之后，以2000r/min离心5min，取上清液用灭菌生理盐水做10倍系列稀释，取10^-6、10^-7、10^-8三个稀释度，分别接种10日龄SPF鸡胚5个，置37℃孵化器继续孵化，弃去24h内死亡的鸡胚，此后每6h照蛋一次，及时将死亡鸡胚取出置2～8℃保存，至120h将鸡胚全部取出，逐个检测鸡胚尿囊液的HA效价，HA≥7log2判为阳性。按Reed-Muench法计算EID₅₀。同时，设未接种的10日龄SPF鸡胚5个做空白对照。结果是本发明制备的NDV-CS-NPs中病毒含量为10^8.5EID₅₀/0.1mL(如表1所示)，符合《中华人民共和国兽用生物制品规程》中新城疫低毒力活疫苗制苗用毒液标准。

表1病毒含量测定结果

本实施方式通过Western blotting分析测定NDV-CS-NPs中病毒结构蛋白抗原性，结果是在分子量75、54、45、41K处显现四条阳性反应带，如图4所示，表明在NDV-CS-NPs制备过程中，NDV包裹前后ND病毒结构蛋白具有完全相同的反应带，NDV结构蛋白没有受到破坏，保持了良好的抗原性。

通过NDV-CS-NPs细胞毒性检测和安全性检验评价本实施方式构建的壳聚糖新城疫疫苗纳米粒黏膜免疫递送系统的安全性：

NDV-CS-NPs细胞毒性检测：取10日龄健康SPF鸡胚肾脏制成1×10⁴个/mL细胞悬液，以0.1mL/孔加入到96孔板。将空白壳聚糖纳米粒和NDV-CS-NPs分别分散于pH 7.2PBS中，配制1.5μg/mL储备液，0.1mL/孔加样；同时，以NDV原液为阳性对照组，空白壳聚糖纳米粒为对照组。细胞加药后于37℃、5％CO₂培养箱中培养48h，于测定前4h加入MTT，0.01mL/孔。测定时一次甩干板中上清，加入DMSO 0.2mL/孔，用酶标仪于570nm处测定OD值，计算细胞杀伤百分率：

细胞杀伤百分率＝(空白组OD_570nm-试验组OD_570nm)/空白组OD_570mm×100％

实验结果测得细胞杀伤百分率为(9.5±3.7)％，表明制备的NDV-CS-NPs毒性较小，壳聚糖新城疫疫苗纳米粒黏膜免疫递送系统具有较高的安全性。

NDV-CS-NPs安全性检验：将NDV-CS-NPs接种4周龄SPF鸡15只，每只鸡口服0.25mL，观察3周并记录鸡只有无异常变化。同时，设15只相同日龄SPF鸡做阳性对照，免疫新城疫La Sota商品疫苗，每只鸡点眼0.25mL。试验结果是连续观察3周，免疫鸡精神、采食、饮水及粪便均正常，证实大剂量口服是安全的，不会引起免疫鸡群出现异常，NDV-CS-NPs具有高度的安全性。

通过SPF鸡免疫接种试验，检测本实施方式制备的NDV-CS-NPs的免疫效果。检测步骤如下：

将60只30日龄SPF鸡分成A、B、C、D、E、F六组，每组10只。A组滴鼻接种新城疫La Sota系活疫苗，0.05mL/只；B组肌肉注射新城疫La Sota系油剂灭活疫苗，0.05mL/只；C组滴鼻接种NDV-CS-NPs，0.06mL/只；D组口服NDV-CS-NPs，0.06mL/只；E组口服空白壳聚糖纳米粒，0.05mL/只；F组不接种疫苗作为阴性对照。

鸡细胞免疫功能检测：采用MTT法检测淋巴细胞转化率。免疫组每组随机取8只鸡，对照组取2只。无菌心脏采血5mL，加肝素钠0.5mL，加入5mL RMPI1640培养基，混匀平分为2份。血样沿离心管壁轻轻加于4mL淋巴细胞分离液上层，2000r/min离心20min，取中间白色淋巴细胞层，移入另一无菌离心管，加RMPI1640完全营养液2-3mL，吹散淋巴细胞，2000r/min离心20min。淋巴细胞再用营养液洗涤2遍，计数，调整细胞浓度为4×10⁶个/mL。取RMPI1640完全营养液(含ConA20μg/mL)加入96孔无菌细胞培养板中，再加淋巴细胞液50μL/孔，置37℃、CO₂培养箱，培养44h后取出，加入5mg/mL MTT 15μL/孔，继续培养4h后取出，加10％SDS-HCl 100μL/孔，继续培养2h后取出，室温放置5min后，用酶标仪测OD570处吸光值。实验结果(如表2所示)表明，口服接种NDV-CS-NPs组和点眼接种NDV-CS-NPs组与其它各组比较都有显著差异(p＜0.05)，但口服接种NDV-CS-NPs组与点眼接种NDV-CS-NPs组相比差异不显著(p＞0.05)，La Sota活疫苗组与新城疫油剂灭活疫苗组及对照组相比差异不显著(p＞0.05)，说明NDV-CS-NPs具有增强T淋巴细胞免疫功能的作用。

表2不同疫苗免疫对SPF鸡淋巴细胞转化率的影响

每组中的OD₅₇₀是五个实验标准差的平均值。数据的不同小写字母表示差异极显著(p＜0.05)。

鸡血清抗体IgG检测：免疫后每周采用常规HI方法检测血清中新城疫IgG抗体。实验结果(如表3所示)表明，各试验组与对照组相比都有极显著性差异(p＜0.01)，在剂量相同的条件下，前4周La Sota活疫苗组和新城疫油剂灭活疫苗组抗体水平一直保持高于其它组，且第3周达到高峰，之后逐渐下降；而点眼接种NDV-CS-NPs组和口服接种NDV-CS-NPs组抗体水平一直呈上升趋势，到第5周高过La Sota活疫苗组和新城疫油剂灭活疫苗组，达到高峰，且口服接种NDV-CS-NPs组比点眼接种NDV-CS-NPs组抗体滴度要高；第6周La Sota活疫苗组和新城疫油剂灭活疫苗组抗体水平明显下降，起不到免疫作用。本试验结果表明经壳聚糖纳米粒包裹后的NDV，产生的结合抗体水平持续时间长，起到了缓释的作用。

表3不同ND疫苗免疫后各组鸡血清中IgG抗体效价(log₂)

每组中的IgG滴度是五个实验标准差的平均值。数据的不同大写字母表示差异极显著(p＜0.05)。

本实施方式制备的壳聚糖猪流感DNA疫苗纳米粒血凝抑制试验：

步骤：1)用微量移液器在96孔V型反应板中各孔加入40μL PBS缓冲液；2)吸取待检血清40μL置于第1孔中，然后倍比稀释至第11孔，弃去40μL，最后一孔不稀释，为红细胞对照；3)向每孔加入40μL本实施方式制备的NDV-CS-NPs；4)置于微量振荡器上振荡1min，混合均匀；5)吸取1％红细胞悬液，每孔各加S0μL；6)置于微量振荡器上振荡1min，混合均匀；7)37℃静置30min，观察结果。实验结果表明，NDV-CS-NPs能刺激特异性B细胞，并且增强体液免疫应答，从而提高抗体滴度。

反应板水平时，空白对照孔和HI阴性孔红细胞应该完全沉至孔底中央；将反应板竖立时，凡血清反应孔与空白对照孔中红细胞以同样速度从孔底流淌者判为血凝抑制。以完全抑制4单位抗原的血清最高稀释度作为HI效价。实验结果表明，经壳聚糖纳米粒包裹后的NDV，产生的结合抗体水平持续时间长，起到了缓释的作用。

攻毒试验：为了检验不同疫苗免疫后所产生的黏膜免疫对机体的保护力，选择在各免疫组ND血清抗体降至2³左右时随机取5只鸡进行攻毒，用F48E9毒株(病毒含量为10⁸EID₅₀/0.1mL)，口服0.2mL/只；同时，设5只SPF鸡口服对照攻毒组，观察14d。试验结果表明，口服免疫NDV-CS-NPs后产生了较强的黏膜免疫，导致口服攻毒后病毒更难以侵入机体而发病。分述如下：①NDV-CS-NPs组，在攻毒后无一死亡，采食、饮水及精神无异常，剖检气管、泄殖腔无出血，仅在十二指肠的肠道淋巴滤泡密集区、盲肠扁桃体等部位有少量轻微出血；②La Sota活疫苗组，有1只鸡死亡，剖检部分活鸡腺胃出血，肠道出血严重；③灭活新城疫疫苗组，有3只鸡死亡，剖检部分活鸡腺胃出血，肠道出血严重；④对照组在攻毒后2～5d内全部死亡，病死鸡鸡冠紫黑，剖检为ND典型病变，气管、喉头出血、腺胃乳头间出血、腺胃周围脂肪出血、十二指肠以至整个肠道黏膜、出血。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中壳聚糖的质量与蒸馏水的体积比为1g∶917mL。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤一中壳聚糖的质量与乙酸的体积比为1g∶83mL。其它与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤二中取5mL步骤一制备的壳聚糖溶液，向其中滴加2.5mL病毒含量为10^8.5EID₅₀的新城疫L-系病毒液。其它与具体实施方式一至三之一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤二中滴加2.5mL浓度为1.0mg/mL的交联剂三聚磷酸钠。其它与具体实施方式一至四之一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤二中于1200r/min磁力搅拌10min。其它与具体实施方式一至五之一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤三中于4℃、13000r/min离心30min。其它与具体实施方式一至六之一相同。

Claims (7)

1.壳聚糖新城疫疫苗纳米粒的制备方法，其特征在于壳聚糖新城疫疫苗纳米粒的制备方法，按以下步骤进行：一、将壳聚糖分散于灭菌的蒸馏水中，在磁力搅拌下，加入体积浓度为36％乙酸，继续搅拌5～15min，用0.22μm滤器过滤，静置至气泡消去，即得到壳聚糖溶液；二、取5mL步骤一制备的壳聚糖溶液，向其中滴加2～3mL病毒含量为10^8.5EID₅₀的新城疫L-系病毒液，搅拌混合均匀后，再滴加2～3mL浓度为1.0mg/mL的交联剂三聚磷酸钠，然后在常温、无菌条件下于1000～1400r/min磁力搅拌10～15min，得溶液A；三、将溶液A于4℃、10000～15000r/min离心30～40min，取沉淀，将沉淀经无菌水洗3～5次，然后真空冷冻干燥22～25h，即得到壳聚糖新城疫疫苗纳米粒；其中步骤一中壳聚糖的质量与蒸馏水的体积比为1g∶900～920mL，步骤一中壳聚糖的质量与乙酸的体积比为1g∶80～85mL。

2.根据权利要求1所述的壳聚糖新城疫疫苗纳米粒的制备方法，其特征在于步骤一中壳聚糖的质量与蒸馏水的体积比为1g∶917mL。

3.根据权利要求1或2所述的壳聚糖新城疫疫苗纳米粒的制备方法，其特征在于步骤一中壳聚糖的质量与乙酸的体积比为1g∶83mL。

4.根据权利要求3所述的壳聚糖新城疫疫苗纳米粒的制备方法，其特征在于步骤二中取5mL步骤一制备的壳聚糖溶液，向其中滴加2.5mL病毒含量为10^8.5EID₅₀的新城疫L-系病毒液。

5.根据权利要求4所述的壳聚糖新城疫疫苗纳米粒的制备方法，其特征在于步骤二中滴加2.5mL浓度为1.0mg/mL的交联剂三聚磷酸钠。

6.根据权利要求5所述的壳聚糖新城疫疫苗纳米粒的制备方法，其特征在于步骤二中于1200r/min磁力搅拌10min。

7.根据权利要求6所述的壳聚糖新城疫疫苗纳米粒的制备方法，其特征在于步骤三中于4℃、13000r/min离心30min。

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